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図面 (2)

課題・解決手段

発酵容器において目的のタンパク質固体結晶または非晶質形態で存在する発酵工程で調製されるタンパク質生成物を精製する方法が開示され、ここで、発酵ブロスのpHが低pHに調節され、それによって目的のタンパク質が溶解し、および不溶性物質から効率的に分離され得る。

概要

背景

産業タンパク質生成の重要な部分は、タンパク質が産生された生成混合物の残渣から所望のタンパク質を精製することである。

発酵産業では、タンパク質は、概して、所望のタンパク質を多量に産生するように設計または選択された特定の細胞により生成される。生成されたタンパク質は、細胞により細胞周囲液体へと分泌され得る。発酵中にタンパク質が生成された後、一般に、タンパク質が所望の形態および純度になるまで、続くステップで精製される。精製工程中、生成されたタンパク質は、概して、生成培地の1つまたは複数の成分から分離されるが、これは、一般に固体細胞材料からの可溶性タンパク質の分離を含む。

タンパク質が十分多量に生成されれば、タンパク質は結晶形態沈殿し、これは、通常、発酵に続く精製工程にさらなる課題をもたらす。何故なら、タンパク質は、固体細胞材料および/または生成混合物の他の固体成分から分離するために、可溶性である必要があるためである。こうした状況において、生成混合物は、沈殿したタンパク質を溶解させることができる追加の水または他の液体で希釈することができる。しかし、生成混合物を希釈することにより、生成混合物中の沈殿タンパク質の問題を解決することができるが、これはあまり望ましい解決法ではない。何故なら、それはまた、体積が増加し、結果的に、その後の精製設備が、希釈による増加した体積を処理することができなければならないことになり、これは、一般に、増加体積に対処するためにさらに多額の投資および高額の運転費用が必要になることを意味するからである。

概要

発酵容器において目的のタンパク質が固体、結晶または非晶質形態で存在する発酵工程で調製されるタンパク質生成物を精製する方法が開示され、ここで、発酵ブロスのpHが低pHに調節され、それによって目的のタンパク質が溶解し、および不溶性物質から効率的に分離され得る。

目的

産業的タンパク質生成の重要な部分は、タンパク質が産生された生成混合物の残渣から所望のタンパク質を精製することである

効果

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請求項1

タンパク質生成物を精製する方法であって、前記タンパク質の少なくとも一部は、前記タンパク質の表面に位置する2〜6個のヒスチジン残基を有し、前記方法は、以下:a.発酵ブロスを提供するステップ、b.任意選択で、pHを6.0未満の値に調節するステップ、c.任意選択で、混合物をある期間にわたって保持するステップ、およびd.前記発酵ブロスからの固体材料の少なくとも一部から、前記溶解したタンパク質生成物を分離するステップを含むステップで行われる、方法。

請求項2

前記タンパク質の前記表面に位置する2〜6個のヒスチジンが、一次配列の内部に配置されるか、または前記タンパク質の前記表面に位置する前記2〜6個のヒスチジンが、前記タンパク質のC−および/またはN−末端延伸の形態である、請求項1に記載の方法。

請求項3

前記目的のタンパク質の前記表面の前記2〜6個のヒスチジン残基の少なくとも1つが、置換または挿入によりもたらされる、請求項2に記載の方法。

請求項4

請求項5

前記酵素が、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4または配列番号25に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性、好ましくは少なくとも95%の配列同一性、好ましくは少なくとも96%の配列同一性、好ましくは少なくとも97%の配列同一性、好ましくは少なくとも98%の配列同一性、好ましくは少なくとも99%の配列同一性を有するプロテアーゼである、請求項4に記載の方法。

請求項6

前記酵素が、配列番号18に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性、好ましくは少なくとも95%の配列同一性、好ましくは少なくとも96%の配列同一性、好ましくは少なくとも97%の配列同一性、好ましくは少なくとも98%の配列同一性、好ましくは少なくとも99%の配列同一性を有するリゾチームである、請求項4に記載の方法。

請求項7

pH4.5での前記目的のタンパク質の溶解度が、pH7.0での溶解度より少なくとも10%高い、好ましくは少なくとも20%高い、好ましくは少なくとも30%高い、好ましくは少なくとも40%高い、好ましくは少なくとも50%高い、好ましくは少なくとも60%高い、好ましくは少なくとも70%高い、好ましくは少なくとも80%高い、好ましくは少なくとも90%高い、好ましくは少なくとも100%高い、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。

請求項8

前記発酵ブロス中の前記タンパク質生成物の濃度が、少なくとも3g/l、例えば少なくとも4g/l、例えば少なくとも5g/l、例えば少なくとも6g/l;例えば少なくとも7g/l、例えば少なくとも8g/l、例えば少なくとも9g/l;例えば少なくとも10g/l、例えば少なくとも11g/l、例えば少なくとも12g/l、例えば少なくとも13g/l、例えば少なくとも14g/l、例えば少なくとも15g/l;例えば少なくとも16g/l、例えば少なくとも17g/l、例えば少なくとも18g/l;例えば少なくとも19g/l、例えば少なくとも20g/lである、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。

請求項9

ステップb)における前記pHが6.0未満、好ましくは5.5未満、好ましくは5.0未満、好ましくは4.5未満のpH値に調節される、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。

請求項10

ステップcに保持期間を含み、前記保持期間が、10秒〜90分の範囲、好ましくは1分〜90分の範囲、好ましくは1分〜60分の範囲、好ましくは1分〜30分の範囲、例えば5分〜30分の範囲、最も好ましくは10〜20分の範囲である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。

請求項11

前記発酵ブロスが、増殖培地中微生物を培養することによって得られる、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。

請求項12

前記微生物が、バチルス(Bacillus)属に属する細菌、例えば、古草菌(Bacillussubtilis)、バチルス・レンツス(B.lentus)およびバチルス・リキニホルミス(B.lichiniformis)、またはアスペルギルス(Aspergillus)属、トリコデルマ(Trichoderma)属、ペニシルム(Penicillum)属、フザリウム(Fusarium)属に属する真菌、例えば、アスペルギルス・ニガー(A.niger)、アスペルギルス・アワモリ(A.awamori)、アスペルギルス・オリゼー(A.oryzae)、ショウユコウジカビ(A.sojae)、トリコデルマ・レエセイ(T.reesei)、トリコデルマ・ロンギブキアツム(T.longibrachiatum)もしくはトリコデルマ・ビリデ(T.viride);または好ましくはサッカロマイセス(Saccharomyces)属、ピチア(Pichia)属、カンジダ(Candida)属、ハネスラ(Hanensula)属、クリベロマイセス(Klyveromyces)属に属する酵母;例えば、サッカロマイセス・セレビシエ(S.cerevisiae)、サッカロマイセス・オバルム(S.ovarum)、ピチア・パストリス(P.Pastoris)、クルイベロマイセス・ラクチス(K.lactis)から選択される、請求項11に記載の方法。

請求項13

ステップdの前記分離が、ろ過、遠心分離またはデカンテーションを用いて実施される、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。

請求項14

ステップdの前記分離の前に、希釈、塩添加およびポリマーの添加などの前処理ステップをさらに含む、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。

請求項15

前記タンパク質生成物が、所与アミノ酸配列を有する目的のタンパク質と、2〜6個のヒスチジン残基のC−および/またはN−末端延伸以外は同じアミノ酸配列を有する修飾タンパク質とを含有する、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。

請求項16

ステップcに保持期間を含み、前記保持期間が、10秒〜90分の範囲、好ましくは1分〜90分の範囲、好ましくは1分〜60分の範囲、好ましくは1分〜30分の範囲、例えば5分〜30分の範囲、最も好ましくは10〜20分の範囲である、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。

請求項17

目的のタンパク質の産生を指令する1つまたは複数の制御配列作動可能リンクされた前記目的のタンパク質をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドと、修飾タンパク質をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドであって、前記修飾タンパク質が、前記目的のタンパク質と比較して、前記タンパク質の表面に位置する2〜6個のヒスチジン残基を含有するように修飾されている、少なくとも1つのポリヌクレオチドとを含む組換え微生物であって、修飾遺伝子が、前記修飾タンパク質の産生を指令する1つまたは複数の制御配列に作動可能にリンクされている、組換え微生物。

請求項18

原核生物細胞、好ましくは、グラム陽性細胞、より好ましくは、バチルス(Bacillus)細胞;最も好ましくは、バチルス・アルカロフィルス(Bacillusalkalophilus)、バチルス・アミロリケファシエンス(Bacillusamyloliquefaciens)、バチルス・ブレビス(Bacillusbrevis)、バチルス・シルクランス(Bacilluscirculans)、バチルス・クラウシイ(Bacillusclausii)、バチルス・コアグランス(Bacilluscoagulans)、バチルス・フィルムス(Bacillusfirmus)、バチルス・ラウツス(Bacilluslautus)、バチルス・レンツス(Bacilluslentus)、バチルス・リケニホルミス(Bacilluslicheniformis)、バチルス・メガテリウム(Bacillusmegaterium)、バチルス・プミルス(Bacilluspumilus)、バチルス・ステアテルモフィルス(Bacillusstearothermophilus)、古草菌(Bacillussubtilis)またはバチルス・チューリンゲンシス(Bacillusthuringiensis)細胞である、請求項17に記載の組換え微生物。

請求項19

真核生物細胞、好ましくは真菌細胞、より好ましくはアスペルギルス(Aspergillus)、トリコデルマ(Trichoderma)またはサッカロマイセス(Saccharomyces)またはピチア(Pichia)細胞;最も好ましくは、アスペルギルス・ニガー(Aspergillusniger)、アスペルギルス・オリゼー(Aspergillus.oryzae)、アスペルギルス・アワモリ(Aspergillusawamori)、アスペルギルス・アクレアツス(Aspergillusaculeatus)、トリコデルマ・レエセイ(Trichodermareesei)、トリコデルマ・ハルジアヌム(Trichodermaharzianum)トリコデルマ・ビレデ(Trichodermavirede)、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomycescerevisiae)、サッカロマイセス・オバルム(Saccharomycesovarum)またはピチア・パストリス(Pichiapastoris)細胞である、請求項17に記載の組換え微生物。

請求項20

前記目的のタンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドの少なくとも2つのコピー、好ましくは前記目的のタンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドの少なくとも3つのコピー、より好ましくは少なくとも4つのコピー、最も好ましくは少なくとも5つのコピーを含む、請求項17〜19のいずれか一項に記載の組換え微生物。

請求項21

前記目的の同じタンパク質をコードする少なくとも2つの異なるポリヌクレオチド、好ましくは前記目的の同じタンパク質をコードする少なくとも3つ、より好ましくは少なくとも4つ、最も好ましくは少なくとも5つのポリヌクレオチドを含む、請求項17〜20のいずれか一項に記載の組換え微生物。

請求項22

前記目的のタンパク質が、酵素、好ましくは、ヒドロラーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、リアーゼ、オキシドレダクターゼ、またはトランスフェラーゼ、例えば、α−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アスパラギナーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、β−キシロシダーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エンドグルカナーゼ、エステラーゼ、緑色蛍光タンパク質、グルカノ−トランスフェラーゼ、グルコアミラーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、リゾチーム、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、またはキシラナーゼである、請求項17〜21のいずれか一項に記載の組換え微生物。

請求項23

前記酵素が、プロテアーゼであり、好ましくは、前記プロテアーゼが、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4または配列番号25の1つに対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性、好ましくは少なくとも95%の配列同一性、好ましくは少なくとも96%の配列同一性、好ましくは少なくとも97%の配列同一性、好ましくは少なくとも98%の配列同一性、好ましくは少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項22のいずれか一項に記載の組換え微生物。

請求項24

前記酵素が、リゾチームであり、好ましくは、配列番号18に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性、好ましくは少なくとも95%の配列同一性、好ましくは少なくとも96%の配列同一性、好ましくは少なくとも97%の配列同一性、好ましくは少なくとも98%の配列同一性、好ましくは少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項22のいずれか一項に記載の組換え微生物。

請求項25

前記ポリヌクレオチドが、宿主細胞染色体中に異なる遺伝子座において組み込まれる、請求項17〜24のいずれか一項に記載の宿主細胞。

請求項26

酵素を生成する方法であって、前記酵素の生成を促進する条件下で、請求項17〜25のいずれか一項に記載の細胞を培養するステップを含む、方法。

請求項27

前記酵素を回収するステップをさらに含む、請求項26に記載の方法。

請求項28

目的のタンパク質と、修飾タンパク質であって、前記目的のタンパク質と比較して、前記タンパク質の表面に2〜6個のヒスチジン残基を含有するように修飾されている修飾タンパク質とを含む、タンパク質生成物。

請求項29

前記修飾タンパク質が、前記タンパク質のC−および/またはN−末端に結合した2〜6個のヒスチジン残基を含む、請求項28に記載のタンパク質生成物。

請求項30

前記目的のタンパク質が、酵素、好ましくは、ヒドロラーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、リアーゼ、オキシドレダクターゼ、またはトランスフェラーゼ、例えば、α−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アスパラギナーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、β−キシロシダーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エンドグルカナーゼ、エステラーゼ、緑色蛍光タンパク質、グルカノ−トランスフェラーゼ、グルコアミラーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、リゾチーム、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、またはキシラナーゼである、請求項28または29に記載のタンパク質生成物。

請求項31

前記酵素が、プロテアーゼであり、好ましくは、前記プロテアーゼが、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4または配列番号25の1つに対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性、好ましくは少なくとも95%の配列同一性、好ましくは少なくとも96%の配列同一性、好ましくは少なくとも97%の配列同一性、好ましくは少なくとも98%の配列同一性、好ましくは少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項30に記載のタンパク質生成物。

請求項32

前記目的の酵素が、リゾチームであり、好ましくは、前記リゾチームが、配列番号18に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性、好ましくは少なくとも95%の配列同一性、好ましくは少なくとも96%の配列同一性、好ましくは少なくとも97%の配列同一性、好ましくは少なくとも98%の配列同一性、好ましくは少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項30に記載のタンパク質生成物。

技術分野

0001

配列表の参照
本願は、コンピュータ読み取り可能な形態での配列表を含み、これは、参照により本明細書に組み込まれる。

0002

本発明は、タンパク質精製の分野、特に、発酵工程により調製されるタンパク質のタンパク質精製の分野に関する。

背景技術

0003

産業タンパク質生成の重要な部分は、タンパク質が産生された生成混合物の残渣から所望のタンパク質を精製することである。

0004

発酵産業では、タンパク質は、概して、所望のタンパク質を多量に産生するように設計または選択された特定の細胞により生成される。生成されたタンパク質は、細胞により細胞周囲液体へと分泌され得る。発酵中にタンパク質が生成された後、一般に、タンパク質が所望の形態および純度になるまで、続くステップで精製される。精製工程中、生成されたタンパク質は、概して、生成培地の1つまたは複数の成分から分離されるが、これは、一般に固体細胞材料からの可溶性タンパク質の分離を含む。

0005

タンパク質が十分多量に生成されれば、タンパク質は結晶形態沈殿し、これは、通常、発酵に続く精製工程にさらなる課題をもたらす。何故なら、タンパク質は、固体細胞材料および/または生成混合物の他の固体成分から分離するために、可溶性である必要があるためである。こうした状況において、生成混合物は、沈殿したタンパク質を溶解させることができる追加の水または他の液体で希釈することができる。しかし、生成混合物を希釈することにより、生成混合物中の沈殿タンパク質の問題を解決することができるが、これはあまり望ましい解決法ではない。何故なら、それはまた、体積が増加し、結果的に、その後の精製設備が、希釈による増加した体積を処理することができなければならないことになり、これは、一般に、増加体積に対処するためにさらに多額の投資および高額の運転費用が必要になることを意味するからである。

発明が解決しようとする課題

0006

従って、大幅な体積増加なしに再可溶化が達成される分離工程のためのタンパク質生成物の再可溶化方法が必要とされている。

課題を解決するための手段

0007

第1の態様では、本発明は、タンパク質生成物を精製する方法に関し、ここで、タンパク質の少なくとも一部は、タンパク質の表面に位置する2〜6個のヒスチジン残基を有し、この方法は、以下:
a.発酵ブロスを提供するステップ、
b.任意選択で、ヒスチジン側鎖のpKaを下回る値にpHを調節するステップ、
c.任意選択で、混合物をある期間にわたって保持するステップ、および
d.発酵ブロスからの固体材料の少なくとも一部から、溶解したタンパク質生成物を分離するステップ
を含むステップで行われる。

0008

第2の態様では、本発明は、目的のタンパク質の産生を指令する1つまたは複数の制御配列作動可能リンクされた目的のタンパク質をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドと、修飾タンパク質をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドであって、修飾タンパク質が、目的のタンパク質と比較して、タンパク質の表面に位置する2〜6個のヒスチジン残基を含有するように修飾されている、少なくとも1つのポリヌクレオチドとを含む組換え微生物に関し、ここで、修飾遺伝子は、修飾タンパク質の産生を指令する1つまたは複数の制御配列に作動可能にリンクされている。

0009

第3の態様では、本発明は、目的のタンパク質の産生を指令する1つまたは複数の制御配列に作動可能にリンクされた目的のタンパク質をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドと、修飾タンパク質をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドであって、修飾タンパク質が、目的のタンパク質と比較して、タンパク質の表面に位置する2〜6個のヒスチジン残基を含有するように修飾されている、少なくとも1つのポリヌクレオチドとを含む組換え微生物に関し、ここで、修飾遺伝子は、修飾タンパク質の産生を指令する1つまたは複数の制御配列に作動可能にリンクされている。

0010

別の態様では、本発明は、目的のタンパク質と、修飾タンパク質であって、目的のタンパク質と比較して、2〜6個のヒスチジン残基によりC−および/またはN−末端延伸された同じアミノ酸配列を有する、修飾タンパク質とを含むタンパク質生成物を生成することを目的とする、第2の態様の組換え微生物の使用に関する。

0011

好ましくは、目的のタンパク質は酵素である。

図面の簡単な説明

0012

発酵中に採取したサンプルを含むリゾチーム発酵からの上清を示すSDS−pageゲルを示す。図面において、レーン1は、マーカーであり、レーン2〜6は、それぞれ、97時間、120時間、144時間、169時間および192時間後のリゾチーム発酵からの発酵ブロスの上清サンプルであり、およびレーン7は、精製されたリゾチーム標準である。169および192時間後のリゾチームの量が、沈殿のために、144時間後と比較して減少しているのを認めることができる。
発酵中に採取したサンプルのリゾチーム発酵からの上清を示すSDS−pageゲルを示す。図面において、レーン1は、マーカーであり、レーン2〜6は、それぞれ、97時間、120時間、144時間、169時間および192時間後のリゾチーム発酵からの発酵ブロスの上清サンプルであり、およびレーン7は、精製されたリゾチーム標準である。リゾチームの量が、全発酵工程を通して増加しているのを認めることができる。

0013

定義
コード配列:「コード配列」という用語は、ポリペプチドのアミノ酸配列を直接的に特定するポリヌクレオチドを意味する。コード配列の境界は、一般にオープンリーディングフレームにより判定され、これは、ATG、GTG、またはTTGなどの開始コドンで開始し、TAA、TAG、またはTGAなどの終止コドンで終わる。コード配列は、ゲノムDNA、cDNA、合成DNA、またはこれらの組み合わせであってよい。

0014

制御配列:「制御配列」という用語は、本発明の成熟型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現に必要な核酸配列を意味する。各制御配列は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して在来(すなわち、同じ遺伝子由来)もしくは外来(すなわち、異なる遺伝子由来)のものであっても、または相互に在来もしくは外来のものであってもよい。このような制御配列としては、これらに限定されないが、リーダポリアデニル化配列プロペプチド配列プロモータシグナルペプチド配列、および転写ターミネータが挙げられる。少なくとも、制御配列は、プロモータ、ならびに転写および翻訳終止シグナルを含む。制御配列は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコード領域に対する制御配列の連結を促進する特定の制限部位を導入する目的で、リンカーを備えていてもよい。

0015

発現:「発現」という用語は、特にこれらに限定されないが、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、および分泌を含むポリペプチドの生成に関与するいずれかのステップを含む。

0016

発現ベクター:「発現ベクター」という用語は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、また、その発現をもたらす制御配列に作動可能にリンクされている直鎖または環状DNA分子を意味する。

0017

宿主細胞:「宿主細胞」という用語は、本発明のポリヌクレオチドを含む核酸構築物または発現ベクターによる形質転換形質移入形質導入等に対する感受性を有するいずれかの細胞型を意味する。「宿主細胞」という用語は、複製の最中に生じる突然変異によって、親細胞と同一ではない親細胞のいずれかの子孫包含する。

0018

単離された:「単離された」という用語は、自然界に存在しない形態または環境にある物質を意味する。単離された物質の非限定的例として、これらに限定されないが、(1)任意の非天然物質、(2)自然界では結合している、天然に存在する成分の1つまたは複数または全部から少なくとも部分的に取り出された任意の物質、例えば、これらに限定されないが、任意の酵素、変異体核酸、タンパク質、ペプチドもしくは補因子;(3)自然界で見出される物質に関して、人為的に修飾された任意の物質;(4)天然では結合している他の成分に関して、その物質の量を増加すること(例えば、宿主細胞における組換え生産;その物質をコードする遺伝子の多数のコピー;ならびに物質をコードする遺伝子と天然に結合したプロモータより強力なプロモータの使用)により、修飾された任意の物質。

0019

成熟型ポリペプチド:「成熟型ポリペプチド」という用語は、N末端プロセシングC末端切断、グリコシル化リン酸化等などの翻訳および任意の翻訳後修飾後における、その最終形態にあるポリペプチドを意味する。宿主細胞が、同じポリヌクレオチドによって発現されるさらに異なる成熟型ポリペプチド(すなわち、異なるC末端および/またはN末端アミノ酸を有する)の2つの混合物を産生し得ることは当技術分野において公知である。さらに、異なる宿主細胞は、ポリペプチドのプロセシングも異なるため、ポリペプチドを発現する1つの宿主細胞は、同じポリヌクレオチドを発現する別の細胞と比較して、異なる成熟型ポリペプチド(例えば、異なるC末端および/またはN末端アミノ酸を有する)を生成し得ることも公知である。

0020

成熟型ポリペプチドコード配列:「成熟型ポリペプチドコード配列」という用語は、成熟型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。

0021

核酸構築物:「核酸構築物」という用語は、一本鎖または二本鎖のいずれかである核酸分子を意味し、これは、天然の遺伝子から単離されるか、またはそうでなければ自然界に存在しないであろう方法で核酸のセグメントを含有するよう修飾されるか、あるいは合成のものであり、1つまたは複数の制御配列を含む。

0022

作動可能にリンクされた:「作動可能にリンクされた」という用語は、制御配列がコード配列の発現を指令するよう、ポリヌクレオチドのコード配列に対して適切な位置に、制御配列が位置する構造を意味する。

0023

配列同一性:2つのアミノ酸配列間または2つのヌクレオチド配列間の関連性が、「配列同一性」というパラメータによって記載される。本発明の目的のために、2つのアミノ酸配列間の配列同一性は、好ましくはバージョン5.0.0以降のEMBOSSパッケージ(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice et al.,2000,TrendsGenet.16:276−277)のNeedleプログラムにおいて実装されている、Needleman−Wunschアルゴリズム(Needleman and Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443−453)を用いて判定される。用いられるパラメータは、10のギャップオープンペナルティ、0.5のギャップエクステンションペナルティおよびEBLOSUM62(BLOSUM62のEMBOSSボージョン)置換マトリックスである。Needle標識された「最長の同一性」(−nobriefオプションを用いて得られる)の出力が同一性割合として用いられ、以下のとおり算出される。
(同等の残基×100)/(アラインメントの長さ−アラインメント中のギャップの総数

0024

本発明の目的のために、2つのデオキシリボヌクレオチド配列間の配列同一性は、好ましくはバージョン5.0.0以降のEMBOSSパッケージ(前述のEMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice et al.,2000)のNeedleプログラムにおいて実装されている、Needleman−Wunschアルゴリズム(前述のNeedleman and Wunsch,1970)を用いて判定される。用いられるパラメータは、10のギャップオープンペナルティ、0.5のギャップエクステンションペナルティおよびEDNAFLLNCBI NUC4.4のEMBOSSバージョン)置換マトリックスである。Needle標識された「最長の同一性」(−nobriefオプションを用いて得られる)の出力が同一性割合として用いられ、以下のとおり算出される。
(同等のデオキシリボヌクレオチド×100)/(アラインメントの長さ−アラインメント中のギャップの総数)

0025

多くのタンパク質生成物は、今日、特定の基質および発酵プロトコルを用いて、発酵槽中で微生物を発酵させる発酵工程で調製される。これはよく知られており、多くの発酵プロトコルが当技術分野において記載されている。発酵中、微生物は、意図するタンパク質を産生し、このタンパク質を発酵ブロス中に排泄する。発酵工程の後、溶解した意図するタンパク質を含む液体部分を、細胞、細胞残屑および基質からの固体残渣などの固体から分離するが、タンパク質生成物は、当技術分野で公知の技術を用いて、液体部分からさらに精製してもよい。しかし、多くの産業的発酵において、意図するタンパク質生成物は、あまりにも多量に産生されるため、タンパク質が沈殿して、結晶もしくは非晶質固体を形成し、これは、固体部分から容易に分離されないため、精製に問題をもたらすことが起こっている。

0026

本発明の方法に使用可能なタンパク質は、原則として、ヒスチジン側鎖のpKaを超えるpH値での溶解度と比較して、ヒスチジン側鎖のpKaを下回るpH値でより高い溶解度を有する任意のタンパク質である。

0027

好ましくは、ヒスチジン側鎖のpKaを下回るpH値は、ヒスチジン側鎖のpKaより少なくとも0.1pH単位低い、好ましくはヒスチジン側鎖のpKa値より、好ましくは少なくとも0.2pH単位低い、好ましくは少なくとも0.3pH単位低い、好ましくは少なくとも0.4pH単位低い、好ましくは少なくとも0.5pH単位低い、好ましくは少なくとも0.6pH単位低い、好ましくは少なくとも0.7pH単位低い、好ましくは少なくとも0.8pH単位低い、好ましくは少なくとも0.9pH単位低い、好ましくは少なくとも1.0pH単位低い、好ましくは少なくとも1.5pH単位低い、好ましくは少なくとも2.0pH単位低い。

0028

ヒスチジン側鎖のpKaを超えるpH値は、ヒスチジン側鎖のpKaより少なくとも0.1pH単位高い、ヒスチジン側鎖のpKa値より、好ましくは少なくとも0.2pH単位高い、好ましくは少なくとも0.3pH単位高い、好ましくは少なくとも0.4pH単位高い、好ましくは少なくとも0.5pH単位高い、好ましくは少なくとも0.6pH単位高い、好ましくは少なくとも0.7pH単位高い、好ましくは少なくとも0.8pH単位高い、好ましくは少なくとも0.9pH単位高い、好ましくは少なくとも1.0pH単位高い、好ましくは少なくとも1.5pH単位高い、好ましくは少なくとも2.0pH単位高い。

0029

ヒスチジンは、3つのpKa値、すなわち、カルボキシル基について1つ、ピロール基について1つ、およびNH2基について1つを有することが理解されよう。ペプチド、例えば、ポリペプチドまたはタンパク質などの場合、カルボキシル基およびNH2基の少なくとも1つは、ペプチド結合において、隣接するアミノ酸と結合することになる。

0030

ヒスチジン側鎖のpKaは、本明細書および特許請求の範囲において、ヒスチジン分子のイミダゾール環のpKaを意味するものとする。イミダゾール基のpKaは、25℃で約6.0である。当業者は、pKaが、溶媒の温度、濃度およびイオン強度などの条件によって若干変動することを理解されよう。タンパク質の精製に関する本発明の場合、適切な条件は、タンパク質の変性を比較的わずかにしか引き起こさない条件、すなわち、比較的穏やかな条件である。こうした条件下で、本発明の目的のために、ヒスチジン側鎖のpKaは、6.0であると想定することができ、これは、別に明示されていない限り、本明細書および特許請求の範囲において想定される。

0031

これは、6.0を下回るpHでは、ヒスチジン、特にタンパク質の表面に露出したヒスチジン上のイミダゾール基が、ほとんどプロトン化されて、その結果、陽荷電されるのに対し、6.0を超えるpHでは、ヒスチジン、特にタンパク質の表面に露出したヒスチジン上のイミダゾール基が、ほとんど非プロトン化されて、その結果、非荷電となることを意味する。

0032

ヒスチジン側鎖のpKaは、遊離ヒスチジンの場合、約6.0である。ヒスチジン側鎖のpKaは、特に、タンパク質構造の内部に位置するヒスチジンの場合、周囲のアミノ酸によって影響され得る。本発明に適切なヒスチジンは、目的のタンパク質の表面に位置するヒスチジンであるため、周囲に対し高度に露出しており、従って、これらのヒスチジンのpKaの変化はわずかであるに過ぎない。従って、本発明の目的のために、ヒスチジン側鎖のpKaは、周囲のアミノ酸とは独立に、6.0であると考えることができる。

0033

このように、一実施形態では、本発明の方法で用いるタンパク質は、pH6.5での溶解度と比較して、pH5.5で高い溶解度を有するタンパク質;またはpH7.0での溶解度と比較して、pH5.0で高い溶解度を有するタンパク質;またはpH8.0での溶解度と比較して、pH4.5で高い溶解度を有するタンパク質である。

0034

本発明は、表面に2〜6個のヒスチジンを有するタンパク質は、典型的に、2〜6個のヒスチジン以外は同じ配列を有する対応するタンパク質と比較して、ヒスチジン側鎖(ヒスチジン側鎖またはその有意な部分が、陽荷電されている)のpKaを下回るpHで高い溶解度を有するという知見に基づく。ヒスチジン側鎖のpKaを超えるpH値では、ヒスチジン側鎖は、概して非荷電であり、典型的には、これによって、このpHでは溶解度が低くなる。

0035

特に、本発明は、タンパク質の表面領域にヒスチジン残基を挿入するか、またはこの領域のヒスチジン残基を置換することによって修飾されたタンパク質に関し、従って、修飾タンパク質は、表面に2〜6個のヒスチジンを含有する。2〜6個のヒスチジンは、一次配列の内部に位置してもよく、または成熟型タンパク質のC−もしくはN−末端に結合していてもよく、あるいはこれらの任意の組み合わせであってもよい。こうした修飾タンパク質は、恐らくこのpHでのヒスチジン残基の陽電荷のために、ヒスチジン側鎖のpKaを下回るpHでは高い溶解度という利点を有するが、ヒスチジン側鎖のpKaを超えるpHでは、修飾タンパク質は、非修飾タンパク質と同じ電荷を有するであろうことから、非修飾タンパク質と全く同様に使用することができる。

0036

タンパク質生成物は、原則として発酵工程で調製されるあらゆるタンパク質であってよく、本発明は、結晶または非晶質形態のタンパク質生成物の一部の沈殿を結果的に引き起こす所与の条件下で、タンパク質がその可溶性を超える濃度で存在する分離工程に関する。

0038

プロテアーゼ
好ましい実施形態では、プロテアーゼは、スブチリシンまたはメタロプロテアーゼである。

0039

スブチリシンは、Asp32、His64およびSer221(スブチリシンBPNの番号付け)から構成される触媒三残基を使用するセリンプロテアーゼである。

0040

スブチリシンは、ペプチダーゼ分類法によれば、以下:クランSB、ファミリーS8、MEROPS ID:S08.001のように表すことができる。

0041

スブチリシンは、例えば、Barrett et al.1998.Handbook of proteolytic enzymes.Academic press,p.289−294に記載されている。Siezen and Leunissen,Protein Science,1997,6&501−523には、スブチラーゼの説明が提供されている。

0042

本発明のプロテアーゼの起源および/または本発明に従う使用について何ら限定はない。従って、プロテアーゼという用語には、天然または野生型プロテアーゼだけではなく、プロテアーゼ活性呈示するその全ての突然変異体、変異体、断片など、さらには、シャッフルプロテアーゼ(shuffled protease)およびコンセンサスプロテアーゼなどの合成プロテアーゼも含まれる。このような遺伝子操作されたプロテアーゼは、当技術分野で広く知られているように、例えば、部位特異的突然変異誘発法によって、PCRPCR反応におけるプライマーの1つとして所望の突然変異を含むPCR断片を使用する)によって、またはランダム変異導入法によって調製することができる。コンセンサスタンパク質の調製は、例えば、欧州特許第897985号明細書に記載されている。

0043

本発明に使用するプロテアーゼの例として、配列番号2(Savinase)もしくは配列番号25(BPN’)などの野生型プロテアーゼ、または配列番号1、配列番号3もしくは配列番号4を有するSavinase変異体などの変異型プロテアーゼが挙げられる。本発明に使用する好ましいプロテアーゼは、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4または配列番号25の1つに対して少なくとも80%の配列同一性、例えば少なくとも90%の配列同一性、例えば少なくとも95%の配列同一性、例えば少なくとも96%の配列同一性、例えば少なくとも97%の配列同一性、例えば少なくとも98%の配列同一性、例えば少なくとも99%の配列同一性を有するプロテアーゼである。

0044

アミラーゼ
好適なアミラーゼ(αおよび/またはβ)は、細菌を起源とするものを含む。化学修飾、またはタンパク質改変された突然変異体も含まれる。アミラーゼとして、例えば、バチルス(Bacillus)、例えば、バチルス・リケニホルミス(B.licheniformis)の株から得られるα−アミラーゼが挙げられ、これについては、英国特許第1,296,839号明細書にさらに詳しく記載されている。

0045

セルラーゼ
好適なセルラーゼは、細菌または真菌を起源とするものを含む。化学修飾、またはタンパク質が操作された(置換、挿入、および/または欠失を含む)突然変異体も含まれる。好適なセルラーゼとして、米国特許第4,435,307号明細書、同第5,648,263号明細書、同第5,691,178号明細書、同第5,776,757号明細書および国際公開第89/09259号パンフレットに開示されているバチルス(Bacillus)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、フミコラ(Humicola)属、フザリウム(Fusarium)属、チエラビア(Thielavia)属、アクレモニウム(Acremonium)属由来のセルラーゼ、例えば、フミコラ・インソレンス(Humicola insolens)、ミセリオフトラテルモフィラ(Myceliophthora thermophila)およびフザリウム・オキシスポルム(Fusarium oxysporum)から産生される真菌性セルラーゼが挙げられる。

0046

リパーゼ
好適なリパーゼは、細菌または真菌を起源とするものを含み、タンパク質が操作された(置換、挿入、および/または欠失を含む)突然変異体も含まれる。好適なリパーゼとして、フミコラ(Humicola)属およびリゾムコール(Rhizomucor)属由来のリパーゼ、例えば、フモコラ・ラヌギノセ(Humocola lanuginose)およびリゾムコール・ミヘイ(Rhizomucor mihei)から産生される真菌性リパーゼが挙げられる。

0047

オキシドレダクターゼ
本発明に従い処理することができるオキシドレダクターゼとして、ペルオキシダーゼ(EC 1.11.1.7)、およびラッカーゼなどのオキシダーゼ、ならびにカタラーゼ(EC 1.11.1.6)が挙げられる。

0048

リゾチーム
「リゾチーム」活性という用語は、O−グリコシルヒドロラーゼとして本明細書に定義され、これは、2つ以上の炭水化物の間、または炭水化物と非炭水化物部分との間のグリコシド結合加水分解を触媒する。リゾチームは、細菌細胞壁ムコ多糖体およびムコペプチド中の特定の残基間のグリコシド結合、例えば、ペプチドグリカン中のN−アセチルムラミン酸およびN−アセチル−D−グルコサミン残基の間、ならびにキトデキストリン中のN−アセチル−D−グルコサミン残基間の1,4−β−結合を切断する、溶菌をもたらす。リゾチームは、酵素クラスEC 3.2.1.17に属する。

0049

本発明で使用されるリゾチームの例として、国際公開第2003/076253号パンフレットに開示されているリゾチームが挙げられる。本発明で使用される好ましいリゾチームは、配列番号18に対して少なくとも80%の配列同一性、例えば少なくとも90%の配列同一性、例えば少なくとも95%の配列同一性、例えば少なくとも96%の配列同一性、例えば少なくとも97%の配列同一性、例えば少なくとも98%の配列同一性、例えば少なくとも99%の配列同一性を有するリゾチームである。

0050

発酵工程の終了時の発酵ブロスのpHおよび低pHは、目的のタンパク質の実効電荷が、発酵終了時のpHから低pHまで変化するように選択する。これを確実にする1つの好ましい方法は、発酵終了時のpH値から低pH値までのpKa値を有する2〜6個のアミノ酸を有する目的のタンパク質を選択することであり、ここで、これらのアミノ酸は、目的のタンパク質の表面に位置する。

0051

一般に使用される宿主細胞のpH耐性および目的のタンパク質のpH安定性を考慮した、好適な範囲内のpKa値を有するアミノ酸残基の好ましい例として、側鎖のpKaが約6.0のヒスチジンを挙げることができる。

0052

発酵終了時の発酵ブロスのpHは、宿主生物発酵培地組成酸素供給、工程中のpH調節持続時間、および発酵工程下での総合的条件などの複数のパラメータに応じて変わり得る。しかし、典型的な産業的発酵工程は、pH調節され、発酵終了時のpHは、特定の工程に適用されるpH調節によって決定される。

0053

本発明に従い使用されるタンパク質は、天然に見出されるタンパク質と同じアミノ酸配列を有するタンパク質として理解される天然のタンパク質であってもよく、またはアミノ酸配列が人間によって改変され、その結果、このようなアミノ酸配列を有するタンパク質が天然では見出されない操作タンパク質であってもよい。

0054

本発明の方法で使用されるこうしたタンパク質の好ましい1クラスは、タンパク質の表面に位置する2〜6個のヒスチジン残基を有するタンパク質である。このようなタンパク質は、天然のタンパク質であってもよく、または操作されている、例えば、その表面に2〜6個のヒスチジンを含有するように操作されていてもよい。表面に位置する2〜6個のヒスチジン残基は、タンパク質の一次アミノ酸配列の内部に位置してもよく、またはタンパク質のアミノ酸配列の一端もしくは他端に位置してもよく、あるいはこれらの組み合わせであってもよい。

0055

本発明の方法で使用される操作タンパク質の好ましい1クラスは、N−もしくはC−末端またはタンパク質に結合されたHisタグを有するタンパク質である。本願において、His−タグは、2〜6個の隣接するヒスチジン残基を含むアミノ酸の短い区間を意味するものとする。Hisタグは、his−タグを含むタンパク質の精製後にhis−タグの除去を可能にし、これによって、hisタグ残基が全くないタンパク質の取得を可能にするプロテアーゼ切断部位を含有してもよい。

0056

本発明の方法で使用される他の操作タンパク質は、一次アミノ酸配列の内部に、およびタンパク質の表面に位置する2〜6個のヒスチジン残基を含有するように操作された酵素である。このようなタンパク質は、欧州特許に出願され、「ENZYME VARIANTS AND POLYNUCLEOTIDESENCODING SAME」という名称同時係属出願欧州特許出願公開第14162434.6号明細書(参照により本明細書に組み込まれる)に記載されているように設計してもよく、その教示内容は、本明細書および特許請求の範囲にも適用される。

0057

一般に、発酵工程でのpHは、最適な生成物収率および品質を達成するために、その工程中に制御する。これは、当技術分野ではよく知られている。表面に位置する2〜6個のヒスチジンを有するタンパク質の使用は、pHを制御することによって、目的のタンパク質の溶解度に影響を与えることができるという点で特に有益となり得る。このように、ヒスチジン側鎖のpKaを下回るpH値までpHを下げることにより、溶解度を高めることができ、また、ヒスチジン側鎖のpKaを超えるpH値までpHを上げることにより、溶解度を低下させることができる。

0058

これは、とりわけ、プロテアーゼ分解を受けやすい意図するタンパク質をもたらすと共に、最後には発酵ブロスとなるプロテアーゼももたらす発酵に有益である。こうした状況は、タンパク質が概して固体状態ではプロテアーゼ分解を受けにくいため、目的のタンパク質が発酵中に沈殿する条件下で上記工程を実施し、かつ固体部分から意図するタンパク質を分離するために、精製時にタンパク質を溶解する上で有益となり得る。

0059

多くの微生物は、発酵中に、意図する生成物として、副活性として、または一部の細胞の溶解の結果としてのいずれかでプロテアーゼを産生し、これらは全て、目的の意図するタンパク質の幾分の分解、ならびにこれによる生成物の消失または生成物品質の低下を招き得ることがわかっている。特に、プロテアーゼ生成のための発酵の場合、産生されたプロテアーゼは、存在するタンパク質を分解する(自己タンパク質分解として知られる)ことになるため、発酵中にプロテアーゼが沈殿して、これにより、自己タンパク質分解から保護される条件下で、プロテアーゼ発酵工程を実施するのが有益であり得、その後、精製時にタンパク質を再可溶化して、この精製工程で、好適な分離技術を用いて生成物を固体から分離する。

0060

これは、本発明に従い、6.0超のpHで発酵させた後、精製工程の少なくとも一部の間、6.0未満のpHまでpHを下げることにより、実施することができる。発酵は、例えば、6.0超、例えば、6.2超;例えば、6.5超;例えば、7.0超のpHで実施してよく、精製は、少なくとも一部を5.8未満、例えば、5.5未満、例えば、5.0未満のpHで実施してよい。

0061

好ましい一実施形態では、目的の遺伝子をコードする1つまたは複数の遺伝子、ならびにコードされたタンパク質が、タンパク質の一次アミノ酸配列の内部に、およびタンパク質の表面に位置する2〜6個のヒスチジン、またはタンパク質のN−および/もしくはC−末端に結合された2〜6個のヒスチジンのHis−タグを含有するように修飾された、目的の遺伝子の修飾形態をコードする1つまたは複数の遺伝子を含有するように操作された操作微生物によってタンパク質生成物が産生され、ここで、目的の遺伝子および目的の修飾遺伝子は全て、微生物の発酵中に発現される。驚くことに、このような操作微生物により産生された目的のタンパク質は、目的の修飾遺伝子を含まない対応する微生物よりも高い溶解度を有すること、さらには、沈殿した目的のタンパク質が、pHを6.0未満に変更することによって容易に可溶性になることが判明した。

0062

操作微生物における目的の遺伝子および目的の修飾遺伝子のコピー数は、1〜20、例えば1〜10、例えば1〜5の範囲であってよい。目的の遺伝子のコピー数は、目的の修飾遺伝子のコピー数と同じでも、同じでなくてもよい。好ましい一実施形態では、目的の修飾遺伝子のコピー数は、1であり、目的の遺伝子のコピー数は、1、2、3、4、5、6、7または8であり、別の好ましい実施形態では、目的の修飾遺伝子のコピー数は、2であり、目的の遺伝子のコピー数は、1、2、3、4、5、6、7または8である。

0063

ポリヌクレオチド
本発明はまた、本明細書に記載する、ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドにも関する。

0064

ポリヌクレオチドの単離またはクローン化に用いられる技術は技術分野において公知であり、ゲノムDNAもしくはcDNAからの単離、またはこれらの組み合わせが含まれる。ゲノムDNAからのポリヌクレオチドのクローン化は、例えば、発現ライブラリの周知のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)または抗体スクリーニングを用いて共有される構造機構を伴うクローン化されたDNA断片を検出することにより実施されることが可能である。例えば、Innis et al.,1990,PCR:A Guide to Methodsand Application,Academic Press,New Yorkを参照のこと。リガーゼ連鎖反応(LCR)、連結活性化転写(LAT)およびポリヌクレオチドベース増幅(NASBA)などの他の核酸増幅法が用いられ得る。

0065

本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの修飾は、ポリペプチドに実質的に類似するポリペプチドの合成に必要であり得る。ポリペプチドに「実質的に同様」という用語は、ポリペプチドの非天然形態を指す。これらのポリペプチドは、天然のソースから単離されたポリペプチドとはいくらかの操作法で異なっていてもよく、例えば、特異活性、耐熱性至適pH等が異なる変異体である。変異体は、ポリペプチドのアミノ酸配列に変化をもたらさないが、酵素の生成のために意図される宿主生体コドン利用に対応する、成熟型ポリペプチドコード配列として提示されるポリヌクレオチドに基づくか、または異なるアミノ酸配列をもたらし得るヌクレオチド置換の導入により構築され得る。ヌクレオチド置換の概要については、例えば、Ford et al.,1991,Protein Expression and Purification 2:95−107を参照のこと。

0066

核酸構築物
本発明はまた、制御配列に適合する条件下で好適な宿主細胞中にコード配列を発現させる1つまたは複数の制御配列に作動可能にリンクした本発明のポリヌクレオチドを含む核酸構築物に関する。

0067

ポリヌクレオチドは、多様な方法で処置されてポリペプチドの発現がもたらされ得る。ベクターへ挿入される前のポリヌクレオチドの処置が、発現ベクターに応じて、望ましいか、または必要であり得る。組換えDNA法を利用するポリヌクレオチドを修飾するための技術は技術分野において周知である。

0068

制御配列は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現のための宿主細胞によって認識されるポリヌクレオチドであるプロモータであり得る。プロモータは、ポリペプチドの発現を媒介する転写制御配列を含有する。プロモータは、ミュータント、切断およびハイブリッドプロモータを含む宿主細胞において転写活性を示すいずれかのポリヌクレオチドであり得、ならびに宿主細胞に対して相同性または非相同性である細胞外または細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得られ得る。

0069

細菌宿主細胞において本発明の核酸構築物の転写を指令する上で好適なプロモータの例としては、バチルス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)α−アミラーゼ遺伝子(amyQ)、バチルス・リケニホルミス(Bacillus licheniformis)α−アミラーゼ遺伝子(amyL)、バチルス・リケニホルミス(Bacillus licheniformis)ペニシリナーゼ遺伝子(penP)、バチルス・ステアテルモフィルス(Bacillus stearothermophilus)マルトジェニックアミラーゼ遺伝子(amyM)、古草菌(Bacillus subtilis)レバンスクラーゼ遺伝子(sacB)、古草菌(Bacillus subtilis)xylAおよびxylB遺伝子、バチルス・チューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis)cryIIIA遺伝子(Agaisse and Lereclus,1994,Molecular Microbiology 13:97−107)、大腸菌(E.coli)lacオペロン、大腸菌(E.coli)trcプロモータ(Egon et al.,1988,Gene 69:301−315)、ストレプトマイセス・コエリコロル(Streptomyces coelicolor)アガラーゼ遺伝子(dagA)、および原核β−ラクタマーゼ遺伝子(Villa−Kamaroff et al.,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75:3727−3731)、ならびにtacプロモータ(DeBoer et al.,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:21−25)から得られるプロモータがある。さらなるプロモータが、「Useful proteins from recombinant bacteria」,Gilbert et al.,1980,Scientific American 242:74−94;および前述のSambrook et al.,1989に記載されている。タンデムプロモータの例は、国際公開第99/43835号パンフレットに開示されている。

0070

糸状真菌宿主細胞において、本発明の核酸構築物の転写を指令するのに好適なプロモータの例は、以下:アスペルギルス・ニズランス(Aspergillus nidulans)アセトアミダーゼ、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)中性α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)耐酸性α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)またはアスペルギルス・アワモリ(Aspergillus awamori)グルコアミラーゼ(glaA)、アスペルギルス・オリゼー(Aspergillus oryzae)TAKAアミラーゼ、アスペルギルス・オリゼー(Aspergillus oryzae)アルカリプロテアーゼ、アスペルギルス・オリゼー(Aspergillus oryzae)トリオースリン酸イソメラーゼ、フザリウム・オキシスポルム(Fusarium oxysporum)トリプシン様プロテアーゼ(国際公開第96/00787号パンフレット)、フザリウム・ベネナツム(Fusarium venenatum)アミログルコシダーゼ(国際公開第00/56900号パンフレット)、フザリウム・ベネナツム(Fusarium venenatum)ダリア(Daria)(国際公開第00/56900号パンフレット)、フザリウム・ベネナツム(Fusarium venenatum)クイン(Quinn)(国際公開第00/56900号パンフレット)、リゾムコール・ミエヘイ(Rhizomucor miehei)リパーゼ、リゾムコール・ミエヘイ(Rhizomucor miehei)アスパラギン酸プロテイナーゼトリコデルマ・レエセイ(Trichoderma reesei)β−グルコシダーゼ、トリコデルマ・レエセイ(Trichoderma reesei)セロビオヒドラーゼI、トリコデルマ・レエセイ(Trichoderma reesei)セロビオヒドラーゼII、トリコデルマ・レエセイ(Trichoderma reesei)エンドグルカナーゼI、トリコデルマ・レエセイ(Trichoderma reesei)エンドグルカナーゼII、トリコデルマ・レエセイ(Trichoderma reesei)エンドグルカナーゼIII、トリコデルマ・レエセイ(Trichoderma reesei)エンドグルカナーゼV、トリコデルマ・レエセイ(Trichoderma reesei)キシラナーゼI、トリコデルマ・レエセイ(Trichoderma reesei)キシラナーゼII、トリコデルマ・レエセイ(Trichoderma reesei)キシラナーゼIII、トリコデルマ・レエセイ(Trichoderma reesei)β−キシロシダーゼ、およびトリコデルマ・レエセイ(Trichoderma reesei)翻訳延長因子の遺伝子から得られるプロモータ、ならびにNA2−tpiプロモータ(非翻訳リーダが、アスペルギルス(Aspergillus)トリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子由来の非翻訳リーダにより置換されているアスペルギルス(Aspergillus)中性α−アミラーゼ遺伝子由来の修飾プロモータ;非限定的例として、非翻訳リーダが、アスペルギルス・ニズランス(Aspergillus nidulans)またはアスペルギルス・オリゼー(Aspergillus oryzae)トリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子由来の非翻訳リーダにより置換されているアスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)中性α−アミラーゼ遺伝子由来の修飾プロモータが挙げられる);ならびにこれらの変異型切断型、およびハイブリッドプロモータである。他のプロモータは、米国特許第6,011,147号明細書に記載されている。

0071

酵母宿主において、有用なプロモータは、以下:サッカロマイセスセレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)エノラーゼ(ENO−1)、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)ガラクトキナーゼ(GAL1)、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)アルコールデヒドロゲナーゼグリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼADH1、ADH2/GAP)、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)トリオースリン酸イソメラーゼ(TPI)、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)メタロチオネイン(CUP1)、およびサッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)3−ホスホグリセリン酸キナーゼの遺伝子から得られる。酵母宿主細胞のための他の有用なプロモータは、Romanos et al.,1992,Yeast 8:423−488により記載されている。

0072

制御配列はまた、宿主細胞によって認識されて転写を終結させる転写ターミネータであり得る。ターミネータは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの3’−末端に作動可能にリンクする。本発明においては、宿主細胞において機能するいずれかのターミネータが用いられ得る。

0073

細菌宿主細胞の好ましいターミネータは、バチルス・クラウジイ(Bacillus clausii)アルカリプロテアーゼ(aprH)、バチルス・リケニホルミス(Bacillus licheniformis)α−アミラーゼ(amyL)、および大腸菌(Escherichia coli)リボソームRNA(rrnB)の遺伝子から得られる。

0074

糸状真菌宿主細胞のための好ましいターミネータは、以下:アスペルギルス・ニズランス(Aspergillus nidulans)アセトアミダーゼ、アスペルギルス・ニズランス(Aspergillus nidulans)アントラニル酸シンターゼ、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)グルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)α−グルコシダーゼ、アスペルギルス・オリゼー(Aspergillus oryzae)TAKAアミラーゼ、フザリウム・オキシスポルム(Fusarium oxysporum)トリプシン様プロテアーゼ、トリコデルマ・レエセイ(Trichoderma reesei)β−グルコシダーゼ、トリコデルマ・レエセイ(Trichoderma reesei)セロビオヒドラーゼI、トリコデルマ・レエセイ(Trichoderma reesei)セロビオヒドラーゼII、トリコデルマ・レエセイ(Trichoderma reesei)エンドグルカナーゼI、トリコデルマ・レエセイ(Trichoderma reesei)エンドグルカナーゼII、トリコデルマ・レエセイ(Trichoderma reesei)エンドグルカナーゼIII、トリコデルマ・レエセイ(Trichoderma reesei)エンドグルカナーゼV、トリコデルマ・レエセイ(Trichoderma reesei)キシラナーゼI、トリコデルマ・レエセイ(Trichoderma reesei)キシラナーゼII、トリコデルマ・レエセイ(Trichoderma reesei)キシラナーゼIII、トリコデルマ・レエセイ(Trichoderma reesei)β−キシロシダーゼ、およびトリコデルマ・レエセイ(Trichoderma reesei)翻訳延長因子の遺伝子から得られる。

0075

酵母宿主細胞のための好ましいターミネータは、以下:サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)エノラーゼ、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)シトクロームC(CYC1)、およびサッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼの遺伝子から得られる。酵母宿主細胞のための他の有用なターミネータは、前述のRomanos et al.,1992により記載されている。

0076

制御配列はまた、プロモータの下流で、かつ遺伝子の発現を増大する遺伝子のコード配列の上流mRNA安定化領域でもあってもよい。

0077

好適なmRNA安定化領域の例は、バチルス・チューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis)cryIIIA遺伝子(国際公開第94/25612号パンフレット)および古草菌(Bacillus subtilis)SP82遺伝子(Hue et al.,1995,Journal of Bacteriology 177:3465−3471)から得られる。

0078

制御配列はまた、リーダ、すなわち、宿主細胞による翻訳に重要なmRNAの非翻訳領域であってもよい。リーダは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの5’−末端に作動可能に連結されている。宿主細胞において機能性である任意のリーダを用いてよい。

0079

糸状真菌宿主細胞のための好ましいリーダは、以下:アスペルギルス・オリゼー(Aspergillus oryzae)TAKAアミラーゼおよびアスペルギルス・ニズランス(Aspergillus nidulans)トリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子から得られる。

0080

酵母宿主細胞に好適なリーダは、以下:サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)エノラーゼ(ENO−1)、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)3−ホスホグリセリン酸キナーゼ、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)α−因子、およびサッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)アルコールデヒドロゲナーゼ/グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(ADH2/GAP)の遺伝子から得られる。

0081

制御配列はまた、ポリアデニル化配列、すなわち、ポリヌクレオチドの3’−末端に作動可能にリンクされて、転写されると、宿主細胞によりシグナルとして認識され、転写mRNAにポリアデノシン残基を付加する配列であってもよい。宿主細胞において機能性のあらゆるポリアデニル化配列を用いてよい。

0082

糸状真菌宿主細胞のための好ましいポリアデニル化配列は、以下:アスペルギルス・ニズランス(Aspergillus nidulans)アントラニル酸シンターゼ、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)グルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)α−グルコシダーゼ、アスペルギルス・オリゼー(Aspergillus oryzae)TAKAアミラーゼ、およびフザリウム・オキシスポルム(Fusarium oxysporum)トリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得られる。

0083

酵母宿主細胞に有用なポリアデニル化配列は、GuoおよびSherman,1995,Mol.Cellular Biol.15:5983−5990に記載されている。

0084

また、制御配列は、ポリペプチドのN−末端に連結したシグナルペプチドをコードし、細胞の分泌経路にポリペプチドを向かわせるシグナルペプチドコード領域であってもよい。ポリヌクレオチドのコード配列の5’−末端は、翻訳リーディングフレーム内で、ポリペプチドをコードするコード配列のセグメントと天然にリンクしたシグナルペプチドコード配列内在的に含有し得る。あるいは、コード配列の5’−末端は、コード配列に対して外来のシグナルペプチドコード配列を含有し得る。外来のシグナルペプチドコード配列は、コード配列が、シグナルペプチドコード配列を天然に含有しない場合に必要となり得る。あるいは、ポリペプチドの分泌を促進するために、天然のシグナルペプチドコード配列を外来のシグナルペプチドコード配列で単に置換してもよい。しかし、発現されたポリペプチドを宿主細胞の分泌経路に向かわせるいずれのシグナルペプチドコード配列を用いてもよい。

0085

細菌宿主細胞のための有効なシグナルペプチドコード配列は、バチルス(Bacillus)NCIB 11837マルトジェニックアミラーゼ、バチルス・リケニホルミス(Bacillus licheniformis)スブチリシン、バチルス・リケニホルミス(Bacillus licheniformis)β−ラクタマーゼ、バチルス・ステアロテルモフィルス(Bacillus stearothermophilus)α−アミラーゼ、バチルス・ステアロテルモフィルス(Bacillus stearothermophilus)中性プロテアーゼ(nprT、nprS、nprM)、および古草菌(Bacillus subtilis)prsAの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード配列である。さらなるシグナルペプチドは、Simonen and Palva,1993,Microbiological Reviews 57:109−137によって記載されている。

0086

糸状真菌宿主細胞のための有効なシグナルペプチドコード配列は、以下:アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)中性アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)グルコアミラーゼ、アスペルギルス・オリゼー(Aspergillus oryzae)TAKAアミラーゼ、フミコラ・インソレンス(Humicola insolens)セルラーゼ、フミコラ・インソレンス(Humicola insolens)エンドグルカナーゼV、フミコラ・ラヌギノサ(Humicola lanuginosa)リパーゼ、およびリゾムコール・ミエヘイ(Rhizomucor miehei)アスパラギン酸プロテイナーゼの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード配列である。

0087

酵母宿主細胞に有用なシグナルペプチドは、以下:サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)α−因子およびサッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)インベルターゼの遺伝子から得られる。他の有用なシグナルペプチドコード配列は、前述のRomanos et al.,1992により記載されている。

0088

制御配列はまた、ポリペプチドのN−末端に位置するプロペプチドをコードするプロペプチドコード配列であり得る。得られたポリペプチドは、酵素原またはプロポリペプチド(または、いくつかの場合においてチモーゲン)として公知である。プロポリペプチドは、一般に非活性であり、プロポリペプチドからのプロペプチドの触媒または自己触媒切断によって活性ポリペプチド転換されることが可能である。プロペプチドコード配列は、古草菌(Bacillus subtilis)アルカリ性タンパク分解酵素(aprE)、古草菌(Bacillus subtilis)中性タンパク分解酵素(nprT)、ミセリオフトラ・テルモフィラ(Myceliophthora thermophila)ラッカーゼ(国際公開第95/33836号パンフレット)、リゾムコール・ミエヘイ(Rhizomucor miehei)アスパラギン酸プロテイナーゼおよびサッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)α−因子の遺伝子から得られ得る。

0089

シグナルペプチドおよびプロペプチド配列の両方が存在する場合、プロペプチド配列は、ポリペプチドのN−末端の隣に位置し、また、シグナルペプチド配列は、プロペプチド配列のN−末端の隣に位置する。

0090

また、宿主細胞の増殖に対してポリペプチドの発現を調節する調節配列を付加することが望ましい場合もある。調節配列の例としては、調節化合物の存在などの化学的または物理的刺激に応じて、遺伝子の発現をオンまたはオフにするものがある。原核系における調節配列としては、lac、tac、およびtrpオペレータ系が挙げられる。調節配列の他の例は、遺伝子増幅を可能にするものである。酵母の場合、ADH2系またはGAL1系を使用することができる。糸状真菌の場合には、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)グルコアミラーゼプロモータ、アスペルギルス・オリゼー(Aspergillus oryzae)TAKAα−アミラーゼプロモータ、およびアスペルギルス・オリゼー(Aspergillus oryzae)グルコアミラーゼプロモータ、トリコデルマ・レエセイ(Trichoderma reesei)セロビオヒドラーゼIプロモータ、およびトリコデルマ・レエセイ(Trichoderma reesei)セロビオヒドラーゼIIプロモータを使用することができる。調節配列の他の例は、遺伝子増幅を可能にするものである。真核生物系では、これらの調節配列は、メトトレキセートの存在下で増幅されるジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、および重金属を用いて増幅されるメタロチオネイン遺伝子を含む。このような場合、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、調節配列に作動可能に連結されている。

0091

発現ベクター
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド、プロモータ、ならびに転写および翻訳終止シグナルを含む組換え発現ベクターに関する。種々のヌクレオチドおよび制御配列が一緒になって、このような部位でポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの挿入または置換を可能とするために1つまたは複数の好都合な制限部位を含み得る組換え発現ベクターが生成される。または、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含む核酸構築物を発現に適切なベクターに挿入することにより発現され得る。発現ベクターの形成において、コード配列は、コード配列が、発現に適切な制御配列と作動可能にリンクするようベクター中に位置されている。

0092

組換え発現ベクターは、組換えDNA法に簡便に供されることが可能であり、ポリヌクレオチドの発現をもたらすことが可能であるいずれかのベクター(例えば、プラスミドまたはウイルス)であり得る。ベクターの選択は、典型的には、ベクターが導入される宿主細胞に対するベクターの親和性に応じることとなる。ベクターは、直鎖または閉鎖された環状プラスミドであり得る。

0093

ベクターは、例えば、プラスミド、染色体外要素、微小染色体、または人工染色体といった、自律複製ベクター(すなわち、染色体外のエンティティとして存在し、その複製が染色体複製から独立しているベクター)であってよい。ベクターは、自己複製を確実とするための何らかの手段を含有してもよい。あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入された際に、ゲノムに組み込まれて、それが組み込まれている染色体と一緒に複製されるものであってもよい。さらに、単一のベクターもしくはプラスミド、または宿主細胞のゲノムに導入しようとする全DNAを互いに含有する2つ以上のベクターもしくはプラスミド、またはトランスポゾンを用いてもよい。

0094

ベクターは、形質転換、形質移入、形質導入等された細胞の選択を容易とする1つまたは複数の選択マーカーを含有することが好ましい。選択マーカーは、その生成物が、殺生剤またはウイルス耐性、重金属に対する耐性、栄養要求体に対する原栄養性等をもたらす遺伝子である。

0095

細菌性選択マーカーの例としては、バチルス・リケニホルミス(Bacillus licheniformis)もしくは古草菌(Bacillus subtilis)のdal遺伝子、またはアンピシリンクロラムフェニコールカナマイシンネオマイシンスペクチノマイシン、またはテトラサイクリン耐性などの抗生物質耐性を付与するマーカーがある。酵母宿主細胞に好適なマーカーとして、これらに限定されないが、ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、およびURA3が挙げられる。糸状真菌宿主細胞に用いられる選択マーカーとして、これらに限定されないが、adeA(ホスホリボシルアミノイミダゾールスクシノカルボキシミドシンターゼ)、adeB(ホスホリボシルアミノイミダゾールシンターゼ)、amdS(アセトアミダーゼ)、argB(オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ)、bar(ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ)、hph(ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ)、niaD(硝酸レダクターゼ)、pyrG(オロチジン−5’−リン酸デカルボキシラーゼ)、sC(硫酸アデニルトランスフェラーゼ)、およびtrpC(アントラニル酸シンターゼ)、ならびにこれらの同等物が挙げられる。アスペルギルス(Aspergillus)細胞で使用するのに好ましいのは、アスペルギルス・ニズランス(Aspergillus nidulans)またはアスペルギルス・オリゼー(Aspergillus oryzae)amdSおよびpyrG遺伝子ならびにストレプトマイセス・ハイグロスコピクス(Streptomyces hygroscopicus)bar遺伝子である。トリコデルマ(Trichoderma)細胞で使用するのに好ましいのは、adeA、adeB、amdS、hph、およびpyrG遺伝子である。

0096

ベクターは、宿主細胞のゲノムへのベクターの統合、またはゲノムとは無関係の細胞中のベクターの自律複製を許容する要素を含有することが好ましい。

0097

宿主細胞ゲノムへの統合に関して、ベクターは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列、または相同的もしくは非相同的組換えによるゲノムへの統合に係るベクターのいずれかの他の要素に依存し得る。または、ベクターは、染色体における正確な位置での宿主細胞のゲノムへの相同的組換えによる統合をもたらす追加のポリヌクレオチドを含有していてもよい。正確な位置で統合される可能性を高めるために、統合要素は、相同的組換えの確率を高めるために対応する標的配列に対して高度の配列同一性を有する、100〜10,000塩基対、400〜10,000塩基対および800〜10,000塩基対などの十分な数の核酸を含有しているべきである。統合要素は、宿主細胞のゲノム中の標的配列と相同的であるいずれかの配列であり得る。さらに、統合要素は、非コーディングまたはコーディングポリヌクレオチドであり得る。他方で、ベクターは、非相同的組換えにより宿主細胞のゲノムに統合され得る。

0098

自律複製に関して、ベクターは、対象の宿主細胞におけるベクターの自律的な複製を可能とする複製起点をさらに含んでいてもよい。複製起点は、細胞において機能する自律複製を媒介するいずれかのプラスミドレプリケータであり得る。「複製起点」または「プラスミドレプリケータ」という用語は、インビボでのプラスミドまたはベクターの複製を可能とするポリヌクレオチドを意味する。

0099

細菌性複製起点の例は、大腸菌(E.coli)における複製を許容するプラスミドpBR322、pUC19、pACYC177およびpACYC184の複製起点、ならびにバチルス属(Bacillus)における複製を許容するpUB110、pE194、pTA1060およびpAMβ1の複製起点である。

0100

酵母宿主細胞で使用する複製起点の例は、2μ複製起点、ARS1、ARS4、ARS1およびCEN3の組み合わせ、ARS4およびCEN6の組み合わせである。

0101

糸状真菌細胞において有用な複製起点の例は、AMA1およびANS1(Gems et al.,1991,Gene 98:61−67;Cullen et al.,1987,Nucleic AcidsRes.15:9163−9175;国際公開第00/24883号パンフレット)である。AMA1遺伝子の単離および上記遺伝子を含むプラスミドもしくはベクターの構築は、国際公開第00/24883号パンフレットに開示されている方法に従って達成することができる。

0102

本発明のポリヌクレオチドの2つ以上のコピーが宿主細胞に挿入されて、ポリペプチドの生成が高められてもよい。ポリヌクレオチドのコピーの数は、配列の少なくとも1つの追加のコピーを宿主細胞ゲノムに統合することにより、または増幅可能な選択マーカー遺伝子をポリヌクレオチドに含めることにより増加させることが可能であり、ここで、選択マーカー遺伝子の増幅されたコピー、従って、ポリヌクレオチドの追加のコピーを含有する細胞は、適切な選択可能な薬剤中で細胞を培養することにより選択可能である。

0103

上記の要素を連結して本発明の組換え発現ベクターを構築するために用いられる手法は、当業者に周知である(例えば、前述のSambrook et al.,1989を参照のこと)。

0104

宿主細胞
本発明はまた、本発明のポリペプチドの生成を指令する1つまたは複数の制御配列に作動可能にリンクされている本発明のポリヌクレオチドを含む、組換え宿主細胞にも関する。ポリヌクレオチドを含む構築物もしくはベクターは、構築物もしくはベクターが染色体性組み込み体として、または既述の自己複製染色体外ベクターとして維持されるよう宿主細胞に導入される。「宿主細胞」という用語は、複製の最中に生じる突然変異により、親細胞と同一ではない親細胞のあらゆる子孫を包含する。宿主細胞の選択は、ポリペプチドをコードする遺伝子およびその供給源に応じて大きく変わるであろう。

0105

宿主細胞は、本発明のポリペプチドの組換え生成に有用なあらゆる細胞(例えば、原核生物)であってよい。

0106

原核生物宿主細胞は、いずれかのグラム陽性またはグラム陰性細菌であってよい。グラム陽性細菌としては、これらに限定されないが、バチルス属(Bacillus)、クロストリジウム属(Clostridium)、エンテロコッカス属(Enterococcus)、ゲオバチルス属(Geobacillus)、ラクトバチルス属(Lactobacillus)、ラクトコッカス属(Lactococcus)、オセアノバチルス属(Oceanobacillus)、スタフィロコッカス属(Staphylococcus)、ストレプトコッカス属(Streptococcus)、およびストレプトマイセス属(Streptomyces)が挙げられる。グラム陰性細菌としては、これらに限定されないが、カムピロバクター属(Campylobacter)、大腸菌(E.coli)、フラボバクテリウム属(Flavobacterium)、フソバクテリウム属(Fusobacterium)、ヘリコバクター属(Helicobacter)、イリオバクター属(Ilyobacter)、ネイッセリア属(Neisseria)、シュードモナス属(Pseudomonas)、サルモネラ属(Salmonella)、およびウレアプラズマ属(Ureaplasma)が挙げられる。

0107

細菌宿主細胞は、これらに限定されないが、バチルス・アルカロフィルス(Bacillus alkalophilus)、バチルス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)、バチルス・ブレビス(Bacillus brevis)、バチルス・シルクランス(Bacillus circulans)、バチルス・クラウシイ(Bacillus clausii)、バチルス・コアグランス(Bacillus coagulans)、バチルス・フィルムス(Bacillus firmus)、バチルス・ラウツス(Bacillus lautus)、バチルス・レンツス(Bacillus lentus)、バチルス・リケニホルミス(Bacillus licheniformis)、バチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)、バチルス・プミルス(Bacillus pumilus)、バチルス・ステアロテルモフィルス(Bacillus stearothermophilus)、古草菌(Bacillus subtilis)、およびバチルス・チューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis)細胞を含むいずれかのバチルス(Bacillus)細胞であってよい。

0108

細菌宿主細胞はまた、これらに限定されないが、ストレプトコッカス・エクイシミリス(Streptococcus equisimilis)、化膿レンサ球菌(Streptococcus pyogenes)、ストレプトコッカス・ウベリス(Streptococcus uberis)、およびストレプトコッカス・ズーエピデミカス(Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus)細胞を含むいずれかのストレプトコッカス(Streptococcus)細胞であってもよい。

0109

細菌宿主細胞はまた、これらに限定されないが、ストレプトマイセス・アクロモゲネス(Streptomyces achromogenes)、ストレプトマイセス・アベルチリス(Streptomyces avermitilis)、ストレプトマイセス・コエリコロル(Streptomyces coelicolor)、ストレプトマイセス・グリセウス(Streptomyces griseus)、およびストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans)細胞を含むいずれかのストレプトマイセス(Streptomyces)細胞であってもよい。

0110

バチルス(Bacillus)細胞へのDNAの導入は、プロトプラスト形質転換(例えば、Chang and Cohen,1979,Mol.Gen.Genet.168:111−115を参照のこと)、コンピテント細胞形質転換(例えば、Young and Spizizen,1961,J.Bacteriol.81:823−829、またはDubnau and Davidoff−Abelson,1971,J.Mol.Biol.56:209−221を参照のこと)、電気穿孔法(例えば、Shigekawa and Dower,1988,Biotechniques 6:742−751を参照のこと)、または接合により(例えば、Koehler and Thorne,1987,J.Bacteriol.169:5271−5278を参照のこと)行われ得る。大腸菌(E.coli)細胞へのDNAの導入は、プロトプラスト形質転換(例えば、Hanahan,1983,J.Mol.Biol.166:557−580を参照のこと)または電気穿孔法(例えば、Dower et al.,1988,Nucleic AcidsRes.16:6127−6145を参照のこと)により行われ得る。ストレプトマイセス(Streptomyces)細胞へのDNAの導入は、プロトプラスト形質転換、電気穿孔法(例えば、Gong et al.,2004,Folia Microbiol.(Praha)49:399−405を参照のこと)、接合(例えば、Mazodier et al.,1989,J.Bacteriol.171:3583−3585)、または形質導入(例えば、Burke et al.,2001,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98:6289−6294を参照のこと)により行われ得る。シュードモナス(Pseudomonas)細胞へのDNAの導入は、電気穿孔法(例えば、Choi et al.,2006,J.Microbiol.Methods 64:391−397)または接合(例えば、Pinedo and Smets,2005,Appl.Environ.Microbiol.71:51−57を参照のこと)により行われ得る。ストレプトコッカス(Streptococcus)細胞へのDNAの導入は、天然の受容能(例えば、Perry and Kuramitsu,1981,Infect.Immun.32:1295−1297を参照のこと)、プロトプラスト形質転換(例えば、Catt and Jollick,1991,Microbios 68:189−207を参照のこと)、電気穿孔(例えば、Buckley et al.,1999,Appl.Environ.Microbiol.65:3800−3804を参照のこと)、または接合(例えば、Clewell,1981,Microbiol.Rev.45:409−436を参照のこと)により行われ得る。しかし、宿主細胞にDNAを導入するための、当技術分野では公知のいずれの方法を用いてもよい。

0111

宿主細胞はまた、真核生物、例えば、哺乳動物昆虫、植物、または真菌細胞であってもよい。

0112

宿主細胞は、真菌細胞であってもよい。本明細書で用いる「真菌」は、子嚢菌(Ascomycota)門、担子菌(Basidiomycota)門、ツボカビ(Chytridiomycota)門、および接合菌(Zygomycota門)、ならびに菌(Oomycota)門およびあらゆる栄養胞子形成菌(Hawksworth et al.,In,Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi,8th edition,1995,CAB International,University Press,Cambridge,UKにより定義されている通り)を含む。

0113

真菌宿主細胞は、酵母細胞であってもよい。本明細書で用いる「酵母」は、有子嚢胞子酵母(エンドケス目(Endomycetales))、担子菌酵母、および不完全菌類(Fungi imperfecti)(不完全酵母菌(Blastomycetes))に属する酵母を含む。酵母の分類法は、将来変わり得ることから、本発明の目的のために、酵母は、Biology and Activities of Yeast(Skinner,Passmore,and Davenport,editors,Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9,1980)に記載の通りに定義されるものとする。

0114

酵母宿主細胞は、カンジダ(Candida)、ハンセヌラ(Hansenula)、クルイベロマイセス(Kluyveromyces)、ピチア(Pichia)、サッカロマイセス(Saccharomyces)、シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)、もしくはヤロウイア(Yarrowia)細胞、例えば、クルイベロマイセス・ラクチス(Kluyveromyces lactis)、サッカロマイセス・カルスベルゲンシス(Saccharomyces carlsbergensis)、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、サッカロマイセス・ジアスタチクス(Saccharomyces diastaticus)、サッカロマイセス・ドウグラシイ(Saccharomyces douglasii)、サッカロマイセス・クルイベリ(Saccharomyces kluyveri)、サッカロマイセス・ノルベンシス(Saccharomyces norbensis)、サッカロマイセス・オビホルミス(Saccharomyces oviformis)、またはヤロウイア・リポリティカ(Yarrowia lypolytica)細胞であってよい。

0115

真菌宿主細胞は、糸状真菌細胞であってもよい。「糸状真菌」は、真菌(Eumycota)門および卵菌(Oomycota)門(前述のHawksworth et al.,1995に定義される通り)のあらゆる糸状形態を包含する。糸状真菌は、概して、キチンセルロースグルカンキトサンマンナン、およびその他の複合多糖類から構成される菌糸壁を特徴とする。栄養成長は、菌糸伸長によるものであり、炭素異化作用は、絶対嫌気性である。対照的に、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)のような酵母による栄養成長は、単細胞葉状体出芽によるものであり、炭素異化作用は、発酵性であり得る。

0116

糸状真菌宿主細胞は、アクレモニウム(Acremonium)、アスペルギルス(Aspergillus)、アウレオバシジウム(Aureobasidium)、ヤケイタケ(Bjerkandera)、セリポリオプシス(Ceriporiopsis)、クリソスポリウム(Chrysosporium)、ヒトヨタケ(Coprinus)、カワラタケ(Coriolus)、クリプトコッカス(Cryptococcus)、フィリバシジウム(Filibasidium)、フザリウム(Fusarium)、フミコラ(Humicola)、マグナポルテ(Magnaporthe)、ムコール(Mucor)、ミセリオフトラ(Myceliophthora)、ネオカリマスチクス(Neocallimastix)、ニューロスポラ(Neurospora)、パエシロマイセス(Paecilomyces)、ペニシリウム(Penicillium)、ファネロケーテ(Phanerochaete)、シワウロコタケ(Phlebia)、ピロマイセス(Piromyces)、ヒラタケ(Pleurotus)、シゾフィルム(Schizophyllum)、タラロマイセス(Talaromyces)、テルモアスクス(Thermoascus)、チエラビア(Thielavia)、トリポクラジウム(Tolypocladium)、カワラタケ(Trametes)、またはトリコデルマ(Trichoderma)細胞であってよい。

0117

例えば、糸状真菌宿主細胞は、アスペルギルス・アワモリ(Aspergillus awamori)、アスペルギルス・フォエティダス(Aspergillus foetidus)、アスペルギルス・フミガーツス(Aspergillus fumigatus)、アスペルギルス・ジャポニクス(Aspergillus japonicus)、アスペルギルス・ニズランス(Aspergillus nidulans)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、アスペルギルス・オリゼー(Aspergillus oryzae)、ヤケイロタケ(Bjerkandera adusta)、セリポリオプシス・アネイリナ(Ceriporiopsis aneirina)、セリポリオプシス・カレジエア(Ceriporiopsis caregiea)、セリポリオプシス・ギルベッセンス(Ceriporiopsis gilvescens)、セリポリオプシス・パノシンタ(Ceriporiopsis pannocinta)、セリポリオプシス・リブロサ(Ceriporiopsis rivulosa)、セリポリオプシス・サブルファ(Ceriporiopsis subrufa)、セリポリオプシス・サブベルミスプラ(Ceriporiopsis subvermispora)、クリソスポリウム・イノプス(Chrysosporium inops)、クリソスポリウム・ケラチノフィルム(Chrysosporium keratinophilum)、クリソスポリウム・ルクノウェンス(Chrysosporium lucknowense)、クリソスポリウム・メルダリウム(Chrysosporium merdarium)、クリソスポリウム・パンニコラ(Chrysosporium pannicola)、クリソスポリウム・クイーンスラジクム(Chrysosporium queenslandicum)、クリソスポリウム・トロピクム(Chrysosporium tropicum)、クリソスポリウム・ゾナツム(Chrysosporium zonatum)、コプリヌス・シネレウス(Coprinus cinereus)、コリオルス・ヒルスツス(Coriolus hirsutus)、フザリウム・バクトリジオイデス(Fusarium bactridioides)、フザリウム・セレアリス(Fusarium cerealis)、フザリウム・クロークウェレンス(Fusarium crookwellense)、フザリウム・クルモルム(Fusarium culmorum)、フザリウム・グラミネアルム(Fusarium graminearum)、フザリウム・グラミヌム(Fusarium graminum)、フザリウム・ヘテロスポルム(Fusarium heterosporum)、フザリウム・ネグンディ(Fusarium negundi)、フザリウム・オキシスポルム(Fusarium oxysporum)、フザリウム・レチクラツム(Fusarium reticulatum)、フザリウム・ロゼウム(Fusarium roseum)、フザリウム・サムブシヌム(Fusarium sambucinum)、フザリウム・サルコクロウム(Fusarium sarcochroum)、フザリウム・スポロトリキオイデス(Fusarium sporotrichioides)、フザリウム・スルフレウム(Fusarium sulphureum)、フザリウム・トルロスム(Fusarium torulosum)、フザリウム・トリコテシオイデス(Fusarium trichothecioides)、フザリウム・ベネナツム(Fusarium venenatum)、フミコラ・インソレンス(Humicola insolens)、フミコラ・ラヌギノサ(Humicola lanuginosa)、ムコール・ミエヘイ(Mucor miehei)、ミセリオフトラ・テルモフィラ(Myceliophthora thermophila)、ニューロスポラ・クラッサ(Neurospora crassa)、ペニシリウム・プルプロゲヌム(Penicillium purpurogenum)、ファネロケーテ・クリソスポリウム(Phanerochaete chrysosporium)、フレビア・ラジアータ(Phlebia radiata)、プレウロツス・エリンギ(Pleurotus eryngii)、チエラビア・テルレストリス(Thielavia terrestris)、トラメテス・ビロサ(Trametes villosa)、トラメテス・ベルシカラー(Trametes versicolor)、トリコデルマ・ハルジアヌム(Trichoderma harzianum)、トリコデルマ・コニンギイ(Trichoderma koningii)、トリコデルマ・ロンギブキアツム(Trichoderma longibrachiatum)、トリコデルマ・レエセイ(Trichoderma reesei)、またはトリコデルマ・ビリデ(Trichoderma viride)細胞であってよい。

0118

真菌細胞は、それ自体知られている方法で、プロトプラストの形成、プロトプラストの形質転換、および細胞壁再生を含む工程により形質転換することができる。アスペルギルス(Aspergillus)およびトリコデルマ(Trichoderma)宿主細胞を形質転換する好適な手順は、欧州特許第238023号明細書、Yelton et al.,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:470−1474、およびChristensen et al.,1988,Bio/Technology 6:1419−1422に記載されている。フザリウム(Fusarium)種を形質転換する適切な方法は、Malardier et al.,1989,Gene 78:147−156、および国際公開第96/00787号パンフレットに記載されている。酵母は、次の文献に記載されている手順を使用して形質転換することができる:Becker and Guarente,In Abelson,J.N. and Simon,M.I.,editors,Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology,Methodsin Enzymology,Volume 194,pp 182−187,Academic Press,Inc.,New York;Ito et al.,1983,J.Bacteriol.153:163;およびHinnen et al.,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75:1920。

0119

生成方法
本発明はまた、本発明のポリペプチドを生成する方法であって、以下:(a)ポリペプチドの生成を促進する条件下で本発明の組換え宿主細胞を培養するステップ;および任意選択で(b)ポリペプチドを回収するステップを含む方法にも関する。

0120

宿主細胞は、当技術分野で公知の方法を用いて、ポリペプチドの生成に好適な栄養培地中で培養する。例えば、細胞は、好適な培地中ならびにポリペプチドの発現および/または単離が可能な条件下で、振盪フラスコ培養により、または実験用もしくは産業用発酵槽における小規模もしくは大規模発酵(連続式バッチ式、フェドバッチ式または固体状発酵を含む)により培養してよい。培養は、炭素源および窒素源と、無機塩類とを含む好適な栄養培地において、当技術分野では公知の手順を用いて行なわれる。好適な培地は、供給業者から入手可能であるか、または(例えば、米国微生物系統保存機関(American Type Culture Collection)のカタログにおいて)公開されている組成に従って調製してもよい。ポリペプチドが栄養培地中に分泌される場合は、ポリペプチドを培地から直接回収することができる。ポリペプチドが分泌されない場合は、細胞溶解物からこれを回収することができる。

0121

ポリペプチドは、ポリペプチドの専門分野において公知の方法を用いて検出することができる。これらの検出方法としては、これらに限定されないが、特定の抗体の使用、酵素産物の形成、または酵素基質の消失が挙げられる。例えば、酵素アッセイを用いてポリペプチドの活性を測定してもよい。

0122

ポリペプチドは、当技術分野において公知の方法を用いて回収することができる。例えば、これらに限定されないが、収集遠心分離、ろ過、抽出、噴霧乾燥蒸発、または沈殿などの従来の手順により栄養培地からポリペプチドを回収することができる。一態様では、ポリペプチドを含む発酵ブロスを回収する。

0123

ポリペプチドは、実質的に純粋なポリペプチドを得るために、当技術分野で公知の様々な方法により精製することができ、こうした方法として、これらに限定されないが、クロマトグラフィ(例えば、イオン交換、親和性、疎水性クロマトフォーカシング、およびサイズ排除)、電気泳動法(例えば、分取等電点電気泳動)、較差溶解度(例えば、硫酸アンモニウム沈殿)、SDS−PAGE、または抽出(例えば、Protein Purification,Janson and Ryden,editors,VCH Publishers,New York,1989を参照のこと)が挙げられる。

0124

代替的な態様においては、ポリペプチドを回収するのではなく、ポリペプチドを発現する本発明の宿主細胞をポリペプチドの供給源として用いる。

0125

発酵ブロス調合物または細胞組成物
本発明はまた、本発明のポリペプチドを含む発酵ブロス調合物または細胞組成物にも関する。発酵ブロス製品は、さらに、発酵工程に用いる別の成分、例えば、細胞(目的のポリペプチドを生成するのに用いられる本発明のポリペプチドをコードする遺伝子を含有する宿主細胞など)、細胞残屑、バイオマス、発酵培地および/または発酵産物なども含む。一部の実施形態では、組成物は、有機酸死滅細胞および/または細胞残屑、ならびに培地を含有する細胞死滅ブロスである。

0126

本明細書で用いる場合、「発酵ブロス」という用語は、回収および/もしくは精製に一切付されないか、または最小限にしか付されない細胞発酵により生成される調製物を指す。例えば、発酵ブロスは、微生物培養物飽和まで増殖させ、タンパク質合成(例えば、宿主細胞による酵素の発現)および細胞培地への分泌を可能にする炭素制限条件下インキュベートする際に生成される。発酵ブロスは、発酵の終わりに得られる発酵物質の未分画もしくは分画成分を含有していてもよい。典型的に、発酵ブロスは、未分画であり、微生物細胞(例えば、糸状真菌細胞)を、例えば遠心分離により除去した後に存在する使用済み培地および細胞残屑を含む。一部の実施形態では、発酵ブロスは、使用済み細胞培地、細胞外酵素、ならびに生育可能なおよび/または生育不能な微生物細胞を含む。

0127

一実施形態では、発酵ブロス調合物および細胞組成物は、少なくとも1つの1〜5炭素有機酸および/またはその塩を含む第1有機酸成分と、少なくとも1つの6以上の炭素有機酸および/またはその塩を含む第2有機酸成分とを含む。特定の実施形態では、第1有機酸成分は、酢酸ギ酸プロピオン酸、それらの塩、またはこれらのうちの2つ以上の混合物であり、また、第2有機酸成分は、安息香酸シクロヘキサンカルボン酸、4−メチル吉草酸フェニル酢酸、それらの塩、またはこれらのうちの2つ以上の混合物である。

0128

一態様では、組成物は、有機酸を含み、また任意選択で、死滅細胞および/または細胞残屑も含有する。一実施形態では、死滅細胞および/または細胞残屑は、これらの成分を含まない組成物を提供するために、細胞死滅全ブロスから除去される。

0129

発酵ブロス調合物または細胞組成物は、防腐剤および/または抗菌(例えば、静菌)剤を含んでもよく、このようなものとして、限定しないが、ソルビトール塩化ナトリウムソルビン酸カリウム、および当技術分野では公知の他の物質などが挙げられる。

0130

細胞死滅全ブロスまたは組成物は、発酵の終わりに得られる発酵物質の未分画成分を含んでもよい。典型的に、細胞死滅全ブロスまたは組成物は、微生物細胞(例えば、糸状真菌細胞)を飽和まで増殖させ、タンパク質合成を可能にする炭素制限条件下でインキュベートした後に存在する使用済み培地および細胞残屑を含有する。一部の実施形態では、細胞死滅全ブロスまたは組成物は、使用済み細胞培地、細胞外酵素、ならびに死滅糸状真菌細胞を含有する。一部の実施形態では、細胞死滅全ブロスまたは組成物中に存在する微生物細胞を、当技術分野では公知の方法を用いて、透過性にするか、および/または溶解させることができる。

0131

本明細書に記載する全ブロスまたは組成物は、典型的に、液体であるが、死滅細胞、細胞残屑、培地成分、および/または不溶性酵素などの不溶性成分を含有してもよい。一部の実施形態では、清澄化した液体組成物を提供するために、不溶性成分を除去してもよい。

0132

本発明の全ブロス調合物および細胞組成物は、国際公開第90/15861号パンフレットまたは国際公開第2010/096673号パンフレットに記載の方法によって生成してもよい。

0133

発酵ブロス
本発明の発酵ブロスは、目的のタンパク質を産生する細胞を含み、目的のタンパク質は、その一部が、結晶および/または非晶質沈殿物として存在する。

0134

当技術分野で公知の任意の細胞を使用してよい。細胞は、微生物または哺乳動物細胞であってよい。本発明の微生物は、任意の属の微生物であってよい。

0135

好ましい実施形態において、目的のタンパク質は、細菌または真菌ソースから取得することができる。

0136

例えば、目的のタンパク質は、バチルス(Bacillus)株、例えば、バチルス・アルカロフィルス(Bacillus alkalophilus)、バチルス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)、バチルス・ブレビス(Bacillus brevis)、バチルス・シルクランス(Bacillus circulans)、バチルス・コアグランス(Bacillus coagulans)、バチルス・ラウツス(Bacillus lautus)、バチルス・レンツス(Bacillus lentus)、バチルス・リケニホルミス(Bacillus licheniformis)、バチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)、バチルス・ステアロテルモフィルス(Bacillus stearothermophilus)、古草菌(Bacillus subtilis)、もしくはバチルス・チューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis);またはストレプトマイセス(Streptomyces)株、例えば、ストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans)もしくはストレプトマイセス・ミュナス(Streptomyces murinus)などのグラム陽性細菌;またはグラム陰性細菌、例えば、大腸菌(E.coli)もしくはシュードモナス属種から得ることができる。好ましい実施形態では、細胞は、バチルス(Bacillus)細胞である。

0137

目的のタンパク質は、真菌供給源、例えば、カンジダ(Candida)、クルイベロマイセス(Kluyveromyces)、ピチア(Pichia)、サッカロマイセス(Saccharomyces)、シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)またはヤロウイア(Yarrowia)株、例えば、サッカロマイセス・カルスベルゲンシス(Saccharomyces carlsbergensis)、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、サッカロマイセス・ジアスタチクス(Saccharomyces diastaticus)、サッカロマイセス・ドウグラシイ(Saccharomyces douglasii)、サッカロマイセス・クルイベリ(Saccharomyces kluyveri)、サッカロマイセス・ノルベンシス(Saccharomyces norbensis)もしくはサッカロマイセス・オビホルミス(Saccharomyces oviformis)株などの酵母株から取得することができる。

0138

目的のタンパク質は、アクレモニウム(Acremonium)、アスペルギルス(Aspergillus)、アウレオバシジウム(Aureobasidium)、クリプトコッカス(Cryptococcus)、フィリバシジウム(Filibasidium)、フザリウム(Fusarium)、フミコラ(Humicola)、マグナポルテ(Magnaporthe)、ムコール(Mucor)、ミセリオフトラ(Myceliophthora)、ネオカリマスチクス(Neocallimastix)、ニューロスポラ(Neurospora)、パエシロマイセス(Paecilomyces)、ペニシリウム(Penicillium)、ピロマイセス(Piromyces)、シゾフィルム(Schizophyllum)、タラロマイセス(Talaromyces)、テルモアスクス(Thermoascus)、チエラビア(Thielavia)、トリポクラジウム(Tolypocladium)、またはトリコデルマ(Trichoderma)株などの糸状真菌株から取得することができ、特に、目的のポリペプチドは、アスペルギルス・アクレアツス(Aspergillus aculeatus)、アスペルギルス・アワモリ(Aspergillus awamori)、アスペルギルス・フォエティダス(Aspergillus foetidus)、アスペルギルス・ジャポニクス(Aspergillus japonicus)、アスペルギルス・ニズランス(Aspergillus nidulans)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、アスペルギルス・オリゼー(Aspergillus oryzae)、フザリウム・バクトリジオイデス(Fusarium bactridioides)、フザリウム・セレアリス(Fusarium cerealis)、フザリウム・クロークウェレンス(Fusarium crookwellense)、フザリウム・クルモルム(Fusarium culmorum)、フザリウム・グラミネアルム(Fusarium graminearum)、フザリウム・グラミヌム(Fusarium graminum)、フザリウム・ヘテロスポルム(Fusarium heterosporum)、フザリウム・ネグンディ(Fusarium negundi)、フザリウム・オキシスポルム(Fusarium oxysporum)、フザリウム・レチクラツム(Fusarium reticulatum)、フザリウム・ロゼウム(Fusarium roseum)、フザリウム・サムブシヌム(Fusarium sambucinum)、フザリウム・サルコクロウム(Fusarium sarcochroum)、フザリウム・スポロトリキオイデス(Fusarium sporotrichioides)、フザリウム・スルフレウム(Fusarium sulphureum)、フザリウム・トルロスム(Fusarium torulosum)、フザリウム・トリコテシオイデス(Fusarium trichothecioides)、フザリウム・ベネナツム(Fusarium venenatum)、フミコラ・インソレンス(Humicola insolens)、フミコラ・ラヌギノサ(Humicola lanuginosa)、ムコール・ミエヘイ(Mucor miehei)、ミセリオフトラ・テルモフィラ(Myceliophthora thermophila)、ニューロスポラ・クラッサ(Neurospora crassa)、ペニシリウム・プルプロゲヌム(Penicillium purpurogenum)、トリコデルマ・ハルジアヌム(Trichoderma harzianum)、トリコデルマ・コニンギイ(Trichoderma koningii)、トリコデルマ・ロンギブラキアツム(Trichoderma longibrachiatum)、トリコデルマ・レエセイ(Trichoderma reesei)、またはトリコデルマ・ビリデ(Trichoderma viride)株から取得することができる。

0139

これらの種の株は、いくつかの微生物保存機関、例えば、米国微生物系統保存機関(American Type Culture Collection)(ATCC)、ドイツ微生物細胞培養コレクション(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)(DSM)、オランダの微生物保存機関(Centraalbureau Voor Schimmelcultures)(CBS)、および農業研究局特許培養物コレクション、リサーチセンター(Agricultural Research Service Patent Culture Collection、Northern Regional Research Center(NRRL)において容易に一般に入手可能である。

0140

好ましい実施形態において、本発明の細胞は、単一細胞である。一部の真菌は、酵母様形態で産生され得る。真菌細胞はまた、国際公開第2005/042758号パンフレットに記載されているように、断片化および/または破砕してもよい。

0141

本発明の目的のために、「〜から得られる」という用語は、所与のソースに関連して本明細書で用いられるとき、目的のタンパク質が、ソースによって産生されるか、またはソース由来の遺伝子が挿入された細胞によって産生されることを意味する。

0142

細胞は、当技術分野で公知の任意の方法により発酵させることもできる。発酵培地は、複合窒素源および/または炭素源、例えば、ダイズミール綿実粕、コーンスティープリカー酵母エキスカゼイン加水分解物、モラッセなどを含む複合培地であってよい。発酵培地は、例えば、国際公開第98/37179号パンフレットに定義されているように、既知組成培地であってもよい。

0143

発酵培地中のいくつかの商業的成分は、可溶性ではなく、非消化性成分を含有し、これらの成分は、発酵工程で発酵培地中に残留するため、発酵後に所望のタンパク質から分離する必要がある。従って、当業者であれば、発酵後の発酵培地が、本発明によれば、一部が結晶または非晶質形態である目的のタンパク質、細胞および細胞残屑ならびに発酵培地の不溶性残渣などのいくつかの固体成分を含むことは理解されよう。

0144

発酵は、フェドバッチ、反復フェドバッチ、または連続発酵工程として実施してよい。

0145

発酵中、目的のタンパク質が産生されるが、効率的な産業的発酵の場合、目的のタンパク質は、その可溶性を超える濃度で産生されるため、目的のタンパク質が沈殿することが往々にして観測される。

0146

目的のタンパク質の沈殿は、発酵後の目的のタンパク質の精製に際し当業者に課題をもたらし、精製工程では、細胞、細胞残屑および増殖培地の固体残渣を、ろ過などの公知の固体/液体分離方法で液体から分離する。目的のタンパク質が、固体形態で完全にまたは部分的に利用可能であれば、これは、分離工程で固体を維持するため、収率を低下させることになる。

0147

本発明の方法は、目的のタンパク質を精製する方法を提供し、ここで、目的のタンパク質は、結晶形態もしくは非晶質形態またはこれらの混合物のいずれかの固体形態で存在する。タンパク質ならびに他の化学化合物は、タンパク質の濃度が固溶限界を超えると、溶液から沈殿することは当技術分野ではよく知られている。従って、本発明の方法は、多量に目的のタンパク質を生成する場合に、特に有用である。従って、発酵ブロス中の目的のタンパク質の濃度は、好ましくは3g/l超、例えば4g/l超、例えば5g/l超、例えば6g/l超、例えば7g/l超、例えば8g/l超、例えば9g/l超、例えば10g/l超、例えば11g/l超、例えば12g/l超、例えば13g/l超、例えば14g/l超、例えば15g/l超、例えば16g/l超、例えば17g/l超、例えば18g/l超、例えば19g/l超、例えば20g/l超である。

0148

固体形態という用語は、本明細書および特許請求の範囲において、目的のタンパク質の産生が、特定のタンパク質の固溶限界を超える十分に高いレベルに達したとき、発酵ブロス中に認められる固体形態を表すために使用される。固体形態は、結晶形態であってもよく、これは、規則的形状および角度を特徴とし、構造全体を通して同じ分子構成を有する構造で、分子が規則的に配置されていることを意味する。典型的に、結晶は、結晶の規則的構成のために、固定角で光を回折させることができる。固体形態はまた、非晶質形態であってもよく、これは、結晶に認められるものより非規則的に分子が配置され、かつ分子の構成が構造の部分によって異なる、非規則的構造として理解される。また、固体形態は、部分的に結晶形態であってもよく、この場合、材料の一部が結晶形態であり、これは、非晶質形態である固体材料の別の部分と混合している。目的のタンパク質が発酵ブロス中に存在する固体形態は、本発明を何ら限定するものではなく、反対に、本発明の方法は、発酵ブロスのpHでの溶解度と比較して、低pHで、より溶解性である特性を有するあらゆる目的のタンパク質に適している。

0149

pHの調節のためにほぼあらゆる酸を使用することができる。酸は、無機または有機のいずれであってもよい。いくつかの例として、塩酸、硫酸、亜硫酸亜硝酸リン酸、酢酸、クエン酸、およびギ酸がある。当業者は、一般に、費用、および後の精製工程でいずれの酸が許容可能であるかに関する考慮に基づいて、本発明の目的に好適な酸を選択することができるであろう。好ましい酸は、リン酸、ギ酸、クエン酸、および酢酸である。

0150

発酵ブロスのpHを低pHに調節すると、目的のタンパク質の溶解度が、pHの変化のために上昇することから、タンパク質は再び可溶化し始める。固体形態の目的のタンパク質の溶解は、容器内での特定の条件および特定のタンパク質の特性に応じて急速となるか、または緩徐となり得る。他の溶解過程と同様に、混合物を攪拌しない対応する状況と比較して、例えば、混合物の攪拌により、攪拌した混合物中で加速される。

0151

pHの調節後、発酵ブロスを後処理工程、例えば、1つまたは複数の精製ステップで処理する前に、目的のタンパク質を溶解させるために保持期間を設けてもよい。保持期間は、後処理前に目的のタンパク質の満足な溶解を確実にするように十分な長さとすべきである。典型的には、保持期間は、少なくとも5分、例えば少なくとも10分、例えば少なくとも20分、例えば少なくとも30分、例えば少なくとも40分、例えば少なくとも50分、例えば少なくとも60分、例えば少なくとも70分、例えば少なくとも80分、例えば少なくとも90分、例えば少なくとも100分、例えば少なくとも110分、例えば少なくとも120分である。

0152

pHの調節および任意選択の保持期間後、所望の最終生成物を取得するために、目的のタンパク質を含む発酵ブロスを後処理する。典型的には、後処理の第1ステップは、目的のタンパク質を溶解状態で含有する発酵ブロスの液体部分を不溶性部分、例えば、細胞および細胞残屑および増殖培地の残渣から分離する分離工程である。本発明は、いずれか特定のタイプの分離工程に限定されるわけではなく、原則として、不溶性物質から液体を分離することができるあらゆるタイプの分離工程、例えば、ろ過、遠心分離またはデカンテーションを使用することができる。分離後、所望の形態、純度および製剤で目的のタンパク質を取得するために、さらなるステップ、例えば、濃縮、クロマトグラフィ、安定化、噴霧乾燥、造粒を適用することができる。

0153

本発明の方法は、固体/液体分離前に、発酵ブロスの前処理をさらに含んでもよく、こうした前処理として、例えば、発酵ブロスを水または水溶液で希釈する希釈ステップ、塩の添加または精製の際に有益な作用を有する他の化合物(例えば、ポリマーもしくは安定剤など)の添加がある。前処理ステップは、pHをヒスチジンのpKaを下回る値に調節する前または後のいずれに行ってもよい。

0154

好ましい実施形態
本発明を、以下の実施形態によって説明する:
1.タンパク質生成物を精製する方法であって、タンパク質の少なくとも一部は、タンパク質の表面に位置する2〜6個のヒスチジン残基を有し、この方法は以下:
a.発酵ブロスを提供するステップ、
b.任意選択で、ヒスチジン側鎖のpKaを下回る値にpHを調節するステップ、
c.任意選択で、混合物をある期間にわたって保持するステップ、および
d.発酵ブロスからの固体材料の少なくとも一部から、溶解したタンパク質生成物を分離するステップ
を含むステップで行われる、方法。
2.ヒスチジン側鎖のpKaが6.0である、実施形態1の方法。
3.タンパク質の表面に位置する2〜6個のヒスチジンが、一次配列の内部に配置される、実施形態1または2の方法。
4.目的のタンパク質の表面の2〜6個のヒスチジン残基の少なくとも1つが、置換または挿入によりもたらされる、実施形態3の方法。
5.タンパク質の表面に位置する2〜6個のヒスチジンが、タンパク質のC−および/またはN−末端延伸の形態である、実施形態1または2の方法。
6.タンパク質生成物が酵素である、実施形態1〜5の方法。
7.酵素が、ヒドロラーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、リアーゼ、オキシドレダクターゼ、またはトランスフェラーゼから選択される、実施形態6の方法。
8.酵素が、α−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アスパラギナーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、β−キシロシダーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エンドグルカナーゼ、エステラーゼ、緑色蛍光タンパク質、グルカノトランスフェラーゼ、グルコアミラーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、リゾチーム、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、またはキシラナーゼである、実施形態7の方法。
9.酵素が、メタロプロテアーゼおよびスブチラーゼから選択されるプロテアーゼである、実施形態8の方法。
10.酵素が、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4または配列番号25に対して少なくとも80%の配列同一性を有するプロテアーゼである、実施形態9の方法。
11.酵素が、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4または配列番号25に対して少なくとも85%の配列同一性を有するプロテアーゼである、実施形態10の方法。
12.酵素が、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4または配列番号25に対して少なくとも90%の配列同一性を有するプロテアーゼである、実施形態11の方法。
13.酵素が、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4または配列番号25に対して少なくとも95%の配列同一性を有するプロテアーゼである、実施形態12の方法。
14.酵素が、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4または配列番号25に対して少なくとも96%の配列同一性を有するプロテアーゼである、実施形態13の方法。
15.酵素が、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4または配列番号25に対して少なくとも97%の配列同一性を有するプロテアーゼである、実施形態14の方法。
16.酵素が、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4または配列番号25に対して少なくとも98%の配列同一性を有するプロテアーゼである、実施形態15の方法。
17.酵素が、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4または配列番号25に対して少なくとも99%の配列同一性を有するプロテアーゼである、実施形態16の方法。
18.酵素が、配列番号18に対して少なくとも80%の配列同一性を有するリゾチームである、実施形態8の方法。
19.酵素が、配列番号18に対して少なくとも85%の配列同一性を有するリゾチームである、実施形態18の方法。
20.酵素が、配列番号18に対して少なくとも90%の配列同一性を有するリゾチームである、実施形態19の方法。
21.酵素が、配列番号18に対して少なくとも95%の配列同一性を有するリゾチームである、実施形態20の方法。
22.酵素が、配列番号18に対して少なくとも96%の配列同一性を有するリゾチームである、実施形態21の方法。
23.酵素が、配列番号18に対して少なくとも97%の配列同一性を有するリゾチームである、実施形態22の方法。
24.酵素が、配列番号18に対して少なくとも98%の配列同一性を有するリゾチームである、実施形態23の方法。
25.酵素が、配列番号18に対して少なくとも99%の配列同一性を有するリゾチームである、実施形態24の方法。
26.pH4.5での目的のタンパク質の溶解度が、pH7.0での溶解度より少なくとも10%高い、好ましくは少なくとも20%高い、好ましくは少なくとも30%高い、好ましくは少なくとも40%高い、好ましくは少なくとも50%高い、好ましくは少なくとも60%高い、好ましくは少なくとも70%高い、好ましくは少なくとも80%高い、好ましくは少なくとも90%高い、好ましくは少なくとも100%高い、実施形態1〜25のいずれかの方法。
27.発酵ブロス中のタンパク質生成物の濃度が、少なくとも3g/l、例えば少なくとも4g/l、例えば少なくとも5g/l、例えば少なくとも6g/l;例えば少なくとも7g/l、例えば少なくとも8g/l、例えば少なくとも9g/l;例えば少なくとも10g/l、例えば少なくとも11g/l、例えば少なくとも12g/l、例えば少なくとも13g/l、例えば少なくとも14g/l、例えば少なくとも15g/l;例えば少なくとも16g/l、例えば少なくとも17g/l、例えば少なくとも18g/l;例えば少なくとも19g/l、例えば少なくとも20g/lである、実施形態1〜26のいずれかの方法。
28.ステップb)におけるpHが6.0未満、好ましくは5.5未満、好ましくは5.0未満、好ましくは4.5未満のpH値に調節される、実施形態1〜27のいずれかの方法。
29.ステップcに保持期間を含み、保持期間が、10秒〜90分の範囲、好ましくは1分〜90分の範囲、好ましくは1分〜60分の範囲、好ましくは1分〜30分の範囲、例えば5分〜30分の範囲、最も好ましくは10〜20分の範囲である、実施形態1〜28のいずれかの方法。
30.発酵ブロスが、増殖培地中で微生物を培養することによって得られる、実施形態1〜29のいずれかの方法。
31.微生物が、細菌および真菌から選択される、実施形態30の方法。
32.微生物が、バチルス(Bacillus)属に属する細菌、例えば、古草菌(Bacillus subtilis)、バチルス・レンツス(B.lentus)およびバチルス・リキニホルミス(B.lichiniformis)から選択される、実施形態31の方法。
33.微生物が、アスペルギルス(Aspergillus)属、トリコデルマ(Trichoderma)属、ペニシルム(Penicillum)属、フザリウム(Fusarium)属に属する真菌、例えば、アスペルギルス・ニガー(A.niger)、アスペルギルス・アワモリ(A.awamori)、アスペルギルス・オリゼー(A.oryzae)、ショウユコウジカビ(A.sojae)、トリコデルマ・レエセイ(T.reesei)、トリコデルマ・ロンギブラキアツム(T.longibrachiatum)もしくはトリコデルマ・ビリデ(T.viride);または好ましくはサッカロマイセス(Saccharomyces)属、ピチア(Pichia)属、カンジダ(Candida)属、ハネンスラ(Hanensula)属、クリベロマイセス(Klyveromyces)属に属する酵母;例えば、サッカロマイセス・セレビシエ(S.cerevisiae)、サッカロマイセス・オバルム(S.ovarum)、ピチア・パストリス(P.Pastoris)、クルイベロマイセス・ラクチス(K.lactis)から選択される、実施形態31の方法。
34.ステップdの分離が、ろ過、遠心分離またはデカンテーションを用いて実施される、実施形態1〜33のいずれかの方法。
35.方法が、ステップdの分離の前に、前処理ステップをさらに含む、実施形態1〜34のいずれかの方法。
36.前処理ステップが、希釈、塩添加およびポリマーの添加から選択される、実施形態35の方法。
37.タンパク質生成物が、所与のアミノ酸配列を有する目的のタンパク質と、2〜6個のヒスチジン残基のC−および/またはN−末端延伸以外は同じアミノ酸配列を有する修飾タンパク質とを含有する、実施形態1〜36のいずれかの方法。
38.発酵ブロスが、目的のタンパク質をコードする遺伝子の1つまたは複数のコピーと、2〜6個のヒスチジン残基によりC−および/またはN−末端が延伸された目的のタンパク質の配列から構成される修飾タンパク質をコードする修飾遺伝子の1つまたは複数のコピーとを含む組換え微生物と一緒に基質を発酵することにより得られる、実施形態37の方法。
39.組換え微生物が、目的のタンパク質をコードする遺伝子の2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つまたは8つのコピーと、修飾遺伝子の1つまたは2つのコピーとを含有する、実施形態38の方法。
40.ステップcに保持期間を含み、保持期間が、10秒〜90分の範囲、好ましくは1分〜90分の範囲、好ましくは1分〜60分の範囲、好ましくは1分〜30分の範囲、例えば5分〜30分の範囲、最も好ましくは10〜20分の範囲である、実施形態1〜39のいずれかの方法。
41.目的のタンパク質の産生を指令する1つまたは複数の制御配列に作動可能にリンクされた目的のタンパク質をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドと、修飾タンパク質をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドであって、修飾タンパク質が、目的のタンパク質と比較して、タンパク質の表面に位置する2〜6個のヒスチジン残基を含有するように修飾されている、少なくとも1つのポリヌクレオチドとを含む組換え微生物であって、修飾遺伝子が、修飾タンパク質の産生を指令する1つまたは複数の制御配列に作動可能にリンクされている、組換え微生物。
42.原核生物細胞、好ましくは、グラム陽性細胞、より好ましくは、バチルス(Bacillus)細胞;最も好ましくは、バチルス・アルカロフィルス(Bacillus alkalophilus)、バチルス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)、バチルス・ブレビス(Bacillus brevis)、バチルス・シルクランス(Bacillus circulans)、バチルス・クラウシイ(Bacillus clausii)、バチルス・コアグランス(Bacillus coagulans)、バチルス・フィルムス(Bacillus firmus)、バチルス・ラウツス(Bacillus lautus)、バチルス・レンツス(Bacillus lentus)、バチルス・リケニホルミス(Bacillus licheniformis)、バチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)、バチルス・プミルス(Bacillus pumilus)、バチルス・ステアロテルモフィルス(Bacillus stearothermophilus)、古草菌(Bacillus subtilis)またはバチルス・チューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis)細胞である、実施形態41の組換え微生物。
43.真核生物細胞、好ましくは真菌細胞、より好ましくはアスペルギルス(Aspergillus)、トリコデルマ(Trichoderma)またはサッカロマイセス(Saccharomyces)またはピチア(Pichia)細胞;最も好ましくは、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、アスペルギルス・オリゼー(Aspergillus oryzae)、アスペルギルス・アワモリ(Aspergillus awamori)、アスペルギルス・アクレアツス(Aspergillus aculeatus)、トリコデルマ・レエセイ(Trichoderma reesei)、トリコデルマ・ハルジアヌム(Trichoderma harzianum) トリコデルマ・ビレデ(Trichoderma virede)、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、サッカロマイセス・オバルム(Saccharomyces ovarum)またはピチア・パストリス(Pichia pastoris)細胞である、実施形態41の組換え微生物。
44.目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの少なくとも2つのコピー、好ましくは目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの少なくとも3つのコピー、より好ましくは少なくとも4つのコピー、最も好ましくは少なくとも5つのコピーを含む、実施形態41〜43のいずれかの組換え微生物。
45.目的の同じタンパク質をコードする少なくとも2つの異なるポリヌクレオチド、好ましくは目的の同じタンパク質をコードする少なくとも3つ、より好ましくは少なくとも4つ、最も好ましくは少なくとも5つのポリヌクレオチドを含む、実施形態41〜44のいずれかの組換え微生物。
46.目的のタンパク質が酵素である、実施形態41〜45のいずれかの組換え微生物。
47.酵素が、ヒドロラーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、リアーゼ、オキシドレダクターゼ、またはトランスフェラーゼである、実施形態46の組換え微生物。
48.酵素が、α−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アスパラギナーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、β−キシロシダーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エンドグルカナーゼ、エステラーゼ、緑色蛍光タンパク質、グルカノ−トランスフェラーゼ、グルコアミラーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、リゾチーム、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、またはキシラナーゼである、実施形態47の組換え微生物。
49.酵素が、プロテアーゼであり、好ましくは、プロテアーゼは、メタロプロテアーゼまたはスブチラーゼである、実施形態48のいずれかの組換え微生物。
50.プロテアーゼが、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4または配列番号25の1つに対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性、好ましくは少なくとも95%の配列同一性、好ましくは少なくとも96%の配列同一性、好ましくは少なくとも97%の配列同一性、好ましくは少なくとも98%の配列同一性、好ましくは少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、実施形態49の組換え微生物。
51.プロテアーゼが、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4または配列番号25から選択される、実施形態50の組換え微生物。
52.酵素が、リゾチームであり、好ましくは、リゾチームは、GH25リゾチームである、実施形態48の組換え微生物。
53.リゾチームが、配列番号18に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性、好ましくは少なくとも95%の配列同一性、好ましくは少なくとも96%の配列同一性、好ましくは少なくとも97%の配列同一性、好ましくは少なくとも98%の配列同一性、好ましくは少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、実施形態52の組換え微生物。
54.リゾチームが、配列番号18のアミノ酸配列を有する、実施形態53の組換え微生物。
55.ポリヌクレオチドが、宿主細胞の染色体中に異なる遺伝子座において組み込まれる、実施形態41〜54のいずれかの組換え微生物。
56.酵素を生成する方法であって、酵素の生成を促進する条件下で、実施形態41〜54のいずれかに定義される細胞を培養するステップを含む、方法。
57.酵素を回収するステップをさらに含む、実施形態56の方法。
58.目的のタンパク質の産生を指令する1つまたは複数の制御配列に作動可能にリンクされた目的のタンパク質をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドと、修飾タンパク質をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドであって、修飾タンパク質が、目的のタンパク質と比較して、タンパク質の表面に位置する2〜6個のヒスチジン残基を含有するように修飾されている、少なくとも1つのポリヌクレオチドとを含む組換え微生物であって、修飾遺伝子が、修飾タンパク質の産生を指令する1つまたは複数の制御配列に作動可能にリンクされている、組換え微生物。
59.修飾タンパク質が、タンパク質のC−および/またはN−末端に結合した2〜6個のヒスチジン残基を含む、実施形態58のタンパク質生成物。
60.目的のタンパク質が酵素である、実施形態58または59のタンパク質生成物。
61.酵素が、ヒドロラーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、リアーゼ、オキシドレダクターゼ、またはトランスフェラーゼである、実施形態60のタンパク質生成物。
62.酵素が、α−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アスパラギナーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、β−キシロシダーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エンドグルカナーゼ、エステラーゼ、緑色蛍光タンパク質、グルカノ−トランスフェラーゼ、グルコアミラーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、リゾチーム、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、またはキシラナーゼである、実施形態61のタンパク質生成物。
63.酵素が、プロテアーゼであり、好ましくは、プロテアーゼは、メタロプロテアーゼまたはスブチラーゼである、実施形態62のタンパク質生成物。
64.プロテアーゼが、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4または配列番号25の1つに対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性、好ましくは少なくとも95%の配列同一性、好ましくは少なくとも96%の配列同一性、好ましくは少なくとも97%の配列同一性、好ましくは少なくとも98%の配列同一性、好ましくは少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、実施形態63のタンパク質生成物。
65.プロテアーゼが、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4または配列番号25から選択される、実施形態64のタンパク質生成物。
66.目的の酵素が、リゾチームであり、好ましくは、リゾチームが、GH25リゾチームである、実施形態62のタンパク質生成物。
67.プロテアーゼが、配列番号18に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性、好ましくは少なくとも95%の配列同一性、好ましくは少なくとも96%の配列同一性、好ましくは少なくとも97%の配列同一性、好ましくは少なくとも98%の配列同一性、好ましくは少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、実施形態66のタンパク質生成物。
68.リゾチームが、配列番号18のアミノ酸配列を有する、実施形態67のタンパク質生成物。

0155

本発明を実施例と共にさらに詳しく説明するが、これらの実施例は、例示のために提供するに過ぎず、決して限定的と考慮すべきではない。

0156

材料および方法
プロテアーゼアッセイ(Suc−AAPF−pNAアッセイ)
pNA基質:Suc−AAPF−pNA(Bachem L−1400)。
温度:室温(25℃)
アッセイバッファー:100mMコハク酸、100mMHEPES、100mM CHES、100mM CABS、1mM CaCl2、150mM KCl、0.001%Triton X−100、pH9.0。

0157

20μlのプロテアーゼ(0.01%Triton X−100に希釈)を100μlのアッセイバッファーと混合した。100μlのpNA基質(50mgを1.0mlのDMSOに希釈した後、0.01%Triton X−100でさらに45倍希釈した)を添加することにより、アッセイを開始した。OD405の増加を、プロテアーゼ活性の基準としてモニタリングした。

0158

リゾチーム活性(LSU(A)DV)の決定
リゾチーム(EC3.2.1.17)は、グラム陽性細菌細胞壁中のペプチドグリカンを分解する酵素である。リゾチームの分析において、マイクロコッカス・リゾデイクティカス(Micrococcus lysodeikticus)ATCC番号4698(Sigma M3770)を分解し、これにより、450nmでの吸光度を低下させ、表1に示す条件下で測定する。吸光度の低下は、サンプル中に存在するLSU(A)DV酵素活性に比例している。

0159

0160

標準(193−81114:23000 LSU(A)DV/g)
0.5000g/100ml酢酸0.1M、NaCl50mM、Triton X−100 0.1%、pH4.5

0161

一般的分子生物学的方法
PCR、クローニング、ヌクレオチドの連結などの一般的方法は、当業者にはよく知られており、例えば、以下の文献に見出すことができる:“Molecular cloning:A laboratory manual”,Sambrook et al.(1989),Cold Spring Harbor lab.,Cold Spring Harbor,NY;Ausubel,F.M.et al.(eds.);“Current protocols in Molecular Biology”,John Wiley and Sons,(1995);Harwood,C.R.,and Cutting,S.M.(eds.);“DNA Cloning:A Practical Approach,Volumes I and II”,D.N.Glover ed.(1985);“Oligonucleotide Synthesis”,M.J.Gait ed.(1984);“Nucleic Acid Hybridization”,B.D.Hames&S.J.Higgins eds(1985);“A Practical Guide To Molecular Cloning”,B.Perbal,(1984)。

0162

0163

3−ステップサイクル

0164

培地および試薬
バッファーおよび基質のために使用する化学物質は、分析グレードの市販の製品であった:
− Cove:342.3g/Lのスクロース、20ml/LのCOVE塩類溶液、10mMアセトアミド、30g/Lのノーブル寒天
− Cove上層寒天:342.3g/Lのスクロース、20ml/LのCOVE塩類溶液、10mMアセトアミド、10g/Lの低融点アガロース
− Cove−2:30g/Lのスクロース、20ml/LのCOVE塩類溶液、10mMアセトアミド、30g/Lのノーブル寒天。
− COVE塩類溶液は、26gのKCl、26gのMgSO4・7H2O、76gのKH2PO4および50mlのCove微量金属、1リットルまでの水から構成される。
− COVEのための微量金属溶液は、0.04gのNaB4O7・10H2O、0.4gのCuSO4・5H2O、1.2gのFeSO4・7H2O、1.0gのMnSO4・H2O、0.8gの中性アミラーゼIIMoO2・2H2O、および10.0gのZnSO4・7H2O、1リットルまでの水から構成される。
−アミログルコシダーゼ微量金属溶液は、6.8gのZnCl2・7H2O、2.5gのCuSO4・5H2O、0.24gのNiCl2・6H2O、13.9gのFeSO4・7H2O、13.5gのMnSO4・H2Oおよび3gのクエン酸、1リットルまでの水から構成される。
− YPGは、4gの酵母エキス、1gのKH2PO4、0.5gのMgSO4・7H2Oおよび15gのグルコース(pH6.0)、1リットルまでの水から構成される。
STCバッファーは、0.8Mのソルビトール、25mMのTris(pH8)、および25mMのCaCl2、1リットルまでの水から構成される。

0165

STPCバッファーは、STCバッファー中40%PEG4000から構成される。

0166

アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)形質転換
アスペルギルス(Aspergillus)形質転換は、Christensen et al.;Biotechnology 1988 6 1419−1422により記載されている通りに実施した。好ましい手順を以下に記載する。

0167

アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)宿主株を、10mMウリジンで補充した100mlのYPG培地に接種してから、32℃、80rpmで16時間インキュベートした。ペレットを収集し、0.6M KClで洗浄した後、1ml当たり20mgの最終濃度で市販のβ−グルカナーゼ製品(GLUCANEX(商標)、Novozymes A/S,Bagsvaerd,Denmark)を含有する20mlの0.6M KClに再懸濁させた。懸濁液を32℃、80rpmで、プロトプラストが形成されるまでインキュベートした後、STCバッファーで2回洗浄した。プロトプラストをヘマトメータ計数してから、STC:STPC:DMSOの8:2:0.1溶液中に再懸濁させて、最終濃度2.0×107プロトプラスト/mlに調節した。約4μgのプラスミドDNAを100μlのプロトプラスト懸濁液に添加し、穏やかに混合した後、上で30分インキュベートした。1mlのSPTCを添加し、プロトプラスト懸濁液を37℃で20分インキュベートした。50℃のCove上層アガロース10mlの添加後、反応物をCove寒天プレート上に注ぎ、プレートを32℃で5日間インキュベートした。

0168

SDS−PAGE
リゾチーム分析に用いるSDSゲルは、BioRad製のAny kD(商標)Mini−PROTEAN(登録商標)TGX Stain−Free(商標)ゲルであった。16ulのサンプルをゲルにロードした(8μlの各サンプルを8ulのローディングバッファーと混合した)。また、10ulのMW Marker:(Amersham製のLow Molecular Weight Calibration Kit for SDS Electrophoresis #17−0446−01)も適用した。ゲルを1×SDSバッファー(BioRad)において、200Vの定電圧で25分間電気泳動させた後、BioRadクライテリオン(criterion)システムを用いることにより、製造者推奨するように分析した。

0169

実施例1
変異体の調製および発現
以下に、発現カセットの突然変異および古草菌(Bacillus subtilis)への発現カセットの導入をまとめる。DNA操作は全て、PCR(例えば、Sambrook et al.;Molecular Cloning;Cold Spring Harbor Laboratory Press)により実施したが、これは、全ての当業者が再現することができる。

0170

スブチラーゼ変異体をコードする組換え古草菌(B.subtilis)構築物を用いて、濃厚な培地(例えば、PS−1:100g/Lのスクロース(Daniscoカタログ番号109−0429)、40g/Lのクラストソイ(crust soy)(ダイズ粉)、10g/LのNa2HPO4・12H2O(Merckカタログ番号6579)、0.1ml/Lリプレイス(replace)−Dowfax63N10(Dow)を含有する振盪フラスコを接種した。培養は、典型的に、220rpmで振盪しながら、30℃で4日間実施する。

0171

以下のタンパク質が産生された。
参照:配列番号1
1HIS:N−末端に結合した1ヒスチジンを有する配列番号1
2HIS:N−末端に結合した2ヒスチジンを有する配列番号1
3HIS:N−末端に結合した3ヒスチジンを有する配列番号1
4HIS:N−末端に結合した4ヒスチジンを有する配列番号1
3intHIS:配列番号1+V239H+N243H+N247H

0172

実施例2
実施例1で産生された参照および変異体を、欧州特許第1 520 012B1号明細書、実施例2に記載の方法を用いて、MGPは添加せずに、標準的実験室規模の発酵槽中で発酵させた。

0173

発酵中に変異体が沈殿したことが観測された。発酵中の活性から、参照、1HIS、2HIS、3HISおよび4HISの発酵によって、概ね同じ収率が得られたのに対し、3intHIS変異体の発酵では、参照より低い収率がもたらされたことが判明した。

0174

実施例3
実施例2からの発酵ブロスを水で3倍希釈し、HClを用いて、40℃でpHをpH4.5に調節した後、発酵ブロスを60分間攪拌した。

0175

pH調節直後および60分後に、前述のプロテアーゼアッセイを用いて、上清中のプロテアーゼ活性を決定した。pH調節を1に設定した直後の参照の濃度に対して、プロテアーゼ濃度を決定した。結果を表3に示す。

0176

0177

これらの結果から、明らかに、本発明の変異体が全て、親(=参照)と比較して、低pHで、より高い溶解度を有することがわかる。さらにデータから、本発明の変異体の溶解度は、開始から高かったものの、60分の保持期間中に、より多くの酵素が溶解状態となることも判明した。

0178

実施例4
変異体の調製および発現
以下に、バチルス・リケニホルミス(Bacillus licheniformis)への発現カセットの突然変異および導入をまとめる。DNA操作は全て、PCR(例えば、Sambrook et al.;Molecular Cloning;Cold Spring Harbor Laboratory Press)により実施したが、これは、全ての当業が再現することができる。

0179

2つの組換えバチルス・リケニホルミス(B.licheniformis)株を調製した。参照株は、サビナーゼ(配列番号2)をコードする発現カセットを、バチルス・リケニホルミス(Bacillus licheniformis)宿主株に形質転換した後、サビナーゼ遺伝子が組み込まれた発現カセットの5つのコピーを有する1形質転換体と、N−末端に4個のヒスチジン残基が結合したサビナーゼをコードする修飾遺伝子を含有する発現カセットの5つのコピーを有する1つの株を選択することにより調製した。

0180

組換え生物および参照生物を標準的実験室規模の発酵槽中で発酵させたところ、タンパク質が発酵中に沈殿することが観測された。発酵中の活性から、参照および4HISの発酵は、概ね同じ収率をもたらしたことが判明した。

0181

実施例5
精製
実施例4から得られた発酵ブロスを水で6倍希釈し、酢酸を用いて、40℃でpHをpH4.5に調節した後、伝導性を調節するために、塩を添加し、発酵ブロスを40℃の水浴中で60分間攪拌した。

0182

pH調節直後および60分後に、前述のプロテアーゼアッセイを用いて、上清中のプロテアーゼ活性を決定した。pH調節直後の参照の濃度(1に設定した)に対して、プロテアーゼ濃度を決定した。

0183

0184

これらの結果から、明らかに、修飾遺伝子の5つのコピーを有する組換え微生物を使用することが、目的の遺伝子のみで形質転換された参照組換え微生物と比較して、低pHで、より高い溶解度をもたらしたことがわかる。さらにデータから、本発明の変異体の溶解度は、開始から高かったものの、60分の保持期間中に、より多くの酵素が溶解状態となることも判明した。

0185

実施例6
以下に、バチルス・リケニホルミス(Bacillus licheniformis)への発現カセットの突然変異および導入をまとめる。DNA操作は全て、PCR(例えば、Sambrook et al.;Molecular Cloning;Cold Spring Harbor Laboratory Press)により実施したが、これは、全ての当業者が再現することができる。

0186

2つの発現カセットは、1つが、サビナーゼ変異体(配列番号3)をコードする遺伝子を含み、1つが、C−末端が4個のヒスチジン残基で延伸された配列番号3の配列を有する修飾サビナーゼ変異体を含む(配列番号3+Hisタグ)。

0187

組換え株は、サビナーゼ変異体(配列番号3)をコードする発現カセットと、修飾遺伝子を含有する発現カセットをバチルス・リケニホルミス(Bacillus licheniformis)宿主株に形質転換した後、サビナーゼ変異型遺伝子を含む発現カセットの5つのコピーと、組み込まれた修飾遺伝子(4His残基で延伸された)の1つのコピーを有する1形質転換体を選択することにより調製した。

0188

組換え生物を標準的実験室規模の発酵槽中で発酵させたところ、タンパク質が発酵中に沈殿することが観測された。

0189

発酵ブロスを水で6倍希釈し、酢酸を用いて、40℃でpHをpH4.5に調節した後、発酵ブロスを40℃の水浴中で60分間攪拌した。

0190

pH調節直後および120分後に、前述のプロテアーゼアッセイを用いて、上清中のプロテアーゼ活性を決定した。pH調節直後の参照の濃度(1に設定した)に対して、プロテアーゼ濃度を決定した。

0191

0192

これらの結果から、目的のプロテアーゼ(配列番号3)の5つのコピーと、同じプロテアーゼのHis−タグ付き形態の1つのコピーとの組み合わせを用いると、沈殿したプロテアーゼの高度およびほぼ完全な溶解が達成されたことがわかる。比較して、目的のプロテアーゼを単独で(産生株にHis−タグ付き形態のコピーを含有させずに)発酵させると、pHを4.5に低下させた後、有意に少量のプロテアーゼしか溶解せず、120分後でも、より小さな画分の生成物しか試験条件下で溶解しない。

0193

以上の結果から、目的のプロテアーゼを含有する発現カセットのみを含有する参照微生物と比較して、目的のプロテアーゼを含有する発現カセットの5つのコピーと、C−末端に結合した4個のヒスチジンを有する目的のプロテアーゼを含有する発現カセットの1つのコピーとを含む組換え微生物を用いた場合、低pHで、優れた溶解度が得られるという利点を確認した。

0194

実施例7
以下に、バチルス・リケニホルミス(Bacillus licheniformis)への発現カセットの突然変異および導入をまとめる。DNA操作は全て、PCR(例えば、Sambrook et al.;Molecular Cloning;Cold Spring Harbor Laboratory Press)により実施したが、これは、全ての当業者が再現することができる。

0195

2つの発現カセット、1つは、サビナーゼ変異体(配列番号3)をコードする遺伝子を含み、1つは、C−末端が4個のヒスチジン残基で延伸された配列番号4の配列を有する修飾サビナーゼ変異体を含む(配列番号4+His−タグ)。

0196

組換え株は、サビナーゼ変異体(配列番号4)をコードする発現カセットと、修飾遺伝子を含有する発現カセットをバチルス・リケニホルミス(Bacillus licheniformis)宿主株に形質転換した後、サビナーゼ変異型遺伝子を含む発現カセットの5つのコピーと、組み込まれた修飾遺伝子(4His−残基で延伸された)の1つのコピーとを有する1形質転換体を選択することにより調製した。

0197

組換え生物を標準的実験室規模の発酵槽中で発酵させたところ、発酵中にタンパク質が沈殿することが観測された。

0198

発酵ブロスを水で6倍希釈し、酢酸を用いて、40℃でpHをpH4.5に調節した後、発酵ブロスを40℃の水浴中で60分間攪拌した。

0199

pH調節直後および120分後に、前述のプロテアーゼアッセイを用いて、上清中のプロテアーゼ活性を決定した。pH調節を1に設定した直後の参照の濃度に対して、プロテアーゼ濃度を決定した。

0200

0201

これらの結果から、目的のプロテアーゼ(配列番号3)の5つのコピーと、同じプロテアーゼのHis−タグ付き形態の1つのコピーとの組み合わせを用いると、沈殿したプロテアーゼの高度およびほぼ完全な溶解が達成されたことがわかる。比較して、目的のプロテアーゼを単独で(産生株にHis−タグ付き形態のコピーを含有させずに)発酵させると、pHを4.5に低下させた後、有意に少量のプロテアーゼしか溶解せず、120分後でも、より小さな画分の生成物しか試験条件下で溶解しない。

0202

以上の結果から、目的のプロテアーゼを含有する発現カセットのみを含有する参照微生物と比較して、目的のプロテアーゼを含有する発現カセットの5つのコピーと、C−末端に結合した4個のヒスチジンを有する目的のプロテアーゼを含有する発現カセットの1つのコピーとを含む組換え微生物を用いた場合、低pHで、優れた溶解度が得られるという利点を確認した。

0203

実施例8.アスペルギルス・ニガー(A.niger)株におけるリゾチームの発現
アスペルギルス(Aspergillus)発現カセットpJaL1470の構築
発現プラスミドpJaL1468は、プラスミドpHUda1260を鋳型として用い、それぞれ、プライマーセットoJaL519(GTTGTAAAACGACGGCCAGTTTCATCTTGAAGTTCCTA、配列番号5)/oJaL522(CTGGCCGTCGTTTTAC、配列番号6)、oJaL521(GGATTTAGTCTTGATCGCGGCCGCACCTGCGTTTCATTTC、配列番号7)/oJaL524(ATCAAGACTAAATCCTC、配列番号8)、oJaL523(TGGAAGTTACGCTCGCATTCTGTAAACGGGC、配列番号9)/oJaL526(CGAGCGTAACTTCCACC、配列番号10)、oJaL525(GAGGGGATCGATGCGTCCGCGGGCGGAGAAGAAG、配列番号11)/oJaL528 (CGCATCGATCCCCTCGTC、配列番号12)、oJaL527(GATATCGGAGAAGCGTCCGCAGTTGATGAAGG、配列番号13)/oJaL530(GCTTCTCCGATATCAAG、配列番号14)およびoJaL529(AGCTTGGCGTAATCATG、配列番号15)/oJaL520(ACCATGATTACGCCAAGCTGCATGCATTAATTAACTTG、配列番号16)による、以下:844bp、2972bp、3514bp、155bp、1548bpおよび2633の6つのPCR断片の増幅によって作製した。6つのPCR断片を、製造者の指示に従い、Infusionクローニングによって互いに連結することにより、プラスミドpJaL1468を作出した。

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