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課題・解決手段

試料中の微生物の有無を検出する組成物及び方法が本明細書に記載され、該方法は、試料を微生物の細胞表面タンパク質に結合して複合体を形成することが可能なアプタマーに接触させ、該混合物を該微生物の第一細胞表面タンパク質または第二細胞表面タンパク質に結合可能な第二アプタマーに接触させ、さらにアッセイを行って該第二アプタマーを検出することを含み、ここで該第二アプタマーの検出が該微生物が該試料中に存在することを示し、また該第二アプタマーの未検出が、該微生物が該試料中に存在しないことを示す。

概要

背景

〔0004〕食品や水の汚染は、先進国の国々や第三世界の国々の両方に主要な健康リスクをもたらし、毎年何百万もの人々の死や病気の原因であると考えられる。食品や水の汚染はさらに家畜水生生物生態系を含む動物の健康をも脅かす

〔0005〕 こうした病気は通常、細菌、寄生虫、またはウイルス等の微生物汚染によって引き起こされる。食品生産に関しては、関与する当事者の複雑さや数のために、多数の意図しない汚染機会や、テロリズムと食品供給の望ましくない相互作用といった可能性が提供される。地表水地下水は通常、水源内またはその近くに排泄するペット、家畜または野生動物によって汚染される一方で、埋立地汚水浄化場、下水管渠及び農地からの流出もまた水の汚染に寄与する。汚染タイプや汚染源にかかわらず、見た目や味には問題が無いが疾患や最終的には死をももたらすような食品や水が汚染されているかどうかを個人が判断するのは難しい。したがって、食品、水、非殺菌製品の微生物汚染または環境のモニタリングは、公衆衛生にとって地球規模で極めて重要である。

〔0006〕 したがって、より改善された、低コストで効率的な、食品と水の両方における微生物汚染のモニタリングのための代替的な組成物及び方法が引き続き必要とされている。本開示は、低細胞密度で存在する微生物捕捉及び濃縮、並びに、培養または細胞溶解を要しない直接検出(例えば、qPCRまたは蛍光染色による)のために、微生物の細胞表面エピトープに高い特異性と親和性を有する新規アプタマー試薬を提供して、こうした必要に答えるものである。

概要

試料中の微生物の有無を検出する組成物及び方法が本明細書に記載され、該方法は、試料を微生物の細胞表面タンパク質に結合して複合体を形成することが可能なアプタマーに接触させ、該混合物を該微生物の第一細胞表面タンパク質または第二細胞表面タンパク質に結合可能な第二アプタマーに接触させ、さらにアッセイを行って該第二アプタマーを検出することを含み、ここで該第二アプタマーの検出が該微生物が該試料中に存在することを示し、また該第二アプタマーの未検出が、該微生物が該試料中に存在しないことを示す。

目的

本発明の1つの目的は、タンパク質シグナルをアプタマーシグナルに変換することである

効果

実績

技術文献被引用数
1件
牽制数
1件

この技術が所属する分野

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請求項1

試料中の微生物の有無の検出方法であって、a)前記試料と第一アプタマーを接触させ混合物を形成し、ここで前記第一アプタマーは前記微生物の第一細胞表面タンパク質に結合して複合体を形成可能であり、かつ第一タグを含み、ここで前記第一タグは固体支持体に結合可能であり、b)前記第一タグの前記固体支持体への結合を可能にする条件下で、前記混合物と前記固体支持体を接触させ、c)前記固体支持体を洗浄して前記複合体に関して前記混合物を濃縮し、及び/または前記固体支持体を洗浄して未結合物質を実質的に除去し、d)前記混合物と第二アプタマーを接触させ、ここで前記第二アプタマーは前記微生物の前記第一細胞表面タンパク質または第二細胞表面タンパク質に結合可能であり、及びe)アッセイを行って前記第二アプタマーを検出し、ここで前記第二アプタマーの検出は前記微生物が前記試料中に存在することを示し、前記第二アプタマーの未検出は前記微生物が前記試料中に存在しないことを示す、ことを含む、検出方法。

請求項2

試料中の微生物の有無の検出方法であって、a)前記試料を固体支持体に接触させ、ここで第一アプタマーは第一タグを介して前記固体支持体に結合し、及びここで前記第一アプタマーは前記微生物の第一細胞表面タンパク質に結合して複合体を形成可能であり、b)前記固体支持体を洗浄して前記複合体に関して前記混合物を濃縮し、及び/または前記固体支持体を洗浄して未結合材料を実質的に除去し、c)前記混合物を第二アプタマーと接触させ、ここで前記第二アプタマーは前記微生物の前記第一細胞表面タンパク質または第二細胞表面タンパク質に結合可能であり、かつ第二タグを含み、及びd)アッセイを行って前記第二アプタマーを検出し、ここで前記第二アプタマーの検出は前記微生物が前記試料中に存在することを示し、前記第二アプタマーの未検出は前記微生物が前記試料中に存在しないことを示すことを含む、検出方法。

請求項3

請求項1及び2に記載の方法であって、前記第一アプタマー及び前記第二アプタマーの少なくとも1つはさらに少なくとも1つのC−5修飾ピリミジンを含む、前記方法。

請求項4

請求項3に記載の方法であって、前記C−5修飾ピリミジンが、5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−デオキシシチジン(BndC);5−(N−2−フェニルエチルカルボキシアミド)−2’−デオキシシチジン(PEdC);5−(N−3−フェニルプロピルカルボキシアミド)−2’−デオキシシチジン(PPdC);5−(N−1−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシシチジン(NapdC);5−(N−2−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシシチジン(2NapdC);5−(N−1−ナフチル−2−エチルカルボキシアミド)−2’−デオキシシチジン(NEdC);5−(N−2−ナフチル−2−エチルカルボキシアミド)−2’−デオキシシチジン(2NEdC);5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(BndU);5−(N−イソブチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(iBudU);5−(N−トリプタミノカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(TrpdU);5−(N−[1−(3−トリメチルアモニウム(trimethylamonium)プロピル]カルボキシアミド)−2’−デオキシウリジンクロライド及び5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NapdU)からなる群より選択される、前記方法。

請求項5

前記第二アプタマーが増幅可能である、請求項1及び2に記載の方法。

請求項6

請求項1及び2に記載の方法であって、前記第二アプタマーが第二タグを含み、ここで前記第二タグは、染料量子ドット放射標識PCRプライマー部位、電気化学官能基、及び酵素に加えて検出可能な酵素基質からなる群より選択される、前記方法。

請求項7

請求項1及び2に記載の方法であって、前記第一タグが、ポリヌクレオチドポリペプチドペプチド核酸ロックド核酸オリゴ糖多糖、抗体、アフィボディ抗体模倣物細胞受容体リガンド、脂質、ビオチンポリヒスチジン、またはこれら構造物の断片もしくは誘導体のいずれかからなる群より選択される、前記方法。

請求項8

固体支持体はビーズ及び基材からなる群より選択される、請求項1及び2に記載の方法。

請求項9

請求項8に記載の方法であって、前記ビーズが、ポリマービーズアガロースビーズポリスチレンビーズアクリルアミドビーズ、固体コアビーズ、多孔性ビーズ常磁性ビーズガラスビーズマイクロビーズ、及び制御細孔ビーズからなる群より選択される、前記方法。

請求項10

請求項11

請求項1及び2に記載の方法であって、前記アッセイが、PCR、qPCR、質量分析配列決定、及びハイブリダイゼーションからなる群より選択される、前記方法。

請求項12

前記微生物が、細菌細胞寄生虫及びウイルスからなる群より選択される、請求項1及び2に記載の方法。

請求項13

前記微生物が細菌細胞である、請求項1及び2に記載の方法。

請求項14

前記細菌細胞が病原性である、請求項13に記載の方法。

請求項15

前記細菌細胞がブドウ球菌細胞である、請求項13に記載の方法。

請求項16

前記細菌細胞が黄色ブドウ球菌細胞である、請求項13に記載の方法。

請求項17

請求項1及び2に記載の方法であって、前記第一細胞表面タンパク質及び前記第二細胞表面タンパク質が同じタンパク質であるかまたは異なるタンパク質である、前記方法。

請求項18

前記第一細胞表面タンパク質が細菌細胞表面タンパク質である、請求項1及び2に記載の方法。

請求項19

前記第二細胞表面タンパク質が細菌細胞表面タンパク質である、請求項1及び2に記載の方法。

請求項20

請求項1及び2に記載の方法であって、前記第一細胞表面タンパク質が、SPA、ClfA、ClfB、FnbA、FnbB、IsdA、IsdB、IsdC、IsdH及びSasDからなる群より選択される、前記方法。

請求項21

前記第一細胞表面タンパク質が、SPA及びClfAからなる群より選択される、請求項1及び2に記載の方法。

請求項22

前記第二細胞表面タンパク質が、SPA、ClfA、ClfB、FnbA、FnbB、IsdA、IsdB、IsdC、IsdH及びSasDからなる群より選択される、請求項1及び2に記載の方法。

請求項23

前記第二細胞表面タンパク質が、SPA及びClfAからなる群より選択される、請求項1及び2に記載の方法。

請求項24

請求項1及び2に記載の方法であって、前記第一アプタマーがGGCWWCGGGWACCWAWWAWNGGWWWAGCC(N)nGWC(配列番号14)の配列を有する核酸分子を含み、ここでWがそれぞれの存在について独立してC−5修飾ピリミジン、Nが非修飾または修飾ヌクレオチドのいずれか、及びnが0、1、2、3、4または5である、前記方法。

請求項25

請求項24に記載の方法であって、前記第一アプタマーの長さが少なくとも約32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49または50個のヌクレオチドである、前記方法。

請求項26

請求項24に記載の方法であって、前記第一アプタマーの長さが約32〜約100個のヌクレオチド(または32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100個のヌクレオチド)である、前記方法。

請求項27

請求項1及び2に記載の方法であって、前記第一アプタマーが、AWCWGGWWC(N)nAWCWGGWWWWWAAG(配列番号15)の配列を有する核酸分子を含み、ここでWがそれぞれの存在について独立して、C−5修飾ピリミジン、Nが非修飾または修飾ヌクレオチドのいずれか、及びnが0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29または30である、前記方法。

請求項28

請求項27に記載の方法であって、前記第一アプタマーの長さが、少なくとも約18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49または50個のヌクレオチドである、前記方法。

請求項29

請求項27に記載の方法であって、前記第一アプタマーの長さが、約18〜約100個のヌクレオチド(または18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100個のヌクレオチド)である、前記方法。

請求項30

請求項1及び2に記載の方法であって、前記第一アプタマーが配列番号1〜8及び10〜12からなる群より選択される配列を有する核酸分子を含み、ここでWがC−5修飾ピリミジンである、前記方法。

請求項31

請求項1及び2に記載の方法であって、前記第二アプタマーがGGCWWCGGGWACCWAWWAWNGGWWWAGCC(N)nGWC(配列番号14)の配列を有する核酸分子を含み、ここでWがそれぞれの存在について独立して、C−5修飾ピリミジン、Nが非修飾または修飾ヌクレオチドのいずれか、及びnが0、1、2、3、4、または5である、前記方法。

請求項32

請求項31に記載の方法であって、前記第二アプタマーの長さが少なくとも約32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49または50個のヌクレオチドである、前記方法。

請求項33

請求項31に記載の方法であって、前記第二アプタマーの長さが約32〜約100個のヌクレオチド(または32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100個のヌクレオチド)である、前記方法。

請求項34

請求項1及び2に記載の方法であって、前記第二アプタマーがAWCWGGWWC(N)nAWCWGGWWWWWAAG(配列番号15)の配列を有する核酸分子を含み、ここでWが、それぞれの存在について独立して、C−5修飾ピリミジン、Nが非修飾または修飾ヌクレオチドのいずれか、及びnが0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29または30である、前記方法。

請求項35

請求項34に記載の方法であって、前記第二アプタマーの長さが少なくとも約18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49または50個のヌクレオチドである、前記方法。

請求項36

請求項34に記載の方法であって、前記第二アプタマーの長さが、約18〜約100個のヌクレオチド(または長さが18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100個のヌクレオチド)である、前記方法。

請求項37

請求項1及び2に記載の方法であって、前記第二アプタマーが、配列番号1〜8及び10〜12からなる群より選択される配列を有する核酸分子を含み、ここでWがC−5修飾ピリミジンである、前記方法。

請求項38

請求項24、27、30、31、34及び37に記載の方法であって、前記C−5修飾ピリミジンが、5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−デオキシシチジン(BndC);5−(N−2−フェニルエチルカルボキシアミド)−2’−デオキシシチジン(PEdC);5−(N−3−フェニルプロピルカルボキシアミド)−2’−デオキシシチジン(PPdC);5−(N−1−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシシチジン(NapdC);5−(N−2−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシシチジン(2NapdC);5−(N−1−ナフチル−2−エチルカルボキシアミド)−2’−デオキシシチジン(NEdC);5−(N−2−ナフチル−2−エチルカルボキシアミド)−2’−デオキシシチジン(2NEdC);5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(BndU);5−(N−イソブチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(iBudU);5−(N−トリプタミノカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(TrpdU);5−(N−[1−(3−トリメチルアモニウム(trimethylamonium)プロピル]カルボキシアミド)−2’−デオキシウリジンクロライド及び5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NapdU)からなる群より選択される、前記方法。

請求項39

請求項1及び2に記載の方法であって、前記試料が、水性試料土壌試料食品試料細胞試料培養試料組織試料細胞片試料、生物試料等からなる群より選択される、前記方法。

請求項40

少なくとも約15〜少なくとも約100個のヌクレオチド(または少なくとも約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100個のヌクレオチド)、少なくとも1つのC−5修飾ピリミジン、を含み、微生物の細胞表面タンパク質に結合可能である、核酸分子。

請求項41

請求項40に記載の核酸分子であって、約15〜約50個のヌクレオチド(または15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49もしくは50個のヌクレオチド)を含む、前記核酸分子。

請求項42

請求項40に記載の核酸分子であって、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、または21個のC−5修飾ピリミジンを含む、前記核酸分子。

請求項43

請求項40に記載の核酸分子であって、C−5修飾ピリミジンを少なくとも10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%以上含む、前記核酸分子。

請求項44

請求項40に記載の核酸分子であって、約0.03nM〜約4.7nM(または0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.2、0.21、0.22、0.23、0.24、0.25、0.26、0.27、0.28、0.29、0.3、0.31、0.32、0.33、0.34、0.35、0.36、0.37、0.38、0.39、0.4、0.41、0.42、0.43、0.44、0.45、0.46、0.47、0.48、0.49、0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7nM)の平衡結合定数(Kd)で前記細胞表面タンパク質に結合可能である、前記核酸分子。

請求項45

請求項40に記載の核酸分子であって、少なくとも約0.03、0.07、0.08、0.14、0.15、0.16、0.22、0.35、0.47、0.63、0.73、0.79、0.84、1.3、1.35、1.98、2.17、3.9及び4.73nMの平衡結合定数(Kd)で前記細胞表面タンパク質に結合可能である、前記核酸分子。

請求項46

請求項40に記載の核酸分子であって、前記C−5修飾ピリミジンが5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−デオキシシチジン(BndC);5−(N−2−フェニルエチルカルボキシアミド)−2’−デオキシシチジン(PEdC);5−(N−3−フェニルプロピルカルボキシアミド)−2’−デオキシシチジン(PPdC);5−(N−1−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシシチジン(NapdC);5−(N−2−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシシチジン(2NapdC);5−(N−1−ナフチル−2−エチルカルボキシアミド)−2’−デオキシシチジン(NEdC);5−(N−2−ナフチル−2−エチルカルボキシアミド)−2’−デオキシシチジン(2NEdC);5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(BndU);5−(N−イソブチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(iBudU);5−(N−トリプタミノカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(TrpdU);5−(N−[1−(3−トリメチルアモニウム(trimethylamonium)プロピル]カルボキシアミド)−2’−デオキシウリジンクロライド及び5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NapdU)からなる群より選択される、前記核酸分子。

請求項47

請求項40に記載の核酸分子であって、前記微生物が、細菌細胞、寄生虫及びウイルスからなる群より選択される、前記核酸分子。

請求項48

前記微生物が細菌細胞である、請求項40に記載の核酸分子。

請求項49

前記細菌細胞が病原性である、請求項48に記載の核酸分子。

請求項50

前記細菌細胞がブドウ球菌細胞である、請求項48に記載の核酸分子。

請求項51

前記細菌細胞が黄色ブドウ球菌細胞である、請求項48に記載の核酸分子。

請求項52

前記細胞表面タンパク質が細菌細胞表面タンパク質である、請求項40に記載の核酸分子。

請求項53

請求項40に記載の核酸分子であって、前記細胞表面タンパク質が、SPA、ClfA、ClfB、FnbA、FnbB、IsdA、IsdB、IsdC、IsdH及びSasDからなる群より選択される、前記核酸分子。

請求項54

請求項40に記載の核酸分子であって、前記第一細胞表面タンパク質が、SPA及びClfAからなる群より選択される、前記核酸分子。

請求項55

請求項40に記載の核酸分子であって、GGCWWCGGGWACCWAWWAWNGGWWWAGCC(N)nGWC(配列番号14)の配列を含み、ここでWがそれぞれの存在について独立してC−5修飾ピリミジン、Nが非修飾または修飾ヌクレオチドのいずれか、及びnが0、1、2、3、4または5である、前記核酸分子。

請求項56

請求項55に記載の核酸分子であって、その長さが少なくとも約32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49または50個のヌクレオチドである、前記核酸分子。

請求項57

請求項55に記載の核酸分子であって、その長さが、約32〜約100個のヌクレオチド(または32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100個のヌクレオチド)である、前記核酸分子。

請求項58

請求項40に記載の方法であって、前記核酸分子が、AWCWGGWWC(N)nAWCWGGWWWWWAAG(配列番号15)の配列を含み、ここでWがそれぞれの存在について独立してC−5修飾ピリミジン、Nが非修飾または修飾ヌクレオチドのいずれか、及びnが0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29または30である、前記核酸分子。

請求項59

請求項58に記載の核酸分子であって、その長さが少なくとも約18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49または50個のヌクレオチドである、前記核酸分子。

請求項60

請求項58に記載の核酸分子であって、その長さが、約18〜約100個のヌクレオチド(または18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100個のヌクレオチド)である、前記核酸分子。

請求項61

請求項40に記載の核酸分子であって、配列番号1〜8及び10〜12からなる群より選択される配列を有する核酸分子を含み、ここでWがC−5修飾ピリミジンである、前記核酸分子。

請求項62

請求項55〜61に記載の核酸分子であって、前記C−5修飾ピリミジンが5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−デオキシシチジン(BndC);5−(N−2−フェニルエチルカルボキシアミド)−2’−デオキシシチジン(PEdC);5−(N−3−フェニルプロピルカルボキシアミド)−2’−デオキシシチジン(PPdC);5−(N−1−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシシチジン(NapdC);5−(N−2−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシシチジン(2NapdC);5−(N−1−ナフチル−2−エチルカルボキシアミド)−2’−デオキシシチジン(NEdC);5−(N−2−ナフチル−2−エチルカルボキシアミド)−2’−デオキシシチジン(2NEdC);5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(BndU);5−(N−イソブチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(iBudU);5−(N−トリプタミノカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(TrpdU);5−(N−[1−(3−トリメチルアモニウム(trimethylamonium)プロピル]カルボキシアミド)−2’−デオキシウリジンクロライド及び5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NapdU)からなる群より選択される、前記核酸分子。

請求項63

請求項40〜61のいずれかに記載の核酸分子を含む試料中の微生物の有無の検出キット

関連出願

0001

〔0001〕 本出願は、2014年2月18日に出願された米国仮特許出願第61/940,955号及び2014年3月4日に出願された米国仮特許出願第61/947,627号に対する利益を主張するものであり、参照により、そのそれぞれの全体が本明細書に組み込まれる。

技術分野

0002

〔0002〕 本開示は通常、試料中の微生物の存在を検出するための組成物及び方法に関する。より具体的には、本開示は微生物タンパク質に結合可能である核酸アプタマー、並びに核酸アプタマーを用いて試料中の微生物を捕捉及び検出するための方法に関する。

0003

〔0003〕 「配列表ST25(Sequence_Listing_ST25)」と題して2015年2月13日に作製した16キロバイトのサイズの配列表は、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。

背景技術

0004

〔0004〕食品や水の汚染は、先進国の国々や第三世界の国々の両方に主要な健康リスクをもたらし、毎年何百万もの人々の死や病気の原因であると考えられる。食品や水の汚染はさらに家畜水生生物生態系を含む動物の健康をも脅かす

0005

〔0005〕 こうした病気は通常、細菌、寄生虫、またはウイルス等の微生物汚染によって引き起こされる。食品生産に関しては、関与する当事者の複雑さや数のために、多数の意図しない汚染機会や、テロリズムと食品供給の望ましくない相互作用といった可能性が提供される。地表水地下水は通常、水源内またはその近くに排泄するペット、家畜または野生動物によって汚染される一方で、埋立地汚水浄化場、下水管渠及び農地からの流出もまた水の汚染に寄与する。汚染タイプや汚染源にかかわらず、見た目や味には問題が無いが疾患や最終的には死をももたらすような食品や水が汚染されているかどうかを個人が判断するのは難しい。したがって、食品、水、非殺菌製品の微生物汚染または環境のモニタリングは、公衆衛生にとって地球規模で極めて重要である。

0006

〔0006〕 したがって、より改善された、低コストで効率的な、食品と水の両方における微生物汚染のモニタリングのための代替的な組成物及び方法が引き続き必要とされている。本開示は、低細胞密度で存在する微生物の捕捉及び濃縮、並びに、培養または細胞溶解を要しない直接検出(例えば、qPCRまたは蛍光染色による)のために、微生物の細胞表面エピトープに高い特異性と親和性を有する新規アプタマー試薬を提供して、こうした必要に答えるものである。

0007

〔0007〕 本開示は、精製した組換または天然タンパク質を用いる多重修飾DNAライブラリでのSELEXによる、いくつかの黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)細胞表面関連タンパク質に対する新規の遅いオフ速度の修飾アプタマー(SOMAmer)試薬の生成について記載する。nM未満のKdを有する高親和性結合剤を、ブドウ球菌タンパク質A(SpA)、クランピング因子(ClfA、ClfB)、フィブロネクチン結合タンパク質(FnbA、FnbB)及び鉄調節表面決定因子(Isd)について取得した。いくつかのアプタマーは、試験した全ての株からの黄色ブドウ球菌細胞に特異的に結合したが、他のブドウ球菌や他の細菌には結合しなかった。SpA及びClfAアプタマーが、低細胞密度マトリクスからの黄色ブドウ球菌細胞の選択的捕捉及び濃縮に有用であることが培養やPCRに示されるように証明され、PCR阻害剤検出限界の改善及び効率的な除去につながった。黄色ブドウ球菌細胞の検出は、細菌細胞表面をアプタマーで被覆し次いでアプタマーのqPCRを行った場合にゲノムPCRと比べて桁違いに強化された。

0008

〔0008〕 本開示は試料中の微生物の有無の検出方法を記載し、該方法が、a)試料と第一アプタマーを接触させ混合物を形成し、ここで該第一アプタマーは微生物の第一細胞表面タンパク質に結合して複合体を形成可能であり、かつ第一タグを含み、ここで該第一タグは固体支持体に結合可能であり、b)該第一タグの該固体支持体への結合を可能にする条件下で、該混合物と該固体支持体を接触させ、c)該固体支持体を洗浄して該複合体に関して混合物を濃縮し、及び/または該固体支持体を洗浄して未結合物質を実質的に除去し、c)該混合物と第二アプタマーを接触させ、ここで該第二アプタマーは該微生物の該第一細胞表面タンパク質または第二細胞表面タンパク質に結合可能であり、及びd)アッセイを行って該第二アプタマーを検出し、ここで該第二アプタマーの検出は該微生物が該試料中に存在することを示し、該第二アプタマーの未検出は該微生物が該試料中に存在しないことを示す、ことを含む。

0009

〔0009〕 本開示はさらに試料中の微生物の有無の検出方法を提供し、該方法が、以下のことを含む:
〔0010〕 a)該試料を固体支持体に接触させ、ここで第一アプタマーは第一タグを介して該固体支持体に結合し、及びここで該第一アプタマーは微生物の第一細胞表面タンパク質に結合して複合体を形成可能であり;b)該固体支持体を洗浄して該複合体に関して混合物を濃縮し、及び/または該固体支持体を洗浄して未結合材料を実質的に除去し;c)該混合物を第二アプタマーと接触させ、ここで該第二アプタマーは該微生物の該第一細胞表面タンパク質または第二細胞表面タンパク質に結合可能であり、かつ第二タグを含み、及びd)アッセイを行って該第二アプタマーを検出し、ここで該第二アプタマーの検出は該微生物が該試料中に存在することを示し、該第二アプタマーの未検出は該微生物が該試料中に存在しないことを示す、こと。

0010

〔0011〕 別の態様において、該第一アプタマー及び該第二アプタマーの該少なくとも1つはさらに少なくとも1つのC−5修飾ピリミジンを含む。関連の態様において、該C−5修飾ピリミジンは5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−デオキシシチジン(BndC);5−(N−2−フェニルエチルカルボキシアミド)−2’−デオキシシチジン(PEdC);5−(N−3−フェニルプロピルカルボキシアミド)−2’−デオキシシチジン(PPdC);5−(N−1−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシシチジン(NapdC);5−(N−2−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシシチジン(2NapdC);5−(N−1−ナフチル−2−エチルカルボキシアミド)−2’−デオキシシチジン(NEdC);5−(N−2−ナフチル−2−エチルカルボキシアミド)−2’−デオキシシチジン(2NEdC);5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(BndU);5−(N−イソブチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(iBudU);5−(N−トリプタミノカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(TrpdU);5−(N−[1−(3−トリメチルアモニウム(trimethylamonium)プロピル]カルボキシアミド)−2’−デオキシウリジンクロライド及び5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NapdU)からなる群より選択される。

0011

〔0012〕 別の態様において、該第二アプタマーは増幅可能である。関連の態様において、該第二アプタマーは酵素的増幅(例えばPCRまたはqPCRによる)用テンプレートである。さらに別の関連の態様において、該第二アプタマーは、該第二アプタマーまたは該第二アプタマーの1以上の領域にハイブリダイズ可能なPCRプライマーによって増幅される。

0012

〔0013〕 別の態様において、該第二アプタマーは第二タグを含み、ここで該第二タグは、染料量子ドット放射標識、PCRプライマー部位、電気化学官能基、及び酵素に加えて検出可能な酵素基質からなる群より選択される。

0013

〔0014〕 別の態様において、該第一タグは、ポリヌクレオチドポリペプチドペプチド核酸ロックド核酸オリゴ糖多糖、抗体、アフィボディ抗体模倣物細胞受容体リガンド、脂質、ビオチンポリヒスチジン、またはこれら構造物の断片もしくは誘導体のいずれかからなる群より選択される。

0014

〔0015〕 別の態様において、固体支持体はビーズ及び基材からなる群より選択される。関連の態様において、該ビーズは、ポリマービーズアガロースビーズポリスチレンビーズアクリルアミドビーズ、固体コアビーズ、多孔性ビーズ常磁性ビーズガラスビーズマイクロビーズ、及び制御細孔ビーズからなる群より選択される。さらに別の関連の態様において、該基材は、マイクロタイターウェルシクロオレフィン共重合体基材、膜、プラスチック基材ナイロンラングミュアブロジェット膜ガラスゲルマニウム基材、シリコン基材シリコンウェーハチップフロースルーチップ、ナノ粒子ポリテトラフルオロエチレン基材、ポリスチレン基材ヒ化ガリウム基材、金基材及び銀基材からなる群より選択される。

0015

〔0016〕 別の態様において、該アッセイは、限定されないが、PCR、qPCR、質量分析配列決定ハイブリダイゼーション等を含む群より選択される。関連の態様において、該アッセイはPCR及びqPCRからなる群より選択される。

0016

〔0017〕 別の態様において、該微生物は、限定されないが、細菌細胞、寄生虫及びウイルスを含む群より選択される。
〔0018〕 別の態様において、該微生物は、細菌細胞である。関連の態様において、該細菌細胞は病原性である。さらに別の関連の態様において、該細菌細胞はブドウ球菌細胞である。別の関連の態様において、該細菌細胞は黄色ブドウ球菌細胞である。

0017

〔0019〕 別の態様において、該第一細胞表面タンパク質及び該第二細胞表面タンパク質は同じタンパク質であるかまたは異なるタンパク質である。
〔0020〕 別の態様において、該第一細胞表面タンパク質は細菌細胞表面タンパク質である。

0018

〔0021〕 別の態様において、該第二細胞表面タンパク質は細菌細胞表面タンパク質である。
〔0022〕 別の態様において、該第一細胞表面タンパク質はSPA、ClfA、ClfB、FnbA、FnbB、IsdA、IsdB、IsdC、IsdH及びSasDからなる群より選択される。関連の態様において、該第一細胞表面タンパク質はSPA及びClfAからなる群より選択される。

0019

〔0023〕 別の態様において、該第二細胞表面タンパク質は、SPA、ClfA、ClfB、FnbA、FnbB、IsdA、IsdB、IsdC、IsdH及びSasDからなる群より選択される。関連の態様において、該第二細胞表面タンパク質はSPA及びClfAからなる群より選択される。

0020

〔0024〕 別の態様において、該第一アプタマーはGGCWWCGGGWACCWAWWAWNGGWWWAGCC(N)nGWC(配列番号14)の配列を有する核酸分子を含み、ここでWがそれぞれの存在について独立してC−5修飾ピリミジン、Nが非修飾または修飾ヌクレオチドのいずれか、及びnが0、1、2、3、4または5である。関連の態様において、nは2である。関連の態様において、該第一アプタマーの長さが少なくとも約32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49または50個のヌクレオチドである。さらに別の関連の態様において、該第一アプタマーの長さが約32〜約100個のヌクレオチド(または32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100個のヌクレオチド)である。

0021

〔0025〕 別の態様において、該第一アプタマーがAWCWGGWWC(N)nAWCWGGWWWWWAAG(配列番号15)の配列を有する核酸分子を含み、ここでWがそれぞれの存在について独立して、C−5修飾ピリミジン、Nが非修飾または修飾ヌクレオチドのいずれか、及びnが0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29または30である。関連の態様において、nは5〜20(または5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19もしくは20)である。別の態様において、nは10〜18(または10、11、12、13、14、15、16、17もしくは18)である。関連の態様において、nは約16である。さらに別の関連の態様において、該第一アプタマーの長さが少なくとも約18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49または50個のヌクレオチドである。

0022

〔0026〕 別の態様において、該第一アプタマーの長さが約18〜約100個のヌクレオチド(または18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100個のヌクレオチド)である。

0023

〔0027〕 別の態様において、該第一アプタマーが配列番号1〜8及び10〜12からなる群より選択される配列を有する核酸分子を含み、ここでWがC−5修飾ピリミジンである。

0024

〔0028〕 別の態様において、該第二アプタマーがGGCWWCGGGWACCWAWWAWNGGWWWAGCC(N)nGWC(配列番号14)の配列を有する核酸分子を含み、ここでWがそれぞれの存在について独立して、C−5修飾ピリミジン、Nが非修飾または修飾ヌクレオチドのいずれか、及びnが0、1、2、3、4、または5である。関連の態様において、nは2である。関連の態様において、該第二アプタマーの長さが少なくとも約32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49または50個のヌクレオチドである。さらに別の関連の態様において、該第二アプタマーの長さが約32〜約100個のヌクレオチド(または32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100個のヌクレオチド)である。

0025

〔0029〕 別の態様において、該第二アプタマーがAWCWGGWWC(N)nAWCWGGWWWWWAAG(配列番号15)の配列を有する核酸分子を含み、ここでWが、それぞれの存在について独立して、C−5修飾ピリミジン、Nが非修飾または修飾ヌクレオチドのいずれか、及びnが0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29または30である。関連の態様において、nは5〜20(または5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19もしくは20)である。別の態様において、nは10〜18(または10、11、12、13、14、15、16、17もしくは18)である。関連の態様において、nは約16である。

0026

〔0030〕 別の態様において、該第二アプタマーの長さが少なくとも約18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49または50個のヌクレオチドである。

0027

〔0031〕 別の態様において、該第二アプタマーの長さが約18〜約100個のヌクレオチド(または長さが18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100個のヌクレオチド)である。

0028

〔0032〕 別の態様において、該第二アプタマーが配列番号1〜8及び10〜12からなる群より選択される配列を有する核酸分子を含み、ここでWがC−5修飾ピリミジンである。

0029

〔0033〕 別の態様において、該C−5修飾ピリミジンが5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−デオキシシチジン(BndC);5−(N−2−フェニルエチルカルボキシアミド)−2’−デオキシシチジン(PEdC);5−(N−3−フェニルプロピルカルボキシアミド)−2’−デオキシシチジン(PPdC);5−(N−1−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシシチジン(NapdC);5−(N−2−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシシチジン(2NapdC);5−(N−1−ナフチル−2−エチルカルボキシアミド)−2’−デオキシシチジン(NEdC);5−(N−2−ナフチル−2−エチルカルボキシアミド)−2’−デオキシシチジン(2NEdC);5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(BndU);5−(N−イソブチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(iBudU);5−(N−トリプタミノカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(TrpdU);5−(N−[1−(3−トリメチルアモニウム(trimethylamonium)プロピル]カルボキシアミド)−2’−デオキシウリジンクロライド及び5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NapdU)からなる群より選択される。

0030

〔0034〕 別の態様において、該試料が、限定されないが、水性試料土壌試料食品試料細胞試料培養試料組織試料細胞片試料、生物試料等を含む群より選択される。

0031

〔0035〕 別の態様及びここに開示の実施形態のいずれかにおいて、該第一アプタマーの濃度が約0.5nmol l−1〜約60nmol l−1(または0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.2、3.5、4、4.5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5、20、20.5、21、21.5、22、22.5、23、23.5、24、24.5、25、25.5、26、26.5、27、27.5、28、28.5、29、29.5、30、30.5、31、31.5、32、32.5、33、33.5、34、34.5、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59もしくは60nmol l−1)である。関連の態様において、該第一アプタマーの濃度は約1nmol l−1〜約40nmol l−1(または1、1.5、2、2.5、3、3.2、3.5、4、4.5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5、20、20.5、21、21.5、22、22.5、23、23.5、24、24.5、25、25.5、26、26.5、27、27.5、28、28.5、29、29.5、30、30.5、31、31.5、32、32.5、33、33.5、34、34.5、35、36、37、38、39もしくは40nmol l−1)である。関連の態様において、該第一アプタマーの濃度は約2nmol l−1〜約35nmol l−1(または、2、2.5、3、3.2、3.5、4、4.5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5、20、20.5、21、21.5、22、22.5、23、23.5、24、24.5、25、25.5、26、26.5、27、27.5、28、28.5、29、29.5、30、30.5、31、31.5、32、32.5、33、33.5、34、34.5もしくは35nmol l−1)である。

0032

〔0036〕 関連の態様において、該第一アプタマーの濃度は少なくとも0.5nmol l−1、1nmol l−1、2nmol l−1、3nmol l−1、3.2nmol l−1、4nmol l−1、5nmol l−1、6nmol l−1、7nmol l−1、8nmol l−1、9nmol l−1、10nmol l−1、11nmol l−1、12nmol l−1、13nmol l−1、14nmol l−1、15nmol l−1、16nmol l−1、17nmol l−1、18nmol l−1、19nmol l−1、20nmol l−1、21nmol l−1、22nmol l−1、23nmol l−1、24nmol l−1、25nmol l−1、26nmol l−1、27nmol l−1、28nmol l−1、29nmol l−1、30nmol l−1、31nmol l−1、32nmol l−1、33nmol l−1、34nmol l−1、35nmol l−1、36nmol l−1、37nmol l−1、38nmol l−1、39nmol l−1、または40nmol l−1である。関連の態様において、該第一アプタマーの濃度は少なくとも1nmol l−1である。関連の態様において、該第一アプタマーの濃度は少なくとも3nmol l−1である。関連の態様において、該第一アプタマーの濃度は少なくとも5nmol l−1である。関連の態様において、該第一アプタマーの濃度は少なくとも10nmol l−1である。関連の態様において、該第一アプタマーの濃度は少なくとも20nmol l−1である。関連の態様において、該第一アプタマーの濃度は少なくとも30nmol l−1である。関連の態様において、該第一アプタマーの濃度は少なくとも32nmol l−1である。

0033

〔0037〕 別の態様及びここに開示の実施形態のいずれかにおいて、該第二アプタマーの濃度が約5nM〜約200nm(または5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195もしくは200nM)である。関連の態様において、該第二アプタマーの濃度は約2.5nM〜約100nM(または2.5、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95もしくは100nM)である。関連の態様において、該第二アプタマーの濃度は約10nM〜約100nM(または10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95もしくは100nM)である。

0034

〔0038〕 関連の態様において、該第二アプタマーの濃度は少なくとも2.5nM、3nM、5nM、10nM、15nM、20nM、25nM、30nM、35nM、40nM、45nM、50nM、55nM、60nM、65nM、70nM、75nM、80nM、85nM、90nM、95nMまたは100nMである。関連の態様において、該第二アプタマーの濃度は少なくとも2nMである。関連の態様において、該第二アプタマーの濃度は少なくとも2.5nMである。関連の態様において、該第二アプタマーの濃度は少なくとも5nMである。関連の態様において、該第二アプタマーの濃度は少なくとも10nMである。関連の態様において、該第二アプタマーの濃度は少なくとも20nMである。関連の態様において、該第二アプタマーの濃度は少なくとも30nMである。関連の態様において、該第二アプタマーの濃度は少なくとも40nMである。関連の態様において、該第二アプタマーの濃度は少なくとも50nMである。関連の態様において、該第二アプタマーの濃度は少なくとも60nMである。関連の態様において、該第二アプタマーの濃度は少なくとも70nMである。関連の態様において、該第二アプタマーの濃度は少なくとも80nMである。関連の態様において、該第二アプタマーの濃度は少なくとも90nMである。関連の態様において、該第二アプタマーの濃度は少なくとも100nMである。

0035

〔0039〕 本開示はさらに少なくとも約15〜少なくとも約100個のヌクレオチド(または少なくとも約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100個のヌクレオチド)、少なくとも1つのC−5修飾ピリミジンを含み、かつ微生物の細胞表面タンパク質に結合可能な核酸分子について記載する。

0036

〔0040〕 別の態様において、該核酸分子は約15〜約50個のヌクレオチド(または15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49もしくは50個のヌクレオチド)を含む。

0037

〔0041〕 別の態様において、該核酸分子は少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、または21個のC−5修飾ピリミジンを含む。

0038

〔0042〕 別の態様において、該核酸分子はC−5修飾ピリミジンを少なくとも10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%以上含む。
〔0043〕 別の態様において、該核酸分子は約0.03nM〜約4.7nM(または0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.2、0.21、0.22、0.23、0.24、0.25、0.26、0.27、0.28、0.29、0.3、0.31、0.32、0.33、0.34、0.35、0.36、0.37、0.38、0.39、0.4、0.41、0.42、0.43、0.44、0.45、0.46、0.47、0.48、0.49、0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7nM)の平衡結合定数(Kd)で細胞表面タンパク質に結合可能である。

0039

〔0044〕 別の態様において、該核酸分子は少なくとも約0.03、0.07、0.08、0.14、0.15、0.16、0.22、0.35、0.47、0.63、0.73、0.79、0.84、1.3、1.35、1.98、2.17、3.9及び4.73nMの平衡結合定数(Kd)で細胞表面タンパク質に結合可能である。

0040

〔0045〕 別の態様において、該C−5修飾ピリミジンは5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−デオキシシチジン(BndC);5−(N−2−フェニルエチルカルボキシアミド)−2’−デオキシシチジン(PEdC);5−(N−3−フェニルプロピルカルボキシアミド)−2’−デオキシシチジン(PPdC);5−(N−1−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシシチジン(NapdC);5−(N−2−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシシチジン(2NapdC);5−(N−1−ナフチル−2−エチルカルボキシアミド)−2’−デオキシシチジン(NEdC);5−(N−2−ナフチル−2−エチルカルボキシアミド)−2’−デオキシシチジン(2NEdC);5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(BndU);5−(N−イソブチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(iBudU);5−(N−トリプタミノカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(TrpdU);5−(N−[1−(3−トリメチルアモニウム(trimethylamonium)プロピル]カルボキシアミド)−2’−デオキシウリジンクロライド及び5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NapdU)からなる群より選択される。

0041

〔0046〕 別の態様において、該微生物は細菌細胞、寄生虫及びウイルスからなる群より選択される。
〔0047〕 別の態様において、該微生物は細菌細胞である。関連の態様において、該細菌細胞は病原性である。

0042

〔0048〕 別の態様において、該細菌細胞はブドウ球菌細胞である。関連の態様において、該細菌細胞は黄色ブドウ球菌細胞である。
〔0049〕 別の態様において、該細胞表面タンパク質は細菌細胞表面タンパク質である。

0043

〔0050〕 別の態様において、該細胞表面タンパク質はSPA、ClfA、ClfB、FnbA、FnbB、IsdA、IsdB、IsdC、IsdH及びSasDからなる群より選択される。

0044

〔0051〕 別の態様において、該第一細胞表面タンパク質はSPA及びClfAからなる群より選択される。
〔0052〕 別の態様において、該核酸分子はGGCWWCGGGWACCWAWWAWNGGWWWAGCC(N)nGWC(配列番号14)の配列を含み、ここでWがそれぞれの存在について独立してC−5修飾ピリミジン、Nが非修飾または修飾ヌクレオチドのいずれか、及びnが0、1、2、3、4または5である。関連の態様においてnは2である。

0045

〔0053〕 別の態様において、該核酸分子の長さは少なくとも約32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49または50個のヌクレオチドである。

0046

〔0054〕 別の態様において、該核酸分子の長さは約32〜約100個のヌクレオチド(または32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100個のヌクレオチド)である。

0047

〔0055〕 別の態様において、該核酸分子はAWCWGGWWC(N)nAWCWGGWWWWWAAG(配列番号15)の配列を含み、ここでWがそれぞれの存在について独立してC−5修飾ピリミジン、Nが非修飾または修飾ヌクレオチドのいずれか、及びnが0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29または30である。関連の態様において、nは5〜20(または5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19もしくは20)である。別の態様において、nは10〜18(または10、11、12、13、14、15、16、17もしくは18)である。関連の態様において、nは約16である。

0048

〔0056〕 別の態様において、該核酸分子の長さは少なくとも約18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49または50個のヌクレオチドである。

0049

〔0057〕 別の態様において、該核酸分子の長さは約18〜約100個のヌクレオチド(または18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100個のヌクレオチド)である。

0050

〔0058〕 別の態様において、該核酸分子は配列番号1〜8及び10〜12からなる群より選択される配列を有する核酸分子を含み、ここでWはC−5修飾ピリミジンである。

0051

〔0059〕 別の態様において、該C−5修飾ピリミジンは5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−デオキシシチジン(BndC);5−(N−2−フェニルエチルカルボキシアミド)−2’−デオキシシチジン(PEdC);5−(N−3−フェニルプロピルカルボキシアミド)−2’−デオキシシチジン(PPdC);5−(N−1−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシシチジン(NapdC);5−(N−2−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシシチジン(2NapdC);5−(N−1−ナフチル−2−エチルカルボキシアミド)−2’−デオキシシチジン(NEdC);5−(N−2−ナフチル−2−エチルカルボキシアミド)−2’−デオキシシチジン(2NEdC);5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(BndU);5−(N−イソブチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(iBudU);5−(N−トリプタミノカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(TrpdU);5−(N−[1−(3−トリメチルアモニウム(trimethylamonium)プロピル]カルボキシアミド)−2’−デオキシウリジンクロライド及び5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NapdU)からなる群より選択される。

0052

〔0060〕 本開示はさらに前述の核酸分子を含む試料中の微生物の有無の検出キットについて記載する。
〔0061〕 本発明の前述及び他の目的、特徴、及び有利な点は、添付図面を参照しながら進められる以下の詳細な記載からさらに明らかとなる。

図面の簡単な説明

0053

図1は、常磁性ビーズ上に固定したSpAアプタマーでの黄色ブドウ球菌の捕捉を示す。菌体捕捉効率を、ビーズの定量培養により算出した。図1Aにおいて、アプタマー濃度は20nmol l−1に固定して0.1ml試料中の菌体を捕捉した。



図1Bにおいて、細胞密度は0.1ml試料中6600CFUに固定し、また捕捉アプタマー濃度は変化させた。



捕捉効率は、定量培養によって算出した。
図2は、アプタマーに基づく黄色ブドウ球菌の捕捉及び、シングルゲノムコピーのqPCRと比べて非常に多数の細胞表面成分に結合したアプタマーのqPCRによる信号増幅を示す。増幅不可能、ビオチン化ClfAアプタマー4522−5または4503−73を黄色ブドウ球菌または表皮ブドウ球菌陰性対照)の捕捉に用い、続いて、増幅可能SpAアプタマー4520−8を用いて検出を行った。ランダムアプタマーライブラリを検出用陰性対照として用いた。参照のため同じ細胞力価(108細胞ml−1)を用いてゲノム標的(sasD遺伝子)のPCR増幅を行った。
図3は、大腸菌において組換型として過剰発現させ、さらにNi−NTアガロース及びStreptactin Sepharose上の親和性クロマトグラフィーで精製した、黄色ブドウ球菌細胞表面関連タンパク質のSDS−PAGE分析を示す。
図4は、SELEXプール4520NapdU及び4531TrpdUからの個々のアプタマーでの放射標識親和性結合アッセイを示し、ここでは0.001〜100nmol l−1に段階希釈した精製SpAタンパク質を用いた(図4A)及び107、106、105、及び104CFU ml−1に希釈した細胞全体(図4B)を用いた。
図4は、SELEXプール4520NapdU及び4531TrpdUからの個々のアプタマーでの放射標識親和性結合アッセイを示し、ここでは0.001〜100nmol l−1に段階希釈した精製SpAタンパク質を用いた(図4A)及び107、106、105、及び104CFU ml−1に希釈した細胞全体(図4B)を用いた。
図5は、常磁性ストレプトアビジンビーズ上に固定したSpA及びClfAアプタマーでの細菌細胞の捕捉を示す。捕捉効率は、低細胞密度での半定量培養(図5A)または高細胞密度での濁り度の減少(図5B)によってモニターした。
図5は、常磁性ストレプトアビジンビーズ上に固定したSpA及びClfAアプタマーでの細菌細胞の捕捉を示す。捕捉効率は、低細胞密度での半定量培養(図5A)または高細胞密度での濁り度の減少(図5B)によってモニターした。

0054

I.用語及び方法
〔0067〕別途指定されない限り、本明細書で使用する技術用語は、従来の用法にしたがって用いられる。分子生物学における一般的用語の定義は、Benjamin Lewin、 Genes V、Oxford University Press発行、 1994 (ISBN 0−19−854287−9); Kendrew et al. (eds.)、The Encyclopedia of Molecular Biology、Blackwell Science Ltd.発行、 1994 (ISBN 0−632−02182−9);及びRobert A. Meyers (ed.)、 Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference、VCH Publishers、 Inc.発行、 1995 (ISBN 1−56081−569−8)に見出すことができる。

0055

〔0068〕 本開示の各種実施形態を評価しやすくするため、特定の用語について以下に説明する。
〔0069〕アプタマー:本明細書で用いる際、「アプタマー」という用語は、標的分子に望ましい作用を有する非天然核酸を指す。望ましい作用には、限定するものではないが、標的の結合、標的の触媒的変化、標的または標的の機能的活性修正あるいは変化させるような標的との反応、(自殺阻害剤におけるような)標的への共有結合的付着、及び標的と別の分子の間の反応促進が含まれる。

0056

〔0070〕アプタマー親和性複合体:本明細書で用いる際、「アプタマー標的親和性複合体」、「アプタマー親和性複合体」または「アプタマー複合体」または「複合体」という用語は、アプタマーとその標的分子との相互作用によって形成される非共有結合複合体を指す。「アプタマー標的親和性複合体」、「アプタマー親和性複合体」または「アプタマー複合体」または「複合体」は、1より多いそのような複合体のセットを指す。アプタマー標的親和性複合体、アプタマー親和性複合体またはアプタマー複合体もしくは複合体は、一般的に、環境条件の変化、例えば、温度の上昇、塩濃度の増加、または変性剤の添加によって、逆行または分離させることができる。しかしながら、所望であれば、そのような複合体は共有結合的な相互作用であり得る。

0057

〔0071〕増幅可能:増幅可能という用語は、本明細書で用いる際、複製またはコピー可能でより多くのそのコピーを作製できる分子(例えば、核酸分子またはアプタマー)を指す。

0058

〔0072〕類似体:類似体という用語は、本明細書で用いる際、構造的化学類似体並びに機能的化学類似体を指す。構造的化学類似体は、別の化学化合物と同様な構造を有するが、1以上の原子または官能基が異なる化合物である。この違いは、原子または官能基の添加、原子または官能基の不在、原子または官能基の置換、またはその組合せによるものであり得る。機能的化学類似体は、同様の化学的生化学的及び/または薬理学的特性を有する化合物である。類似体という用語は、化合物のS及びR立体異性体をも含んでよい。

0059

〔0073〕生物活性:生物活性という用語は、本明細書で用いる際、生理学的または病態生理学的プロセスに影響し得る1以上の細胞間、細胞内また細胞外プロセス(例えば、細胞‐細胞結合、リガンド‐受容体結合、細胞シグナリング等)を指す。

0060

〔0074〕生物試料:生物試料は、本明細書で用いる際、「試料」及び「テスト試料」を指し、これらは交換可能に用いられ、あらゆる材料、生物学的液体組織または個体から取得する細胞もしくはその他個体に由来するものを指す。この例として、血液(全血白血球末梢血単核細胞バフィーコート血漿、及び血清を含む)粘液洗浄液、鼻の息、息、尿、精液唾液髄膜液、羊水液、リンパ液乳頭吸引液気管支吸引液滑液、関節吸引液、細胞、細胞抽出物、及び脳脊髄液があげられる。例としてはさらに、上記の全ての実験的に分離された画分もあげられる。例えば、血液試料は血清または血液細胞の特定のタイプを含有する、赤血球細胞白血球細胞(白血球)等の画分に分画できる。必要であれば、試料は、組織及び液体試料の組合せ等の、個体由来の試料の組合せであることができる。「生物試料」という用語はまた、例えば、糞便試料、組織試料、または組織生検等に由来する、ホモジナイズされた固形材料を含有する、材料も含む。「生物試料」という用語はまた、組織培養または細胞培養に由来する材料も含む。生物試料の取得に適切な方法であればいずれも採用可能であり、その代表例としては静脈切開スワブ(例えば、口腔スワブ)、及び穿刺吸引細胞診手法などがあげられる。穿刺吸引が可能な組織の代表例としてはリンパ節、肺洗浄、BAL(気管支肺胞洗浄)、甲状腺、及び肝臓があげられる。試料は、顕微解剖(例えば、レーザーキャプチャー顕微解剖(LCM)またはレーザー顕微解剖(LMD))、膀胱洗浄スメアー(例えば、PAPスメアー)、もしくは管洗浄等によってさらに回収可能である。個体から取得または個体に由来する「生物試料」には、個体から取得後に任意の適切な方式で処理したあらゆる試料が含まれる。

0061

〔0075〕 C−5修飾ピリミジン:C−5修飾ピリミジン(またはC−5修飾ヌクレオチド)は、本明細書で用いる際、C−5位に修飾があるピリミジンを指す。C−5修飾ピリミジンの例として、米国特許第5,719,273号及び同第5、945、527号、並びに、「ヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチド(Nuclease Resistant Oligonucleotides)」と題して2010年12月14日に出願の米国仮特許出願第61/422,957号に記載のものがあげられる。追加例をここに記載する。

0062

〔0076〕細胞表面タンパク質:細胞表面タンパク質は、本明細書で用いる際、細胞の表面、細胞膜細胞壁エンベロープ上に発現されるか、または、細胞膜もしくは細胞壁エンベロープ及び/または細胞の細胞内スペース内に発現されたタンパク質の1部分またはドメインを有する細胞の外部表面上、細胞膜の外部上もしくは細胞壁エンベロープ上に、露出するドメインを有するタンパク質を指す。

0063

〔0077〕コンセンサス配列:コンセンサス配列は、本明細書で用いる際、配列アライメントを行った一連核酸配列の各位置で、最も高頻度に見られたヌクレオチドを表すヌクレオチド配列を指す。

0064

〔0078〕共有結合:共有結合または相互作用は、原子間の少なくとも一対の電子共有に関与する化学結合を指す。
〔0079〕濃縮:濃縮(enrich)(濃縮(enrichment))という用語は、本明細書で用いる際、少なくとも1つの成分(例えば、複合体またはアプタマー‐標的複合体)または成分群が比例で表した場合に結果的に別の成分または成分群と比べて増加するようなプロセスに、試料をかけることを意味する。濃縮は、1つの成分が別の成分と比べて少なくとも5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%増加することを意味してよい。

0065

〔0080〕阻害:阻害という用語は、本明細書で用いる際、ペプチドまたはポリペプチドの発現を、該ペプチドまたはポリペプチドがもはや測定可能活性または生物活性を有しない程度に防ぐかまたは低減させる、または、ペプチドまたはポリペプチドの安定性を低減、及び/またはその活性を、該ペプチドまたはポリペプチドが測定可能な活性または生物活性をもはや有しない程度に低減または防ぐことを意味する。

0066

〔0081〕微生物:微生物という用語は、本明細書で用いる際、単細胞または多細胞生物を指し、細菌、古細菌原生動物菌類藻類微小植物輪虫類渦虫類、ウイルス等を含み得る。

0067

〔0082〕 修飾:修飾される(または修飾するもしくは修飾)という用語及びそのいずれかのバリエーションは、オリゴヌクレオチドに関して用いる場合、オリゴヌクレオチドの4つの構成要素であるヌクレオチド塩基(すなわち、A、G、T/U、及びC)の少なくとも1つが、天然に生じるヌクレオチドの類似体またはエステルであることを意味する。

0068

〔0083〕 調節:調節という用語は、本明細書で用いる際、基準発現量に対してペプチド、タンパク質またはポリペプチドの発現量を増加または減少させることによって、その発現量を変化させること、及び/または、基準安定性及び/または活性レベルに対してペプチド、タンパク質またはポリペプチドの安定性及び/または活性レベルを増強または低減させることによって、その安定性及び/または活性を変化させることを意味する。

0069

〔0084〕非共有結合:非共有結合または非共有相互作用は、原子間の電子対の共有を含まない、化学結合または相互作用を指す。非共有結合または相互作用の例としては、水素結合イオン結合静電結合)、ファンデルワールス力及び疎水性相互作用があげられる。

0070

〔0085〕核酸:核酸は、本明細書で用いる際、DNA、RNA及び/またはその類似体を含有するあらゆる核酸配列を指し、またこれは一本鎖二本鎖及び複数鎖の形を含んでよい。「核酸」、「オリゴ」、「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、交換可能に使用してよい。

0071

〔0086〕医薬的に許容される:医薬的に許容されるとは、本明細書で用いる際、動物及びとりわけ人間における使用について、連邦政府もしくは州政府の規制当局により認可される、または米国薬局方もしくはその他の一般的に認められる薬局方に記載されていることを意味する。

0072

〔0087〕医薬的に許容される塩:医薬的に許容される塩または化合物(例えば、アプタマー)の塩は、本明細書で用いる際、イオン結合を含有する生成物を指し、代表的には化合物を、個体への投与に好適な酸または塩基のどちらかと反応させて生成する。医薬的に許容される塩の例としては、限定するものではないが、酸付加塩類、例えば、塩酸塩臭化水素酸リン酸塩硫酸塩、硫酸水素塩アルキルスルホン酸塩アリールスルホン酸塩、アリールアルキルスルホン酸塩、酢酸塩安息香酸塩クエン酸塩マレイン酸塩フマル酸塩コハク酸塩乳酸塩、及び酒石酸塩アルカリ金属カチオン、例えば、Li、Na、K、アルカリ土類金属塩、例えばMgもしくはCa、または有機アミン塩があげられる。

0073

〔0088〕医薬組成物:医薬組成物は、本明細書で用いる際、個体投与に好適な形態のアプタマーを含む製剤を指す。医薬組成物は、典型的にはその意図する投与経路適合するように製剤化される。投与経路の例としては、限定するものではないが、経口及び非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、吸入局所経皮、経粘膜、及び直腸投与があげられる。

0074

〔0089〕 SELEX:SELEXという用語は、本明細書で用いる際、通常、望ましい方式にて標的分子と相互作用する核酸についての選択を指し、例えば、高親和性でのタンパク質との結合及び選択した核酸の増幅があげられる。SELEXは、特定の標的分子に高親和性を有するアプタマーの同定に用いてもよい。SELEX及び「SELEXプロセス」という用語は交換可能に用いてよい。

0075

〔0090〕配列同一性:配列同一性は、本明細書で用いる際、2つ以上の核酸配列との関連で、ギャップ数及び2つ以上の配列のアライメントを最適にするのに導入を要する各ギャップの長さを考慮した、これら配列で共有する同一のヌクレオチド位置の数の関数である(すなわち、%同一性=同一位置の数/全位置の数x100)。配列比較及び2つ以上の配列間の%同一性の決定は、そのデフォルトパラメータでのBLASTやGapped BLASTプログラム等の数学アルゴリズムを用いて行うことができる(例えば、Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403, 1990;BLASTN at www.ncbi.nlm.nih.gov/BLASTを参照)。配列比較に関しては、典型的には1つの配列が、試験配列と比較する基準配列として作用する。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験及び基準配列をコンピュータに入力、必要に応じてサブ配列座標を指定、さらに配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。次いで配列比較アルゴリズムによって、試験配列(または複数の試験配列)の基準配列に対する%配列同一性が、指定したプログラムパラメーターに基づいて、算出される。比較に最適な配列のアライメントを、例えば、Smith及びWaterman(Adv. Appl. Math., 2:482, 1981)の局地的相同性アルゴリズム、Needleman及びWunsch(J. Mol. Biol., 48:443, 1970)の相同性アライメントアルゴリズム、Pearson及びLipman(Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988)の類似性サーチ法、これらアルゴリズムのコンピュータ化された実施(GAP、BESTFIT、FASTA、及びTFASTA、Wisconsin Genetics Software PackageにおけるGenetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.)、または目視検査(通常、Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, pub. by Greene Publishing Assoc.及びWiley−Interscience (1987)を参照)によって実施できる。本明細書で用いる際、核酸の%同一性を記載する場合、例えばSpa(またはSPA)アプタマー、その配列が少なくとも、例えば、基準ヌクレオチド配列に約95%同一であれば、当該核酸配列が基準核酸配列の100ヌクレオチドにつき5つまでの点突然変異を有する場合を除き、この核酸配列は基準配列と同一であることを意味する。換言すれば、望ましい核酸配列を取得するには、その配列の少なくとも約95%が基準核酸配列に同一であれば、その基準配列中の5%までのヌクレオチドを検出または別のヌクレオチドと置換してよいか、またはこの基準配列中のヌクレオチドの全数の5%までのヌクレオチドの数をこの基準配列(ここで挿入配列と称する)に挿入してよい。望ましい配列生成のための基準配列のこうした突然変異は、基準ヌクレオチド配列の5’もしくは3’末端位置または、これら末端位置間のいずれかの位置であって、該基準配列中ヌクレオチド間に別個にかもしくは該基準配列内の1以上の隣接基間のどちらかに挿入され点在する位置にて発生し得る。

0076

〔0091〕固体支持体:固体支持体は、分子が、直接もしくは間接的に、共有かまたは非共有結合を介して付着し得る表面を有するあらゆる基材を指す。固体支持体の例には、その表面に付加する捕捉要素またはプローブ物理的な支持を提供可能なあらゆる基材材料が含まれる。材料は通常、捕捉要素またはプローブのその表面への付着、並びに、あらゆる後続処理、取扱、またはアッセイ実行中に遭遇する加工に関連する条件に耐えうる。材料は、天然に生じる材料、合成材料、または天然に生じる材料を修飾した材料であってよい。適当な固体支持体材料は、シリコン、シリコンウェーハチップ、グラファイト、鏡面、積層、膜、セラミックプラスチック(例えば、ポリビニルクロライド)、シクロオレフィン共重合体、アガロースゲルもしくはビーズ、ポリアクリルアミドポリアクリラートポリエチレンポリプロピレン、ポリ(4−メチルブテン)、ポリスチレンポリメタクリレート、ポリ(エチレンテレフタレート)、ポリテトラフルオロエチレン(PTFEまたはTeflon(登録商標))、ナイロン、ポリ(ビニルブチラート)等のポリマーを含む)、ゲルマニウム、ヒ化ガリウム、金、銀、ラングミュア‐ブロジェット膜、フロースルーチップ等の、それ自身で用いるかまたは他の材料と併用するものを含んでよい。シリカを含み、かつ、例えば、バイオガラスとして利用可能なガラスをさらに含む、ガラス等のさらなる硬質材料も考慮してよい。利用してよい他の材料は、例えば、制御孔ガラスビーズ、架橋ビーズSepharose(登録商標)、もしくはアガロース樹脂等の多孔質材料、または架橋ビス−アクリルアミド及びアザラクトンコポリマーを含む。他のビーズは、ナノ粒子、ポリマービーズ、固体コアビーズ、常磁性ビーズ、またはマイクロビーズを含む。例えば、表面上に取り込まれた、1つ以上の官能基、例えば、アミノカルボキシルチオール、またはヒドロキシル官能基のいずれかを有することができる、当該技術分野で既知の任意の他の材料も企図される。

0077

〔0092〕固体支持体に用いられる材料は、単純から複雑までの範囲に及ぶ多様な構成のうちのいずれをとってもよい。固体支持体は、ストリッププレートディスクロッド粒子、ビーズ、チューブ、ウェル(マイクロタイター)等を含む、多くの形状のうちのいずれか1つを有することができる。固体支持体は、多孔質または非多孔質磁性、常磁性または非磁性多分散または単分散親水性または疎水性であってもよい。固体支持体はまた、密接に充填された(カラムマトリックスにおけるように)または緩やかに充填された粒子のゲルまたはスラリーの形態であってもよい。

0078

〔0093〕 一実施形態において、捕捉要素が付着した固体支持体を用いて、タグ付アプタマー−標的親和性複合体またはアプタマー−標的共有結合複合体試験混合物から捕捉する。1つの具体例において、タグがビオチン部分である場合、固体支持体は、ストレプトアビジンを被覆したビーズまたは樹脂、例えば、DynabeadsM−280ストレプトアビジン、Dynabeads MyOneストレプトアビジン、Dynabeads M−270ストレプトアビジン(インビトロジェン)、ストレプトアビジンアガロース樹脂(ピアス)、ストレプトアビジンUltralink樹脂、MagnaBindストレプトアビジンビーズ(サーモフィッシャーサイエンティフィック)、BioMagストレプトアビジン、ProMagストレプトアビジン、シリカストレプトアビジン(バングズラボラトリーズ)、ストレプトアビジンセファロースHigh Performance(GEヘルスケア)、ストレプトアビジンポリスチレンミクロスフェア(ミクロスフェア‐ナノスフェア)、ストレプトアビジン被覆ポリスチレン粒子スフェロテック)、またはビオチンタグ付き分子を捕捉するために当業者によって一般的に用いられる任意の他のストレプトアビジンを被覆したビーズもしくは樹脂であってもよい。

0079

〔0094〕 本発明の1つの目的は、タンパク質シグナルをアプタマーシグナルに変換することである。その結果として、収集/検出されたアプタマーの量は、結合した標的分子量及び試料中の標的分子量の指標となり、またそれらに直接比例し得る。第2分配またはキャッチの後に、第二固体支持体からアプタマー−標的親和性またはアプタマー−標的共有結合複合体を溶出させることなく、多くの検出スキームを用いることができる。以下の検出法の実施形態に加えて、他の検出法が当業者に既知である。

0080

〔0095〕 多くの検出法は、検出の前にアプタマーに取り込まれる明示的な標識を必要とする。これらの実施形態において、核酸合成のための標準技術を用いて、合成中または合成後のいずれかに、例えば、蛍光色素または化学発光色素等の標識をアプタマー内に取り込むことができる。適切な試薬とともに標準的な酵素反応を用いて、合成中または合成後のいずれかに、放射性標識を取り込むことができる。標識化はまた、好適な酵素技術を用いることによって、第2分配及び溶出の後に行うことができる。例えば、上述の標識を有するプライマーを用いて、PCRにより、溶出したアプタマーの増幅産物内に標識が取り込まれる。定量化のためにゲル技術を用いる場合、同様にPCRを用いて異なるサイズの質量標識を取り込むことができる。これらの質量標識はまた、さらなる多重化能力のために、異なる蛍光色素または化学発光色素も取り込むことができる。合成中または合成後のいずれかにアプタマーに取り込まれる特異的タグを用い、次いで、タグと会合し、かつ標識を担持するプローブを添加することによって、標識を間接的にアプタマーに添加してもよい。標識は、上述のもの、及び、例えば、比色読み取りのための標準的なアッセイに使用される酵素を含む。これらの酵素は、酵素基質と合わさって作用し、例えば、西ワサビペルオキシダーゼ(HRP)及びアルカリホスファターゼ(AP)等の酵素を含む。標識は、電気化学的検出のための電気化学的官能基である材料または化合物も含んでよい。

0081

〔0096〕 例えば、アプタマーは、試験試料と接触させる前に、上述のように32P等の放射性同位元素で標識してもよい。4つの基本的アッセイ、及び上述のようなそのバリエーションのうちのいずれか1つを利用して、アッセイ終了時に第二固体支持体上の放射活性を定量するだけで、アプタマーを検出し得る。放射活性のカウントは、元の試験試料中の標的の量に正比例する。同様に、試験試料と接触させる前に、アプタマーを上述のように蛍光色素で標識すると、第二固体支持体上で直接、単純な蛍光読み取りが可能となる。同様に、アプタマーの溶出を必要とせずに、第二固体支持体からの直接的な読み取りのために、化学発光標識または量子ドットを利用することができる。

0082

〔0097〕 別の実施形態において、アプタマー−標的親和性複合体(またはアプタマー−標的共有結合複合体)の量または濃度は、複製プロセス中に「分子ビーコン」を用いて決定される(例えば、Tyagi et al., Nat. Biotech. J. 6:49 53, 1998;米国特許第5,925,517号を参照)。分子ビーコンは、折り畳まれてヘアピンループになり、ヘアピンが形成された時に、フルオロフォアによってほとんどまたはまったくシグナルが発生しないように、ヘアピン構造の一方の端にフルオロフォアを、他方の端に消光剤を含有する、特異的核酸プローブである。ループ配列は、標的ポリヌクレオチド配列に特異的であり、アプタマー配列にハイブリダイズすると、ヘアピンの折り畳み構造がほどけ、それによって蛍光シグナルを発生する。

0083

〔0098〕 第二固体支持体になおも結合する少数のアプタマーの多重化検出のために、異なる励起発光スペクトルを有する蛍光色素を用いて、2つ、または3つ、または5つ、または最大10個の個々のアプタマーを検出及び定量できる。同様に、多重化読み取りのために、異なるサイズの量子ドットを用いることができる。第二固体支持体から遊離アプタマーを分配した後で量子ドットを導入できる。固有の量子ドットに付着したアプタマー特異的ハイブリダイゼーション配列を用いることにより、2、3、4、5、及び最大10個のアプタマーの多重化読み取りを行うことができる。個々に検出され得る異なる放射性同位体、例えば、32P、3H、13C、及び35S等を用いた異なるアプタマーの標識化も、限定された多重化読み取りに用いることができる。

0084

〔0099〕 一実施形態において、スライドまたはチップ(アジレントのアレイイルミナのBeadChipアレイ、ニンブルジェンのアレイ、またはカスタムプリントしたアレイ等)に固定された固有のプローブまたは一連の固有のプローブに各アプタマーまたは光アプタマーをハイブリダイズさせるために、標準的なDNAハイブリダイゼーションアレイ、またはチップが用いられる。それぞれの固有のプローブは、アプタマー上の配列に相補的である。相補配列は、アプタマーに取り込まれた固有のハイブリダイゼーションタグ、またはアプタマー配列の一部、または全アプタマー配列であってもよい。第二分配またはキャッチ後に固体支持体から放出されたアプタマーは、適切なハイブリダイゼーション緩衝液に添加され、標準的なハイブリダイゼーション法を用いて処理される。例えば、アプタマー溶液をDNAハイブリダイゼーションアレイとともに約60℃で12時間インキュベートして、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを確保する。アレイを洗浄し、次いで、蛍光スライドスキャナ走査して、アレイの各特徴についてアプタマーハイブリダイゼーション強度の画像を生成する。画像のセグメント化及び定量化は、ArrayVision等の画像処理ソフトウェアを使用して達成される。一実施形態において、多重化アプタマーアッセイは、最大25個のアプタマー、最大50個のアプタマー、最大100個のアプタマー、最大200個のアプタマー、最大500個のアプタマー、最大1000個のアプタマー、及び、最大10,000個のアプタマーを用いて検出できる。

0085

〔00100〕 一実施形態において、上述のようなアプタマーに相補的な固有のDNAプローブを有するアドレス可能マイクロビーズが、ハイブリダイゼーションに用いられる。マイクロビーズは、Luminexビーズ技術等の固有の蛍光色素を用いてアドレス可能であり得るか、または、Illumina VeraCode技術におけるようなバーコード標識、もしくはレーザ方式のトランスポンダーを用いる。一実施形態において、第二固体支持体から放出されたアプタマーは、適切なハイブリダイゼーション緩衝液に添加され、標準的なマイクロビーズハイブリダイゼーション法を用いて処理される。例えば、アプタマー溶液をマイクロビーズのセットとともに約60℃で2時間インキュベートして、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを確保する。次いで、個々のビーズの種類を数えてアプタマー蛍光シグナルを定量するLuminex機器で溶液を処理する。別の実施形態において、VeraCodeビーズをアプタマー溶液と接触させ、約60℃で2時間ハイブリダイズさせ、次いで、グリッド入りの表面に沈着させて、同定及び蛍光定量化のためにスライドスキャナを使用して走査する。別の実施形態において、トランスポンダー用マイクロビーズをアプタマー試料とともに約60℃でインキュベートし、次いでトランスポンダー用マイクロビーズに適切なデバイスを使用して定量する。一実施形態において、多重化アプタマーアッセイは、最大25個のアプタマー、最大50個のアプタマー、最大100個のアプタマー、最大200個のアプタマー、及び、最大500個のアプタマーを用いたマイクロビーズへのハイブリダイゼーションによって検出できる。

0086

〔00101〕溶出したアプタマーを含有する試料は、上述のような蛍光標識とともに固有の質量タグを取り込むように処理できる。次いで、質量標識アプタマーを、本質的にはDNAシーケンサーであるCGE機器に注入し、それらの固有の質量によってアプタマーを同定し、標識反応中に取り込まれた色素からの蛍光を用いて定量する。この技術の1つの代表的な例が、アルテアテクノロジーズによって開発されている。

0087

〔00102〕 上述の方法の多くにおいて、アプタマーの溶液は、増幅することができ、任意に、定量化前にタグ付けできる。標準的なPCR増幅が、第二固体支持体から溶出したアプタマーの溶液と共に使用できる。そのような増幅は、DNAアレイハイブリダイゼーション、マイクロビーズハイブリダイゼーション、及びCGE読み取りの前に用いることができる。

0088

〔00103〕 別の実施形態において、アプタマー−標的親和性複合体(またはアプタマー−標的共有結合複合体)は、Q−PCRを用いて検出及び/または定量される。本明細書において使用される場合、「Q−PCR」は、アッセイの結果が定量的である、すなわち、アッセイが、試験試料中に存在するアプタマーの量または濃度を定量できるような方式で、また、そのような制御条件下で行われるPCR反応を指す。

0089

〔00104〕 一実施形態において、試験試料中のアプタマー−標的親和性複合体(またはアプタマー−標的共有結合複合体)の量または濃度は、TaqMan(登録商標)PCRを用いて決定される。この技術は、一般的に、標的配列からシグナルを発生させるために、オリゴヌクレオチド複製酵素の5’−3’エキソヌクレアーゼ活性に依存する。TaqManプローブは、定量されるアプタマーの配列に基づいて選択され、一般的に、例えば、6−カルボキシフルオレセイン等の5’末端フルオロフォア、及び、例えば、6−カルボキシテトラメチルフルオレセイン等の3’末端消光剤を含み、アプタマー配列がポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いて増幅されるとシグナルを発生する。ポリメラーゼがアプタマー配列をコピーすると、PCRプライマーから下流にアニーリングされたプローブからエキソヌクレアーゼ活性によりフルオロフォアが遊離され、それによってシグナルを発生する。複製産物が生成されるとシグナルが増加する。PCR産物の量は、行われる複製サイクル数、及びアプタマーの出発濃度の両方に依存する。

0090

〔00105〕 別の実施形態において、アプタマー−標的親和性複合体(またはアプタマー−標的共有結合複合体)の量または濃度は、複製プロセス中に挿入蛍光色素を用いて決定される。例えば、SYBR(登録商標)グリーン等の挿入色素は、一本鎖DNAの存在下で発生する蛍光シグナルと比較して、二本鎖DNAの存在下で大きな蛍光シグナルを発生する。PCR中に二本鎖DNA産物が形成されると、色素によって生成されるシグナルが増加する。生成されるシグナルの大きさは、PCRサイクル数及びアプタマーの出発濃度の両方に依存する。

0091

〔00106〕 別の実施形態において、アプタマー−標的親和性複合体(またはアプタマー−標的共有結合複合体)は、質量分析を用いて検出及び/または定量される。上述の酵素技術を用いて固有の質量タグを導入できる。質量分析による読み取りに、検出標識は必要なく、むしろ質量自体を用いて、同定、及び、当業者に一般的に用いられる技術を用いて、質量分析法による分析中に生じる質量ピークの位置及び質量ピーク下面積に基づいた定量の両方を行った。質量分析を使用した例は、Sequenomによって開発されたMassARRAY(登録商標)システムである。

0092

〔00107〕 SOMAmer:SOMAmer(またはSOMAmer試薬)という用語は、本明細書で用いる際、そのオフ速度の特徴が改良されているアプタマーを指す。SOMAmer試薬は、あるいは、遅いオフ速度の(Slow Off−Rate)修飾アプタマーとも称され、ここにその全体を参照として組み入れる、「改良されたOff−Rateを有するアプタマー生成方法(Method for Generating Aptamers with Improved Off−Rates)」と題する米国特許出願公開第20090004667号に記載の改良されたSELEX法により選択されてよい。遅いオフ速度の修飾アプタマーは、30分以上、60分以上、90分以上、120分以上、150分以上、180分以上、210分以上、または240分以上のオフ速度(t1/2)を有するアプタマー(疎水性修飾を有する少なくとも1つのヌクレオチドを含むアプタマーを含む)を指す。

0093

〔00108〕スペーサー配列:スペーサー配列は、本明細書で用いる際、アプタマーの核酸配列の5’末端、3’末端または5’及び3’末端の両端に共有的に結合した小分子(または複数の小分子)を含むあらゆる配列を指す。スペーサー配列の代表例としては、限定するものではないが、ポリエチレングリコール炭化水素鎖、及び標的−アプタマー結合活性を保持する一方でコンセンサス領域を接続する共有結合の分子足場を提供する他のポリマーまたはコポリマーがあげられる。ある特定の態様においては、このスペーサー配列は、例えば末端3’または5’ヒドロキシル、2’炭素、またはピリミジンのC5位もしくはプリンのC8位等の塩基修飾といった標準的な結合を介して、アプタマーに共有結合的に付着させてよい。

0094

〔00109〕 実質的に除去:実質的に除去とは、本明細書で用いる際、別の1成分(例えば、固体支持体またはアプタマー‐標的複合体に結合した材料)と比べて、少なくとも5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%以上の1成分または複数の成分(例えば、固体支持体に結合していない材料)を除去することを意味する。

0095

〔00110〕 タグ:本明細書に開示されるように、アプタマーは、「タグ」をさらに含むことができ、それは、固体支持体にアプタマー(及びそれに結合した任意の標的分子)を付着させるかまたは固定するための手段、及び/または、アプタマーまたは複合体(アプタマー−標的複合体)を検出するための手段を提供する成分を指す。「タグ」は、「捕捉要素」と会合することができる部分である。「タグ」または「捕捉要素」は、1つより多くのそのような成分のセットを指す。タグは、任意の好適な方法によって、アプタマーに付着させることができるか、または含めることができる。一般的に、タグは、アプタマーが、固体支持体に付着した捕捉要素または受容体と、直接的または間接的のいずれかで会合できるようにする。捕捉要素は、典型的には、タグとの相互作用において非常に特異的であり、かつ、それに続く処理ステップまたは手順の間に、その会合を保持するように選択(または設計)される。タグは、固体支持体上の空間的に定義されたアドレスへの、アプタマー−標的親和性複合体(または共有結合アプタマー−標的親和性複合体)の局在化を可能にすることができる。したがって、異なるタグが、固体支持体上の空間的に定義された異なるアドレスへの異なるアプタマー−標的共有結合複合体の局在化を可能にすることができる。タグは、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ペプチド核酸、ロックド核酸、オリゴ糖、多糖、抗体、アフィボディ、抗体模倣物、細胞受容体、リガンド、脂質、ビオチン、ポリヒスチジン、またはこれらの構造のあらゆる断片もしくは誘導体、上記の任意の組み合わせ、または捕捉要素(もしくは後に記載するようなリンカー分子)が特異性を持って結合するかさもなければ会合するように設計もしくは設定できる任意の他の構造であることができる。検出を目的とするタグという文脈では、タグは色素、量子ドット、放射標識、PCRプライマー部位、電気化学官能基、及び酵素に加えて検出可能な酵素基質であってよい。タグは、アプタマーに付着する2つの異なるドメインまたは領域を含んでもよく、これによってアプタマーを検出可能とする(例えば、PCRプライマー部位がアプタマーの5’または3’末端に付着し得る2つの異なる核酸配列を含むか、または、場合によっては1つのPCRプライマー部位がアプタマーの5’末端に付着し、第二PCRプライマーセット(1対の)がアプタマーの3’末端に付着する)。

0096

〔00111〕 通常、タグはSELEX前またはSELEX後のどちらかにアプタマーに加えてよい。一実施形態において、タグはアプタマーの5’末端に含まれる。別の実施形態において、タグはアプタマーの3’末端に含まれる。また別の実施形態において、タグはアプタマーの5’末端と3’末端の両方に含まれてもよい。別の実施形態において、タグはアプタマーの内部セグメントであってよい。

0097

〔00112〕標的分子:標的分子(または標的)は、本明細書で用いる際、核酸が所望の様式で作用し得るあらゆる化合物または分子を指す(例えば、標的の結合、標的を触媒的に変化させる、標的と反応して標的またはその機能的活性を修飾もしくは変性させる、標的に共有結合的に付着(自殺阻害剤におけるように)、及び標的と別の分子間の反応を促進)。標的分子の例としては、限定するものではないが、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、脂質、多糖、糖タンパク質ホルモン、受容体、抗原、抗体、ウイルス、病原体有害物質基質代謝産物遷移状態類似体、補因子、阻害剤、薬物、色素、栄養素増殖因子、細胞、組織、前述のいずれかのいずれかの部分または断片等があげられる。実質的にあらゆる化学的または生物学的エフェクターは、好適な標的であってよい。あらゆるサイズの分子が標的としての役割を果たし得る。また、標的は、標的と核酸との間の相互作用の可能性または強度を高めるようにある特定の方法で修飾することもできる。また、標的の例としては、特定化合物もしくは分子にわずかな変更を加えたバリエーション、例えば、タンパク質の場合、例えば、そのアミノ酸配列ジスルフィド結合形成グリコシル化、脂質化、アセチル化リン酸化におけるバリエーション、または、他のあらゆる操作もしくは修飾、例えば、分子の同一性を実質的に変性させない、標識成分とのコンジュゲーションがあげられる。「標的分子」または「標的」は、あるタイプの分子もしくは分子種のコピー1セット、または、アプタマーに結合可能な多分子構造を指す。「標的分子」または「標的」は、こうした2セット以上の分子を指す。

0098

〔00113〕 本明細書で用いる際、「ヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチド、もしくはデオキシリボヌクレオチド、またはそれらの修飾形態、及びその類似体を指す。ヌクレオチドは、プリン(例えば、アデニンヒポキサンチングアニン、ならびにその誘導体及び類似体)、ならびにピリミジン(例えば、シトシンウラシルチミン、ならびにその誘導体及び類似体)を含む種を含む。

0099

〔00114〕 本明細書で用いる際、「核酸」、「オリゴヌクレオチド」、及び「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチドのポリマーを指して交換可能に使用され、これらの種類の核酸、オリゴヌクレオチド、及びポリヌクレオチドのDNA、RNA、DNA/RNAハイブリッド、及び修飾型を含み、種々の実体または部分の任意の位置におけるヌクレオチド単位への付着が含まれる。「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、及び「核酸」という用語は、二本鎖または一本鎖分子、及び三重らせん分子を含む。核酸、オリゴヌクレオチド、及びポリヌクレオチドは、アプタマーという用語よりも広義の用語であるため、核酸、オリゴヌクレオチド、及びポリヌクレオチドという用語は、アプタマーであるヌクレオチドのポリマーを含むが、核酸、オリゴヌクレオチド、及びポリヌクレオチドという用語は、アプタマーに限定されない。

0100

〔00115〕 本明細書で用いる際、「修飾する」、「修飾された」、「修飾」、及びそのバリエーションのいずれかは、オリゴヌクレオチドに関して用いる場合は、オリゴヌクレオチドの4つの構成成分であるヌクレオチド塩基(すなわち、A、G、T/U、及びC)の少なくとも1つが天然に生じるヌクレオチドの類似体またはエステルであることを意味する。いくつかの実施形態において、この修飾ヌクレオチドは、ヌクレアーゼ耐性をオリゴヌクレオチドに付与する。いくつかの実施形態において、この修飾ヌクレオチドは、主にアプタマーとタンパク質標的との疎水的相互作用をもたらし、高結合効率と安定的な共結晶複合体が得られる。C−5位における置換を有するピリミジンは、修飾ヌクレオチドの1例である。修飾例としては、主鎖修飾、メチル化イソ塩基、イソシチジン及びイソグアニジン等の異例の塩基対の組合せ等があげられる。修飾としてはさらに、キャッピング等の3’及び5’修飾があげられる。他の修飾としては、1つ以上の天然に生じるヌクレオチドと類似体との置換、ヌクレオチド間修飾等、例えば、無荷電連結(例えば、メチルホスホン酸ホスホトリエステル、ホスホアミダート(phosphoamidates)、カルバメート等)を有するもの、荷電連結(例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等)を有するもの、干渉物質(例えば、アクリジンソラーレン等)を有するもの、キレーター(例えば、金属類放射性金属類、ホウ素、酸化的金属類等)を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、及び修飾結合(例えば、アルファアノマー核酸等)を有するものがあげられる。さらに、通常ヌクレオチドの糖上に存在するヒドロキシル基のいずれかはホスホン酸基またはリン酸基で置換してよく;標準的な保護基で保護してよく;または活性化してさらに別のヌクレオチドまたは固体支持体への追加連結を調製してよい。5’及び3’末端OH基はリン酸化またはアミン、約1〜約20炭素原子有機キャッピング基部分、いくつかの実施形態では約10〜約80kDaの範囲のポリエチレングリコール(PEG)ポリマー、いくつかの実施形態では約20〜約60kDaの範囲のPEGポリマー、または他の親水性もしくは疎水性生物学的もしくは合成ポリマーでリン酸化または置換可能である。いくつかの実施形態において、修飾は、ピリミジンのC−5位の修飾である。これら修飾は、直接C−5位におけるアミド連結または他のタイプの連結を介してなされ得る。

0101

〔00116〕ポリヌクレオチドは当技術分野において一般的に知られているリボースまたはデオキシリボース糖類の類似型を含有することもでき、それには2’−O−メチル−、2’−O−アリル、2’−フルオロ−または2’−アジド−リボース、炭素環式糖類似体、α−アノマー糖類、エピマー糖類、例えばアラビノースもしくはキシロース類、リキソース類、ピラノース糖類、フラノース糖類、セドヘプツロース類、非環式類似体及び脱塩基性ヌクレオシド類似体、例えばメチルリボシドが含まれる。上記で言及したように、1以上のホスホジエステル連結を代わりの連結基により置換してよい。これらの代わりの連結基には、リン酸塩がP(O)S(「チオエート」)、P(S)S(「ジチオエート」)、(O)NR2(「アミデート」)、P(O)R、P(O)OR’、COまたはCH2(「ホルムアセタール」)により置換されている態様が含まれ、ここでそれぞれのRまたはR’は独立してHまたは場合によりエーテル(−O−)連結、アリールアルケニルシクロアルキルシクロアルケニルもしくはアラルジル(araldyl)を含有する置換もしくは非置換アルキル(1〜20C)である。ポリヌクレオチド中の全ての連結が同一である必要はない。糖類、プリン類、及びピリミジン類の類似型の置換は最終産物の設計において好都合であり得、例えばポリアミド主鎖のような代わりの主鎖構造も好都合であり得る。

0102

〔00117〕 本明細書で用いる際、「ヌクレアーゼ」という用語は、オリゴヌクレオチドのヌクレオチドサブユニット間燐酸ジエステル結合を切断可能である酵素を指す。本明細書で用いる際、「エンドヌクレアーゼ」という用語は、オリゴヌクレオチドの内部の部位における1以上の燐酸ジエステル結合を切断する酵素を指す。本明細書で用いる際、「エキソヌクレアーゼ」という用語は、オリゴヌクレオチドの末端ヌクレオチドを連結する1以上の燐酸ジエステル結合を切断する酵素を指す。生物学的液体は典型的にはエンドヌクレアーゼとエキソヌクレアーゼの混合物を含有する。

0103

〔00118〕 本明細書で用いる際、「ヌクレアーゼ耐性の」及び「ヌクレアーゼ耐性」という用語は、エンドまたはエキソヌクレアーゼの基質として能力が低下したオリゴヌクレオチドを指し、例えばこうした酵素と接触すると、このオリゴヌクレオチドは分解されないか、または非修飾ヌクレオチドで構成されるオリゴヌクレオチドよりもゆっくりと分解される。

0104

〔00119〕 本明細書で用いる際、「少なくとも1つのピリミジン」という用語は、核酸の修飾に関してであれば、核酸内の1つ、数個、または全てのピリミジンを指し、核酸内のC、T、またはUのいずれかまたは全ての、どちらかの発生または全ての発生が修飾か非修飾であり得ることを示す。

0105

〔00120〕 本明細書で用いる際、A、C、G、U及びTはそれぞれ、別途明記しない限りdA、dC、dG、dU及びdTを示す。
〔00121〕 本明細書で用いる際、「核酸リガンド」、「アプタマー」、及び「クローン」は、標的分子に対する望ましい作用を有する非天然の核酸を指して交換可能に用いられる。望ましい作用は、限定するものではないが、標的の結合、標的を触媒的に変化させ、標的または標的の機能活性を修飾または変更するように標的と反応させ、共有結合的に標的に付着させること(自殺阻害剤におけるように)、及び標的と別の分子との間の反応を促進することを含む。いくつかの実施形態において、作用は、標的分子に対する特異的結合親和性であり、そのような標的分子は、Watson/Crick塩基対形成または三重らせん形成とは無関係な機構を介して核酸リガンドに結合するポリヌクレオチド以外の三次元化学構造であり、アプタマーは、標的分子によって結合されるといった既知の生理学的機能を有する核酸ではない。所与の標的に対するアプタマーは、(a)候補混合物を標的と接触させ、候補混合物中の他の核酸と比較して標的に対する高い親和性を有する核酸を、候補混合物の残りから分配可能であり、(b)候補混合物の残りからより高い親和性の核酸を分配し、(c)リガンドが豊富核酸混合物を得るようにより高い親和性の核酸を増殖させ、それによって標的分子のアプタマーが同定される、ことを含む方法によって、核酸の候補混合物から同定される核酸を含む(アプタマーは標的のリガンドである)。親和性相互作用が程度の問題であることは認識されているが、この文脈において、アプタマーのその標的に対する「特異的結合親和性」とは、アプタマーが、混合物または試料中の、他の標的以外の成分に結合するよりもはるかに高い程度の親和性でその標的に結合することを意味する。「アプタマー」または「核酸リガンド」は、特定のヌクレオチド配列を有する核酸分子のタイプまたは種のコピー1セットである。アプタマーは、任意の好適な数のヌクレオチドを含むことができる。「アプタマー」は、1つより多くのそのような分子のセットを指す。異なるアプタマーが、同じかまたは異なる数のヌクレオチドを有することができる。アプタマーは、DNAまたはRNAであってもよく、かつ一本鎖、二本鎖であってもよく、または二本鎖もしくは三本鎖領域を含有してもよい。

0106

〔00122〕 本明細書で用いる際、「タンパク質」は、「ペプチド」、「ポリペプチド」、または「ペプチド断片」と同義的に用いられる。「精製(された)」ポリペプチド、タンパク質、ペプチド、またはペプチド断片は、そのアミノ酸配列を取得する細胞、組織、または無細胞供給源に由来する細胞材料も他の混在タンパク質をも実質的に含まないかまたは、化学的に合成される際は、化学前駆体も他の化学品も実質的に含まない。

0107

〔00123〕 「SPAアプタマー」は、SPAタンパク質に結合可能なアプタマーである。「SpA」、「SPA」または「Spa」という用語は、交換可能に用いてSPAタンパク質またはSPAアプタマーを指してよい。

0108

〔00124〕 「ClfAアプタマー」は、ClfAタンパク質に結合可能なアプタマーである。
〔00125〕 「ClfBアプタマー」は、ClfBタンパク質に結合可能なアプタマーである。

0109

〔00126〕 「FnbAアプタマー」は、FnbAタンパク質に結合可能なアプタマーである。
〔00127〕 「FnbBアプタマー」は、FnbBタンパク質に結合可能なアプタマーである。

0110

〔00128〕 「IsdAアプタマー」は、IsdAタンパク質に結合可能なアプタマーである。
〔00129〕 「IsdBアプタマー」は、IsdBタンパク質に結合可能なアプタマーである。

0111

〔00130〕 「IsdCアプタマー」は、IsdCタンパク質に結合可能なアプタマーである。
〔00131〕 「IsdHアプタマー」は、IsdH多ンパク質に結合可能なアプタマーである。

0112

〔00132〕 「SasDアプタマー」は、SasDタンパク質に結合可能なアプタマーである。
〔00133〕別途説明のない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は全て、本開示が属する当該技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。単数形の「a」、「an」、及び「the」は、別途文脈上明確な指示のない限り、複数形の指示対象を含むものとする。「AまたはBを含む」は、AまたはB、またはA及びBを含むことを意味する。さらに、核酸またはポリペプチドに付す全ての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、及び全ての分子量または分子質量値はおおよその値であり、説明を目的として付与されることを理解されたい。

0113

〔01134〕 さらに、ここに記載の範囲は、範囲内の値全てについて簡潔にしてあると理解される。例えば、1〜50の範囲は1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、もしくは50(並びに、別途文脈上明記の無い限り、その分数)からなる群からのあらゆる数、数の組合せ、または部分的範囲の数を含むよう理解される。あらゆる濃度範囲パーセント範囲比率範囲、または整数の範囲は、別途指示のない限り、列挙の範囲内のあらゆる整数、及び、適宜、その分数(例えば、ある整数の10分の1や100分の1)を含むものと理解されたい。さらに、あらゆる物理的特性、例えばポリマーサブユニット、サイズまたは厚さに関連してここに列挙するあらゆる数の範囲は、別途指示のない限り、列挙範囲内の全ての整数を含むものと理解されたい。本明細書で用いる際、「約」または「実質的に〜から成る」は、別途指示のない限り、指示した範囲、値、または構造のプラスマイナス20%を意味する。本明細書で用いる際、「含む(include)」及び「含む(comprise)」という用語は、制限的ではなく、同義的に用いられる。詞「a」及び「an」は、本明細書で用いる際、列挙される成分の「1(つ)以上」を指す。択一(例えば、「または(もしくは)」)の使用は、どちらか1つ、両方、またはその選択肢のいずれかの組合せを意味すると理解されたい。

0114

〔00135〕 ここに記載のものに同様かまたは匹敵する方法や材料を本開示の実践または試験に用いることは可能であるが、好適な方法及び材料を以下に記載する。本開示で引用するすべての刊行物、特許出願、特許、及びここに記載のその他参考文献は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれるものとする。矛盾が生じる場合には、用語の説明を含む本明細書が優先される。また、材料、方法及び実施例は例示をのみ目的とするものであり、限定することは意図しない。

0115

概説
〔00136〕微生物の表面上の特定成分への結合剤は、異なる検出プラットフォームのための有用な価値ある診断ツールであり得る。

0116

SELEX
〔00137〕 SELEXには、一般に、核酸の候補混合物を調製すること、この候補混合物を所望の標的分子へ結合させて親和性複合体を生成すること、この親和性複合体を未結合の候補核酸より分離させること、この親和性複合体より結合核酸を分離して単離すること、その核酸を精製すること、及び特異的なアプタマー配列を同定することが含まれる。この方法には、選択されるアプタマーの親和性をさらに純化させるために、多数のラウンドを含めてよい。この方法には、この方法中の1以上の時点で増幅工程を含めることができる。例えば、「核酸リガンド(Nucleic Acid Ligands)」と題した米国特許第5,475,096号を参照のこと。SELEX法を使用して、その標的へ共有結合するアプタマーだけでなく、その標的へ非共有的に結合するアプタマーも産生できる。例えば、「指数的濃縮による核酸リガンドの系統進化法:Chemi−SELEX(Systematic Evolution of Nucleic Acids Ligands by Exponential Enrichment: Chemi−SELEX)」と題した、米国特許第5,705,337号を参照のこと。

0117

〔00138〕SELEX法を使用して、例えば、改善されたin vivo安定性または改善された送達特性のような改善された特性をアプタマーに付与する修飾ヌクレオチドを含有する高親和性アプタマーを同定できる。そのような修飾例には、リボース及び/またはリン酸塩及び/または塩基の位置での化学的な置換が含まれる。修飾ヌクレオチドを含有する、SELEX法で同定されるアプタマーについては、ピリミジンの5’及び2’位で化学的に修飾されたヌクレオチド誘導体を含有するオリゴヌクレオチドについて記載する、「修飾ヌクレオチドを含有する高親和性核酸リガンド(High Affinity Nucleic Acid LigandsContaining Modified Nucleotides)」と題した米国特許第5,660,985号に記載されている。米国特許第5,580,737号(上記参照)は、2’−アミノ(2’−NH2)、2’−フルオロ(2’−F)、及び/または2’−O−メチル(2’−OMe)で修飾された1以上のヌクレオチドを含有する高度に特異的なアプタマーについて記載する。拡張された物理及び化学特性を有する核酸ライブラリとSELEX及び光SELEXにおけるそれらの使用について記載する、「SELEXと光SELEX(SELEX and PHOTOSELEX)」と題した米国特許出願公開第20090098549号も参照のこと。

0118

〔00139〕 SELEXはまた、所望のオフ速度特性を有するアプタマーを同定するために使用することができる。標的分子へ結合し得るアプタマーを生成するための改善されたSELEX法について記載する、「オフ速度が改善されたアプタマーを生成するための方法(Method for Generating Aptamers with Improved Off−Rates)」と題した米国特許出願公開第20090004667号を参照のこと。上述のように、遅いオフ速度のアプタマーは、「SOMAmer」として知られる。そのそれぞれの標的分子からの解離速度がより遅いアプタマーもしくはSOMAmer試薬及び光アプタマーもしくはSOMAmer試薬を産生するための方法が記載されている。この方法は、候補混合物を標的分子と接触させ、核酸−標的複合体の形成が生じることを可能にし、及び遅いオフ速度濃縮法を実施することを含むが、ここでは解離速度が速い核酸−標的複合体が解離して再形成されない一方で、解離速度が遅い複合体はそのまま残存する。その上、この方法には、オフ速度性能が改善されたアプタマーまたはSOMAmer試薬を生成する、候補核酸混合物の産生における修飾ヌクレオチドの使用が含まれる。

0119

〔00140〕アッセイのバリエーションでは、その標的分子にアプタマーが共有結合もしくは「光架橋」できるようにする光反応官能基を含むアプタマーを用いる。例えば、「核酸リガンド診断バイオチップ(Nucleic Acid Ligand Diagnostic Biochip)」と題した米国特許第6,544,776号を参照されたい。これらの光反応アプタマーは光アプタマーとも称する。例えば、それぞれ「指数関数的濃縮による核酸リガンドの系統進化(Systematic Evolution of Nucleic Acid Ligandsby Exponential Enrichment):核酸リガンドの光選択と溶液SELEX(Photoselection of Nucleic Acid and Solution SELEX)」と題した、米国特許第5,763,177号、米国特許第6,001,577号、及び米国特許第6,291,184号;また、例えば、「核酸リガンドの光選択(Photoselection of Nucleic Acid Ligands)」と題した米国特許第6,458,539号も参照されたい。マイクロアレイを試料に接触させると、光アプタマーはその標的分子に結合する機会を得て、当該光アプタマーが光活性化され、固体支持体を洗浄して、非特異的に結合した分子を除去する。光アプタマー上で光活性化された官能基による共有結合のため、光アプタマーに結合する標的分子は通常除去されないので、厳格洗浄条件を採用してよい。

0120

〔00141〕 これらアッセイフォーマットの両方において、試料に接触させる前に、アプタマーまたはSOMAmer試薬を固体支持体上に固定する。ある特定の状況下では、しかしながら、試料と接触させる前にアプタマーまたはSOMAmer試薬を固定しても、最適なアッセイは行えない可能性がある。例えば、アプタマーまたはSOMAmer試薬の前もっての固定は、アプタマーまたはSOMAmer試薬と標的分子との、固体支持体表面上において、例えば反応時間が長引き、結果としてアプタマーまたはSOMAmer試薬のその標的分子への効率的な結合に要するインキュベーション期間延長する、といった非効率的な混合をもたらし得る。さらに、光アプタマーまたは光アプタマーをアッセイに用い、また固体支持体として利用する材料次第では、この固体支持体が、光アプタマーまたは光アプタマー及びその標的分子間の共有結合形成を引き起こすために用いた光を散乱または吸収しがちであり得る。さらに、採用した方法次第では、固体支持体の表面もまた使用した全ての標識剤曝露され影響を受けるため、そのアプタマーまたは光アプタマーに結合した標的分子の検出が不正確なものとなり得る。最後に、固体支持体上へのアプタマーまたはSOMAmer試薬の固定は一般的には、アプタマーまたはSOMAmer試薬を試料に曝露する前に、アプタマーまたはSOMAmer試薬−調製ステップ(すなわち、固定)を含み、この調製ステップはアプタマーまたはSOMAmer試薬の活性または機能性に影響し得る。

0121

〔00142〕アプタマーがその標的を溶液中にて捕捉、次いで、検出前にアプタマー−標的混合物の特定の成分を除去するよう設計された分離ステップの採用を可能にするアプタマーアッセイについても記載がある(「試験試料の多重化分析(Multiplexed Analyses of Test samples)」と題した米国特許出願公開第20090042206号を参照)。記載のアプタマーアッセイ法によって、核酸(すなわち、アプタマー)を検出及び定量することによる試験試料中の非核酸標的(例えば、タンパク質標的)の検出及び定量化が可能になる。記載の方法によって非核酸標的の検出及び定量用の核酸代用物(すなわち、アプタマー)が作製され、それにより、増幅を含む広範囲の核酸技術を、タンパク質標的を含むより広い範囲の所望の標的に適用することが可能になる。

0122

〔00143〕 標的がペプチドであるSELEX法の実施形態については、「精製タンパク質無しの修飾SELEX法(Modified SELEX Processes Without Purified Protein)」と題した米国特許第6,376,190号に記載がある。

0123

アプタマーへの化学修飾
〔00144〕 アプタマーは、その特性及び特徴を改善する修飾ヌクレオチドを含有してよい。こうした改善の非制限的な例として、in vivo安定性、分解に対する安定性、その標的に対する結合親和性、及び/または改善された送達特徴があげられる。

0124

〔00145〕 こうした修飾の例として、リボース及び/またはリン酸塩及び/またはヌクレオチドの塩基位置での化学的置換があげられる。修飾ヌクレオチドを含有するSELEX法で同定されたアプタマーは、「修飾ヌクレオチドを含有する高親和性核酸リガンド(High Affinity Nucleic Acid LigandsContaining Modified Nucleotides)」と題した米国特許第5,660,985号に記載されており、ピリミジンの5’−及び2’−位で化学修飾されたヌクレオチド誘導体を含有するオリゴヌクレオチドについて記載されている。米国特許第5,580,737号、(上述を参照)では、2’−アミノ(2’−NH2)、2’−フルオロ(2’−F)、及び/または2’−O−メチル(2’−OMe)で修飾した1以上のヌクレオチドを含有する高度に特異的なアプタマーについて記載されている。さらに、拡大した物理的及び化学的特性を有する核酸ライブラリ、並びにSELEX及び光SELEXにおけるその使用について記載されている「SELEX及びPHOTOSELEX」と題した米国特許出願公開第20090098549号をも参照されたい。

0125

〔00146〕 C−5修飾の具体例としては、下記に例示のベンジルカルボキシアミド(あるいはベンジルアミノカルボニル)(Bn)、ナフチルメチルカルボキシアミド(あるいはナフチルメチルアミノカルボニル)(Nap)、トリプタミノカルボキシアミド(あるいはトリプタミノカルボニル)(Trp)、及びイソブチルカルボキシアミド(あるいはイソブチルアミノカルボニル)(iBu)から独立して選択される置換基を有する、C−5位でのデオキシウリジンの置換があげられる。

0126

0127

〔00147〕 C−5修飾の具体例としては、デオキシウリジンの置換があげられる。C−5修飾ピリミジンの化学修飾はさらに、単独でまたはあらゆる組み合わせで、2’−位糖修飾環外アミンでの修飾、及び4−チオウリジンの置換等と組み合わせることもできる。

0128

〔00148〕 代表的なC−5修飾ピリミジンとしては、5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(BndU)、5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、5−(N−イソブチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(iBudU)、5−(N−イソブチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、5−(N−イソブチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、5−(N−トリプタミノカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(TrpdU)、5−(N−トリプタミノカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、5−(N−トリプタミノカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、5−(N−[1−(3−トリメチルアモニウム(trimethylamonium)プロピル]カルボキシアミド)−2’−デオキシウリジンクロライド、5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NapdU)、5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジンまたは5−(N−[l−(2,3−ジヒドロキシプロピル)]カルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン)があげられる。

0129

〔00149〕 存在する場合、ヌクレオチド構造への修飾は、ポリヌクレオチドのアセンブリの前または後に付与できる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分で分断され得る。ポリヌクレオチドは、標識成分とのコンジュゲーション等によって、重合後にさらに修飾できる。

0130

〔00150〕 本開示の核酸配列中に組み込んでよい修飾ヌクレオチド(例えば、C−5修飾ピリミジン)のさらなる非制限の例としては、下記があげられる。

0131

0132

式中、R’は下記のように定義される:

0133

0134

式中、
R’’’’は、分岐または直鎖低級アルキル(C1−C20);ヒドロキシル(OH)、ハロゲン(F、Cl、Br、I);ニトリル(CN);ボロン酸(BO2H2);カルボン酸(COOH);カルボン酸エステル(COOR’’);第一アミド(CONH2);第二アミド(CONHR’’);第三アミド(CONR’’R’’’);スルホンアミド(SO2NH2);N−アルキルスルホンアミド(SONHR’’);からなる群より選択され、
式中、
R’’、R’’’は独立して、分岐または直鎖低級アルキル(C1−C2));フェニル(C6H5);R’’’’置換フェニル環(R’’’’C6H4);式中、R’’’’は上記に定義される;カルボン酸(COOH);カルボン酸エステル(COOR’’’’’);式中、R’’’’’が分岐または直鎖低級アルキル(C1−C20);及びシクロアルキル;式中、R’’=R’’’=CH2)n;からなる群より選択され、
式中、n=2〜10である。

0135

〔00151〕 さらに、C−5修飾ピリミジンヌクレオチドは以下を含む:

0136

0137

〔00152〕 いくつかの実施形態において、該修飾ヌクレオチドが、ヌクレアーゼ耐性をオリゴヌクレオチドに付与する。C−5位に置換を有するピリミジンは修飾ヌクレオチドの1例である。修飾例としては、主鎖修飾、メチル化、イソ塩基、イソシチジン及びイソグアニジン等の異例の塩基対の組合せ等があげられる。修飾としてはさらに、キャッピング等の3’及び5’修飾があげられる。他の修飾としては、1以上の天然ヌクレオチドと類似体との置換、ヌクレオチド間修飾等、例えば、無荷電連結(例えば、メチルホスホン酸、ホスホトリエステル、ホスホアミダート(phosphoamidates)、カルバメート等)を有するもの、荷電連結(例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等)を有するもの、干渉物質(例えば、アクリジン、ソラーレン等)を有するもの、キレーター(例えば、金属類、放射性金属類、ホウ素、酸化的金属類等)を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、及び修飾連結(例えば、アルファアノマー核酸等)を有するものがあげられる。さらに、通常ヌクレオチドの糖上に存在するヒドロキシル基のいずれかはホスホン酸基またはリン酸基で置換してよく;標準的な保護基で保護してよく;または活性化してさらに別のヌクレオチドまたは固体支持体への追加連結を調製してよい。5’及び3’末端OH基はリン酸化またはアミン、約1〜約20炭素原子の有機キャッピング基部分、1実施形態において約10〜約80kDaの範囲のポリエチレングリコール(PEG)ポリマー、別の実施形態で約20〜約60kDaの範囲のPEGポリマー、または他の親水性もしくは疎水性生物学的もしくは合成ポリマーで置換可能である。1実施形態において、修飾は、ピリミジンのC−5位の修飾である。これら修飾は、直接C−5位におけるアミド連結または他のタイプの連結を介してなされ得る。

0138

〔00153〕ポリヌクレオチドは当該技術分野において一般的に知られているリボースまたはデオキシリボース糖類の類似型を含有することもでき、それには2’−O−メチル−、2’−O−アリル、2’−フルオロ−または2’−アジド−リボース、炭素環式糖類似体、a−アノマー糖類、エピマー糖類、例えばアラビノース、キシロース類またはリキソース類、ピラノース糖類、フラノース糖類、セドヘプツロース類、非環式類似体及び脱塩基性ヌクレオシド類似体、例えばメチルリボシドが含まれる。上記で言及したように、1以上のホスホジエステル連結を代わりの連結基により置換してよい。これらの代わりの連結基には、リン酸塩がP(O)S(「チオエート」)、P(S)S(「ジチオエート」)、(O)NR2(「アミデート」)、P(O)R、P(O)OR’、COまたはCH2(「ホルムアセタール」)により置換されている実施形態が含まれ、ここでそれぞれのRまたはR’は独立してHまたは場合によりエーテル(−O−)連結、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニルもしくはアラルジル(araldyl)を含有する置換もしくは非置換アルキル(1〜20C)である。ポリヌクレオチド中の全ての連結が同一である必要はない。糖類、プリン類、及びピリミジン類の類似型の置換は最終産物の設計において好都合であり得、例えばポリアミド主鎖のような代わりの主鎖構造も好都合であり得る。

0139

〔00154〕 以下の実施例は、ある特定の特性及び/または実施形態の例示を目的として提供される。これらの実施例は、本開示をここに記載の実施形態の特定の特性に限定するものとして理解すべきではない。

0140

黄色ブドウ球菌(本明細書にてS. aureusとも称する)
〔00155〕免疫蛍光顕微法用の表面抗原の染色は抗体−蛍光団コンジュゲートを用い、in vivo感染モデル内で比較的少数の黄色ブドウ球菌細胞を経時検出することが実証されている(Timofeyeva et al., 2014)。黄色ブドウ球菌細胞表面に対して特異的なリガンドとしての短いペプチドはファージディスプレイによって同定されており、また、合成コンセンサスペプチド(SA5−1)は、添加した生物試料中蛍光量ドットを用いて約100CFU ml−1を検出可能であった(Rao et al., 2013)。

0141

〔00156〕 主要グループとして、MSCRAMM(微生物表面成分認識接着マトリクス分子(Microbial Surface Components recognizing adhesive matrix molecules))、SERAM(分泌エキスパンドレパートリー接着分子(secretable expanded repertoire adhesive molecules))、並びにその他細胞外毒素及び免疫回避因子(Gill et al., 2005; Speziale et al., 2009)があげられる。細菌細胞全体をSELEXのために(Cao et al., 2009)、またはLiCl、リゾスタフィン、または2%SDSで細胞から抽出した表面関連タンパク質、(Palma et al., 1998; Hussain et al., 2001; Roche et al., 2003)、またはトリプシンシェービングで放出させたもの(Ythier et al., 2012)を、用いることができる。しかしながら、インビトロの表面プロテオーム組成は異なる株間で異なり、また培地増殖期に依存する。さらに、黄色ブドウ球菌以外のブドウ球菌は密接に関連したタンパク質を発現し、このことは、周到なカウンターセレクション無しでの種に特異的な試薬の単離を妨げ得る。したがって、我々は、ほとんどの増殖条件下で豊富に発現される、よく保存された、黄色ブドウ球菌に特異的な細胞表面タンパク質に注力を傾けることを選択し、これら組換型SELEX標的を産生した。

0142

〔00157〕黄色ブドウ球菌細胞表面上に露出されるタンパク質は、細胞外分子と直接相互作用可能であり、これには薬物及び抗体が含まれ、さらにこれら接着または免疫回避タンパク質は、ワクチン候補標的を表す(Stranger−Jones et al., 2006; McCarthy and Lindsay、 2010; Dreisbach et al., 2011)。黄色ブドウ球菌細胞エンベロープ、細胞壁関連タンパク質、及びタンパク質付着のためのメカニズム、は極めてよく理解されている(Dreisbach et al., 2011)。58の黄色ブドウ球菌株の全ゲノム配列比較は、しかし、接着もしくは免疫応答回避に関係するタンパク質のバリエーション、または特定株におけるタンパク質の欠損もしくは切断を明らかにした(McCarthy及びLindsay、2010)。アドヘシンは、保存LPXTGモチーフを介してペプチドグリカンへ共有結合的に付着した表面タンパク質のファミリーを含む(Schneewind et al., 1995)。表面タンパク質のプロテオーム及びトランスクリプトームプロファイリングにより、黄色ブドウ球菌において表面タンパク質が粘着表現型とよく相関することが示された(Roche et al., 2003; Ythier et al., 2012)。

0143

〔00158〕 我々がアプタマーを生成した10個の表面関連タンパク質は、SpA、ClfA、ClfB、FnbA、FnbB、SasD、IsdA、IsdB、IsdC、及びIsdHを含む。これらのタンパク質は全て、LPXTGソルターゼモチーフのトレオニン及びグリシン間のソルターゼ媒介による切断によって細胞壁に付着し、ペプチドグリカンのペンタグリシン架橋鎖にアミド連結する(Marraffini et al., 2006)。我々の目的は、黄色ブドウ球菌細胞に対する結合剤の取得であったので、表面露出ドメインを表すが、シグナル配列及び細胞壁埋込ドメインの繰返し領域を欠いた組換タンパク質を産生した。黄色ブドウ球菌タンパク質A(SpA)は細菌表面上に存在し、並びに細胞外環境に分泌される。SpAは有力な免疫回避因子であり、抗体のFc領域及びB細胞受容体(IgM)のFab領域に結合するため、オプソニン化貪食作用ブロックし、さらにB細胞死をもたらす(Falugi et al., 2013; Kobayashi and Deleo, 2013)。SpAは黄色ブドウ球菌でよく保存されているが、表皮ブドウ球菌やスタフィロコッカスヘモリチカスなどの非病原性ブドウ球菌においては不在であるため、このタンパク質は、魅力的な診断標的を表す。切断SpA変異体を有する臨床分離株は、C末端局在化シグナルを有するXC領域を欠き、したがって主に細胞外で見られることが記載されている(Sorum et al., 2013)。ClfA及びClfBは構造的に関連したフィブリノゲン結合タンパク質である(McDevitt et al., 1997; Ni Eidhin et al., 1998)。ClfBは、前鼻孔剥離上皮細胞への粘着について役割を果たす鍵となる因子の一つであり、典型的には増殖の対数期初期にて産生される(Ni Eidhin et al., 1998)。FnbA及びFnbBは、細胞外マトリクス、フィブロネクチン及びエラスチンの両方の成分に接着し、感染の間、ホスト組織のコロニー形成に重要である(Roche et al., 2004)。SasDは未知の生理学的役割を持つ接着タンパク質であると推定される(Roche et al., 2003; Ythier et al., 2012)。うち4つのタンパク質は、鉄分が制限された条件下で黄色ブドウ球菌にて誘導される鉄応答表面決定因子(iron−responsive surface determinant)(Isd)系に属し、ヘモグロビンからのヘムの捕捉(IsdB、IsdH)及びその細胞壁を介した運搬(IsdA、IsdC)のために重要である(Mazmanian et al.、 2003; Grigg et al.,2010)。

0144

〔00159〕概念証明として及びその効率評価のため、黄色ブドウ球菌細胞表面関連タンパク質に対して生成したこれらアプタマーを、qPCRを使用した黄色ブドウ球菌の捕捉及び検出、またさらにフローサイトメトリーによってその細胞を直接検出するために用いた。

0145

〔00160〕 SOMAmer(遅いオフ速度の修飾アプタマー)試薬は、一本鎖DNA(ssDNA)からできており、アミノ酸側鎖模倣物を備えるその5−プライム位置にて修飾されたピリミジン残基を含有し、またきわめて遅い(長い(30分超))解離速度を有する(Gold et al.,2010)。こうした特性は、標準的なRNAまたはDNAアプタマーと比べて、アプタマーのより良い親和性及びより良い運動特性につながる。実質的にはあらゆるタンパク質をSELEX(指数的濃縮によるリガンドの系統進化法)に用いて、キネティックチャレンジ(kinetic challenge)、分配(partitioning)、及び修飾ssDNAのランダムライブラリからの増幅を用いた選択を複数回行うことにより、特異的な高親和性アプタマーを生成可能である(Gold et al.,2010; Vaught et al.,2010)。抗体と比べてアプタマーが有利な点としては、溶液中の例外的な温度安定性、低分子量、より高い多重化能力、熱、乾燥、溶剤に対する化学的安定性、可逆的再生性、試薬製造の簡易化、一貫したロット性能及びより低いコストがあげられる。アプタマーは、1000個超のヒトタンパク質に対して生成されており、SomaLogicが開発した、これらのタンパク質を少ない(0.1ml)血液試料において同時にかつ高い精度をもって測定するためのSOMAscan(商標)プロテオミックプラットフォーム基盤となっている。この高度多重化アッセイの適用は、医療の様々な領域におけるバイオマーカー発見につながった(Gold et al., 2012)。微生物タンパク質に関しては、我々は以前にクロストリジウムディフィシル(Clostridium difficile)毒素のためのアプタマーの特性について報告し、これら結合剤の広範囲にわたる利用可能性を示した(Ochsner et al., 2013)。

0146

〔00161〕 遅いオフ速度の修飾アプタマー(SOMAmer試薬)試薬を、精製組換えまたは天然タンパク質を使用する多重修飾DNAライブラリでのSELEXによって、いくつかの黄色ブドウ球菌細胞表面関連タンパク質に対して生成した。nM未満のKdを有する高親和性結合剤を、ブドウ球菌タンパク質A(SpA)、クランピング因子(ClfA、ClfB)、フィブロネクチン結合タンパク質(FnbA、FnbB)及び鉄調節表面決定因子(Isd)について取得した。さらにスクリーニングを行ったところ、いくつかのアプタマーは試験した全株の黄色ブドウ球菌細胞に特異的に結合するが、他のブドウ球菌または他の細菌には特異的に結合しないことが明らかになった。培養及びPCRで示されたようにSpA及びClfAアプタマーは、低細胞密度マトリクスからの黄色ブドウ球菌細胞の選択的捕捉及び濃縮に有用であることが実証され、このことは、PCR阻害剤の検出限界の改善及び効率的な除去につながった。細菌細胞表面をアプタマーで被覆し、次いでこのアプタマーにqPCRを行った場合に、黄色ブドウ球菌細胞の検出は桁違いに増強された。また、蛍光標識したSpAアプタマーも、フローサイトメトリーにおけるその直接的検出剤としての有用性が実証された。

0147

アプタマー組成物を含むキット
〔00162〕 本開示は、ここに記載のアプタマーのいずれかを含むキットを提供する。例えば、このキットは、(1)標的に結合する少なくとも1つのアプタマー、(2)少なくとも1つの医薬的に許容される担体、例えば溶剤または溶液、を含み得る。追加のキット成分例としては任意で(1)ここで同定されるいずれかの医薬的に許容される賦形剤、例えば安定剤、緩衝剤等、(2)キット成分を保持及び/または混合するための少なくとも1つの容器バイアルまたは同様の装置、及び(3)送達装置をあげることができる。

0148

〔00163〕 別の態様において、本開示は、配列番号9で表すSPAタンパク質に結合するアプタマー配列を提供する。該ヌクレオチド配列はさらに下記配列に一般化してもよい:
GGCWWCGGGWACCWAWWAWNGGWWWAGCC(N)nGWC(配列番号14)
ここで配列中「W」がC−5修飾ピリミジンで占めてよい位置を表し、及び「N」が非修飾または修飾ヌクレオチドのいずれかで占めてよい位置を表し、及びnが0〜2(または0、1もしくは2)である。

0149

〔00164〕 別の態様において、NはC、T、GまたはAである。別の態様において、NはC、TまたはAである。
〔00165〕 別の態様において、ヌクレオチド配列は最大約100個のヌクレオチド、最大約95個のヌクレオチド、最大約90個のヌクレオチド、最大約85個のヌクレオチド、最大約80個のヌクレオチド、最大約75個のヌクレオチド、最大約70個のヌクレオチド、最大約65個のヌクレオチド、最大約60個のヌクレオチド、最大約55個のヌクレオチド、最大約50個のヌクレオチド、最大約45個のヌクレオチド、最大約40個のヌクレオチドを含んでよい。

0150

〔00166〕 本開示の別の態様において、アプタマーは、配列番号14のいずれかに、少なくとも約95%同一、少なくとも約90%同一、少なくとも約85%同一、少なくとも約80%同一、または少なくとも約75%同一であってよい。別の実施形態において、アプタマーは配列番号14の配列断片を含む。

0151

〔00167〕 別の態様において、アプタマーは、1〜50(または1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49もしくは50)個のC−5修飾ピリミジンを含む。別の態様において、アプタマーは5〜30(または5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29もしくは30)個のC−5修飾ピリミジンを含む。別の態様において、アプタマーは10〜15(または10、11、12、13、14もしくは15)個のC−5修飾ピリミジンを含む。

0152

〔00168〕 別の態様において、アプタマーはC−5修飾ピリミジンを約1%〜100%(または1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100%)含む。別の態様において、アプタマーはC−5修飾ピリミジンを約10%〜約50%(または10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50%)含む。別の態様において、アプタマーはC−5修飾ピリミジンを約20%〜約40%(または20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39もしくは40%)含む。別の態様において、アプタマーはC−5修飾ピリミジンを約25%〜約35%(または25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35%)含む。別の態様において、アプタマーはC−5修飾ピリミジンを約27%〜約33%(または27、28、29、30、31、32もしくは33%)含む。別の態様において、アプタマーはC−5修飾ピリミジンを約37%〜約43%(または37、38、39、40、41、42、43%)含む。

0153

〔00169〕 別の態様において、WはC−5修飾ウリジンまたはシチジンを表してよい。
〔00170〕 別の態様において、Wは下記に例示するC−5修飾ピリミジンを表してよい。

0154

0155

式中、R’は下記に定義する通りであり:

0156

0157

式中、
R’’’’が、分岐または直鎖低級アルキル(C1−C20);ヒドロキシル(OH)、ハロゲン(F、Cl、Br、I);ニトリル(CN);ボロン酸(BO2H2);カルボン酸(COOH);カルボン酸エステル(COOR’’);第一アミド(CONH2);第二アミド(CONHR’’);第三アミド(CONR’’R’’’);スルホンアミド(SO2NH2);N−アルキルスルホンアミド(SONHR’’);からなる群より選択され、
式中、
R’’、R’’’が独立して、分岐または直鎖低級アルキル(C1−C2));フェニル(C6H5);R’’’’置換フェニル環(R’’’’C6H4)(ここでR’’’’は上記に定義する通りであり);カルボン酸(COOH);カルボン酸エステル(COOR’’’’’)(ここで、R’’’’’が分岐または直鎖低級アルキル(C1−C20)であり);及びシクロアルキル(ここでR’’=R’’’=(CH2)n);からなる群より選択され、
ここで、n=2〜10である。

0158

〔00171〕 別の態様において、Wは、5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(BndU)、5−(N−イソブチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(iBudU)、5−(N−トリプタミノカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(TrpdU)、5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NapdU)及びその組合せからなる群より選択されるC−5修飾ピリミジンを表してよい。

0159

〔00172〕 別の態様において、Wは、5−(N−トリプタミノカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(TrpdU)及び5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NapdU)及びその組合せからなる群より選択されるC−5修飾ピリミジンを表す。

0160

〔00173〕 別の態様において、Wは、式Iで示す構造を含む化合物を表してよく:

0161

0162

式中、
Rが独立して−(CH2)n−、ここでnが0、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10から選択される整数であり;
RX1が独立して:

0163

0164

0165

からなる群より選択され、
式中、

0166

0167

がRX1基の−(CH2)n−基への結合点を示し;及び
式中、
RX4が独立して、置換または非置換の分岐または直鎖低級アルキル(C1−C20);ヒドロキシル基;ハロゲン(F、Cl、Br、I);ニトリル(CN);ボロン酸(BO2H2);カルボン酸(COOH);カルボン酸エステル(COORX2);第一アミド(CONH2);第二アミド(CONHRX2);第三アミド(CONRX2RX3);スルホンアミド(SO2NH2);N−アルキルスルホンアミド(SONHRX2);からなる群より選択され、
RX2及びRX3がそれぞれの存在について独立して、置換または非置換の分岐または直鎖低級アルキル(C1−C20);フェニル(C6H5);RX4置換フェニル環(RX4C6H4)(ここで、RX4は上記に定義する通りであり);カルボン酸(COOH);カルボン酸エステル(COORX5)(ここで、RX5は分岐または直鎖低級アルキル(C1−C20);及びシクロアルキル(ここで、RX2及びRX3は共に置換または非置換の5または6員環を形成する);からなる群より選択され、
Xが独立して、−H、−OH、−OMe、−O−アリル、−F、−OEt、−OPr、−OCH2CH2OCH3、−NH2及び−アジド;からなる群より選択され、
R’が独立して−H、−OAc;−OBz;−P(NiPr2)(OCH2CH2CN);及び−OSiMe2tBu;からなる群より選択され、
R’’が独立して水素、4、4’−ジメトキシトリチルDMT)及び三リン酸塩(−P(O)(OH)−O−P(O)(OH)−O−P(O)(OH)2)またはその塩;からなる群より選択され、
Zが独立して−H、置換または非置換の分岐または直鎖低級アルキル(C1−C4);
及びその塩;からなる群より選択され、
ただし以下の例外を伴う:
n=4であれば、RX1はHではありえない;
n=3であれば、RX1はCH3ではありえない;
n=0であれば、RX1は-CH(CH3)2ではありえない;及び
n=2、RX1が

0168

0169

及びRX4がヒドロキシルであれば、RX1は

0170

0171

ではありえない。
〔00174〕 関連の態様において、nは1、2または3から選択される整数である。

0172

〔00175〕関連の態様において、RX1は:

0173

0174

からなる群より選択され、
式中、

0175

0176

は、RX1基の−(CH2)n−基への結合点を示し;及び
Zは独立して−H、置換または非置換の分岐または直鎖低級アルキル(C1−C4)からなる群より選択される。

0177

〔00176〕 関連の態様において、RX4は独立して分岐または直鎖低級アルキル(C1−C6);−OH;−F及びカルボン酸(COOH)からなる群より選択される。
〔00177〕 関連の態様において、Xは独立して−H、−OH、−OMe及び−Fからなる群より選択される。

0178

〔00178〕 関連の態様において、R’は−H、−OAc及び−P(NiPr2)(OCH2CH2CN)からなる群より選択される。
〔00179〕 関連の態様において、R’’は三リン酸塩(−P(O)(OH)−O−P(O)(OH)−O−P(O)(OH)2)である。

0179

〔00180〕 別の態様において、本開示は、式II(BndC)、III(PEdC)、IV(PPdC)、V(NapdC)、VI(2NapdC)、VII(NEdC)及びVIII(2NEdC)からなる群より選択される構造を含む化合物を提供し:

0180

0181

式中、
Xが独立して−H、−OH、−OMe、−O−アリル、−F、−OEt、−OPr、−OCH2CH2OCH3、−NH2及び−アジドからなる群より選択される。

0182

〔00181〕 本開示の別の態様において、アプタマーはその標的に関して約10nM以下の解離定数(Kd)を有してよい。別の典型的な実施形態において、アプタマーはその標的タンパク質に関して約15nM以下の解離定数(Kd)を有する。さらに別の典型的な実施形態において、アプタマーはその標的タンパク質に関して約20nM以下の解離定数(Kd)を有する。さらに別の典型的な実施形態において、アプタマーはその標的タンパク質に関して約25nM以下の解離定数(Kd)を有する。さらに別の典型的な実施形態において、アプタマーはその標的タンパク質に関して約30nM以下の解離定数(Kd)を有する。さらに別の典型的な実施形態において、アプタマーはその標的タンパク質に関して約35nM以下の解離定数(Kd)を有する。さらに別の典型的な実施形態において、アプタマーはその標的タンパク質に関して約40nM以下の解離定数(Kd)を有する。さらに別の典型的な実施形態において、アプタマーはその標的タンパク質に関して約45nM以下の解離定数(Kd)を有する。さらに別の典型的な実施形態において、アプタマーはその標的タンパク質に関して約50nM以下の解離定数(Kd)を有する。さらに別の典型的な実施形態において、アプタマーはその標的タンパク質に関して約3〜10nM(または3、4、5、6、7、8、9もしくは10nM0)の範囲の解離定数(Kd)を有する。好適な解離定数は、マルチポイント滴定を使用し、式y=(最大−最小)(タンパク質)/(Kd+タンパク質)+最小をあてはめる結合アッセイで決定できる。解離定数の決定が、その測定条件に高度に依存すること、したがって数値平衡時間等のファクターによって著しく変化し得ることを理解されたい。他の実施形態において、アプタマーは配列番号1〜15から選択されるアプタマーのKd未満かまたはこれと等しいKdを有する。

0183

〔00182〕 ClfAタンパク質に結合するアプタマー配列のモチーフを、配列番号13で表す。この配列モチーフはさらに、下記配列に一般化してもよい:
AWCWGGWWC(N)nAWCWGGWWWWWAAG(配列番号15)。

0184

〔00183〕 該配列中「W」がC−5修飾ピリミジンが占めてよい位置を表し、及び「N」が非修飾または修飾ヌクレオチドまたはスペーサー配列またはリンカーのいずれかで占めてよい位置を表す。さらに、nが1〜30(または1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29もしくは30)、または2〜20(または2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19もしくは20)、または5〜18(または5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17もしくは18)、または10〜16(または10、11、12、13、14、15もしくは16)の数であってよく、またはNは約16である。

0185

〔00184〕 別の態様において、ヌクレオチド配列は最大約100個のヌクレオチド、最大約95個のヌクレオチド、最大約90個のヌクレオチド、最大約85個のヌクレオチド、最大約80個のヌクレオチド、最大約75個のヌクレオチド、最大約70個のヌクレオチド、最大約65個のヌクレオチド、最大約60個のヌクレオチド、最大約55個のヌクレオチド、最大約50個のヌクレオチド、最大約45個のヌクレオチド、最大約40個のヌクレオチド、最大約35個のヌクレオチド、最大約30個のヌクレオチド、最大約25個のヌクレオチド、及び最大約20個のヌクレオチドを含んでよい。

0186

〔00185〕 本開示の別の態様において、アプタマーは、配列番号15のいずれかに、少なくとも約95%同一、少なくとも約90%同一、少なくとも約85%同一、少なくとも約80%同一、または少なくとも約75%同一であってよい。別の実施形態において、アプタマーは配列番号15の配列断片を含む。

0187

〔00186〕 別の態様において、アプタマーはC−5修飾ピリミジンを約1%〜100%(または1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100%)含む。別の態様において、アプタマーはC−5修飾ピリミジンを約10%〜約50%(または10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50%)含む。別の態様において、アプタマーはC−5修飾ピリミジンを約20%〜約40%(または20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39もしくは40%)含む。別の態様において、アプタマーはC−5修飾ピリミジンを約25%〜約35%(または25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35%)含む。別の態様において、アプタマーはC−5修飾ピリミジンを約27%〜約33%(または27、28、29、30、31、32もしくは33%)含む。別の態様において、アプタマーはC−5修飾ピリミジンを約37%〜約43%(または37、38、39、40、41、42、43%)含む。

0188

〔00187〕 別の態様において、WはC−5修飾ウリジンまたはシチジンを表してよい。
〔00188〕 別の態様において、Wは下記に例示のC−5修飾ピリミジンを表してよい:

0189

0190

式中、R’は下記に定義する通りであり:

0191

0192

式中、
R’’’’は、分岐または直鎖低級アルキル(C1−C20);ヒドロキシル(OH)、ハロゲン(F、Cl、Br、I);ニトリル(CN);ボロン酸(BO2H2):カルボン酸(COOH);カルボン酸エステル(COOR’’);第一アミド(CONH2):第二アミド(CONHR’’);第三アミド(CONR’’R’’’);スルホンアミド(SO2NH2);N−アルキルスルホンアミド(SONHR’’);からなる群より選択され、
式中
R’’、R’’’は独立して、分岐または直鎖低級アルキル(C1−C2));フェニル(C6H5);R’’’’置換フェニル環(R’’’’C6H4)(ここでR’’’’は上記に定義する通りであり);カルボン酸(COOH);カルボン酸エステル(COOR’’’’’)(ここでR’’’’’は分岐または直鎖低級アルキル(C1−C20);及びシクロアルキル(ここでR’’=R’’’=(CH2)n);からなる群より選択され、
ここでn=2〜10である。

0193

〔00189〕 別の態様において、Wは、5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(BndU)、5−(N−イソブチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(iBudU)、5−(N−トリプタミノカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(TrpdU)、5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NapdU)及びその組合せからなる群より選択されるC−5修飾ピリミジンを表してよい。

0194

〔00190〕 別の態様において、Wは、5−(N−トリプタミノカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(TrpdU)及び5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NapdU)及びその組合せからなる群より選択される、C−5修飾ピリミジンを表してよい。

0195

別の態様において、Wは式Iに示す構造を含む化合物を表してよく:

0196

0197

式中、
Rが独立して−(CH2)n−であり、ここでnが0、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10から選択される整数であり;
RX1が独立して:

0198

0199

0200

からなる群より選択され、
式中、

0201

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