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技術 糖標的化治療剤

出願人 エコール・ポリテクニーク・フェデラル・ドゥ・ローザンヌ(ウペエフエル)アノキオン・ソシエテ・アノニム
発明者 ジェフリー・エイ・フッベルステファーヌ・コントスクリステン・マリー・ロレンツデイビッド・スコット・ウィルソンシュニング・ガイ
出願日 2015年2月20日 (5年9ヶ月経過) 出願番号 2016-570196
公開日 2017年3月16日 (3年8ヶ月経過) 公開番号 2017-507180
状態 特許登録済
技術分野 蛋白脂質酵素含有:その他の医薬 抗原、抗体含有医薬:生体内診断剤 化合物または医薬の治療活性 医薬品製剤 他の有機化合物及び無機化合物含有医薬
主要キーワード 脱気サイクル 相対測定値 アンカー側 隣接性 有機物分子 オデッセイ ダビデ スズカケノキ
関連する未来課題
重要な関連分野

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図面 (12)

課題・解決手段

標的化治療剤は、移植拒絶自己免疫疾患食物アレルギー、および治療薬に対する免疫応答治療において有用である。

概要

背景

本開示の背景
米国出願第2012/0039989号、米国出願第2012/0178139号およびWO2013/121296号は、寛容化のための抗原提示における赤血球役割活用する、赤血球への抗原の標的化を記載する。このアプローチでこれまで生じた肯定的な結果にもかかわらず、代替アプローチの可能性への関心が依然としてある。

概要

標的化治療剤は、移植拒絶自己免疫疾患食物アレルギー、および治療薬に対する免疫応答治療において有用である。

目的

本開示の概要
本開示の態様は、式1の化合物を含む組成物を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

式1の化合物を含む組成物であって:ここで:mが約1から100の整数であり;Xが、患者が望ましくない免疫応答発症する抗原、もしくはその免疫寛容誘導部分を含み;またはXが、循環タンパク質もしくはペプチドまたは抗体に特異的に結合する、抗体、抗体フラグメントもしくはリガンドを含み、該循環タンパク質もしくはペプチドまたは抗体は、移植拒絶治療薬に対する免疫応答、自己免疫疾患過敏症および/もしくはアレルギーに原因的に関与し;Yが、リンカー部分を含み;かつZが、肝臓標的化部分を含む、組成物。

請求項2

Zが、ガラクトースガラクトサミンまたはN−アセチルガラクトサミンを含む、請求項1に記載の組成物。

請求項3

YにそのC1、C2またはC6でコンジュゲートされたZを含む、請求項2に記載の組成物。

請求項4

Yが、N−ヒドロキシスクシンイミジルリンカー、マレイミドリンカー、ビニルスルホンリンカー、ピリジルジチオールポリエチレングリコール)リンカー、ピリジルジチオールリンカー、n−ニトロフェニルカーボネートリンカー、NHS−エステルリンカー、およびニトロフェノキシポリ(エチレングリコール)エステルリンカーから選択される、請求項1に記載の組成物。

請求項5

Yが:Xに特異的に結合する、抗体、抗体フラグメント、ペプチドまたは他のリガンド;ジスルファニルエチルエステル;式YaからYpの1つにより表される構造を含み:およびまたは式Y’−CMPにより表される部分を有し:ここで:左の括弧“(”は、XおよびY間の結合を示し;右または下の括弧および“)”は、YおよびZ間の結合を示し;nは約1から100の整数であり;pは約2から150の整数であり;qは約1から44の整数であり;R8は、−CH2−または−CH2−CH2−C(CH3)(CN)−であり;R9は、直接結合または−CH2−CH2−NH−C(O)−であり;かつY’はYの残存部分を表す、請求項1に記載の組成物。

請求項6

nが約40から80であり;pが約10から100であり;qが約3から20であり;R8が−CH2−CH2−C(CH3)(CN)−であり;かつR9が−CH2−CH2−NH−C(O)−である場合に、Zが、そのC1でコンジュゲートされたガラクトースまたはN−アセチルガラクトサミンである、請求項5に記載の組成物。

請求項7

Yが、式Ya、式Yb、式Yh、式Yi、式Yk、式Ymまたは式Ynを含む、請求項5に記載の組成物。

請求項8

Yが、式Ya、式Yb、式Ymまたは式Ynを含む、請求項5に記載の組成物。

請求項9

Yが、式Ya、式Yb、式Ymまたは式Ynを含む、請求項6に記載の組成物。

請求項10

Xが:移植患者が望ましくない免疫応答を発症する外来性移植抗原;患者が望ましくない免疫応答を発症する外来性の食物動物、植物もしくは環境の抗原;患者が望ましくない免疫応答を発症する外来性の治療薬;もしくは患者が望ましくない免疫応答を発症する内在性型に対する合成自己抗原、またはそれらの免疫寛容誘導部分を含む、請求項1に記載の組成物。

請求項11

式2の化合物を含む組成物であって:ここで:m’+m”が1に等しく、かつZがDOM26h−196−61である場合、Xはインターフェロンリバビリン、ネクサバールソラフェニブアービタクスセツキシマブ、アバスタチン/ベバシズマブまたはハーセプチントラスツズマブではないという条件で、m’はゼロまたは約1から10の整数であり、m”はゼロまたは約1から10の整数であり、かつm'+m”の総和は約1から10の整数であるが、少なくとも1であり;それぞれXは、外来性抗原、もしくは患者が望ましくない免疫応答を発症する自己抗原、またはその免疫寛容誘導部分を含み;それぞれYは、リンカー部分もしくは直接結合、またはXに特異的に結合する、抗体、抗体フラグメント、ペプチドもしくは他のリガンドを含み;かつZは肝臓標的化部分を含む、組成物。

請求項12

ZがASGPR標的化抗体、ASGPR標的化抗体フラグメント、ASGPR標的化ペプチド、ASGPR標的化scFv、または別のASGPRリガンドを含む、請求項11に記載の組成物。

請求項13

Xが、患者が望ましくない免疫応答を発症する関連抗原の群またはその免疫寛容誘導フラグメントの群を含む、請求項11に記載の組成物。

請求項14

Xが:インスリンプロインスリンプレプロインスリングルタミン酸デカルボキシラーゼ−65GAD−67、グルコース−6−ホスファターゼ2、インスリノーマ−関連タンパク質2、インスリノーマ−関連タンパク質2β、ICA69、ICA12、カルボキシペプチダーゼH、Imogen38、GLIMA38、クロモグラニンA、HSP−60、カルボキシペプチダーゼE、ペリフェリン、2型グルコース輸送体肝細胞癌−腸−膵臓/膵臓の関連タンパク質、S100β、グリア線維性酸性タンパク質再生遺伝子II、膵臓十二指腸ホメオボックス1、筋強直性ジストロフィーキナーゼ膵島特異的グルコース−6−ホスファターゼ触媒サブユニット−関連タンパク質、およびSSGタンパク質共役型受容体1−5の2つ以上;ミエリン塩基性タンパク質ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質、ミエリンプロテオリピドタンパク質、配列番号:11、配列番号:12、配列番号:13、配列番号:14、配列番号:15、配列番号:16、および配列番号:17の2つ以上;ならびに配列番号:24、配列番号:25、配列番号:26、および配列番号:27の2つ以上を含む群から選択される、請求項13に記載の組成物。

請求項15

Yが免疫プロテアソーム切断部位を有するリンカーである、請求項11に記載の組成物。

請求項16

Xが:移植患者が望ましくない免疫応答を発症する外来性の移植抗原;患者が望ましくない免疫応答を発症する外来性の食物、動物、植物もしくは環境の抗原;患者が望ましくない免疫応答を発症する外来性の治療薬;もしくは患者が望ましくない免疫応答を発症する内在性型に対する合成自己抗原、またはそれらの免疫寛容誘導部分を含む、請求項11に記載の組成物。

請求項17

かかる治療を必要とする哺乳類に、有効量の、式1の化合物を含む組成物を投与することによる、抗原に対する望ましくない免疫応答のための治療方法であって:ここで:mは約1から100の整数であり;Xは、患者が望ましくない免疫応答を発症する抗原、もしくはその免疫寛容誘導部分を含み;またはXは、循環タンパク質もしくはペプチドまたは抗体に特異的に結合する、抗体、抗体フラグメントもしくはリガンドを含み、該循環タンパク質もしくはペプチドまたは抗体は、移植拒絶、治療薬に対する免疫応答、自己免疫疾患、過敏症および/もしくはアレルギーに原因的に関与し;Yはリンカー部分を含み;かつZは肝臓標的化部分を含む、治療方法。

請求項18

Xが、患者が望ましくない免疫応答を発症する抗原、もしくはその免疫寛容誘導部分を含み;かつYが:Xに特異的に結合する、抗体、抗体フラグメント、ペプチドまたは他のリガンド;ジスルファニルエチルエステル;式YaからYpの1つにより表される構造を含み:およびまたは式Y’−CMPにより表される部分を有し:ここで:左の括弧“(”は、XおよびY間の結合を示し;右または下の括弧および“)”は、YおよびZ間の結合を示し;nは約1から100の整数であり;pは約2から150の整数であり;qは約1から44の整数であり;R8は、−CH2−または−CH2−CH2−C(CH3)(CN)−であり;R9は、直接結合または−CH2−CH2−NH−C(O)−であり;ならびにY’はYの残存部分を表す、請求項17に記載の方法。

請求項19

Xが、抗体、抗体フラグメントもしくはリガンドを含み、かつ前記組成物を、Xに特異的に結合する、循環タンパク質もしくはペプチドまたは抗体のクリアランスのため投与し、該循環タンパク質もしくはペプチドまたは抗体は、移植拒絶、治療薬に対する免疫応答、自己免疫疾患、過敏症および/もしくはアレルギーに原因的に関与する、請求項17に記載の方法。

請求項20

Xが、抗体、抗体フラグメントもしくはリガンドを含み、かつ移植拒絶、治療薬に対する免疫応答、自己免疫疾患、過敏症および/またはアレルギーに原因的に関与する抗体の濃度を、投与後約12から約48時間の間の時間で測定される、患者の血中で少なくとも50%w/wまで減少させるように、前記組成物を有効量で投与する、請求項17に記載の方法。

請求項21

前記組成物を抗原部分Xに関する患者の寛容化のために投与する、請求項17に記載の方法。

請求項22

Xが:移植患者が望ましくない免疫応答を発症する外来性の移植抗原;患者が望ましくない免疫応答を発症する外来性の食物、動物、植物もしくは環境の抗原;患者が望ましくない免疫応答を発症する外来性の治療薬;もしくは患者が望ましくない免疫応答を発症する内在性型に対する合成自己抗原、またはそれらの免疫寛容誘導部分を含む、請求項17に記載の方法。

請求項23

かかる治療を必要とする哺乳類に、有効量の、式2を含む組成物を投与することによる、抗原に対する望ましくない免疫応答のための治療方法であって:ここで:m’+m”が1に等しく、かつZがDOM26h−196−61である場合、Xはインターフェロン、リバビリン、ネクサバール/ソラフェニブ、アービタックス/セツキシマブ、アバスタチン/ベバシズマブまたはハーセプチン/トラスツズマブではないという条件で、m’はゼロまたは約1から10の整数であり、m”はゼロまたは約1から10の整数であり、かつm'+m”の総和は約1から10の整数であるが、少なくとも1であり;それぞれXは抗原部分であり;それぞれYは、リンカー部分もしくは直接結合、またはXに特異的に結合する、抗体、抗体フラグメント、ペプチドもしくは他のリガンドであり;かつZは肝臓標的化部分である、方法。

請求項24

抗原部分Xに特異的に結合する、循環タンパク質もしくはペプチドまたは抗体のクリアランスのために前記組成物を投与し、該循環タンパク質もしくはペプチドまたは抗体は、移植拒絶、治療薬に対する免疫応答、自己免疫疾患、過敏症および/もしくはアレルギーに原因的に関与する、請求項23に記載の方法。

請求項25

移植拒絶、治療薬に対する免疫応答、自己免疫疾患、過敏症および/またはアレルギーに原因的に関与する抗体の濃度を、投与後約12から約48時間の間の時間で測定される患者の血中で少なくとも50%w/wまで減少させるように、前記組成物を有効量で投与する、請求項23に記載の方法。

請求項26

前記組成物を抗原部分Xに関する患者の寛容化のために投与する、請求項23に記載の方法。

請求項27

ZがASGPR標的化抗体、ASGPR標的化抗体フラグメント、ASGPR標的化ペプチド、ASGPR標的化scFv、または別のASGPRリガンドを含む、請求項23に記載の方法。

請求項28

Xが、患者が望ましくない免疫応答を発症する関連抗原の群またはその免疫寛容誘導フラグメントの群を含む、請求項23に記載の方法。

請求項29

Xが:インスリン、プロインスリン、プレプロインスリン、グルタミン酸デカルボキシラーゼ−65GAD−67、グルコース−6−ホスファターゼ2、インスリノーマ−関連タンパク質2、インスリノーマ−関連タンパク質2β、ICA69、ICA12、カルボキシペプチダーゼH、Imogen38、GLIMA38、クロモグラニンA、HSP−60、カルボキシペプチダーゼE、ペリフェリン、2型グルコース輸送体、肝細胞癌−腸−膵臓/膵臓の関連タンパク質、S100β、グリア線維性酸性タンパク質、再生遺伝子II、膵臓十二指腸ホメオボックス1、筋強直性ジストロフィーキナーゼ、膵島特異的グルコース−6−ホスファターゼ触媒サブユニット−関連タンパク質、およびSSTGタンパク質共役型受容体1−5の2つ以上;ミエリン塩基性タンパク質、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質、ミエリンプロテオリピドタンパク質、配列番号:11、配列番号:12、配列番号:13、配列番号:14、配列番号:15、配列番号:16、および配列番号:17の2つ以上;ならびに配列番号:24、配列番号:25、配列番号:26、および配列番号:27の2つ以上を含む群から選択される、請求項23に記載の方法。

請求項30

望ましくない免疫応答を治療する、請求項1−10または11−16のいずれかの組成物の使用。

請求項31

Xに対する患者の寛容化のための、ここで、Xは、患者が望ましくない免疫応答を発症する抗原、もしくはその免疫寛容誘導部分を含むものであり、または移植拒絶、治療薬に対する免疫応答、自己免疫疾患、過敏症および/またはアレルギーに原因的に関与する循環タンパク質もしくはペプチドまたは抗体のクリアランスのための、ここで、Xは循環タンパク質もしくはペプチドまたは抗体に特異的に結合する、抗体、抗体フラグメントもしくはリガンドを含むものである、:請求項1−10のいずれかの組成物の使用。

請求項32

前記組成物を抗原部分Xに関する患者の寛容化のために投与する、請求項11−16のいずれかの組成物の使用。

技術分野

0001

関連出願の相互参照
本出願は、出典明示により本明細書に組み込まれる“糖標的化治療剤(GLYCOTARGETING THRAPUTICS)”と題される同時係属中の2014年2月21日に出願された米国仮出願番号第61/942,942号の優先権を主張する。

0002

本開示の分野
本開示の分野は、移植拒絶自己免疫疾患食物アレルギー、および治療薬に対する免疫応答治療において有用である薬学的に許容可能な組成物に関する。

背景技術

0003

本開示の背景
米国出願第2012/0039989号、米国出願第2012/0178139号およびWO2013/121296号は、寛容化のための抗原提示における赤血球役割活用する、赤血球への抗原の標的化を記載する。このアプローチでこれまで生じた肯定的な結果にもかかわらず、代替アプローチの可能性への関心が依然としてある。

課題を解決するための手段

0004

本開示の概要
本開示の態様は、式1の化合物を含む組成物を提供する:



ここで:
mは約1から100の整数であり;
Xは、患者が望ましくない免疫応答を発症する抗原、もしくはその免疫寛容誘導部分を含み;または
Xは、循環タンパク質もしくはペプチドまたは抗体に特異的に結合する、抗体、抗体フラグメントもしくはリガンドを含み、当該循環タンパク質もしくはペプチドまたは抗体は、移植拒絶、治療薬に対する免疫応答、自己免疫疾患、過敏症および/もしくはアレルギーに原因的に関与し;
Yは、リンカー部分を含み;かつ
Zは、肝臓標的化部分を含む。

0005

Zはまた、例えば、YにそのC1、C2またはC6でコンジュゲートされたガラクトースガラクトサミンまたはN−アセチルガラクトサミンを含みうる。

0006

Yは、N−ヒドロキシスクシンイミジルリンカー、マレイミドリンカー、ビニルスルホンリンカー、ピリジルジチオールポリエチレングリコール)リンカー、ピリジルジチオールリンカー、n−ニトロフェニルカーボネートリンカー、NHS−エステルリンカー、およびニトロフェノキシポリ(エチレングリコール)エステルリンカーから選択されうる。

0007

Yはさらに、Xに特異的に結合する、抗体、抗体フラグメント、ペプチドもしくは他のリガンド;ジスルファニルエチルエステル;式YaからYpの1つにより表される構造を含むことができ:









および



または式Y’−CMPにより表される部分を有する:



ここで:左の括弧“(”は、XおよびY間の結合を示し;右または下の括弧および“)”は、YおよびZ間の結合を示し;nは約1から100の整数であり;pは約2から150の整数であり;qは約1から44の整数であり;R8は、−CH2−または−CH2−CH2−C(CH3)(CN)−であり;R9は、直接結合または−CH2−CH2−NH−C(O)−であり;かつY’は、Yの残存部分を表す。

0008

上記の別の態様では、nは約40から80であり、pは約10から100であり、qは約3から20であり、R8は、−CH2−CH2−C(CH3)(CN)−であり;かつR9が−CH2−CH2−NH−C(O)−である場合に、Zは、そのC1でコンジュゲートされたガラクトースまたはN−アセチルガラクトサミンである。

0009

上記のさらに別の態様では、Yは、式Ya、式Yb、式Yh、式Yi、式Yk、式Ymまたは式Yn、特に式Ya、式Yb、式Ymまたは式Ynを含む。

0010

Xは:移植患者が望ましくない免疫応答を発症する外来性移植抗原;患者が望ましくない免疫応答を発症する外来性の食物動物、植物もしくは環境の抗原;患者が望ましくない免疫応答を発症する外来性の治療薬;もしくは患者が望ましくない免疫応答を発症する内在性型に対する合成自己抗原、またはそれらの免疫寛容誘導部分をさらに含みうる。

0011

本開示はまた、かかる治療を必要とする哺乳類に、有効量の、上述の式1の化合物を含む組成物を投与することによる、抗原に対する望ましくない免疫応答のための治療方法に関連する。かかる方法において、抗原部分Xに特異的に結合する、循環タンパク質もしくはペプチドまたは抗体のクリアランスのために当該組成物は投与でき、当該循環タンパク質もしくはペプチドまたは抗体は、移植拒絶、治療薬に対する免疫応答、自己免疫疾患、過敏症および/もしくはアレルギーに原因的に関与する。当該組成物は、移植拒絶、治療薬に対する免疫応答、自己免疫疾患、過敏症および/またはアレルギーに原因的に関与する抗体の濃度を患者の血中で少なくとも50%w/wまで減少させるように有効量で投与でき、投与後約12から約48時間の間の時間で測定される。当該組成物は抗原部分Xに関する患者の寛容化のために投与されうる。

0012

本開示のさらに別の態様は、式2の化合物を含む組成物を提供する:



ここで:m’+m”が1に等しく、かつZがDOM 26h−196−61である場合、Xはインターフェロンリバビリン、ネクサバールソラフェニブアービタクスセツキシマブ、アバスタチン/ベバシズマブまたはハーセプチントラスツズマブではないという条件で、m’はゼロまたは約1から10の整数であり、m”はゼロまたは約1から10の整数であり、かつm'+m”の総和は約1から10の整数であるが、少なくとも1であり;それぞれXは、患者が望ましくない免疫応答を発症する、外来性抗原もしくは自己抗原、またはそれらの免疫寛容誘導部分であり;それぞれYは、リンカー部分もしくは直接結合、またはXに特異的に結合する、抗体、抗体フラグメント、ペプチドもしくは他のリガンドであり;かつZは肝臓標的化部分である。

0013

式2を伴う上記態様では、ZはASGPR標的化抗体、ASGPR標的化抗体フラグメント、ASGPR標的化ペプチド、ASGPR標的化scFv、または別のASGPRリガンドを含みうる。Yは免疫プロテアソーム切断部位を有するリンカーでありうる。Xは、患者が望ましくない免疫応答を発症する関連抗原の群またはその免疫寛容誘導フラグメントの群を含みうる。例えば、Xは、以下を含む群から選択されうる:
インスリンプロインスリンプレプロインスリングルタミン酸デカルボキシラーゼ−65 GAD−67、グルコース−6−ホスファターゼ2、インスリノーマ−関連タンパク質2、インスリノーマ−関連タンパク質2β、ICA69、ICA12、カルボキシペプチダーゼH、Imogen38、GLIMA38、クロモグラニンA、HSP−60、カルボキシペプチダーゼE、ペリフェリン、2型グルコース輸送体肝細胞癌−腸−膵臓/膵臓の関連タンパク質、S100β、グリア線維性酸性タンパク質再生遺伝子II(regenerate gene II)、膵臓十二指腸ホメオボックス1、筋強直性ジストロフィーキナーゼ膵島特異的グルコース−6−ホスファターゼ触媒サブユニット−関連タンパク質、およびSSGタンパク質共役型受容体1−5の2つ以上;
ミエリン塩基性タンパク質ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質、ミエリンプロテオリピドタンパク質、配列番号:11、配列番号:12、配列番号:13、配列番号:14、配列番号:15、配列番号:16、および配列番号:17の2つ以上;ならびに
・ 配列番号:24、配列番号:25、配列番号:26、および配列番号:27の2つ以上。

0014

本開示はまた、かかる治療を必要とする哺乳類に、有効量の、上述の式2の化合物を含む組成物を投与することによる、抗原に対する望ましくない免疫応答のための治療方法に関連する。かかる方法において、抗原部分Xに特異的に結合する、循環タンパク質もしくはペプチドまたは抗体のクリアランスのために当該組成物は投与でき、当該循環タンパク質もしくはペプチドまたは抗体は、移植拒絶、治療薬に対する免疫応答、自己免疫疾患、過敏症および/もしくはアレルギーに原因的に関与する。当該組成物は、移植拒絶、治療薬に対する免疫応答、自己免疫疾患、過敏症および/またはアレルギーに原因的に関与する抗体の濃度を患者の血中で少なくとも50%w/wまで減少させるように有効量で投与でき、投与後約12から約48時間の間の時間で測定される。当該組成物は抗原部分Xに関する患者の寛容化のために投与されうる。

図面の簡単な説明

0015

図1は、ガラクトースコンジュゲーション[F1aA−PE−m4−n80(Gal−PE)]が、以下を含む肝臓の細胞へOVAを優先的に標的化することを示す一連グラフである:(A.)類洞内皮細胞(LSEC)、(B.)クッパー細胞(KC)、(C.)肝細胞、および(D.)他の抗原提示細胞APC)。

0016

図2は、F1aA−OVA−m4−n80(Gal−OVA)、OVAまたは生理食塩水(すなわちナイーブ(naive))で処置されたマウスにおけるOTI CD8+T細胞の増殖を示すグラフである。

0017

図3は、生理食塩水、OVAまたはF1aA−OVA−m4−n80(GAL−OVA)で処置された増殖性T細胞の世代におけるOT−I CD8+T細胞提示表面マーカー(A.)PD−1+および(B.)アネキシンV+の割合を示す一連のグラフである。

0018

図4は、ガラクトースコンジュゲーション[F1aA−OVA−m4−n80(Gal−OVA)]がOVA−特異抗体力価により決定されるOVAの免疫原性を減少させることを示すグラフである(Ab力価log−1で示される)。

0019

図5は、F1aA−OVA−m4−n80(Gal−OVA)が血清からOVA−特異的な抗体を枯渇させることができることを示す。

0020

図6は、F1aA−OVA−m4−n80(mGal−OVA)、F1b−OVA−m1−n44−p34(pGal−OVA)、およびN’−DOM−Gly3Ser−OVA−Gly3Ser−6xHis−C’(Dom−OVA)が、OVAおよびアジュバントLPSでの皮内チャレンジ後の流入領域リンパ節におけるOVA−特異的な免疫応答軽減することができることを示す。

0021

図7は、F1aA−OVA−m4−n80およびF1b−OVA−m1−n44−p34の特性評価を示す。(A.)F1aA−OVA−m4−n80(マゼンタ)、F1b−OVA−m1−n44−p34(青)およびコンジュゲートされていないOVA(黒色)の、サイズ排除HPCLの形跡。左へのシフトは、分子量の増加を表す。(B.)OVAコンジュゲーション後の増加した分子量を示すポリアクリルアミドゲル:(1.)コンジュゲートされていないOVA、(2.)F1aA−OVA−m4−n80および(3.)F1b−OVA−m1−n44−p34。

0022

図8は、静脈内急速投与として注射後のマウスの循環におけるN−OVA−Gly3Ser−6xHis−C(OVA)、N−DOM−Gly3Ser−OVA−Gly3Ser−6xHis−C(DOM−OVA)、またはN−OVA−Gly3Ser−DOM−Gly3Ser−6xHis−C(OVA DOM)の標準化された量を示すグラフである。

0023

図9は、生理食塩水、DOMおよびOVA、DOM−OVA、またはOVA−DOMでの処置後の個々のマウスの循環における抗OVAIgG抗体の力価を示す一連のグラフである。OVA単独(a)またはOVAおよびCpG−B(b)の静脈内注射により抗OVAIgG生産が誘導された。処置時間は垂直の破線により示される。力価は、検出可能な抗OVA IgGを有する血漿の最大倍希釈のlog10として計算される。

0024

詳細な説明
2つの公知のアシアロ糖タンパク質受容体(“ASGPR”)は、肝細胞および肝臓類洞内皮細胞(または“LSEC”)上に発現される。他のガラクトース/ガラクトサミン/N−アセチルガラクトサミン受容体は、複数の細胞タイプ[例えば、樹状細胞、肝細胞、LSEC、およびクッパー細胞]上に様々な形態で確認されうる。樹状細胞は、“プロフェッショナルな抗原提示細胞”と考えられ、それは、それらの主要な機能が、免疫応答を生成するための免疫系に抗原を提示することだからである。肝臓内のいくつかの細胞は、抗原を提示することができると知られているが、肝臓が免疫寛容誘導に関与していることはより知られている。肝臓は、免疫寛容誘導臓器であると理解されている。例えば、移植臓器の1つが肝臓である場合、複数の臓器移植の事例では、より低い拒絶発生率報告されている。LSECの事例は、当該文献よりも新しく;結果的に、免疫寛容誘導および/または炎症性免疫応答の緩和におけるそれらの役割は、未だ広く認められておらず、またはあまり理解されていない。しかしながら、それらはまた、抗原特異的な寛容の誘導において重要な役割を果たしうることが明らかになってきている。

0025

赤血球表面の特有の特徴の1つは、その糖鎖付加、すなわち、かなりの数のグリコシル化タンパク質の存在である。実際に、グリコホリン(例えば、グリコホリンA)は、赤血球結合のための標的として利用されてきた。グリコホリンは、共有結合で付着した多くの糖鎖を有するタンパク質であり、終末端はシアル酸である。赤血球が古くなり、かつクリアランスの機が熟すと、そのグリコホリンの末端シアル酸は、失われる傾向があり、遊離末端でN−アセチルガラクトサミンを残す。N−アセチルガラクトサミンは肝細胞関連ASGPRにより選択的に受け取られるリガンドであり、肝細胞によるN−アセチルガラクトサミン−含有物質の結合、ならびに肝臓におけるそれらの引き続く取り込みおよびプロセシングにつながる。

0026

これまでに、肝臓の標的化をもたらす様式での治療薬の糖鎖付加は、治療薬の乏しい循環半減期をもたらす肝臓による初回通過クリアランスのために回避されるべきであると当業者に理解されている。同様に、いくつかのモノクローナル抗体は、それらのFc受容体への最適な結合のために、ASN297で特異的にグリコシル化される必要がある。驚いたことに、ガラクトシル化は免疫寛容誘導を誘導する様式で使用できることがここに見出された。

0027

本開示は、肝臓、特に肝細胞、LSEC、クッパー細胞および/または星状細胞、より特には肝細胞および/またはLSECへの送達のため(および、それらによる取り込みのため)に標的化されるある特定の治療用組成物、ならびに、さらにより特には、特異的にASGPRに結合するある特定の治療用組成物を提供する。肝臓標的化は、治療の2つの機構:寛容化およびクリアランスを容易にする。寛容化は、アポトーシス細胞をクリアランスする際および免疫系により“自己(self)”として認識されるそれらのタンパク質をプロセシングする際の肝臓の役割、並びに免疫寛容のための周辺タンパク質をサンプリングする際の肝臓の役割を活用する。クリアランスは、毒素ポリペプチド等を急速に除去および分解することによる血液精製における肝臓の役割を活用する。肝臓へのこれらの組成物の標的化は、ガラクトシル化部分(例えば、ガラクトース、ガラクトサミンおよびN−アセチルガラクトサミン、特にC1、C2またはC6でコンジュゲートされる)により、別の肝臓標的化部分(例えば、モノクローナル抗体、またはそのフラグメントもしくはscFv)により、またはかかる肝臓標的化が望ましいポリペプチドを脱−シアル化することにより達成される。ガラクトシル化または他の肝臓標的化部分は、抗原に化学的にコンジュゲートされ、または組換えにより融合されうる一方で、脱シアル化は抗原ポリペプチド上のガラクトース様部分を晒す。当該抗原は、内在性(自己抗原)または外因性(外来性抗原)であり得、限定されないが:移植患者が望ましくない免疫応答(例えば、移植拒絶)を発症する外来性の移植抗原、患者が望ましくない免疫(例えば、アレルギー性または過敏症)応答を発症する外来性の食物、動物、植物もしくは環境の抗原、患者が望ましくない免疫応答(例えば、過敏症および/または減少治療活性)を発症する治療薬、患者が望ましくない免疫応答(例えば、自己免疫疾患)を発症する自己抗原、またはそれらの免疫寛容誘導部分(例えば、フラグメントまたはエピトープ);を含み;これらの組成物は、抗原に対する寛容化を誘導するために有用である。あるいは、ガラクトシル化または他の肝臓標的化部分は、循環タンパク質もしくはペプチドまたは抗体に特異的に結合する、抗体、抗体フラグメントもしくはリガンドにコンジュゲートでき、当該循環タンパク質もしくはペプチドまたは抗体は、移植拒絶、治療薬に対する免疫応答、自己免疫疾患、および/またはアレルギー(上述されるように)に原因的に関与し;これらの組成物は、循環タンパク質、ペプチドまたは抗体をクリアランスするために有用である。従って、本開示の組成物は、望ましくない免疫応答、例えば、移植拒絶、治療薬に対する免疫応答、自己免疫疾患、および/またはアレルギー治療するために使用されうる。少なくとも1つの薬学的に許容可能な賦形剤と混合される治療有効量の本開示の組成物を含有する医薬組成物もまた提供される。別の態様では、本開示は、移植拒絶、治療薬に対する応答、自己免疫疾患またはアレルギーなどの望ましくない免疫応答の治療のための方法を提供する。

0028

定義

0029

明細書中で使用されるように、以下の単語および語句は使用される文脈が他のことを示す場合を除き、下記に記載される意味を有すると一般に意図される。

0030

文脈が明らかに別段の指示をしない限り、単数形“a”、“an、”および“the”は、複数の対象を含む。

0031

“約”という用語は、数値に関連して使用される場合、典型的により低い限界、すなわち、例えば、指示される数値より5−10%小さい値を有し、かつ高い限界、すなわち、例えば、指示される数値より5−10%大きい値を有する範囲以内の数値を包含することを意味する。

0032

“抗原”は、T細胞受容体B細胞受容体または抗体などの適応免疫応答の受容体のための標的として機能する任意の物質である。抗原は体内から由来してもよい(“自己(self)”、“自己(auto)”または“内在性の”)。例えば、吸入、摂取、注射、または移植により入り込み、抗原が体外から由来してもよい(“非自己”、“外来性の(foreign)”または“外因性の(endogenous)”)。外来性抗原は、食物抗原、動物抗原、植物抗原、環境抗原、治療薬、同種移植において存在する抗原を含むが、これらに限定されない。

0033

本明細書で使用される“抗原結合分子”は、分子、特に免疫グロブリン分子などのタンパク質に関し、エピトープへの特異的な結合を提供している抗体可変領域を含有する。抗体可変領域は、例えば、完全な抗体、抗体フラグメント、ならびに抗体もしくは抗体フラグメントの組換え誘導体中に存在しうる。本明細書で使用される抗体の“抗原結合フラグメント”(または“結合部分”)という用語は、標的配列に特異的に結合する能力を保持する1つ以上の抗体のフラグメントを指す。抗体可変領域を含有する抗原結合フラグメントは、“Fv”、“Fab”、および“F(ab’)2”領域、“単一ドメイン抗体(sdAb)”、“ナノボディー”、“一本鎖Fv(scFv)”フラグメント、“直列型のscFvs”(VHA−VLA−VHB−VLB)、“ダイアボディー(diabodies)”、“トリアボディー(triabodies)”または“トリボディー(tribodies)”、“一本鎖ダイアボディー(scDb)”、および“二重特異的なT細胞エンゲージャー(bi−specific T−cell engagers)(BiTEs)”を含む(限定なし)。

0034

化学改変”は、ポリペプチドの1つ以上のアミノ酸天然に存在する化学構造における変化を指す。かかる改変は側鎖または末端にすることができ、例えば、アミノ末端またはカルボキシル末端を変化させる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドを他の材料に連結させ、または治療薬に付着させるために都合よく使用されうる化学基を作製するために、改変は有用である。

0035

“含む(including)”、“含有する”、または“により特徴づけられる”と同義の“含む(comprising)”という用語は、包括的もしくは非限定的であり、かつ付加的な列挙されていない要素または方法工程を除外しない。“からなる”という語句は、任意の要素、工程、または特定されない成分を除外する。“本質的に〜からなる”という語句は、特定される材料もしくは工程の主題が記載される範囲を限定し、かつそれらは、その基礎および新規の特徴に実質的に影響しない。

0036

“保存的変化”は、活性を変化させずに一般にアミノ酸配列に対してなすことができる。これらの変化は、“保存的置換”または“変異”と称され;すなわち、特定のサイズまたは特徴を有するアミノ酸の群に属するアミノ酸を別のアミノ酸と置換することができる。アミノ酸配列についての置換物は、そのアミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択することができる。例えば、非極性疎水性)アミノ酸は、アラニンロイシンイソロイシンバリンプロリンフェニルアラニントリプトファンメチオニン、およびチロシンを含む。極性中性のアミノ酸はグリシンセリンスレオニンシステイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンを含む。正電荷の(塩基性)アミノ酸は、アルギニンリジンおよびヒスチジンを含む。負電荷の(酸性)アミノ酸は、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含む。かかる置換は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または等電点により決定される見かけ上の分子量に実質的に影響すると予想されない。保存的置換はまた、配列の光学異性体を他の光学異性体に置換すること、具体的には配列の1つ以上残基についてDアミノ酸をLアミノ酸に置換することを含む。さらに、配列中のアミノ酸がDからLへの異性体置換を受けうる。例示的保存的置換は、正電荷を維持するArgをLysへ、およびその逆;負電荷を維持するAspをGluへ、およびその逆;ThrをSerへ、結果、遊離OHが維持される;ならびに遊離NH2を維持するAsnをGlnへの置換を含むが、これらに限定されない。化学誘導体化のための要求が生じるならば、保存的置換のさらに別のタイプは、望ましい化学反応性を有するアミノ酸が化学的コンジュゲーション反応のための反応性部位を付与するために導入される場合を構成する。かかるアミノ酸は、Cys(スルフヒドリル基を挿入する)、Lys(第一級アミンを挿入する)、AspおよびGlu(カルボン酸基を挿入する)、またはケトンアジドアルキンアルケン、およびテトラジン側鎖を含有する特殊な非標準アミノ酸を含むが、これらに限定されない。遊離NH2またはSHを有するアミノ酸の保存的置換または付加は、式1のリンカーおよびガラクトシル化部分との化学的コンジュゲーションのために特に有利でありうる。さらに、ポリペプチド配列または対応する核酸配列点変異欠失、および挿入は、いくつかの場合において、ポリペプチドまたは核酸フラグメントの機能の喪失なく作製されうる。置換は、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50以上の残基を含みうる。本発明において使用可能な変異体は、200まで(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、または200まで)の総数のアミノ酸配列における変化(すなわち交換、挿入、欠失、N末端切断(truncation)、および/またはC末端切断)を示してもよい。本明細書に記載されるアミノ酸残基は、標準ポリペプチド命名法、J.Biol.Chem.,(1969),243,3552−3559に合わせて一文字アミノ酸表記または三文字略称のいずれかを利用する。全てのアミノ酸残基配列は、アミノ末端からカルボキシ末端の従来の方向における左右配向を有する式により本明細書に表される。

0037

“有効量”または“治療有効量”という用語は、かかる治療を必要とする哺乳類に投与される場合に下記に規定される治療を達成するために十分な本開示の組成物の量を指す。この量は、治療される対象および疾患状態、対象の体重および年齢、疾患状態の重症度、選択される特定の本開示の組成物、投与のタイミング、投与の様式等に従う投薬レジメンに、依存して変動するだろう。そして、それら全ては当業者により容易に決定されうる。

0038

抗原決定基としても知られている“エピトープ”は、巨大分子、例えばタンパク質のセグメントであり、適応免疫系により、例えば抗体、B細胞、またはT細胞により認識される。エピトープは、抗体またはその抗原結合フラグメントに結合することが可能な巨大分子の部分またはセグメントである。この文脈において、“結合”という用語は、特に、特異的な結合に関する。本発明の文脈において、“エピトープ”という用語は、免疫系により認識されるタンパク質またはポリタンパク質のセグメントをことが好ましい。

0039

ガラクトースという用語は、当該技術分野でよく知られており、かつ開鎖型でおよび環状型で両方存在し、D−およびL−異性体を有する単糖を指す。環状型では2つのアノマー、すなわちアルファおよびベータがある。アルファ型において、C1アルコール基アキシアル位にあり、一方でベータ型において、C1アルコール基はエクアトリアル位にある。特に、“ガラクトース”は、環状六員環ピラノース、より特にはD−異性体、およびさらにより特にはアルファ−D−型(α−D−ガラクトピラノース)を指す。ガラクトースの構造および付番は下記に示される。

0040

0041

“ガラクトシル化部分”という用語は、肝臓標的化部分の特定のタイプを指す。ガラクトシル化部分はガラクトース、ガラクトサミンおよび/またはN−アセチルガラクトサミン残基を含むが、これらに限定されない。

0042

“肝臓標的化部分”という用語は、例えばポリペプチドを肝臓に導く能力を有する部分を指す。肝細胞、類洞上皮細胞、クッパー細胞、星状細胞、および/または樹状細胞を含むが、これらに限定されない異なる細胞タイプを、肝臓は含む。典型的には、肝臓標的化部分は、これらの細胞の1つ以上へポリペプチドを導く。それぞれの肝細胞の表面上で、受容体は存在し、肝臓標的化部分を認識し、および肝臓標的化部分に特異的に結合する。肝臓標的化は、ガラクトシル化部分への抗原もしくはリガンドの化学的コンジュゲーション、潜在的なガラクトシル部分を晒すための抗原もしくはリガンドの脱シアル化、ASGPR−結合部分への抗原もしくはリガンドの組換え体の融合もしくは化学的コンジュゲーション、または抗原またはリガンドへの内在性の抗体の特異的な結合により達成でき、ここで抗原またはリガンドは:潜在的なガラクトシル部分を晒すために脱シアル化され、ガラクトシル化部分にコンジュゲートされ、またはASGPR−結合部分へ組換えにより融合され、もしくは化学的にコンジュゲートされる。天然に存在する脱シアル化タンパク質は、本開示の範囲内に包含されない。

0043

様々な置換基のために提供される“数値”および“範囲”は、記載の範囲内の全ての整数を包含するように意図される。例えば、約1から100、特に約8から90、およびより特に約40から80のエチレングリコール基を含む混合物であって、典型的にn±約10%(または1から約25、±3より小さい整数について)として特定される整数を包含する混合物を表す整数としてnを規定する場合、nは、約1から100の整数(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、25、30、34、35、37、40、41、45、50、54、55、59、60、65、70、75、80、82、83、85、88、90、95、99、100、105または110)とすることができ、かつ開示される混合物は、1−4、2−4、2−6、3−8、7−13、6−14、18−23、26−30、42−50、46−57、60−78、85−90、90−110および107−113エチレングリコール基などの範囲を包含すると理解されるべきである。併用の用語“約”および“±10%”または“±3”は、どこで使用されても同等の範囲のための特異的な裏付けを開示し、および提供すると理解されるべきである。

0044

“任意の”または“任意に”という用語は、引き続いて記載される事象もしくは状況が起こっても起こらなくてもよいこと、ならびに、当該記載は事象もしくは状況が起こる実例、およびそれが起こらない実例を含むことを意味する。

0045

特定の標的に特異的に結合するペプチドは、その標的に対する“リガンド”と称される。

0046

翻訳後修飾(例えば、リン酸化または糖鎖付加)ならびに/または付加的なポリペプチドを有する複合体形成、ならびに/または核酸および/もしくは炭水化物、または他の分子とのマルチサブユニット複合体への合成に関係なく、“ポリペプチド”は、アミノ酸残基の鎖を指す用語である。従ってプロテオグリカンはまた本明細書でポリペプチドと称される。長いポリペプチド(約50アミノ酸超を有する)は、“タンパク質”と称される。短いポリペプチド(約50アミノ酸以下を有する)は、“ペプチド”と称される。サイズ、アミノ酸組成および三次元構造に依存して、ある特定のポリペプチドは、“抗原結合分子”、“抗体”、“抗体フラグメント”または“リガンド”と称されうる。ポリペプチドは、多くの方法により産生でき、その多くは当該技術分野でよく知られている。例えば、ポリペプチドを、抽出により(例えば、単離細胞から)、ポリペプチドをコードする組換え核酸の発現により、または化学合成により、得ることができる。ポリペプチドは、例えば、組換え技術、およびコードされるポリペプチドの発現のために宿主細胞へ導入される(例えば、形質転換または遺伝子導入により)ポリペプチドをコードする発現ベクターにより産生されうる。

0047

本明細書で使用される、“薬学的に許容可能な担体”または“薬学的に許容可能な賦形剤”は、任意の、および全ての溶媒分散媒被膜抗菌および抗真菌剤等張剤および吸収遅延剤等を含む。薬学的に活性な物質のためのかかる媒質および薬剤の使用は、当該技術分野でよく知られている。任意の従来の媒質もしくは薬剤が活性成分不適合である限りを除いて、治療用組成物におけるその使用が想定される。補助的な活性成分はまた、当該組成物に組み込まれうる。

0048

ポリペプチドに関して本明細書で使用される“精製”という用語は、化学合成されており、従って他のポリペプチドにより実質的に汚染されていないポリペプチド、またはほとんどの自然に付随する他の細胞成分(例えば、他の細胞タンパク質、ポリヌクレオチド、または細胞成分)から分離され、または単離されているポリペプチドを指す。精製ポリペプチドの例は、乾燥重量で少なくとも70%で、自然に伴うタンパク質および天然に存在する有機物分子からフリーであるポリペプチドである。従って精製ポリペプチドの調製は、例えば、乾燥重量で少なくとも80%、少なくとも90%、または少なくとも99%ポリペプチドでありうる。ポリペプチドはまた、精製または標識(例えば、親和性マトリックスへの取り込み、顕微鏡での可視化)を容易にするタグ配列(例えば、ポリヒスチジンタグ、mycタグ、FLAG(登録商標)タグ、または他の親和性タグ)を含有するよう設計されうる。従って別段の指示がない限り、ポリペプチドを含む精製組成物は精製ポリペプチドを指す。“単離され”という用語は、本開示のポリペプチドまたは核酸がそれらの自然環境中ではないことを示す。従って本開示の単離産物は、培養上清に含有され、部分的に濃縮され、異種由来から産生され、ベクタークローニングされ、またはビヒクルを用いて製剤化等されうる。

0049

配列同一性”という用語は、ポリペプチド配列比較に関して使用される。この表現は特に配列同一性の割合を指し、例えばそれぞれの参照ポリペプチドまたはそれぞれの参照ポリヌクレオチドと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性の割合を指す。問題とするポリペプチドおよび参照ポリペプチドは、特に、一続きの20、30、40、45、50、60、70、80、90、100以上のアミノ酸に渡ってまたは参照ポリペプチドの全長に渡って示される配列同一性を示す。

0050

生物学の分野で一般に使用されるように、“特異的な結合”という用語は非標的組織と比較して相対的に高い親和性で標的に結合する分子を指し、例えば静電相互作用ファンデルワールス相互作用水素結合等の複数の非共有結合性の相互作用を一般に伴う。特異的な結合の相互作用は、抗体−抗原結合、酵素基質結合、およびある特定のタンパク質−受容体相互作用を特徴づける;一方で、かかる非標的結合が重要でない程度まで随時、それらの特異的な標的加えて組織に、かかる分子は結合するかも知れない、高−親和性結合対はまだ、特異的な結合の定義内に入りうる。

0051

“治療(treatment)”または“治療(treating)”という用語は、哺乳類における疾病または障害の任意の治療を意味し:
疾病もしくは障害を予防することもしくは保護すること、すなわち、臨床症状が発症しないようにすること;
疾病もしくは障害を阻害すること、すなわち、臨床症状の発症を抑止もしくは抑制すること;ならびに/または
疾病もしくは障害を軽減すること、すなわち、臨床症状の退縮を引き起こすことを含む。

0052

“望ましくない免疫応答”という用語は、対象の免疫系による反応を指し、それは所定の状況で望ましくない。もしかかる反応が疾病または障害の予防、減少、または治癒につながらず、代わりに障害または疾病を引き起こし、増強しまたは悪化させるならば、当該免疫系の反応は望ましくない。典型的には、もし免疫系の反応が不適当な標的に対して向けられるならば、免疫系の反応は、疾病を引き起こし、増強しまたは悪化させる。例示的に、望ましくない免疫応答は、移植拒絶、治療薬に対する免疫応答、自己免疫疾患、ならびにアレルギー性もしくは過敏症を含むが、これらに限定されない。

0053

“変異体”という用語は、その長さ、配列、または構造における1つ以上の変化により由来されるタンパク質と比較して異なるタンパク質として理解されている。タンパク質変異体が由来するポリペプチドはまた、親ポリペプチドまたはポリヌクレオチドとしてよく知られている。“変異体”という用語は、親分子の“フラグメント”または“誘導体”を含む。典型的には、“フラグメント”は、長さまたはサイズにおいて親分子より小さく、一方で“誘導体”は、親分子と比較してそれらの配列または構造における1つ以上差異を示す。改変分子はまた、例えば翻訳後修飾タンパク質(例えばグリコシル化、リン酸化、ユビキチン化パルミトイル化、もしくはタンパク分解的切断タンパク質)およびメチル化DNAなどの改変核酸が包含されるが、これらに限定されない。RNA−DNAハイブリッドなどの異なる分子の混合物はまた、“変異体”という用語により包含されるが、限定されない。天然に存在する、および人工的に構築された変異体は、本明細書で使用される“変異体”という用語により包含されると理解されている。さらに、変異体が親分子の少なくとも1つの生物学的活性を示す、すなわち、機能的に活性であるという条件で、本発明において使用可能な変異体はまた、親分子の相同体オルソログ、もしくはパラログ、または人工的に構築された変異体に由来してもよい。変異体は、それが由来する親ポリペプチドへのある特定の配列同一性の度合により特徴づけられうる。より正確には、本開示の文脈におけるタンパク質変異体は、その親ポリペプチドへの少なくとも80%の配列同一性を示してもよい。好ましくは、タンパク質変異体の配列同一性は一続きの20、30、40、45、50、60、70、80、90、100以上のアミノ酸に渡る。

実施例

0054

組成物

0055

本開示の一態様は、式1により表される組成物、医薬品製剤、およびかかる組成物を利用する治療方法に関し:



ここで:
mは約1から100の整数であり、特に約1から20、およびもっとも特には1から約10であり;
Xは抗原部分、特に外来性抗原、もしくは患者が望ましくない免疫応答を発症する自己抗原、またはかかる抗原部分の免疫寛容誘導部分(例えば、フラグメントまたはエピトープ)であり;
Yはリンカー部分もしくは直接結合、またはXに特異的に結合する、抗体、抗体フラグメント、ペプチドもしくは他のリガンドであり;かつ
Zは肝臓標的化部分、特にガラクトシル化部分である。
それぞれの抗原、抗体、抗体フラグメントもしくはリガンドがリンカーまたはガラクトシル化部分が結合されうる部位(主にN末端のアミンリジン残基およびシステイン残基)の個々の数および密度を有するとされる中で、式1におけるmについての値は、Xの性質に依存するだろう。リジンまたはシステイン残基を加えることにより、かかる部位の限定数を有する抗原は、例えばNまたはC末端で、誘導体化されうる(任意に切断可能なリンカー、特に免疫プロテアソーム切断部位を有するリンカーを介して)。一般に、式1の組成物におけるガラクトシル化の十分な度合を提供することは、肝細胞による取り込みを容易にするするために好ましい。本開示の医薬品製剤および方法は、それぞれ異なるX部分(例えば、特定の望ましくない免疫応答に関連するいくつかのエピトープ)を担う式1の組成物の混合物を利用することができる。

0056

式1の組成物は、反応式に関して下記に記載される式1aから1pにより説明されるように、Xが移植患者が望ましくない免疫応答(例えば、移植拒絶)を発症する外来性の移植抗原、患者が望ましくない免疫応答(例えば、アレルギー性または過敏症)を発症する外来性の食物、動物、植物もしくは環境の抗原、患者が望ましくない免疫応答(例えば、過敏症および/または減少治療活性)を発症する外来性の治療薬、または患者が望ましくない免疫応答(例えば、自己免疫疾患)を発症する自己抗原であり;Yが式YaからYpのリンカーであり;かつ/または、Zがガラクトース、ガラクトサミンまたはN−アセチルガラクトサミンである、亜属を含む。

0057

本開示はさらに、式2により表される薬学的に許容可能な組成物を提供し:



ここで:
m’はゼロまたは約1から10の整数であり、m”はゼロまたは約1から10の整数であり、かつm’+m”の総和は約1から10の整数であるが、少なくとも1であり;
Xは抗原部分、特に外来性抗原、もしくは患者が望ましくない免疫応答を発症する自己抗原、またはかかる抗原部分の免疫寛容誘導部分(例えば、フラグメントまたはエピトープ)であり;
Yはリンカー部分もしくは直接結合、またはXに特異的に結合する、抗体、抗体フラグメント、ペプチドもしくは他のリガンドであり;かつ
Zは肝臓標的化部分、特にASGPR標的化抗体、ASGPR標的化抗体フラグメント、ASGPR標的化ペプチド、ASGPR標的化scFv、または別のASGPRリガンドであり、
かかる組成物は、任意に単離および精製を容易にするアミノ酸配列[例えば、配列:HHHHHH(配列番号:1)を有する“Hisタグ”もしくは“6xHis”]ならびに付加的なリンカー[例えば、配列:GGGS(配列番号:2)を有する“Gly3Ser”]を含む。m’+m”が、1より大きい式2の組成物において、X部分は、同一もしくは異なるものとすることができ、ならびにY部分は、同一もしくは異なるものとすることができる。m’+m”についての値は、Xが完全タンパク質である場合、より小さく(例えば、3以下)、またはXがペプチドである場合、より大きい(約10まで)。リンカー“Y”は切断部位、特に免疫プロテアソーム切断部位を有利に含みうる。

0058

式2の組成物は、Xが移植患者が望ましくない免疫応答(例えば、移植拒絶)を発症する外来性の移植抗原、患者が望ましくない免疫応答(例えば、アレルギー性または過敏症)を発症する外来性の食物、動物、植物もしくは環境の抗原、患者が望ましくない免疫応答(例えば、過敏症および/または減少治療活性)を発症する外来性の治療薬、または患者が望ましくない免疫応答(例えば、自己免疫疾患)を発症する自己抗原である、亜属を含む。

0059

あるいは、式1および/または式2の組成物において、Xは、循環タンパク質もしくはペプチドまたは抗体に特異的に結合する、抗体、抗体フラグメントもしくはリガンドとすることができ、当該循環タンパク質もしくはペプチドまたは抗体は、移植拒絶、治療薬に対する免疫応答、自己免疫疾患、過敏症および/もしくはアレルギーに原因的に関与する。

0060

式2の組成物は融合タンパク質として調製でき、かつそれらの調製および精製において有用ないくつかの成分、例えば、特異的な輸送経路へ発現ポリペプチドを導き、かつ引き続いてポリペプチドから切断されるシグナル配列もしくはリーダー配列などを含みうる;従ってシグナル配列は、発現されるタンパク質およびそれをコードするDNAのパーツでありうるが、最終的な組成物の部分ではない。発現系において使用される哺乳類のシグナル配列の一例は、Igκ鎖配列であり、タンパク質分泌を導く:METDTLLLWVLLLWPGSTG(配列番号:3)である。同様に、発現系において使用される一般的な細菌性のシグナル配列の一例は、pelBシグナル配列であり、発現タンパク質を細菌のペリプラズムへ導く:MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA(配列番号:4)である。

0061

抗原

0062

式1の組成物および/または式2におけるXとして利用される抗原は、タンパク質またはペプチドとすることができ、例えば抗原は、完全なもしくは部分的な治療薬、完全長の移植タンパク質もしくはそのペプチド、完全長の自己抗原もしくはそのペプチド、完全長のアレルゲンもしくはそのペプチド、ならびに/または核酸、または上述の抗原の模倣体であってもよい。

0063

本開示の実行において利用される抗原は、以下の1つ以上でありうる:
・抗体フラグメント、ならびに抗体および抗体フラグメントとの融合タンパク質を含む、タンパク質、ペプチド、抗体および抗体様分子である治療薬。これらは、ヒト、非ヒト(マウスなど)および非天然(すなわち、設計された)タンパク質、抗体、キメラ抗体ヒト化抗体、ならびに例えばフィブロネクチン、DARPin、ノッチン等の非抗体結合スキャフォールドを含む。
・移植患者が望ましくない免疫応答を発症するヒト同種移植抗原。
・ 望ましくない自己免疫応答を引き起こす自己抗原。自己抗原は、自己免疫疾患患者における内在性の起源のものである一方で、本開示の組成物において利用されるポリペプチドは、典型的に外因的に合成される(発生源から精製され、濃縮されることとは対照的に)と当業者は認識するだろう。
・ 患者が望ましくない免疫応答を経験する食物、動物、植物および環境の抗原などの外来性抗原。治療用のタンパク質はまた、その外因的起源に起因する外来性抗原と考えらうる一方で、本開示の記載を明確にするために、かかる治療剤は別々の群として記載されていると当業者は認識するだろう。同様に、植物または動物抗原は食すことができ、かつ食物抗原と考えられ、かつ環境抗原は植物から由来してもよい。それらは、しかしながら、全て外来性抗原である。簡潔性の観点で、当業者が、特に詳細な説明および実施例に照らして、本開示の組成物において利用されうる抗原を認識できるかかる潜在的に重複する群の全てを区別し、および規定するように記載する試みはなされないだろう。
抗原は、完全タンパク質、完全タンパク質の部分、ペプチド等とすることができ、かつリンカーおよび/もしくはガラクトシル化部分への付着のために誘導体化でき(上述のように)、変異体とすることができ、および/もしくは特に配列同一性を維持して保存的置換を含有することができ、ならびに/または脱シアル化することができる。

0064

抗原が治療用のタンパク質、ペプチド、抗体または抗体様分子である実施形態では、特異的な抗原は以下から選択されうる:アバタセプトアブシキシマブアダリムマブアデノシンデアミナーゼアド−トラスツズマブエムタンシン、アガルシダーゼアルファ、アガルシダーゼベータ、アルデスロイキンアルグルセラーゼ、アルグルコシダーゼアルファ、α−1−プロテアーゼ阻害剤アナキンラアニストレプラーゼ(アニソイル化プラスミノーゲンストレプトキナーゼ活性化複合体)、アンチトロンビンIII、抗胸腺細胞グロブリンアルテプラーゼ、ベバシズマブ、ビバリルジンボツリヌス毒素A型ボツリヌス毒素B型C1エステラーゼ阻害剤カナキヌマブ、カルボキシペプチダーゼG2(グルカルピダーゼおよびVoraxaze)、セルトリズマブ ペゴル、セツキシマブ、コラゲナーゼマムシ類(Crotalidae)免疫Fab、ダルベポエチン−α、デノスマブ、ジゴキシン免疫Fab、ドルナーゼアルファ、エクリズマブエタネルセプト、活性化第VII因子、第VIII因子、第IX因子、第XI因子、第XIII因子フィブリノーゲンフィルグラスチム、ガルスルファーゼ、ゴリムマブ、酢酸ヒストレリンヒアルロニダーゼ、イデュルスルファーゼ、イミグルセラーゼインフリキシマブ、インスリン[組換え体ヒトインスリン(“rHu インスリン”)およびウシインスリンを含む]、インターフェロン−α2a、インターフェロン−α2b、インターフェロン−β1a、インターフェロン−β1b、インターフェロン−γ1b、イピリムマブ、L−アルギナーゼL−アスパラギナーゼ、L−メチオニナーゼ(methionase)、ラクターゼ、ラロニダーゼ、レピルジンヒルジンメカセルミン、メカセルミンリンファバートメトキシナタリズマブオクトレオチドオファツムマブ、オプレルベキン、膵臓アミラーゼ膵臓リパーゼパパイン、Peg−アスパラギナーゼ、Peg−ドキソルビシンHCl、PEG−エポエチン−β、ペグフィルグラスチム、Peg−インターフェロン−α2a、Peg−インターフェロン−α2b、ペグロチカーゼペグビソマントフェニルアラニンアンモニアリアーゼ(PAL)、プロテインCラスブリカーゼウリカーゼ)、サクロシダーゼ、サケカルシトニンサルグラモスチム、ストレプトキナーゼ、テネクテプラーゼテリパラチドトシリズマブアトリズマブ)、トラスツズマブ、1型アルファ−インターフェロン、ウステキヌマブ、vW因子。治療用のタンパク質は天然の供給源から獲得され(例えば、濃縮され、かつ精製される)、または例えば、組換えにより合成される得、ならびに典型的にはIgGモノクローナルもしくはフラグメントまたは融合物である抗体治療剤を含む。

0065

様々な形式のアブシキシマブ、アダリムマブ、アガルシダーゼアルファ、アガルシダーゼベータ、アルデスロイキン、アルグルコシダーゼアルファ、第VIII因子、第IX因子、インフリキシマブ、インスリン(rHu インスリンを含む)、L−アスパラギナーゼ、ラロニダーゼ、ナタリズマブ、オクトレオチド、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ(PAL)、またはラスブリカーゼ(ウリカーゼ)および一般にIgGモノクローナル抗体を、特定の治療用のタンパク質、ペプチド、抗体もしくは抗体様分子は含む。

0066

別の特定の群は、止血剤(第VIII因子および第IX因子)、インスリン(rHu インスリンを含む)、ならびに非ヒト治療ウリカーゼ、PALおよびアスパラギナーゼを含む。

0067

血液学および移植において望ましくない免疫応答は、自己免疫性再生不良性貧血、移植拒絶(一般に)、および移植片対宿主病骨髄移植拒絶)を含む。抗原がヒト同種移植抗原である実施形態では、特定の配列は:様々なMHCクラスIおよびMHCクラスIIハプロタイプタンパク質(例えば、組織の交差適合試験において同定されるドナーレシピエント差異)のサブユニットならびにRhCE、Kell、Kidd、DuffyおよびSsを含む少数血液型抗原上の単一アミノ酸多型から選択されうる。かかる組成物は、所定のドナー/レシピエントの対のために個々に調製されうる。

0068

抗原が自己抗原である実施形態では、特異的な抗原(およびそれらが関連する自己免疫疾患)は以下から選択されうる:
・1型糖尿病において、いくつかの主要な抗原は:インスリン、プロインスリン、プレプロインスリン、グルタミン酸デカルボキシラーゼ−65(GAD−65またはグルタミン酸デカルボキシラーゼ2)、GAD−67、グルコース−6−ホスファターゼ2(IGRPまたは膵島特異的グルコース−6−ホスファターゼ触媒サブユニット関連タンパク質)、インスリノーマ−関連タンパク質2(IA−2)、およびインスリノーマ−関連タンパク質2(IA−2)と同定されており;他の抗原は、ICA69、ICA12(SOX−13)、カルボキシペプチダーゼH、Imogen38、GLIMA38、クロモグラニンA、HSP−60、カルボキシペプチダーゼE、ペリフェリン、2型グルコース輸送体、肝細胞癌−腸−膵臓/膵臓の関連タンパク質、S100β、グリア線維性酸性タンパク質、再生遺伝子II、膵臓十二指腸ホメオボックス1、筋強直性ジストロフィーキナーゼ、膵島特異的グルコース−6−ホスファターゼ触媒サブユニット−関連タンパク質、およびSSTGタンパク質共役型受容体1−5を含む。インスリンは自己抗原および治療用のタンパク質抗原の両方として特徴づけられうる抗原の一例であることに留意すべきである。例えば、rHu インスリンおよびウシインスリンは治療用のタンパク質抗原(望ましくない免疫攻撃の対象である)であり、一方で内在性ヒトインスリンは自己抗原(望ましくない免疫攻撃の対象である)である。内在性ヒトインスリンは、医薬組成物において利用されるためには入手可能ではないので、組換え型が本開示の組成物において利用される。
・ 本開示の組成物において有用な外因的に得られる形態を含むヒトインスリンは、以下の配列(UNIPROT P01308)を有する:
MALWMRLLPLLALLALWGPD PAAAFVNQHLCGSHLVEALY LVCGERGFFTPKTRRAELQVGQVELGG GPGAGSLQPLALEGSLQKRG IVEQCCTSIC SLYQLENYCN(配列番号:5)。
・ 本開示の組成物において有用な外因的に得られる形態を含むGAD−65は、以下の配列(UNIPROT Q05329)を有する:
MASPGSGFWS FGSEDGSGDS ENPGTARAWC QVAQKFTGGIGNKLCALLYG DAEKPAESGG SQPPRAAARK AACACDQKPCSCSKVDVNYAFLHATDLLPA CDGERTLAF LQDVMILLQ YVVKSFDRST KVIDFHYPNE LLQEYNWELA DQPQNLEIMHCTTLKYA IKTGHPRYFNQLSTGLDMVGLAADWLTSTANTMFTYEIAPVFVLLEYVTLKKMREIIGW PGGSGDGIFSPGGAISNMYA MMIARFKMFPEVKEGMAALPRLIAFTSEHSHFSLKKGAAALGGTSVILIKCDERGKM IPSDLERRIL EAKQKGFVPF LVSATAGTTV YGAFDPLLAVADICKKYKIMHVDAAWGGG LLMSRKHKWK LSGVERANSVTWNPHKMMGV PLQCSALLVREEGLMQNCNQ MHASYLFQQD KHYDLSYDTG DKALQCGRHVDVFKLWLMWR AKGTTGFEAHVDKCLELAEY LYNIIKNREG YEMFDGKPQHTVCFWYIP PSLRTLEDNE ERMSRLSKVA PVIKARMMEY GTTMVSYQPLGDKVNFFRMV ISNPAATHQD IDFLIEEIER LGQDL(配列番号:6)。
・ 本開示の組成物において有用な外因的に得られる形態を含むIGRPは、以下の配列(UNIPROT QN9QR9)を有する:
MDFLHRNGVLIIQHLQKDYRAYYTFLNFMSNVGDPRNIFFIYFPLCFQFNQTVGTKMIWVAVIGDWLNLIFKWILFGHRPYWWVQETQIYPNHSSPCLEQFPTTCETGPGSPSGHAMGASCVWYVMVTAALSHTVCGMDKFSITLHRLTWSFLWSVFWLIQISVCIRVFIATHFPHQVILGVIGGMLVAEAFEHTPGIQTASLGTYLKTNLFLFLFAVGFYLLLRVLNIDLLWSVPIAKKWCANPDWIHIDTTPFAGLVRNLGVLFGLGFAINSEMFLLSCRGGNNYTLSFRLLCALTSLTILQLYHFLQIPTHEEHLFYVLSFCKSASIPLTVVAFIPYSVHMLMKQSGKKSQ(配列番号:7)。
橋本甲状腺炎およびグレーブス病を含む甲状腺の自己免疫疾患において、主要な抗原は、チログロブリン(TG)、甲状腺ペルオキシダーゼ(TPO)および甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR)を含み;他の抗原は、ナトリウムヨウ共輸送体(NIS)およびメガリンを含む。甲状腺関連眼疾患および皮膚症において、TSHRを含む甲状腺自己抗原に加えて、抗原はインスリン様成長因子1受容体である。副甲状腺機能低下症において、主要な抗原はカルシウム感受性受容体である。
アジソン病において、主要な抗原は、21−ヒドロキシラーゼ、17 −ヒドロキシラーゼ、およびP450側鎖切断酵素(P450scc)を含み;他の抗原は、ACTH受容体、P450c21およびP450c17を含む。
・ 早期卵巣機能不全において、主要な抗原は、FSH受容体および −エノラーゼを含む。
・自己免疫性下垂体炎または下垂体自己免疫疾患において、主要な抗原は、下垂体特異的タンパク質因子(PGSF)1aおよび2を含み;別の抗原は、2型ヨードチロニンデヨージナーゼを含む。
多発性硬化症において、主要な抗原は、ミエリン塩基性タンパク質(“MBP”)、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質(“MOG”)およびミエリンプロテオリピドタンパク質(“PLP”)を含む。
・ 本開示の組成物において有用な外因的に得られる形態を含むMBPは、以下の配列(UNIPROT P02686)を有する:
MGNHAGKRELNAEKASTSETNRGESEKKRNLGELSRTTSEDNEVFGEADANQNNGTSSQDTAVTDSKRTADPKNAWQDAHPADPGSRPHLIRLFSRDAPGREDNTFKDRPSESDELQTIQEDSAATSESLDVMASQKRPSQRHGSKYLATASTMDHARHGFLPRHRDTGILDSIGRFFGGDRGAPKRGSGKDSHHPARTAHYGSLPQKSHGRTQDENPVVHFFKNIVTPRTPPPSQGKGRGLSLSRFSWGAEGQRPGFGYGGRASDYKSAHKGFKGVDAQGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR(配列番号:8)。
・ 本開示の組成物において有用な外因的に得られる形態を含むMOGは、以下の配列(UNIPROT Q16653)を有する:
MASLSRPSLPSCLCSFLLLLLLQVSSSYAGQFRVIGPRHPIRALVGDEVELPCRISPGKNATGMEVGWYRPPFSRVVHLYRNGKDQDGDQAPEYRGRTELLKDAIGEGKVTLRIRNVRFSDEGGFTCFFRDHSYQEEAAMELKVEDPFYWVSPGVLVLLAVLPVLLLQITVGLIFLCLQYRLRGKLRAEIENLHRTFDPHFLRVPCWKITLFVIVPVLGPLVALIICYNWLHRRLAGQFLEELRNPF(配列番号:9)。
・ 本開示の組成物において有用な外因的に得られる形態を含むPLPは、以下の配列(UNIPROT P60201)を有する:
MGLLECCARCLVGAPFASLVATGLCFFGVALFCGCGHEALTGTEKLIETYFSKNYQDYEYLINVIHAFQYVIYGTASFFFLYGALLLAEGFYTTGAVRQIFGDYKTTICGKGLSATVTGGQKGRGSRGQHQAHSLERVCHCLGKWLGHPDKFVGITYALTVVWLLVFACSAVPVYIYFNTWTTCQSIAFPSKTSASIGSLCADARMYGVLPWNAFPGKVCGSNLLSICKTAEFQMTFHLFIAAFVGAAATLVSLLTFMIAATYNFAVLKLMGRGTKF(配列番号:10)。
・ 多発性硬化症を治療するための本開示の組成物において有用なペプチド/エピトープは、式1の組成物において個々に、式1の組成物の混合物においてともに、または1つ以上の式2の組成物において融合される、いくつかの、または全ての以下の配列を含む:
・ MBP13−32:KYLATASTMDHARHGFLPRH(配列番号:11);
・ MBP83−99:ENPWHFFKNIVTPRTP(配列番号:12);
・ MBP111−129:LSRFSWGAEGQRPGFGYGG(配列番号:13);
・ MBP146−170:AQGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR(配列番号:14);
・ MOG1−20:GQFRVIGPRHPIRALVGDEV(配列番号:15);
・ MOG35−55:MEVGWYRPPFSRWHLYRNGK(配列番号:16);および
・ PLP139−154:HCLGKWLGHPDKFVGI(配列番号:17)。
関節リウマチにおいて、主要な抗原は、コラーゲンII、免疫グロブリン結合タンパク質免疫グロブリンGのフラグメント結晶化領域二本鎖DNA、ならびに関節リウマチの病態において関与されるタンパク質の自然なおよびシトルリン化形態を含み、フィブリン/フィブリノーゲン、ビメンチン、コラーゲンIおよびII、ならびにアルファ−エノラーゼを含む。
・ 自己免疫性胃炎において、主要な抗原は、H+、K+−ATPaseである。
悪性貧血において、主要な抗原は、内因子である。
セリアック病において、主要な抗原は、組織トランスグルタミナーゼならびに、自然なおよび脱アミドされるグルテンまたはアルファ−、ガンマ−、およびオメガグリアジングルテニン、ホルデン、セカリン、ならびにアベニンなどのグルテン−様タンパク質の形態である。例えば、セリアック病の主要な抗原は、アルファグリアジンであると同時に、アルファグリアジンは、組織グルタミナーゼが、アルファグリアジンのグルタミンをグルタミン酸に変換することによる脱アミドを通じて、体において、より免疫原性に変わると当業者は認識するだろう。従って、アルファグリアジンが最初の外来性食物抗原であると同時に、一度体において改変されてより免疫原性になると、それは自己抗原として特徴づけられうる。
白斑において、主要な抗原は、チロシナーゼ、ならびにチロシナーゼ関連タンパク質1および2である。
・ 本開示の組成物において有用な外因的に得られる形態を含むMART1、T細胞1により認識されるメラノーマ抗原メランAは、以下の配列(UNIPROT Q16655)を有する:
MPREDAHFIYGYPKKGHGHSYTTAEEAAGIGILTVILGVLLLIGCWYCRRRNGYRALMDKSLHVGTQCALTRRCPQEGFDHRDSKVSLQEKNCEPVVPNAPPAYEKLSAEQSPPPYSP(配列番号:18)。
・ 本開示の組成物において有用な外因的に得られる形態を含むチロシナーゼは、以下の配列(UNIPROT P14679)を有する:
MLLAVLYCLLWSFQTSAGHFPRACVSSKNLMEKECCPPWSGDRSPCGQLSGRGSCQNILLSNAPLGPQFPFTGVDDRESWPSVFYNRTCQCSGNFMGFNCGNCKFGFWGPNCTERRLLVRRNIFDLSAPEKDKFFAYLTLAKHTISSDYVIPIGTYGQMKNGSTPMFNDINIYDLFVWMHYYVSMDALLGGSEIWRDIDFAHEAPAFLPWHRLFLLRWEQEIQKLTGDENFTIPYWDWRDAEKCDICTDEYMGGQHPTNPNLLSPASFFSSWQIVCSRLEEYNSHQSLCNGTPEGPLRRNPGNHDKSRTPRLPSSADVEFCLSLTQYESGSMDKAANFSFRNTLEGFASPLTGIADASQSSMHNALHIYMNGTMSQVQGSANDPIFLLHHAFVDSIFEQWLRRHRPLQEVYPEANAPIGHNRESYMVPFIPLYRNGDFFISSKDLGYDYSYLQDSDPDSFQDYIKSYLEQASRIWSWLLGAAMVGAVLTALLAGLVSLLCRHKRKQLPEEKQPLLMEKEDYHSLYQSHL(配列番号:19)。
・ 本開示の組成物において有用な外因的に得られる形態を含むメラニン形成細胞タンパク質PMEL、gp100は、以下の配列(UNIPROT P40967)を有する:
MDLVLKRCLLHLAVIGALLAVGATKVPRNQDWLGVSRQLRTKAWNRQLYPEWTEAQRLDCWRGGQVSLKVSNDGPTLIGANASFSIALNFPGSQKVLPDGQVIWVNNTIINGSQVWGGQPVYPQETDDACIFPDGGPCPSGSWSQKRSFVYVWKTWGQYWQVLGGPVSGLSIGTGRAMLGTHTMEVTVYHRRGSRSYVPLAHSSSAFTITDQVPFSVSVSQLRALDGGNKHFLRNQPLTFALQLDPSGYLAEADLSYTWDFGDSSGTLISRALVVTHTYLEPGPVTAQVVLQAAIPLTSCGSSPVPGTTDGHRPTAEAPNTTAGQVPTTEVVGTTPGQAPTAEPSGTTSVQVPTTEVISTAPVQMPTAESTGMTPEKVPVSEVMGTTLAEMSTPEATGMTPAEVSIVVLSGTTAAQVTTTEWVETTARELPIPEPEGPDASSIMSTESITGSLGPLLDGTATLRLVKRQVPLDCVLYRYGSFSVTLDIVQGIESAEILQAVPSGEGDAFELTVSCQGGLPKEACMEISSPGCQPPAQRLCQPVLPSPACQLVLHQILKGGSGTYCLNVSLADTNSLAVVSTQLIMPGQEAGLGQVPLIVGILLVLMAVVLASLIYRRRLMKQDFSVPQLPHSSSHWLRLPRIFCSCPIGENSPLLSGQQV(配列番号:20)。
重症筋無力症において、主要な抗原はアセチルコリン受容体である。
尋常性天疱瘡およびバリアント型において、主要な抗原はデスモグレイン3、1および4であり;他の抗原は、ペンファキシン(pemphaxin)、デスモコリンプラコグロビンペルプラキン(perplakin)、デスモプラキン、およびアセチルコリン受容体を含む。
水疱性類天疱瘡において、主要な抗原は、BP180およびBP230を含み;他の抗原は、プレクチンおよびラミニン5を含む。
・ ジューリング疱疹状皮膚炎において、主要な抗原は、筋内膜および組織トランスグルタミナーゼを含む。
後天性表皮水疱症において、主要な抗原は、コラーゲンVIIである。
全身性硬化症において、主要な抗原は、マトリックスメタロプロテイナーゼ1および3、コラーゲン−特異的分子シャペロン熱ショックタンパク質47、フィブリリン−1、ならびにPDGF受容体を含み;他の抗原は、Scl−70、U1 RNP、Th/To、Ku、Jo1、NAG−2、セントロメアタンパク質、トポイソメラーゼI、核小体タンパク質、RNAポリメラーゼI、IIおよびIII、PM−Slc、フィブリラリン、ならびにB23を含む。
混合性結合組織病において、主要な抗原はU1snRNPである。
シェーグレン症候群において、主要な抗原は核抗原SS−AおよびSS−Bであり;他の抗原は、フォドリン、ポリ(ADP−リボースポリメラーゼおよびトポイソメラーゼ、ムスカリン受容体、ならびにFc−γ受容体IIIbを含む。
全身性エリテマトーデスにおいて、主要な抗原は、“スミス抗原”、SS−A、ハイモビリティグループボックス1(HMGB1)、ヌクレオソームヒストンタンパク質および二本鎖DNAを含む核タンパク質(これらに対して、疾病過程において自己抗体が作製される)を含む。
グッドパスチャー症候群において、主要な抗原は、コラーゲンIVを含む糸球体基底膜タンパク質を含む。
リウマチ性心疾患において、主要な抗原は、心筋ミオシンである。
・ 多腺性自己免疫症候群1型において、抗原は、芳香族L−アミノ酸デカルボキシラーゼヒスチジンデカルボキシラーゼシステインスルフィン酸デカルボキシラーゼ、トリプトファンヒドロキシラーゼ、チロシンヒドロキシラーゼフェニルアラニンヒドロキシラーゼ、肝臓P450チトクロームP450 1A2もしくは2A6、SOX−9、SOX−10、カルシウム感知受容体タンパク質、ならびに1型インターフェロンのインターフェロンアルファ、ベータおよびオメガを含む。
視神経脊髄炎において、主要な抗原は、AQP4である。
・ 本開示の組成物において有用な外因的に得られる形態を含むアクアポリン4は、以下の配列(UNIPROT P55087)を有する:
MSDRPTARRWGKCGPLCTRENIMVAFKGVWTQAFWKAVTAEFLAMLIFVLLSLGSTINWGGTEKPLPVDMVLISLCFGLSIATMVQCFGHISGGHINPAVTVAMVCTRKISIAKSVFYIAAQCLGAIIGAGILYLVTPPSVVGGLGVTMVHGNLTAGHGLLVELIITFQLVFTIFASCDSKRTDVTGSIALAIGFSVAIGHLFAINYTGASMNPARSFGPAVIMGNWENHWIYWVGPIIGAVLAGGLYEYVFCPDVEFKRRFKEAFSKAAQQTKGSYMEVEDNRSQVETDDLILKPGVVHVIDVDRGEEKKGKDQSGEVLSSV(配列番号:21)。
・ ぶどう膜炎において、主要な抗原は、網膜S−抗原または“S−アレスチン”および光受容体間レチノイド結合タンパク(IRBP)またはレチノール結合タンパク質3を含む。
・ 本開示の組成物において有用な外因的に得られる形態を含むS−アレスチンは、以下の配列(UNIPROT P10523)を有する:
MAASGKTSKS EPNHVIFKKI SRDKSVTIYL GNRDYIDHVS QVQPVDGVVL VDPDLVKGKK VYVTLTCAFR YGQEDIDVILTFRRDLYFS RVQVYPPVGA ASTPTKLQES LLKKLGSNTY PFLLTFPDYLPCSVMLQPAPQDSGKSCGVD FEVKAFATDS TDAEEDKIPK KSSVRLLIRK VQHAPLEMGP QPRAEAAWQF FMSDKPLHLA VSLNKEIYFH GEPIPVTVTV TNNTEKTVKK IKAFVEQVAN VVLYSSDYYV KPVAMEEAQE KVPPNSTLTK TLTLLPLLAN NRERRGIALD GKIKHEDTNL ASSTIIKEGI DRTVLGILVS YQIKVKLTVS GFLGELTSSE VATEVPFRLM HPQPEDPAKE SYQDANLVFE EFARHNLKDA GEAEEGKRDK NDVDE(配列番号:22)。
・ 本開示の組成物において有用な外因的に得られる形態を含むIRBPは、以下の配列(UNIPROT P10745)を有する:
MMREWVLLMSVLLCGLAGPTHLFQPSLVLDMAKVLLDNYCFPENLLGMQEAIQQAIKSHEILSISDPQTLASVLTAGVQSSLNDPRLVISYEPSTPEPPPQVPALTSLSEEELLAWLQRGLRHEVLEGNVGYLRVDSVPGQEVLSMMGEFLVAHVWGNLMGTSALVLDLRHCTGGQVSGIPYIISYLHPGNTILHVDTIYNRPSNTTTEIWTLPQVLGERYGADKDVVVLTSSQTRGVAEDIAHILKQMRRAIVVGERTGGGALDLRKLRIGESDFFFTVPVSRSLGPLGGGSQTWEGSGVLPCVGTPAEQALEKALAILTLRSALPGVVHCLQEVLKDYYTLVDRVPTLLQHLASMDFSTVVSEEDLVTKLNAGLQAASEDPRLLVRAIGPTETPSWPAPDAAAEDSPGVAPELPEDEAIRQALVDSVFQVSVLPGNVGYLRFDSFADASVLGVLAPYVLRQVWEPLQDTEHLIMDLRHNPGGPSSAVPLLLSYFQGPEAGPVHLFTTYDRRTNITQEHFSHMELPGPRYSTQRGVYLLTSHRTATAAEEFAFLMQSLGWATLVGEITAGNLLHTRTVPLLDTPEGSLALTVPVLTFIDNHGEAWLGGGVVPDAIVLAEEALDKAQEVLEFHQSLGALVEGTGHLLEAHYARPEVVGQTSALLRAKLAQGAYRTAVDLESLASQLTADLQEVSGDHRLLVFHSPGELVVEEAPPPPPAVPSPEELTYLIEALFKTEVLPGQLGYLRFDAMAELETVKAVGPQLVRLVWQQLVDTAALVIDLRYNPGSYSTAIPLLCSYFFEAEPRQHLYSVFDRATSKVTEVWTLPQVAGQRYGSHKDLYILMSHTSGSAAEAFAHTMQDLQRATVIGEPTAGGALSVGIYQVGSSPLYASMPTQMAMSATTGKAWDLAGVEPDITVPMSEALSIAQDIVALRAKVPTVLQTAGKLVADNYASAELGAKMATKLSGLQSRYSRVTSEVALAEILGADLQMLSGDPHLKAAHIPENAKDRIPGIVPMQIPSPEVFEELIKFSFHTNVLEDNIGYLRFDMFGDGELLTQVSRLLVEHIWKKIMHTDAMIIDMRFNIGGPTSSIPILCSYFFDEGPPVLLDKIYSRPDDSVSELWTHAQVVGERYGSKKSMVILTSSVTAGTAEEFTYIMKRLGRALVIGEVTSGGCQPPQTYHVDDTNLYLTIPTARSVGASDGSSWEGVGVTPHVVVPAEEALARAKEMLQHNQLRVKRSPGLQDHL(配列番号:23)。

0069

抗原が、望ましくない免疫応答が発症しうる、食物抗原などの外来性抗原である実施形態では、特異的な抗原は、以下でありうる:
ピーナッツ由来のもの:コンアラキン(Ara h 1)、アレルゲンII(Ara h 2)、ピーナッツアグルチニン、コングルチン(Ara h 6);
・ コンアラキンは、例えばUNIPROT Q6PSU6として同定される配列を有する
リンゴ由来のもの:31kdaの主要アレルゲン/疾病寛容タンパク質相同体(Mal d 2)、脂質転移タンパク質前駆物質(Mal d 3)、主要アレルゲンMal d 1.03D(Mal d 1);
乳由来のもの:α−ラクトアルブミン(ALA)、ラクトトランスフェリンキウイ由来のもの:アクチニジン(Act c 1、Act d 1)、フィトシスタチンタウマチン−様タンパク質(Act d 2)、キウェリン(Act d 5);
卵白由来のもの:オボムコイドオボアルブミンオボトランスフェリン、およびリゾチーム
卵黄由来のもの:リベチンアポチリン(apovitillin)、およびボスベチン(vosvetin);
カラシナ由来のもの:2Sアルブミン(Sin 1)、11Sグロブリン(Sin 2)、脂質転移タンパク質(Sin 3)、プロフィリン(Sin 4);
セロリ由来のもの:プロフィリン(Api g 4)、高分子量糖タンパク質(Api g 5);
エビ由来のもの:Pen 1アレルゲン(Pen 1)、アレルゲン Pen m 2(Pen m 2)、トロポミオシン速筋アイソフォーム
コムギおよび/または他の穀物由来のもの:高分子量グルテニン、低分子量グルテニン、アルファ−、ガンマ−およびオメガ−グリアジン、ホルデン、セカリンおよび/またはアベニン;
・セリアック病を治療するための本開示の組成物において有用なペプチド/エピトープは、式1の組成物において個々に、式1の組成物の混合物においてともに、または1つ以上の式2の組成物において融合される、いくつかの、または全ての以下の配列を含む:
・DQ−2関連、天然型native)アルファ−グリアジン“33−mer”:
LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF(配列番号:24)
・ DQ−2関連、脱アミド化アルファ−グリアジン“33−mer”:
LQLQPFPQPELPYPQPELPYPQPELPYPQPQPF(配列番号:25)
・ DQ−8関連、アルファ−グリアジン:
QQYPSGQGSFQPSQQNPQ(配列番号:26)
・ DQ−8関連、オメガ−グリアジン(コムギ、U5UA46):
QPFPQPEQPFPW(配列番号:27)
イチゴ由来のもの:主要イチゴアレルギーFra a 1−E(Fra a 1);および
バナナ由来のもの:プロフィリン(Mus xp 1)。

0070

抗原が、望ましくない免疫応答が発症する、動物、植物および環境の抗原などの外来性抗原である実施形態では、特異的な抗原は例えば、以下の由来のタンパク質またはペプチドを含むネコ、マウス、イヌウマハチホコリ樹木およびセイタカアワダチソウでありうる:
・ クサ(weed)(ブタクサアレルゲンamb a 1、2、3、5、および6、ならびにAmb t 5;アカザ(pigweed) Che a 2および5;ならびに他のクサアレルゲンPar j 1、2、および3、ならびにPar o 1を含む);
・ クサ(grass)(主要アレルゲンCyn d 1、7、および12;Dac g 1、2、および5;Hol I 1.01203;Lol p 1、2、3、5、および11;Mer 1;Pha 1;Poa p 1および5を含む);
・ ブタクサおよび他のクサ由来の花粉ナガバギシギシ(curly dock)、シロザ(lambs quarters)、アカザ、オオバコ、ヒメスイバ、およびヤマヨモギを含む)、クサ(grass)(バミューダグラスジョンソングラスケンタッキーグラスオーチャードグラスハルガヤ、およびオオアワガエリを含む)、および樹木(キササゲニレヒッコリーオリーブペカン、アメリカスズカケノキ、およびクルミを含む);
・ ホコリ(ヤケヒョウヒダニ種由来の、例えばDer p 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、14、15、18、20、21、および23;コナヒョウヒダニ種由来の、例えばDer f 1、2、3、6、7、10、11、13、14、15、16、18、22、および24;熱帯タマクダニ種由来の、例えばBlo t 1、2、3、4、5、6、10、11、12、13、19、および21の主要アレルゲンを含み;さらに、シワチリダニ(Euroglyphus maynei)由来のアレルゲンEur m 2、ケナガコダニ由来のアレルゲンTyr p 13、ならびにアレルゲンBla g 1、2、および4;ゴキブリ由来のPer 1、3、および7を含む);
ペット(ネコ、イヌ、げっ歯類、および家畜を含み;主要ネコアレルゲンは、Fel d 1から8、ネコIgABLa g 2、およびネコアルブミンを含み;主要イヌアレルゲンは、Can f 1から6、およびイヌアルブミンを含む);
・ 主要アレルゲンApi m 1から12を含む、ハチの針;ならびに
アスペルギルス属およびペニシリウム属の種、並びにアルテルナリアアルテルナータ(Alternaria alternata)、ダビデエラ・タシアナ(Davidiella tassiana)、および紅色白癬菌種由来のアレルゲンを含む、真菌

0071

当業者によって理解されるように、患者を試験して、望ましくない免疫応答を発症したことがある抗原を同定することができ、かつタンパク質、ペプチド等を当該抗原に基づいて開発でき、本開示の組成物におけるXとして組み込むことができる。

0072

シアル化抗原、抗体、抗体フラグメント

0073

以下は、糖鎖付加が特異的にASGPRを標的とするようにしておくために除去されうるシアル化を有する抗原、抗体、抗体フラグメントの例である:卵胞刺激ホルモン(FSH)、ヒト絨毛性ゴナドトロピンHCG)、黄体形成ホルモン(LH)、オステオポンチン、甲状腺刺激ホルモン(TSH)、アガルシダーゼアルファ、アガルシダーゼベータ(FABRAZYME(登録商標);ジェンザイム)、エポエチンアルファおよびエポエチンベータフォリトロピンアルファ(GONAL−F(登録商標);メルクセローノ)およびフォリトロピンベータ(FOLLISTIM(登録商標);シェリングプラウ)、インスリン成長因子結合タンパク質6(IGFBP−6)、ルトロピンアルファ(LUVERIS(登録商標);メルク/セローノ)、トランスフォーミング増殖因子β1、アンチトロンビン(ATryn(登録商標)/TROMBATE−III(登録商標);ジェンザイム/タレクリスバイオセラピューティクス)、甲状腺刺激ホルモンアルファ(THYROGEN(登録商標);ジェンザイム)、レノグラスチム、サルグラモスチム(LEUKINE(登録商標);ジェンザイム)、インターロイキン−3、プロウロキナーゼリンホトキシン、C1−エステラーゼ阻害剤(Berinert(登録商標);CSL)、IgG−様抗体、インターフェロンベータ、活性化凝固第VII因子(NOVOSEVEN(登録商標);ノボノルディスク)、活性化凝固第VIII因子(モロクトコグアルファ)、活性化凝固第IX因子(ノナコグアルファ)(BENEFIX(登録商標);ワイス)、ならびにp55腫瘍壊死受容体融合タンパク質。(Byrne et al.,Drug Discovery Today,Vol 12,No.7/8,pages 319−326,Apr.2007 and Sola et al.,BioDrugs.2010;24(1):9−21を参照されたい)。以前に高グリコシル化され、かつ肝細胞−ASGPR標的化のために脱シアル化されうる薬学的に関連するタンパク質は:インターフェロンアルファおよびガンマ、黄体形成ホルモン、Fv抗体フラグメント、アスパラギナーゼ、コリンエステラーゼダルベポエチンアルファ(AraNESP(登録商標);アムジェン)、トロンボポエチンレプチン、FSH、IFN−α2、血清アルブミン、およびコリフォリトロピンアルファを含む。

0074

細菌または酵母において産生されるタンパク質(アルギナーゼ、いくつかのインスリン、およびウリカーゼなど)を含む、シアル酸で正常に終わらないグリカンを有するタンパク質は、脱シアル化の影響を受けないだろう。

0075

公的に入手可能なUNIPROTなどの参照は、全てではないがほとんどの目的の抗原、抗体、抗体フラグメントおよびリガンド上での脱シアル化のための部位の、存在および位置を開示すると当業者は認識するだろう。

0076

抗体およびペプチドリガンド

0077

抗体、抗体フラグメントまたはリガンドを利用する実施形態では、かかる部分は、標的とされる循環タンパク質もしくはペプチドまたは抗体に特異的に結合するために選択され、かつ循環している標的とされる部分の肝臓の取り込みをもたらし、おそらく標的化部分を有する付加物として、究極的に、循環している標的とされる部分のクリアランスおよび不活性化をもたらす。例えば、肝臓標的化第VIII因子は、循環第VIII因子抗体に結合し、かつクリアランスするだろう。当業者は、かかる部分の同定のための手順を熟知しているだろう。

0078

リンカー

0079

本開示の組成物において利用されるリンカー(式1における“Y”)は、N−ヒドロキシスクシンイミジルリンカー、マレイミドリンカー、ビニルスルホンリンカー、ピリジルジチオール−ポリ(エチレングリコール)リンカー、ピリジルジチオールリンカー、n−ニトロフェニルカーボネートリンカー、NHS−エステルリンカー、ニトロフェノキシポリ(エチレングリコール)エステルリンカー等を含みうる。

0080

リンカーの1つの特定の基は下記の式Y’−CMP(ここで、Y’は、リンカーの残存部分を示し、かつR9およびZは規定されているとおりである)。より特には、式Y’−CMPを含むリンカーの基において、R9置換基は、エチルアセトアミド基、ならびにさらにより特には、N−アセチルガラクトサミンのC1とコンジュゲートされたエチルアセトアミドである。

0081

ジチオールを含有するリンカー、とりわけ特には、ジスルファニルエチルカルバミン酸を含有するリンカー(Xの遊離アミンを含む名称、そうでなければXの遊離アミンを含まない“ジスルファニルエチルエステル”と命名される)は、例えば下記に説明されるように(ここで、Y’は、リンカーの残存部分を示し、かつX’およびZは規定されているとおりである)、いったん細胞の内側に入るとその最初の形態において抗原を切断し、かつ解放する能力を有するので、本開示の組成物において特に有利である。

0082

0083

特に式Yaから式Ypにおいて下記に説明されるリンカーに関して:
左の括弧“(”は、XおよびY間の結合を示し;
右または下の括弧“)”は、YおよびZ間の結合を示し;
nは、約1から100、特に約8から90(例えば、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90または95)、より特には、約40から80(例えば、39、40、43、45、46、48、50、52、53、55、57、60、62、65、66、68、70、73、75、78、80または81)のエチレングリコール基を含む混合物を表す整数であり、ここで、混合物は典型的に、n±10%として特定される整数を包含し;
pは、約2から150、特に約20から100(例えば、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100または105)およびより特には、約30から40(例えば、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43または44)を含む混合物を表す整数であり、ここで、混合物は典型的に、p±10%として特定される整数を包含し;
qは、約1から44、特に約3から20(例えば、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21または22)およびより特には、約4から12(例えば、4、5、6、7、8、9、10、11、12または13)を含む混合物を表す整数であり、ここで、混合物は典型的に、q±10%として特定される整数を包含し;かつ
R8は、−CH2−(“メチル”)または−CH2−CH2−C(CH3)(CN)−(“1−シアノ−1−メチル−プロピル”または“CMP”)である。
式1の以下の構造:



において説明されるように、R9は、直接結合または−CH2−CH2−NH−C(O)−(エチルアセトアミド基または“EtAcN”)、(ここで、EtAcN基が示され、かつリンカーの残りは、Y’と称される)であり:
かつZはC1でコンジュゲートされたガラクトース、ガラクトサミンまたはN−アセチルガラクトサミンである。

0084

0085

0086

0087

0088

0089

0090

0091

0092

0093

0094

0095

0096

0097

(式Ynのリンカーは、疎水性抗原へのコンジュゲーションに特に適切なYnを与えるある特定の前駆物質を介して合成されうる。)

0098

0099

0100

式YhからYnとして上記に示されるリンカーは、分離せずに利用される異性体として合成される。例えば、式Yh、Yi、YjおよびYnのリンカーは、下記に説明される8、9−ジヒドロ−1H−ジベンゾ[b、f][1、2、3]トリアゾロ[4、5−d]アゾシン−8イルおよび8、9−ジヒドロ−3H−ジベンゾ[b、f][1、2、3]トリアゾロ[4、5−d]アゾシン−8イル構造の混合物だろう:



式Yk、YLおよびYmのリンカーは、下記に説明される8、9−ジヒドロ−1H−ジベンゾ[3、4:7、8]シクロオクタ[1、2−d][1、2、3]トリアゾール−8−イルおよび8、9−ジヒドロ−1H−ジベンゾ[3、4:7、8]シクロオクタ[1、2−d][1、2、3]トリアゾール−9−イル構造の混合物だろう:



かかる異性体の混合物の存在は、かかるリンカーを利用する組成物の機能性を損なわない。

0101

ガラクトシル化部分

0102

本開示の組成物において利用されるガラクトシル化部分は、組成物を肝細胞へ標的とするのに(例えば、特異的に肝細胞に結合すること)役立ち、かつ以下から選択されうる:ガラクトース、ガラクトサミンまたはN−アセチルガラクトサミン。ガラクトースのC3/C4−ジオールアンカー側のいずれかを改変しながら、ASGPR親和性が保持されうることが報告されており(Mamidyala,Sreeman K.,et al.,J.Am.Chem.Soc.2012,134,1978−1981)、従ってコンジュゲーションの箇所は、特にC1、C2およびC6である。

0103

特定のガラクトシル化部分は、C1もしくはC6でコンジュゲートされたガラクトース、C2でコンジュゲートされたガラクトサミン、ならびにC6でコンジュゲートされたN−アセチルガラクトサミンを含む。他の特定のガラクトシル化部分は、C2でコンジュゲートされた、より特には、CH2であるR9置換基を有するリンカーにコンジュゲートされたN−アセチルガラクトサミンを含む。さらに他の特定のガラクトシル化部分は、C1でコンジュゲートされる、より特には、エチルアセトアミド基であるR9置換基を有するリンカーにコンジュゲートされたガラクトース、ガラクトサミンまたはN−アセチルガラクトサミンを含む。

0104

ASGPR標的化抗体

0105

本開示の組成物において利用されるASGPR−特異的な抗体はまた、本開示の組成物を肝細胞へ標的化するのに役立ち、かつ商業的に入手可能な産物から選択されうる、例えば:アブカム・ピーエルシー、ケンブリッジイギリス由来の抗アシアロ糖タンパク質受容体1抗体(ab42488)およびサンタクルズ・バイオテクノロジー株式会社、ダラス、テキサス由来のASGPR1/2(FL−291)(sc28977)。あるいは、かかる抗体は、Dom26h−196−61、などの多くの公開されている配列、単一ドメイン抗ASGPR抗体
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFEKYAMAWVRQAPGKGLEWVSRISARGVTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASHKRHEHTRFDSWGQGTLVTVSS(配列番号:6)
[Coulstock E,et al.,(2013)“Liver−targeting of interferon−alpha with tissue−specific domain antibodies.”PLoS One.8(2):e57263および米国第2013/0078216号]、または保存的置換を有するかかる配列のいずれかを使って発現されうる。上記に参照される米国特許出願は、ある特定の治療剤[肝疾患の治療のためのインターフェロン(インターフェロンアルファ2、インターフェロンアルファ5、インターフェロンアルファ6、またはコンセンサスインターフェロン)、リバビリン、ネクサバール/ソラフェニブ、アービタックス/セツキシマブ、アバスタチン/ベバシズマブ、およびハーセプチン/トラスツズマブを含む]を送達するための、DOM26h−196−61などの肝臓標的化分子を開示する。DOM26h−196−61または米国第2013/0078216号において記載される別の肝臓標的化分子を利用する、式2に対応する物質の組成物は、それらの範囲内でインターフェロン(インターフェロンアルファ2、インターフェロンアルファ5、インターフェロンアルファ6、またはコンセンサスインターフェロン)、リバビリン、ネクサバール/ソラフェニブ、アービタックス/セツキシマブ、アバスタチン/ベバシズマブ、およびハーセプチン/トラスツズマブを含む。

0106

ASGPRを特異的に標的とする抗体、抗体フラグメント、またはペプチドのための新規配列は、当業者によく知られている様々な方法を使って発見されうる。これらの方法は、ワクチン接種技術、ハイブリドーマ技術、ライブラリーディスプレイ技術(細菌性およびファージプラットフォームを含む)、内在性レパートリースクリーニング技術、定向進化(directed evolution)および合理的設計を含みうるが、これらに限定されない。

0107

命名法

0108

式1の組成物は、IUPACおよび慣用名の組み合わせを使って命名されうる。例えば、式1に対応する化合物、ここでXはシクロブチル部分(例示の目的のための抗原の代わりに示される)であり、Yは式Yaであり、mは1であり、nは4であり、かつZはN−アセチルガラクトサミン−2−イルである:



は、(Z)−(21−シクロブチル−1−オキソ−1−((2、4、5−トリヒドロキシ−6−(ヒドロキシメチルテトラヒドロ−2H−ピラン−3−イル)アミノ)−4、7、10、13−テトラオキサ−16、17−ジチアヘンイコサン−21−イリデントリアズ−1−イン−2−イウムクロライドと命名でき、それ故にXが組織トランスグルタミナーゼである、対応する本開示の組成物は、(Z)−(21−(組織トランスグルタミナーゼ)−1−オキソ−1−((2、4、5−トリヒドロキシ−6−(ヒドロキシメチル)テトラヒドロ−2H−ピラン−3−イル)アミノ)−4、7、10、13−テトラオキサ−16、17−ジチアヘンイコサン−21−イリデン)トリアズ−1−イン−2−イウムクロライドと命名されうる。X’が組織トランスグルタミナーゼであり、mが2であり、nが4であり、かつZ’がN−アセチルガラクトサミン−2−イルである、対応する本開示の組成物は、(3Z)−((組織トランスグルタミナーゼ)−1、3−ジルビス(1−オキソ−1−((2、4、5−トリヒドロキシ−6−(ヒドロキシメチル)テトラヒドロ−2H−ピラン−3−イル)アミノ)−4、7、10、13−テトラオキサ−16、17−ジチアヘンイコサン−21−イル−21−イリデン))ビス(トリアズ−1−イン−2−イウムクロライドと命名されうる。

0109

簡潔性の観点で、式1の組成物は、Xおよび式1aから1pの1つに対応する物(反応式において説明される)と、それに続く変数m、n、pおよび/もしくはq、R8、R9ならびに、それがコンジュゲートされたガラクトシル化部分および位置の同定のための整数の記載を参照することにより、代替命名系を使って命名されうる。この系のもとでは、Xがオボアルブミンであり、mが2であり、nが4であり、かつZがN−アセチルガラクトサミン−2−イルである式1aの組成物は、“F1a−OVA−m2−n4−2NAcGAL”と命名されうる。

0110

同様に、以下の式1の組成物



は、



と命名されうる。異性体:



は、



と命名されうる(正式名称との差異を同定する際に、便宜のために太字ハイライトが加えられる)。本開示のための採用された命名系を利用すると、異性体の両方は、“F1n−インスリン−m1−n1−p1−q4−CMP−EtAcN−1NAcGAL”と命名でき、ここで、CMPは、R8が、1−シアノ−1−メチル−プロピルであることを示し、EtAcNは、R9が、エチルアセトアミドであることを示し、かつ1NAcGALは、Z”がC1でコンジュゲートされたN−アセチルガラクトサミンであることを示す。Zの名称の前の略称EtAcNの非存在は、R9が直接結合であることを示すだろう。

0111

式2の組成物において、左から右への配向は、反対の特段の表示がない、NからCの順番を特定すると解釈されるべきではない。例えば、m’が1であり、m”が0であり、Xがオボアルブミンであり、YがGly3Serであり、かつZが抗ASGPR Dom26h−196−61である、式2の化合物は、OVA−Gly3Ser−DOMと命名でき、かつ以下の両方を網羅するとして読まれる:
N−OVA−Gly3Ser−DOM−C
および
N−DOM−Gly3Ser−OVA−C
例えばm’が1であり、m”が0であり、Xがオボアルブミンであり、YがGly3Serであり、かつZが抗ASGPR Dom26h−196−61である式2の組成物(付加的なリンカーを介して付着される精製タグを有する)は、以下の通り命名されうる:
N−OVA−Gly3Ser−DOM−Gly3Ser−6xHis−C
または
N−DOM−Gly3Ser−OVA−Gly3Ser−6xHis−C
ここで、C’末端Gly3Ser−6xHis基は、単離および精製を容易にするアミノ酸配列を表す。

0112

m’が1であり、m”が1であり、それぞれXが第VIII因子であり、それぞれYがGly3Serであり、かつZが抗ASGPR Dom26h−196−61である式2の組成物(付加的なリンカーを介して付着される精製タグを有する)は、FVIII−Gly3Ser−DOM−Gly3Ser−FVIII−Gly3Ser−6xHisと命名でき、かつ以下の両方を包含する:
N−FVIII−Gly3Ser−DOM−Gly3Ser−FVIII−Gly3Ser−6xHis−C
および
N−6xHis−Gly3Ser−FVIII−Gly3Ser−DOM−Gly3Ser−FVIII−C。

0113

m’が3であり、m”が0、1であり、3つのX抗原がそれぞれ、脱アミド化アルファ−グリアジン“33−mer”(配列番号:25)、アルファ−グリアジン(配列番号:26)およびオメガ−グリアジン(配列番号:27)であり、それぞれYが、免疫プロテアソーム切断部位を有するリンカー(“IPC”)、ならびにZが抗ASGPR Dom26h−196−61である式2の組成物は:
脱アミド化アルファ−グリアジン“33−mer”−IPC−アルファ−グリアジン−IPC−オメガ−グリアジン−IPC−DOMと命名されうる。

0114

本開示の組成物の調製

0115

例えば、Zhu,L.,et al.,Bioconjugate Chem.2010,21,2119−2127において記載される手順を適応させることにより、式1の組成物は調製されうる。ある特定の式1の組成物の合成はまた、反応式1から14に関して下記に記載される。他の合成アプローチは、当業者にとって明らかだろう。

0116

式101(下記)は、Xの代替表示であり、



ここで、R1は、リンカーへのコンジュゲーションのための到達できるようにするためにXの三次元構造上に位置する遊離表面アミノ(−NH2)もしくはチオール(−SH)部分であり、かつX’は、同定される遊離アミノ基を除くXの残りを表す[(X”は、遊離チオール基を除くXの残りを表す反応式において使用される]。Xの正体(identity)に依存して、少なくとも1つの(N末端のアミン)が存在するだろう、そして、約1から100の整数である、より典型的には、1もしくは約4から20、ならびにもっとも典型的には1から約10であるmにより表されるように、複数のR1基(主にリジン残基またはジスルフィド結合に関与するシステイン残基に由来する)が存在できる。

0117

反応式において利用される変数は、上記に規定されているとおりであり、加えて以下を含み、それらは特定の反応式または工程に関してでなければ、任意の特異的な指標のこれらの意味が存在しないと理解されるべきである。
・ R2は、OHまたは保護基であり;
・ R3は、OH、NH2、NHAc、保護基またはNH−保護基であり;
・ R4は、OHまたは保護基であり;
・ R5は、OHまたは保護基であり;
・ R6は、OHまたは保護基であり;
・ Z’はC1またはC6でコンジュゲートされたガラクトース、C2でコンジュゲートされたガラクトサミン、またはC6でコンジュゲートされたN−アセチルガラクトサミンであり;
・ R8は、−CH2または−CH2−CH2−C(CH3)(CN)−であり;および
・ R9は直接結合であり、かつZ”はC2でコンジュゲートされたN−アセチルガラクトサミンであり;
・ R9はエチルアセトアミド基であり、かつZ”はC1でコンジュゲートされたガラクトース、ガラクトサミンまたはN−アセチルガラクトサミンである。

0118

合成反応パラメータ

0119

“溶媒”、“不活性有機溶媒”または“不活性溶媒”という用語は、それらと組み合わせて記載されている反応の条件のもとでは不活性な溶媒[例えば、ベンゼントルエンアセトニトリルテトラヒドロフラン(“THF”)、ジメチルホルムアミド(“DMF”)、クロロホルムメチレンクロライド(またはジクロロメタン)、ジエチルエーテルメタノールピリジン等を含む]を意味する。もし反対に特定されなければ、本開示の反応において使用される溶媒は、不活性有機溶媒である。

0120

“q.s.”という用語は、述べられた機能を達成する、例えば、溶液を望ましい容積(すなわち、100%)へともたらすのに十分な量を加えることを意味する。

0121

所望であれば、例えば、濾過、抽出、結晶化、カラムクロマトグラフィー薄層クロマトグラフィーもしくは厚層クロマトグラフィー遠心性サイズ排除クロマトグラフィー高速液体クロマトグラフィー再結晶昇華高速タンパク質液体クロマトグラフィー、ゲル電気泳動透析、またはこれらの手順組み合わせなどの、任意の適切な分離または精製手順により、本明細書に記載される化合物および中間体の単離および精製が影響されうる。適切な分離および単離手順の特定の例示を、下記の実施例の出典明示により得ることができる。しかしながら、他の同等の分離または単離手順はまた、やはり、使用されうる。

0122

別段の特定がない限り(実施例を含む)、全ての反応は、標準大気圧(約1気圧)ならびに周囲の(もしくは室温の)温度(約20℃)、約pH7.0−8.0で行われる。

0123

反応産物の特性評価は、通例の手段、例えば、プロトンおよびカーボンNMR、質量分析法、サイズ排除クロマトグラフィー、赤外分光法、ゲル電気泳動により行われる。

0124

反応式1は、Zがガラクトース、ガラクトサミンまたはN−アセチルガラクトサミンでありうる式1の組成物の調製を説明する。その点において、および上記に規定されているように、反応式1において利用されるようなZ’が、C1およびC6でコンジュゲートされ、かつ式1による以下の構造に対応するガラクトース:



、C2でコンジュゲートされ、かつ式1による以下の構造に対応するガラクトサミン:



、ならびにC6でコンジュゲートされ、かつ式1による以下の構造に対応するN−アセチルガラクトサミン:



を包含する。

0125

反応式1

0126

0127

0128

0129

0130

0131

反応式1、工程1において上記で説明されるように、pH約8.0、約1時間でトラウト試薬(式102)との接触により遊離表面アミノ基(式101’)を有する抗原、抗体、抗体フラグメントまたはリガンド上に表面チオール基が生成でき、例えば、遠心性サイズ排除クロマトグラフィーを介して、未反応のトラウト試薬が除去されている式103’を与える。下記に示される2つの構造は、反応式1、工程1の産物を説明し、それぞれX上に最初に確認される遊離表面アミノ基を示し(すなわち、式103’、ここでX’は同定される遊離表面アミノ基を除くXの残りを表す)、および遊離表面アミノ基を省略する(すなわち、式103)。これは、Xおよび式101間として説明される区別に似ている。慣習がその後の反応式において続いた。

0132

反応式1、工程2において、ピリジルジチオール−ポリ(エチレングリコール)−NHSエステル(式104)を、ガラクトサミン(式105、ここでR3は、NH2およびR2、R4、R5およびR6は、OHである)と約pH8、約1時間で撹拌しながら、接触させて式106Aの対応するピリジルジチオール−ポリ(エチレングリコール)−糖を与ええ、さらに精製せずに使用することができる。

0133

反応式1、工程3において、4、4’−ジチオジピリジン(式107)を、チオール−ポリ(エチレングリコール)プロパン酸(式108)と接触させて、対応するピリジルジチオール−ポリ(エチレングリコール)プロパン酸(式109)を与える。

0134

反応式1、工程4において、式109の酸を、R2が、OHであり、ならびにR3、R4、R5およびR6が保護基(“PG”)であり、ここでR6が、OHであり、かつR2、R3、R4およびR5がPGであり、または、ここでR6が、N−アセチルであり、かつR2、R3、R4およびR5がPGである式105の保護されるガラクトースまたはN−アセチルガラクトサミン、と接触させて、式106B、106Cおよび106Dの対応するピリジルジチオール−ポリ(エチレングリコール)−糖を与え、脱保護後に用いることができる。

0135

反応式1、工程5において、工程1の産物(式103’)の撹拌溶液に、過剰(mの値に対応する)の、工程2または工程4(式106、すなわち、106A、106B、106Cまたは106D)の産物を約1時間加え、それに続いて遠心性サイズ排除クロマトグラフィーで任意の遊離残存反応物を除去して、式1a、それぞれ、式1aA、式1aB、式1aCおよび式1aDによる対応産物を得る。

0136

式1aに対応する組成物は、それぞれ、例えば以下の通りに命名されうる:
“F1aA−X’−mm−nn”または“F1a−X’−mm−nn−2NGAL”
“F1aB−X’−mm−nn”または“F1a−X’−mm−nn−1GAL”
“F1aC−X’−mm−nn”または“F1a−X’−mm−nn−6GAL”
“F1aD−X’−mm−nn”または“F1a−X’−mm−nn−6NAcGAL”
それぞれ、式106A−Dによる中間体を利用する産物として作製される。

0137

反応式2−14に移り、それらと利用される命名法の目的のため、特に明記されている場合を除き、Z”はC2でコンジュゲートされたN−アセチルガラクトサミン:



またはC1でコンジュゲートされたガラクトース、ガラクトサミンまたはN−アセチルガラクトサミンを指す。組成物にコンジュゲートされるC1は、例えばC3ヒドロキシルでアミンを環化することにより、および続いて隣接性のリンカーの部分への保護されるガラクトサミンの組み込みを脱保護することにより、合成の間、保護される必要があるということに留意すべきである。

0138

ガラクトースをメタクリル酸化することにより、例えば、ガラクトサミンおよびメタクリル酸無水物を接触させ、それに続いて適切な溶媒においてアゾビスイソブチロニトリル(AIBN)の存在下で、凍結融解サイクルで開始し、それに続いて約60−80℃、好ましくは70℃で約5−8、好ましくは約6時間加熱する、対応するRAFT剤との可逆的付加−開裂連鎖移動(RAFT)重合により、式201、401、501、601、701、803および1401のポリ(ガラクトースメタクリル酸)反応物を調製することができる。低級アルカノール、好ましくはメタノールにおいて、ポリマー沈殿することができる。

0139

反応式2

0140

0141

反応式2において説明されるように、例えば、反応式1、工程1(式103’)に関して記載される、調製される遊離表面チオール基を有する抗原、抗体、抗体フラグメントまたはリガンドを、過剰(mの値に対応する)の式201のピリジルジチオール−ポリ(エチレングリコール)と約1時間接触させて式1bによる対応産物を得る。

0142

式1bの組成物は以下の通り命名されうる:
“F1b−X’−mm−nn−pp−2NAcGAL”または“F1b−X’−mm−nn−pp−EtAcN−Z”。
例えば、X’がウリカーゼであり、mが1であり、nが4であり、pが4であり、かつZ”がC2でコンジュゲートされたN−アセチルガラクトサミンである式1bの組成物は、“F1b−ウリカーゼ−m1−n4−p4−2NAcGAL”または“30−(ウリカーゼ)−3、5、7、9−テトラメチル−12−オキソ−1−フェニル−1−チオキソ−3、5、7、9−テトラキス((2、4、5−トリヒドロキシ−6−(ヒドロキシメチル)テトラヒドロ−2H−ピラン−3−イル)カルバモイル)−13、16、19、22−テトラオキサ−2、25、26−トリチアトリアコンタン−30−イミニウム”と命名されうる。

0143

反応式3

0144

0145

反応式3において説明されるように、天然型の遊離表面チオール基(システイン)を有する抗原、抗体、抗体フラグメントまたはリガンド[式101に対応し、かつここで当該用語が引き続いて利用されるように、X”は、同定される遊離表面チオール基を除くXを表すことを説明する式101”]を、過剰(mの値に対応する)の式201のピリジルジチオール−ポリ(エチレングリコール)と接触させて式1cによる対応産物を得る。

0146

式1cに対応する組成物は、以下の通り命名されうる:
“F1c−X’−mm−nn−pp−2NAcGAL”または“F1c−X’−mm−nn−pp−EtAcN−Z”。

0147

反応式4

0148

0149

反応式4において説明されるように、式101”の天然型の遊離表面チオール基を有する抗原、抗体、抗体フラグメントまたはリガンドを、過剰(mの値に対応する)の式401のピリジルジチオールと接触させて式1dによる対応産物を得る。

0150

式1dに対応する組成物は、以下の通り命名されうる:
“F1d−X’−mm−pp−2NAcGAL”または“F1d−X’−mm−pp−EtAcN−Z”。

0151

反応式5

0152

0153

反応式5において説明されるように、式101’の天然型の遊離表面アミノ基を有する抗原、抗体、抗体フラグメントまたはリガンドを、過剰(mの値に対応する)の式501のn−ニトロフェニルカーボネートと接触させて式1eによる対応産物を得る。

0154

式1eに対応する組成物は、以下の通り命名されうる:
“F1e−X’−mm−pp−2NAcGAL”または“F1e−X’−mm−pp−EtAcN−Z”。

0155

反応式6

0156

0157

反応式6において説明されるように、式101’の天然型の遊離表面アミノ基を有する抗原、抗体、抗体フラグメントまたはリガンドを、過剰(mの値に対応する)の式601のn−ニトロフェニルカーボネートポリ(エチレングリコール)エステルと接触させて式1fによる対応産物を得る。

0158

式1fに対応する組成物は、以下の通り命名されうる:
“F1f−X’−mm−nn−pp−2NAcGAL”または“F1f−X’−mm−nn−pp−EtAcN−Z”。

0159

反応式7

0160

0161

反応式7において説明されるように、式101’の天然型の遊離表面アミノ基を有する抗原、抗体、抗体フラグメントまたはリガンドを、過剰(mの値に対応する)の式701のNHS−エステルポリ(エチレングリコール)エステルと接触させて式1gによる対応産物を得る。

0162

式1gに対応する組成物は、以下の通り命名されうる:
“F1g−X’−mm−pp−2NAcGAL”または“F1g−X’−mm−pp−EtAcN−Z”

0163

反応式8

0164

0165

0166

反応式8、工程1において説明されるように、式101’の天然型の遊離表面アミノ基を有する抗原、抗体、抗体フラグメントまたはリガンドを、式801のクリックケミストリーのための過剰(mの値に対応する)のアミン−反応性リンカーと接触させて式802による対応産物を得る。

0167

反応式8、工程2において、式802の産物を、その後式803のガラクトース(アミン)ポリマーの同等量(再度mの値に対応する)と接触させて式1hによる対応する異性体産物を得る。上記に説明される2つの異性体は、式802の三重結合を有する式803のアジドの非特異的な環化を生じる。かかる非特異的な環化は、他の組成物の合成において起こり、ここでYは式YhからYnから選択されるが、それぞれの実例において説明されないだろう。

0168

式1hに対応する組成物は、以下の通り命名されうる:
“F1h−X’−mm−nn−pp−qq−2NAcGAL”または“F1h−X’−mm−nn−pp−qq−EtAcN−Z”。

0169

反応式9

0170

0171

0172

反応式9、工程1において説明されるように、式101”の天然型の遊離表面チオール基を有する抗原、抗体、抗体フラグメントまたはリガンドを、式901のクリックケミストリーのための過剰(mの値に対応する)のチオール−反応性リンカーと接触させて式902”による対応産物を得る。

0173

反応式9、工程2において、式902”の産物を、その後式803のガラクトース(アミン)ポリマーの同等量(再度mの値に対応する)と接触させて式1iによる対応する異性体産物を得る。

0174

式1iに対応する組成物は、以下の通り命名されうる:
“F1i−X’−mm−nn−pp−qq−2NAcGAL”または“F1i−X’−mm−nn−pp−qq−EtAcN−Z”。

0175

反応式9に関して記載される手順に従い、出発物質101”を式103’の化合物(トラウト試薬で誘導体化される)に置換することにより、下記に示されるように式1jの対応する異性体産物が得られる。

0176

0177

式1jに対応する組成物は、以下の通り命名されうる:
“F1j−X’−mm−nn−pp−qq−2NAcGAL”または“F1j−X’−mm−nn−pp−qq−EtAcN−Z”。

0178

反応式10

0179

0180

0181

反応式10、工程1において説明されるように、式101”の天然型の遊離表面チオール基を有する抗原、抗体、抗体フラグメントまたはリガンドを、式1001のクリックケミストリーのための過剰(mの値に対応する)のチオール−反応性リンカーと接触させて式1002による対応産物を得る。

0182

反応式10、工程2において、式1002の産物を、その後式803のガラクトース(アミン)ポリマーの同等量(再度mの値に対応する)と接触させて式1kによる対応する異性体産物を得る。

0183

式1kに対応する組成物は、以下の通り命名されうる:
“F1k−X’−mm−nn−pp−qq−2NAcGAL”または“F1k−X’−mm−nn−pp−qq−EtAcN−Z”。

0184

反応式10に関して記載される手順に従い、出発物質101”を式103’の化合物(トラウト試薬で誘導体化される)に置換することにより、下記に示されるように式1Lの対応する異性体産物が得られる。

0185

0186

式1Lに対応する組成物は以下の通り命名されうる:
“F1L−X’−mm−nn−pp−qq−2NAcGAL”または“F1L−X’−mm−nn−pp−qq−EtAcN−Z”。

0187

反応式11

0188

0189

0190

0191

0192

0193

0194

0195

反応式11、工程1において説明されるように、ガラクトース、保護されるガラクトサミンまたはN−アセチル−D−ガラクトサミン(式1101、ここでそれぞれR3およびR4は、OHであり、R3は、NH−保護基(例えば、R4で環化される)であり、またはR3は、NHAcでありかつR4は、OHである)を、2−クロロエタン−1−オールと接触させて、それに続いて冷却およびアセチルクロライドを滴下する。当該溶液を室温に加温し、かつその後70℃に数時間加熱した。エタノールを粗産物に加え、かつ得られる溶液を炭素存在下で撹拌し、その後濾過し、それに続いて溶媒除去し式1102の対応産物を得る。

0196

反応式11、工程2において説明されるように、式1102の産物を、過剰のアジ化ナトリウムに加え、かつ90℃に数時間加熱し、その後濾過し、それに続いて溶媒除去し式1103の対応産物を得る。

0197

反応式11、工程3において説明されるように、式1103の産物を炭素およびエタノールのパラジウムの溶液に加え、かつ水素ガス(3気圧)のもとで数時間撹拌し、その後濾過し、それに続いて溶媒除去し式1104の対応産物を得る。

0198

反応式11、工程4において説明されるように、式1104の産物をメタクリル酸無水物の溶液に加え、トリエチルアミンを加えて、かつ反応を2時間撹拌し、それに続いて溶媒除去および単離により式1105の対応産物を得る。

0199

反応式11、工程5において説明されるように、アジド−改変uRAFT剤(式1106)を、アゾビスイソブチロニトリルを有する式1105の産物の溶液に加えて、4凍結脱気サイクルに供し、かつその後70℃で撹拌する。数時間後、式1107の対応するポリマー産物を低級アルカノールの添加により沈殿させ、それに続いて溶媒除去する。ここでR3は、NH−保護基(例えば、R4で環化される)であり、保護基はこの箇所で除去される。

0200

反応式11、工程6において説明されるように、式101’の天然型の遊離表面アミノ基を有する抗原、抗体、抗体フラグメントまたはリガンドをpH8.0緩衝液に加え、かつ過剰(mの値に対応する)の式1108のジオキソピロリジンと撹拌しながら接触させる。1時間後、未反応の式1108を除去し、かつ得られる式1109の産物はさらに精製せずに使用される。

0201

反応式11、工程7において説明されるように、式1107の産物をpH8.0緩衝液に加え、そして式1109の産物に加える。2時間撹拌後、過剰の式1107を除去し、式1mの対応する異性体産物を得る。

0202

工程5において式1105の産物をN−(2、4、5−トリヒドロキシ−6−(ヒドロキシメチル)テトラヒドロ−2H−ピラン−3−イル)メタクリルアミドに置換し、かつ工程6および7を続行することにより、Z”がC2でコンジュゲートされたN−アセチルガラクトサミンである式1mの対応する異性体産物が得られる。

0203

式1mに対応する組成物は、以下の通り命名されうる:
“F1m−X’−mm−nn−pp−qq−EtAcN−Z”、ここでZ“は1GAL、1NGALもしくは1NAcGAL、または”F1m−X’−mm−nn−pp−qq−2NAcGAL”である。

0204

反応式12

0205

反応式12の合成アプローチは、有機溶媒の使用のために疎水性の抗原、抗体、抗体フラグメントおよびリガンド(例えば、インスリン)に特に適切である。

0206

反応式12、工程1において説明されるように、式101’の天然型の遊離表面アミノ基を有する抗原、抗体、抗体フラグメントまたはリガンドを、トリエチルアミンを含有する有機溶媒(例えば、DMF)において溶解する。これに、式1201の化合物の量(mの値に対応する)を加え、それに続いて撹拌およびt−ブチルメチルエーテルを加える。式1202の対応産物を沈殿物として回収する。

0207

式1202の産物を有機溶媒において再懸濁し、かつ式1107(例えば、反応式11に関して記載されるように得られる)の量(mの値に対応する)を加え、それに続いて撹拌する。当該反応産物をジクロロメタンの添加を介して沈殿させ、それに続いて濾過および溶媒除去した。精製(例えば、PBSにおける再懸濁、それに続く遠心性サイズ排除クロマトグラフィー)は、式1nの対応する異性体産物を得る。

0208

式1nに対応する組成物は、以下の通り命名されうる:
“F1n−X’−mm−nn−pp−qq−EtAcN−Z”、ここでZ“は1GAL、1NGALもしくは1NAcGAL、または”F1m−X’−nm−nn−pp−qq−2NAcGAL”である。

0209

反応式13

0210

0211

0212

反応式13、工程1において、ニトロフェノキシカルボニルオキシアルキルジチオール−ポリ(エチレングリコール)−NHSエステル(式1301)を、ガラクトース、ガラクトサミンまたはN−アセチルガラクトサミン(式105)と接触させて、他の2つの説明される産物と一緒に、式1302の対応産物を与え、ここから式1302の望ましいニトロフェノキシカルボニルジチオール−ポリ(エチレングリコール)−カルボキシエチルガラクトース、ガラクトサミンまたはN−アセチルガラクトサミンが次の工程に進む前に単離される。

0213

反応式13、工程2において説明されるように、式101’の天然型の遊離表面アミノ基を有する抗原、抗体、抗体フラグメントまたはリガンドを、過剰(mの値に対応する)の式1302の産物と接触させて式1oによる対応産物を得る。

0214

式1oに対応する組成物は、以下の通り式1oに対応する組成物は、以下の通り命名されうる:
“F1o−X’−mm−nn−Z’”。

0215

反応式14

0216

0217

反応式14において説明されるように、天然型の遊離表面アミノ基を有する抗原、抗体、抗体フラグメントまたはリガンド(式101’)を、過剰(mの値に対応する)の式1401のピリジルジチオール−ポリ(エチレングリコール)−NHSエステルと接触させて式1pによる対応産物を得る。

0218

式1pに対応する組成物は、以下の通り命名されうる:
“F1p−X’−mm−nn−pp−2NAcGAL”または“F1p−X’−mm−nn−pp−EtAcN−Z”。

0219

融合タンパク質の調製

0220

商業的に入手可能な哺乳類の、細菌性の、酵母の、もしくは昆虫の細胞発現ベクター、ならびに公開されている、発見されている、もしくは設計されている遺伝子配列を使って、人工的に許容される方法論を介して、式2の融合タンパク質組成物を発現させることができる。タグ配列と共にX、YおよびZをコードする配列を、発現ベクターに、例えば、哺乳類の発現ベクターpSecTag Aにクローニングすることができ、ここで、融合タンパク質はC末端からIgκ鎖分泌リーダー配列に挿入される。部位特異的突然変異誘発法およびQuikChangeプロトコール(Geiser,et al.)のバリエーションを含む様々な他のクローニング技術は利用でき、かつ当業者によく知られている。哺乳類細胞において[例えば、ヒト胚腎臓(HEK293)細胞またはチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞において]、ポリエチレンイミンを使って上記に記載されるベクターでの一過性の遺伝子導入により融合タンパク質を一過性に発現することができる。例えば、約7日間バルプロ酸またはDMSOが補充される適切な培地(例えば、FreeStyle 293培地、ライフテクノロジーズ)において、遺伝子導入細胞を培養し、その後、当該細胞を遠心分離により除去し、かつ培養上清を収集し、かつ濾過により無菌化する。

0221

あるいは、安定に遺伝子導入された哺乳類の細胞系統を作製することにより、融合タンパク質を安定に発現することができる。加えて、適合性の培地(例えばLB、2XYT、SOB、SOC、TBおよび他の培地(broth))、補充物(例えばグリセリン、グルコース、および他の補充物)ならびに適切な増殖および発現条件を使うことによって、大腸菌コリネバクテリウム属、またはシュードモナスフルオレッセンスなどの細菌において融合タンパク質を産生するために発現ベクターを使用することができる。酵母における発現系は、一般にサッカロマイセスセレビシエおよびピキアパストリス、またはサッカロマイセス属、ピキア属、クリベロマイセス属、およびヤロウイア属の他の生物、ならびにあまり一般には使用されない、例えば糸状菌アスペルギルストリコデルマ、もしくはミセリオフトラサーモフィラC1などの生物を使用することができる。昆虫発現系は、バキュロウイルス感染昆虫細胞または非溶解性昆虫細胞発現を利用して、高い量でタンパク質発現レベルを達成することができ;ほとんどの一般的な昆虫細胞はSf9およびSf21(スポドプテラ・フルギペルダ由来)、Hi−5(イラクサギンウワバ由来)、ならびにシュナイダー2および3(キイロショウジョウバエ由来)を含むが、これらに限定されない。

0222

アフィニティークロマトグラフィーにより(例えば、HisTrap Ni2+セファロースカラムGEヘルスケア、Hisタグ融合タンパク質用を使って)培養上清から、発現融合タンパク質産物を精製することができ、それに続いて、サイズ排除クロマトグラフィー(例えば、Superdex75カラム、GEヘルスケアを使って)またはイオン交換クロマトグラフィーなどの他のクロマトグラフィーの精製工程を行う。例えば、SDS−PAGEゲルクマシーブリリアンブルー染色およびウェスタンブロッティング(例えばHisタグ融合タンパク質用抗6xHisタグウェスタンブロッティング)により、タンパク質純度を検証することができる。タンパク質濃度ランベルトベールの法則を使って決定することができ、それは例えば、NanoDrop 2000(Thermo Scientific)を使って280nmでの吸光度を測定することができる。例えば、ExPASy ProtParam ツールを使ってタンパク質のアミノ酸配列から、分子量および吸光係数推定することができる。例えば、HEK−BlueTLR4レポーター細胞系統(Invivogen)を使って、製造元指示書に従ってエンドトキシンレベルを測定することができる。

0223

脱シアル化抗原、抗体、抗体フラグメントおよびリガンドの調製

0224

商業的に入手可能なノイラミニダーゼ(アセチルノイラミニルヒドロラーゼまたはシアリダーゼとしてもよく知られている)酵素または硫酸を使って、人工的に許容される方法論を介して脱シアル化タンパク質を産生させることができる。目的のタンパク質の酵素的脱シアル化について、当該タンパク質をノイラミニダーゼと共に37℃で1時間、または必要に応じてそれより長くインキュベートすることができる。酸加水分解による化学的脱シアル化について、目的のタンパク質を硫酸0.025Nで、80℃で1時間または必要に応じてそれより長く処理することができる。その後、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィーにより(例えば、HisTrap Ni2+セファロースカラム、GEヘルスケアを使って)反応混合物から脱シアル化タンパク質を精製することができ、それに続いてサイズ排除クロマトグラフィー(例えば、Superdex75カラム、GEヘルスケアを使って)を行う。例えば、SDS−PAGEゲルのクマシーブリリアントブルー染色および抗6xHisタグウェスタンブロッティングにより、タンパク質純度を検証することができる。例えば商業的に入手可能なキット(例えばアブカム、プロザイム、またはシグマ)を使って、レクチンに基づくタンパク質の検出、ウェスタンブロットにおけるシアル酸含量またはシアル酸含量の比色定量により、脱シアル化を検証することができる。脱シアル化タンパク質濃度をランベルト・ベールの法則を使って決定することができ、それは例えば、NanoDrop 2000(Thermo Scientific)を使って280nmでの吸光度を測定することができる。例えば、ExPASy ProtParam ツールを使ってタンパク質のアミノ酸配列から、分子量および吸光係数を推定することができる。例えば、HEK−BlueTLR4レポーター細胞系統(Invivogen)を使って、製造元の指示書に従ってエンドトキシンレベルを測定することができる。

0225

特定のプロセスおよび最終工程

0226

式103’の化合物を、過剰(mの値に対応する)の式106の化合物と接触させて式1aの対応産物を与える。

0227

式103’の化合物を、過剰(mの値に対応する)の式201の化合物と接触させて式1bの対応産物を与える。

0228

式802の化合物、902または1002を、過剰(mの値に対応する)の式803の化合物と接触させてそれぞれ式1h、式1iまたは式1kの対応産物を与える。

0229

式1109の化合物を、過剰(mの値に対応する)の式1107の化合物と接触させて式1mの対応産物を与え、特には、ここで、nは約80であり、pは約30であり、qは約4であり、かつ抗原の機能であるmは約2から10である。

0230

式1202の化合物を、過剰(mの値に対応する)の式1107の化合物と接触させて式1nの対応産物を与え、特には、ここでnは約1であり、pは約30であり、qは約4であり、かつ抗原の機能であるm約2から10である。

0231

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