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技術 発酵大豆粕の向上した生産能を有するバチルス属菌株及びそれを用いて発酵大豆粕を製造する方法

出願人 シージェイチェイルジェダングコーポレイション
発明者 タエクベオムキムソングフイグウオンビナキムセオングジュンチョキュングイルカングセウングウオンパルクヨウングホホングミンジュパルク
出願日 2015年1月28日 (2年8ヶ月経過) 出願番号 2016-566591
公開日 2017年3月2日 (7ヶ月経過) 公開番号 2017-506081
状態 未査定
技術分野 飼料または食品用豆類 飼料(2)(一般) 微生物による化合物の製造 微生物、その培養処理 突然変異または遺伝子工学
主要キーワード 組成物質 移送過程 比率値 化学的加工 直径サイズ 時間液体培養 植物性飼料 発酵開始前

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図面 (7)

課題・解決手段

本発明は、抗栄養因子除去活性タンパク分解酵素活性及び病原菌に対する抗菌活性に優れ、粘液質生成能の低下したバチルスアミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)K2G菌株、前記菌株を用いて発酵大豆粕製造する方法、これから製造された発酵大豆粕、及びこれを含む飼料組成物に関する。本発明によるバチルス・アミロリケファシエンスK2G菌株を用いて製造された発酵大豆粕は、トリプシン阻害因子大豆オリゴ糖及び多糖類など、多様な抗栄養因子がほぼ消失し、粗タンパク含量とタンパク質溶解度が高いだけでなく、低分子化により、家畜消化吸収しやすい小さいサイズのペプチドで構成されており、吸収率飼料効率に優れた高品質植物性タンパク質飼料として有用に用いることができる。

背景

ヒトに致命的な狂病などの疾病飼料添加される動物性タンパク質成分に起因した結果であると判定され、全世界的に飼料に添加される動物性タンパク質を植物性タンパク質代替しようとする動きが急速に進められている。

飼料市場において魚粉肉骨粉または血漿のような動物性タンパク質の代替品として使用している植物性タンパク質原料の中で、最も大きな割合を占めているのが脱脂大豆粕(以下、「大豆粕」という)である。大豆粕は、大豆油を絞ったあとの残りかすを意味するものであり、豆かすとも呼ばれる。韓国において植物性タンパク質飼料源として用いられる大豆粕は、全飼料の60%を占め、供給量は年間200万トンに達している(2004年、韓国単味飼料協会)。

大豆粕は、乾燥物基準として、タンパク質が55〜56重量%、可溶性炭水化物が13〜14重量%、不溶性炭水化物が21〜22重量%が含有されており、この他に1重量%程度の粗脂肪と4〜6重量%程度を含んでいる(非特許文献1)。

一方、大豆粕には、多様な抗栄養因子(anti-nutritional factor、ANF)が含まれており、飼料として利用した場合、消化率阻害されるという問題点がある(非特許文献2)。その中で代表的なものがトリプシン阻害因子(trypsin inhibitor、TI)であり、動物において食餌TIは、トリプシン(trypsin)とキモトリプシン(chymotrypsin)の適切な酵素機能を阻害し、全タンパク質の利用性を低下させる。特に、このような抗栄養因子の影響は、仔家畜の場合に顕著に現れるため、仔家畜用飼料に添加される大豆粕の使用量を制限している。それ以外にも、血球凝集素であるヘマグルチニン(hemagglutinin)、家畜の下痢腹痛を誘発するラフィノーススタキオースなどのようなオリゴ糖、栄養成分の吸収を阻害する多糖類などが知られている。これらの一部は、熱処理により破壊されるが、この過程大豆タンパク質変性され、溶解度が減少し、リジン(lysine)などの必須アミノ酸消失され得る。これに対し、最近では、大豆のタンパク質をより効率的に利用するために、抗栄養因子を除去して効率性を増大させる加工方法が開発されている。

現在、生産されている濃縮大豆タンパク質(soy protein concentrates)、分離大豆タンパク質(isolated soy proteins)または加水分解大豆タンパク質(hydrolized soy protein )などのような大豆タンパク質加工品は、化学的処理または酵素的処理により生産されている。しかし、化学的処理方法は、生産単価が高く、製造過程中の熱処理、化学的処理、熱乾燥などにより、タンパク質の変性、水溶性アミノ酸の消失などが起き、実際のタンパク質の溶解度が低下するという問題点を有する。このため、化学的加工方法は、タンパク質の深刻な変性が起こらない程度で熱処理をするため、抗栄養因子のトリプシン阻害因子が大豆タンパク質内に相当量存在するようになる。

このような化学的加工方法の問題点を解決する手段としてバチルス菌またはカビを利用した生物学的加工方法で発酵させた発酵大豆粕製品が開発された(特許文献1、特許文献2、特許文献3)。前記発酵処理加工方法は、発酵過程中に多数の抗栄養因子を除去することができ、さらにタンパク質や炭水化物消化しやすい低分子の形に分解することができるため、消化吸収率に優れた高品質の飼料用タンパク素材製造することができる。

しかし、前記発酵処理加工方法は、一般的に、固体発酵を利用するが、固体発酵は好気的な状態と発酵の過程で生産される発酵熱を除去するために持続的に空気を吹き込まなければならない短所がある。また、前記発酵処理加工方法は、適正なレベル以上の抗栄養因子を除去するためには、48時間以上の長い発酵時間を必要とする。このような長い発酵時間は、製麹機の回転率を低下させ、全体的な原価の上昇をもたらす。

そこで、本発明者らは、発酵処理大豆粕の製造時の発酵時間を最大限に短縮するために、発酵大豆粕の生産に必要な優れた特性を有するバチルスサブチリスTP菌株(KFCC11343P、国際寄託番号KCCM11438P)を用いて固体発酵により発酵大豆粕を製造する方法を開発した(特許文献4)。前記方法は、抗栄養因子の除去活性及びタンパク質分解能力に優れたバチルスサブチリスTP6菌株を用いて、従来の発酵大豆粕に比べて短い発酵時間にもかかわらず同等以上の品質を有する発酵大豆粕を製造することができる。

しかし、前記方法は、大豆粕の発酵時に大腸菌サルモネラ菌汚染される場合、このような病原菌に対するバチルスサブチリスTP6菌株の増殖抑制能が弱く、発酵過程中に、病原菌も共に増殖することになる問題点が発生し得る。

そこで、本発明者らは、大豆粕の固体発酵に有用な改良された特性を有する発酵菌株選抜するために鋭意研究、努力した結果、抗栄養因子の除去、タンパク分解酵素活性及び病原菌に対する抗菌活性が優れながら、発酵過程中に粘液質生成能の低下したバチルスアミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)K2G菌株を開発した。また、本発明者らは、前記菌株を用いて大豆粕を固体発酵させると、従来に比べて短縮された発酵時間内に大豆タンパク質の加水分解による低分子化及び粗タンパク含量の増加、トリプシン阻害因子の不活性化非消化性多糖類のような抗栄養因子の含量の減少などにより、消化吸収率と飼料効率が増加した高品質の発酵大豆粕を製造することができることを確認することにより、本発明を完成した。

概要

本発明は、抗栄養因子除去活性、タンパク分解酵素活性及び病原菌に対する抗菌活性に優れ、粘液質生成能の低下したバチルス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)K2G菌株、前記菌株を用いて発酵大豆粕を製造する方法、これから製造された発酵大豆粕、及びこれを含む飼料組成物に関する。本発明によるバチルス・アミロリケファシエンスK2G菌株を用いて製造された発酵大豆粕は、トリプシン阻害因子、大豆オリゴ糖及び多糖類など、多様な抗栄養因子がほぼ消失し、粗タンパク含量とタンパク質の溶解度が高いだけでなく、低分子化により、家畜が消化吸収しやすい小さいサイズのペプチドで構成されており、吸収率と飼料効率に優れた高品質の植物性タンパク質飼料として有用に用いることができる。

目的

本発明の目的は、発酵大豆粕の生産能が向上した新規なバチルス・アミロリケファシエンス菌株を提供する

効果

実績

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請求項1

固体発酵により発酵大豆粕製造する方法において、寄託番号KCCM11471Pとして寄託されたバチルスアミロリケファシエンスK2G菌株大豆粕に接種する段階を含むことを特徴とする発酵大豆粕の製造方法

請求項2

下記段階を含む請求項1に記載の方法:a)大豆粕に水分を添加して熱処理する段階;b)前記熱処理された大豆粕を冷却した後、バチルス・アミロリケファシエンスK2G菌株を接種する段階;及びc)前記大豆粕に接種されたバチルス・アミロリケファシエンスK2G菌株を固体培養して発酵大豆粕を得る段階。

請求項3

段階a)において水分が添加された大豆粕が30〜80%(v/w)の水分含量を有する、請求項2に記載の方法。

請求項4

段階a)の熱処理が、大豆粕を70〜130℃で10〜30分間熱処理することである、請求項2に記載の方法。

請求項5

段階b)において大豆粕が30〜50℃に冷却される、請求項2に記載の方法。

請求項6

段階b)においてバチルス・アミロリケファシエンスK2G菌株が接種直後に105〜109CFU/gの菌数となるように接種される、請求項2に記載の方法。

請求項7

段階c)において固体培養が30〜45℃で12〜48時間行われる、請求項2に記載の方法。

請求項8

段階c)で得られた発酵大豆粕を乾燥及び粉砕する段階をさらに含む、請求項2に記載の方法。

請求項9

寄託番号KCCM11471Pとして寄託されたバチルス・アミロリケファシエンスK2G菌株。

請求項10

請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法により製造された発酵大豆粕。

請求項11

請求項10による発酵大豆粕を含む飼料組成物

技術分野

0001

本発明は、発酵大豆粕生産能が向上した新規バチルス属(Bacillus sp.)菌株及びそれを用いて発酵大豆粕を製造する方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、抗栄養因子の削除及びタンパク分解酵素活性に優れ、病原菌に対して高い抗菌活性を示しながら発酵過程中に粘液質生成能が低下し、発酵大豆粕の生産能が向上した新規なバチルスアミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)菌株、前記菌株を用いて発酵大豆粕を製造する方法、これから製造された発酵大豆粕、及びこれを含む飼料組成物に関する。

背景技術

0002

ヒトに致命的な狂病などの疾病飼料添加される動物性タンパク質成分に起因した結果であると判定され、全世界的に飼料に添加される動物性タンパク質を植物性タンパク質代替しようとする動きが急速に進められている。

0003

飼料市場において魚粉肉骨粉または血漿のような動物性タンパク質の代替品として使用している植物性タンパク質原料の中で、最も大きな割合を占めているのが脱脂大豆粕(以下、「大豆粕」という)である。大豆粕は、大豆油を絞ったあとの残りかすを意味するものであり、豆かすとも呼ばれる。韓国において植物性タンパク質飼料源として用いられる大豆粕は、全飼料の60%を占め、供給量は年間200万トンに達している(2004年、韓国単味飼料協会)。

0004

大豆粕は、乾燥物基準として、タンパク質が55〜56重量%、可溶性炭水化物が13〜14重量%、不溶性炭水化物が21〜22重量%が含有されており、この他に1重量%程度の粗脂肪と4〜6重量%程度を含んでいる(非特許文献1)。

0005

一方、大豆粕には、多様な抗栄養因子(anti-nutritional factor、ANF)が含まれており、飼料として利用した場合、消化率阻害されるという問題点がある(非特許文献2)。その中で代表的なものがトリプシン阻害因子(trypsin inhibitor、TI)であり、動物において食餌TIは、トリプシン(trypsin)とキモトリプシン(chymotrypsin)の適切な酵素機能を阻害し、全タンパク質の利用性を低下させる。特に、このような抗栄養因子の影響は、仔家畜の場合に顕著に現れるため、仔家畜用飼料に添加される大豆粕の使用量を制限している。それ以外にも、血球凝集素であるヘマグルチニン(hemagglutinin)、家畜の下痢腹痛を誘発するラフィノーススタキオースなどのようなオリゴ糖、栄養成分の吸収を阻害する多糖類などが知られている。これらの一部は、熱処理により破壊されるが、この過程大豆タンパク質変性され、溶解度が減少し、リジン(lysine)などの必須アミノ酸消失され得る。これに対し、最近では、大豆のタンパク質をより効率的に利用するために、抗栄養因子を除去して効率性を増大させる加工方法が開発されている。

0006

現在、生産されている濃縮大豆タンパク質(soy protein concentrates)、分離大豆タンパク質(isolated soy proteins)または加水分解大豆タンパク質(hydrolized soy protein )などのような大豆タンパク質加工品は、化学的処理または酵素的処理により生産されている。しかし、化学的処理方法は、生産単価が高く、製造過程中の熱処理、化学的処理、熱乾燥などにより、タンパク質の変性、水溶性アミノ酸の消失などが起き、実際のタンパク質の溶解度が低下するという問題点を有する。このため、化学的加工方法は、タンパク質の深刻な変性が起こらない程度で熱処理をするため、抗栄養因子のトリプシン阻害因子が大豆タンパク質内に相当量存在するようになる。

0007

このような化学的加工方法の問題点を解決する手段としてバチルス菌またはカビを利用した生物学的加工方法で発酵させた発酵大豆粕の製品が開発された(特許文献1、特許文献2、特許文献3)。前記発酵処理加工方法は、発酵過程中に多数の抗栄養因子を除去することができ、さらにタンパク質や炭水化物消化しやすい低分子の形に分解することができるため、消化吸収率に優れた高品質の飼料用タンパク素材を製造することができる。

0008

しかし、前記発酵処理加工方法は、一般的に、固体発酵を利用するが、固体発酵は好気的な状態と発酵の過程で生産される発酵熱を除去するために持続的に空気を吹き込まなければならない短所がある。また、前記発酵処理加工方法は、適正なレベル以上の抗栄養因子を除去するためには、48時間以上の長い発酵時間を必要とする。このような長い発酵時間は、製麹機の回転率を低下させ、全体的な原価の上昇をもたらす。

0009

そこで、本発明者らは、発酵処理大豆粕の製造時の発酵時間を最大限に短縮するために、発酵大豆粕の生産に必要な優れた特性を有するバチルスサブチリスTP6菌株(KFCC11343P、国際寄託番号KCCM11438P)を用いて固体発酵により発酵大豆粕を製造する方法を開発した(特許文献4)。前記方法は、抗栄養因子の除去活性及びタンパク質分解能力に優れたバチルスサブチリスTP6菌株を用いて、従来の発酵大豆粕に比べて短い発酵時間にもかかわらず同等以上の品質を有する発酵大豆粕を製造することができる。

0010

しかし、前記方法は、大豆粕の発酵時に大腸菌サルモネラ菌汚染される場合、このような病原菌に対するバチルスサブチリスTP6菌株の増殖抑制能が弱く、発酵過程中に、病原菌も共に増殖することになる問題点が発生し得る。

0011

そこで、本発明者らは、大豆粕の固体発酵に有用な改良された特性を有する発酵菌株選抜するために鋭意研究、努力した結果、抗栄養因子の除去、タンパク分解酵素活性及び病原菌に対する抗菌活性が優れながら、発酵過程中に粘液質生成能の低下したバチルス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)K2G菌株を開発した。また、本発明者らは、前記菌株を用いて大豆粕を固体発酵させると、従来に比べて短縮された発酵時間内に大豆タンパク質の加水分解による低分子化及び粗タンパク含量の増加、トリプシン阻害因子の不活性化非消化性多糖類のような抗栄養因子の含量の減少などにより、消化吸収率と飼料効率が増加した高品質の発酵大豆粕を製造することができることを確認することにより、本発明を完成した。

0012

韓国特許登録第10−0645284号公報
韓国特許登録第10−0459240号公報
韓国特許登録第10−0925173号公報
韓国特許公開第10−2011−0027535号公報

先行技術

0013

ハン・インギュ、植物性タンパク質飼料、飼料加工学、先進文化社、67-107、1998
Li et al. J. Anim. Sci,. 68: 1790, 1990
Goto et al.Biosci.Biotechnol.Biochem,. 56:1031-1035.、1992
Abulto et al. J. Appl. Poult. Res. 7:189-195, 1998b
Parsonset al. J Anim Sci., 69: 2918-24, 1991

発明が解決しようとする課題

0014

本発明の目的は、発酵大豆粕の生産能が向上した新規なバチルス・アミロリケファシエンス菌株を提供することにある。

0015

本発明の他の目的は、前記バチルス・アミロリケファシエンス菌株を用いて固体発酵により発酵大豆粕を製造する方法を提供することにある。

0016

本発明のもう一つの目的は、前記方法により製造された発酵大豆粕を提供することにある。

0017

本発明のもう一つの目的は、前記発酵大豆粕を含む飼料組成物を提供することにある。

課題を解決するための手段

0018

前記目的を達成するための一つの態様として、本発明は、固体発酵による発酵大豆粕の製造に有用である新規なバチルス・アミロリケファシエンスK2G菌株(KCCM11471P)を提供する。

0019

本発明によるバチルス・アミロリケファシエンスK2G菌株は、抗栄養因子除去活性、タンパク分解酵素活性及び病原菌に対する抗菌活性に優れ、粘液質生成能が低下し、固体発酵により高品質の発酵大豆粕を製造することができることを特徴とする。

0020

具体的には、本発明によるバチルス・アミロリケファシエンスK2G菌株は、活性が強力なタンパク分解酵素を生産して大豆粕の消化を阻害するトリプシン阻害因子(TI)のような多様な多糖類抗栄養因子を不活性化させるだけでなく、高分子である大豆タンパク質を大部分加水分解して低分子化することにより、発酵大豆粕の消化吸収率を大幅に増加させることができる。

0021

また、本発明によるバチルス・アミロリケファシエンスK2G菌株は、大豆粕の構成成分のうち、炭水化物を用いて活発生育しながら、菌体を構成するタンパク質に転換させるため、発酵大豆粕内の粗タンパク含量を相対的に増加させ、これは、高品質飼料の製造に重要な意味を有する。

0022

好ましい一実施例において、本発明は、固体発酵による発酵大豆粕の製造に有用に用いられる発酵菌株を選別するために、まず、多様な伝統的な発酵食品から14種のタンパク分解酵素生成能に優れた菌株を分離する(表1を参照)。

0023

前記のように分離された14種の菌株のうち、家畜に対して食中毒を起こす代表的な病原菌である大腸菌及びサルモネラ菌に対して最も優れた抗菌活性を示すCJ823菌株を選別する。

0024

選別されたCJ823菌株は、従来の固体発酵により発酵大豆粕を製造する方法において発酵菌株として用いられたバチルスサブチリスTP6菌株(KFCC11343P;非特許文献4)に比べて、大腸菌とサルモネラ菌に対して格段に優れた抗菌活性を示す(表2を参照)。

0025

また、CJ823菌株は、実際の発酵過程中においてもサルモネラ菌の生育を効果的に抑制し、高品質の発酵大豆粕の製造に適していることが確認される(表3を参照)。

0026

このようにCJ823菌株は、タンパク分解酵素を高濃度で生産し、病原菌に対して優れた抗菌活性を示すが、発酵過程中に生産される酵素により原料大豆糖質、タンパク質に由来するレバン型のフルクタン(levan form fructan)とポリグルタミン酸(polyglutamate)の重合により粘着性粘液質が生成される。このような粘液質の生成は、発酵大豆粕の大規模な生産時において発酵工程の制御、発酵物移送などに問題をもたらし得る。

0027

そこで、本発明者らは、CJ823菌株の酵素的/生理的特性はそのまま維持しながら粘液質の生成能の低下した変異株を開発するために、CJ823菌株にUVを照射して突然変異を誘発する(図3を参照)。

0028

まず、254nmのUVをCJ823菌株に照射した後、脱脂乳含有選別培地からコロニー形態及び粘液質の形成によるクリアーゾーン(clear zone)の形成可否に応じて16種の変異株を選別する。選別された16種の変異株を固体培養した後、タンパク分解酵素活性とγ-PGA(Poly-γ-Glutamic Acid)の含量を分析し、タンパク分解酵素活性は最も高く、比較的に低いγ-PGAAの含量を示すU304変異株を最終的に選別する(表4を参照)。

0029

最終的に選別されたU304変異株の同定のために一次的に糖利用性を分析した結果、U304変異株は、生化学的な特性上、バチルスサブチリス及びバチルス・アミロリケファシエンスと98%の類似率を示すことが確認される(表5を参照)。

0030

また、16SrRNA塩基配列分析の結果、U304変異株は、配列番号:1の16S rRNA塩基配列を有する。前記配列を根拠に公知菌株との配列相同性の比較及び系統分類学的な類縁関係を分析した結果、U304変異株は、バチルス・アミロリケファシエンスと99.92%の類似性を示し、系統樹で最も類縁関係が高いことが判明される(図5を参照)。

0031

これに対し、前記生化学的特性、配列相同性及び系統分類学的な類縁関係の分析結果を総合して、本発明によるU304変異株をバチルス・アミロリケファシエンスK2Gと命名した。

0032

本発明によるバチルス・アミロリケファシエンスK2G菌株は、タンパク分解酵素を高濃度で生産し、大腸菌またはサルモネラ菌のような病原菌に対して優れた抗菌活性を示す親菌株の特性はそのまま維持し、かつ、ポリ−γ−グルタミン酸のような高分子物質の生成が著しく低下し、粘液質生成能の低下した改良菌株であり、固体発酵による発酵大豆粕の製造に非常に有用に用いられる。

0033

このような有用性を確認するために、本発明によるバチルス・アミロリケファシエンスK2G菌株の固体発酵による粗タンパク含量の変化を調べた結果、24時間発酵すると、本発明によるバチルス・アミロリケファシエンスK2G菌株により発酵した大豆粕は、従来、大豆粕発酵菌株として知られているバチルスサブチリスTP6菌株により発酵された大豆粕と同等レベル以上の粗タンパク含量を示すことを確認する(表6を参照)。

0034

また、本発明によるバチルス・アミロリケファシエンスK2G菌株の発酵による大豆粕内のトリプシン阻害因子(TI)の含量の変化を調べた結果、本発明によるバチルス・アミロリケファシエンスK2G菌株により16時間発酵された大豆粕のTIの含量は、バチルスサブチリスTP6菌株により24時間発酵された大豆粕のTIの含量に相当することが示され、16時間の発酵だけで同等なレベルの抗栄養因子の低減効果が達成されることが確認される(表7を参照)。

0035

前記結果は、固体発酵による発酵大豆粕の製造時、本発明によるバチルス・アミロリケファシエンスK2G菌株が、高品質のタンパク質飼料として粗タンパクの含量は高く、抗栄養因子の含量は低い発酵大豆粕を、従来に比べて短縮された発酵時間で製造することができることを意味する。このような発酵時間の短縮は、製麹機の回転率を高め、これは年間の生産可能な配置数の増加につながり消費者に、より安価で高品質の発酵大豆粕を供給することができるという点で、本発明の優位性を確認することができる。

0036

そこで、本発明者らは、抗栄養因子除去活性、タンパク分解酵素活性及び病原菌に対する抗菌活性に優れ、粘液質生成能が低下し、固体発酵による高品質の発酵大豆粕の製造に有用に用いられるバチルス・アミロリケファシエンスK2G菌株をブダペスト条約の下、2013年11月7日付で韓国微生物保存センター(Korean Culture Center of Microorganisms、KCCM)に寄託し、寄託番号KCCM11471Pが与えられた。

0037

発明の別の態様において、本発明は、バチルス・アミロリケファシエンスK2G菌株を用いて固体発酵により発酵大豆粕を製造する方法を提供する。

0038

具体的には、本発明による製造方法は、
a)大豆粕に水分を添加して熱処理する段階
b)前記熱処理された大豆粕を冷却した後、バチルス・アミロリケファシエンスK2G菌株を接種する段階; 及び
c)前記大豆粕に接種されたバチルス・アミロリケファシエンスK2G菌株を固体培養して発酵大豆粕を得る段階を含むことを特徴とする。

0039

段階a)は、原料である大豆粕に水分を添加して熱処理を行う段階であり、原料大豆粕は、固体発酵する前に、適量の水を直接噴霧混合して水分含量を調節した後、一定の時間で熱処理することが望ましい。

0040

発明の好ましい実施例によると、前記段階a)おける水分は、大豆粕の水分含量が30〜80%(v/w)、好ましくは30〜70%(v/w)、さらに好ましくは40〜60%(v/w)となるように添加することが望ましい。前記水分含量の範囲の大豆粕は、低水分による発酵速度遅延を防止し、大豆粕の移送及び発酵後の乾燥工程に多くの費用が要されるという問題点を改善するだけでなく、熱効率の面で好ましい。

0041

次いで、水分が添加された大豆粕を熱処理するが、熱処理の目的は、原料大豆粕中の雑菌死滅させると共に大豆細胞壁を破壊し、タンパク質を変性させることにより、目的とする微生物が活発に生育できる環境を提供するためのことにある。熱処理は、当業界において公知となった多様な方法を利用することができるが、好ましくは、スチーム(steam)または過熱水蒸気(superheated steam)を用いて行われる。

0042

発明の好ましい実施例によると、段階a)の熱処理は、70〜130℃のスチームで10〜60分間蒸煮したり、200〜300℃の過熱水蒸気で数秒〜数分の短時間で熱処理する。より好ましくは、70〜130℃のスチームで10〜30分間蒸煮し、最も好ましくは80〜121.1℃のスチームで10〜30分間蒸煮する。

0043

熱処理温度が低かったり、処理時間が短い場合には、雑菌の殺菌効果が低下し、その後の発酵工程が円滑に進まないという問題点があり、熱処理温度が高かったり、処理時間が長くなる場合には、大豆粕内のタンパク質の変性による消化率が減少し、最終製品品質低下問題が発生する。したがって、このような問題点が発生しないように熱処理温度または処理時間を前記範囲内で採用することが望ましい。

0044

このような熱処理過程を通じて大豆粕に存在する汚染菌がほとんど死滅し、その後の工程である固体発酵が円滑に進められる化学的環境になる効果だけでなく、消化率を阻害するトリプシン阻害因子(TI)のような抗栄養因子がわずかに減少する効果も期待し得る。

0045

段階b)は、前記のように熱処理した大豆粕を固体発酵が可能な温度に冷却した後、バチルス・アミロリケファシエンスK2G菌株を接種する段階である。本発明において、大豆粕は熱処理が終結した後、自然冷却させるが、冷却速度を高めて過熱を防止し、均一に冷却するためにコンベヤー(conveyor)式の放冷気を利用した移送過程を経れば、簡単に行うことができる。

0046

発明の好ましい実施例によると、段階b)において大豆粕は、30〜50℃に、より好ましくは35〜45℃に、最も好ましくは37℃に冷却される。

0047

熱処理した大豆粕を冷却した後、製造した大豆粕の培地に本発明によるバチルス・アミロリケファシエンスK2G菌株を培養した前培養液をそのまま、または適切に殺菌水希釈し、できるだけ均一に接種することが望ましい。

0048

熱処理した大豆粕に接種する発酵菌株の量は、大豆粕の固体発酵を左右する重要な要因になる。熱処理した大豆粕への発酵菌株の接種量は、接種直後の菌数が105〜109 CFU/gになるようにすることが望ましい。

0049

接種量が105 CFU/g未満の場合には、種菌発酵液の所要量が少ない反面、大豆粕を発酵させるのに多くの時間が要され、製品の生産に要求される発酵時間が長くなり、雑菌汚染の可能性が高いという短所がある。一方、接種量が109 CFU/gを超える場合には、発酵時間は大幅に短縮することができるが、接種用種菌の生産が負担になるという短所がある。特に、用いる発酵菌株の生育特性発酵装置の種類に応じて、発酵成績が大きく左右されるため、生産段階で菌株の特性を考慮し、接種量を適切に選定することが望ましい。

0050

段階c)は、大豆粕に接種されたバチルス・アミロリケファシエンスK2G菌株を固体発酵させて発酵大豆粕を得る段階であり、例えば、充填層発酵器(packed-bed fermentor)を用いて発酵させる。

0051

充填層発酵器には、回分式通気培養装置密閉式培養装置連続式通気培養装置など多様な形式があり、大豆粕の固体発酵に有用なものであれば、その形式に制限なく本発明の方法に用いられ、生産規模に応じて適切な装置を選択して使用することが望ましい。

0052

発明の好ましい実施例によると、充填層発酵器にバチルス・アミロリケファシエンスK2G菌株を接種した大豆粕を5〜50cmの厚さで載置し、20〜50℃で12〜72時間発酵させる。この時、大豆粕の充填層の厚さは、厚いほど好ましく、30〜45℃で12〜48時間発酵させることが好ましい。最も好ましくは、37℃で24時間発酵させることである。

0053

本発明の方法は、前記の段階c)の後に得られた発酵大豆粕を低温低湿乾燥及び粉砕する段階をさらに含むことができる。

0054

発酵過程において大豆粕中の水分は、一部蒸発するが、発酵終了直後には、残存水分含量が20〜50%(v/w)とかなり高い。しかし、発酵大豆粕製品の最終的な水分含量は、10〜12%(v/w)が望ましいため、乾燥工程が必要である。

0055

また、本発明によるバチルス・アミロリケファシエンスK2G菌株を用いた固体発酵時に発酵大豆粕の状態が非常に良好であるが、部分的に若干弱く凝った塊を形成するため、乾燥した後、発酵大豆粕の粒子サイズが均一に粉砕する必要がある。

0056

乾燥及び粉砕は、当業界において公知となった多様な方法で行うことができるが、過度高温で乾燥した場合には、発酵大豆粕中の生菌の大部分が死滅するため、注意しなければならない。好ましくは、生菌が死滅しない低温で乾燥しなければならず、低温低湿度熱風で乾燥することが最も好ましい。粉砕過程は、発酵大豆粕を利用しようとする目的に応じて多様な大きさに粉砕してもよく、粉砕方法として好ましくは、ハンマーミル(hammer mill)を利用してもよい。

0057

前述した本発明の方法によりアミロリケファシエンスK2G菌株を用いて、大豆粕を固体発酵することにより、大豆粕に含有されたTIをはじめとして、各種抗栄養因子が減少し、タンパク質の加水分解及び低分子化により消化吸収率が向上し、粗タンパク含量が増加した発酵大豆粕が得られ、これは、飼料としての絶対的な価値が改善されたものとして、動物性タンパク質を代替し得る高品質のタンパク質飼料材料として利用価値が非常に高い。

0058

よって、発明の別の態様では、前記方法により製造された発酵大豆粕を含む飼料組成物を提供する。

0059

本発明による飼料組成物内の発酵大豆粕の含量は、適用される家畜の種類及び年齢適用形態、目的とする効果などに応じて適宜に調節可能であり、例えば、1〜99重量%、好ましくは10〜90重量%、さらに好ましくは20〜80重量%で用いることができるが、これらに限定されるものではない。

0060

本発明の飼料組成物は、投与のために発酵大豆粕以外に、さらにクエン酸フマル酸アジピン酸乳酸などの有機酸リン酸カリウムリン酸ナトリウム重合リン酸塩などのリン酸塩ポリフェノールカテチン、トコフェロールビタミンC緑茶抽出物キトサンタンニン酸などの天然抗酸化剤のうち1種以上を混合して用いることができ、必要に応じて抗インフルエンザ剤緩衝液静菌剤など、他の通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤分散剤界面活性剤結合剤または潤滑剤を付加的に添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などのような注射用剤形カプセル顆粒または錠剤に製剤化することができる。

0061

また、本発明の飼料組成物は、補助成分としてアミノ酸無機塩類ビタミン抗酸化剤抗真菌剤抗菌剤などのような各種補助剤及び粉砕または破砕された小麦大麦トウモロコシなどの植物性タンパク質飼料、血粉肉粉分などの動物性タンパク質飼料、動物性脂肪及び植物性脂肪のような主成分以外にも、栄養補充剤成長促進剤、消化吸収促進剤、疾病予防剤と共に用いられる。

0062

本発明の飼料組成物を飼料添加物として用いる場合、前記飼料組成物をそのまま添加したり、他の成分と共に用いることができ、常法に従って適切に用いられる。飼料組成物の投与形態は、非毒性製薬上許容可能な担体と組み合わせて、即時放出または徐放性剤形に製造することができる。このような食用担体は、トウモロコシの澱粉ラクトーススクロースプロピレングリコールであってもよい。高体型担体の場合には、錠剤、散剤トローチ剤などの投与形態であってもよく、液状担体の場合には、シロップ剤液体懸濁液剤エマルジョン剤溶液剤などの投与形態であってもよい。また、投与剤は、保存剤、潤滑剤、溶液促進剤、安定化剤を含有することができ、他の炎症性疾患改善剤及びウイルス予防上、有用な物質を含有することもできる。

0063

本発明の飼料組成物は、哺乳類家禽類魚類及び甲殻類を含む多数の動物食餌、すなわち、飼料に適用することができる。商業的に重要な、牛、ヤギなどの哺乳類、象、ラクダなどの動物園の動物、などの家畜に用いられる。商業的に重要な家禽類には、ニワトリ、アヒルガチョウなどが含まれ、マスエビのような商業的に飼育される魚類及び甲殻類を含むことができる。

0064

本発明による飼料組成物は、家畜飼料乾燥重量基準で1kg当たり約10〜500g、好ましくは10〜100gの量で混合することができ、完全に混合した後、マッシュで供給したり、追加の加工工程を通じてペレット化膨張化、押出工程を経ることが望ましい。

発明の効果

0065

本発明によるバチルス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)K2G菌株(KCCM11471P)は、抗栄養因子除去活性、タンパク分解酵素活性及び病原菌に対する抗菌活性に優れ、発酵過程中に低減した粘液質生成能を示すため、これを種菌として用いて大豆粕を固体発酵させると、大豆タンパク質の加水分解による低分子化及び粗タンパク含量の増加、トリプシン阻害因子の不活性化、非消化性多糖類のような抗栄養因子の含量の減少などにより、消化吸収率と飼料効率が増加した高品質の発酵大豆粕を製造することができる。

図面の簡単な説明

0066

本発明により、タンパク分解酵素の高生産菌株を選別するための実施例1の結果を示したものである。
実施例1で選別されたタンパク分解酵素の高生産菌株の大腸菌とサルモネラ菌に対する生育阻害活性測定した結果である。
本発明によるタンパク分解酵素の高生産菌株を対象に粘液質生成能が低下した変異株を選別する過程を示したものである。
本発明による変異株選別の過程でγ−PGAの含量の定性分析のために濃度勾配SDS−PAGEを行った結果である。レーンM:分子量マーカーレーン1:1g/Lγ−PGAの標準物質レーン2:0.5g/Lγ−PGAの標準物質 レーン3:0.25g/Lγ−PGAの標準物質 レーン4:CJ823菌株 レーン5:U304変異株 レーン6:U305変異株 レーン7:U306変異株 レーン8:U307変異株
前記過程により選別された変異株バチルス・アミロリケファシエンスK2Gの系統分類学的な類縁関係を示す系統樹(phylogenic tree)である。
本発明によるバチルス・アミロリケファシエンスK2Gを用いた固体発酵により得られた発酵大豆粕の加水分解化の程度をSDS−PAGEで確認した結果である。レーンM:分子量マーカーレーン1:原料(生大豆粕)レーン2:TP6発酵20時間レーン3:K2G発酵16時間 レーン4:K2G発酵20時間

0067

以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する。これらの実施例は、単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の要旨により、本発明の範囲がこれらの実施例により制限されないということは、本発明が属する技術分野において通常の知識を有する者に自明であろう。

0068

実施例1:タンパク分解酵素の高生産菌株の選別
本発明者らは、タンパク分解酵素の生成能に優れた菌株を分離するために、多様な伝統的な発酵食品(キムチ味噌類、伝統的な地酒、塩辛など)から約3000種の微生物を分離し、これらのうち同定を通じて確認された約1308種の飼料適合性短尾飼料協会、プロバイオティクス)バチルス菌を中心にタンパク分解酵素の発現が高く、抗菌活性を有し、生育速度が速い多機能菌株を見出そうとした。

0069

具体的には、タンパク分解酵素の高生産菌株の選別は、2%(w/v)の脱脂乳(Difco、USA)が含有されたYM寒天培地(yeast extract 3.0g、malt extract 3.0g、peptone 10.0g、agar 20.0g)で基質が分解されて生じるクリアーゾーンの大きさを比較して選別した(図1)。

0070

これから、選別されたタンパク分解酵素の高生産菌株をそれぞれTSB培地(enzymatic digest of casein 17.0g、enzymatic digest of soybean meal 3.0g NaCl 5.0g、dipotassium phosphate 2.5g、dextrose 2.5g、final pH 7.3±0.2 at 25℃)に接種した後、37℃、200rpmの条件で12時間培養し、培養液を脱脂乳含有YM寒天培地に1.0μlずつ点滴(spotting)した。前記寒天培地を37℃で16時間培養した後、培地上に形成されたクリアーゾーンの直径を測定した。

0071

この時、従来の固体発酵により発酵大豆粕を製造する方法で発酵菌株として用いられたバチルスサブチリスTP6(KFCC11343P)を対照群として用いた(特許文献4)。

0072

0073

前記表1に示されるように、14種の菌株をタンパク分解酵素の高生産菌株で選別したが、これらは、全てバチルスサブチリスTP6に比べて、より高いタンパク分解酵素活性を示すことが確認された。

0074

実施例2:病原菌の増殖抑制能を有する菌株の分離
家畜に対して食中毒を起こす代表的な病原菌である大腸菌及びサルモネラ菌の生育や増殖を抑制することができる菌株を分離し、発酵大豆粕の生産に適用してサルモネラ菌がない無毒性製品を開発するために、前記実施例1で分離した14種のタンパク分解酵素の高生産菌株を対象に、病原菌に対する抗菌活性を測定した。

0075

病原菌に対する抗菌活性は、サルモネラティフィムリウム(Salmonella typhymuriumATCC14028)と大腸菌(E. coli KCCM11835)を対象に、spot−on−the−lawn test方法を用いて測定した。

0076

具体的には、14種のタンパク分解酵素の高生産菌株のそれぞれをGYP培地(glucose 10.0g、yeast extract 8.0g、 polypeptone 2.0g、pH 7.0)に接種し、37℃で180 rpmで12時間液体培養した。前記タンパク分解酵素の高生産菌株の培養液1.5μlをサルモネラ・ティフィムリウムATCC14028と大腸菌ATCC11835のそれぞれが1×105 CFU/mlの個数で添加されたGYP寒天培地(glucose 10.0g、yeast extract 8.0g、polypeptone 2.0g、agar 15.0g、pH 7.0)に点滴した後、37℃で15時間、静置培養した。培地上に点滴したタンパク分解酵素の高生産菌株のコロニーの周囲に形成される生育阻害ゾーン(inhibition zone)のサイズを観察して活性力価を測定し、その結果を下記表2に示した。この時、バチルスサブチリスTP6を対照群として用いた。

0077

0078

前記表2において、「−」または「+」は、生菌阻害ゾーン直径サイズを基準に、活性力価を決定したものであり、「−」は、抗菌または抗菌活性がないことを、「+」は、 阻害ゾーンの直径サイズが10.05mm以下であることを、「++」は、 阻害ゾーンの直径サイズが10.05〜14.05mmであることを、「+++」は、 阻害ゾーンの直径サイズが14.05〜17.05mmであることを、「++++」は、 阻害ゾーンの直径サイズが17.05mm以上であることを意味する。

0079

家畜において最も頻繁に発生する消化器性疾病の原因菌であるサルモネラ菌と大腸菌を対象にして選別された14種のタンパク分解酵素の高生産菌株の抗菌スペクトルを調べた結果、CJ823が最も優れた抗菌力を示すことが確認された。選別されたCJ823は、対照群であるバチルスサブチリスTP6に比べて大腸菌(++++ vs. +)とサルモネラ菌(++++ vs. ++)の両方に対して非常に高い抗菌活性を示した。

0080

実施例3:サルモネラ増殖抑制大豆粕適用の実験
前記実施例2の結果によると、寒天培地上でCJ823はサルモネラ菌に対して優れた抗菌活性を示した。しかし、実際の大豆粕発酵過程の中でもサルモネラ菌に対する増殖抑制力を表すかどうかを確認するために下記実験を行った。

0081

具体的には、CJ823とサルモネラ・ティフィムリウムATCC14028を、100℃で30分間蒸煮した大豆粕(水分45%)に、それぞれ4.5×107 CFU/gと1.0×103 CFU/gの濃度混合接種し、37℃で24時間恒湿が維持される条件で菌数の変化を観察した。この時、大豆粕にサルモネラ・ティフィムリウムを単独接種したものを対照群として、サルモネラ・ティフィムリウムとバチルスサブチリスTP6を混合接種したものを比較群として使用した。

0082

菌株を接種してから発酵の開始前と、12、16及び20時間の発酵経過後に一定量の大豆粕をとり、0.8%のNaCl滅菌溶液で希釈した後、XLD寒天培地(yeast extract 3g、lactose 7.5 g、sucrose 7.5 g、xylose 3.5 g、L-lysine 5 g、ferric ammonium citrate 0.8 g、Phenol Red 0.08 g NaCl 5 g、sodium deoxycholate 2.5 g、sodium thiosulfate 6.8 g、agar 13.5 g、final pH:7.4±0.2 at 25℃)に100μlを塗布してサルモネラ・ティフィムリウムのコロニーの数を測定し、その結果を下記表3に示した。

0083

両菌株間の比率値は、主発酵菌株であるCJ823が蒸煮した大豆粕で増殖する間に、サルモネラ・ティフィムリウムが汚染されるという仮定の下で測定したものであり、実際の汚染率は、発酵大豆粕の製造環境により変わり得る。

0084

0085

前記表3に示されるように、サルモネラ・ティフィムリウム単独で接種した対照群は、培養時間が増加するにつれて菌数が着実に増加して、発酵20時間経過後には3.1×107 CFU/gまで増加したのに対して、バチルスサブチリスTP6と混合接種した比較群では、サルモネラ・ティフィムリウムの菌数が2.2×104 CFU/gレベルに抑制され、本発明によるCJ823と混合接種した実験群では、サルモネラ・ティフィムリウムの菌数がこれより減少して3.5× 102 CFU/gレベルであった。

0086

前記結果から、本発明によるCJ823が、実際の発酵過程中でもサルモネラ菌の生育を効果的に抑制し、高品質の発酵大豆粕の製造に適していることが分かる。

0087

実施例4:変異株の選抜
前記実施例1〜3で選別されたCJ823は、タンパク分解酵素を高濃度で生産し、病原菌に対して優れた抗菌活性を示すが、発酵過程中に生産される酵素により原料大豆の糖質、大豆タンパク由来のレバン型のフルクタン(levan form fructan)とポリグルタミン酸(polyglutamate)の重合により粘着性粘液質が生成された。大規模な工業化の過程で、このような粘液質の過量生成は、撹拌を困難にして発酵物内の溶存酸素、温度などを制御するのに問題となり、移送を困難にするなどの問題が発生した。

0088

そこで、本発明者らは、CJ823の酵素的/生理的特性はそのまま維持するか、または向上しながら粘液質の生成能の低下した変異株を開発するために、以下のようにCJ823にUVを照射して突然変異を誘発した。変異株の選別過程は、図3に示した通りである。

0089

まず、CJ823をTSB寒天培地(ezymatic digest of casein 17.0g、 enzymatic digest of soybean meal 3.0g、NaCl 5.0g、dipotassium phosphate 2.5 g、dextrose 2.5 g、final pH: 7.3±0.2 at 25℃)に塗抹して37℃で12時間培養して菌株を活性化した。

0090

本培養は、予め準備したTSB培地(ezymatic digest of casein 17.0g、enzymatic digest of soybean meal 3.0g、NaCl 5.0g、dipotassium phosphate 2.5 g、dextrose 2.5 g、final pH:7.3±0.2 at 25℃)に種菌懸濁液を1%接種した後、37℃、180rpmで振とう培養した。培養後、培養液を25℃、8000rpmの条件で10分間遠心分離して菌体と上清液を分離した後、菌体のみを取り、0.8%のNaCl殺菌溶液洗浄した。洗浄後、回収された菌体をUVランプ(VIBERLOURMAT、115 V、60 Hzの)を用いて、254nmの波長紫外線を照射して人工突然変異させた。

0091

選別培地である2%の脱脂乳含有TSA寒天培地(enzymatic digest of casein 15 g、enzymatic digest of soybean meal 5 g、NaCl 5 g、agar 15 g、final pH 7.3±0.2 at 25℃)に塗抹して37℃で20時間培養した。培養後、形成されたクリアーゾーンの大きさ(直径、mm)をキャリパー(Caliper、CD-20CPX、Mitutoyo、Kanagawa、Japan)で測定し、タンパク質分解活性の高い16種の変異株を1次選抜した。

0092

次に、選抜された16種の変異株を、それぞれ熱処理された大豆粕に接種し、20時間培養し、これから得られた培養液を、25℃で8000rpmの条件で10分間遠心分離して菌体と上清液を分離した。分離された上清液のγ−PGAの含量は、非特許文献3()に開示された方法に従って分離及び精製して凍結乾燥した後、回収されたγ−PGAの重量を測定した。

0093

タンパク分解酵素活性は、前記実施例1に記載された方法により測定し、γ−PGAの含量は、下記2種類の定性及び定量分析法を用いて測定した。

0094

まず、γ−PGA活性の定性分析のために、前記で分離された上清液40μlを5×染色緩衝液10μlと混合した後、5〜20%の濃度勾配SDS−ポリアミドゲルローディングして濃度勾配SDS−PAGEを行った。電気泳動後、クマシー染色試薬標準タンパク質を染色した後、脱色し、再度メチレンブルー(methylene blue)でポリ-γ-グルタミン酸を染色して定性評価した。

0095

その結果、図4に示されるように、レーン4のCJ823(親菌株)の上清液では、高分子のポリ−γ−グルタミン酸が検出されたが、レーン5のU304変異株の上清液では、高分子物質の生成能が非常に低下された一方、高いタンパク分解酵素活性を示すことを確認した。

0096

一方、γ−PGAの含量の定量分析は、固体発酵の上澄液同量蒸留水で希釈した後、20,000×gで20分間遠心分離して得られた上澄液に6 MのHClでpH3.0に調節した後、4℃で一日静置した。その後、25,000×gで30分間再び遠心分離した後、沈殿体を回収した。沈殿体を100〜200倍の蒸留水に完全に溶解させた後、25,000×gで30分間遠心分離して不純物を除去し、4℃で一日透析(dialysis)して塩を除去した。これを凍結乾燥してγ−PGAを回収し、これから得られた結果を下記表4に示した。

0097

0098

表4に示されるように、変異株の大部分は、CJ823に比べて低いγ−PGAの含量を示し、これらのうち、タンパク分解酵素活性は最も高く、かつ相対的に低いγ−PGAの含量を示すU304変異株を最終選抜した。特に、U304変異株は、対照群であるバチルスサブチリスTP6より低いγ−PGAの含量を示しながら、それより3倍以上高いタンパク分解酵素活性を示した。

0099

最終選抜されたU304変異株は、タンパク分解酵素を高濃度で生産して病原菌に対して優れた抗菌活性を示す親菌株の特性はそのまま維持しながら、ポリ−γ−グルタミン酸のような高分子物質の生成は顕著に低下し、低いγ−PGAの含量を示し、粘液質生成能の低下したことを特徴とする。

0100

実施例5:U304変異株(K2G)の16SrRNA遺伝子塩基配列決定及び系統樹解析
粘液質生成能の低下したU304変異株の同定のために、新たなNA寒天培地に菌を接種し、37℃で16時間培養した。形成されたコロニーは、0.8%のNaCl滅菌溶液で希釈した後、63種の乾燥培地及び生化学反応物で構成されたBCL ID card(bioMNitek Inc.、Hazewood、USA)に注入し、その結果は15分間隔でVITEK 2 Compact software(bioMVitek)に統合的に保存、分析され、14時間後に同定が完了した。

0101

16SrRNA遺伝子の塩基配列による菌同定のために、汎用プライマー(universal primer)として配列番号2及び3の518F(5’- CCAGCAGCCGCGGTAATACG-3’)と800R(5'-TACCAGGGTATCTAATCC-3')を利用するが、16S rRNA遺伝子をPCR増幅したお後、同定に重要な50〜900bp塩基配列を含む1,333bpを BigDye Terminator v3.1+BigDye Terminator Sequence Kid(Applied Biosystems Inc./USA)を用いて解読した。16SrRNA塩基配列分析の結果、U304変異株は、配列番号:1の16S rRNA塩基配列を有する。

0102

遺伝子塩基配列との類似性は、ブラスト類似性調査プログラム(Blast similarity search program:National Institute of Biotechnology Information)と、多重配列整列を行った後、系統樹における位置を判別した(図5)。

0103

0104

63種類の生化学的検査の結果をバイテックコンパクトソフトウェア(Vitec 2 Compact Software)で分析した結果、98%の確率でバチルスサブチリス/バチルス・アミロリケファシエンス(Bacillus subtilis/amyloliquefacien)に分類された。また、図5に示されるように、系統図の解析の結果、U304変異株は、標準菌株であるバチルス・アミロリケファシエンス亜種プランタルム(Bacillus amyloliquefacienssubsp.plantarum)FZB42T(CP000560)と最も近い近縁関係を示し、16S rDNA遺伝子配列相同性が99.92%(1332 bp/1333 bp)で確認された。

0105

これに対し、前記生化学特性と系統分類学的類縁関係の分析結果を総合し、本発明によるU304変異株をバチルス・アミロリケファシエンスK2Gと命名し、ブダペスト条約下で2013年11月7日付で韓国微生物保存センター(Korean Culture of Microorganisms、KCCM)に寄託番号KCCM11471Pとして寄託した。

0106

実施例6:バチルス・アミロリケファシエンスK2Gを利用した大豆粕発酵時の発酵時間に応じた粗タンパク含量の変化

0107

本発明によるバチルス・アミロリケファシエンスK2Gを利用した大豆粕発酵時の発酵時間に応じた粗タンパク含量の変化を調べるために、下記のような実験を行った。

0108

まず、大豆粕400gの水分含量を45%に合わせて100℃で30分間蒸煮し、40℃以下に冷却させた。次いで、前記バチルス・アミロリケファシエンスK2GをTSB寒天培地(ezymatic digest of casein 17.0g、enzymatic digest of soybean meal 3.0g、NaCl 5.0g、dipotassium phosphate 2.5 g、dextrose 2.5 g、agar 15.0g、final pH: 7.3±0.2 at 25℃)に塗抹し、37℃で12時間培養して菌株を活性化させた。活性化させた菌株を0.8%のNaCl滅菌溶液9mlに約2白金(A660nmで0.2程度に希釈する)を懸濁し、この懸濁液を種菌として使用した。本培養は、予め準備した40mlのTSB培地(ezymatic digest of casein 17.0g、enzymatic digest of soybean meal 3.0g、NaCl 5.0g、dipotassium phosphate 2.5 g、dextrose 2.5 g、final pH:7.3±0.2 at 25℃)に種菌懸濁液を1%で接種した後、37℃で180rpmで振とう培養した。

0109

準備したバチルス・アミロリケファシエンスK2Gの培養液40ml(5.0×107 cfu/ml)の水分含量を45%に合わせて蒸煮した大豆粕に入れてよく混合した後、37℃で20時間恒湿が維持される条件で静置培養した。前記培養試料を、60℃の乾燥機で水分含量が10%以下になるまで乾燥した後、ケルダール装置(Kjeldahl system、Kjltec 2100)を用いて、各試料の粗タンパク含量を測定した。この時、発酵開始前と、発酵12、16及び20時間経過後に粗タンパク含量を測定し、対照群としてバチルスサブチリスTP6を使用した。それから測定された粗タンパク含量(%、水分10%の補正)を下記表6に示した。この時、対照群としてバチルスサブチリスTP6を使用した。

0110

0111

表6に示されるように、24時間発酵を基準とした時、本発明によるバチルス・アミロリケファシエンスK2Gで発酵された大豆粕は、従来大豆粕発酵菌株として知られているバチルスサブチリスTP6で発酵された大豆粕と同等以上のレベルの粗タンパク含量を示した。

0112

前記結果から、本発明によるバチルス・アミロリケファシエンスK2Gは、高品質のタンパク質飼料として発酵大豆粕の製造に有用に用いられることを確認した。

0113

実施例7:バチルス・アミロリケファシエンスK2Gを利用した大豆粕発酵時の発酵時間によるTIの含量の変化

0114

本発明によるバチルス・アミロリケファシエンスK2Gを利用した大豆粕発酵時の発酵時間に応じたトリプシン阻害因子(TI)の含量の変化を測定するために、下記のような実験を行った。

0115

具体的には、前記実施例6と同様に、大豆粕400gを水45%に合わせて、100℃で30分間蒸煮し、蒸煮された大豆粕にバチルス・アミロリケファシエンスK2Gを4.5×107 cfu/mlの濃度で接種した後、37℃で24時間恒湿が維持される条件で培養した。発酵開始前と、発酵16、20、及び24時間経過後にTIの含量をAACC−71−10(American association of cereal chemists、1995)により測定し、それから測定されたTIの含量(mg/g)を下記表7に示した。この時、対照群としてバチルスサブチリスTP6を用いた。

0116

0117

表7に示されるように、発酵16時間経過後、本発明によるバチルス・アミロリケファシエンスK2Gで発酵された大豆粕はTI含量0.39mg/gを示したが、これは、従来大豆粕発酵菌株として知られているバチルスサブチリスTP6で24時間発酵された大豆粕のTI含量に相当するものであり、16時間の発酵のみで同等レベルの抗栄養因子の低減効果を示した。

0118

このような発酵時間の短縮は、製麹機の回転率を高め、これは年間生産可能な配置数の増加につながり、消費者に、より安価で高品質の発酵大豆粕を供給することができるという点で、本発明の優位性を確認することができる。

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実施例8:バチルス・アミロリケファシエンスK2Gを利用した大豆粕発酵時大豆タンパク質の加水分解化の程度及びKOHの溶解度の測定

0120

大豆粕は、タンパク質の含量が高い植物性飼料原料であるが、抗栄養因子及び消化吸収率が低いタンパク質の含有により、特に仔家畜の成長に不十分であるという欠点もある。このような欠点を改善する方法の一つが、微生物を利用した発酵を通じて加水分解されたペプチドの形で作成するか、または消化が容易に行われるように低分子量のタンパク質に分解することである。本発明によるバチルス・アミロリケファシエンスK2Gはタンパク分解酵素の高生産菌株であり、それを用いて製造された発酵大豆粕は、前記菌株から分泌されたタンパク分解酵素により大豆タンパク質が分解されると予想された。

0121

これを確認するために、まず、本発明による発酵大豆粕の加水分解の程度を測定した。前記実施例6と同様に大豆粕400gを水分45%に合わせて、100℃で30分間蒸煮し、蒸煮された大豆粕にバチルス・アミロリケファシエンスK2Gを4.5×107 cfu/mlの濃度で接種し、37℃で24時間恒湿が維持される条件で培養した。それから、得られた培養液を25℃で8000 rpmの条件で10分間遠心分離して菌体と上清液を分離した。分離された上清液40μlを5×染色緩衝液10μlと混合した後、SDS−PAGE(10%)を行い、分子量に応じたタンパク質の移動相を確認した。電気泳動後、ポリアミドゲルをクマシーブリリアン試薬(Coomassie Brilliant R250)で染色し、組成物質タンパク質組成と分子量を確認し、その結果を図6に示した。この時、対照群として生大豆粕とバチルスサブチリスTP6で製造された発酵大豆粕を用いた。

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図6に示されるように、本発明によるバチルス・アミロリケファシエンスK2Gで製造された発酵大豆粕は、生大豆粕または他の菌株で製造された発酵大豆粕と比較してサイズが小さい分子の方にタンパク質の密度が偏っていることを確認することができる。SDS−ポリアミドゲル上で、上のバンドが分子量の大きいタンパク質であり、下のバンドが分子量の小さいタンパク質を示す。前記結果から、同一の分子量である場合、本発明によるバチルス・アミロリケファシエンスK2Gを用いた発酵により大豆粕内の分子量の大きいタンパク質が分子量の小さいタンパク質に加水分解されたことを確認した。

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一方、従来のレポートによると、KOH(potassium hydroxide)溶解度が80%である大豆粕と、これより低い濃度(55%〜68%)の大豆粕を用いて、4回の肉鶏飼養試験を行った結果、KOH溶解度が低い大豆粕を給与した肉鶏の体重、飼料摂取量及び飼料効率がKOH溶解度が80%である大豆粕を給与した肉鶏に比べて有意に低かったり、低くなる傾向を示した(非特許文献4)。

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そこで、本発明による発酵大豆粕のKOH溶解度を文献(非特許文献5)に開示された方法に従って測定した。簡単に説明すると、前記のように準備された発酵大豆粕0.1gを0.2%のKOH溶液に添加し、20分間混合した後、ろ過してろ液に対する窒素含量をケルダール装置で測定して溶解度を換算し、その結果を表8に示した。

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実施例

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前記表8に示されるように、蒸煮された大豆粕では、KOHの溶解度が80%から70%まで低下する傾向を示したが、本発明によるバチルス・アミロリケファシエンスK2Gを用いた固体発酵が進むと共に、KOHの溶解度は再び85%まで上昇した。前記結果は、本発明によるバチルス・アミロリケファシエンスK2Gから分泌されたタンパク分解酵素により大豆タンパクが分解されながら、KOHが上昇したと判断される。

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本発明によるバチルス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)K2G菌株(KCCM11471P)は、抗栄養因子除去活性、タンパク分解酵素活性及び病原菌に対する抗菌活性に優れ、発酵過程中に低下した粘液質生成能を示すため、これを種菌として用いて大豆粕を固体発酵させると、大豆タンパク質の加水分解による低分子化及び粗タンパク含量の増加、トリプシン阻害因子の不活性化、非消化性多糖類のような抗栄養因子の含量の減少などにより、消化吸収率及び飼料効率が増加した高品質の発酵大豆粕を製造することができる。

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