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技術 平滑化変異体及びその使用方法

出願人 ジェネンテック,インコーポレイテッドキュリス,インコーポレイテッド
発明者 フレデリック・ジ・ド・サウヴァージロバート・エル・ヤウクジェリ・ジ・ペ・ディジクラーフヘイリー・シャープ
出願日 2015年2月4日 (5年9ヶ月経過) 出願番号 2016-549788
公開日 2017年3月2日 (3年8ヶ月経過) 公開番号 2017-506072
状態 特許登録済
技術分野 ペプチド又は蛋白質 生物学的材料の調査,分析 微生物、その培養処理 酵素、微生物を含む測定、試験 抗原、抗体含有医薬:生体内診断剤 突然変異または遺伝子工学
主要キーワード ドッキングステ 指示期間 取り込み頻度 シェル効果 結合ビス 内容物情報 カウント測定 デザインソフトウェア
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この項目の情報は公開日時点(2017年3月2日)のものです。
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課題・解決手段

分子標的療法による癌患者治療後のチロシンキナーゼにおける突然変異出現は、獲得した薬剤耐性の主要メカニズムを表す。ここでは、髄芽腫などにおいてヘッジホッグ(HH)経路阻害剤に対する耐性をもたらす、セルペンチン受容体における変異、すなわち平滑化SMO)を記載する。SMOの保存残基におけるアミノ酸置換は、Hhシグナル伝達を維持するが、Hh経路阻害剤がGDC−0449、SMOを結合しかつ該経路を抑制することをできなくする。いくつかの実施形態では、本発明は、新規変異型SMOタンパク質及び核酸並びにSMO変異を検出するためのスクリーニング方法並びに薬剤耐性を示す変異型SMOを特異的に調節する薬剤のスクリーニング方法を提供する。

概要

背景

発明の背景
分子標的癌治療薬が臨床において印象的な活性を示している。最も注目された例のいくつかとしては、フィラデルフィア染色体陽性慢性骨髄性白血病CML)又はKIT/PDGFR変異消化管間質腫瘍GIST)におけるチロシンキナーゼ阻害剤イマチニブ及びEGFR変異非小細胞肺癌(NSCLC)におけるエルロチニブが挙げられる(Krause,D.S.及びR.A.Van Etten(2005)N.Engl.J.Med.353(2):172−187)。これらの薬剤を用いた治療は、これらの分子異常を有する患者集団における劇的な抗腫瘍応答をもたらした。しかし、この印象的な初期床応答にもかかわらず、ほとんどの患者薬剤耐性の獲得のため最終的に進行する(Engelman,J.A.及びJ.Settleman(2008)Curr.Opin.Genet.Dev.18(1):73−79)。耐性メカニズムの同定は、結果として、より合理的な薬物の組み合わせ及び耐性の出現を潜在的に克服する又は避けることができる「第二世代阻害剤の開発の扉を開いた。

髄芽腫は、小児における最も一般的な脳の悪性腫瘍を示す小脳原始神経外胚葉腫瘍である(Polkinghorn,W.R.及びN.J.Tarbell(2007)Nat.Clin.Pract.Oncol.4(5):295−304)。髄芽腫の治療の一形態は、アジュバント放射線療法である。生存率の改善にもかかわらず、アジュバント放射線衰弱副作用に関連するため、新たな分子標的療法の必要性が支持される。

ヘッジホッグ(Hh)シグナル伝達経路は、髄芽腫の病因に直接関与する。抑制性受容体PTCH1における機能変異の根本的な欠失による場合が最も多い構成的Hhシグナルが孤発例の約30%で実証されている(Zurawel,R.H.外,(2000)Genes Chromosomes Cancer 27(1):44−51;Kool,M.外,(2008)PLoS ONE 3(8):e3088;Dellovade,T.外(2006)Annu.Rev.Neurosci.29:539;Rubin,L.L.及びF.J.de Sauvage(2006)Nat.Rev.Drug Discov.5:1026)。PTCH1に対するヘテロ接合マウス(PTCH1+/−)は髄芽腫を自発的に発症する場合があり、Hh経路阻害剤による治療により、腫瘍の除去及び生存期間延長が生じた(Goodrich,L.V.外(1997)Science 277(5329):1109−1113;Romer,J.T.外(2004)Cancer Cell6(3):229−240)。しかし、近年、新規Hh経路阻害剤GDC−0449により治療された患者は、最初に、治療に対して劇的な応答を示した(Charles M.Rudin外(2009)N.Engl.J.Med.(前出))が、治療に対する永久的な応答を獲得するのにはやはり失敗し、腫瘍の再発を示したことが観察されている。

BCCは、最も一般的なヒトの癌であり、主にHh経路の過剰活性化によって活動化する(Oro外,1997;Xie外,1998)。Hhシグナル伝達と癌との関連は、最初に、髄芽腫(MB)及びBCCに影響を非常に受けやすいゴーリン又は基底細胞母斑症候群(BCNS)の患者で発見された。これらの患者は、一般に、Hhリガンドに対する受容体をコードするPatched1(PTCH1)内にヘテロ生殖細胞変異を有する(Hahn外,1996;Johnson外,1996)。Hhリガンド結合は、蛇行膜貫通(TM)シグナル伝達物質平滑化SMO)のPTCH1抑制を緩和する。散発的性BCCの大半は、PTCH1の変異及びヘテロ接合性消失(LOH)を不活性化させることにより活動化し、残りの大部分は、SMOの変異の活性化を維持する(Reifenberger外,2005)。SMOは、融合サプレッサー(SUFU)及びプロテインキナーゼAPKA)の阻害によりGLI転写因子の活性化及び核局在化を促進する。SUFUは、細胞質においてGLI転写因子を結合させ隔離することによってHh経路を負に調節する(Stone外,1999)。また、SUFUの機能喪失変異ゴーリン症候群とも関連する(Pastorino外,2009;Smith外,2014;Taylor外,2002)。また、散発性BCCの約50%はTP53変異も有する(Jayaraman外,2014)。

数種のHh経路阻害剤(HPI)が近年BCC及びMBの両方について臨床試験中である(Amakye外,2013)。以前からGDC−0449として知られているビスモデギブは、転移性局所的に進行したBCCの治療について承認を受けたSMO阻害剤である(Sekulic外、2012)。ビスモデギブによる治療を受けたBCC患者の大半は、完全応答及び部分応答の両方を含めて臨床的利益を経験する(Sekulic外,2012)。

しかし、予備的な推定から、進行BCC患者の20%までが治療の1年以内にビスモデギブに対する耐性を生じることが示唆される(Chang及びOro,2012)。これまで、臨床でのビスモデギブに対する耐性獲得唯一の機能的に特徴づけられた機構は、転移性MB患者からのものである。SMO−D473H変異が再発転移性腫瘍からの生検で検出され、試験管内で薬物結合を阻害することが示された(Yauch外,009)。近年、他の4つの臨床SMO変異がビスモデギブ耐性BCCで報告されたが、機能的には検討されなかった(Brinkhuizen外,2014;Pricl外,2014)。SMO阻害剤に対するいくつかの耐性機構が、追加のSMO変異、GLI2などの下流Hh経路成分増幅及びホスファチジルイノシトール3−キナーゼ(PI3K)キナーゼ及び非定型プロテインキナーゼCι/λ(aPKC−ι/λ)などのバイパスシグナル伝達経路の活性化を含めた前臨床モデルから示されている(Atwood外,2013;Buonamici外,2010;Dijkgraaf外,2011)。しかし、どの機構が患者において耐性にするのか不明なままである。

概要

分子標的療法による癌患者の治療後のチロシンキナーゼにおける突然変異の出現は、獲得した薬剤耐性の主要メカニズムを表す。ここでは、髄芽腫などにおいてヘッジホッグ(HH)経路阻害剤に対する耐性をもたらす、セルペンチン受容体における変異、すなわち平滑化(SMO)を記載する。SMOの保存残基におけるアミノ酸置換は、Hhシグナル伝達を維持するが、Hh経路阻害剤がGDC−0449、SMOを結合しかつ該経路を抑制することをできなくする。いくつかの実施形態では、本発明は、新規変異型SMOタンパク質及び核酸並びにSMO変異を検出するためのスクリーニング方法並びに薬剤耐性を示す変異型SMOを特異的に調節する薬剤のスクリーニング方法を提供する。

目的

本発明は、変異型SMOタンパク質をコードする単離核酸分子であって、該アミノ酸配列野生型SMOアミノ酸配列の281位に対応するアミノ酸位置にトリプトファン以外のアミノ酸を含むものを提供する

効果

実績

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請求項1

列番号1に対して少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む変異型SMタンパク質をコードする単離核酸分子であって、該アミノ酸配列がアミノ酸281にトリプトファン以外のアミノ酸を含む単離核酸分子。

請求項2

前記変異型SMOタンパク質が配列番号2のアミノ酸配列を含み、該アミノ酸配列がアミノ酸281にシステイン(C)を含む、請求項1に記載の単離核酸分子。

請求項3

配列番号5の親核酸配列を含み、該配列が該アミノ酸281コード配列を異なるアミノ酸をコードするように変化させる変異を有する、請求項1に記載の単離核酸分子。

請求項4

アミノ酸281コード配列に変異を組み込む変異型SMOタンパク質又はそのフラグメントをコードする核酸に特異的にハイブリダイズすることのできる核酸プローブ

請求項5

前記プローブが前記変異型SMO又はそのフラグメントをコードする核酸に相補的である、請求項4に記載のプローブ。

請求項6

約10〜約50ヌクレオチド長を有する、請求項4に記載のプローブ。

請求項7

検出可能な標識をさらに含む請求項4に記載のプローブ。

請求項8

配列番号1に対して少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む変異型SMOタンパク質をコードする単離核酸分子であって、該アミノ酸配列がアミノ酸459にアラニン以外のアミノ酸を含む単離核酸分子。

請求項9

前記変異型SMOタンパク質が配列番号3のアミノ酸配列を含み、該アミノ酸配列がアミノ酸459にバリン(V)を含む、請求項8に記載の単離核酸分子。

請求項10

配列番号5の親核酸配列を含み、該配列がアミノ酸459コード配列を異なるアミノ酸をコードするように変化させる変異を含む、請求項8に記載の単離核酸分子。

請求項11

前記アミノ酸459コード配列に変異を組み込む変異型SMOタンパク質又はそのフラグメントをコードする核酸に特異的にハイブリダイズすることのできる核酸プローブ。

請求項12

前記プローブが前記変異型SMO又はそのフラグメントをコードする核酸に相補的である、請求項11に記載のプローブ。

請求項13

約10〜約50ヌクレオチド長を有する、請求項11に記載のプローブ。

請求項14

検出可能な標識をさらに含む請求項11に記載のプローブ。

請求項15

配列番号1に対して少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む変異型SMOタンパク質をコードする単離核酸分子であって、該アミノ酸配列がアミノ酸535にトリプトファン以外のアミノ酸を含む単離核酸分子。

請求項16

前記変異型SMOタンパク質が配列番号4のアミノ酸配列を含み、該アミノ酸配列がアミノ酸535にロイシン(L)を含む、請求項15に記載の単離核酸分子。

請求項17

配列番号5の親核酸配列を含み、該配列がアミノ酸535コード配列を異なるアミノ酸をコードするように変化させる変異を含む、請求項15に記載の単離核酸分子。

請求項18

アミノ酸535コード配列に変異を組み込む変異型SMOタンパク質又はそのフラグメントをコードする核酸に特異的にハイブリダイズすることのできる核酸プローブ。

請求項19

前記プローブが前記変異型SMO又はそのフラグメントをコードする核酸に相補的である、請求項18に記載のプローブ。

請求項20

約10〜約50ヌクレオチド長を有する、請求項18に記載のプローブ。

請求項21

検出可能な標識をさらに含む請求項18に記載のプローブ。

請求項22

配列番号1に対して少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む変異型SMOタンパク質をコードする単離核酸分子であって、該アミノ酸配列がアミノ酸408にイソロイシン(I)以外のアミノ酸を含む単離核酸分子。

請求項23

前記変異型SMOタンパク質が配列番号6のアミノ酸配列を含み、該アミノ酸配列がアミノ酸408にバリン(V)を含む、請求項22に記載の単離核酸分子。

請求項24

配列番号5の親核酸配列を含み、該配列がアミノ酸408コード配列を異なるアミノ酸をコードするように変化させる変異を含む、請求項22に記載の単離核酸分子。

請求項25

アミノ酸408コード配列に変異を組み込む変異型SMOタンパク質又はそのフラグメントをコードする核酸に特異的にハイブリダイズすることのできる核酸プローブ。

請求項26

前記プローブが前記変異型SMO又はそのフラグメントをコードする核酸に相補的である、請求項25に記載のプローブ。

請求項27

約10〜約50ヌクレオチド長を有する、請求項25に記載のプローブ。

請求項28

検出可能な標識をさらに含む請求項25に記載のプローブ。

請求項29

配列番号2に対して少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む単離変異型SMOタンパク質であって、該アミノ酸配列がアミノ酸281にトリプトファン以外のアミノ酸を含む単離変異型SMOタンパク質。

請求項30

配列番号2のアミノ酸配列を含み、該アミノ酸配列がアミノ酸281にトリプトファン以外のアミノ酸を含む、請求項29に記載の変異型SMOタンパク質。

請求項31

前記アミノ酸配列がアミノ酸281にシステイン(C)を含む、請求項29又は30に記載の単離変異型SMOタンパク質。

請求項32

配列番号3に対して少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む単離変異型SMOタンパク質であって、該アミノ酸配列がアミノ酸459にアラニン以外のアミノ酸を含む単離変異型SMOタンパク質。

請求項33

配列番号3のアミノ酸配列を含み、該アミノ酸配列がアミノ酸459にアラニン以外のアミノ酸を含む、請求項32に記載の変異型SMOタンパク質。

請求項34

前記アミノ酸配列がアミノ酸459にバリン(V)を含む、請求項32又は33に記載の単離変異型SMOタンパク質。

請求項35

配列番号4に対して少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む単離変異型SMOタンパク質であって、該アミノ酸配列がアミノ酸535にトリプトファン以外のアミノ酸を含む単離変異型SMOタンパク質。

請求項36

配列番号4のアミノ酸配列を含み、該アミノ酸配列がアミノ酸535にトリプトファン以外のアミノ酸を含む、請求項35に記載の前記変異型SMOタンパク質。

請求項37

前記アミノ酸配列がアミノ酸535にロイシン(L)を含む、請求項35又は36に記載の単離変異型SMOタンパク質。

請求項38

配列番号6に対して少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む単離変異型SMOタンパク質であって、該アミノ酸配列がアミノ酸408にイソロイシン(I)以外のアミノ酸を含む単離変異型SMOタンパク質。

請求項39

配列番号6のアミノ酸配列を含み、該アミノ酸配列がアミノ酸408にイソロイシン(I)以外のアミノ酸を含む、請求項38に記載の変異型SMOタンパク質。

請求項40

前記アミノ酸配列がアミノ酸408にバリン(V)を含む、請求項38又は39に記載の単離変異型SMOタンパク質。

請求項41

請求項29〜31のいずれかに記載の変異型SMOタンパク質に特異的に結合する単離抗体であって、該抗体がアミノ酸281にトリプトファンを有する野生型SMOには結合しない単離抗体。

請求項42

前記抗体がモノクローナル抗体キメラ抗体ヒト化抗体単鎖抗体又はその抗原結合フラグメントである、請求項41に記載の抗体。

請求項43

前記抗体が細胞毒性剤に結合されている、請求項41又は42に記載の抗体。

請求項44

前記抗体が検出可能な標識に結合されている、請求項41又は42に記載の抗体。

請求項45

前記抗体がSMO活性阻害する、請求項41〜44のいずれかに記載の抗体。

請求項46

請求項32〜34のいずれかに記載の単離変異型SMOタンパク質に特異的に結合する単離抗体であって、該抗体がアミノ酸459にアラニンを有する野生型SMOには結合しない単離抗体。

請求項47

前記抗体がモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体又はその抗原結合フラグメントである、請求項46に記載の抗体。

請求項48

前記抗体が細胞毒性剤に結合されている、請求項46又は47に記載の抗体。

請求項49

前記抗体が検出可能な標識に結合されている、請求項46又は47に記載の抗体。

請求項50

前記抗体がSMO活性を阻害する、請求項46〜49のいずれかに記載の抗体。

請求項51

請求項35〜37のいずれかに記載の変異型SMOタンパク質に特異的に結合する単離抗体であって、該抗体がアミノ酸535にトリプトファンを有する野生型SMOには結合しない単離抗体。

請求項52

前記抗体がモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体又はその抗原結合フラグメントである、請求項39に記載の抗体。

請求項53

前記抗体が細胞毒性剤に結合されている、請求項51又は52に記載の抗体。

請求項54

前記抗体が検出可能な標識に結合されている、請求項51又は52に記載の抗体。

請求項55

前記抗体がSMO活性を阻害する、請求項51〜54のいずれかに記載の抗体。

請求項56

請求項38〜40のいずれかに記載の変異型SMOタンパク質に特異的に結合する単離抗体であって、該抗体がアミノ酸408にイソロイシンを有する野生型SMOには結合しない単離抗体。

請求項57

前記抗体がモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体又はその抗原結合フラグメントである、請求項56に記載の抗体。

請求項58

前記抗体が細胞毒性剤に結合されている、請求項56又は57に記載の抗体。

請求項59

前記抗体が検出可能な標識に結合されている、請求項56又は57に記載の抗体。

請求項60

前記抗体がSMO活性を阻害する、請求項56又は57のいずれかに記載の抗体。

請求項61

サンプルにおいて変異型SMO遺伝子を検出する方法であって、該サンプルから、変異を含む疑いのあるSMO又はそのフラグメントの第1細胞外ループカルボキシ末端に相当する核酸を増幅し、及び該増幅された核酸の電気泳動移動度と対応する野生型SMO遺伝子又はそのフラグメントの電気泳動移動度とを比較することを含む方法。

請求項62

前記電気泳動移動度をポリアクリルアミドゲル上で決定する、請求項61に記載の方法。

請求項63

サンプルにおいて変異型SMO遺伝子を検出する方法であって、該サンプルから、変異を含む疑いのあるSMO又はそのフラグメントの第1膜貫通ドメインアミノ末端に相当する核酸を増幅し、及び該増幅された核酸の電気泳動移動度と対応する野生型SMO遺伝子又はそのフラグメントの電気泳動移動度とを比較することを含む方法。

請求項64

前記電気泳動移動度をポリアクリルアミドゲル上で決定する、請求項63に記載の方法。

請求項65

サンプルにおいて変異型SMO遺伝子を検出する方法であって、該サンプルから、変異を含む疑いのあるSMO又はそのフラグメントの第2膜貫通ドメインのカルボキシ末端に相当する核酸を増幅し、及び該増幅された核酸の電気泳動移動度と対応する野生型SMO遺伝子又はそのフラグメントの電気泳動移動度とを比較することを含む方法。

請求項66

前記電気泳動移動度をポリアクリルアミドゲル上で決定する、請求項65に記載の方法。

請求項67

サンプルにおける変異型SMO遺伝子を検出する方法であって、該サンプルから、変異を含む疑いのあるSMO又はそのフラグメントの第5細胞外ループのアミノ末端に相当する核酸を増幅し、及び該増幅された核酸の電気泳動移動度と対応する野生型SMO遺伝子又はそのフラグメントの電気泳動移動度とを比較することを含む方法。

請求項68

前記電気泳動移動度をポリアクリルアミドゲル上で決定する、請求項67に記載の方法。

請求項69

サンプルにおける変異型SMO遺伝子を検出する方法であって、該サンプルから、変異を含む疑いのあるSMO又はそのフラグメントの膜貫通ドメイン6のカルボキシ末端に相当する核酸を増幅し、及び該増幅された核酸の電気泳動移動度と対応する野生型SMO遺伝子又はそのフラグメントの電気泳動移動度とを比較することを含む方法。

請求項70

前記電気泳動移動度をポリアクリルアミドゲル上で決定する、請求項69に記載の方法。

請求項71

サンプルにおける変異型SMO遺伝子を検出する方法であって、該サンプルから、変異を含む疑いのあるSMO又はそのフラグメントの膜貫通ドメイン7のカルボキシ末端に相当する核酸を増幅し、及び該増幅された核酸の電気泳動移動度と対応する野生型SMO遺伝子又はそのフラグメントの電気泳動移動度とを比較することを含む方法。

請求項72

前記電気泳動移動度をポリアクリルアミドゲル上で決定する、請求項71に記載の方法。

請求項73

サンプルにおける少なくとも1つのSMO変異を同定する方法であって、該サンプルからの核酸と、アミノ酸281コード配列をトリプトファン以外のアミノ酸に変化させる変異を組み込む変異型SMOタンパク質又はそのフラグメントをコードする核酸に特異的にハイブリダイズすることのできる核酸プローブとを接触させ、及び該ハイブリダイゼーションを検出することを含む方法。

請求項74

前記プローブが検出可能に標識されている、請求項73に記載の方法。

請求項75

前記プローブがアンチセンスオリゴマーである、請求項73に記載の方法。

請求項76

前記核酸サンプル中におけるSMO遺伝子又はそのフラグメントを増幅させ、そして該プローブと接触させる、請求項73に記載の方法。

請求項77

サンプルにおける少なくとも1つのSMO変異を同定する方法であって、該サンプルからの核酸と、アミノ酸459コード配列をアラニン以外のアミノ酸に変化させる変異を組み込む変異型SMOタンパク質又はそのフラグメントをコードする核酸に特異的にハイブリダイズすることのできる核酸プローブとを接触させ、及び該ハイブリダイゼーションを検出することを含む方法。

請求項78

前記プローブが検出可能に標識されている、請求項77に記載の方法。

請求項79

前記プローブがアンチセンスオリゴマーである、請求項77に記載の方法。

請求項80

前記核酸サンプル中におけるSMO遺伝子又はそのフラグメントを増幅させ、そして該プローブと接触させる、請求項77に記載の方法。

請求項81

サンプルにおける少なくとも1つのSMO変異を同定する方法であって、該サンプルからの核酸と、アミノ酸535コード配列をトリプトファン以外のアミノ酸に変化させる変異を組み込む変異型SMOタンパク質又はそのフラグメントをコードする核酸に特異的にハイブリダイズすることのできる核酸プローブとを接触させ、及び該ハイブリダイゼーションを検出することを含む方法。

請求項82

前記プローブが検出可能に標識されている、請求項81に記載の方法。

請求項83

前記プローブがアンチセンスオリゴマーである、請求項81に記載の方法。

請求項84

前記核酸サンプル中におけるSMO遺伝子又はそのフラグメントを増幅させ、そして該プローブと接触させる、請求項81に記載の方法。

請求項85

サンプルにおける少なくとも1つのSMO変異を同定する方法であって、該サンプルからの核酸と、アミノ酸408コード配列をイソロイシン以外のアミノ酸に変化させる変異を組み込む変異型SMOタンパク質又はそのフラグメントをコードする核酸に特異的にハイブリダイズすることのできる核酸プローブとを接触させ、及び該ハイブリダイゼーションを検出することを含む方法。

請求項86

前記プローブが検出可能に標識されている、請求項85に記載の方法。

請求項87

前記プローブがアンチセンスオリゴマーである、請求項85に記載の方法。

請求項88

前記核酸サンプル中におけるSMO遺伝子又はそのフラグメントを増幅させ、そして該プローブと接触させる、請求項85に記載の方法。

請求項89

GDC−0449による治療耐性である又は耐性になるヒト被験体において腫瘍を同定するための方法であって、該腫瘍のサンプルにおいて変異SMO遺伝子又は変異SMOタンパク質の存在を決定し、該変異SMO遺伝子がアミノ酸281に変異を含むSMOタンパク質をコードし、該SMOタンパク質がアミノ酸281に変異を含み、それによって、該変異SMO遺伝子又は変異SMOタンパク質の存在は、該腫瘍がGDC−0449による治療に耐性であることを示すことを含む方法。

請求項90

GDC−0449による治療に感受性でない又はもはや感受性ではない腫瘍を有する被験体を、前記変異SMOを結合する化合物で治療することをさらに含む、請求項89に記載の方法。

請求項91

前記変異の存在又は非存在を、核酸サンプルを検査することによって決定する、請求項89に記載の方法。

請求項92

前記変異の存在又は非存在を、タンパク質サンプルを検査することによって決定する、請求項89に記載の方法。

請求項93

GDC−0449による治療に耐性であるヒト被験体において腫瘍を同定するための方法であって、該腫瘍のサンプルにおいて変異SMO遺伝子又は変異SMOタンパク質の存在を決定し、該変異SMO遺伝子がアミノ酸459に変異を含むSMOタンパク質をコードし、該SMOタンパク質がアミノ酸459に変異を含み、それによって、該変異SMO遺伝子又は変異SMOタンパク質の存在は、該腫瘍がGDC−0449による治療に耐性であることを示すことを含む方法。

請求項94

GDC−0449による治療に感受性でない又はもはや感受性ではない腫瘍を有する被験体を、前記変異SMOを結合する化合物で治療することをさらに含む、請求項93に記載の方法。

請求項95

前記変異の存在又は非存在を、核酸サンプルを検査することによって決定する、請求項93に記載の方法。

請求項96

前記変異の存在又は非存在を、タンパク質サンプルを検査することによって決定する、請求項93に記載の方法。

請求項97

GDC−0449による治療に耐性である又は耐性になるヒト被験体において腫瘍を同定するための方法であって、該腫瘍のサンプルにおいて変異SMO遺伝子又は変異SMOタンパク質の存在を決定し、該変異SMO遺伝子がアミノ酸535に変異を含むSMOタンパク質をコードし、該SMOタンパク質がアミノ酸535に変異を含み、それによって、該変異SMO遺伝子又は変異SMOタンパク質の存在は、該腫瘍がGDC−0449による治療に耐性であることを示すことを含む方法。

請求項98

GDC−0449による治療に感受性でない又はもはや感受性ではない腫瘍を有する被験体を、前記変異SMOを結合する化合物で治療することをさらに含む、請求項97に記載の方法。

請求項99

前記変異の存在又は非存在を、核酸サンプルを検査することによって決定する、請求項97に記載の方法。

請求項100

前記変異の存在又は非存在を、タンパク質サンプルを検査することによって決定する、請求項97に記載の方法。

請求項101

GDC−0449による治療に耐性であるヒト被験体において腫瘍を同定するための方法であって、該腫瘍のサンプルにおいて変異SMO遺伝子又は変異SMOタンパク質の存在を決定し、該変異SMO遺伝子がアミノ酸408に変異を含むSMOタンパク質をコードし、該SMOタンパク質がアミノ酸408に変異を含み、それによって、該変異SMO遺伝子又は変異SMOタンパク質の存在は、該腫瘍がGDC−0449による治療に耐性であることを示すことを含む方法。

請求項102

GDC−0449による治療に感受性でない又はもはや感受性ではない腫瘍を有する被験体を、前記変異SMOを結合する化合物で治療することをさらに含む、請求項101に記載の方法。

請求項103

前記変異の存在又は非存在を、核酸サンプルを検査することによって決定する、請求項101又は102に記載の方法。

請求項104

前記変異の存在又は非存在を、タンパク質サンプルを検査することによって決定する、請求項101又は102に記載の方法。

請求項105

GDC−0449による治療に耐性であるヒト被験体において腫瘍を同定するための方法であって、該腫瘍のサンプルにおいて変異SMO遺伝子又は変異SMOタンパク質の存在を決定し、該変異SMO遺伝子がアミノ酸533に変異を含むSMOタンパク質をコードし、該SMOタンパク質がアミノ酸533に変異を含み、それによって、該変異SMO遺伝子又は変異SMOタンパク質の存在は、該腫瘍がGDC−0449による治療に耐性であることを示すことを含む方法。

請求項106

GDC−0449による治療に感受性でない又はもはや感受性ではない腫瘍を有する被験体を、前記変異SMOを結合する化合物で治療することをさらに含む、請求項105に記載の方法。

請求項107

前記変異の存在又は非存在を、核酸サンプルを検査することによって決定する、請求項105又は106に記載の方法。

請求項108

前記変異の存在又は非存在を、タンパク質サンプルを検査することによって決定する、請求項105又は106に記載の方法。

請求項109

アミノ酸281に変異を組み込む変異型SMOタンパク質のシグナル伝達を阻害する化合物のスクリーニング方法であって、該変異型SMOと試験化合物とを接触させ、及び該化合物の該変異型SMOへの結合を検出し、それによって、該変異型SMOへの該試験化合物の結合は、該試験化合物が変異型SMOの阻害剤であることを示すことを含む方法。

請求項110

アミノ酸281に変異を組み込む変異型SMOタンパク質のシグナル伝達を阻害する化合物のスクリーニング方法であって、該変異型SMOを発現する細胞と試験化合物とを接触させ、及び該細胞におけるGliの活性を検出し、それによって、該Gli活性の存在は、該試験化合物が変異型SMOの阻害剤ではないことを示すことを含む方法。

請求項111

アミノ酸459に変異を組み込む変異型SMOタンパク質のシグナル伝達を阻害する化合物のスクリーニング方法であって、該変異型SMOと試験化合物とを接触させ、及び該化合物の該変異型SMOへの結合を検出し、それによって、該変異型SMOへの該試験化合物の結合は、該試験化合物が変異型SMOの阻害剤であることを示すことを含む方法。

請求項112

アミノ酸459に変異を組み込む変異型SMOタンパク質のシグナル伝達を阻害する化合物のスクリーニング方法であって、該変異型SMOを発現する細胞と試験化合物とを接触させ、及び該細胞におけるGliの活性を検出し、それによって、該Gli活性の存在は、該試験化合物が変異型SMOの阻害剤ではないことを示すことを含む方法。

請求項113

アミノ酸535に変異を組み込む変異型SMOタンパク質のシグナル伝達を阻害する化合物のスクリーニング方法であって、該変異型SMOと試験化合物とを接触させ、及び該化合物の該変異型SMOへの結合を検出し、それによって、該変異型SMOへの該試験化合物の結合は、該試験化合物が変異型SMOの阻害剤であることを示すことを含む方法。

請求項114

アミノ酸535に変異を組み込む変異型SMOタンパク質のシグナル伝達を阻害する化合物のスクリーニング方法であって、該変異型SMOを発現する細胞と試験化合物とを接触させ、及び該細胞におけるGliの活性を検出し、それによって、該Gli活性の存在は、該試験化合物が変異型SMOの阻害剤ではないことを示すことを含む方法。

請求項115

アミノ酸408に変異を組み込む変異型SMOタンパク質のシグナル伝達を阻害する化合物のスクリーニング方法であって、該変異型SMOと試験化合物とを接触させ、及び該化合物の該変異型SMOへの結合を検出し、それによって、該変異型SMOへの該試験化合物の結合は、該試験化合物が変異型SMOの阻害剤であることを示すことを含む方法。

請求項116

アミノ酸408に変異を組み込む変異型SMOタンパク質のシグナル伝達を阻害する化合物のスクリーニング方法であって、該変異型SMOを発現する細胞と試験化合物とを接触させ、及び該細胞におけるGliの活性を検出し、それによって、該Gli活性の存在は、該試験化合物が変異型SMOの阻害剤ではないことを示すことを含む方法。

請求項117

アミノ酸533に変異を組み込む変異型SMOタンパク質のシグナル伝達を阻害する化合物のスクリーニング方法であって、該変異型SMOと試験化合物とを接触させ、及び該化合物の該変異型SMOへの結合を検出し、それによって、該変異型SMOへの該試験化合物の結合は、該試験化合物が変異型SMOの阻害剤であることを示すことを含む方法。

請求項118

アミノ酸533に変異を組み込む変異型SMOタンパク質のシグナル伝達を阻害する化合物のスクリーニング方法であって、該変異型SMOを発現する細胞と試験化合物とを接触させ、及び該細胞におけるGliの活性を検出し、それによって、該Gli活性の存在は、該試験化合物が変異型SMOの阻害剤ではないことを示すことを含む方法。

請求項119

異常なヘッジホッグシグナル伝達を有する細胞の増殖又は成長を阻害する方法であって、該細胞にブロモドメイン阻害剤投与することを含み、該細胞が配列番号1のアミノ酸位置281、408、459、533又は535に相当するアミノ酸位置のいずれか1つ以上に変異を有する平滑化タンパク質を発現する方法。

請求項120

前記細胞が被験体のものである、請求項119に記載の方法。

請求項121

前記細胞が癌細胞である、請求項119又は120に記載の方法。

請求項122

前記細胞がSUFU変異をさらに含む、請求項121に記載の方法。

請求項123

前記細胞がヒト細胞であり、該細胞がSUFU遺伝子のコピー喪失をもたらす10q欠失変異を含む、請求項122に記載の方法。

請求項124

前記10qの欠失がPTEN遺伝子のコピーの喪失をさらにもたらす、請求項123に記載の方法。

請求項125

前記ブロモドメイン阻害剤がI−BET762、JQ1又はJQ2である、請求項119〜124のいずれかに記載の方法。

請求項126

ヘッジホッグ経路阻害剤を同定する方法であって、該方法は、細胞と試験薬剤の所定量とを接触させ、ここで、該細胞はヘッジホッグタンパク質応答し又はヘッジホッグシグナル伝達経路の増大したヘッジホッグシグナル伝達及び/又は活性を有し、該細胞は請求項22〜30のいずれかに記載の変異型SMOタンパク質を発現し、及び(b)対照と比較して、該試験薬剤が該細胞内においてヘッジホッグシグナル伝達を阻害するかどうかを決定し、該試験薬剤が該対照に対して該細胞内におけるヘッジホッグシグナル伝達を阻害する場合には、該試験薬剤をヘッジホッグ経路阻害剤として同定することを含む方法。

請求項127

前記試験薬剤が前記細胞内においてヘッジホッグシグナル伝達を阻害する能力を、Gli1発現アッセイを使用して決定する、請求項126に記載の方法。

請求項128

ヘッジホッグ経路阻害剤の阻害剤を同定する方法であって、該方法は、細胞と試験薬剤の所定量とを接触させ、ここで、該細胞はヘッジホッグタンパク質に応答し又はヘッジホッグシグナル伝達経路の増大したヘッジホッグシグナル伝達及び/又は活性を有し、該細胞は請求項29〜40のいずれかに記載の変異型SMOタンパク質を発現し、及び(b)対照と比較して、該試験薬剤が該細胞の成長及び/又は増殖を阻害するかどうかを決定し、該試験薬剤が該対照に対して該細胞の成長及び/又は増殖を阻害する場合には、該試験薬剤をヘッジホッグ経路阻害剤として同定することを含む方法。

請求項129

対照が野生型SMOタンパク質を発現する細胞である、請求項126〜128のいずれかに記載の方法。

請求項130

前記対照が前記試験薬剤と接触させた細胞と同じ変異型SMOタンパク質を発現する細胞であり、該対照を該変異型SMOタンパク質が部分的又は完全に耐性である対照薬剤で処理する、請求項126〜128のいずれかに記載の方法。

請求項131

対照薬剤がビスモデギブ、LY2940680、LDE225及び/又は化合物5である、請求項130に記載の方法。

請求項132

前記試験薬剤が変異型SMOタンパク質に結合するが、野生型SMOタンパク質には結合しない、請求項126〜131のいずれかに記載の方法。

請求項133

前記試験薬剤が変異体SMOタンパク質と野生型SMOタンパク質の両方に結合する、請求項126〜131のいずれかに記載の方法。

請求項134

前記試験薬剤が野生型SMOタンパク質を発現する細胞よりも変異型SMOタンパク質を発現する細胞においてヘッジホッグシグナル伝達経路を阻害するのに有効である、請求項126又は127に記載の方法。

請求項135

前記試験薬剤が野生型SMOタンパク質を発現する細胞よりも変異型SMOタンパク質を発現する細胞の成長及び/又は増殖を阻害するのに有効である、請求項128に記載の方法。

請求項136

請求項1〜3、8〜9、15〜17又は22〜24のいずれかに記載の核酸を含むベクター

請求項137

請求項136に記載のベクターを含む宿主細胞

請求項138

請求項136に記載のベクターを含む又はそれを発現することができる宿主細胞。

請求項139

ヘッジホッグ経路阻害剤を同定する方法であって、該方法は、細胞と試験薬剤の所定量とを接触させ、ここで、該細胞はヘッジホッグタンパク質に応答し又はヘッジホッグシグナル伝達経路の増大したヘッジホッグシグナル伝達及び/又は活性を有し、該細胞は請求項136に記載のベクターを発現し、及び(b)対照と比較して、該試験薬剤が該細胞内においてヘッジホッグシグナル伝達を阻害するかどうかを決定し、該試験薬剤が該対照に対して該細胞内におけるヘッジホッグシグナル伝達を阻害する場合には、該試験薬剤をヘッジホッグ経路阻害剤として同定することを含む方法。

請求項140

前記試験薬剤が前記細胞内においてヘッジホッグシグナル伝達を阻害する能力を、Gli1発現アッセイを使用して決定する、請求項139に記載の方法。

請求項141

ヘッジホッグ経路阻害剤を同定する方法であって、該方法は、細胞と試験薬剤の所定量とを接触させ、ここで、該細胞はヘッジホッグタンパク質に応答し又はヘッジホッグシグナル伝達経路の増大したヘッジホッグシグナル伝達及び/又は活性を有し、該細胞は請求項136に記載のベクターを発現し、及び(b)対照と比較して、該試験薬剤が該細胞の成長及び/増殖を阻害するかどうかを決定し、該試験薬剤が該対照に対して該細胞の成長及び/増殖を阻害する場合には、該試験薬剤をヘッジホッグ経路阻害剤として同定する方法。

技術分野

0001

関連出願
本願は、2014年2月4日に出願された米国仮出願第61/935775号の優先権の利益を主張する。本明細書においてその全体が参照により本明細書に援用される。

背景技術

0002

発明の背景
分子標的癌治療薬が臨床において印象的な活性を示している。最も注目された例のいくつかとしては、フィラデルフィア染色体陽性慢性骨髄性白血病CML)又はKIT/PDGFR変異消化管間質腫瘍GIST)におけるチロシンキナーゼ阻害剤イマチニブ及びEGFR変異非小細胞肺癌(NSCLC)におけるエルロチニブが挙げられる(Krause,D.S.及びR.A.Van Etten(2005)N.Engl.J.Med.353(2):172−187)。これらの薬剤を用いた治療は、これらの分子異常を有する患者集団における劇的な抗腫瘍応答をもたらした。しかし、この印象的な初期床応答にもかかわらず、ほとんどの患者薬剤耐性の獲得のため最終的に進行する(Engelman,J.A.及びJ.Settleman(2008)Curr.Opin.Genet.Dev.18(1):73−79)。耐性メカニズムの同定は、結果として、より合理的な薬物の組み合わせ及び耐性の出現を潜在的に克服する又は避けることができる「第二世代阻害剤の開発の扉を開いた。

0003

髄芽腫は、小児における最も一般的な脳の悪性腫瘍を示す小脳原始神経外胚葉腫瘍である(Polkinghorn,W.R.及びN.J.Tarbell(2007)Nat.Clin.Pract.Oncol.4(5):295−304)。髄芽腫の治療の一形態は、アジュバント放射線療法である。生存率の改善にもかかわらず、アジュバント放射線衰弱副作用に関連するため、新たな分子標的療法の必要性が支持される。

0004

ヘッジホッグ(Hh)シグナル伝達経路は、髄芽腫の病因に直接関与する。抑制性受容体PTCH1における機能変異の根本的な欠失による場合が最も多い構成的Hhシグナルが孤発例の約30%で実証されている(Zurawel,R.H.外,(2000)Genes Chromosomes Cancer 27(1):44−51;Kool,M.外,(2008)PLoS ONE 3(8):e3088;Dellovade,T.外(2006)Annu.Rev.Neurosci.29:539;Rubin,L.L.及びF.J.de Sauvage(2006)Nat.Rev.Drug Discov.5:1026)。PTCH1に対するヘテロ接合マウス(PTCH1+/−)は髄芽腫を自発的に発症する場合があり、Hh経路阻害剤による治療により、腫瘍の除去及び生存期間延長が生じた(Goodrich,L.V.外(1997)Science 277(5329):1109−1113;Romer,J.T.外(2004)Cancer Cell6(3):229−240)。しかし、近年、新規Hh経路阻害剤GDC−0449により治療された患者は、最初に、治療に対して劇的な応答を示した(Charles M.Rudin外(2009)N.Engl.J.Med.(前出))が、治療に対する永久的な応答を獲得するのにはやはり失敗し、腫瘍の再発を示したことが観察されている。

0005

BCCは、最も一般的なヒトの癌であり、主にHh経路の過剰活性化によって活動化する(Oro外,1997;Xie外,1998)。Hhシグナル伝達と癌との関連は、最初に、髄芽腫(MB)及びBCCに影響を非常に受けやすいゴーリン又は基底細胞母斑症候群(BCNS)の患者で発見された。これらの患者は、一般に、Hhリガンドに対する受容体をコードするPatched1(PTCH1)内にヘテロ生殖細胞変異を有する(Hahn外,1996;Johnson外,1996)。Hhリガンド結合は、蛇行膜貫通(TM)シグナル伝達物質平滑化SMO)のPTCH1抑制を緩和する。散発的性BCCの大半は、PTCH1の変異及びヘテロ接合性消失(LOH)を不活性化させることにより活動化し、残りの大部分は、SMOの変異の活性化を維持する(Reifenberger外,2005)。SMOは、融合サプレッサー(SUFU)及びプロテインキナーゼAPKA)の阻害によりGLI転写因子の活性化及び核局在化を促進する。SUFUは、細胞質においてGLI転写因子を結合させ隔離することによってHh経路を負に調節する(Stone外,1999)。また、SUFUの機能喪失変異ゴーリン症候群とも関連する(Pastorino外,2009;Smith外,2014;Taylor外,2002)。また、散発性BCCの約50%はTP53変異も有する(Jayaraman外,2014)。

0006

数種のHh経路阻害剤(HPI)が近年BCC及びMBの両方について臨床試験中である(Amakye外,2013)。以前からGDC−0449として知られているビスモデギブは、転移性局所的に進行したBCCの治療について承認を受けたSMO阻害剤である(Sekulic外、2012)。ビスモデギブによる治療を受けたBCC患者の大半は、完全応答及び部分応答の両方を含めて臨床的利益を経験する(Sekulic外,2012)。

0007

しかし、予備的な推定から、進行BCC患者の20%までが治療の1年以内にビスモデギブに対する耐性を生じることが示唆される(Chang及びOro,2012)。これまで、臨床でのビスモデギブに対する耐性獲得唯一の機能的に特徴づけられた機構は、転移性MB患者からのものである。SMO−D473H変異が再発転移性腫瘍からの生検で検出され、試験管内で薬物結合を阻害することが示された(Yauch外,009)。近年、他の4つの臨床SMO変異がビスモデギブ耐性BCCで報告されたが、機能的には検討されなかった(Brinkhuizen外,2014;Pricl外,2014)。SMO阻害剤に対するいくつかの耐性機構が、追加のSMO変異、GLI2などの下流Hh経路成分増幅及びホスファチジルイノシトール3−キナーゼ(PI3K)キナーゼ及び非定型プロテインキナーゼCι/λ(aPKC−ι/λ)などのバイパスシグナル伝達経路の活性化を含めた前臨床モデルから示されている(Atwood外,2013;Buonamici外,2010;Dijkgraaf外,2011)。しかし、どの機構が患者において耐性にするのか不明なままである。

発明が解決しようとする課題

0008

追加のGDC−0449耐性変異型SMOタンパク質を同定し、そしてこのような変異型SMOタンパク質においてSMO活性を調節してGDC−0449による治療時における薬剤耐性を克服する化合物見出すことが当該技術分野において急務となっている。さらに、そのSMO遺伝子型自然変異による又は獲得した変異及び耐性による治療に対して耐性の場合がある患者を診断する方法に対する要望がさらに存在する。

課題を解決するための手段

0009

開示の概要
本発明は、特定の実施形態では、単離された変異型SMO核酸及びタンパク質、例えば腫瘍の化学療法耐性に関連するものに関し、また、SMO変異に結合し又はSMO活性を調節する化合物についての及びスクリーニング方法、並びに癌診断及び治療、特に薬剤耐性腫瘍の診断及び/又は予後及び治療である変異の検出に関するものでもある。

0010

いくつかの実施形態では、本発明は、変異型SMOタンパク質をコードする単離核酸分子であって、該アミノ酸配列野生型SMOアミノ酸配列の281位に対応するアミノ酸位置にトリプトファン以外のアミノ酸を含むものを提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号1に対して少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む変異型SMOタンパク質をコードする単離核酸分子であって、該アミノ酸配列がアミノ酸281にトリプトファン以外のアミノ酸を含むものを提供する。いくつかの実施形態では、変異型SMOタンパク質は、配列番号2のアミノ酸配列を含み、該アミノ酸配列は、アミノ酸281にシステイン(C)を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号5の親核酸配列を含み、該配列は、異なるアミノ酸をコードするように、アミノ酸281をコードする配列を変化させる変異を含有する。いくつかの実施形態では、本発明は、アミノ酸281をコードする配列に変異を組み込む変異型SMOタンパク質又はそのフラグメントをコードする核酸にハイブリダイズ可能な核酸プローブも提供する。いくつかの実施形態では、プローブは、変異型SMO又はそのフラグメントをコードする該核酸に相補的である。いくつかの実施形態では、プローブは、約10〜約50ヌクレオチド長を有する。いくつかの実施形態では、プローブは検出可能な標識をさらに含む。

0011

いくつかの実施形態では、本発明は、変異型SMOタンパク質をコードする単離核酸分子を提供し、該アミノ酸配列は、野生型SMOアミノ酸配列の459位に対応するアミノ酸位置にアラニン以外のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号1に対して少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む変異型SMOタンパク質をコードする単離核酸分子を提供し、該アミノ酸配列は、アミノ酸459におけるアラニン以外のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、変異型SMOタンパク質は、配列番号3のアミノ酸配列を含み、該アミノ酸配列はアミノ酸459にバリン(V)を含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、配列番号5の親核酸配列を含み、該配列は、異なるアミノ酸をコードするようにアミノ酸459コード配列を変化させる変異を有する。いくつかの実施形態では、本発明は、アミノ酸459コード配列に突然変異を組み込む変異型SMOタンパク質又はそのフラグメントをコードする核酸に特異的にハイブリダイズ可能な核酸プローブを提供する。いくつかの実施形態では、プローブは、変異型SMO又はそのフラグメントをコードする核酸に相補的である。いくつかの実施形態では、プローブは、約10〜50ヌクレオチド長を有する。いくつかの実施形態では、プローブは検出可能な標識をさらに含む。

0012

いくつかの実施形態では、本発明は、変異型SMOタンパク質をコードする単離核酸分子を提供し、該アミノ酸配列は、野生型SMOアミノ酸配列の535位に対応するアミノ酸位置にトリプトファン以外のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号1に対して少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む変異型SMOタンパク質をコードする単離核酸分子を提供し、該アミノ酸配列は、アミノ酸535にトリプトファン以外のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、変異型SMOタンパク質は、配列番号4のアミノ酸配列を含み、該アミノ酸配列はアミノ酸535にロイシン(L)を含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、配列番号5の親核酸配列を含み、該配列は、異なるアミノ酸をコードするようにアミノ酸535コード配列を変化させる変異を有する。いくつかの実施形態では、本発明は、アミノ酸535コード配列に突然変異を組み込む変異型SMOタンパク質又はそのフラグメントをコードする核酸に特異的にハイブリダイズ可能な核酸プローブを提供する。いくつかの実施形態では、プローブは、変異型SMO又はそのフラグメントをコードする核酸に相補的である。いくつかの実施形態では、プローブは、約10〜50ヌクレオチド長を有する。いくつかの実施形態では、プローブは検出可能な標識をさらに含む。

0013

いくつかの実施形態では、本発明は、変異型SMOタンパク質をコードする単離核酸分子を提供し、該アミノ酸配列は、野生型SMOアミノ酸配列の408位に対応するアミノ酸位置にイソロイシン以外のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号1に対して少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む変異型SMOタンパク質をコードする単離核酸分子を提供し、該アミノ酸配列は、アミノ酸408にイソロイシン(I)以外のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、変異型SMOタンパク質は、配列番号7のアミノ酸配列を含み、該アミノ酸配列はアミノ酸408にバリン(V)を含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、配列番号5の親核酸配列を含み、該配列は、異なるアミノ酸をコードするようにアミノ酸408コード配列を変化させる変異を有する。いくつかの実施形態では、本発明は、アミノ酸408コード配列に突然変異を組み込む変異型SMOタンパク質又はそのフラグメントをコードする核酸に特異的にハイブリダイズ可能な核酸プローブを提供する。いくつかの実施形態では、プローブは、変異型SMO又はそのフラグメントをコードする核酸に相補的である。いくつかの実施形態では、プローブは、約10〜50ヌクレオチド長を有する。いくつかの実施形態では、プローブは検出可能な標識をさらに含む。

0014

いくつかの実施形態では、本発明は、アミノ酸配列を含む単離変異型SMOタンパク質を提供し、該アミノ酸配列は、野生型SMOアミノ酸配列の281位に対応するアミノ酸位置にトリプトファン以外のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号2に対して少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む単離変異型SMOタンパク質を提供し、該アミノ酸配列は、アミノ酸281にトリプトファン以外のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、該アミノ酸配列はアミノ酸281にシステイン(C)を含む。

0015

いくつかの実施形態では、本発明は、アミノ酸配列を含む変異型SMOタンパク質を提供し、該アミノ酸配列は、野生型SMOアミノ酸配列の459位に対応するアミノ酸位置にアラニン以外のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号3に対して少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む単離変異型SMOタンパク質を提供し、該アミノ酸配列は、アミノ酸459にアラニン以外のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、該アミノ酸配列はアミノ酸459にバリン(V)を含む。

0016

いくつかの実施形態では、本発明は、アミノ酸配列を含む変異型SMOタンパク質を提供し、該アミノ酸配列は、野生型SMOアミノ酸配列の535位に対応するアミノ酸位置にトリプトファン以外のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号4に対して少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む単離変異型SMOタンパク質を提供し、該アミノ酸配列は、アミノ酸535にトリプトファン以外のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、該アミノ酸配列はアミノ酸535にロイシン(L)を含む。

0017

いくつかの実施形態では、本発明は、アミノ酸配列を含む変異型SMOタンパク質を提供し、該アミノ酸配列は、野生型SMOアミノ酸配列の408位に対応するアミノ酸位置にイソロイシン以外のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号7に対して少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む単離変異型SMOタンパク質を提供し、該アミノ酸配列は、アミノ酸408にイソロイシン(I)以外のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、該アミノ酸配列は、アミノ酸408にイソロイシン(I)以外のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、該アミノ酸配列はアミノ酸408にバリン(V)を含む。

0018

いくつかの実施形態では、本発明は、ここに開示された変異型SMOタンパク質のいずれかに特異的に結合する単離抗体を提供し、該抗体は、野生型SMOタンパク質には結合しない。

0019

いくつかの実施形態では、本発明は、アミノ酸281にトリプトファン以外のアミノ酸を含む変異型SMOタンパク質に特異的に結合する単離抗体を提供し、該抗体は、アミノ酸281にトリプトファンを有する野生型SMOには結合しない。いくつかの実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体キメラ抗体ヒト化抗体単鎖抗体又はそれらの抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体は、細胞傷害剤に結合する。いくつかの実施形態では、抗体は、検出可能な標識に結合する。いくつかの実施形態では、抗体は、SMO活性を阻害する。

0020

いくつかの実施形態では、本発明は、アミノ酸459にアラニン以外のアミノ酸を含む変異型SMOタンパク質に特異的に結合する単離抗体を提供し、該抗体は、アミノ酸459にトリプトファンを有する野生型SMOには結合しない。いくつかの実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体又はそれらの抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体は細胞傷害剤に結合する。いくつかの実施形態では、抗体は検出可能な標識に結合する。いくつかの実施形態では、抗体はSMO活性を阻害する。

0021

いくつかの実施形態では、本発明は、アミノ酸535にトリプトファン以外のアミノ酸を含む変異型SMOタンパク質に特異的に結合する単離抗体を提供し、該抗体は、アミノ酸535にトリプトファンを有する野生型SMOには結合しない。いくつかの実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体又はそれらの抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体は細胞傷害剤に結合する。いくつかの実施形態では、抗体は検出可能な標識に結合する。いくつかの実施形態では、抗体はSMO活性を阻害する。

0022

いくつかの実施形態では、本発明は、アミノ酸408にイソロイシン以外のアミノ酸を含む変異型SMOタンパク質に特異的に結合する単離抗体を提供し、該抗体は、アミノ酸408にイソロイシンを有する野生型SMOには結合しない。いくつかの実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体又はそれらの抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体は細胞傷害剤に結合する。いくつかの実施形態では、抗体は検出可能な標識に結合する。いくつかの実施形態では、抗体はSMO活性を阻害する。

0023

いくつかの実施形態では、本発明は、サンプル中の変異型SMO遺伝子を検出する方法であって、変異を含む疑いのあるSMO又はそのフラグメントの第1細胞外ループカルボキシ末端に相当するサンプル核酸を増幅し、そして該増幅核酸電気泳動移動度と対応する野生型SMO遺伝子又はそのフラグメントの電気泳動移動度とを比較することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、電気泳動移動度をポリアクリルアミドゲル上で決定する。

0024

いくつかの実施形態では、本発明は、サンプル中の変異型SMO遺伝子を検出する方法であって、変異を含む疑いのあるSMO又はそのフラグメントの第1膜貫通ドメインアミノ末端に相当する該サンプル核酸を増幅し、そして該増幅核酸の電気泳動移動度と対応する野生型SMO遺伝子又はそのフラグメントの電気泳動移動度とを比較することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、電気泳動移動度をポリアクリルアミドゲル上で決定する。

0025

いくつかの実施形態では、本発明は、サンプル中の変異型SMO遺伝子を検出する方法であって、変異を含む疑いのあるSMO又はそのフラグメントの第2膜貫通ドメインのカルボキシ末端に相当する該サンプル核酸を増幅し、そして該増幅核酸の電気泳動移動度と対応する野生型SMO遺伝子又はそのフラグメントの電気泳動移動度とを比較することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、電気泳動移動度をポリアクリルアミドゲル上で決定する。

0026

いくつかの実施形態では、本発明は、サンプル中の変異型SMO遺伝子を検出する方法であって、変異を含む疑いのあるSMO又はそのフラグメントの第5細胞外ループのアミノ末端に相当する該サンプル核酸を増幅し、そして該増幅核酸の電気泳動移動度と対応する野生型SMO遺伝子又はそのフラグメントの電気泳動移動度とを比較することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、電気泳動移動度をポリアクリルアミドゲル上で決定する。

0027

いくつかの実施形態では、本発明は、サンプル中の変異型SMO遺伝子を検出する方法であって、変異を含む疑いのあるSMO又はそのフラグメントの膜貫通ドメイン6のカルボキシ末端に相当する該サンプル核酸を増幅し、そして該増幅核酸の電気泳動移動度と対応する野生型SMO遺伝子又はそのフラグメントの電気泳動移動度とを比較することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、電気泳動移動度をポリアクリルアミドゲル上で決定する。

0028

いくつかの実施形態では、本発明は、サンプル中の変異型SMO遺伝子を検出する方法であって、変異を含む疑いのあるSMO又はそのフラグメントの膜貫通ドメイン7のカルボキシ末端に相当する該サンプル核酸を増幅し、そして該増幅核酸の電気泳動移動度と対応する野生型SMO遺伝子又はそのフラグメントの電気泳動移動度とを比較することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、電気泳動移動度をポリアクリルアミドゲル上で決定する。

0029

いくつかの実施形態では、本発明は、サンプル中における少なくとも1つのSMO変異を同定する方法であって、該サンプルからの核酸と、アミノ酸281をコードする配列をトリプトファン以外のアミノ酸に変化させる変異を組み込む変異型SMOタンパク質をコードする核酸又はそのフラグメントに特異的にハイブリダイズすることができる核酸プローブとを接触させ、そして該ハイブリダイゼーションを検出することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、該プローブは検出可能に標識されている。いくつかの実施形態では、該プローブはアンチセンスオリゴマーである。いくつかの実施形態では、該核酸サンプル中における該SMO遺伝子又はそのフラグメントを増幅させ、そしてプローブと接触させる。

0030

いくつかの実施形態では、本発明は、サンプル中における少なくとも1つのSMO変異を同定する方法であって、該サンプルからの核酸と、アミノ酸459をコードする配列をアラニン以外のアミノ酸に変化させる変異を組み込む変異型SMOタンパク質をコードする核酸又はそのフラグメントに特異的にハイブリダイズすることができる核酸プローブとを接触させ、そして該ハイブリダイゼーションを検出することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、該プローブは検出可能に標識されている。いくつかの実施形態では、該プローブはアンチセンスオリゴマーである。いくつかの実施形態では、該核酸サンプル中における該SMO遺伝子又はそのフラグメントを増幅させ、そしてプローブと接触させる。

0031

いくつかの実施形態では、本発明は、サンプル中における少なくとも1つのSMO変異を同定する方法であって、該サンプルからの核酸と、アミノ酸535をコードする配列をトリプトファン以外のアミノ酸に変化させる変異を組み込む変異型SMOタンパク質をコードする核酸又はそのフラグメントに特異的にハイブリダイズすることができる核酸プローブとを接触させ、そして該ハイブリダイゼーションを検出することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、該プローブは検出可能に標識されている。いくつかの実施形態では、該プローブはアンチセンスオリゴマーである。いくつかの実施形態では、該核酸サンプル中における該SMO遺伝子又はそのフラグメントを増幅させ、そしてプローブと接触させる。

0032

いくつかの実施形態では、本発明は、サンプル中における少なくとも1つのSMO変異を同定する方法であって、該サンプルからの核酸と、アミノ酸408をコードする配列をイソロイシン以外のアミノ酸に変化させる変異を組み込む変異型SMOタンパク質をコードする核酸又はそのフラグメントに特異的にハイブリダイズすることができる核酸プローブとを接触させ、そして該ハイブリダイゼーションを検出することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、該プローブは検出可能に標識されている。いくつかの実施形態では、該プローブはアンチセンスオリゴマーである。いくつかの実施形態では、該核酸サンプル中における該SMO遺伝子又はそのフラグメントを増幅させ、そしてプローブと接触させる。

0033

いくつかの実施形態では、本発明は、GDC−0449による治療に耐性である又は耐性になるヒト被験体において腫瘍を同定するための方法であって、該腫瘍のサンプル中における変異型SMO遺伝子又は変異型SMOタンパク質の存在を決定し、ここで、該変異型SMO遺伝子は、アミノ酸281に突然変異を含むSMOタンパク質をコードし、該SMOタンパク質はアミノ酸281に突然変異を含み、それによって、該変異型SMO遺伝子又は変異型SMOタンパク質の存在は、該腫瘍がGDC−0449による治療に耐性であることを示すことを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法は、GDC−0449による治療に影響を受けない又はもはや影響を受けやすくない腫瘍を有する被験体を該変異型SMOに結合する化合物で治療することを含む。いくつかの実施形態では、変異の有無を、核酸サンプルを調査することによって決定する。いくつかの実施形態では、該変異の有無を、タンパク質サンプル検査することによって決定する。

0034

いくつかの実施形態では、本発明は、GDC−0449による治療に耐性である又は耐性になるヒト被験体において腫瘍を同定するための方法であって、該腫瘍のサンプル中における変異型SMO遺伝子又は変異型SMOタンパク質の存在を決定し、ここで、該変異型SMO遺伝子は、アミノ酸459に突然変異を含むSMOタンパク質をコードし、該SMOタンパク質はアミノ酸459に突然変異を含み、それによって、該変異型SMO遺伝子又は変異型SMOタンパク質の存在は、該腫瘍がGDC−0449による治療に耐性であることを示すことを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法は、GDC−0449による治療に影響を受けない又はもはや影響を受けやすくない腫瘍を有する被験体を該変異型SMOに結合する化合物で治療することを含む。いくつかの実施形態では、変異の有無を、核酸サンプルを調査することによって決定する。いくつかの実施形態では、該変異の有無を、タンパク質サンプルを検査することによって決定する。

0035

いくつかの実施形態では、本発明は、GDC−0449による治療に耐性である又は耐性になるヒト被験体において腫瘍を同定するための方法であって、該腫瘍のサンプル中における変異型SMO遺伝子又は変異型SMOタンパク質の存在を決定し、ここで、該変異型SMO遺伝子は、アミノ酸535に突然変異を含むSMOタンパク質をコードし、該SMOタンパク質はアミノ酸535に突然変異を含み、それによって、該変異型SMO遺伝子又は変異型SMOタンパク質の存在は、該腫瘍がGDC−0449による治療に耐性であることを示すことを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法は、該変異型SMOを結合する化合物によるGDC−0449を用いた治療に感受性でなはい又はもはや感受性ではない腫瘍を有する対象を治療することを含む。いくつかの実施形態では、変異の有無を、核酸サンプルを調査することによって決定する。いくつかの実施形態では、該変異の有無を、タンパク質サンプルを検査することによって決定する。

0036

いくつかの実施形態では、本発明は、GDC−0449による治療に耐性である又は耐性になるヒト被験体において腫瘍を同定するための方法であって、該腫瘍のサンプル中における変異型SMO遺伝子又は変異型SMOタンパク質の存在を決定し、ここで、該変異型SMO遺伝子は、アミノ酸408に突然変異を含むSMOタンパク質をコードし、該SMOタンパク質はアミノ酸408に突然変異を含み、それによって、該変異型SMO遺伝子又は変異型SMOタンパク質の存在は、該腫瘍がGDC−0449による治療に耐性であることを示すことを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法は、GDC−0449による治療に影響を受けない又はもはや影響を受けやすくない腫瘍を有する被験体を該変異型SMOに結合する化合物で治療することを含む。いくつかの実施形態では、変異の有無を、核酸サンプルを調査することによって決定する。いくつかの実施形態では、該変異の有無を、タンパク質サンプルを検査することによって決定する。

0037

いくつかの実施形態では、本発明は、GDC−0449による治療に耐性である又は耐性になるヒト被験体において腫瘍を同定するための方法であって、該腫瘍のサンプル中における変異型SMO遺伝子又は変異型SMOタンパク質の存在を決定し、ここで、該変異型SMO遺伝子は、アミノ酸533に突然変異を含むSMOタンパク質をコードし、該SMOタンパク質はアミノ酸533に突然変異を含み、それによって、該変異型SMO遺伝子又は変異型SMOタンパク質の存在は、該腫瘍がGDC−0449による治療に耐性であることを示すことを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法は、GDC−0449による治療に影響を受けない又はもはや影響を受けやすくない腫瘍を有する被験体を該変異型SMOに結合する化合物で治療することを含む。いくつかの実施形態では、変異の有無を、核酸サンプルを調査することによって決定する。いくつかの実施形態では、該変異の有無を、タンパク質サンプルを検査することによって決定する。

0038

いくつかの実施形態では、本発明は、アミノ酸281に変異を組み込む変異体SMOタンパク質のシグナル伝達を阻害する化合物のスクリーニング方法であって、該変異体SMOと試験化合物とを接触させ、そして該化合物の該変異体SMOへの結合を検出し、それによって、該試験化合物の該変異型SMOへの結合は、該試験化合物が変異体SMOの阻害剤であることを示すことを含む方法を提供する。

0039

いくつかの実施形態では、本発明は、アミノ酸281に変異を組み込む変異体SMOタンパク質のシグナル伝達を阻害する化合物のスクリーニング方法であって、該変異体SMOを発現する細胞と試験化合物とを接触させ、そして該細胞におけるGliの活性を検出し、それによって、Gli活性の存在は、該試験化合物が変異体SMOの阻害剤であることを示すことを含む方法を提供する。

0040

いくつかの実施形態では、本発明は、アミノ酸459に変異を組み込む変異体SMOタンパク質のシグナル伝達を阻害する化合物のスクリーニング方法であって、該変異体SMOと試験化合物とを接触させ、そして該化合物の該変異体SMOへの結合を検出し、それによって、該試験化合物の該変異型SMOへの結合は、該試験化合物が変異体SMOの阻害剤であることを示すことを含む方法を提供する。

0041

いくつかの実施形態では、本発明は、アミノ酸459に変異を組み込む変異体SMOタンパク質のシグナル伝達を阻害する化合物のスクリーニング方法であって、該変異体SMOを発現する細胞と試験化合物とを接触させ、そして該細胞におけるGliの活性を検出し、それによって、Gli活性の存在は、該試験化合物が変異体SMOの阻害剤であることを示すことを含む方法を提供する。

0042

いくつかの実施形態では、本発明は、アミノ酸535に変異を組み込む変異体SMOタンパク質のシグナル伝達を阻害する化合物のスクリーニング方法であって、該変異体SMOと試験化合物とを接触させ、そして該化合物の該変異体SMOへの結合を検出し、それによって、該試験化合物の該変異型SMOへの結合は、該試験化合物が変異体SMOの阻害剤であることを示すことを含む方法を提供する。

0043

いくつかの実施形態では、本発明は、アミノ酸535に変異を組み込む変異体SMOタンパク質のシグナル伝達を阻害する化合物のスクリーニング方法であって、該変異体SMOを発現する細胞と試験化合物とを接触させ、そして該細胞におけるGliの活性を検出し、それによって、Gli活性の存在は、該試験化合物が変異体SMOの阻害剤であることを示すことを含む方法を提供する。

0044

いくつかの実施形態では、本発明は、アミノ酸408に変異を組み込む変異体SMOタンパク質のシグナル伝達を阻害する化合物のスクリーニング方法であって、該変異体SMOと試験化合物とを接触させ、そして該化合物の該変異体SMOへの結合を検出し、それによって、該試験化合物の該変異型SMOへの結合は、該試験化合物が変異体SMOの阻害剤であることを示すことを含む方法を提供する。

0045

いくつかの実施形態では、本発明は、アミノ酸408に変異を組み込む変異体SMOタンパク質のシグナル伝達を阻害する化合物のスクリーニング方法であって、該変異体SMOを発現する細胞と試験化合物とを接触させ、そして該細胞におけるGliの活性を検出し、それによって、Gli活性の存在は、該試験化合物が変異体SMOの阻害剤であることを示すことを含む方法を提供する。

0046

いくつかの実施形態では、本発明は、アミノ酸533に変異を組み込む変異体SMOタンパク質のシグナル伝達を阻害する化合物のスクリーニング方法であって、該変異体SMOと試験化合物とを接触させ、そして該化合物の該変異体SMOへの結合を検出し、それによって、該試験化合物の該変異型SMOへの結合は、該試験化合物が変異体SMOの阻害剤であることを示すことを含む方法を提供する。

0047

いくつかの実施形態では、本発明は、アミノ酸533に変異を組み込む変異体SMOタンパク質のシグナル伝達を阻害する化合物のスクリーニング方法であって、該変異体SMOを発現する細胞と試験化合物とを接触させ、そして該細胞におけるGliの活性を検出し、それによって、Gli活性の存在は、該試験化合物が変異体SMOの阻害剤であることを示すことを含む方法を提供する。

0048

本発明は、変異型SMOタンパク質をコードする単離核酸分子を提供する。一態様では、該核酸分子は、配列番号2に対して少なくとも95%同一であるアミノ酸配列をコードし、該アミノ酸配列は、配列番号2の位置281に、トリプトファン(W)以外の任意のアミノ酸であるアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、配列番号2の位置281のアミノ酸はシステイン(C)である。本発明の一態様では、単離核酸配列は、配列番号5(野生型SMO)の親核酸配列を含むが、ただし、位置841、842及び/又は843に、コードアミノ酸をトリプトファン(W)から異なるアミノ酸に変化させる1以上の変異を含む。いくつかの実施形態では、変異は、トリプトファン(W)からシステイン(C)に変化させる。

0049

いくつかの実施形態では、該核酸分子は、配列番号3に対して少なくとも95%同一であるアミノ酸配列をコードし、該アミノ酸配列は、配列番号3の位置459に、アラニン(A)以外の任意のアミノ酸であるアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、配列番号3の位置459のアミノ酸はバリン(V)である。本発明の一態様では、単離核酸配列は、配列番号5(野生型SMO)の親核酸配列を含むが、ただし、位置1375、1376及び/又は1377に、コードアミノ酸をアラニン(A)から異なるアミノ酸に変化させる1以上の変異を含む。いくつかの実施形態では、変異は、アラニン(A)からバリン(V)に変化させる。

0050

いくつかの実施形態では、該核酸分子は、配列番号4に対して少なくとも95%同一であるアミノ酸配列をコードし、該アミノ酸配列は、配列番号4の位置535に、トリプトファン(W)以外の任意のアミノ酸であるアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、配列番号4の位置535のアミノ酸はロイシン(L)である。本発明の一態様では、単離核酸配列は、配列番号5(野生型SMO)の親核酸配列を含むが、ただし、位置1603、1604及び/又は1605に、コードアミノ酸をトリプトファン(W)から異なるアミノ酸に変化させる1以上の変異を含む。いくつかの実施形態では、変異は、トリプトファン(W)からロイシン(L)に変化させる。

0051

別の態様では、本発明は、SMOのアミノ酸281に変異を組み込む変異型SMOタンパク質又はそのフラグメントをコードする核酸に特異的にハイブリダイズすることのできる核酸プローブを提供する。一実施形態では、該プローブは、変異型SMO又はそのフラグメントをコードする核酸に相補的である。該プローブは約10〜約50ヌクレオチド長を有することができる。いくつかの実施形態では、該プローブは検出可能に標識できる。該プローブは、変異型Smoを野生型Smo(281位にトリプトファンを有する)に対して差次的に結合させる。

0052

別の態様では、本発明は、SMOのアミノ酸459に変異を組み込む変異型SMOタンパク質又はそのフラグメントをコードする核酸に特異的にハイブリダイズすることのできる核酸プローブを提供する。一実施形態では、該プローブは、変異型SMO又はそのフラグメントをコードする核酸に相補的である。該プローブは約10〜約50ヌクレオチド長を有することができる。いくつかの実施形態では、該プローブは検出可能に標識できる。該プローブは、変異型Smoを野生型Smo(459位にトリプトファンを有する)に対して差次的に結合させる。

0053

別の態様では、本発明は、SMOのアミノ酸535に変異を組み込む変異型SMOタンパク質又はそのフラグメントをコードする核酸に特異的にハイブリダイズすることのできる核酸プローブを提供する。一実施形態では、該プローブは、変異型SMO又はそのフラグメントをコードする核酸に相補的である。該プローブは約10〜約50ヌクレオチド長を有することができる。いくつかの実施形態では、該プローブは検出可能に標識できる。該プローブは、変異型Smoを野生型Smo(535位にトリプトファンを有する)に対して差次的に結合させる。

0054

いくつかの実施形態では、本発明は、変異型SMO核酸又はそのフラグメントを提供する。本発明の核酸は、単離変異型SMOコード配列を含む。いくつかの実施形態では、該核酸は、配列番号5の核酸配列に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一である配列を含み、かつ、該核酸が配列番号1のヌクレオチド位置281に相当するヌクレオチド位置にトリプトファン(W)以外のアミノ酸を含むSMOポリペプチドをコードするように少なくとも1つの変異を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号1の281位に相当するアミノ酸位置にシステイン(C)をコードする。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号5の位置841、842及び/又は843に相当するヌクレオチド位置に親野生型SMOからの少なくとも1個の変異を有する。いくつかの実施形態では、パーセント同一性は、配列番号と85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%であるが、ただし、配列番号5の841、842及び/又は843位に相当するヌクレオチド位置には少なくとも1個の変異が存在するものとする。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号5の核酸配列に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一の配列を含み、かつ、核酸が配列番号1の408位に相当するアミノ酸位置にイソロイシン(I)以外のアミノ酸を含むSMOポリペプチドをコードするように少なくとも1個の突然変異を含有する配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号1の408位に相当するアミノ酸位置にバリン(V)をコードする。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号5の位置1222、1223及び/又は1224に相当するヌクレオチド位置に親野生型SMOからの少なくとも1個の変異を有する。いくつかの実施形態では、パーセント同一性は、配列番号5と85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%であるが、ただし、配列番号5の1222、1223及び/又は1224位に相当するヌクレオチド位置には少なくとも1個の変異が存在するものとする。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号5の核酸配列に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一の配列を含み、かつ、核酸が配列番号1の459位に相当するアミノ酸位置にアラニン(A)以外のアミノ酸を含むSMOポリペプチドをコードするように少なくとも1個の突然変異を含有する配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号1の459位に相当するアミノ酸位置にバリン(V)をコードする。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号5の位置1375、1376及び/又は1377に相当するヌクレオチド位置に親野生型SMOからの少なくとも1個の変異を有する。いくつかの実施形態では、パーセント同一性は、配列番号5と85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%であるが、ただし、配列番号5の1375、1376及び/又は1377位に相当するヌクレオチド位置には少なくとも1個の変異が存在するものとする。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号5の核酸配列に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一の配列を含み、かつ、核酸が配列番号1の533位に相当するアミノ酸位置にセリン(S)以外のアミノ酸を含むSMOポリペプチドをコードするように少なくとも1個の突然変異を含有する配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号1の533位に相当するアミノ酸位置にアスパラギン(N)をコードする。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号5の位置1597、1598及び/又は1599に相当するヌクレオチド位置に親野生型SMOからの少なくとも1個の変異を有する。いくつかの実施形態では、パーセント同一性は、配列番号5と85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%であるが、ただし、配列番号5の1597、1598及び/又は1599位に相当するヌクレオチド位置には少なくとも1個の変異が存在するものとする。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号5の核酸配列に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一の配列を含み、かつ、核酸が配列番号1の535位に相当するアミノ酸位置にトリプトファン(W)以外のアミノ酸を含むSMOポリペプチドをコードするように少なくとも1個の突然変異を含有する配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号1の535位に相当するヌクレオチド位置にロイシン(L)をコードする。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号5の位置1603、1604及び/又は1605に相当するヌクレオチド位置に親野生型SMOからの少なくとも1個の変異を有する。いくつかの実施形態では、パーセント同一性は、配列番号5と85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%であるが、ただし、配列番号5の1603、1604及び/又は1605ヌクレオチド位に相当するヌクレオチド位置には少なくとも1個の変異が存在するものとする。

0055

また、本発明は、少なくとも20ヌクレオチド長であるフラグメントに上記変異の領域に及ぶような核酸のフラグメントを包含する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドフラグメントは、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95又は100ヌクレオチド長である。これらのフラグメントは、全長変異型SMOコード核酸分子にまで上記変異の領域に及ぶ任意の長さとすることができる。

0056

いくつかの実施形態では、本発明は、変異型SMOタンパク質又はそれらのフラグメントを提供する。

0057

いくつかの実施形態では、SMOタンパク質は、配列番号1に少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むが、ただし、アミノ酸位置281に置換が存在するものとする。いくつかの実施形態では、SMOタンパク質は、配列番号1に少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むが、ただし、該アミノ酸配列は、配列番号1の281位に相当するアミノ酸位置にトリプトファン(W)以外のアミノ酸を含むものとする。いくつかの実施形態では、SMOタンパク質は、配列番号1に少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むが、ただし、該SMOタンパク質は、配列番号1の281位に相当するアミノ酸位置にシステイン(C)を含むものとする。

0058

いくつかの実施形態では、SMOタンパク質は、配列番号1に少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むが、ただし、アミノ酸位置408に変異が存在するものとする。いくつかの実施形態では、SMOタンパク質は、配列番号1に少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むが、ただし、該アミノ酸配列は、配列番号1の408位に相当するアミノ酸位置にイソロイシン(I)以外のアミノ酸を含むものとする。いくつかの実施形態では、SMOタンパク質は、配列番号1に少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むが、ただし、該SMOタンパク質は、配列番号1の408位に相当するアミノ酸位置にバリン(V)を含むものとする。

0059

いくつかの実施形態では、SMOタンパク質は、配列番号1に少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むが、ただし、アミノ酸位置459に変異が存在するものとする。いくつかの実施形態では、SMOタンパク質は、配列番号1に少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むが、ただし、該アミノ酸配列は、配列番号1の459位に相当するアミノ酸位置にアラニン(A)以外のアミノ酸を含むものとする。いくつかの実施形態では、SMOタンパク質は、配列番号1に少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むが、ただし、該SMOタンパク質は、配列番号1の459位に相当するアミノ酸位置にバリン(V)を含むものとする。

0060

いくつかの実施形態では、SMOタンパク質は、配列番号1に少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むが、ただし、アミノ酸位置533に変異が存在するものとする。いくつかの実施形態では、SMOタンパク質は、配列番号1に少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むが、ただし、該アミノ酸配列は、配列番号1の533位に相当するアミノ酸位置にセリン(S)以外のアミノ酸を含むものとする。いくつかの実施形態では、SMOタンパク質は、配列番号1に少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むが、ただし、該SMOタンパク質は、配列番号1の533位に相当するアミノ酸位置にアスパラギン(N)を含むものとする。

0061

いくつかの実施形態では、SMOタンパク質は、配列番号1に少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むが、ただし、アミノ酸位置535に変異が存在するものとする。いくつかの実施形態では、SMOタンパク質は、配列番号1に少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むが、ただし、該アミノ酸配列は、配列番号1の535位に相当するアミノ酸位置にトリプトファン(W)以外のアミノ酸を含むものとする。いくつかの実施形態では、SMOタンパク質は、配列番号1に少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含むが、ただし、該SMOタンパク質は、配列番号1の535位に相当するアミノ酸位置にロイシン(L)を含むものとする。

0062

いくつかの実施形態では、変異型ヒトSMOは、アミノ酸281が「Xaa」(本願に関して、トリプトファン(W)以外の任意のアミノ酸を表す)として示される配列番号2に示される。いくつかの実施形態では、Xaaはシステイン(C)である。

0063

いくつかの実施形態では、変異型ヒトSMOは、アミノ酸408が「Xaa」(本願に関して、イソロイシン(I)以外の任意のアミノ酸を表す)として示される配列番号6に示される。いくつかの実施形態では、Xaaはバリン(V)である。

0064

いくつかの実施形態では、変異型ヒトSMOは、アミノ酸459が「Xaa」(本願に関して、アラニン(A)以外の任意のアミノ酸を表す)として示される配列番号3に示される。いくつかの実施形態では、Xaaはバリン(V)である。

0065

いくつかの実施形態では、変異型ヒトSMOは、アミノ酸533が「Xaa」(本願に関して、セリン(S)以外の任意のアミノ酸を表す)として示される配列番号7に示される。いくつかの実施形態では、Xaaはアスパラギン(N)である。

0066

いくつかの実施形態では、Xaaはバリン(V)である。いくつかの実施形態では、変異型ヒトSMOは、アミノ酸535が「Xaa」(本願に関して、トリプトファン(W)以外の任意のアミノ酸を表す)として示される配列番号4に示される。いくつかの実施形態では、Xaaはロイシン(L)である。

0067

また、本発明は、配列番号2に対して少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む単離変異型SMOタンパク質であって、該アミノ酸配列が位置281にトリプトファン(W)以外のアミノ酸を含むものも提供する。いくつかの実施形態では、位置281でのアミノ酸はシステイン(C)である。

0068

また、本発明は、配列番号3に対して少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む単離変異型SMOタンパク質であって、該アミノ酸配列が位置459にアラニン(A)以外のアミノ酸を含むものも提供する。いくつかの実施形態では、位置459でのアミノ酸はバリン(V)である。

0069

また、本発明は、配列番号4に対して少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む単離変異型SMOタンパク質であって、該アミノ酸配列が位置535にトリプトファン(W)以外のアミノ酸を含むものも提供する。いくつかの実施形態では、位置535でのアミノ酸はロイシン(L)である。

0070

本発明は、本発明の変異型SMOタンパク質に特異的に結合する抗体であって、該抗体のエピトープが281位にトリプトファン以外のアミノ酸を有する変異型SMO上に存在するが、野生型SMOには結合しないものをさらに提供する。いくつかの態様では、該抗体は、変異型SMOに対して高い親和性で結合するが、野生型SMOには高い親和性では結合しない。いくつかの態様では、該抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体又はその抗原結合フラグメント(例えば、Fab、Fab’、F(ab’)2又はFvフラグメント)である。いくつかの実施形態では、抗体は、検出可能な標識に結合されている。他の実施形態では、抗体は細胞障害剤、例えば限定されないが、化学療法剤毒素又は放射性同位体に結合している。いくつかの態様では、抗体はSMO活性を阻害する。他の実施形態では、抗体は変異型SMO活性のみを阻害する。

0071

本発明は、本発明の変異型SMOタンパク質に特異的に結合する抗体であって、該抗体のエピトープが408位にトリプトファン以外のアミノ酸を有する変異型SMO上に存在するが、野生型SMOには結合しないものをさらに提供する。いくつかの態様では、該抗体は、変異型SMOに対して高い親和性で結合するが、野生型SMOには高い親和性では結合しない。いくつかの態様では、該抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体又はその抗原結合フラグメント(例えば、Fab、Fab’、F(ab’)2又はFvフラグメント)である。いくつかの実施形態では、抗体は、検出可能な標識に結合されている。他の実施形態では、抗体は細胞障害剤、例えば限定されないが、化学療法剤、毒素又は放射性同位体に結合している。いくつかの態様では、抗体はSMO活性を阻害する。他の実施形態では、抗体は変異型SMO活性のみを阻害する。

0072

本発明は、本発明の変異型SMOタンパク質に特異的に結合する抗体であって、該抗体のエピトープが459位にアラニン以外のアミノ酸を有する変異型SMO上に存在するが、野生型SMOには結合しないものをさらに提供する。いくつかの態様では、該抗体は、変異型SMOに対して高い親和性で結合するが、野生型SMOには高い親和性では結合しない。いくつかの態様では、該抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体又はその抗原結合フラグメント(例えば、Fab、Fab’、F(ab’)2又はFvフラグメント)である。いくつかの実施形態では、抗体は、検出可能な標識に結合されている。他の実施形態では、抗体は細胞障害剤、例えば限定されないが、化学療法剤、毒素又は放射性同位体に結合している。いくつかの態様では、抗体はSMO活性を阻害する。他の実施形態では、抗体は変異型SMO活性のみを阻害する。

0073

本発明は、本発明の変異型SMOタンパク質に特異的に結合する抗体であって、該抗体のエピトープが533位にトリプトファン以外のアミノ酸を有する変異型SMO上に存在するが、野生型SMOには結合しないものをさらに提供する。いくつかの態様では、該抗体は、変異型SMOに対して高い親和性で結合するが、野生型SMOには高い親和性では結合しない。いくつかの態様では、該抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体又はその抗原結合フラグメント(例えば、Fab、Fab’、F(ab’)2又はFvフラグメント)である。いくつかの実施形態では、抗体は、検出可能な標識に結合されている。他の実施形態では、抗体は細胞障害剤、例えば限定されないが、化学療法剤、毒素又は放射性同位体に結合している。いくつかの態様では、抗体はSMO活性を阻害する。他の実施形態では、抗体は変異型SMO活性のみを阻害する。

0074

本発明は、本発明の変異型SMOタンパク質に特異的に結合する抗体であって、該抗体のエピトープが535位にトリプトファン以外のアミノ酸を有する変異型SMO上に存在するが、野生型SMOには結合しないものをさらに提供する。いくつかの態様では、該抗体は、変異型SMOに対して高い親和性で結合するが、野生型SMOには高い親和性では結合しない。いくつかの態様では、該抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体又はその抗原結合フラグメント(例えば、Fab、Fab’、F(ab’)2又はFvフラグメント)である。いくつかの実施形態では、抗体は、検出可能な標識に結合されている。他の実施形態では、抗体は細胞障害剤、例えば限定されないが、化学療法剤、毒素又は放射性同位体に結合している。いくつかの態様では、抗体はSMO活性を阻害する。他の実施形態では、抗体は変異型SMO活性のみを阻害する。

0075

また、本発明は、サンプル中における変異型SMO遺伝子を検出する方法であって、サンプルから変異を含む疑いのあるSMOの第1、第2、第5、第6又は第7膜貫通ドメイン、SMOのカルボキシ末端膜貫通ドメイン6、SMOのカルボキシ末端膜貫通ドメイン7又はそれらのフラグメントをコードする核酸を増幅し、及び該増幅核酸の電気泳動移動度と対応する野生型SMO遺伝子又はそのフラグメントの電気泳動移動度とを比較することを含む方法も提供する。いくつかの実施形態では、該電気泳動移動度は、ポリアクリルアミドゲル上で決定される。このような実施形態では、変異型SMOの電気泳動移動度は、野生型Smoと区別できる。

0076

さらに、本発明は、サンプル中における少なくとも1つのSMO変異を同定する方法であって、該サンプルからの核酸と、変異を取り入れる変異型SMOタンパク質又はそのフラグメントをコードする核酸に特異的にハイブリダイズできる核酸プローブとを接触させ、及び該ハイブリダイゼーションを検出することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法は、SMOの第1、第2、第5、第6又は第7膜貫通ドメインにおいて変異を検出する。いくつかの実施形態では、SMO変異は、Smoにおいて841、842及び/又は843位で生じ(281位にアミノ酸をコードする)、ここで、該変異は、トリプトファン以外のアミノ酸をコードするコドンをもたらす。いくつかの実施形態では、該方法は、SMOの膜貫通ドメイン6のカルボキシ末端部分における変異を検出する。いくつかの実施形態では、SMO変異は、Smoにおいて1375、1376及び/又は1377位(459位にアミノ酸をコードする)に生じ、ここで、該変異は、アラニン以外のアミノ酸をコードするコドンをもたらす。いくつかの実施形態では、該方法は、SMOの膜貫通ドメイン7のカルボキシ末端部分における変異を検出する。いくつかの実施形態では、SMO変異は、Smoにおいて1603、1604及び/又は1605位(535位にアミノ酸をコードする)に生じ、ここで、該変異はトリプトファン以外のアミノ酸をコードするコドンをもたらす。いくつかの実施形態では、プローブは検出可能に標識される。いくつかの実施形態では、プローブはアンチセンスオリゴマーである。いくつかの実施形態では、サンプル中におけるSMO遺伝子又はそのフラグメントの核酸を増幅させ、そしてプローブと接触させる。

0077

また、本発明は、GDC−0449などの化学療法剤による治療に耐性であるヒト被験体において腫瘍を同定するための方法であって、腫瘍サンプル中における変異型SMO遺伝子又は変異型SMOタンパク質の存在を決定することを含み、ここで、該変異は、膜表面でSMOの一部をコードするSMO遺伝子内に位置し(例えば、SMOの膜貫通ドメイン6のカルボキシ末端部分又はSMOの膜貫通ドメイン7のカルボキシ末端部分)、それによって、該変異型SMO遺伝子又は変異型SMOタンパク質の存在は、腫瘍が化学療法剤(例えばGDC−0449、これに限定されない)での治療に耐性であることを示す方法も提供する。いくつかの実施形態では、化学療法剤はGDC−0449である。他の実施形態では、化学療法剤はシクロパミンである。いくつかの実施形態では、変異はSMOのアミノ酸281をコードするSMO遺伝子の部分にある。いくつかの実施形態では、変異はトリプトファンから別のアミノ酸にSMOのアミノ酸281に変化を引き起こす。いくつかの実施形態では、他のアミノ酸はシステイン(C)である。いくつかの実施形態では、変異はSMOのアミノ酸459をコードするSMO遺伝子の部分にある。いくつかの実施形態では、変異は、アラニンから別のアミノ酸にSMOのアミノ酸459に変化を引き起こす。いくつかの実施形態では、他のアミノ酸はバリン(V)である。いくつかの実施形態では、変異は、SMOのアミノ酸535をコードするSMO遺伝子の部分にある。いくつかの実施形態では、変異は、トリプトファンから別のアミノ酸にSMOのアミノ酸535に変化を引き起こす。いくつかの実施形態では、他のアミノ酸はロイシン(L)である。

0078

また、本発明は、SMO阻害剤による治療に感受性であるヒト被験体において腫瘍を同定するための方法であって、(i)腫瘍サンプル中における野生型SMOタンパク質又は遺伝子の存在を決定し、それによって、野生型SMOタンパク質又は遺伝子の存在は、腫瘍がSMO阻害剤による治療に感受性であることを示し、又は(ii)腫瘍の試料で変異型SMOタンパク質又は遺伝子の存在を決定することを含み、ここで、該変異はSMOの281位でアミノ酸の変化をもたらし、それによって変異型SMOタンパク質又は遺伝子の存在は、腫瘍がGDC−0449などのSMO阻害剤による治療に感受性ではないことを示す方法も提供する。いくつかの実施形態では、SMO変異は、トリプトファン(W)281から他のアミノ酸への変化である。いくつかの実施形態では、アミノ酸はシステイン(C)である。

0079

また、本発明は、SMO阻害剤による治療に感受性であるヒト被験体において腫瘍を同定するための方法であって、(i)腫瘍サンプル中における野生型SMOタンパク質又は遺伝子の存在を決定し、それによって、野生型SMOタンパク質又は遺伝子の存在は、腫瘍がSMO阻害剤による治療に感受性であることを示し、又は(ii)腫瘍の試料で変異型SMOタンパク質又は遺伝子の存在を決定することを含み、ここで、該変異はSMOの459位でアミノ酸の変化をもたらし、それによって変異型SMOタンパク質又は遺伝子の存在は、腫瘍がGDC−0449などのSMO阻害剤による治療に感受性ではないことを示す方法も提供する。いくつかの実施形態では、SMO変異は、アラニン(A)459から他のアミノ酸への変化である。いくつかの実施形態では、アミノ酸はバリン(V)である。

0080

また、本発明は、SMO阻害剤による治療に感受性であるヒト被験体において腫瘍を同定するための方法であって、(i)腫瘍サンプル中における野生型SMOタンパク質又は遺伝子の存在を決定し、それによって、野生型SMOタンパク質又は遺伝子の存在は、腫瘍がSMO阻害剤による治療に感受性であることを示し、又は(ii)腫瘍の試料で変異型SMOタンパク質又は遺伝子の存在を決定することを含み、ここで、該変異はSMOの535位でアミノ酸の変化をもたらし、それによって変異型SMOタンパク質又は遺伝子の存在は、腫瘍がGDC−0449などのSMO阻害剤による治療に感受性ではないことを示す方法も提供する。いくつかの実施形態では、SMO変異は、トリプトファン(W)535から他のアミノ酸への変化である。いくつかの実施形態では、アミノ酸はロイシン(L)である。

0081

また、本発明は、ヘッジホッグ依存性腫瘍の治療を受けている患者の予後を決定する方法であって、腫瘍のサンプル中において、アミノ酸281、アミノ酸459又はアミノ酸535での変異の有無を決定し、それによって、該変異の存在は、所定のSmo阻害剤を使用して該変異が存在しない場合と比較して予後不良を示す方法も提供する。

0082

さらに、本発明は、アミノ酸281、アミノ酸459又はアミノ酸535に変異を組み込む変異型SMOタンパク質のシグナル伝達を阻害する化合物をスクリーニングする方法であって、該変異型とSMO試験化合物とを接触させ、そして該化合物の該変異型SMOへの結合を検出することを含み、それによって、該試験化合物の該変異型SMOへの結合は、該試験化合物が該変異型SMOの阻害剤であることを示す方法を提供する。

0083

また、本発明は、アミノ酸459、アミノ酸281又はアミノ酸535に変異を組み込む変異型SMOタンパク質のシグナル伝達を阻害する化合物をスクリーニングする方法であって、変異型SMOを発現する細胞と試験化合物とを接触させ、そして該細胞内でのGliの活性を検出することを含み、それによって、該Gli活性の存在は、該試験化合物が該変異型SMOの阻害剤ではないことを示す方法も提供する。いくつかの実施形態では、Gli活性は、検出可能な標識に結合されたGLIタンパク質を使用して測定される。いくつかの実施形態では、検出可能な標識は蛍光標識(例えば、ルシフェラーゼ)である。

図面の簡単な説明

0084

図1A〜1Gは、野生型ヒトSMO(1A)及びいくつかのヒト変異型SMO(1B−1I)についてのアミノ酸配列を示す。図1Aは、配列番号1を示す。
図1A〜1Gは、野生型ヒトSMO(1A)及びいくつかのヒト変異型SMO(1B−1I)についてのアミノ酸配列を示す。図1Bは、配列番号2を示す。
図1A〜1Gは、野生型ヒトSMO(1A)及びいくつかのヒト変異型SMO(1B−1I)についてのアミノ酸配列を示す。図1Cは、配列番号3を示す。
図1A〜1Gは、野生型ヒトSMO(1A)及びいくつかのヒト変異型SMO(1B−1I)についてのアミノ酸配列を示す。図1Dは、配列番号4を示す。
図1A〜1Gは、野生型ヒトSMO(1A)及びいくつかのヒト変異型SMO(1B−1I)についてのアミノ酸配列を示す。図1Eは、配列番号5を示す。
図1A〜1Gは、野生型ヒトSMO(1A)及びいくつかのヒト変異型SMO(1B−1I)についてのアミノ酸配列を示す。図1Fは、配列番号6を示す。
図1A〜1Gは、野生型ヒトSMO(1A)及びいくつかのヒト変異型SMO(1B−1I)についてのアミノ酸配列を示す。図1Gは、配列番号7を示す。
図2は、ビスモデギブ耐性BCCにおけるヘッジホッグ経路のシグナル伝達のレベルを決定するために実施した実験の結果を示す。
図3は、処置前及び処置後生検におけるSMO−A459V変異の頻度を決定するために実施した実験の結果を示す。
図4は、W281変異を有するSMO変異体のビスモデギブ結合ポケットを示す。
図5Aは、SMO−A459V変異体がPTCHに感受性かどうかを決定するために実施した実験の結果を示す。
図5Bは、SMO−A459V変異体がビスモデギブに対して感受性であるかどうかを決定するために実施した実験の結果を示す。
図5Cは、SMO−A459V、SMO−W281C、及びSMO−W535L変異体が変異を活性化しているかどうかを決定するために実施した実験の結果を示す。
図5Dは、SMO−W281C変異体がPTCH感受性であるかどうかを決定するために実施した実験の結果を示す。
図5Eは、SMO−W281C変異体がビスモデギブに対して感受性であるかどうかを決定するために実施した実験の結果を示す。
図5Fは、SMO−A459V及びSMO−W281Cがビスモデギブへの結合を損なったかどうかを決定するために実施した実験の結果を示す。
図6AはHh経路の概略図を示す。図6Bは、転移した患者12(PT12)からの散発性BCCの初期応答及び疾患の進行を示すスキャン写真を示す。赤の矢印は、治療前(PreRx)並びにビスモデギブ治療の4ヶ月後(病変サイズの減少を示す)及び37ヶ月後(病気の進行を示す)におけるコンピュータ断層撮影(CTスキャン)における標的病変を示す。図6Cは、最初にビスモデギブに応答したが、その後再発した(黒矢印)、治療の指示期間後におけるゴーリン症候群の患者(PT10)からの2つの局所的に進行したBCCの写真を示す。
図6Dは、ビスモデギブ治療の前及び11ヶ月後における患者9.1(PT09.1)からの局所的に進行した散発性BCCのヘマトキシリン及びエオシン(H&E)染色切片を示す。再発病変は、未治療の腫瘍の組織学的性質を維持していることに注意されたい。スケールバーは50μmを表す。図6Eは、ビスモデギブ耐性及び正常皮膚生検におけるGLI1及びMKI67発現レベルを示すグラフである。ピアソン相関係数(R)=0.96。正規化された読取り回数が示されている。図6Fは、12名の再発BCC患者で同定されたHh経路遺伝子及びTP53における遺伝的変化表形式の概要である。生殖細胞系列PTCH1変異体がゴーリンBCCについて報告されている一方で、体細胞変異が散発性BCCについて示されている。2つの領域的に異なる生検をPT06、PT08及びPT09について同じ初期腫瘍再増殖時に得た。2つの別々のBCCは患者PT10において耐性を生じた。LOHを、SNPアレイからのマイナー対立遺伝子頻度によって決定した。緑のボックスは、LOH事象、その後の変異対立遺伝子コピー数増加を強調するものである。対立遺伝子特異的発現をRNAseqにより決定した。
図7は、治療未経験散発性BCCで特定されSMO変異体を示す表である。SMO−A239Vは、以前には報告されていない(COSMIC/dbSNP)のに対し、他の全てのものは、以前に発癌性変異について報告されている。注:標的バリアントコーリングはSMO−A239Vを同定したが、異なる読取カットオフ及び感度の低下のため、体細胞バリアントコールVariantToolsは同定しなかった。
図8Aは、この研究で同定されたSMO突然変異の表形式の概要を示す。全ての変異は本質的に体細胞であった。これらは、同じ患者からの血液又は他の組織のいずれかで検出されなかったからである。
図8Bは、SMO TM領域(灰色のヘリックス;Wang外,2013)の結晶構造ドッキングされたビスモデギブ(黄色)の計算モデルを示す。これまでに特徴づけられていない変異体残留物を緑色で強調している。
図8Cは、治療前及び治療後の生検におけるSMO変異の有病率を示す棒グラフである。棒グラフは、ピロシーケンスによって決定される、PT03、PT04及びPT12(8C)についてのSMO−A459Vに相当する位置での野生型(青)又は変異型(赤)ヌクレオチドの取り込み頻度を示す。SMO変異はヘテロ接合性であることが予期され、SMOのコピー数は、最大Y軸値を決めることに留意されたい。このコピー数は、PT03、PT04、PT12、PT10及びPT11については50%であり(SMOコピー数は2である)、PT09については25%である(SMOコピー数は4である)。変異型ヌクレオチドの取り込みは、全ての治療前サンプルにおけるピロシーケンスアッセイバックグラウンドレベル(<5%)の範囲内にあるとみなされた。四重アッセイからのデータを血液コントロールに対してプロットする。エラーバーは、データの範囲を表す。図8Dは、治療前及び治療後の生検におけるSMO変異の有病率を示す棒グラフである。棒グラフは、ピロシーケンスによって決定される、PT09(8D)についてのSMO−V321Mに相当する位置での野生型(青)又は変異型(赤)ヌクレオチドの取り込み頻度を示す。SMO変異はヘテロ接合性であることが予期され、SMOのコピー数は、最大Y軸値を決めることに留意されたい。このコピー数は、PT03、PT04、PT12、PT10及びPT11のために50%であり(SMOコピー数は2である)、PT09については25%である(SMOコピー数は4である)。変異型ヌクレオチドの取り込みは、全ての治療前サンプルにおけるピロシーケンスアッセイのバックグラウンドレベル(<5%)の範囲内にあるとみなされた。四重アッセイからのデータを血液コントロールに対してプロットする。エラーバーは、データの範囲を表す。
図8Eは、治療前及び治療後の生検におけるSMO変異の有病率を示す棒グラフである。棒グラフは、ピロシーケンスによって決定される、PT11(8E)についてのSMO−L412Fに相当する位置での野生型(青)又は変異型(赤)ヌクレオチドの取り込み頻度を示す。SMO変異はヘテロ接合性であることが予期され、SMOのコピー数は、最大Y軸値を決めることに留意されたい。このコピー数は、PT03、PT04、PT12、PT10及びPT11のために50%であり(SMOコピー数は2である)、PT09については25%である(SMOコピー数は4である)。変異型ヌクレオチドの取り込みは、全ての治療前サンプルにおけるピロシーケンスアッセイのバックグラウンドレベル(<5%)の範囲内にあるとみなされた。四重アッセイからのデータを血液コントロールに対してプロットする。エラーバーは、データの範囲を表す。図8Fは、初期にビスモデギブに対して応答したが、その後示された期間後に再発したPT11からの局所的に進行したBCC(白矢印)の写真を示す。
図9は、SMOのタンパク質ドメイン内における治療未経験BCC(薄い灰色‐S278I)、耐性BCC(黒)又は両方(薄い灰色−L412F、W535L)で同定された変異の位置を示す概略図である。アスタリスクは、以前に報告された発癌性変異を強調するものである。TMヘリックスは、円筒によって表される。
図10Aは、SMO(灰色)に結合する結合ビスモデギブ(黄色)のトップダウン図を示し、かつ、薬剤結合ポケットにW281、V321及びI408(全て緑色)が近いこと明らかにする計算ドッキングモデルを示す。図10Bの左は、ビスモデギブ(黄色)を基準にしたV321及びW281(両方とも緑色)の位置を示す。図10Bの中央は、PT02からのC281変異体がおそらくビスモデギブとの相互作用破壊することを示す。図10Bの右は、PT09からのM321変異体がW281の立体構造に影響を与えることが予期されることを示す。図10Cは、I408(左)からバリン(右)への変異がH470及びV404(これらは両方はビスモデギブと相互作用する)のパッキングに影響を与えることが予測されることを示す。この変異は、全体のタンパク質骨格構造のさらに大きな変化を引き起こし、ひいては第2シェル効果により薬剤結合中に影響を及ぼす場合がある。全てのパネルにおいて、変異残留物を赤字で強調している。
図11Aは、示されたSMO構築物トランスフェクトしたC3H10T1/2細胞におけるGliルシフェラーゼレポーター活性を示すグラフである。値はSMO−WTの活性に対して正規化されたものであり、プロットしたデータは、3回の平均値±SDである。図11Bは、示されたPTCH1対SMO発現構築物比でトランスフェクトされたC3H10T1/2細胞におけるGliルシフェラーゼレポーター活性を示すグラフである。値はPTCH1共トランスフェクションなしの活性に対して正規化されたものであり、プロットしたデータは、3回の平均値±SDである。
図11Cは、HEK−293細胞内におけるSMO薬剤結合ポケット変異体の細胞表面発現を示す表である。示された値は、10000個の細胞の事象について及び空ベクタートランスフェクト細胞及びヨウ化プロピジウム(PI)でゲートしてFACSによって決定されるときのSMOの細胞表面発現を有する生存細胞パーセンテージである。図11Dは、SHHと共に又はSHHなしで培養された非形質導入ウイルスなし)、コントロールウイルス(tRFPのみ)又はCreウイルス(tRFP−IRES−eGFPcre)感染患者の小脳顆粒ニューロン前駆細胞メチル−[3H]−チミジン取り込みからの結果を示すグラフである。メチル−[3H]−チミジン取り込みを、1分当たりのカウントで表し(CPM)、そしてプロットされたデータは3回の平均値±のSDである。
図11Eは、10000万個の細胞事象について及び非形質細胞でゲートしてFACSにより決定される、示されたウイルス構築物による感染後にtdTomatoの発現について陽性であるPtch1loxp/loxP Tp53loxp/loxP Rosa26LSL−tdTomato(PPT)小脳顆粒ニューロン前駆細胞(CGNP)のパーセンテージを示す棒グラフである。図11Fは、定量的RTPCRによってパネルEからのPPT CGNPにおけるヒトSMOmRNAレベルの定量化を示す棒グラフである。データは、マウスハウスキーピング遺伝子RPL19に対する2ΔCt値であり、3回の平均±SDとしてプロットされる。
図12Aは、ビスモデギブによる用量応答後における、SMO構築物がトランスフェクトされたC3H10T1/2細胞における正規化Gliルシフェラーゼレポーター活性を示すグラフである。値は、未処理の活性に対して正規化され、プロットしたデータは、3回の平均値±標準偏差(SD)である。IC50値は、非線形回帰フィッティング後に算出された。図12Bは、示されたMO構築物がトランスフェクトされたHEK−293細胞へのビスモデギブ−[3H]の結合を示す棒グラフである。EVは、空のベクターを意味し、薬剤結合を1分当たりカウント測定した(cpm)。特異的結合を、全結合から非特異的結合を減算することにより、過剰量での非標識ビスモデギブとの拮抗後に算出した。示したデータは、平均値±SDである。
図12Cは、一次CGNPのウイルス形質導入スキームを示す図である。SHHの不在下では形質導入CGNPのみが増殖し、これにより、SMO変異体がビスモデギブの存在下での増殖を促進する能力を具体的に試験することが可能となる。
図12Dは、SHHリガンド除去後のビスモデギブによる用量応答の後における、示されたウイルスがトランスフェクトされたPPT CGNPの正規化メチル−[3H]−チミジンの取り込みを示す一連のグラフである。各グラフは、同じコントロールデータを示す。プロットされたデータは、3回の平均値±SDである。
図13Aは、21残基(濃い灰色の球形)の合計がSMO TM構造(灰色ヘリックス)に結合したビスモデギブ(薄い灰色の球形)の4.5Å内に原子を有することが予測されることを示すモデルである。図13Bは、N219、D384及びS387が水素結合ネットワーク破線)を形成することを示すモデルである。これらの残基のいずれかの変異は、ビスモデギブ結合ポケットの形状を変化させる可能性がある。図13Cは、示されたSMO構築物がトランスフェクトされかつ1μMのビスモデギブで処理されたC3H10T1/2細胞におけるGli−ルシフェラーゼレポーター活性を示す。値は、各構築物について未処理の活動レベルに正規化されたものであり、プロットされたデータは3回の平均±SDである。
図14Aは、SMO TM領域(灰色のらせん、Wang外,2013)の結晶構造にドッキングされたビスモデギブ(薄い灰色の球形)の計算モデルを示す。薬剤結合ポケットに対して遠位変異体残基は濃い灰色で強調されている。図14Bは、示されたSMO構築物がトランスフェクトされたC3H10T1/2細胞におけるGliルシフェラーゼレポーター活性の結果を示す棒グラフである。値はSMO−WTの活性レベルに対して正規化されたものであり、プロットされたデータは3回の平均値±SDである。
図15Aは、ビスモデギブによる用量応答後における、示されたSMO構築物をトランスフェクトしたC3H10T1/2細胞における正規化Gliルシフェラーゼレポーター活性を示すグラフである。プロットされたデータは、3回の平均値±SDである。図15Bは、示されたSMO構築物をトランスフェクトしたHEK−293細胞への[3H]−ビスモデギブの結合を示す棒グラフである。非トランスフェクト細胞(UN)及び空ベクター(EV)がトランスフェクトされた細胞をコントロールとして含めた。薬剤結合を1分当たりのカウント(cpm)で測定し、そして特異的結合を、総結合から非特異的結合を引くことにより、過剰の非標識ビスモデギブの競合後に算出した。
図15Cは、HEK−293細胞における活性化SMO変異体の細胞表面発現を示す表である。示される値は、10000個の細胞事象についてのFACS及び空ベクタートランスフェクト細胞及びPIでのゲート化によって決定されるときのSMOの細胞表面発現を有する生存細胞のパーセンテージである。
図15Dは、SHHリガンドを除去した後のビスモデギブによる用量応答後における、示されたウイルスがトランスフェクトされたPPT CGNPの正規化メチル−[3H]−チミジン取り込みを示すグラフである。プロットされたデータは、3回の平均値±SDである。2回の独立した実験を示す。
図16Aは、様々なSMO変異体がトランスフェクトされかつ示された化合物500nMで処理されたPPT CGNPの正規化メチル−[3H]−チミジン取り込みを示す。評価した各野生型(WT)又はSMO変異体のデータのセットについて、次の処理条件のそれぞれのデータを左から右に次の順序でバーとして示す:ビスモデギブ、LY2940680、LDE225及び化合物5。値を、薬剤なしの増殖レベルに正規化し、プロットされたデータは、3回の平均値±SDである。薬剤の存在下でのSMO−WTの残留増殖は、これらの一次CGNP培養の線維芽細胞及びグリア汚染によるものであることに留意されたい。
図16Bは、図16Aと同じデータを示すが、ただし、導入CGNPをビスモデギブ又はJQ1のいずれかの1μMで処理した。JQ1を有するSMO−WTでは、残留増殖が少ないが、これは、この化合物もHh非依存性細胞増殖を阻害することを示唆することに留意されたい。

0085

詳細な説明
ヘッジホッグ依存性腫瘍のための化学療法に対する耐性に関連する変異事象が、シクロパミン及びGDC−0449などのヘッジホッグシグナル伝達を阻害する化合物による治療に対する腫瘍の耐性を与える平滑化(SMO)で生じることが本発明の発見である。本発明は、ヘッジホッグシグナル伝達に依存する癌についての予後、診断及び治療薬として有用な組成物及び方法を提供する。

0086

ここで説明する又は参照する技術及び手順は、一般的によく理解されており、かつ、当業者により従来の方法、例えば次に記載された広く利用されている方法を用いて一般的に使用される:Sambrook外,Molecular Cloning:A Laboratory Manual 第3版(2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.;Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel,外著,(2003));the series Methodsin Enzymology(Academic Press,Inc.):PCR2:A Practical Approach(M.J.MacPherson,B.D.Hames及びG.R.Taylor著(1995)),Harlow及びLane著,(1988)Antibodies,A Laboratory Manual,and Animal Cell Culture(R.I.Freshney著,(1987));Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait著,1984);Methods in Molecular Biology,Humana Press;Cell Biology:A Laboratory Notebook(J.E.Cellis著,1998)Academic Press;Animal Cell Culture(R.I.Freshney)著,1987);Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather及びP.E.Roberts,1998)Plenum Press;Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths及びD.G.Newell著,1993−8)J.Wiley and Sons;Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir及びC.C.Blackwell著.);Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller及びM.P.Calos著,1987);PCR:The Polymerase Chain Reaction,(Mullis外著,1994);Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan外著,1991);Short Protocols in Molecular Biology(Wiley and Sons,1999);Immunobiology(C.A.Janeway及びP.Travers,1997);Antibodies(P.Finch,1997);Antibodies:A Practical Approach(D.Catty.著,IRL Press,1988−1989);Monoclonal Antibodies:A Practical Approach(P.Shepherd及びC.Dean著,Oxford University Press,2000);Using Antibodies:A Laboratory Manual(E.Harlow及びD.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999);The Antibodies(M.Zanetti and J.D.Capra著,Harwood Academic Publishers,1995);並びにCancer:Principles and Practice of Oncology(V.T.DeVita外著,J.B.Lippincott Company,1993)。引用した参考文献は、その全体が参考として援用される。

0087

本明細書を解釈する目的のために、次の定義が適用され、適宜、単数形で使用される用語は複数形を含み、その逆も同様である。以下に示す任意の定義が参照により援用される任意の刊行物矛盾する場合には、以下に示す定義が優先するものとする。

0088

本発明をさらに詳細な説明を継続する前に、本発明は、特定の組成物又はプロセス工程に限定されず、それ自体変更可能であると解すべきである。本明細書及び特許請求の範囲で使用するときに、単数形の「a」、「an」及び「the」は、文脈が明確に指示しない限り、複数の対象を含むことに留意しなければならない。

0089

特に定義しない限り、ここで使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が関連する技術分野の当業が一般的に理解するのと同じ意味を有する。例えば、the Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology,Juo,Pei−Show,2nd ed.,2002,CRCPress;The Dictionary of Cell and Molecular Biology,第3版,1999,Academic Press;and the Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology,Revised,2000,Oxford University Pressは本発明で使用される用語の多くの一般的な辞書となる。

0090

アミノ酸は、ここでは、それらの一般に知られている3文字記号によって又はIUPAC−IUB生化学命名法委員会によって推奨される1文字記号によって言及する場合がある。同様に、ヌクレオチドは、一般的に受け入れられている1文字コードにより言及する場合がある。

0091

ここで、ここで使用されるときに、「及び/又は」は、他のものと共に又は他のものなしに2つの特定の特徴又は成分のそれぞれの特定の開示として解釈すべきことを指摘することが好都合である。「A及び/又はB」は、例えば、それぞれが個別に本明細書に記載されているかのように、(i)A、(ii)B並びに(iii)A及びBのそれぞれの特定の開示であると解釈すべきである。

0092

用語「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は、アミノ酸残基重合体をいうために本明細書において区別なく使用される。これらの用語は、1種以上のアミノ酸残基が対応する天然型アミノ酸人工化学的模倣体並びに天然アミノ酸重合体及び非天然アミノ酸重合体であるアミノ酸重合体に適用される。本明細書で使用するときに、用語「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」には、少なくとも、ここに記載される変異型SMOタンパク質、その変異体又はそのフラグメントのいずれかが包含される。

0093

ここで、用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、かつ、具体的には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも2種のインタクトな抗体から形成される多重特異性抗体(例えば二重特異性抗体)及び抗体フラグメントカバーするが、ただし、これらのものが所望の生物学的活性を示す場合に限る。

0094

「単離」抗体とは、その自然環境の成分から同定されかつ分離され及び/又は回収されたものである。その自然環境の汚染成分は、抗体についての研究、診断又は治療用途を妨害するであろう物質であり、酵素ホルモン及び他のタンパク質様又は非タンパク質溶質を挙げることができる。いくつかの態様では、抗体は、例えば、ローリー法で決定されるときに、(1)抗体の95重量%超まで、いくつかの実施形態では、99重量%超まで精製され;(2)例えば、スピニングカップシークエネーターの使用によってN末端又は内部アミノ酸配列の少なくとも15残基を得るのに十分な程度にまで精製され、或いは(3)例えば、クマシーブルー又は銀染色を使用して還元又は非還元条件下でのSDS−PAGEにより均一になるまで精製される。単離抗体は、組換え細胞内におけるin situ抗体を含む。というのは、抗体の自然環境の少なくとも1種成分は存在しないからである。しかしながら、通常は、単離抗体は少なくとも1回の精製工程により調製される。

0095

天然抗体」は、通常、2個の同一の軽(L)鎖及び2個の同一の重(H)鎖から構成される約150,000ダルトンヘテロ四量体糖タンパク質である。それぞれの軽鎖は、1個の共有ジスルフィド結合によって重鎖に結合しているが、ジスルフィド結合の数は異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で異なる。また、各重鎖及び軽鎖は、規則的に間隔の開いた鎖内ジスルフィド架橋を有する。各重鎖は、一方の末端可変ドメイン(VH)を有し、それに多数の定常ドメインが続く。各軽鎖は、一方の末端に可変ドメイン(VL)及び他方の末端に定常ドメインを有する;軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一定常ドメインと整列し、軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列する。特定のアミノ酸残基が、軽鎖と重鎖可変ドメインと間の境界を形成すると考えられている。

0096

抗体の「可変領域」又は「可変ドメイン」とは、抗体の重鎖又は軽鎖のアミノ末端ドメインをいう。重鎖の可変ドメインを「VH」ということができる。軽鎖の可変ドメインを「VL」ということができる。これらのドメインは、一般に抗体の最も可変的な部分であり、かつ、抗原結合部位を含む。

0097

用語「可変」とは、可変ドメインの所定の部分が抗体間において配列の点で広範囲に異なり、かつ、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合及び特異性の点で使用されることを意味する。しかし、可変性は抗体の可変ドメイン全体にわたって均一に分布しているわけではない。このものは、軽鎖及び重鎖可変ドメインの両方において高頻度可変領域HVR)と呼ばれる3つのセグメントに集中している。可変ドメインのさらに高度に保存された部分はフレームワーク領域(FR)と呼ばれる。天然重鎖及び軽鎖可変ドメインは、それぞれ、βシート構造の一部を連結する、場合によってはループを形成する3つのHVRにより結合した、大きくβシート構造を採用する4つのFR領域を含む。各鎖内におけるHVRは、FR領域によって近接して共に保持され、かつ、他の鎖からのHVRと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する(Kabat外,Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,National Institute of Health,Bethesda,MD(1991))。定常ドメインは、抗体の抗原への結合には直接関与しないが、抗体依存性細胞毒性における抗体の関与といった様々なエフェクター機能を発揮する。

0098

任意の脊椎動物種からの抗体(免疫グロブリン)の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパκ)及びラムダ(λ)と呼ばれる2つの明確に異なるタイプの一方に分類できる。

0099

それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、抗体(免疫グロブリン)は異なるクラスに分類できる。免疫グロブリンの5つの主要なクラス:IgAIgDIgEIgG及びIgMが存在し、これらのいくつかは、サブクラス(アイソタイプ)、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及びIgA2に分割できる。免疫グロブリンの異なるクラスに相当する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ及びμと呼ばれる。免疫グロブリンのサブユニット構造及び異なるクラスの三次元構造は周知であり、一般に、例えば、Abbas外.Cellular and Mol.Immunology,第4版.(W.B.Saunders,Co.,2000)に記載されている。抗体は、抗体と1種以上の他のタンパク質又はペプチドとの共有結合又は非共有結合によって形成される大きな融合分子の一部であることができる。

0100

ここでは、用語「完全長抗体」、「インタクトな抗体」及び「全抗体」は、その実質的に無傷の形態の抗体をいうために区別なく使用され、以下に定義される抗体フラグメントをいうものではない。これらの用語は、特にFc領域を含む重鎖を有する抗体を指す。

0101

本明細書の目的上、「の抗体」とは、細胞傷害性部分又は放射性標識には結合していない抗体のことである。

0102

「抗体フラグメント」は、インタクトな抗体の一部を含み、いくつかの実施形態では、その抗原結合領域を含む。抗体フラグメントの例としては、Fab、Fab’、F(ab’)2及びFvフラグメント;ダイアボディ;直鎖状抗体;単鎖抗体分子;及び抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体が挙げられる。

0103

抗体のパパイン消化により、2つの同一の抗原結合フラグメントを、それぞれ単一の抗原結合部位を有する「Fab」フラグメント及び残りの「Fc」フラグメントが生じ、それらの名称は、容易に結晶化するその能力を反映している。ペプシン処理により、2つの抗原結合部位を有し、かつ、依然として抗原を架橋することが可能なF(ab’)2フラグメントが生じる。

0104

「Fv」は、完全な抗原結合部位を含む最小の抗体フラグメントである。一実施形態では、二本鎖Fv種は、堅固な非共有結合での1個の重鎖と1個の軽鎖可変ドメインとの二量体からなる。単鎖Fv(scFv)種では、1本の重鎖及び1本の軽鎖可変ドメインは、柔軟なペプチドリンカーによって共有結合でき、それによって軽鎖及び重鎖は、2本鎖Fv種と類似の「二量体」構造に会合できる。それは、この配置では、各可変ドメインの3つのHVRは、VH−VL二量体の表面に抗原結合部位を決定するように相互作用する。集合的に、6個のHVRが抗体に対する抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン(又は抗原に特異的な3個のみのHVRを含むFvの半分)であっても、抗原を認識しかつ結合させる能力を有するが、ただし結合部位全体よりも低い親和性である。

0105

Fabフラグメントは、重鎖及び軽鎖可変ドメインを含み、また軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第一定常ドメイン(CH1)を含む。Fab’フラグメントは、抗体ヒンジ領域からの1個以上のシステインを含む重鎖CH1ドメインのカルボキシ末端での数個の残基の付加によりFabフラグメントとは相違する。ここで、Fab’−SHは、定常ドメインのシステイン残基遊離チオール基を有するFab’に対する命名である。F(ab’)2抗体フラグメントは、元々、間にヒンジシステインを有するFab’フラグメントの対として生成された。抗体フラグメントの他の化学結合も知られている。

0106

「単鎖Fv」又は「scFv」抗体フラグメントは、抗体のVH及びVLドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。一般に、scFvポリペプチドは、VHドメインとVLドメインと間に、scFvが抗原結合のための所望の構造を形成するのを可能にするポリペプチドリンカーを含む。scFvの概説については、例えば、Pluckthun,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,(Springer−Verlag,New York,1994),pp.269−315を参照されたい。

0107

用語「ダイアボディ」は、2個の抗原結合部位を有する抗体フラグメントであって、そのフラグメントが同じポリペプチド鎖(VH−VL)内における軽鎖可変ドメイン(VL)に結合した重鎖可変ドメイン(VH)を含むものをいう。同じ鎖上にある2つのドメイン間での対形成を可能にする非常に短いリンカーを使用することにより、これらのドメインは、別の鎖の相補的ドメインと対形成し、かつ、2つの抗原結合部位を創り出す。ダイアボディは、二価又は二重特異性であることができる。ダイアボディは、より完全には、例えば、EP404097;WO1993/01161;Hudson外,Nat.Med.9:129−134(2003);及びHollinger外,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444−6448(1993)。また、トリアディ及びテトラボディも、Hudson外,Nat.Med.9:129−134(2003)に記載されている。

0108

本明細書で使用するときに、用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体をいう、すなわち、集団を構成する個々の抗体が可能な変異、例えば少量で存在する場合のある天然型変異を除いて同一である。したがって、修飾語モノクローナル」は、抗体の特徴を別個の抗体の混合物ではないものと示す。所定の実施形態では、このようなモノクローナル抗体は、典型的には、標的を結合させるポリペプチド配列を含む抗体を含み、その際、該標的に結合するポリペプチド配列は、複数のポリペプチド配列からの単一の標的結合の選択を含む方法によって得られた。例えば、選択プロセスは、ハイブリドーマクローンファージクローン又は組換えDNAクローンプールといった、複数のクローンからの独特のクローンの選択であることができる。選択された標的結合配列をさらに変更して、例えば、標的に対する親和性を改善させ、標的結合配列をヒト化し、細胞培養におけるその産生を改善し、生体内でのその免疫原性を低減させ、多重特異性抗体を生成すること、そして改変された標的結合配列を含む抗体もこの開示のモノクローナル抗体であることを理解すべきである。典型的には異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に対するものである。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体調製物は、それらのものが典型的には他の免疫グロブリンによって汚染されないという点で有利である。

0109

修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるべきモノクローナル抗体は、例えばハイブリドーマ法(例えばKohler及びMilstein,Nature,256:495−97(1975);Hongo外,Hybridoma,14(3):253−260(1995),Harlow外,Antibodies:A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,2nd ed.1988);Hammerling外,:Monoclonal Antibodies and T−Cell Hybridomas 563−681(Elsevier,N.Y.,1981)),recombinant DNA methods(例えば米国特許第4,816,567号),phage−display technologies(例えばClackson外,Nature,352:624−628(1991);Marks外,J.Mol.Biol.222:581−597(1992);Sidhu外,J.Mol.Biol.338(2):299−310(2004);Lee外,J.Mol.Biol.340(5):1073−1093(2004);Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467−12472(2004);及びLee外,J.Immunol.Methods 284(1−2):119−132(2004)並びにヒト免疫グロブリン遺伝子座又はヒト免疫グロブリン配列をコード遺伝子の一部又は全てを有する動物においてヒト又はヒト様抗体を産生するための技術を含めた様々な技術(例えばWO1998/24893;WO1996/34096;WO1996/33735;WO1991/10741;Jakobovits外,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2551(1993);Jakobovits外,Nature 362:255−258(1993);Bruggemann外,Year in Immunol.7:33(1993);U.S.Patent Nos.5,545,807;5,545,806;5,569,825;5,625,126;5,633,425;and 5,661,016;Marks外,Bio/Technology 10:779−783(1992);Lonberg外,Nature 368:856−859(1994);Morrison,Nature 368:812−813(1994);Fishwild外,Nature Biotechnol.14:845−851(1996);Neuberger,Nature Biotechnol.14:826(1996);及びLonberg and Huszar,Intern.Rev.Immunol.13:65−93(1995)によって作製できる。

0110

ここで、モノクローナル抗体には、特に「キメラ」抗体が含まれる。重鎖及び/又は軽鎖の一部が特定の種に由来する又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体の対応配列と同一又は相同である一方で、鎖の残りは別の種に由来する又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体の対応配列並びにこのような抗体のフラグメントと同一又は相同であるが、ただし、それらのものが所望の生物活性を示す場合に限る(例えば、米国特許第4,816,567号;及びMorrison外,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851−6855(1984))。キメラ抗体としては、PRIATIZED(登録商標)抗体が挙げられる。抗体の抗原結合領域が、例えば目的の抗原でマカクザル免疫化することによって産生される抗体に由来する。

0111

非ヒト(例えば、マウス)抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。一実施形態では、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)であり、ここで、該レシピエントのHVR由来の残基は、マウス、ラットウサギ又は所望の特異性、親和性及び/又は能力を有する非ヒト霊長類などの非ヒト種(ドナー抗体)のHVR由来の残基によって置換されている。いくつかの例では、ヒト免疫グロブリンのFR残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見出されない残基を含むことができる。これらの修飾は、抗体性能をさらにさらに改良するために行うことができる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質的に全てを含み、その際、超可変ループの全て又は実質的に全ては、非ヒト免疫グロブリンのものに相当し、そしてFRの全て又は実質的に全てはヒト免疫グロブリン配列のものである。また、ヒト化抗体は、任意に、免疫グロブリン定常領域(Fc)、典型的にはヒト免疫グロブリンのそれの少なくとも一部も含む。詳細については、Jones外,Nature 321:522−525(1986);Riechmann外,Nature 332:323−329(1988);及びPresta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593−596(1992)参照。また、例えばVaswani and Hamilton,Ann.Allergy,Asthma & Immunol.1:105−115(1998);Harris,Biochem.Soc.Transactions 23:1035−1038(1995);Hurle and Gross,Curr.Op.Biotech.5:428−433(1994);並びに米国特許第6,982,321号及び同7,087,409号参照。

0112

ヒト抗体」は、ヒトによって産生される抗体のアミノ酸配列に相当する及び/又はここに開示されるヒト抗体を作製するための技術のいずれかを使用して作製されたアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、特に非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を除外する。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーを含めた当該技術分野において公知の様々な技術を使用して生成できる。Hoogenboom and Winter,J.Mol.Biol.,227:381(1991);Marks外,J.Mol.Biol.,222:581(1991)。また、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用できるのは、Cole外,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,p.77(1985);Boerner外,J.Immunol.,147(1):86−95(1991)に記載された方法である。また、van Dijk and van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.,5:368−74(2001)も参照されたい。ヒト抗体は、抗原チャレンジに応答してこのような抗体を産生するように改変されているが、ただしその内因性遺伝子座が無効になっているトランスジェニック動物、例えば免疫ゼノマウスに抗原を投与することにより調製できる(例えば、XENOMOUSE(商標)技術に関しては米国特許第6075181号及び同6150584号を参照)。例えば、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術により生成されたヒト抗体についてはLi外,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557−3562(2006)も参照されたい。

0113

本明細書で使用されるときに、用語「超可変領域」、「HVR」又は「HV」は、配列において高頻度可変であり及び/又は構造的に定まったループを形成する抗体可変ドメインの領域をいう。一般に、抗体は、6個のHVRを含み;VHにおいて3つ(H1、H2、H3)及びVL(L1、L2、L3)において3つ。ネイティブ抗体では、H3及びL3は、6つのHVRの最多様性を示し、特にH3は、抗体に良好な特異性を与える際に独自の役割を果たしていると考えられる。例えば、Xu外,Immunity 13:37−45(2000);Johnson and Wu,Methodsin Molecular Biology 248:1−25(Lo著,Human Press,Totowa,NJ,2003)参照。実際、重鎖からなる天然型ラクダ抗体のみが軽鎖の非存在下で機能的かつ安定である。例えば、Hamers−Casterman外,Nature 363:446−448(1993);Sheriff外,Nature Struct.Biol.3:733−736(1996)参照。多数のHVRの描写の数が使用されており、かつ、ここに含まれる。カバット相補性決定領域(CDR)は配列可変性に基づいており、最も一般的に使用されている(Kabat外,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))。コチアは構造的ループの場所に代わりに言及している(Chothia及びLesk J.Mol.Biol.196:901−917(1987))。AbmのHVRは、KabatのHVRとChothiaの構造的ループとの間の妥協を表し、かつ、Oxford MolecularのAbM抗体モデリングソフトウェアにより使用されている。「接触」HVRは、利用可能な複合体結晶構造の分析に基づく。これらのHVRのそれぞれからの残基を以下に示す。

0114

ループC 接触
−−−− −−−−−−−−
L1LLL L30−L36
L2 LLL L46−L55
L3 LLL L89−L96
H1 H31−H35B H26−H35B H H30(Kabat番号付け
H1 HHH H30(Chothia番号付け)
H2 HHH H47−H58
H3 H95−H102 H95−H102 H9 H93−H101

0115

HVRは、次のように「拡張HVR」を含むことができる。VLにおける24−36又は24−34(L1)、46−56又は50−56(L2)及び89−97又は89−96(L3)及びVHにおける26−35(H1)、50−65又は49−65(H2)及び93−102、94−102又は95−102(H3)。可変ドメイン残基は、これらの定義のそれぞれについてKabat外(前出)に従って番号が付けられている。

0116

「フレームワーク」又は「FR」残基とは、ここに定義されるようなHVR残基以外の可変ドメイン残基である。

0117

用語「Kabatにおける可変ドメイン残基番号付け」又は「Kabatのようなアミノ酸位置番号付け」及びそれらの変形は、Kabat外(前出)における抗体の編集の重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインのために使用される番号付けシステムをいう。この番号付けシステムを使用して、実際の直鎖アミノ酸配列は、可変ドメインのFR若しくはHVRの短縮又はそれへの挿入に相当する、より少ない又は追加のアミノ酸を含有することができる。例えば、重鎖可変ドメインは、H2の残基52の後に単一のアミノ酸挿入(Kabatに従って残基52a)及び重鎖FR残基82の後に挿入残基(例えばKabatに従って残基82a、82b及び82cなど)を含むことができる。残基のKabat番号付けは、配列の相同領域で、抗体と「基準」カバット番号付け配列とをアライメントすることによって所定の抗体について決定できる。Kabat番号付けシステムは、可変ドメイン内の残基に言及するときに一般に使用される(おおよそ軽鎖の残基1−107及び重鎖の残基1−113)(例えば、Kabat外,Sequences of Immunological Interest.第5版.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。「EU番号付けシステム」又は「EUインデックス」は、免疫グロブリン重鎖定常領域内の残基に言及するときに一般に使用される(例えば、Kabat外前出で報告されたEUインデックス)。

0118

「親和性成熟」抗体とは、その1個以上のHVRに1以上の変化を有するものであり、これは、該変化を有しない親抗体と比較して抗原に対する抗体の親和性の改善をもたらす。一実施形態では、親和性成熟抗体は、標的抗原に対してナノモル又はさらにはピコモルの親和性を有する。親和性成熟抗体は、当該技術分野で知られている所定の手順を使用して生成できる。例えば、Marks外,Bio/Technology 10:779−783(1992)には、VH及びVLドメインシャッフリングによる親和性成熟が記載されている。HVR及び/又はフレームワーク残基のランダム突然変異誘発は、例えば、に記載されている。Barbas外.Proc Nat.Acad.Sci.USA 91:3809−3813(1994);Schier外.Gene 169:147−155(1995);Yelton外.J.Immunol.155:1994−2004(1995);Jackson外.,J.Immunol.154(7):3310−9(1995);及びHawkins外,J.Mol.Biol.226:889−896(1992)に記載されている。

0119

ブロッキング」抗体又は「アンタゴニスト」抗体とは、それが結合する抗原の生物学的活性を阻害又は減少させるものである。所定のブロッキング抗体又はアンタゴニスト抗体は、抗原の生物学的活性を実質的に又は完全に阻害する。

0120

本明細書で使用するときに、「アゴニスト抗体」は、目的のポリペプチドの機能的活性の少なくとも1つを部分的に又は完全に模倣する抗体である。

0121

成長阻害」抗体とは、抗体が結合する抗原を発現する細胞の増殖を阻害又は減少させるものである。例えば、抗体は、Smo又は変異体を試験管内又は生体内で発現させる癌細胞の増殖を阻害又は減少させることができる。

0122

アポトーシス誘導する」抗体とは、アネキシンVの結合、DNAのフラグメント化、細胞収縮小胞体の拡張、細胞フラグメント化及び/又は膜小胞(アポトーシス小体と呼ばれる)の形成といった標準的なアポトーシスアッセイにより決定されるようなプログラム細胞死を誘導するものである。

0123

抗体の「エフェクター機能」とは、抗体のFc領域(天然配列のFc領域又はアミノ酸配列変異Fc領域)に起因する生物学的活性をいい、抗体アイソタイプにより変わる。抗体エフェクター機能の例としては、C1q結合及び補体依存性細胞傷害(CDC);Fc受容体結合;抗体依存性細胞仲介細胞傷害ADCC);食作用細胞表面受容体(例えば、B細胞受容体)の下方調節;及びB細胞の活性化が挙げられる。

0124

本明細書において、用語「Fc領域」は、天然配列Fc領域及び変異体Fc領域を含めて、免疫グロブリン重鎖C末端領域を定義するために使用される。免疫グロブリン重鎖のFc領域の境界は異なる場合があるが、ヒトIgG重鎖Fc領域は、通常、Cys226位のアミノ酸残基から又はPro230からカルボキシル末端にまで伸長するように定義される。Fc領域のC末端リジン(EU番号付けシステムに係る残基447)は、例えば、抗体の産生又は精製中に又は組換え抗体の重鎖をコードする核酸を操作することによって除去できる。したがって、インタクトな抗体の組成物は、全てのK447残基が除去された抗体集団、K447残基が除去されていない抗体集団及びK447残基を有する抗体と該残基を有しない抗体との混合物を有する抗体集団を含むことができる。

0125

「機能的Fc領域」は、天然配列Fc領域の「エフェクター機能」を有する。代表的な「エフェクター機能」としては、C1q結合;CDC;Fc受容体結合;ADCC;食作用;細胞表面受容体(例えばB細胞受容体;BCR)のダウンレギュレーションなどが挙げられる。このようなエフェクター機能は、一般に、結合ドメイン(例えば、抗体可変ドメイン)と結合するFc領域を必要とし、例えば本明細書における定義で開示されているような様々なアッセイを使用して評価できる。

0126

「天然配列Fc領域」は、天然に見出されるFc領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。天然配列ヒトFc領域としては、天然配列ヒトIgG1のFc領域(非A及びAアロタイプ);天然配列ヒトIgG2のFc領域;天然配列ヒトIgG3のFc領域;及び天然配列のヒトIgG4のFc領域並びにそれらの天然型変異体が挙げられる。

0127

変異型Fc領域」とは、少なくとも1つのアミノ酸修飾、いくつかの実施形態では1つ以上のアミノ酸置換によって天然配列Fc領域とは相違するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異型Fc領域は、天然配列Fc領域又は親ポリペプチドのFc領域と比較して少なくとも1つのアミノ酸置換、例えば天然配列Fc領域又は親ポリペプチドのFc領域において約1〜約10のアミノ酸置換、いくつかの実施形態では約1〜約5のアミノ酸置換を有する。変異型Fc領域は、本明細書のいくつかの実施形態では、天然配列Fc領域及び/又は親ポリペプチドのFc領域と少なくとも約80%の相同性、いくつかの実施形態ではそれと少なくとも約90%の相同性、いくつかの実施形態ではそれと少なくとも約95%の相同性を有する。

0128

「Fc受容体」又は「FcR」は、抗体のFc領域に結合する受容体を説明する。いくつかの実施形態では、FcRは天然ヒトFcRである。いくつかの実施形態では、FcRは、IgG抗体ガンマ受容体)と結合し、かつ、FcγRI、FcγRII及びFcγRIIIサブクラスの受容体を含むものであり、対立遺伝子変異体及びそれらの受容体の選択的スプライシング型が含まれる。FcγRII受容体としては、主として細胞質ドメインの点で異なる類似のアミノ酸配列を有するFcγRIIA(「活性化受容体」)及びFcγRIIB(「阻害重合体」)が挙げられる。活性化受容体FcγRIIAは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ(ITAM)を含有する。阻害受容体FcγRIIBは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ(ITIM)を含有する(例えば、Daeron、Annu. Rev. Immunol. 15:203−234(1997))。FcRは、例えばRavetch及びKinet,Annu.Rev.Immunol 9:457−92(1991);Capel外,Immunomethods4:25−34(1994);及びde Haas外,J.Lab.Clin.Med.126:330−41(1995)で検討されている。将来的に同定されるべきものを含めて、他のFcRは、本明細書にける用語「FcR」に包含される。

0129

また、用語「Fc受容体」又は「FcR」は、新生児受容体FcRnを含み、これは、母性IgGから胎児への移行(Guyer外,J.Immunol.117:587(1976)及びKim外,J.Immunol.24:249(1994))及び免疫グロブリンの恒常性の調節を担当する。FcRnへの結合を測定する方法が知られている(例えば、Ghetie and Ward.,Immunol.Today 18(12):592−598(1997);Ghetie外,Nature Biotechnology,15(7):637−640(1997);Hinton外,J.Biol.Chem.279(8):6213−6216(2004);WO2004/92219(Hinton外参照)。

0130

生体内でのヒトFcRnへの結合及びヒトFcRn高親和性結合ポリペプチド血清半減期は、例えば、ヒトFcRnを発現するトランスジェニックマウス若しくはトランスフェクトヒト細胞株又は変異型Fc領域を有するポリペプチドが投与された霊長類においてアッセイできる。WO2000/42072(Presta)には、FcRへの結合が改善又は減少した抗体変異体が記載されている。例えば、Shields外.J.Biol.Chem.9(2):6591−6604(2001)も参照。

0131

「ヒトエフェクター細胞」とは、1種以上のFcRを発現し、かつ、エフェクター機能を実行する白血球のことである。所定の実施形態では、細胞は、少なくともFcγRIIIを発現し、ADCCエフェクター機能を実行する。ADCCを仲介するヒト白血球の例としては、末梢血単核細胞(PBMC)、ナチュラルキラー(NK)細胞、単球細胞傷害性T細胞及び好中球が挙げられる。エフェクター細胞は、天然源、例えば血液から単離できる。

0132

「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」又は「ADCC」とは、細胞毒性の形態をいう。所定の細胞傷害性細胞(例えば、NK細胞、好中球、及びマクロファージ)上に存在するFc受容体(のFcR)上に結合した分泌Igがこれらの細胞傷害性エフェクター細胞を抗原保持標的細胞に特異的に結合させ、続いて細胞毒により標的細胞を死滅させるのを可能にする。ADCC、NK細胞を仲介する主要な細胞はFcγRIIIのみを発現するのに対し、単球はFcγRI、FcγRII、及びFcγRIIIを発現する。造血細胞上でのFcR発現は、Ravetch and Kinet,Annu.Rev.Immunol 9:457−92(1991)の第464頁の表3に要約されている。目的の分子のADCC活性を評価するために、例えば、米国特許第5,500,362号若しくは同5,821,337号又は米国特許第6,737,056(Presta)に記載されているような生体内ADCCアッセイを実行してもよい。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞としては、PBMC細胞及びNK細胞が挙げられる。その代わりに又はそれに加えて、目的の分子のADCC活性を、例えば、Clynes外PNAS(USA)95:652−656(1998)に開示されているような動物モデルにおいて生体内で評価してもよい。

0133

「補体依存性細胞障害」又は「CDC」とは、補体の存在下での標的細胞の溶解をいう。従来の補体経路の活性化は、同族抗原に結合している抗体(適切なサブクラスの)に補体系(C1q)の第一成分を結合させることによって開始される。補体活性化を評価するために、例えばGazzano−Santoro外,J.Immunol. Methods202:163(1996)に記載されているようなCDCアッセイを実施することができる。改変Fc領域のアミノ酸配列及び増加若しくは減少したC1q結合能を有するポリペプチド変異体(変異体Fc領域を有するポリペプチド)は、例えば、米国特許第6,194,551号及びWO1999/51642号に記載されている。また、例えばIdusogie外.J.Immunol.164:4178−4184(2000)も参照されたい。

0134

用語「Fc領域含有抗体」とは、Fc領域を含む抗体をいう。Fc領域のC末端リジン(EU番号付けシステムによれば残基447)は、例えば、抗体の精製中又は抗体をコードする核酸の組換え技術によって除去できる。したがって、本発明に係るFc領域を有する抗体を含む組成物は、K447を有する抗体、K447が全て除去された抗体又はK447残基を有する抗体と該残基を有しない抗体との混合物を含むことができる。

0135

結合親和性」とは、一般に、分子(例えば抗体)の単一結合部位とその結合パートナー(例えば抗原)との間の非共有結合的な相互作用の総合的な強さをいう。特に断りのない限り、本明細書で使用するときに、「結合親和性」とは、結合対(例えば抗体と抗原)のメンバー間の1:1の相互作用を反映する固有の結合親和性をいう。パートナーYに対する分子Xの親和性は、一般に、解離定数(Kd)により表すことができる。親和性は、本明細書に記載されたものを含めて、当該技術分野において知られている一般的な方法によって測定できる。低親和性抗体は、一般に抗原にゆっくりと結合し、かつ、容易に解離する傾向があるのに対し、高親和性抗体は、一般にそれよりも速く抗原に結合し、かつ、長く結合した状態が維持される傾向がある。結合親和性を測定する様々な方法が当技術分野で知られており、それらのいずれも本発明の目的のために使用できる。結合親和性を測定するための特定の例示的及び代表的な実施形態を以下に説明する。

0136

一実施形態では、本発明に係る「Kd」又は「Kd値」は、次のアッセイで説明されるように、目的の抗体のFabバージョンとその抗原を用いて実施される放射性標識抗原結合アッセイRIA)によって測定される。抗原に対するFabの溶液結合親和性は、非標識抗原の滴定系列の存在下で、最小濃度の(125I)標識抗原でFabを平衡化し、その後結合した抗原を抗Fab抗体コートプレートで捕捉することによって測定される(例えばChen外,J.Mol.Biol.293:865−881(1999)参照)。アッセイの条件を確立するために、MICROTITER(登録商標)マルチウェルプレートサーモサイエンティフィック社)を、50mM炭酸ナトリウム(pH9.6)中捕獲用抗Fab抗体(CappelLabs)の5μg/mlで一晩被覆し、その後PBS中2%(w/v)ウシ血清アルブミンにより室温で2〜5時間(約23℃)にわたりブロックする。非吸着プレート(Nunc#269620)において、100pM又は26pMの[125I]−抗原を目的のFab連続希釈物と混合する(例えば、Presta外,Cancer Res.57:4593−4599(1997)における抗VEGF抗体Fab−12の評価と一致)。所望のFabを一晩インキュベートする;しかし、このインキュベーションは、平衡に到達するのを確保するためにさらに長期間(例えば、約65時間)継続できる。その後、混合物を室温でインキュベート捕捉プレートに移す(例えば1時間)。次いで、溶液を除去し、そしてプレートをPBS中0.1%TWEEN−20(商標)で8回洗浄する。プレートが乾燥したら、150μL/ウェルシンチラント(MICROSCINT−20(商標);Packard社)を添加し、そしてプレートを10分間TOPCOUNT(商標)ガンマカウンター(Packard社)でカウントする。20%以下の最大結合を与えるそれぞれのFabの濃度を、拮抗結合アッセイで使用するために選択する。

0137

別の実施形態によれば、Kd又はKd値は、固定された抗原CM5チップと共に25℃でBIACORE(登録商標)−2000又はBIACORE(登録商標)−3000(ビアコア社、米国ニュージャージーピスカタウェイ)を使用して表面プラズモン共鳴アッセイを用いて〜10応答単位(RU)で測定される。簡単にいうと、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ(CM5、BIACORE社)を供給者の指示に従ってN−エチル−N’−(3−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩(EDC)及びN−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)で活性化する。抗原を5μL/分の流速注入する前に10mM酢酸ナトリウム、pH4.8で5μg/ml(〜0.2μM)まで希釈して結合タンパク質のおよそ10応答単位(RU)を達成する。抗原の注入後に、1Mエタノールアミンを注入して未反応群をブロックする。動態測定のために、Fabの2倍連続希釈物(0.78nM〜500nM)を約25μl/分の流速で25℃で0.05%TWEEN−20(商標)界面活性剤(PBST)と共にPBSに注入する。会合速度(kon)及び解離速度(koff)を、会合及び解離センサーグラムを同時にフィッティングすることにより、単純な1対1ラングミュア結合モデル(BIACORE(登録商標)評価ソフトウェアバージョン3.2)を使用して算出する。平衡解離定数(Kd)を、比koff/konとして算出する。例えば、Chen外,J.Mol.Biol.293:865−881(1999)参照。on速度が上記表面プラズモン共鳴アッセイにより106M-1s-1を超える場合には、on速度は、分光光度計、例えばストップフロー装備分光光度計(テルアビブインスツルメンツ社)又は撹拌キュベットを有する8000シリーズSLM−AMINCO(商標)分光光度計(ThermoSpectronic社)で測定されるときの増加濃度の抗原の存在下でPBS中pH7.2において25℃で20nMの抗抗原抗体(Fab型)の蛍光発光強度の増加又は減少を測定する(励起=295nm;発光=340nm、16nmバンドパス蛍光消光技術を使用することによって決定できる。

0138

また、本発明に係る「on速度」、「会合の速度」、「会合速度」又は「kon」は、上記のようにBIACORE(登録商標)−2000又はBIACORE(登録商標)−3000システム(ビアコア社、米国ニュージャージー州ピスカタウェイ)を使用して決定できる。

0139

本明細書で使用するときに、用語「実質的に同様」又は「実質的に同一」とは、2つの数値(例えば、本発明の抗体に関連する一方及び基準/比較抗体に関連する他方)間の類似性の程度が十分に高く、そのため、当業者が、該2つの値の間の差が該値(例えば、Kd値)によって測定される生物学的特性の文脈内でほとんど又は全く生物学的及び/又は統計的に有意でないと見なすであろうことをいう。該2つの値間の差は、例えば、基準/比較値に応じて約50%未満、約40%未満、約30%未満、約20%未満及び/又は約10%未満である。

0140

本明細書で使用するときに、用語「実質的に減少」又は「実質的に異なる」とは、2つの数値(一般に分子に関連する一方及び基準/比較分子に関連する他方)間の類似性の程度が十分に高く、そのため、当業者が、該2つの値の間の差が該値(例えば、Kd値)によって測定される生物学的特性の文脈内で統計的に有意なものと見なすであろうことをいう。該2つの値間の差は、例えば、基準/分子に応じて約10%超、約20%超、約30%超、約40%超及び/又は約50%超である。

0141

「精製(された)」とは、分子がサンプル中においてそれが含まれるサンプルの少なくとも95重量%又は少なくとも98重量%の濃度で存在することを意味する。

0142

「単離(された)」核酸分子とは、例えばその天然の環境中において通常関連のある少なくとも1種の他の核酸分子から分離された核酸分子である。単離核酸分子は、通常核酸分子を発現する細胞に含まれる核酸分子をさらに含むが、該核酸分子は、染色体外に存在する又はその天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。

0143

「単離(された)」タンパク質は、例えばその天然の環境中において通常関連する少なくとも1種の他の細胞成分から分離されたタンパク質である。いくつかの実施形態では、「単離」タンパク質は、そのタンパク質が通常は発現されない細胞内で発現したタンパク質である。いくつかの実施形態では、単離タンパク質組換えタンパク質である。

0144

本明細書で使用するときに、用語「ベクター」とは、連結されている別の核酸を輸送できる核酸分子をいうものとする。一つのタイプのベクターは「プラスミド」であり、これは追加のDNAセグメントを連結することができる環状二本鎖DNAをいう。別のタイプのベクターはファージベクターである。別のタイプのベクターは、追加のDNAセグメントをウイルスゲノムに連結することができるウイルスベクターである。所定のベクターは、それらが導入される宿主細胞内で自律複製可能である(例えば、複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター)。他のベクター(例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター)を宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込むことができ、それによって宿主ゲノムと共に複製する。さらに、所定のベクターは、それらが機能的に連結される遺伝子の発現を指示することができる。本明細書においては、このようなベクターを「組換え発現ベクター」又は単に「発現ベクター」という。一般に、組換えDNA技術において有用な発現ベクターは、プラスミド形態の場合が多い。本明細書において、「プラスミド」及び「ベクター」は区別なく使用する場合がある。プラスミドはベクターの最も一般的に使用される形態だからである。

0145

本明細書において区別なく使用される「ポリヌクレオチド」又は「核酸」とは、任意の長さのヌクレオチドの重合体をいい、DNA及びRNAを包含する。いくつかの実施形態では、核酸は、cDNA分子又はそのフラグメントである。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドリボヌクレオチド修飾ヌクレオチド若しくは塩基、及び/又はそれらのアナログ、或いはDNA若しくはRNAポリメラーゼにより又は合成反応により重合体中に組み込むことができる任意の基質とすることができる。ポリヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチド及びそれらのアナログなどを含むことができる。存在する場合には、ヌクレオチド構造に対する修飾は、重合体の形成前又は後に付与できる。ヌクレオチド配列は、非ヌクレオチド成分により中断されていてもよい。ポリヌクレオチドは、標識への結合などの合成後になされる修飾を含むことができる。他のタイプの修飾としては、例えば、アナログによる天然型ヌクレオチドの1種以上の「キャップ」置換、ヌクレオチド内修飾、例えば、非荷電結合を有するもの(例えば、メチルホスホネートホスホトリエステルカルバメートなど)及び荷電結合を有するもの(例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート)、ペンダント部分を含有するもの、例えばタンパク質(例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチドポリ−L−リジンなど)、インターカレーターを有するもの(例えば、アクリジンソラレンなど)、キレート剤を有するもの(例えば、金属、放射性金属ホウ素、酸化金属など)、アルキル化剤を含有するもの、修飾結合を有するもの(例えば、αアノマー核酸など)並びにポリヌクレオチドの未修飾形態が挙げられる。さらに、糖類中に通常存在するヒドロキシル基のいずれかは、例えば、ホスホネート基ホスフェート基によって置換されていてよく、標準的な保護基によって保護されていてよく又は追加のヌクレオチドへのさらなる連結を調製するように活性化されていてよく、又は固体若しくは半固体支持体に結合されていてよい。5’及び3’末端OHは、リン酸化でき又はアミン若しくは1〜20個の炭素原子有機キャッピング基部分で置換できる。また、他のヒドロキシルを標準的な保護基に誘導体化することもできる。また、ポリヌクレオチドは、当該技術分野において一般に知らされているリボース又はデオキシリボース糖のアナログ形態、例えば、2’−O−メチル−、2’−O−アリル−、2’−フルオロ−又は2’−アジドリボース、炭素環式糖アナログ、α−アノマー糖、エピマー糖、例えばアラビノースキシロース又はリキソースピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース非環式アナログ及び塩基性ヌクレオシド、例えばアナログメチルリボシドなどを含むこともできる。1以上のホスホジエステル結合は別の連結基によって置換されていてもよい。これらの別の連結基としては、実施形態が挙げられるが、これに限定されない。ホスフェートがP(O)S(「チオエート」)、P(S)S(「ジチオエート」)、(O)NR2(「アミデート」)、P(O)R、P(O)OR’、CO又はCH2(「ホルムアセタール」)(ここで、それぞれのR又はR’は、独立して、H又はエーテル(−O−)結合を含有していてよい置換若しくは非置換アルキル(1〜20C)、アリールアルケニルシクロアルキルシクロアルケニル又はアラルジル。ポリヌクレオチド中の全ての結合が同一である必要はない。上記説明は、RNA及びDNAを含めて、本明細書で引用される全てのポリヌクレオチドに当てはまる

0146

本明細書で使用されるときに、「オリゴヌクレオチド」とは、一般的に、一般には全長約200未満のヌクレオチドである(必須ではない)、短い概して一本鎖の一般に合成ポリヌクレオチドをいう。用語「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」は相互に排他的ではない。ポリヌクレオチドのための上記説明は、オリゴヌクレオチドにも等しく十分に適用可能である。

0147

本明細書において区別なくに使用される用語「Smo」又は「SMO」又は「平滑化」とは、特に示さない限り、霊長類(例えばヒト)及び齧歯動物(例えば、マウス及びラット)などの哺乳類を含めて任意の脊椎動物源からの任意の天然平滑化タンパク質又は核酸をいう。この用語は、「全長」未プロセシングSMO並びに細胞内でのプロセシングにより得られるSMOの任意の形態を包含する。また、この用語は、SMOの天然型変異体、例えばスプライス変異体又は対立遺伝子変異体を包含する。いくつかの実施形態では、本明細書で使用するときに、「変異型SMO」又は「変異型SMOポリペプチド」又は「変異型SMOタンパク質」とは、ヒトSMOの位置281でのSMOの第2膜貫通に変異を有するSMO、ヒトSMOの位置408でのSMOの第5膜貫通ドメインに変異を有するSMO、ヒトSMOの位置459でのSMOの膜貫通ドメイン6に変異を有するSMO及び/又はヒトSMOの位置533若しくは535でのSMOの膜貫通ドメイン7に変異を有するSMOをいう。いくつかの実施形態では、本明細書中で使用されるときに、「変異型SMO」又は「変異型SMOポリペプチド」又は「変異型SMOタンパク質」とは、配列番号1の位置281、408、412、459、533及び/又は535に相当する1個以上のアミノ酸に変異を含む平滑化ポリペプチドをいう。いくつかの実施形態では、配列番号1の位置281、408、412、459、533及び/又は535に相当する1個以上のアミノ酸での変異は、W281C、I408V、A459V、S533N及び/又はW535Lを含む。同様に、変異型SMOタンパク質は、野生型ヒトSMOの上記位置の任意の1以上に変異を有すると記載される。本発明は、本明細書に記載の変異型ポリペプチド又は核酸のいずれかが配列識別子を基準にして説明できる又は野生型ヒトSMOに関連して説明できることを意図する。さらに、変異体は、配列番号1に関連して説明でき又は他の配列識別子のいずれかに関連して説明できる。

0148

いくつかの実施形態では、本明細書で使用されるときに、「治療」(及び「治療する」」等のバリエーション)とは、治療される個体又は細胞の自然過程を改変するための臨床的介入をいい、これは、予防のため又は臨床病理経過中に実施できる。治療の望ましい効果としては、疾患の発症又は再発の予防、症状の緩和、疾患の任意の直接的又は間接的な病理学的結果の減少、転移の予防、疾患の進行速度の低下、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、疾患若しくは障害の発症を遅らせる又は疾患若しくは障害の進行を遅らせるために使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で使用されるときに、「治療する」又は「治療」又は「緩和」とは、治療される状態の1つ以上の症状の重症度を改善し、緩和し、及び/又は減少させることをいう。一例として、癌を治療するとは、進行又は発症を改善し(患者の状態を改善する)、遅延し又は遅らせる、癌の1以上の症状の重症度を低下させることをいう。例えば、癌の治療としては、次の任意の1つ以上が挙げられる:腫瘍の大きさを減少させる、腫瘍サイズ増加の速度を減少させる、サイズの増加を停止させる、転移の数を減少させる、痛みを低減させる、生存率を増加させる及び無増悪生存期間を増大させる。

0149

「治療する」又は「治療」又は「緩和」とは、治療される状態の1つ以上の症状の重症度を改善し、緩和し、及び/又は減少させることをいう。一例として、癌を治療するとは、進行又は発症を改善し(患者の状態を改善する)、遅延し又は遅らせる、癌の1以上の症状の重症度を低下させることをいう。例えば、癌の治療としては、次の任意の1つ以上が挙げられる:腫瘍の大きさを減少させる、腫瘍サイズ増加の速度を減少させる、サイズの増加を停止させる、転移の数を減少させる、痛みを低減させる、生存率を増加させる及び無増悪生存期間を増大させる。「診断」とは、疾患又は腫瘍の識別特性を同定又は決定するプロセスをいう。癌の場合には、診断の方法を、重症度又は疾患進行に基づいてステージング又は腫瘍分類として表現される場合もある。

0150

「診断」とは、疾患又は腫瘍の識別特性を同定又は決定するプロセスをいう。癌の場合には、診断の方法を、重症度又は疾患進行に基づいてステージング又は腫瘍分類として表現される場合もある。

0151

「個体」、「被験体」又は「患者」は、ヒトなどの脊椎動物である。所定の実施形態では、脊椎動物は哺乳動物である。哺乳動物としては、家畜ウシなど)、競技用動物、ペットネコイヌ、及びウマなど)、霊長類、マウス及びラットが挙げられるが、これらに限定されない。所定の実施形態では、哺乳動物はヒトである。

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