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技術 マイクロペプチド及び遺伝子発現をモジュレートするためのその使用

出願人 ユニヴェルシテポールサバティエトゥールーズトロワサントルナショナルドゥラルシェルシュシアンティフィック
発明者 コンビエ,ジャン−フィリップロール−セルグ,ドミニクベカード,ギヨームペール,フランソワプラザ,セルジュカヴァイユ,ジェローム
出願日 2014年10月31日 (4年8ヶ月経過) 出願番号 2016-526869
公開日 2017年2月9日 (2年5ヶ月経過) 公開番号 2017-504308
状態 特許登録済
技術分野 突然変異または遺伝子工学 植物の育種及び培養による繁殖 酵素、微生物を含む測定、試験 蛋白脂質酵素含有:その他の医薬 他の有機化合物及び無機化合物含有医薬 動物,微生物物質含有医薬 化合物または医薬の治療活性 農薬・動植物の保存 ペプチド又は蛋白質
主要キーワード 垂直式 生長部 実験回数 窒素非含有 害虫駆除用 植物衛生 カツラ つぼみ
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図面 (20)

課題・解決手段

マイクロRNAの一次転写産物の配列中に含まれるヌクレオチド配列によりコードされるマイクロペプチド(miPEP)を検出及び同定する方法、及び遺伝子発現モジュレートするためのその使用。

概要

背景

マイクロRNA(miRNA)は、標的mRNAを分解することによって、又はその翻訳阻害することによって、転写後レベル標的遺伝子発現を制御する、成熟後に約21ヌクレオチド長の小さなノンコーディングRNAである。miRNAは、植物及び動物において生じる。
標的遺伝子は、多くの場合、発達過程において重要な遺伝子である。例えば、それらは、転写因子又はプロテアソームタンパク質をコードする。

miRNAの発現調節は殆ど理解されていないが、殆どのコーディング遺伝子と同様、調節にはRNAポリメラーゼIIが関与することが特に知られている:この酵素は「pri-miRNA」と呼ばれる一次転写産物を産生し、その後、これは特にDicer型酵素を含むタンパク質複合体によって成熟される。この成熟は、まず、miRNA及びその相補配列のmiRNA*を含むステムループ二次構造を有する「pre-miRNA」と呼ばれるmiRNA前駆体の形成をもたらす。次に、前駆体が成熟してmiRNA及びmiRNA*を含むより短い二本鎖RNAの形成をもたらす。その後、miRNAは、RISC複合体に引き渡され、これが標的遺伝子のmRNAを切断するか、又はその翻訳を阻害する。

概要

マイクロRNAの一次転写産物の配列中に含まれるヌクレオチド配列によりコードされるマイクロペプチド(miPEP)を検出及び同定する方法、及び遺伝子発現モジュレートするためのその使用。なし

目的

本発明の1つの態様は、マイクロRNAの発現をモジュレートすることができるペプチドを提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

- a)マイクロRNAの一次転写産物の配列中に含まれる12〜303ヌクレオチド長オープンリーディングフレームを検出する工程と、- b)・前記オープンリーディングフレームのものと同一のヌクレオチド配列又はその縮重配列によってコードされ、前記マイクロRNAの一次転写産物の転写とは独立して当該細胞中に存在するペプチドの存在下における、前記マイクロRNAを発現する特定の真核細胞における前記マイクロRNAの蓄積と、・前記ペプチドの非存在下における、前記マイクロRNAを発現する前記特定の真核細胞と同じタイプの真核細胞における前記マイクロRNAの蓄積と、を比較する工程とを含み、前記ペプチド非存在下における前記マイクロRNAの蓄積からの、前記ペプチド存在下における前記マイクロRNAの蓄積のモジュレーションが、前記オープンリーディングフレームによりコードされるマイクロペプチドの存在を示す、マイクロRNAの一次転写産物の配列中に含まれるヌクレオチド配列によりコードされるマイクロペプチド(miPEP)を検出及び同定する方法。

請求項2

前記マイクロRNAの蓄積のモジュレーションが、前記マイクロRNAの蓄積の増大又は減少であり、特に増大である請求項1に記載のmiPEPを検出及び同定する方法。

請求項3

前記細胞中における前記ペプチドの存在が、-前記ペプチドをコードする核酸の当該細胞内への導入、又は-前記ペプチドの当該細胞内への導入に起因する請求項1又は2に記載のmiPEPを検出及び同定する方法。

請求項4

前記工程a)におけるオープンリーディングフレームが、前記マイクロRNAの一次転写産物の5'部分又は3'部分、好ましくは5'部分に含まれる、請求項1〜3のいずれか1項に記載のmiPEPを検出及び同定する方法。

請求項5

前記マイクロRNAが、野生型植物細胞又は野生型動物細胞中に存在し、前記工程b)において用いられる真核細胞が、植物細胞、好ましくはアブラナ科植物細胞、マメ科植物細胞若しくはナス科植物細胞であるか、又は動物細胞、好ましくはヒト細胞若しくはドロソフィラ属動物細胞である、請求項1〜4のいずれか1項に記載のmiPEPを検出及び同定する方法。

請求項6

前記マイクロRNAが、前記工程b)において用いられる真核細胞において内因性のものである、請求項1〜5のいずれか1項に記載のmiPEPを検出及び同定する方法。

請求項7

前記マイクロRNAが、前記工程b)において用いられる真核細胞において外因性のものであり、前記真核細胞が、前記マイクロRNAの発現を可能にするベクターを含む請求項1〜6のいずれか1項に記載のmiPEPを検出及び同定する方法。

請求項8

前記マイクロRNAの蓄積が、定量RT-PCR、ノザンブロットDNAチップ又はRNAチップを用いて測定される請求項1〜7のいずれか1項に記載のmiPEPを検出及び同定する方法。

請求項9

請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法によって得られたヌクレオチド配列によってコードされるmiPEP。

請求項10

マイクロRNAの一次転写産物に含まれるヌクレオチド配列中に含まれる12〜303ヌクレオチドのオープンリーディングフレームによってコードされる3〜100アミノ酸、好ましくは4〜40アミノ酸のmiPEPであって、前記miPEPは、真核細胞における前記マイクロRNAの蓄積をモジュレートすることができ、前記ヌクレオチド配列は、前記マイクロRNAの一次転写産物の5'部分又は3'部分、好ましくは5'部分に含まれ、前記miPEPによるマイクロRNAのモジュレーションは、miPEPの存在下における細胞と非存在下における細胞とのマイクロRNA量の変化を観察することによって証明される、miPEP。

請求項11

前記miPEPが、-配列番号1〜配列番号104及び配列番号355、-配列番号375〜配列番号386、又は-配列番号424からなるペプチドの群から選択される請求項9又は10に記載のmiPEP。

請求項12

特に-配列番号105〜配列番号208及び配列番号356、-配列番号387〜配列番号399、又は-配列番号425からなる核酸の群から選択される、請求項9〜11のいずれか1項に記載のmiPEPをコードする核酸分子

請求項13

特定の真核細胞における遺伝子の発現をモジュレートするための、少なくとも: -請求項9〜11のいずれか1項に記載のmiPEP、 -前記miPEPをコードする核酸、又は -前記核酸を含むベクターの使用であって、前記特定の真核細胞は、その一次転写産物が前記少なくとも1つのmiPEPをコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列を含み、その蓄積が前記少なくとも1つのmiPEPによってモジュレートされるマイクロRNAを発現することができ、前記遺伝子の発現は、前記マイクロRNAによって調節され、前記miPEPは、特に:-配列番号1〜配列番号104及び配列番号355、-配列番号375〜配列番号386、又は-配列番号424、特に:配列番号59、配列番号24、配列番号43、配列番号76、配列番号77、配列番号14、配列番号63及び配列番号424からなるペプチドの群から選択され、前記核酸は、特に:-配列番号105〜配列番号208及び配列番号356、-配列番号387〜配列番号399、又は-配列番号425、特に:配列番号163、配列番号128、配列番号147、配列番号180、配列番号181、配列番号118、配列番号425及び配列番号167からなる核酸の群から選択され、前記マイクロRNAが、特に:-配列番号282〜配列番号354及び配列番号358、-配列番号412〜配列番号423、又は-配列番号427、特に:配列番号319、配列番号297、配列番号305、配列番号331、配列番号291、配列番号322及び配列番号427からなる核酸の群から選択される、使用。

請求項14

ヒト又は動物用薬剤として用いるための、少なくとも: -請求項9〜11のいずれか1項に記載のmiPEP、 -前記miPEPをコードする核酸、又は -前記核酸を含むベクターを含む組成物

請求項15

真核細胞におけるmiPEPの蓄積工程を行うことを含み、前記miPEPは:-3〜100アミノ酸、好ましくは4〜20アミノ酸のサイズ、及び-前記遺伝子の発現を調節するマイクロRNAの一次転写産物に含まれるヌクレオチド配列によってコードされるものと同一のペプチド配列を有し、-前記マイクロRNA蓄積をモジュレートすることができ、前記真核細胞における前記miPEPの蓄積は、前記miPEPの蓄積がない前記遺伝子の発現と比較して、前記遺伝子の発現のモジュレーションを誘導し、当該方法は、ヒトの身体又は動物の身体の外科的処置又は治療的処置のためにも、人間の遺伝的同一性改変のためにも用いられない、真核植物細胞又は真核動物細胞、特にヒト細胞においてマイクロRNAにより調節される遺伝子の発現をモジュレートする方法。

請求項16

植物の成長及び/又は発達を促進するための、特に植物の生理学的パラメータ、特にバイオマス、葉の表面積開花果実のサイズ、植物種子の産生及び/又は選択をモジュレートするための、特に植物の単為結実若しくは雌雄同体を制御するための、又は特に植物種子の生理学的パラメータ、特に発根系根張り及び水分ストレス耐性を改変するための、又は-植物病害の予防又は治療のための、特に感染性疾患への耐性を促進するための植物用薬剤としての、少なくとも: -請求項9〜11のいずれか1項に記載のmiPEP、 -前記miPEPをコードする核酸、又は -前記核酸を含むベクターを含む組成物の使用。

請求項17

植物を根絶するか、又はその成長を遅らせるための除草剤としての、少なくとも: -請求項9〜11のいずれか1項に記載のmiPEP、 -前記miPEPをコードする核酸、又は -前記核酸を含むベクターを含む組成物の使用。

請求項18

特に植物又は当該植物に接触している支持体に適用することによって、植物に有害であるか又はそのように分類されがちな生物を根絶するための害虫駆除剤、特に昆虫綱動物駆除剤クモ動物駆除剤、軟体動物門動物駆除剤又はネズミ目動物駆除剤としての、少なくとも: -請求項9〜11のいずれか1項に記載のmiPEP、 -前記miPEPをコードする核酸、又は -前記核酸を含むベクターを含む組成物の使用。

技術分野

0001

本発明は、マイクロペプチド(マイクロRNAによりコードされるペプチド又は「miPEP」)及び遺伝子発現モジュレートするためのその使用に関する。

背景技術

0002

マイクロRNA(miRNA)は、標的mRNAを分解することによって、又はその翻訳阻害することによって、転写後レベル標的遺伝子発現を制御する、成熟後に約21ヌクレオチド長の小さなノンコーディングRNAである。miRNAは、植物及び動物において生じる。
標的遺伝子は、多くの場合、発達過程において重要な遺伝子である。例えば、それらは、転写因子又はプロテアソームタンパク質をコードする。

0003

miRNAの発現調節は殆ど理解されていないが、殆どのコーディング遺伝子と同様、調節にはRNAポリメラーゼIIが関与することが特に知られている:この酵素は「pri-miRNA」と呼ばれる一次転写産物を産生し、その後、これは特にDicer型酵素を含むタンパク質複合体によって成熟される。この成熟は、まず、miRNA及びその相補配列のmiRNA*を含むステムループ二次構造を有する「pre-miRNA」と呼ばれるmiRNA前駆体の形成をもたらす。次に、前駆体が成熟してmiRNA及びmiRNA*を含むより短い二本鎖RNAの形成をもたらす。その後、miRNAは、RISC複合体に引き渡され、これが標的遺伝子のmRNAを切断するか、又はその翻訳を阻害する。

発明が解決しようとする課題

0004

更に、マイクロRNAの一次転写産物におけるイントロンの存在が、成熟マイクロRNAの発現を増大させることが示されている(Schwabら,EMBO Rep., 14(7): 615-21, 2013)。しかしながら、実験が困難なために、マイクロRNAの一次転写産物又はpri-miRNAはあまり研究されてこなかった。

0005

真核生物の遺伝子の約50%は、コーディング配列上流の5'UTR領域(5'非翻訳領域)内に小さなオープンリーディングフレームを有する。これら小さなオープンリーディングフレーム(又は「uORF」、上流ORFの略)は、当該uORFにコードされるペプチドによって、主にシスに作用して、mRNAに対するリボソームの固定及び速度をモジュレートすることにより、また未知メカニズムによりトランスにも作用して、翻訳調節因子役割を果たし得る(Combierら, Gene Dev, 22: 1549-1559, 2008)。定義によれば、uORFは、コーディング遺伝子の上流に存在する。

0006

近年、長鎖遺伝子間ノンコーディングRNA(lincRNA)中にも小さなORFが発見されているが、その推定上の機能(もし存在するならば)は、未知である(Ingoliaら, Cell, 147(4): 789-802, 2011; Guttman及びRinn, Nature, 482(7385): 339-46, 2012)。

0007

しかしながら、ノンコーディングマイクロRNA中における、ペプチドをコードするORFの存在については、まだ何の報告例もない。今日まで、マイクロRNA及び、ひいてはその一次転写産物は、それらの具体的な作用機序に基づき、ペプチドを産生しないノンコーディング調節性RNAとして常に考えられてきた。

課題を解決するための手段

0008

本発明の1つの態様は、マイクロRNAの発現をモジュレートすることができるペプチドを提供することである。
本発明の別の態様は、マイクロRNAの1以上の標的遺伝子の発現をモジュレートするための手段を提供することである。
本発明は、マイクロRNAにより標的化される遺伝子の発現を、当該マイクロRNA以外の手段によって、より簡便に、より効果的に制御することを可能にするという利点を提供する。

図面の簡単な説明

0009

HAM1及びHAM2遺伝子の発現(A)又はM.トランカツラにおける側根数(B)に対するMtmiR171b(メディカゴトランカツラで同定されたmiR171b)の過剰発現の効果を示す。
M. トランカツラにおけるMtmiR171bの発現並びにHAM1及びHAM2遺伝子の発現(A)又は側根数(B)に対するMtmiPEP171b1の過剰発現の効果を示す。
M. トランカツラにおけるMtmiR171bの発現、HAM1及びHAM2遺伝子の発現(A)並びに側根数(B)に対するMtmiPEP171b1の効果を示す。
M. トランカツラにおけるpre-MtmiR171b (A)及びMtmiR171b(B)の発現に対するMtmiPEP171b1の効果を示す。
M. トランカツラにおける種々のマイクロRNA前駆体の発現に対するMtmiPEP171b1の過剰発現の効果(A)及びMtmiPEP171b1の効果(B)を示す。
モデル植物ニコチアベンサミアナにおいて示された、MtmiR171bの発現に対するMtmiPEP171b1の翻訳の効果を示す。
モデル植物ニコチアナ ベンサミアナにおいて示された、pre-MtmiR171bの発現に対するMtmiPEP171b1の過剰発現の効果を示す。
モデル植物ニコチアナ ベンサミアナにおいて示された、pre-MtmiR171bの発現に対するMtmiPEP171b1の効果を示す。
モデル植物ニコチアナ ベンサミアナにおいて示された、pri-miR171b (A)、pre-MtmiR171b (B)及びMtmiR171b (C)の発現に対するMtmiPEP171b1の効果を示す。
MtmiPEP171b1を発現するために改変されたタバコ葉細胞におけるMtmiPEP171b1の局在を示す。
モデル植物タバコにおいて示された、AtmiR165aの発現に対する(アラビドプシスタリアナにおいて同定された)AtmiPEP165aの発現の効果(A)及びAtmiR319aに対する(アラビドプシス タリアナにおいて同定された)AtmiPEP319a2の発現の効果(B)を示す。
アラビドプシス タリアナの根の成長に対するAtmiPEP165a処置の効果を示す。
ドロソフィラにおいて同定されたmiPEP8の配列の保存を示す。
ドロソフィラ種におけるmiPEP8の質量(kDa)及び等電点(pI)の変化を示す。
miPEPの機能に対する配列付加の効果を示す。
メディカゴ トランカツラの根系におけるMtmiPEP171b1の発現を示す。
ドロソフィラメラガスター細胞におけるDmmiPEP8の発現を示す。
D. メラノガスター細胞におけるDmmiR8蓄積に対するDmmiPEP8の影響を示す。
ホモサピエンス細胞におけるHsmiR155蓄積に対するHsmiPEP155の効果を示す。
モデル植物ニコチアナ ベンサミアナにおいて示された、MtmiR171bの発現に対するMtmiPEP171b1の翻訳の効果を示す。
モデル植物ニコチアナ ベンサミアナにおいて示された、MtmiR171bの発現に対するMtmiPEP171b1の過剰発現の効果を示す。
AtmiR165aの蓄積及びその標的遺伝子(PHAVOLUTA: PHV、PHABOLUSA:PHB及びREVOLUTA: REV)の蓄積に対するAtmiPEP165aの効果を示す。
A. タリアナにおけるAtmiR164aの発現に対するAtmiPEP164aを用いる処置の効果を示す。
アラビドプシス タリアナの成長に対するAtmiPEP164aを用いる処置の効果を示す。
A. タリアナにおけるAtmiR165aの発現に対するAtmiPEP165aを用いる処置の効果を示す。
A. タリアナにおけるAtmiR319aの発現に対するAtmiPEP319a1の過剰発現の効果を示す。
アラビドプシス タリアナの成長に対するAtmiPEP319aを用いる処置の効果を示す。
免疫染色を示す。
A. タリアナにおけるAtmiR160bの発現に対するAtmiPEP160b1の過剰発現の効果を示す。
AtmiR164aの発現に対するAtmiPEP164a1の効果を示す。
A. タリアナにおけるAtmiR319aの発現に対するAtmiPEP319a1の過剰発現の効果を示す。
M. トランカツラにおけるMtmiR169dの発現に対するMtmiPEP169dの効果を示す。
M. トランカツラにおけるMtmiR171eの発現に対するMtmiPEP171eの過剰発現の効果を示す。
野生型M. トランカツラ種植物におけるMtmiPEP171b1の局在を示す。
野生型A. タリアナ種植物におけるAtmiPEP165aの存在を示す。
A. タリアナにおけるAtmiPEP165aの作用を示す。
M. トランカツラにおける側根数に対するpri-miR171bの効果を示す。
ドロソフィラ メラノガスター細胞におけるDmmiPEP8翻訳の可能性を示す。

0010

よって、本発明は、
- a)マイクロRNAの一次転写産物の配列中に含まれる12〜303ヌクレオチド長のオープンリーディングフレームを検出する工程と、
- b) ・上記オープンリーディングフレームのものと同一のヌクレオチド配列又はその縮重配列によってコードされ、上記マイクロRNAの一次転写産物の転写とは独立して当該細胞中に存在するペプチドの存在下における、上記マイクロRNAを発現する特定の真核細胞における上記マイクロRNAの蓄積と、
・ 上記ペプチドの非存在下における、上記マイクロRNAを発現する上記特定の真核細胞と同じタイプの真核細胞における上記マイクロRNAの蓄積と、を比較する工程とを含み、
上記ペプチドの非存在下における上記マイクロRNAの蓄積からの、上記ペプチドの存在下における上記マイクロRNAの蓄積のモジュレーションが、上記オープンリーディングフレームによりコードされるマイクロペプチドの存在を示す、
マイクロRNAの一次転写産物の配列中に含まれるヌクレオチド配列によりコードされるマイクロペプチド(miPEP)を検出及び同定する方法に関する。

0011

本発明は、特に、
- a)マイクロRNAの一次転写産物の配列中に含まれる15〜303ヌクレオチド長のオープンリーディングフレームを検出する工程と、
- b) ・上記オープンリーディングフレームのものと同一のヌクレオチド配列又はその縮重配列によりコードされ、上記マイクロRNAの一次転写産物の転写とは独立して当該細胞中に存在するペプチドの存在下における、上記マイクロRNAを発現する特定の真核細胞における上記マイクロRNAの蓄積と、
・ 上記ペプチドの非存在下における、上記マイクロRNAを発現する上記特定の真核細胞と同じタイプの真核細胞における上記マイクロRNAの蓄積と、を比較する工程とを含み、
上記ペプチド非存在下における上記マイクロRNAの蓄積からの、上記ペプチド存在下における上記マイクロRNAの蓄積のモジュレーションが、上記オープンリーディングフレームによりコードされるマイクロペプチドの存在を示す、マイクロRNAの一次転写産物の配列中に含まれるヌクレオチド配列によりコードされるマイクロペプチド(miPEP)を検出及び同定する方法に関する。

0012

本発明は、特に、
a)マイクロRNAの一次転写産物の配列中に含まれる15〜303ヌクレオチド長又は12ヌクレオチド長のオープンリーディングフレームを検出する工程と、
b) ・上記オープンリーディングフレームのものと同一のヌクレオチド配列又はその縮重配列によりコードされ、上記マイクロRNAの一次転写産物の転写とは独立して当該細胞中に存在するペプチドの存在下における、上記マイクロRNAを発現する特定の真核細胞における上記マイクロRNAの蓄積と、
・ 上記ペプチドの非存在下における、上記マイクロRNAを発現する上記特定の真核細胞と同じタイプの真核細胞における上記マイクロRNAの蓄積と、を比較する工程とを含み、
上記ペプチド非存在下における上記マイクロRNAの蓄積からの、上記ペプチド存在下における上記マイクロRNAの蓄積のモジュレーションが、上記オープンリーディングフレームによりコードされるマイクロペプチドの存在を示す、マイクロRNAの一次転写産物の配列中に含まれるヌクレオチド配列によりコードされるマイクロペプチド(miPEP)を検出及び同定する方法に関する。

0013

本発明は、特に、
- a)マイクロRNAの一次転写産物の配列中に含まれる12ヌクレオチド長のオープンリーディングフレームを検出する工程と、
- b) ・上記オープンリーディングフレームのものと同一のヌクレオチド配列又はその縮重配列によりコードされ、上記マイクロRNAの一次転写産物の転写とは独立して当該細胞中に存在するペプチドの存在下における、上記マイクロRNAを発現する特定の真核細胞における上記マイクロRNAの蓄積と、
・ 上記ペプチドの非存在下における、上記マイクロRNAを発現する上記特定の真核細胞と同じタイプの真核細胞における上記マイクロRNAの蓄積と、を比較する工程とを含み、
上記ペプチド非存在下における上記マイクロRNAの蓄積からの、上記ペプチド存在下における上記マイクロRNAの蓄積のモジュレーションが、上記オープンリーディングフレームによりコードされるマイクロペプチドの存在を示す、マイクロRNAの一次転写産物の配列中に含まれるヌクレオチド配列によりコードされるマイクロペプチド(miPEP)を検出及び同定する方法に関する。

0014

したがって、第1の工程において、マイクロペプチドの検出及び同定方法は、マイクロRNAの一次転写産物中の、ペプチドをコードする可能性のあるオープンリーディングフレームの存在を検出することからなる。
第2の工程に関しては、マイクロRNA蓄積に対する上記ペプチドの効果を探ることによって、上記ペプチドを特徴決定すること、すなわち上記ペプチドが細胞内で実際に産生されたペプチドに相当するか否かを決定することを可能にする。

0015

マイクロRNA蓄積に対するペプチドの効果を示すために、マイクロRNAを発現する第1の細胞に大量のペプチドを導入する。次いで、この第1の細胞におけるマイクロRNA蓄積を測定し、第1の細胞と同一であるが上記ペプチドを含まない第2の細胞におけるマイクロRNA蓄積と比較する。

0016

よって、ペプチド存在下の細胞とペプチド非存在下の細胞とのマイクロRNA量の変化を観察することにより、(i)当該マイクロRNAの一次転写産物によりコードされるペプチドが存在すること、(ii)当該ペプチドの配列が、当該マイクロRNAの一次転写産物で同定されるオープンリーディングフレームによりコードされること、及び(iii)当該ペプチドが、当該マイクロRNA蓄積に対して効果を有すること、が示される。

0017

したがって、本発明は、一方ではマイクロRNAの一次転写産物上に、マイクロペプチドをコードできるオープンリーディングフレームが存在することを観察し、他方では上記マイクロペプチドが上記マイクロRNA蓄積をモジュレートできることを観察したという本発明者らによる予測されなかった2つの観察結果に基づいている。

0018

特に、本発明は、
- a)マイクロRNAの一次転写産物の配列中に含まれる15〜303ヌクレオチド長のオープンリーディングフレームを検出する工程と、
- b) ・上記オープンリーディングフレームのものと同一のヌクレオチド配列又はその縮重配列によりコードされ、上記マイクロRNAの一次転写産物の転写とは独立して当該細胞中に存在するペプチドの存在下における、上記マイクロRNAの一次転写産物を発現する特定の真核細胞における上記マイクロRNAの蓄積と、
・ 上記ペプチドの非存在下における、上記マイクロRNAの一次転写産物を発現する上記特定の真核細胞と同じタイプの真核細胞における上記マイクロRNAの蓄積と、を比較する工程とを含み、
上記ペプチド非存在下における上記マイクロRNAの蓄積からの、上記ペプチド存在下における上記マイクロRNAの蓄積のモジュレーションが、上記オープンリーディングフレームによりコードされるマイクロペプチドの存在を示す、マイクロRNAの一次転写産物の配列中に含まれるヌクレオチド配列によりコードされるマイクロペプチド(miPEP)を検出及び同定する方法に関する。

0019

特に、本発明は、
- a)マイクロRNAの一次転写産物の配列中に含まれる15〜303ヌクレオチド長又は12ヌクレオチド長のオープンリーディングフレームを検出する工程と、
- b) ・上記オープンリーディングフレームのものと同一のヌクレオチド配列又はその縮重配列によりコードされ、上記マイクロRNAの一次転写産物の転写とは独立して当該細胞中に存在するペプチドの存在下における、上記マイクロRNAの一次転写産物を発現する特定の真核細胞における上記マイクロRNAの蓄積と、
・ 上記ペプチドの非存在下における、上記マイクロRNAの一次転写産物を発現する上記特定の真核細胞と同じタイプの真核細胞におけるマイクロRNA蓄積と、を比較する工程とを含み、
上記ペプチド非存在下における上記マイクロRNAの蓄積からの、上記ペプチド存在下における上記マイクロRNAの蓄積のモジュレーションが、上記オープンリーディングフレームによりコードされるマイクロペプチドの存在を示す、マイクロRNAの一次転写産物の配列中に含まれるヌクレオチド配列によりコードされるマイクロペプチド(miPEP)を検出及び同定する方法に関する。

0020

特に、本発明は、
- a)マイクロRNAの一次転写産物の配列中に含まれる12ヌクレオチド長のオープンリーディングフレームを検出する工程と、
- b) ・上記オープンリーディングフレームのものと同一のヌクレオチド配列又はその縮重配列によりコードされ、上記マイクロRNAの一次転写産物の転写とは独立して当該細胞中に存在するペプチドの存在下における、上記マイクロRNAの一次転写産物を発現する特定の真核細胞における上記マイクロRNAの蓄積と、
・ 上記ペプチドの非存在下における、上記マイクロRNAの一次転写産物を発現する上記特定の真核細胞と同じタイプの真核細胞における上記マイクロRNAの蓄積と、を比較する工程とを含み、
上記ペプチド非存在下における上記マイクロRNAの蓄積からの、上記ペプチド存在下における上記マイクロRNAの蓄積のモジュレーションが、上記オープンリーディングフレームによりコードされるマイクロペプチドの存在を示す、マイクロRNAの一次転写産物の配列中に含まれるヌクレオチド配列によりコードされるマイクロペプチド(miPEP)を検出及び同定する方法に関する。

0021

本発明において、用語「マイクロRNA」、「ノンコーディングマイクロRNA」及び「miRNA」は、同義であり、互換可能に用いられ得る。それらは、翻訳されず、ペプチド又はタンパク質をもたらさない約21ヌクレオチドのRNAの小分子と定義される。
しかしながら、この成熟型において、マイクロRNAは、例えばRISC複合体によって、転写後機構により特定の遺伝子を調節する機能を果たす。

0022

マイクロRNAの一次転写産物又は「pri-miRNA」は、DNA分子の転写から直接得られるRNA分子に相当する。一般に、この一次転写産物は、例えばRNAの特定の構造又はスプライシング現象によるRNAの特定部分の切断に関連付けられる1以上の転写後修飾を受け、 マイクロRNAの前駆体又は「pre-miRNA」をもたらし、次いでマイクロRNAの成熟型又は「miRNA」をもたらす。

0023

用語「マイクロペプチド」及び「miPEP」(マイクロRNAによりコードされるペプチド)は、同義であり、互換可能に用いられ得る。それらは、マイクロRNAの一次転写産物上に存在するオープンリーディングフレームによってコードされ、当該マイクロRNAの蓄積をモジュレートできるペプチドと定義される。
本発明で意味するところのマイクロペプチドは、「マイクロ」がペプチドのサイズに対応するものでないことから、必ずしも、小さなペプチドであると解されるべきではない。

0024

本発明によれば、miPEPは、転写モジュレータ、特に転写活性因子と考えることもできる。このような転写モジュレータは、転写レベルで作用して、pri-miRNA、pre-miRNA及びmiRNAの蓄積をモジュレートすることができる。

0025

遺伝子コード縮重を考慮すれば、同一のマイクロペプチドは、複数のヌクレオチド配列によってコードされ得る。この種のヌクレオチド配列は、少なくとも1つのヌクレオチドで互いに異なるが同一のペプチドをコードし、「縮重配列」と呼ばれる。

0026

用語「オープンリーディングフレーム」又は「ORF」は、同義であり、互換可能に用いられ得る。それらは、ペプチド又はタンパク質をコードする可能性のあるDNA又はRNA分子中のヌクレオチド配列に相当する:オープンリーディングフレームは、開始コドン(一般にメチオニンをコードする開始コドン)から始まり、一連コドンアミノ酸をコードする各々のコドン)が続き終止コドン(翻訳されない終止コドン)で終わる。
本発明においては、ORFは、それがマイクロRNAの一次転写産物上に存在するとき、特に「miORF」と呼ばれ得る。

0027

特定の本発明において定義されるmiORFは、12〜303ヌクレオチドのサイズを有し得、3〜100アミノ酸のペプチドをコードし得る。
特に、本発明で定義するmiORFは、15〜303ヌクレオチドのサイズを有し得る。アミノ酸は3ヌクレオチドのコドンによりコードされるので、15〜303ヌクレオチドのmiORFは、4〜100アミノ酸のmiPEPをコードする。
特に、miORFは、15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 47, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 69, 72, 75, 78, 81, 84, 87, 90, 93, 96, 99, 102, 105, 108, 111, 114, 117, 120, 123, 126, 129, 132, 135, 138, 141, 144, 147, 150, 153, 156, 159, 162, 165, 168, 171, 174, 177, 180, 183, 186, 189, 192, 195, 198, 201, 204, 207, 210, 213, 216, 219, 222, 225, 228, 231, 234, 237, 240, 243, 246, 249, 252, 255, 258, 261, 264, 267, 270, 273, 276, 279, 282, 285, 288, 291, 294, 297, 300又は303ヌクレオチドのサイズを有し、4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99又は100アミノ酸のサイズを有するmiPEPをそれぞれコードする。

0028

本発明において、「蓄積」とは、細胞内における分子、例えばマイクロRNA又はマイクロペプチドの産生量を意味する。
よって、細胞内の分子蓄積の「モジュレーション」は、細胞内に存在する当該分子の量の変化に相当する。
更に、miPEPの効果は、miRNA蓄積のモジュレーションだけでなく、対応するpri-miRNA又はpre-miRNA蓄積のモジュレーションによっても観察することができる。

0029

1つの実施形態では、本発明は、マイクロRNA蓄積のモジュレーションが当該マイクロRNA蓄積の増大又は減少、特に増大である、上記で定義したmiPEPの検出及び同定方法に関する。
「蓄積の減少」は、細胞内における分子の量の減少に相当する。
反対に、「蓄積の増大」は、細胞内における分子の量の増大に相当する。
有利な実施形態では、本発明は、マイクロRNA蓄積のモジュレーションが当該マイクロRNA蓄積の増大である、上記で定義したmiPEPの検出及び同定方法に関する。

0030

1つの実施形態では、本発明は、細胞内におけるペプチドの存在が、
- 当該ペプチドをコードする核酸の当該細胞内への導入、又は
- 当該ペプチドの当該細胞内への導入
に起因する、上記で定義したmiPEPの検出及び同定方法に関する。

0031

miPEPを特徴決定するためには、当該細胞内に試験対象のペプチドが存在する、マイクロRNAを発現する細胞のモデルを得る必要がある。そのために、細胞とペプチドとを接触させることによって、又はペプチドをコードする核酸を細胞内に導入し、その後当該細胞内で核酸がペプチドに翻訳されることによって、ペプチドを細胞内に導入することができる。

0032

1つの実施形態では、工程a)におけるオープンリーディングフレームが、マイクロRNAの一次転写産物の5'部分又は3'部分、好ましくは5'部分に含まれる、上記で定義したmiPEPの検出及び同定方法に関する。
マイクロRNAの一次転写産物の5'部分又は3'部分は、マイクロRNAの成熟中に切断されるRNA分子の末端部分に相当する。

0033

1つの実施形態では、本発明は、マイクロRNAが、野生型植物細胞中に存在する、上記で定義したmiPEPの検出及び同定方法に関する。
本発明において、野生型植物細胞は、ヒトにより遺伝子操作されていない植物細胞に相当する。

0034

1つの実施形態では、本発明は、マイクロRNAが、野生型動物細胞、特に野生型ヒト細胞又は野生型ドロソフィラ属(Drosophila)動物細胞中に存在する、上記で定義したmiPEPの検出及び同定方法に関する。
本発明において、野生型動物細胞は、ヒトにより遺伝子操作されていない動物細胞、特にヒト細胞に相当する。

0035

1つの実施形態では、本発明は、工程bにおいて用いられる特定の真核細胞及び当該特定の真核細胞と同じタイプの真核細胞が、アラビドプシスタリアナ(Arabidopsis thaliana)などのアブラナ科植物グリシンクス(Glycine max、ダイズ)、メディカゴトランカツラ(Medicago truncatula)及びメディカゴサティバ(Medicago sativa) (アルファルファ)などのマメ科植物、又はニコチアナベンサミアナ(Nicotiana benthamiana、タバコ)、ソラナムベロサム(Solanum tuberosum、ジャガイモ)、ソラナムリコパーシカム(Solanum lycopersicum、トマト)若しくはソラナムメロンゲナ(Solanum melongena、ナス)などのナス科植物の植物細胞である、上記で定義したmiPEPの検出及び同定方法に関する。

0036

1つの実施形態では、本発明は、工程bにおいて用いられる特定の真核細胞及び当該特定の真核細胞と同じタイプの真核細胞が、植物細胞、好ましくはメディカゴトランカツラ細胞、ニコチアナベンサミアナ細胞又はアラビドプシスタリアナ細胞である、上記で定義したmiPEPの検出及び同定方法に関する。
1つの実施形態では、本発明は、工程bにおいて用いられる特定の真核細胞及び当該特定の真核細胞と同じタイプの真核細胞が、動物細胞、好ましくはヒト細胞又はドロソフィラ属動物細胞である、上記で定義したmiPEPの検出及び同定方法に関する。

0037

上記で定義したマイクロペプチドの検出及び同定方法では、マイクロRNAに対するペプチドの潜在的効果を示すことができるように、マイクロRNAの一次転写産物上の、ペプチドをコードできるORFを同定した後に、上記マイクロRNA及び上記ペプチドを有する細胞モデルを得る必要がある。

0038

したがって、2つの選択肢が考えられる:
- miORFが同定された細胞モデルと、miRNAに対するペプチドの効果が示された細胞モデルとが同一であるか、又は
- miORFが同定された細胞モデルと、miRNAに対するペプチドの効果が示された細胞モデルとが異なる。

0039

第1の選択肢では、ペプチドの効果を観察するために用いられる細胞モデルは、マイクロRNAの一次転写産物が単離された細胞モデルと同一である。この細胞モデルでは、特定の真核細胞は、マイクロRNAを天然に含んでおり、これら細胞内には、試験対象のペプチドのみ導入する必要がある。この文脈において、マイクロRNAは、それが細胞内に天然に存在するために、「内因性のもの」と称される。しかし、内因性マイクロRNAのその他のコピーを、例えば内因性マイクロRNAをコードするベクターを細胞内に導入することによって、細胞に添加してもよい。

0040

第2の選択肢では、ペプチドの効果を観察するために用いられる細胞モデルは、マイクロRNAの一次転写産物が単離された細胞モデルとは異なる。この細胞モデルでは、特定の真核細胞は、マイクロRNAも試験対象のペプチドも含まない。したがって、これら2つの要素をこれら細胞内に導入する必要がある。この文脈において、マイクロRNAは、それが細胞内に天然に存在しないために、「外因性のもの」と称される。

0041

1つの実施形態では、本発明は、マイクロRNAが、工程b)において用いられる真核細胞において、及び工程b)において用いられる特定の真核細胞と同じタイプの真核細胞において、内因性のものである、上記で定義したmiPEPの検出及び同定方法に関する。
1つの実施形態では、本発明は、マイクロRNAが、工程b)において用いられる、上記マイクロRNAの発現を可能にするベクターを含む真核細胞において、及び工程b)において用いられる、特定の真核細胞と同じタイプの、上記マイクロRNAの発現を可能にするベクターを含む真核細胞において、外因性のものである、上記miPEPの検出及び同定方法に関する。

0042

1つの実施形態では、本発明は、マイクロRNAの蓄積が、定量RT-PCR又はノザンブロットを用いて測定される、上記で定義したmiPEPの検出及び同定方法に関する。
1つの実施形態では、本発明は、マイクロRNAの蓄積が、DNAチップ又はRNAチップを用いて測定される、上記で定義したmiPEPの検出及び同定方法に関する。
マイクロRNAの蓄積は、特定の核酸分子アッセイのための分子生物学的手法を用いて測定してもよい。

0043

また、別の態様では、本発明は、
- a)マイクロRNAの一次転写産物の配列中に含まれる15〜303ヌクレオチド長のオープンリーディングフレームを検出する工程と、
- b) ・上記オープンリーディングフレームのものと同一のヌクレオチド配列又はその縮重配列によりコードされ、上記マイクロRNAの一次転写産物の転写とは独立して当該細胞中に存在するペプチドの存在下における、上記マイクロRNAを発現する特定の真核細胞における上記マイクロRNAの蓄積と、
・ 上記ペプチドの非存在下における、上記マイクロRNAを発現する上記特定の真核細胞と同じタイプの真核細胞における上記マイクロRNAの蓄積と、を比較する工程とを含み、
上記ペプチドの非存在下における上記マイクロRNAの蓄積からの、上記ペプチドの存在下における上記マイクロRNAの蓄積のモジュレーションが、その一次転写産物がマイクロペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むマイクロRNAの存在を示す、その一次転写産物の配列がmiPEPをコードするヌクレオチド配列を含むマイクロRNAを検出及び同定する方法に関する。

0044

特に、本発明は、
- a)マイクロRNAの一次転写産物の配列中に含まれる15〜303ヌクレオチド長のオープンリーディングフレームを検出する工程と、
- b) ・上記オープンリーディングフレームのものと同一のヌクレオチド配列又はその縮重配列によりコードされ、上記マイクロRNAの一次転写産物の転写とは独立して当該細胞中に存在するペプチドの存在下における、上記マイクロRNAの一次転写産物を発現する特定の真核細胞における上記マイクロRNAの蓄積と、
・ 上記ペプチドの非存在下における、上記マイクロRNAの一次転写産物を発現する上記特定の真核細胞と同じタイプの真核細胞における上記マイクロRNAの蓄積と、を比較する工程とを含み、
上記ペプチドの非存在下における上記マイクロRNAの蓄積からの、上記ペプチドの存在下における上記マイクロRNAの蓄積のモジュレーションが、その一次転写産物がマイクロペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むマイクロRNAの存在を示す、その一次転写産物の配列がmiPEPをコードするヌクレオチド配列を含むマイクロRNAを検出及び同定する方法に関する。

0045

1つの実施形態では、本発明は、マイクロRNA蓄積のモジュレーションが、マイクロRNA蓄積の増大又は減少、特に増大である、上記で定義したマイクロRNAの検出及び同定方法に関する。
1つの実施形態では、本発明は、細胞内におけるペプチドの存在が、
- 当該ペプチドをコードする核酸の当該細胞内への導入、又は
- 当該ペプチドの当該細胞内への導入
に起因する、上記で定義したマイクロRNAの検出及び同定方法に関する。

0046

1つの実施形態では、本発明は、工程a)におけるオープンリーディングフレームが、マイクロRNAの一次転写産物の5'部分又は3'部分、好ましくは5'部分に含まれる、上記で定義したマイクロRNAの検出及び同定方法に関する。
1つの実施形態では、本発明は、マイクロRNAが、野生型植物細胞中に存在する、上記で定義したマイクロRNAの検出及び同定方法に関する。
1つの実施形態では、本発明は、マイクロRNAが、野生型動物細胞、特に野生型ヒト細胞中に存在する、上記で定義したマイクロRNAの検出及び同定方法に関する。

0047

1つの実施形態では、本発明は、工程b)において用いられる真核細胞及び特定の真核細胞と同じタイプの真核細胞が、植物細胞、好ましくはメディカゴトランカツラ細胞である、上記で定義したマイクロRNAの検出及び同定方法に関する。
1つの実施形態では、本発明は、工程b)において用いられる真核細胞及び特定の真核細胞と同じタイプの真核細胞が、動物細胞、好ましくはドロソフィラ属動物細胞である、上記で定義したマイクロRNAの検出及び同定方法に関する。

0048

1つの実施形態では、本発明は、マイクロRNAが、工程b)において用いられる真核細胞において、及び工程b)において用いられる、特定の真核細胞と同じタイプの真核細胞において、内因性のものである、上記で定義したマイクロRNAの検出及び同定方法に関する。
1つの実施形態では、本発明は、マイクロRNAが、工程b)において用いられる、マイクロRNAの発現を可能にするベクターを含む真核細胞において、及び工程b)において用いられる、特定の真核細胞と同じタイプの、マイクロRNAの発現を可能にするベクターを含む真核細胞において、外因性のものである、上記で定義したマイクロRNAの検出及び同定方法に関する。

0049

1つの実施形態では、本発明は、マイクロRNAの蓄積が、定量RT-PCR又はノザンブロットを用いて測定される、上記で定義したマイクロRNAの検出及び同定方法に関する。
1つの実施形態では、本発明は、マイクロRNAの蓄積が、DNAチップ又はRNAチップを用いて測定される、上記で定義したマイクロRNAの検出及び同定方法に関する。

0050

別の態様では、本発明は、上記で定義した方法を実施することによって得られるmiPEPに関する。
より具体的には、本発明は、上記で定義した方法を実施することによって得られるヌクレオチド配列によってコードされるmiPEPに関する。言い換えれば、本発明は、上記で定義した方法を実施することによって検出及び同定されるヌクレオチド配列によってコードされるmiPEPに関する。

0051

また、本発明の別の態様は、マイクロRNAの一次転写産物に含まれるヌクレオチド配列によってコードされ、真核細胞におけるマイクロRNA蓄積をモジュレートできる、3〜100アミノ酸、特に4〜100アミノ酸、特に4〜60アミノ酸、好ましくは4〜40アミノ酸のmiPEPに関する。
また、本発明の別の態様は、マイクロRNAの一次転写産物に含まれるヌクレオチド配列によってコードされ、真核細胞におけるマイクロRNA蓄積をモジュレートできる、4〜100アミノ酸又は3アミノ酸のmiPEPに関する。
また、本発明の別の態様は、マイクロRNAの一次転写産物に含まれるヌクレオチド配列によってコードされ、真核細胞におけるマイクロRNA蓄積をモジュレートできる、3アミノ酸のmiPEPに関する。

0052

特に、本発明において定義されるmiPEPは、15〜303ヌクレオチドのmiORFによってコードされ、4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99又は100アミノ酸、特に5, 8, 10, 18, 19, 23, 37, 50又は59アミノ酸のサイズを有する。
特に、本発明のmiPEPは、4〜10アミノ酸、4〜20アミノ酸、4〜30アミノ酸、4〜40アミノ酸、4〜50アミノ酸、4〜60アミノ酸、4〜70アミノ酸、4〜80アミノ酸、4〜90アミノ酸又は4〜100アミノ酸の範囲のサイズを有する。

0053

更に、マイクロRNAの一次転写産物について複数のmiORFが同定され得、このことはマイクロRNAの一次転写産物が複数のmiPEPをコードする可能性があることを示していることに留意すべきである。
また、miPEPの効果は、一般的に、1つのマイクロRNA、すなわち当該miPEPをコードする一次転写産物に由来するマイクロRNAに特異的であることに留意すべきである。

0054

miPEPによるマイクロRNAのモジュレーションは、miPEPの存在下及び非存在下における細胞間のマイクロRNA量の変化を観察することで証明され得る。

0055

1つの実施形態では、本発明は、ヌクレオチド配列がマイクロRNAの一次転写産物の5'部分又は3'部分、好ましくは5'部分に含まれる、上記で定義したmiPEPに関する。
1つの実施形態では、本発明は、ヌクレオチド配列がマイクロRNAの一次転写産物上に存在する第1のオープンリーディングフレームに相当する、上記で定義したmiPEPに関する。
1つの実施形態では、本発明は、塩基性の、好ましくは8より高い等電点を有する、上記で定義したmiPEPに関する。
1つの実施形態では、本発明は、酸性の等電点を有する、上記で定義したmiPEPに関する。

0056

1つの実施形態では、本発明は、配列番号1〜配列番号104、配列番号375〜配列番号386及び配列番号355からなるペプチドの群から選択される、上記で定義したmiPEPに関する(表1)。
1つの実施形態では、本発明は、
- 配列番号1〜配列番号104及び配列番号355、
- 配列番号375〜配列番号386、又は
- 配列番号424
からなるペプチドの群から選択される、上記で定義したmiPEPに関する。
1つの実施形態では、本発明は、アミノ酸配列MVTからなる、上記で定義したmiPEPに関する。

0057

別の態様では、本発明は、上記で定義したmiPEPをコードする核酸分子に関する。
1つの実施形態では、本発明は、配列番号105〜配列番号208、配列番号387〜配列番号399及び配列番号356からなる核酸の群から選択される、上記で定義した核酸分子に関する(表2)。
1つの実施形態では、本発明は、
- 配列番号105〜配列番号208及び配列番号356、
- 配列番号387〜配列番号399、又は
- 配列番号425
からなる核酸の群から選択される、上記で定義した核酸分子に関する。

0058

特定の実施形態では、本発明は、miR171b(配列番号319)の一次転写産物に含まれるヌクレオチド配列(配列番号163)によってコードされ、真核細胞において上記miR171bの蓄積をモジュレートできる、MtmiPEP171b1(配列番号59)に関する。
特定の実施形態では、本発明は、miR164a(配列番号297)の一次転写産物に含まれるヌクレオチド配列(配列番号128)によってコードされ、真核細胞において上記miR164aの蓄積をモジュレートできる、AtmiPEP164a1(配列番号24)に関する。

0059

特定の実施形態では、本発明は、miR165a(配列番号305)の一次転写産物に含まれるヌクレオチド配列(配列番号147)によってコードされ、真核細胞において上記miR165aの蓄積をモジュレートできる、AtmiPEP165a(配列番号43)に関する。
特定の実施形態では、本発明は、miR319a(配列番号331)の一次転写産物に含まれるヌクレオチド配列(配列番号180)によってコードされ、真核細胞において上記miR319aの蓄積をモジュレートできる、AtmiPEP319a1(配列番号76)に関する。

0060

特定の実施形態では、本発明は、miR319a(配列番号331)の一次転写産物に含まれるヌクレオチド配列(配列番号181)によってコードされ、真核細胞において上記miR319aの蓄積をモジュレートできる、AtmiPEP319a2(配列番号77)に関する。
特定の実施形態では、本発明は、miR160b(配列番号291)の一次転写産物に含まれるヌクレオチド配列(配列番号118)によってコードされ、真核細胞において上記miR160bの蓄積をモジュレートできる、AtmiPEP160b1(配列番号14)に関する。

0061

特定の実施形態では、本発明は、miR169d(配列番号427)の一次転写産物に含まれるヌクレオチド配列(配列番号425)によってコードされ、真核細胞において上記miR169dの蓄積をモジュレートできる、MtmiPEP169d(配列番号424)に関する。
特定の実施形態では、本発明は、miR171e(配列番号322)の一次転写産物に含まれるヌクレオチド配列(配列番号167)によってコードされ、真核細胞において上記miR171eの蓄積をモジュレートできるMtmiPEP171e(配列番号63)に関する。

0062

特定の実施形態では、本発明は、miR1(配列番号353)の一次転写産物に含まれるヌクレオチド配列(配列番号206)によってコードされ、真核細胞において上記miR1の蓄積をモジュレートできる、DmmiPEP1a(配列番号102)に関する。
特定の実施形態では、本発明は、miR1(配列番号353)の一次転写産物に含まれるヌクレオチド配列(配列番号207)によってコードされ、真核細胞において上記miR1の蓄積をモジュレートできる、DmmiPEP1b(配列番号103)に関する。

0063

特定の実施形態では、本発明は、miR8(配列番号354)の一次転写産物に含まれるヌクレオチド配列(配列番号208)によってコードされ、真核細胞において上記miR8の蓄積をモジュレートできる、DmmiPEP8(配列番号104)に関する。
特定の実施形態では、本発明は、miR155(配列番号358)の一次転写産物に含まれるヌクレオチド配列(配列番号356)によってコードされ、真核細胞において上記miR155の蓄積をモジュレートできる、HsmiPEP155(配列番号355)に関する。

0064

別の態様では、本発明は、特に植物又はヒトなどの動物に天然に存在するmiPEPのものと同一の配列を含むか又は当該配列からなる、単離されたペプチド、又は単離精製されたペプチド、又は合成ペプチド、又は組換えペプチドに関する。
別の態様では、本発明は、上記で定義した少なくとも1つの核酸分子を含むベクターに関する。

0065

また、別の態様では、本発明は、その一次転写産物が少なくとも1つのmiPEPをコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列を含み、その蓄積が上記少なくとも1つのmiPEPによってモジュレートされるマイクロRNAを発現することができる特定の真核細胞において、当該マイクロRNAによりその発現が調節される少なくとも1つの遺伝子の発現をモジュレートするための、少なくとも、
- 上記で定義したmiPEP、
- 上記miPEPをコードする核酸、又は
- 上記核酸を含むベクター
の使用に関する。

0066

また、別の態様では、本発明は、その一次転写産物が少なくとも1つのmiPEPをコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列を含み、その蓄積が上記少なくとも1つのmiPEPによってモジュレートされるマイクロRNAを発現することができる特定の真核細胞において、当該マイクロRNAによりその発現が調節される少なくとも1つの遺伝子の発現をモジュレートするための、少なくとも、
- マイクロRNAの一次転写産物に含まれるヌクレオチド配列によってコードされ、真核細胞において当該マイクロRNAの蓄積をモジュレートできる、4〜100アミノ酸、好ましくは4〜40アミノ酸のmiPEP、
- 上記miPEPをコードする核酸、又は
- 上記核酸を含むベクター
の使用に関する。

0067

また、別の態様では、本発明は、その一次転写産物が少なくとも1つのmiPEPをコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列を含み、その蓄積が上記少なくとも1つのmiPEPによってモジュレートされるマイクロRNAを発現することができる特定の真核細胞において、当該マイクロRNAによりその発現が調節される少なくとも1つの遺伝子の発現をモジュレートするための、少なくとも、
- マイクロRNAの一次転写産物に含まれるヌクレオチド配列によってコードされ、真核細胞において当該マイクロRNAの蓄積をモジュレートできる、4〜100アミノ酸又は3アミノ酸のmiPEP、
- 上記miPEPをコードする核酸、又は
- 上記核酸を含むベクター
の使用に関する。

0068

また、別の態様では、本発明は、その一次転写産物が少なくとも1つのmiPEPをコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列を含み、その蓄積が上記少なくとも1つのmiPEPによってモジュレートされるマイクロRNAを発現することができる特定の真核細胞において、当該マイクロRNAによりその発現が調節される少なくとも1つの遺伝子の発現をモジュレートするための、少なくとも、
- マイクロRNAの一次転写産物に含まれるヌクレオチド配列によってコードされ、真核細胞において当該マイクロRNAの蓄積をモジュレートできる、3アミノ酸のmiPEP、
- 上記miPEPをコードする核酸、又は
- 上記核酸を含むベクター
の使用に関する。

0069

本発明は、miPEPを用いて当該マイクロRNA蓄積をモジュレートすることによって、同一のマイクロRNAの1以上の標的遺伝子の発現をモジュレートすることができるという本発明者らによる驚くべき観察結果に基づく。

0070

1つの実施形態では、本発明は、特定の真核細胞が植物細胞である、上記で定義した使用に関する。
1つの実施形態では、本発明は、特定の真核細胞が、アラビドプシスタリアナなどのアブラナ科植物、グリシンマクス(ダイズ)、メディカゴトランカツラ及びメディカゴサティバ(アルファルファ)などのマメ科植物、ニコチアナベンサミアナ(タバコ)、ソラナムツベロサム(ジャガイモ)、ソラナムリコパーシカム(トマト)又はソラナムメロンゲナ(ナス)などのナス科植物の植物細胞である、上記で定義した使用に関する。

0071

1つの実施形態では、本発明は、特定の真核細胞が、動物細胞、特にヒト細胞である、上記で定義した使用に関する。
1つの実施形態では、本発明は、特定の真核細胞が、動物細胞、特にヒト細胞であり、miPEPが、ヒトの身体又は動物の身体の外科的処置又は治療的処置のためにも、人間の遺伝的同一性の改変のためにも用いられない、上記で定義した使用に関する。
1つの実施形態では、本発明は、特定の真核細胞が動物細胞であり、miPEPがヒトの身体又は動物の身体の外科的処置又は治療的処置に用いられる、上記で定義した使用に関する。

0072

1つの実施形態では、本発明は、マイクロRNA及び遺伝子が、特定の真核細胞において内因性のものである、上記で定義した使用に関する。
1つの実施形態では、本発明は、マイクロRNA及び遺伝子が、特定の真核細胞において外因性のものであり、当該特定の真核細胞が当該マイクロRNA及び遺伝子の発現を可能にする少なくとも1つのベクターを含む、上記で定義した使用に関する。

0073

本発明では、「内因性」及び「外因性」との表現は、種間の配列保存性に鑑みて、異なる種のマイクロRNA及び/又は遺伝子を区別するために用いられる。
よって、用語「内因性」とは、マイクロRNA及び/又は遺伝子が、懸案の細胞において天然に存在し得ることを示す。しかしながら、内因性マイクロRNA及び/又は内因性遺伝子のその他のコピーを、例えばクローニングによって、当該懸案の細胞に人工的に添加してもよい。
反対に、用語「外因性」とは、マイクロRNA及び/又は遺伝子が、懸案の細胞において天然に存在し得ないことを示す。それは、別のタイプの細胞又は別の種の生体において同定されるマイクロRNA及び/又は遺伝子である;したがって、このマイクロRNA及び/又は遺伝子は、必ず当該懸案の細胞に人工的に導入される。
したがって、本発明において、遺伝的に形質転換された細胞は、配列が類似している可能性のあるマイクロRNA及び/又は遺伝子の2つの群(一方は内因性のもので、他方は外因性のもの)を含み得る。

0074

1つの実施形態では、本発明は、miRNAの一次転写産物及び遺伝子が、マイクロRNAの一次転写産物の発現を可能にする少なくとも1つのベクターを含む特定の真核細胞において外因性のものである、上記で定義した使用に関する。
1つの実施形態では、本発明は、miRNAの一次転写産物が、人工的に細胞内に導入されるベクターによってコードされる、上記で定義した使用に関する。

0075

1つの実施形態では、本発明は、miPEPが、配列番号1〜配列番号104、配列番号375〜配列番号386及び配列番号355からなるペプチドの群から選択される、上記で定義した使用に関する(表1)。
1つの実施形態では、本発明は、miPEPが、
- 配列番号1〜配列番号104及び配列番号355、
- 配列番号375〜配列番号386、又は
- 配列番号424
からなるペプチドの群から選択される、上記で定義した使用に関する。

0076

1つの実施形態では、本発明は、miPEPが、MtmiPEP171b1 (配列番号59)、AtmiPEP164a1 (配列番号24)、AtmiPEP165a (配列番号43)、AtmiPEP319a1 (配列番号76)及びAtmiPEP319a2 (配列番号77)から選択される、上記で定義した使用に関する。
1つの実施形態では、本発明は、miPEPが、MtmiPEP171b1 (配列番号59) 、AtmiPEP164a1 (配列番号24) 、AtmiPEP165a (配列番号43) 、AtmiPEP319a1 (配列番号76) 、AtmiPEP319a2 (配列番号77) 、AtmiPEP160b1 (配列番号14) 、MtmiPEP171e (配列番号63)及びMtmiPEP169d (配列番号424)から選択される、上記で定義した使用に関する。1つの実施形態では、本発明は、miPEPが、DmmiPEP1a (配列番号102) 、DmmiPEP1b (配列番号103)及びDmmiPEP8 (配列番号104)から選択される、上記で定義した使用に関する。

0077

1つの実施形態では、本発明は、miPEPが、HsmiPEP155a (配列番号355)である、上記で定義した使用に関する。
1つの実施形態では、本発明は、核酸が、配列番号105〜配列番号208及び配列番号356からなる核酸の群から選択される、上記で定義した使用に関する(表2)。
1つの実施形態では、本発明は、核酸が、
- 配列番号105〜配列番号208及び配列番号356、
- 配列番号387〜配列番号399、又は
- 配列番号425
からなる核酸の群から選択される、上記で定義した使用に関する。

0078

1つの実施形態では、本発明は、核酸が、miORF171b (配列番号163)、miORF164a1 (配列番号128)、miORF165a (配列番号147)、miORF319a1 (配列番号180)及びmiORF319a2 (配列番号181)から選択される、上記で定義した使用に関する。
1つの実施形態では、本発明は、核酸が、miORF171b (配列番号163)、miORF164a1 (配列番号128)、miORF165a (配列番号147)、miORF319a1 (配列番号180)、miORF319a2 (配列番号181)、miORF160b1 (配列番号118)、miORF169d (配列番号425)及びmiORF171e (配列番号167)から選択される、上記で定義した使用に関する。

0079

1つの実施形態では、本発明は、核酸が、miORF1a (配列番号206)、miORF1b (配列番号207)及びmiORF8 (配列番号208)から選択される、上記で定義した使用に関する。
1つの実施形態では、本発明は、核酸が、miORF155 (配列番号356)から選択される、上記で定義した使用に関する。

0080

1つの実施形態では、本発明は、マイクロRNAが、配列番号282〜配列番号354及び配列番号358からなる核酸の群から選択される、上記で定義した使用に関する。
1つの実施形態では、本発明は、マイクロRNAが、
- 配列番号282〜配列番号354及び配列番号358、
- 配列番号412〜配列番号423、又は
- 配列番号427
からなる核酸の群から選択される、上記で定義した使用に関する。

0081

1つの実施形態では、本発明は、マイクロRNAが、miR171b (配列番号319)、miR165a (配列番号305)及びmiR319a (配列番号331)から選択される、上記で定義した使用に関する。
1つの実施形態では、本発明は、マイクロRNAが、miR171b (配列番号319)、miR164a (配列番号297)、miR165a (配列番号305)、miR319a (配列番号331)、miR160b (配列番号291)、miR171e (配列番号322)及びmiR169d (配列番号427)から選択される、上記で定義した使用に関する。

0082

1つの実施形態では、本発明は、マイクロRNAが、miR1a (配列番号353)及びmiR8 (配列番号354)から選択される、上記で定義した使用に関する。
1つの実施形態では、本発明は、マイクロRNAが、miR155 (配列番号358)から選択される、上記で定義した使用に関する。

0083

別の態様では、本発明は、特に、
-3〜100アミノ酸、好ましくは4〜20アミノ酸のサイズを有し、
-当該遺伝子の発現を調節するマイクロRNAの一次転写産物に含まれるヌクレオチド配列によってコードされるものと同一のペプチド配列を有し、
-上記マイクロRNAの蓄積をモジュレートすることができる
miPEPの、真核細胞内における蓄積工程を行うことを含み、
上記真核細胞内における上記miPEPの蓄積が、上記miPEPの蓄積がない上記遺伝子の発現に対して、上記遺伝子の発現のモジュレーションを誘導する、真核細胞におけるマイクロRNAによって調節される遺伝子の発現をモジュレートする方法に関する。

0084

別の態様では、本発明は、特に、
-4〜100アミノ酸又は3アミノ酸のサイズを有し、
-当該遺伝子の発現を調節するマイクロRNAの一次転写産物に含まれるヌクレオチド配列によってコードされるものと同一のペプチド配列を有し、
-上記マイクロRNAの蓄積をモジュレートすることができる
miPEPの、真核細胞内における蓄積工程を行うことを含み、
上記真核細胞内における上記miPEPの蓄積が、上記miPEPの蓄積がない上記遺伝子の発現に対して、上記遺伝子の発現のモジュレーションを誘導する、真核細胞におけるマイクロRNAによって調節される遺伝子の発現をモジュレートする方法に関する。

0085

別の態様では、本発明は、特に、
-3アミノ酸のサイズを有し、
-当該遺伝子の発現を調節するマイクロRNAの一次転写産物に含まれるヌクレオチド配列によってコードされるものと同一のペプチド配列を有し、
-上記マイクロRNAの蓄積をモジュレートすることができる
miPEPの、真核細胞内における蓄積工程を行うことを含み、
上記真核細胞内における上記miPEPの蓄積が、上記miPEPの蓄積がない上記遺伝子の発現に対して、上記遺伝子の発現のモジュレーションを誘導する、真核細胞におけるマイクロRNAによって調節される遺伝子の発現をモジュレートする方法に関する。

0086

特に、本発明は、
-4〜100アミノ酸、好ましくは4〜20アミノ酸のサイズを有し、
-当該遺伝子の発現を調節するマイクロRNAの一次転写産物に含まれるヌクレオチド配列によってコードされるものと同一のペプチド配列を有し、
-上記マイクロRNAの蓄積をモジュレートすることができる
miPEPの、真核細胞内における蓄積工程を行うことを含み、
上記真核細胞内における上記miPEPの蓄積が、上記miPEPの蓄積がない上記遺伝子の発現に対して、上記遺伝子の発現のモジュレーションを誘導する、真核細胞におけるマイクロRNAによって調節される遺伝子の発現をモジュレートする方法に関する。

0087

1つの実施形態では、本発明は、細胞内におけるmiPEPの蓄積が、
- 当該miPEPをコードする核酸の当該細胞内への導入、又は
- 当該miPEPの当該細胞内への導入
に起因する、上記で定義した遺伝子の発現をモジュレートする方法に関する。

0088

1つの実施形態では、本発明は、真核細胞が、植物細胞である、上記で定義した遺伝子の発現をモジュレートする方法に関する。
1つの実施形態では、本発明は、真核細胞が、動物細胞、特にヒト細胞である、上記で定義した遺伝子の発現をモジュレートする方法に関する。

0089

1つの実施形態では、本発明は、真核細胞が、動物細胞、特にヒト細胞であり、ヒトの身体又は動物の身体の外科的処置又は治療的処置のためにも、人間の遺伝的同一性の改変のためにも用いられない、上記で定義した遺伝子の発現をモジュレートする方法に関する。
1つの実施形態では、本発明は、マイクロRNA及び遺伝子が、真核細胞において内因性のものである、上記で定義した遺伝子の発現をモジュレートする方法に関する。
1つの実施形態では、本発明は、マイクロRNA及び遺伝子が、当該マイクロRNA及び遺伝子の発現を可能にする少なくとも1つのベクターを含む真核細胞において外因性のものである、上記で定義した遺伝子の発現をモジュレートする方法に関する。

0090

1つの実施形態では、本発明は、miPEPが、配列番号1〜配列番号104、配列番号375〜配列番号386及び配列番号355からなるペプチドの群から選択される、上記で定義した遺伝子の発現をモジュレートする方法に関する。
1つの実施形態では、本発明は、miPEPが、
- 配列番号1〜配列番号104及び配列番号355、
- 配列番号375〜配列番号386、又は
- 配列番号424
からなるペプチドの群から選択される、上記で定義した遺伝子の発現をモジュレートする方法に関する。

0091

特定の実施形態では、本発明は、
真核細胞におけるMtmiPEP171b1 (配列番号59)の蓄積工程を行うことを含み、
真核細胞におけるMtmiPEP171b1の蓄積は、MtmiPEP171b1の蓄積がない遺伝子の発現に対して、遺伝子発現のモジュレーションを誘導する、
真核細胞におけるmiR171b (配列番号319)により調節される遺伝子の発現をモジュレートする方法に関する。

0092

特定の実施形態では、本発明は、
真核細胞におけるMtmiPEP171b1 (配列番号59)の蓄積工程を行うことを含み、
真核細胞におけるMtmiPEP171b1の蓄積は、MtmiPEP171b1の蓄積がない遺伝子の発現に対して、遺伝子発現のモジュレーションを誘導し、
上記遺伝子が、HAM1(アクセッション番号MtGI9- TC114268)及びHAM2(アクセッション番号MtGI9- TC120850)(メディカゴトランカツラ遺伝子発現アトラス(Medicago truncatula Gene Expression Atlas)「MtGEA」データベースでのアクセッション番号)から選択される、
真核細胞におけるmiR171b (配列番号319)により調節される遺伝子の発現をモジュレートする方法に関する。

0093

特定の実施形態では、本発明は、
真核細胞におけるAtmiPEP165a1 (配列番号24)の蓄積工程を行うことを含み、
真核細胞におけるAtmiPEP164a1の蓄積は、AtmiPEP164a1の蓄積がない遺伝子の発現に対して、遺伝子発現のモジュレーションを誘導する、
真核細胞におけるmiR164a (配列番号297)により調節される遺伝子の発現をモジュレートする方法に関する。

0094

特定の実施形態では、本発明は、
真核細胞におけるAtmiPEP165a (配列番号43)の蓄積工程を行うことを含み、
真核細胞におけるAtmiPEP165aの蓄積は、AtmiPEP165aの蓄積がない遺伝子の発現に対して、遺伝子発現のモジュレーションを誘導する、
真核細胞におけるmiR165a (配列番号305)により調節される遺伝子の発現をモジュレートする方法に関する。

0095

特定の実施形態では、本発明は、
真核細胞におけるAtmiPEP319a1 (配列番号76)の蓄積工程を行うことを含み、
真核細胞におけるAtmiPEP319a1の蓄積は、AtmiPEP319a1の蓄積がない遺伝子の発現に対して、遺伝子発現のモジュレーションを誘導する、
真核細胞におけるmiR319a (配列番号331)により調節される遺伝子の発現をモジュレートする方法に関する。

0096

特定の実施形態では、本発明は、
真核細胞におけるAtmiPEP319a2 (配列番号77)の蓄積工程を行うことを含み、
真核細胞におけるAtmiPEP319a2の蓄積は、AtmiPEP319a2の蓄積がない遺伝子の発現に対して、遺伝子発現のモジュレーションを誘導する、
真核細胞におけるmiR319a (配列番号331)により調節される遺伝子の発現をモジュレートする方法に関する。

0097

特定の実施形態では、本発明は、
真核細胞におけるAtmiPEP160b1 (配列番号14)の蓄積工程を行うことを含み、
真核細胞におけるAtmiPEP160b1の蓄積は、AtmiPEP160b1の蓄積がない遺伝子の発現に対して、遺伝子発現のモジュレーションを誘導する、
真核細胞におけるmiR160b (配列番号291)により調節される遺伝子の発現をモジュレートする方法に関する。

0098

特定の実施形態では、本発明は、
真核細胞におけるMtmiPEP169d (配列番号424)の蓄積工程を行うことを含み、
真核細胞におけるMtmiPEP169dの蓄積は、MtmiPEP169dの蓄積がない遺伝子の発現に対して、遺伝子発現のモジュレーションを誘導する、
真核細胞におけるmiR169d (配列番号427)により調節される遺伝子の発現をモジュレートする方法に関する。

0099

特定の実施形態では、本発明は、
真核細胞におけるMtmiPEP171e (配列番号 63)の蓄積工程を行うことを含み、
真核細胞におけるMtmiPEP171eの蓄積は、MtmiPEP171eの蓄積がない遺伝子の発現に対して、遺伝子発現のモジュレーションを誘導する、
真核細胞におけるmiR171e (配列番号322)により調節される遺伝子の発現をモジュレートする方法に関する。

0100

特定の実施形態では、本発明は、
真核細胞におけるDmmiPEP1a (配列番号102)の蓄積工程を行うことを含み、
真核細胞におけるDmmiPEP1aの蓄積は、DmmiPEP1aの蓄積がない遺伝子の発現に対して、遺伝子発現のモジュレーションを誘導する、
真核細胞におけるmiR1 (配列番号353)により調節される遺伝子の発現をモジュレートする方法に関する。

0101

特定の実施形態では、本発明は、
真核細胞におけるDmmiPEP1b(配列番号103)の蓄積工程を行うことを含み、
真核細胞におけるDmmiPEP1bの蓄積は、DmmiPEP1bの蓄積がない遺伝子の発現に対して、遺伝子発現のモジュレーションを誘導する、
真核細胞におけるmiR1 (配列番号353)により調節される遺伝子の発現をモジュレートする方法に関する。

0102

特定の実施形態では、本発明は、
真核細胞におけるDmmiPEP8 (配列番号104)の蓄積工程を行うことを含み、
真核細胞におけるDmmiPEP8の蓄積は、DmmiPEP8の蓄積がない遺伝子の発現に対して、遺伝子発現のモジュレーションを誘導する、
真核細胞におけるmiR8 (配列番号354)により調節される遺伝子の発現をモジュレートする方法に関する。

0103

特定の実施形態では、本発明は、
真核細胞におけるhsmiPEP155 (配列番号355)の蓄積工程を行うことを含み、
真核細胞におけるhsmiPEP155の蓄積は、hsmiPEP155の蓄積がない遺伝子の発現に対して、遺伝子発現のモジュレーションを誘導する、
真核細胞におけるmiR155 (配列番号358)により調節される遺伝子の発現をモジュレートする方法に関する。

0104

別の態様では、本発明は、ペプチドが、miPEPをコードするヌクレオチド配列を有するマイクロRNAの一次転写産物の転写とは独立して真核細胞内に存在する、上記で定義したmiPEPと同一のペプチドを含む改変真核細胞に関する。

0105

本発明において、用語「改変真核細胞」とは、真核細胞が、ペプチドとして、又はmiPEPをコードするベクターとして、の如何を問わず、細胞内に人工的に導入されたmiPEPを含むことを意味する。
細胞内に人工的に導入されたmiPEPに加えて、本発明の改変真核細胞は、miPEPをコードするmiORFに対応する少なくとも1つの核酸も含む。
細胞内に人工的に導入されたmiPEP及びmiORFに加えて、本発明の改変真核細胞は、その一次転写産物がmiORFを含む少なくとも1つのmiRNAも含む。

0106

1つの実施形態では、本発明は、マイクロRNAが内因性のものである、上記で定義した改変真核細胞に関する。
別の実施形態では、本発明は、マイクロRNAが外因性のものであり、改変真核細胞がマイクロRNAの発現を可能にするベクターを含む、上記で定義した改変真核細胞に関する。

0107

1つの実施形態では、本発明は、植物細胞である上記で定義した改変真核細胞に関する。
1つの実施形態では、本発明は、植物細胞が、メディカゴトランカツラ又はアラビドプシスタリアナの細胞であり、ペプチドが、
- 配列番号1〜配列番号101、
- 配列番号375〜配列番号386、又は
- 配列番号424
からなるペプチドの群から選択される、上記で定義した改変真核細胞に関する。

0108

1つの実施形態では、本発明は、植物細胞が、メディカゴトランカツラ又はアラビドプシスタリアナの細胞であり、ペプチドが、配列番号43、配列番号59及び配列番号77からなる群から選択される、上記で定義した改変真核細胞に関する。
1つの実施形態では、本発明は、植物細胞が、メディカゴ トランカツラ又はアラビドプシス タリアナの細胞であり、ペプチドが、配列番号59、配列番号24、配列番号43、配列番号76、配列番号77、配列番号14、配列番号424及び配列番号63からなる群から選択される、上記で定義した改変真核細胞に関する。

0109

1つの実施形態では、本発明は、動物細胞である上記で定義した改変真核細胞に関する。
1つの実施形態では、本発明は、動物細胞がドロソフィラ属動物細胞であり、ペプチドが、配列番号102、配列番号103及び配列番号104からなるペプチドの群から選択される、上記で定義した改変真核細胞に関する。
1つの実施形態では、本発明は、動物細胞がヒト細胞であり、ペプチドが、配列番号355からなる、上記で定義した改変真核細胞に関する。

0110

別の態様では、本発明は、上記で定義した少なくとも1つの改変真核細胞を含む植物に関する。
また、別の態様では、本発明は、上記で定義した少なくとも1つの改変真核細胞を含む非ヒト動物に関する。

0111

別の態様では、本発明は、少なくとも、
- 上記で定義したmiPEP、
- 上記miPEPをコードする核酸、又は
- 上記核酸を含むベクター
を含む組成物に関する。

0112

別の態様では、本発明は、
- 配列番号1〜配列番号101、
- 配列番号375〜配列番号386、又は
- 配列番号424
からなる群から選択される少なくとも1つのmiPEPを含む組成物に関する。

0113

別の態様では、本発明は、少なくとも、
- 上記で定義したmiPEP、
- 上記miPEPをコードする核酸、又は
- 上記核酸を含むベクター
を含む害虫駆除用組成物に関する。

0114

別の態様では、本発明は、少なくとも、
- 上記で定義したmiPEP、
- 上記miPEPをコードする核酸、又は
- 上記核酸を含むベクター
を含む植物用薬剤組成物(composition phytopharmaceutique)に関する。

0115

別の態様では、本発明は、少なくとも、
- 上記で定義したmiPEP、
- 上記miPEPをコードする核酸、又は
- 上記核酸を含むベクター
を含むエリシター組成物(composition elicitrice)に関する。

0116

「エリシター組成物」とは、優れた共生能、又は熱ストレス水分ストレス若しくは化学的ストレスのそれらの性質の如何を問わず種々のストレスに対する優れた耐性を植物に付与することができる組成物を指す。
この目的のために、本発明は、植物の成長(成長阻害、又は反対に、成長促進)及び生理的機能(より優れた菌根形成能、より優れた根粒形成能、種々のストレスに対してのより優れた耐性)に作用する組成物にも関する。
特に、本発明は、植物の成長を促進させるための組成物に関する。

0117

別の態様では、本発明は、少なくとも、
- 上記で定義したmiPEP、
- 上記miPEPをコードする核酸、又は
- 上記核酸を含むベクター
を含む除草用組成物に関する。

0118

別の態様では、本発明は、少なくとも、
- 上記で定義したmiPEP、
- 上記miPEPをコードする核酸、又は
- 上記核酸を含むベクター
を含む昆虫綱動物駆除用組成物に関する。

0119

別の態様では、本発明は、好ましくは配列番号24からなるmiPEP164aを活性成分として含む組成物、特に植物衛生用組成物(composition phytosanitaire)に関する。
別の態様では、本発明は、好ましくは配列番号76からなるmiPEP319aを活性成分として含む組成物、特に植物衛生用組成物に関する。

0120

別の態様では、本発明は、好ましくは配列番号59からなるmiPEP171bを活性成分として含む組成物、特に植物衛生用組成物に関する。
別の態様では、本発明は、好ましくは配列番号43からなるmiPEP165aを活性成分として含む組成物、特に植物衛生用組成物に関する。

0121

別の態様では、本発明は、好ましくは配列番号77からなるmiPEP319a2を活性成分として含む組成物、特に植物衛生用組成物に関する。
別の態様では、本発明は、好ましくは配列番号14からなるmiPEP160b1を活性成分として含む組成物、特に植物衛生用組成物に関する。

0122

別の態様では、本発明は、好ましくは配列番号424からなるmiPEP169dを活性成分として含む組成物、特に植物衛生用組成物に関する。
別の態様では、本発明は、好ましくは配列番号63からなるmiPEP171eを活性成分として含む組成物、特に植物衛生用組成物に関する。miPEPの溶解特性は、特に、それらのアミノ酸組成によって決まる。親水性のmiPEPは、水などの水性溶液中に溶解し、容器詰めすることができる。疎水性のmiPEPは、有機溶媒などの溶媒中に溶解し、容器詰めすることができる。

0123

miPEPを用いる植物の処置について、有機溶媒は、少量では植物に非毒性の溶媒である。すなわち、それらは、植物の発達に対して有害な効果を有しない。限定されないが、有機溶媒は、アセトニトリル及び酢酸から選択することができる。

0124

また、miPEPは、例えばアセトニトリルと酢酸との混合物のような有機溶媒混合物中に溶解し、容器詰めすることができる。特に、miPEPは、50%アセトニトリル、10%酢酸及び40%水(体積/体積/体積)を含む溶液中に溶解することができる。
好ましくは、miPEP164a及びmiPEP165aは水に溶解し、miPEP171b及びmiPEP319aは50%アセトニトリル、10%酢酸及び40%水(体積/体積/体積)を含む溶液に溶解する。

0125

限定されないが、上記で定義した組成物、害虫駆除用組成物、植物用薬剤組成物、除草用組成物及び昆虫綱動物駆除用組成物は、10-9 M〜10-4 MのmiPEP、特に10-9 M、10-8 M、10-7 M、10-6 M、10-5 M又は10-4 MのmiPEPを含み得る。
想定される適用に依存して、より高濃度又はより低濃度の組成物が提供されてもよい。例えば、miPEPを散布によって植物に適用しなければならない場合には、10-1 M〜10-3 MのmiPEP、特に10-1 M、10-2 M又は10-3 MのmiPEPを含む組成物が想定され得る。

0126

別の態様では、本発明は、植物を根絶するか、又はその成長を遅延させるための除草剤としての、好ましくは植物の種又は属に特異的な除草剤としての上記で定義した組成物の使用に関する。

0127

別の態様では、本発明は、
-植物の成長及び/又は発達を促進するための、
特に植物の生理的パラメータ、特にバイオマス、葉の表面積開花果実のサイズ、植物種子の産生及び/又は選択をモジュレートするための、
特に単為結実又は雌雄同体を制御するための、又は
植物種子の生理的パラメータ、特に発、根系の根張り及び水分ストレス耐性を改変するための、又は
-植物病害の予防又は治療のための、
特に感染性疾患への耐性を促進するための、
植物用薬剤としての上記で定義した組成物の使用に関する。

0128

別の態様では、本発明は、植物の生理的パラメータ、特にバイオマス、葉の表面積又は果実のサイズをモジュレートするための、上記で定義した組成物の使用に関する。
1つの実施形態では、本発明は、果実のサイズを大きくすることを目的として果樹をまばらにするための、上記で定義した組成物の使用に関する。
1つの実施形態では、本発明は、植物の単為結実又は雌雄同体を制御するために用いられる、植物種子の産生及び/又は選択のための上記で定義した組成物の使用に関する。

0129

1つの実施形態では、本発明は、葉又は根を介して植物に投与される、上記で定義した組成物の使用に関する。
1つの実施形態では、本発明は、植物種子の産生及び/又は選択のための、上記で定義した組成物の使用に関する。

0130

1つの実施形態では、本発明は、植物種子の生理的パラメータ、特に根系の根張り、発芽及び水分ストレス耐性を改変するために用いられる、上記で定義した組成物の使用に関する。
1つの実施形態では、本発明は、植物種子のコーティング又はフィルムコーティングによって適用される、上記で定義した組成物の使用に関する。

0131

別の態様では、本発明は、植物に有害な生物又はそのように分類され得る生物を根絶するための害虫駆除剤、特に昆虫綱動物駆除剤クモ動物駆除剤、軟体動物門動物駆除剤又はネズミ目動物駆除剤としての、上記で定義した組成物の使用に関する。
1つの実施形態では、本発明は、昆虫綱動物駆除剤としての、上記で定義した組成物の使用に関する。
1つの実施形態では、本発明は、昆虫綱動物の害虫を根絶するための、上記で定義した組成物の使用に関する。

0132

1つの実施形態では、本発明は、有害なものとして分類される動物種又はそのように分類されがちな動物種、特にネズミ科動物、特にラットを根絶するための、上記で定義した組成物の使用に関する。
1つの実施形態では、本発明は、特に植物又は当該植物に接している支持体に適用することによって、植物に有害であるか又はそのように分類されがちな生物を根絶するための害虫駆除剤、特に昆虫綱動物駆除剤、クモ綱動物駆除剤、軟体動物門動物駆除剤又はネズミ目動物駆除剤としての、上記で定義した組成物の使用に関する。

0133

別の態様では、本発明は、昆虫綱動物の害虫から植物を保護するために当該植物に適用される、上記で定義した組成物の使用に関する。
別の態様では、本発明は、植物の成長を促進させるためのペプチドの使用であって、
上記ペプチドは、上記植物に導入されており、
上記ペプチドは、上記植物において天然に存在するmiPEPのものと同一の配列を含むか又は当該配列からなるアミノ酸配列を有し、
上記植物において天然に存在する上記miPEPは、その配列がmiRNAの一次転写産物上に位置するオープンリーディングフレームによってコードされる4〜100アミノ酸のペプチドであり、
上記miPEPは、上記植物における上記miRNAの蓄積をモジュレートすることができ、
上記miRNAは、植物の生長部分又は繁殖部分、特に根、、葉又は花の発達に関与する少なくとも1つの遺伝子の発現を調節する、使用に関する。

0134

驚くべきことに、本発明者らは、その配列が、miRNAの一次転写産物によってコードされるmiPEPのものと同一の配列を含むか又は当該配列からなるペプチドを用いて、植物の成長を促進することができることを見出した。

0135

本発明において、用語「植物」とは、一般に、発達の段階に拘りなく植物の全体又は部分(種又は若芽(jeune pousse)の形態の植物を含む)、植物の1以上の器官(例えば葉、根、茎、花)、植物の1以上の細胞又は植物細胞のクラスタをいう。
本発明において、用語「成長」とは、時間を経ての、植物の全体又は部分の発達をいう。よって、植物の成長は、植物の特定の部分、細胞又は器官、例えば葉、根、茎又は花について観察可能な発達のパラメータモニタリングすることによって、測定及び定量され得る。

0136

限定されないが、植物の成長を測定及び定量するためのパラメータは、特に、
-葉のサイズ、表面積、体積、質量及び数、
-花のサイズ及び数、
-茎(又は)のサイズ、
-根の長さ及び数、
-発芽(germination)の早さ
-つぼみ形成(bourgeonnement)の早さ
-開花誘導(又は開花期への移行)の早さ、又は
-細胞数
であり得る。
マメ科植物の場合、植物の成長は、根の根粒形成率又は根粒のサイズ及び数にも関連付けられ得る。

0137

更に、本発明において、表現「植物の成長の促進」又は「植物の成長の改善」とは、
-発達の加速化(例えば、参照用植物に対しての、所定の時点における植物の葉のサイズの巨大化等)、
- 発達の増大(例えば、参照用植物では達成できない植物の葉のサイズの巨大化等)、又は
- 植物の発達における加速化及び増大
のいずれかを示す。

0138

miPEPは植物において天然に存在するペプチドなので、本発明による使用は、園芸又は農業における慣用化学的方法と比較して環境に優しいという利点を有することに着目することが重要である。

0139

また、本発明は、植物の成長を促進するための、当該植物に導入されるmiPEPの使用であって、
上記導入されるmiPEPは、上記植物において天然に存在するmiPEPのものと同一の配列を含むか又は当該配列からなるペプチドであり、
上記天然に存在するmiPEPは、その配列が、miRNAの一次転写産物の5'に位置するオープンリーディングフレームによってコードされる4〜100アミノ酸のペプチドであり、
上記miPEPは、上記植物における上記miRNAの蓄積をモジュレートすることができ、
上記miRNAは、植物の生長部分又は繁殖部分、特に根、茎、葉又は花の発達に関与する少なくとも1つの遺伝子の発現を調節し、
上記導入されるmiPEP量及び天然に存在するmiPEP量の総和は、天然に存在するmiPEP量よりも厳密に大きい、使用に関する。

0140

本発明において、表現「導入されるmiPEP」は、「植物において天然に存在するmiPEP」とは反対に、植物に人工的に導入されるmiPEPをいう。したがって、植物へのmiPEPの導入は、自然な現象ではなく、交雑にも選択にも相当しない技術的な工程である。
導入されるmiPEPは、植物の外部で産生されたペプチド(例えば、単離及び/又は精製されたペプチド、合成ペプチド又は組換えペプチド)又はmiPEPをコードする核酸の植物への非自然的導入後の植物において産生されたペプチドのいずれかであり得る。

0141

miPEPが導入されていない植物は、天然に存在するmiPEP量に相当するmiPEP基底量を有する。miPEPのものと同一の配列を含むか又は当該配列からなるmiPEPの使用は、その一次転写産物がmiPEPをコードする配列を含むmiRNAの蓄積をモジュレートするmiPEPの総量の増大をもたらす。
更に、導入されるmiPEPは、植物において存在し、その導入は、その安定性に対する影響を有しない。

0142

1つの実施形態では、本発明は、植物の生長部分又は繁殖部分の発達に関与する遺伝子が、NAC1 (アクセッション番号AT1G56010.1)、NAC4 (アクセッション番号AT5G07680.1)、NAC5 (アクセッション番号AT5G61430.1)、CUC1 (アクセッション番号AT3G15170.1)、CUC2 (アクセッション番号AT5G53950.1)、TCP3 (アクセッション番号AT1G53230.1)及びTCP4 (アクセッション番号AT3G15030.1) (アラビドプシス情報資源「TAIR」(The Arabidopsis Information Resource)データベースによるアクセッション番号)からなる群から選択される、上記で定義した使用に関する。

0143

特に、本発明は、植物の生長部分又は繁殖部分の発達に関与する遺伝子が、NAC1、NAC4、NAC5、CUC1及びCUC2からなる群から選択される、上記で定義した使用に関する。
1つの実施形態では、本発明は、植物の生長部分又は繁殖部分の発達に関与する遺伝子が、TCP3及びTCP4からなる群から選択される、上記で定義した使用に関する。

0144

1つの実施形態では、本発明は、miRNAが、miR164a及びmiR319aから選択される、上記で定義した使用に関する。
1つの実施形態では、本発明は、miRNAが、miR164a、miR319a、miR171b、miR165a、miR160b、miR169d及びmiR171eから選択される、上記で定義した使用に関する。
1つの実施形態では、本発明は、miPEPが、AtmiPEP164a1、AtmiPEP319a1、AtmiPEP319a2、MtmiPEP171b1、AtmiPEP165a1、AtmiPEP160b1、MtmiPEP169d、MtmiPEP171eから選択される、上記で定義した使用に関する。

0145

特に、本発明は、miR164aが、配列番号297からなるヌクレオチド配列を有する、上記で定義した使用に関する。
特に、本発明は、miR164aが、配列番号297のヌクレオチド配列と少なくとも80%の同一性、好ましくは少なくとも90%の同一性を有するヌクレオチド配列を有する、上記で定義した使用に関する。
1つの実施形態では、本発明は、miPEPが、AtmiPEP164a1であり、特にAtmiPEP164a1が、配列番号24からなるアミノ酸配列を有する上記で定義した使用に関する。

0146

特に、本発明は、miR319aが、配列番号331からなるヌクレオチド配列を有する、上記で定義した使用に関する。
特に、本発明は、miR319aが、配列番号331のヌクレオチド配列と少なくとも80%の同一性、好ましくは少なくとも90%の同一性を有するヌクレオチド配列を有する、上記で定義した使用に関する。
1つの実施形態では、本発明は、miPEPが、AtmiPEP319a1であり、特にAtmiPEP319a1が、配列番号76からなるアミノ酸配列を有する、上記で定義した使用に関する。

0147

1つの実施形態では、本発明は、植物が、アラビドプシスタリアナなどのアブラナ科植物、グリシンマクス(ダイズ)、メディカゴトランカツラ及びメディカゴサティバ(アルファルファ)などのマメ科植物又はニコチアナベンサミアナ(タバコ)、ソラナムツベロサム(ジャガイモ)、ソラナムリコパーシカム(トマト)若しくはソラナムメロンゲナ(ナス)などのナス科植物である、上記で定義した使用に関する。
1つの実施形態では、本発明は、植物が、アブラナ科植物である、上記で定義した使用に関する。
1つの実施形態では、本発明は、植物が、アラビドプシス タリアナである、上記で定義した使用に関する。

0148

1つの実施形態では、本発明は、アラビドプシスタリアナ種植物の成長を促進するための上記で定義した使用であって、
AtmiPEP164a1は、アラビドプシス タリアナ種植物に導入され、
AtmiPEP164a1は、アラビドプシス タリアナ種植物において天然に存在するものでもあり、
導入されるAtmiPEP164a1は、その配列が天然に存在するAtmiPEP164a1のものと同一の配列を含むか又は当該配列からなるペプチドであり、
天然に存在するAtmiPEP164a1の配列は、miR164aの一次転写産物の5'に位置するオープンリーディングフレームによってコードされ、
miR164aは、アラビドプシス タリアナの生長部分又は繁殖部分の発達に関与する少なくとも1つの遺伝子の発現を制御し、
導入されるAtmiPEP164a1量及び天然に存在するAtmiPEP164a1量の総和は、アラビドプシス タリアナ種植物において天然に存在するAtmiPEP164a1量よりも厳密に大きい、使用に関する。

0149

1つの実施形態では、本発明は、アラビドプシスタリアナ種植物の成長を促進させるための、上記で定義した使用であって、
AtmiPEP319a1は、アラビドプシス タリアナ種植物に導入され、
AtmiPEP319a1は、アラビドプシス タリアナ種植物において天然に存在するものでもあり、
導入されるAtmiPEP319a1は、その配列が天然に存在するAtmiPEP319a1のものと同一の配列を含むか又は当該配列からなるペプチドに導入され、
天然に存在するAtmiPEP319a1の配列は、miR319aの一次転写産物の5'に位置するオープンリーディングフレームによってコードされ、
miR319aは、アラビドプシス タリアナの生長部分又は繁殖部分の発達に関与する少なくとも1つの遺伝子の発現を制御し、
導入されるAtmiPEP319a1量及び天然に存在するAtmiPEP319a1量の総和は、アラビドプシス タリアナ種植物において天然に存在するAtmiPEP319a1量よりも厳密に大きい、使用に関する。

0150

1つの実施形態では、本発明は、miPEPが、好ましくは散水噴霧又は肥料堆肥培養土又は不活性な支持体を添加することによって、外部から植物に導入される、上記で定義した使用に関する。
1つの実施形態では、本発明は、miPEPが、散水及び噴霧することによって導入される、上記で定義した使用に関する。
1つの実施形態では、本発明は、miPEPが、散水及び肥料を添加することによって導入される、上記で定義した使用に関する。
1つの実施形態では、本発明は、miPEPが、噴霧及び肥料を添加することによって導入される、上記で定義した使用に関する。
1つの実施形態では、本発明は、miPEPが、散水、噴霧及び肥料を添加することによって導入される、上記で定義した使用に関する。

0151

事実、本発明者らは、植物において、対応するmiRNAの蓄積をモジュレートするために、miPEPを含む組成物を植物に直接適用できることを予期せぬことに見出した。このことは、miPEPが、植物によって捕捉されることを示す。
1つの実施形態では、本発明は、植物が、10-9 M〜10-4 MのmiPEPを含む組成物、特に10-9 M、10-8 M、10-7 M、10-6 M、10-5 M又は10-4 MのmiPEPを含む組成物を用いて処置される、上記で定義した使用に関する。
好ましくは、植物に散水又は噴霧することによって適用するために、組成物は、10-8 M〜10-5 Mの濃度を有する。
加えて、より高濃度又はより低濃度の組成物が、miPEPを用いての植物の処置のために想定され得る。限定されないが、例えば、導入される外因性miPEPを散布によって植物に適用する場合には、10-1 M〜10-3 M、特に10-2 MのmiPEPを含む、より高濃度の組成物が用いられ得る。

0152

1つの実施形態では、本発明は、miPEPをコードする核酸によりmiPEPが植物に導入され、上記核酸が植物に導入される、上記で定義した使用に関する。
1つの実施形態では、本発明は、miPEPが導入されている植物における茎サイズが、miPEPが何も導入されていないか、又は上記のmiPEPが導入されていない同齢の同じ植物における茎サイズと比較して増大される、上記で定義した使用に関する。

0153

1つの実施形態では、本発明は、miPEPが導入されている植物における葉の数が、miPEPが何も導入されていないか、又は上記のmiPEPが導入されていない同齢の同じ植物における葉の数と比較して増大される、上記で定義した使用に関する。
1つの実施形態では、本発明は、miPEPが導入されている植物における葉のサイズが、miPEPが何も導入されていないか、又は上記のmiPEPが導入されていない同齢の同じ植物における葉のサイズと比較して増大される、上記で定義した使用に関する。

0154

1つの実施形態では、本発明は、miPEPが導入されている植物における根の数が、miPEPが何も導入されていないか、又は上記のmiPEPが導入されていない同齢の同じ植物における根の数と比較して増大される、上記で定義した使用に関する。
1つの実施形態では、本発明は、miPEPが導入されている植物における根の長さが、miPEPが何も導入されていないか、又は上記のmiPEPが導入されていない同齢の同じ植物における根の長さと比較して増大される、上記で定義した使用に関する。

0155

1つの実施形態では、本発明は、miPEPが導入されている植物における根粒形成率が、miPEPが何も導入されていないか、又は上記のmiPEPが導入されていない同齢の同じ植物における根粒形成率と比較して増大される、上記で定義した使用に関する。
1つの実施形態では、本発明は、miPEPが導入されている植物における根粒数が、miPEPが何も導入されていないか、又は上記のmiPEPが導入されていない同齢の同じ植物における根粒数と比較して増大される、上記で定義した使用に関する。

0156

miPEPが導入されている植物における成長を測定及び定量するためのパラメータ(例えば茎サイズ、葉の数及びサイズ、根の数及び長さ、根の根粒形成率又は根粒数)の増大は、好ましくは、同一条件下で育ったがmiPEPが何も導入されていない同齢の同じ植物(すなわち、同種及び/又は変種の植物)との比較によって証明される。

0157

別の態様では、本発明は、植物において天然に存在するものでもあるmiPEPを当該植物に導入する工程を含む、植物の成長を促進するための方法であって、
導入されるmiPEPは、その配列が、天然に存在するmiPEPのものと同一の配列を含むか又は当該配列からなる4〜100アミノ酸のペプチドであり、
天然に存在するmiPEPの配列は、miRNAの一次転写産物の5'に位置するオープンリーディングフレームによってコードされ、
miPEPは、miRNAの蓄積をモジュレートすることができ、
miRNAは、植物の生長部分又は繁殖部分、特に根、茎、葉又は花の発達に関与する少なくとも1つの遺伝子の発現を調節し、
導入されるmiPEP量及び天然に存在するmiPEP量の総和が、天然に存在するmiPEPの量よりも厳密に大きい、方法に関する。

0158

1つの実施形態では、本発明は、植物の生長部分又は繁殖部分の発達に関与する遺伝子が、NAC1 (アクセッション番号AT1G56010.1)、NAC4 (アクセッション番号AT5G07680.1)、NAC5 (アクセッション番号AT5G61430.1)、CUC1 (アクセッション番号AT3G15170.1)、CUC2 (アクセッション番号AT5G53950.1)、TCP3 (アクセッション番号AT1G53230.1)及びTCP4 (アクセッション番号AT3G15030.1)からなる群から選択される、上記で定義した方法に関する。
特に、本発明は、植物の生長部分又は繁殖部分の発達に関与する遺伝子が、NAC1、NAC4、NAC5、CUC1及びCUC2からなる群から選択される、上記で定義した方法に関する。
1つの実施形態では、本発明は、植物の生長部分又は繁殖部分の発達に関与する遺伝子が、TCP3及びTCP4からなる群から選択される、上記で定義した方法に関する。

0159

1つの実施形態では、本発明は、miRNAが、miR164a、miR319a、miR171b、miR165a、miR160b、miR169d及びmiR171eから選択される、上記で定義した方法に関する。
1つの実施形態では、本発明は、miPEPが、AtmiPEP164a1、AtmiPEP319a1、AtmiPEP319a2、MtmiPEP171b1、AtmiPEP165a1、AtmiPEP160b1、MtmiPEP169d、MtmiPEP171eから選択される、上記で定義した方法に関する。
1つの実施形態では、本発明は、miRNAがmiR164aであり、特にmiR164aが配列番号297からなるヌクレオチド配列を有する、上記で定義した方法に関する。
1つの実施形態では、本発明は、miPEPがAtmiPEP164a1であり、特にAtmiPEP164a1が配列番号24からなるアミノ酸配列を有する、上記で定義した方法に関する。

0160

1つの実施形態では、本発明は、miRNAがmiR319aであり、特にmiR319aが配列番号331からなるヌクレオチド配列を有する、上記で定義した方法に関する。
1つの実施形態では、本発明は、miPEPがAtmiPEP319a1であり、特にAtmiPEP319a1が配列番号76からなるアミノ酸配列を有する、上記で定義した方法に関する。

0161

1つの実施形態では、本発明は、植物が、アラビドプシスタリアナなどのアブラナ科植物、グリシンマクス(ダイズ)、メディカゴトランカツラ及びメディカゴサティバ(アルファルファ)などのマメ科植物又はニコチアナベンサミアナ(タバコ)、ソラナムツベロサム(ジャガイモ)、ソラナムリコパーシカム(トマト)若しくはソラナムメロンゲナ(ナス)などのナス科植物である、上記で定義した方法に関する。
1つの実施形態では、本発明は、植物がアブラナ科植物である、上記で定義した方法に関する。
1つの実施形態では、本発明は、植物がアラビドプシス タリアナである、上記で定義した方法に関する。

0162

1つの実施形態では、本発明は、アラビドプシスタリアナ種植物の成長を促進するための、上記で定義した方法であって、
AtmiPEP164a1は、アラビドプシス タリアナ種植物に導入され、
AtmiPEP164a1は、アラビドプシス タリアナ種植物において天然に存在するものでもあり、
導入されるAtmiPEP164a1は、その配列がmiR164aの一次転写産物の5'に位置するオープンリーディングフレームによってコードされる4〜100アミノ酸のペプチドである天然に存在するAtmiPEP164a1のものと同一の配列を含むか又は当該配列からなるペプチドであり、
AtmiPEP164a1は、アラビドプシス タリアナの生長部分又は繁殖部分の発達に関与する少なくとも1つの遺伝子の発現を調節するmiR164a蓄積を増大させることができ、
導入されるAtmiPEP164a1量及び天然に存在するAtmiPEP164a1量の総和は、天然に存在するAtmiPEP164a1量よりも厳密に大きい、方法に関する。

0163

1つの実施形態では、本発明は、アラビドプシスタリアナ種植物の成長を促進するための、上記で定義した方法であって、
AtmiPEP319a1は、アラビドプシス タリアナ種植物に導入され、
AtmiPEP319a1は、アラビドプシス タリアナ種植物において天然に存在するものでもあり、
導入されるAtmiPEP319a1は、その配列がmiR319aの一次転写産物の5'に位置するオープンリーディングフレームによってコードされる4〜100アミノ酸のペプチドである天然に存在するAtmiPEP319a1のものと同一の配列を含むか又は当該配列からなるペプチドであり、
AtmiPEP319a1は、アラビドプシス タリアナの生長部分又は繁殖部分の発達に関与する少なくとも1つの遺伝子の発現を調節するmiR319aの蓄積を増大させることができ、
導入されるAtmiPEP319a1量及び天然に存在するAtmiPEP319a1量の総和は、天然に存在するAtmiPEP319a1量よりも厳密に大きい、方法に関する。

0164

1つの実施形態では、本発明は、miPEPが、好ましくは肥料、堆肥、培養土又は不活性な支持体を散水、噴霧又は添加することによって、外部から植物に導入される、上記で定義した方法に関する。
1つの実施形態では、本発明は、miPEPが、10-9 M〜10-4 MのmiPEPを含む組成物、特に10-9、10-8、10-7、10-6、10-5又は10-4 MのmiPEPを含む組成物の形態で植物に投与される、上記で定義した方法に関する。
1つの実施形態では、本発明は、miPEPが、当該miPEPをコードする核酸により植物に導入され、上記の核酸が植物に導入される、上記で定義した方法に関する。

0165

1つの実施形態では、本発明は、miPEPが導入されている植物の茎サイズが、miPEPが何も導入されていないか又は上記のmiPEPが導入されていない同齢の同じ植物の茎サイズと比べて増大される、上記で定義した方法に関する。
1つの実施形態では、本発明は、miPEPが導入されている植物の葉の数が、miPEPが何も導入されていないか又は上記のmiPEPが導入されていない同齢の同じ植物の葉の数と比べて増大される、上記で定義した方法に関する。

0166

1つの実施形態では、本発明は、miPEPが導入されている植物の葉のサイズが、miPEPが何も導入されていないか又は上記のmiPEPが導入されていない同齢の同じ植物の葉のサイズと比べて増大される、上記で定義した方法に関する。
1つの実施形態では、本発明は、miPEPが導入されている植物の根の数が、miPEPが何も導入されていないか又は上記のmiPEPが導入されていない同齢の同じ植物の根の数と比べて増大される、上記で定義した方法に関する。

0167

1つの実施形態では、本発明は、miPEPが導入されている植物の根の長さが、miPEPが何も導入されていないか又は上記のmiPEPが導入されていない同齢の同じ植物の根の長さと比べて増大される、上記で定義した方法に関する。
1つの実施形態では、本発明は、miPEPが導入されている植物の根粒形成率が、miPEPが何も導入されていないか又は上記のmiPEPが導入されていない同齢の同じ植物の根粒形成率と比べて増大される、上記で定義した方法に関する。

0168

1つの実施形態では、本発明は、miPEPが導入されている植物の根粒数が、miPEPが何も導入されていないか又は上記のmiPEPが導入されていない同齢の同じ植物の根粒数と比べて増大される、上記で定義した方法に関する。
別の態様では、本発明は、植物の成長を促進するための上記で定義した使用又は方法に従ってmiPEPが導入されている植物に関する。

0169

別の態様では、本発明は、
a)miPEPの発現を可能にする条件下で、植物に、又は植物の少なくとも1つの細胞に、4〜100アミノ酸のmiPEPをコードする核酸を導入する工程であって、
上記miPEPは、上記植物において天然に存在するものでもあり、
上記天然に存在するmiPEPは、その配列がmiRNAの一次転写産物の5'に位置するオープンリーディングフレームによってコードされるペプチドであり、
上記miPEPは、植物における上記miRNAの蓄積をモジュレートすることができ、
上記miRNAは、植物の生長部分又は繁殖部分、特に根、茎、葉又は花の発達に関与する少なくとも1つの遺伝子の発現を調節する、工程と、
b)トランスジェニック植物の取得を可能にする条件下で、工程a)において得られた植物又は植物の少なくとも1つの細胞を培養する工程と
を含む、トランスジェニック植物を製造する方法に関する。

0170

別の態様では、本発明は、
a)miPEPの発現を可能にする条件下で、植物に、又は植物の少なくとも1つの細胞に、4〜100アミノ酸又は3アミノ酸のmiPEPをコードする核酸を導入する工程であって、
上記miPEPは、上記植物において天然に存在するものでもあり、
上記天然に存在するmiPEPは、その配列がmiRNAの一次転写産物の5'に位置するオープンリーディングフレームによってコードされるペプチドであり、
上記miPEPは、植物における上記miRNAの蓄積をモジュレートすることができ、
上記miRNAは、植物の生長部分又は繁殖部分、特に根、茎、葉又は花の発達に関与する少なくとも1つの遺伝子の発現を調節する、工程と、
b)トランスジェニック植物の取得を可能にする条件下で、工程a)において得られた植物又は植物の少なくとも1つの細胞を培養する工程と
を含む、トランスジェニック植物を製造する方法に関する。

0171

別の態様では、本発明は、
a)miPEPの発現を可能にする条件下で、植物に、又は植物の少なくとも1つの細胞に、3アミノ酸のmiPEPをコードする核酸を導入する工程であって、
上記miPEPは、上記植物において天然に存在するものでもあり、
上記天然に存在するmiPEPは、その配列がmiRNAの一次転写産物の5’に位置するオープンリーディングフレームによってコードされるペプチドであり、
上記miPEPは、植物における上記miRNAの蓄積をモジュレートすることができ、
上記miRNAは、植物の生長部分又は繁殖部分、特に根、茎、葉又は花の発達に関与する少なくとも1つの遺伝子の発現を調節する、工程と、
b)トランスジェニック植物の取得を可能にする条件下で、工程a)において得られた植物又は植物の少なくとも1つの細胞を培養する工程と
を含む、トランスジェニック植物を製造する方法に関する。

0172

1つの実施形態では、本発明は、核酸が導入されていない同一の植物と比較して、工程b)において得られたトランスジェニック植物の成長が改善されている、上記で定義したトランスジェニック植物の製造方法に関する。
1つの実施形態では、本発明は、植物に導入される核酸によってコードされるmiPEPの発現が、核酸が導入されていない同一の植物と比較して、成長の改善をもたらす、上記で定義したトランスジェニック植物の製造方法に関する。

0173

1つの実施形態では、本発明は、工程a)が、核酸を含むベクター、好ましくはプラスミドを用いて行われる、上記で定義したトランスジェニック植物の製造方法に関する。
1つの実施形態では、本発明は、工程a)の核酸の発現が、強力なプロモータ、好ましくは強力な構成性プロモータ、例えば35Sプロモータの制御下に置かれている、上記で定義したトランスジェニック植物の製造方法に関する。

0174

1つの実施形態では、本発明は、植物の生長部分又は繁殖部分の発達に関与する遺伝子が、NAC1 (アクセッション番号 AT1G56010.1)、NAC4 (アクセッション番号AT5G07680.1)、NAC5 (アクセッション番号AT5G61430.1)、CUC1 (アクセッション番号AT3G15170.1)、CUC2 (アクセッション番号AT5G53950.1)、TCP3 (アクセッション番号AT1G53230.1)及びTCP4 (アクセッション番号AT3G15030.1)からなる群から選択される、上記で定義したトランスジェニック植物の製造方法に関する。

0175

1つの実施形態では、本発明は、miPEPが、配列番号1〜配列番号101及び配列番号375〜配列番号386からなる群から選択される配列を含むか又は当該配列からなるアミノ酸配列を有する、上記で定義したトランスジェニック植物の製造方法に関する。
1つの実施形態では、本発明は、miPEPが、
- 配列番号1〜配列番号101、
- 配列番号375〜配列番号386、又は
- 配列番号424
からなる群から選択される配列を含むか又は当該配列からなるアミノ酸配列を有する、上記で定義したトランスジェニック植物の製造方法に関する。

0176

1つの実施形態では、本発明は、miRNAがmiR164aであり、特にmiR164aが配列番号297からなるヌクレオチド配列を有する、上記で定義したトランスジェニック植物の製造方法に関する。
1つの実施形態では、本発明は、miPEPがAtmiPEP164a1であり、特にAtmiPEP164a1が配列番号24からなるアミノ酸配列を有する、上記で定義したトランスジェニック植物の製造方法に関する。

0177

1つの実施形態では、本発明は、miRNAがmiR319aであり、特にmiR319aが配列番号331からなるヌクレオチド配列を有する、上記で定義したトランスジェニック植物の製造方法に関する。
1つの実施形態では、本発明は、miPEPがAtmiPEP319a1であり、特にAtmiPEP319a1が配列番号76からなるアミノ酸配列を有する、上記で定義したトランスジェニック植物の製造方法に関する。

0178

1つの実施形態では、本発明は、工程a)において導入される核酸が、配列番号128及び配列番号180から選択されるヌクレオチド配列を含む、上記で定義したトランスジェニック植物の製造方法に関する。

0179

1つの実施形態では、本発明は、植物が、アラビドプシスタリアナなどのアブラナ科植物、グリシンマクス(ダイズ)、メディカゴトランカツラ及びメディカゴサティバ(アルファルファ)などのマメ科植物又はニコチアナベンサミアナ(タバコ)、ソラナムツベロサム(ジャガイモ)、ソラナムリコパーシカム(トマト)若しくはソラナムメロンゲナ(ナス)などのナス科植物である、上記で定義したトランスジェニック植物の製造方法に関する。
1つの実施形態では、本発明は、トランスジェニック植物がアブラナ科植物である、上記で定義したトランスジェニック植物の製造方法に関する。
1つの実施形態では、本発明は、トランスジェニック植物がアラビドプシス タリアナである、上記で定義したトランスジェニック植物の製造方法に関する。

0180

1つの実施形態では、本発明は、
a)AtmiPEP164a1の発現を可能にする条件下において、配列番号24のアミノ酸配列からなるAtmiPEP164a1をコードする配列番号128のヌクレオチド配列を含む核酸を、アラビドプシスタリアナ種植物に、又はアラビドプシス タリアナ種植物の少なくとも1つの細胞に導入する工程であって、
上記AtmiPEP164a1は、上記のアラビドプシス タリアナ種植物において天然に存在するものでもあり、
上記天然に存在するmiPEPは、その配列がmiR164aの一次転写産物の5'に位置するオープンリーディングフレームによってコードされるペプチドであり、
上記AtmiPEP164a1は、上記miR164の蓄積をモジュレートすることができ、
上記miR164aは、アラビドプシス タリアナの生長部分又は繁殖部分の発達に関与する少なくとも1つの遺伝子の発現を制御する、工程と、
b)トランスジェニックアラビドプシス タリアナ種植物の取得を可能にする条件下で、工程a)において得られた植物又は植物の少なくとも1つの細胞を培養する工程と
を含む、上記で定義したトランスジェニック植物の製造方法に関する。

0181

1つの実施形態では、本発明は、
a)AtmiPEP319a1の発現を可能にする条件下において、配列番号76のアミノ酸配列からなるAtmiPEP319a1をコードする配列番号180のヌクレオチド配列を含む核酸を、アラビドプシスタリアナ種植物に、又はアラビドプシス タリアナ種植物の少なくとも1つの細胞に導入する工程であって、
上記AtmiPEP319a1は、上記のアラビドプシス タリアナ種植物において天然に存在するものでもあり、
上記天然に存在するmiPEPは、その配列がmiR319aの一次転写産物の5’に位置するオープンリーディングフレームによってコードされるペプチドであり、
上記AtmiPEP319a1は、上記miR319の蓄積をモジュレートすることができ、
上記miR319aは、アラビドプシス タリアナの生長部分又は繁殖部分の発達に関与する少なくとも1つの遺伝子の発現を調節する、工程と、
b)トランスジェニックアラビドプシス タリアナ種植物の取得を可能にする条件下で、工程a)において得られた植物又は植物の少なくとも1つの細胞を培養する工程と
を含む、上記で定義したトランスジェニック植物の製造方法に関する。

0182

1つの実施形態では、本発明は、miPEPが、当該miPEPをコードする核酸により植物に導入され、上記の核酸が植物に導入される、上記で定義した製造方法に関する。

0183

1つの実施形態では、本発明は、miPEPが導入されている植物の茎サイズが、miPEPが何も導入されていないか、又は上記のmiPEPが導入されていない同齢の同じ植物の茎サイズと比べて増大される、上記で定義したトランスジェニック植物の製造方法に関する。
1つの実施形態では、本発明は、miPEPが導入されている植物の葉の数が、miPEPが何も導入されていないか、又は上記のmiPEPが導入されていない同齢の同じ植物の葉の数と比べて増大される、上記で定義したトランスジェニック植物の製造方法に関する。

0184

1つの実施形態では、本発明は、miPEPが導入されている植物の葉のサイズが、miPEPが何も導入されていないか、又は上記のmiPEPが導入されていない同齢の同じ植物の葉のサイズと比べて増大される、上記で定義したトランスジェニック植物の製造方法に関する。
1つの実施形態では、本発明は、miPEPが導入されている植物の根の数が、miPEPが何も導入されていないか、又は上記のmiPEPが導入されていない同齢の同じ植物の根の数と比べて増大される、上記で定義したトランスジェニック植物の製造方法に関する。

0185

1つの実施形態では、本発明は、miPEPが導入されている植物の根の長さが、miPEPが何も導入されていないか、又は上記のmiPEPが導入されていない同齢の同じ植物の根の長さと比べて増大される、上記で定義したトランスジェニック植物の製造方法に関する。
1つの実施形態では、本発明は、miPEPが導入されている植物の根粒形成率が、miPEPが何も導入されていないか、又は上記のmiPEPが導入されていない同齢の同じ植物の根粒形成率と比べて増大される、上記で定義したトランスジェニック植物の製造方法に関する。

0186

1つの実施形態では、本発明は、miPEPが導入されている植物の根粒数が、miPEPが何も導入されていないか、又は上記のmiPEPが導入されていない同齢の同じ植物の根粒数と比べて増大される、上記で定義したトランスジェニック植物の製造方法に関する。

0187

また、1つの態様では、本発明は、上記で定義した製造方法によって得られるトランスジェニック植物に関する。
別の態様では、本発明は、miPEPをコードするベクターを含むトランスジェニック植物であって、
上記miPEPは、上記の植物において天然に存在するものでもあり、
上記天然に存在するmiPEPは、その配列がmiRNAの一次転写産物の5'部分に位置するオープンリーディングフレームによってコードされるペプチドであり、
上記miPEPは、植物における上記miRNAの蓄積をモジュレートすることができ、
上記miRNAは、少なくとも1つの遺伝子の発現を調節し、
植物に導入されるベクターによってコードされる上記miPEPの発現は、核酸が導入されていない同一の植物と比べて上記遺伝子の発現のモジュレーションをもたらす、トランスジェニック植物に関する。

0188

1つの実施形態では、本発明は、遺伝子が、植物の生長部分又は繁殖部分、特に根、茎、葉又は花の発達に関与し、植物に導入された核酸によってコードされるmiPEPの発現が、核酸が導入されていない同一の植物と比較して当該トランスジェニック植物の成長の改善をもたらす、上記で定義したトランスジェニック植物に関する。
1つの実施形態では、本発明は、miPEPが、
- 配列番号1〜配列番号101、
- 配列番号375〜配列番号386、又は
- 配列番号424
からなる群から選択される、上記で定義したトランスジェニック植物に関する。

0189

別の態様では、本発明は、ベクターを含むトランスジェニック植物であって、
上記ベクターは、miRNAの一次転写産物の発現を可能にする核酸を含み、
上記miRNAの一次転写産物は、miPEPをコードするオープンリーディングフレームを含み、
上記miPEPは、植物におけるmiRNAの蓄積をモジュレートすることができ、
上記miRNAは、植物において少なくとも1つの遺伝子の発現を調節し、
植物に導入されるベクターによりコードされるmiPEPの発現は、核酸が導入されていない同一の植物と比べて、上記遺伝子の発現のモジュレーションをもたらす、トランスジェニック植物に関する。

0190

1つの実施形態では、本発明は、核酸が内因性のものである、上記で定義したトランスジェニック植物に関する。
核酸が内因性のものである場合、少なくとも1コピーの核酸は、植物に導入されるベクターとは独立して、当該植物内において既に天然に存在している。

0191

1つの実施形態では、本発明は、核酸が外因性のものである、上記で定義したトランスジェニック植物に関する。
核酸が外因性のものである場合、既に植物内において天然に存在する当該核酸のコピーはない。
1つの実施形態では、本発明は、遺伝子が、植物の生長部分又は繁殖部分、特に根、茎、葉又は花の発達に関与し、植物に導入される核酸によってコードされるmiPEPの発現は、核酸が導入されていない同一の植物と比較して当該トランスジェニック植物の成長の改善をもたらす、上記で定義したトランスジェニック植物に関する。

0192

1つの実施形態では、本発明は、miPEPが、
- 配列番号1〜配列番号101、
- 配列番号375〜配列番号386、又は
- 配列番号424
からなる群から選択される、上記で定義したトランスジェニック植物に関する。

0193

別の態様では、本発明は、植物種子の所定量と、その配列が当該植物において天然に存在するmiPEPのものと同一の配列を含むか又は当該配列からなるペプチドの所定量とを組み合わせて含む組成物に関する。

0194

1つの実施形態では、本発明は、miPEPが、
- 配列番号1〜配列番号101、
- 配列番号375〜配列番号386、又は
- 配列番号424
からなる群から選択される、上記で定義した組成物に関する。

0195

1つの実施形態では、本発明は、植物、特にA.タリアナの種子の所定量と、その配列がAtmiPEP164a1のものと同一の配列を含むか又は当該配列からなるペプチドの所定量とを組み合わせて含む組成物に関する。
1つの実施形態では、本発明は、植物、特にA. タリアナの種子の所定量と、その配列がAtmiPEP319a1のものと同一の配列を含むか又は当該配列からなるペプチドの所定量とを組み合わせて含む組成物に関する。
1つの実施形態では、本発明は、植物、特にM.トランカツラの種子の所定量と、その配列がMtmiPEP171bのものと同一の配列を含むか又は当該配列からなるペプチドの所定量とを組み合わせて含む組成物に関する。

0196

1つの実施形態では、本発明は、コーティング種子を形成するように製剤化された、上記で定義した組成物に関する。
コーティングは、アグリ-食品産業において慣用の方法によって行うことができ、溶媒又は土壌、例えばバインダ又は粘土中で分解可能な材料を用いて達成することができる。

0197

本発明によれば、コーティングは、例えばmiPEPの組成物又はmiPEPと組み合わせた種子の組成物に特定の性質を付与するために用いることができる。
1つの実施形態では、本発明は、MtmiPEP171bを含むコーティング種子を形成するように製剤化された、上記で定義した組成物に関する。
1つの実施形態では、本発明は、AtmiPEP164a1を含むコーティング種子を形成するように製剤化された、上記で定義した組成物に関する。
1つの実施形態では、本発明は、AtmiPEP319a1を含むコーティング種子を形成するように製剤化された、上記で定義した組成物に関する。

0198

別の態様では、本発明は、少なくとも、
- 上記で定義したmiPEP、
- 上記miPEPをコードする核酸、又は
- 上記核酸を含むベクター
と、医薬的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物に関する。

0199

別の態様では、本発明は、少なくとも、
- 上記で定義したmiPEP、
- 上記miPEPをコードする核酸、又は
- 上記核酸を含むベクター
を含む、特にヒト又は動物用の医薬として用いるための組成物に関する。
本発明の組成物の使用は、ヒトの医療及び獣類の医療において適用可能である。

0200

別の態様では、本発明は、少なくとも、
- 上記で定義したmiPEP、
- 上記miPEPをコードする核酸、又は
- 上記核酸を含むベクター
を含む、患者の遺伝子の発現の脱調節に関連付けられる疾患の予防及び/又は治療に用いるための組成物であって、
上記遺伝子の発現は、その蓄積が上記miPEPによってモジュレートされるマイクロRNAによって調節される、組成物に関する。

0201

1つの実施形態では、本発明は、疾患が、がん糖尿病肥満、感染性疾患及び神経変性疾患から選択される、上記で定義した組成物に関する。
1つの実施形態では、本発明は、疾患が、がん、糖尿病、肥満、感染性疾患、神経変性疾患、循環器疾患(maladies cardiovasculaires)及び自己免疫疾患から選択される、上記で定義した組成物に関する。
1つの実施形態では、本発明は、疾患が、がん、糖尿病、肥満、感染性疾患、神経変性疾患、循環器疾患及び自己免疫疾患から選択される、上記で定義した組成物に関する。
1つの実施形態では、本発明は、疾患が、循環器疾患及び自己免疫疾患から選択される、上記で定義した組成物に関する。

0202

別の態様では、本発明は、少なくとも、
- 上記で定義したmiPEP、
- 上記miPEPをコードする核酸、又は
- 上記核酸を含むベクター
を含む、動物又はヒトの寄生生物感染の予防及び/又は治療に用いるための組成物であって、
上記寄生生物は、その蓄積が上記miPEPによってモジュレートされるマイクロRNAによって、その発現が調節される遺伝子を有する、組成物に関する。

0203

別の態様では、本発明は、医薬として用いるための、真核細胞におけるマイクロRNAの蓄積をモジュレートすることができ、マイクロRNAの一次転写産物に含まれるヌクレオチド配列によってコードされる4〜100アミノ酸又は3アミノ酸のmiPEPに関する。

0204

別の態様では、本発明は、miPEPを特異的に認識する抗体に関する。
特に、本発明は、AtmiPEP165aを特異的に認識する抗体に関する。
特に、本発明は、MtmiPEP171bを特異的に認識する抗体に関する。
特に、本発明は、AtmiPEP164a1を特異的に認識する抗体に関する。
特に、本発明は、AtmiPEP319a1を特異的に認識する抗体に関する。

0205

このような抗体は、当業者に公知の方法によって、例えば、動物による免疫反応及び抗体産生惹起するために非ヒト動物にmiPEPを注入することによって、取得することができる。

0206

別の態様では、本発明は、miPEPを特異的に認識する抗体を用いて、植物からの生物試料を標識する工程を含む、miPEPの免疫染色方法(un procede d'immunolocalisation)に関する。
特に、本発明は、AtmiPEP165aを特異的に認識する抗体を用いるAtmiPEP165aの免疫染色方法に関する。
特に、本発明は、MtmiPEP171bを特異的に認識する抗体を用いるMtmiPEP171bの免疫染色方法に関する。
特に、本発明は、AtmiPEP164a1を特異的に認識する抗体を用いるAtmiPEP164a1の免疫染色方法に関する。
特に、本発明は、AtmiPEP319a1を特異的に認識する抗体を用いるMtmiPEP319a1の免疫染色方法に関する。

0207

別の態様では、本発明は、医薬として用いるための、本発明のmiPEPを特異的に認識する抗体に関する。
別の態様では、本発明は、本発明のmiPEPを特異的に認識する抗体と、医薬的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物に関する。

0208

別の態様では、本発明は、その配列が、上記で定義したmiPEPのものと同一の配列を含むか又は当該配列からなる組換えペプチドをコードする発現ベクターで生体を形質転換する工程を含む、組換えペプチドを製造する方法に関する。
1つの実施形態では、生体は、細菌、酵母、(酵母以外の)菌類、動物細胞、植物及び動物を含む群から選択される。
1つの実施形態では、生体は、エシェリシアコリ(Escherichia coli)である。

0209

特に、本発明は、
-組換えペプチドをコードする核酸を、タグ、例えばGSTをコードする核酸に結合させる工程と、
-組換えペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターをE.コリ細菌に導入する工程と、
-発現ベクターを含むE. コリ細菌をLB培地中で、好ましくは0.2〜0.4のODまで培養する工程と、
-好ましくは4〜5時間、IPTGで組換えペプチドの産生を誘導する工程と、
-E. コリ細菌を遠心分離して溶菌する工程と、
-上清濾過する工程と、
-グルタチオンセファロースアフィニティカラムで組換えペプチドを精製する工程と、
-必要に応じて、プロテアーゼを用いてGSTを切断する工程と
を含む、上記で定義した組換えペプチドを製造する方法に関する。

0210

miPEP、miORF、miRNA及びmiRNAの一次転写産物の全ての配列を表1、2、3、4、5及び6に示す。
表7は、pri-miR171bの種々の領域のDNA配列についての多型解析を表す(ハプロタイプは、他のハプロタイプと少なくとも1つのアミノ酸が異なるときに定義される)。

0211

以下の図及び実施例は本発明をより詳細に説明するが、その範囲を限定するものではない。

0212

図1.HAM1及びHAM2遺伝子の発現(A)又はM.トランカツラにおける側根数(B)に対するMtmiR171b(メディカゴトランカツラで同定されたmiR171b)の過剰発現の効果
(A) Y軸は、コントロール植物(白色カラム)又はMtmiR171bを過剰発現する植物(黒色カラム)におけるMtmiR171b(左カラム)、HAM1(中央カラム)又はHAM2 (右カラム)の相対的発現を示す。エラーバーは、平均の標準誤差個体数=10)に相当する。MtmiR171bの過剰発現は、HAM1及びHAM2遺伝子の発現減少を誘導する。
(B) Y軸は、コントロール植物(白色カラム)又はMtmiR171bを過剰発現する植物(黒色カラム)において観察された側根の平均数を示す。エラーバーは、平均の標準誤差(個体数=100)に相当する。MtmiR171bの過剰発現は、側根数の減少をもたらす。

0213

図2 .M.トランカツラにおけるMtmiR171bの発現並びにHAM1及びHAM2遺伝子の発現(A)又は側根数(B)に対するMtmiPEP171b1の過剰発現の効果
(A) Y軸は、コントロール植物(白色カラム)又はMtmiPEP171b1を過剰発現する植物(黒色カラム)におけるMtmiPEP171b1 (左側のグラフ)、miR171b (右側のグラフ、左カラム)、又はHAM1 (アクセッション番号MtGI9- TC114268) (右側のグラフ、中央カラム)又はHAM2 (アクセッション番号MtGI9- TC120850) (右側のグラフ、右カラム)の相対的発現を示す。エラーバーは、平均の標準誤差(個体数=10)に相当する。MtmiPEP171b1の過剰発現は、MtmiR171bの蓄積増大並びにHAM1及びHAM2遺伝子の発現減少を誘導する。
(B) Y軸は、コントロール植物(白色カラム)又はMtmiPEP171b1を過剰発現する植物(黒色カラム)において観察された側根の平均数を示す。エラーバーは、平均の標準誤差(個体数=100)に相当する。MtmiPEP171b1の過剰発現は、側根数の減少をもたらす。

0214

図3 .M.トランカツラにおけるMtmiR171bの発現、HAM1及びHAM2遺伝子の発現(A)並びに側根数(B)に対するMtmiPEP171b1の効果
(A) Y軸は、コントロール植物(白色カラム)又は1日1回、5日間の散水によって0.01 μM (明灰色カラム)、0.1 μM (暗灰色カラム)又は1 μM (黒色カラム)のMtmiPEP171b1で処置した植物におけるMtmiR171b(左カラム)、HAM1(中央カラム)又はHAM2(右カラム)の相対的発現を示す。エラーバーは、平均の標準誤差(個体数=10)に相当する。種々の濃度のMtmiPEP171b1の適用は、MtmiR171bの蓄積増大並びにHAM1及びHAM2遺伝子の発現減少を誘導する。
(B) Y軸は、コントロール植物(白色カラム)又は1日1回、5日間の散水によって0.1μMのMtmiPEP171b1で処置した植物(黒色カラム)において観察された側根の平均数を示す。エラーバーは、平均の標準誤差(個体数=100)に相当する。0.1 μMのMtmiPEP171b1の適用は、側根数の減少をもたらす。
(C) Y軸は、コントロール植物(白色カラム)或いは1日1回、5日間の散水によって0.01 μM (灰色カラム)、0.1 μM (暗灰色カラム)若しくは1 μM(黒色カラム)のMtmiPEP171b1又はそのアミノ酸組成がmiPEP171bと同一であるがその配列が異なる0.01μMのスクランブルペプチド(LIVSHLYSEKFDCMRKILRI、配列番号428)(明灰色カラム)で処置した植物におけるMtmiR171b(左カラム)、HAM1(中央カラム)又はHAM2(右カラム)の相対的発現を示す。エラーバーは、平均の標準誤差(個体数=10)に相当する。

0215

図4 .M.トランカツラにおけるpre-MtmiR171b (A)及びMtmiR171b(B)の発現に対するMtmiPEP171b1の効果
Y軸は、コントロール植物(左カラム)又は1日1回、5日間の散水によって0.01 μM、0.1 μM又は1 μMのMtmiPEP171b1で処置した植物(右カラム)のマイクロRNAの種々の形態にある前駆体の相対的発現を示す。エラーバーは、平均の標準誤差(個体数=200)に相当する。種々の濃度のMtmiPEP171b1の適用は、pre-MtmiR171b (A)及びMtmiR171b (B)の蓄積増大をもたらす。

0216

図5.M.トランカツラにおける種々のマイクロRNA前駆体の発現に対するMtmiPEP171b1の過剰発現の効果(A)及びMtmiPEP171b1の効果(B)
Y軸は、MtmiPEP171b1を過剰発現する植物におけるマイクロRNA前駆体の発現と、コントロールの根における当該前駆体の発現との比(A)又はMtmiPEP171b1 (0.1 μM)で処置された植物におけるマイクロRNA前駆体の発現と、コントロールの根における当該前駆体の発現との比(B)を示す。試験された種々のマイクロRNA前駆体をx軸の左から右に示す。すなわち、pre-MtmiR171b (配列番号246) 、pre-MtmiR169 (配列番号359)、pre-MtmiR169a (配列番号360)、pre-MtmiR171a (配列番号361)、pre-MtmiR171h (配列番号362)、pre-MtmiR393a (配列番号363)、pre-MtmiR393b (配列番号364)、pre-MtmiR396a (配列番号365)及びpre-MtmiR396b (配列番号366)である。エラーバーは、平均の標準誤差(個体数=10)に相当する。MtmiPEP171b1は、MtmiR171b蓄積に対してのみ効果をもたらし、その他のmiRNAに対しては効果をもたらさないことが注目される。

0217

図6.モデル植物ニコチアナベンサミアナにおいて示された、MtmiR171bの発現に対するMtmiPEP171b1の翻訳の効果
Y軸は、pri-MtmiR171b(白色カラム)又はATGコドンがATTで置き換えられた変異型pri-MtmiR171b(黒色カラム)を発現させるために形質転換されたタバコ植物におけるMtmiR171bの相対的発現を示す。したがって、変異型pri-MtmiR171bは、MtmiPEP171b1を産生することができない。エラーバーは、平均の標準誤差(個体数=30)に相当する。MtmiPEP171b1が翻訳されないことにより、miR171b蓄積が著しく低減することが注目される。

0218

図7.モデル植物ニコチアナベンサミアナにおいて示された、pre-MtmiR171bの発現に対するMtmiPEP171b1の過剰発現の効果
Y軸は、MtmiR171b(左カラム)、MtmiR171b及びMtmiPEP171b1(中央カラム)、又は、MtmiR171b及び開始コドンATGがATTで置き換えられた変異型MtmiORF171b(右カラム)を発現させるために形質転換されたタバコ植物におけるpre-MtmiR171bの相対的発現を示す。エラーバーは、平均の標準誤差(個体数=30)に相当する。MtmiPEP171b1の発現はMtmiR171bの発現を増大させるが、この効果はMtmiORF171bからMtmiPEP171b1への翻訳に依存することが注目される。

0219

図8.モデル植物ニコチアナベンサミアナにおいて示された、pre-MtmiR171bの発現に対するMtmiPEP171b1の効果
Y軸は、MtmiPEP171b1(0.1μM)がサンプリングの12時間前及び30分前に2回噴霧されたか(右カラム)又は噴霧されなかった(左カラム)、MtmiR171bを発現させるために形質転換されたタバコ植物におけるMtmiR171bの相対的発現を示す。エラーバーは、平均の標準誤差(個体数=6)に相当する。噴霧によって適用されるペプチドMtmiPEP171b1は、MtmiR171bの蓄積増大を誘導する。

0220

図9.モデル植物ニコチアナベンサミアナにおいて示された、pri-miR171b (A)、pre-MtmiR171b (B)及びMtmiR171b (C)の発現に対するMtmiPEP171b1の効果
Y軸は、MtmiR171bを発現するために改変されたタバコ植物(左カラム)、又はMtmiR171bを発現し、MtmiPEP171b1を過剰発現するために改変されたタバコ植物(右カラム、図9A)、又は0.1μMのmiPEP171b1で処置されたタバコ植物(図9B及びC)における種々の形態にあるマイクロRNA前駆体の相対的発現を示す。エラーバーは、平均の標準誤差(個体数=30)に相当する。MtmiPEP171b1の過剰発現又はmiPEP171b1の適用は、pri-MtmiR171b (A)、pre-MtmiR171b (B)及びMtmiR171b (C)の蓄積を増大させる。

0221

図10.MtmiPEP171b1を発現するために改変されたタバコ葉細胞におけるMtmiPEP171b1の局在
写真は、GFPタンパク質のみ(左パネル)又はMtmiPEP171b1に融合したGFPタンパク質(右パネル)を発現させるために改変されたタバコ葉細胞を示す。これらの観察結果は、MtmiPEP171b1が核にある小体(petits corps nucleaires)に局在することを示す。

0222

図11.モデル植物タバコにおいて示された、AtmiR165aの発現に対する(アラビドプシスタリアナにおいて同定された)AtmiPEP165aの発現の効果(A)及びAtmiR319aに対する(アラビドプシス タリアナにおいて同定された)AtmiPEP319a2の発現の効果(B)
(A) Y軸は、AtmiR165a(左カラム)又はAtmiR165a及びAtmiPEP165a(右カラム)を発現するために改変されたタバコ植物におけるAtmiR165aの相対的発現を示す。
(B) Y軸は、AtmiR319a(左カラム)又はAtmiR319a及びAtmiPEP319a(右カラム)を発現するために改変されたタバコ植物におけるAtmiR319aの相対的発現を示す。
エラーバーは、平均の標準誤差(個体数=30)に相当する。
いずれの場合においても、miORFの発現、したがってmiPEPの産生は、pre-miRNAの蓄積増大をもたらすことが注目される。

0223

図12.アラビドプシスタリアナの根の成長に対するAtmiPEP165a処置の効果
写真は、同齢の2つの植物を示す:コントロール植物(左側の植物)及びAtmiPEP165aで処置された植物(右側の植物)。AtmiPEP165aでの処置は、アラビドプシス タリアナにおいて根の成長が大きく加速されるという表現型をもたらす。このグラフは、漸増用量のAtmiPEP165aを用いる処置に応答してのpre-miR165の発現を示す。

0224

図13.ドロソフィラにおいて同定されたmiPEP8の配列の保存
miPEP8の配列(配列番号104)は、12匹の種々のドロソフィラ種のmiORF8の配列(配列番号208)から推測し、アライメントした。ヒストグラムは、分析した12種におけるmiORF8配列間の各アミノ酸の保存を示す。

0225

図14.ドロソフィラ種におけるmiPEP8の質量(kDa)及び等電点(pI)の変化(evolution)
左側のY軸は、miPEP8のサイズ(kD)を示す。右側のY軸は、miPEPの等電点を示す。X軸は、miPEPの由来、すなわちドロソフィラ種を示す。それらのサイズの有意な変化(3倍以上)にも拘らず、miPEPの電荷は、試験された12種では依然として強い塩基性(>9.8)であることが注目される。

0226

図15.miPEPの機能に対する配列付加の効果
miPEP171bを過剰発現させるためにタバコの葉を形質転換した。これらのグラフは、配列(タグHis、HA又はGFP)の付加がmiPEPの機能を変更しないことを示す。Y軸は、MtmiR171b(左カラム)を発現させるために、MtmiR171b及びタグタンパク質が付加されたか又は付加されていないMtmiPEP171b1(右カラム)を発現させるために形質転換されたタバコ植物におけるpre-MtmiR171bの相対的発現を示す。エラーバーは、平均の標準誤差(個体数=6)に相当する。MtmiPEP171b1の発現がMtmiR171bの発現を増大させるが、この効果はタグの存在とは独立していることが注目される。

0227

図16.メディカゴトランカツラの根系におけるMtmiPEP171b1の発現
GUSタンパク質(青色)と、miR17bのプロモータ(A、E)、miPEP171b1のATG(B、F)、全miPEP171b1(C、G)又はATG2(miPEPの後の前駆体に位置する2番目のATG)(D、H)との融合物を発現させるために、メディカゴ トランカツラの根を形質転換した。根の先端(A)及び側根(E)においてmiRNAが発現していることが明らかである。転写物融合体(B、F)及び翻訳物融合体(C、G)は、同一の組織においてmiPEP171bの発現を示すが、次のATGは活性ではない(D、H)。

0228

図17.ドロソフィラメラノガスター細胞におけるDmmiPEP8の発現
DmmiPEP8(OE miPEP8)又はその翻訳開始コドンが変異したmiPEP8(OE miPEP8 mut)を過剰発現させるために、ドロソフィラ メラノガスター細胞をトランスフェクトした。Y軸は、pre-miR8の相対的発現を示す。エラーバーは、平均の標準誤差(独立した実験回数=6)に相当する。DmmiPEP8の発現がDmmiR8の発現を増大させ、この効果はmRNAの翻訳に関連付けられることが注目される。

0229

図18.D.メラノガスター細胞におけるDmmiR8蓄積に対するDmmiPEP8の影響
野生型DmmiR8(OE miR8)又はその翻訳開始コドンが変異したDmmiR8(OE miR8 miPEP8 mut)を過剰発現させるために、ドロソフィラメラノガスター細胞をトランスフェクトした。Y軸は、pre-miR8の相対的発現を示す。エラーバーは、平均の標準誤差(独立した実験回数=2)に相当する。DmmiPEP8の存在がDmmiR8の発現を増大させることが注目される。

0230

図19.ホモサピエンス細胞におけるHsmiR155蓄積に対するHsmiPEP155の効果
HsmiPEP155(OE miPEP155)を過剰発現させるために、ホモ サピエンスのHeLa細胞をトランスフェクトした。Y軸は、pre-miR155の相対的発現を示す。エラーバーは、平均の標準誤差(独立した実験回数=2)に相当する。HsmiPEP155の発現はHsmiR155の発現を増大させることが注目される。

0231

図20.モデル植物ニコチアナベンサミアナにおいて示された、MtmiR171bの発現に対するMtmiPEP171b1の翻訳の効果
Y軸は、pri-miR171b(左カラム)、miORF171bが欠失したpri-miR171b(中央カラム)又はATGコドンがATTで置き換えられた変異型pri-miR171b(右カラム)を発現させるために形質転換されたタバコ植物においてMtmiR171bの相対的発現を示す。したがって、変異型pri-miR171bは、miPEP171b1を産生することができない。エラーバーは、平均の標準誤差(個体数=30)に相当する。miPEP171b1の翻訳がされないことにより、miR171b蓄積は著しく低減することが注目される。

0232

図21.モデル植物ニコチアナベンサミアナにおいて示された、MtmiR171bの発現に対するMtmiPEP171b1の過剰発現の効果
Y軸は、miPEP171bの発現を可能にするベクターと、第2の空ベクター(白色カラム)、MtmiPEP171bの発現を可能にするベクター(左の黒色カラム)、MtmiPEP171bをコードするORFのATGコドンがATTで置き換えられたベクター(中央の黒色カラム)又は翻訳されるペプチドのアミノ酸配列を改変することなくORFのヌクレオチド配列を変異させたベクター(縮重ORFによってコードされるmiPEP、右の黒色カラム)のいずれかとで形質転換されたタバコ植物におけるMtmiR171bの相対的発現を示す。エラーバーは、平均の標準誤差(個体数=30)に相当する。MtmiPEP171b1の発現がMtmiR171bの発現を増大させ、この効果がMtmiORF171bからMtmiPEP171b1への翻訳に依存することが注目される。

0233

図22.AtmiR165aの蓄積及びその標的遺伝子(PHAVOLUTA: PHV、PHABOLUSA:PHB及びREVOLUTA: REV)の蓄積に対するAtmiPEP165aの効果
Y軸は、水(コントロール)又は種々の濃度(0.01 μM、0.1 μM、1 μM又は10 μM)のAtmiPEP165aで処置されたアラビドプシスタリアナの根におけるAtmiR165a、PHV、PHB及びREVの相対的発現を示す。エラーバーは、平均の標準誤差(個体数=10)に相当する。
より高濃度のAtmiPEP165aを用いての植物の処置は、AtmiR165a蓄積の用量依存的な効果と、AtmiPEP165a量に応じたその標的遺伝子の負の調節とを示す。

0234

図23.A.タリアナにおけるAtmiR164aの発現に対するAtmiPEP164aを用いる処置の効果
写真は、水(コントロール、左側の写真)又はAtmiPEP164aのものと同一の配列を有する0.1μMの合成ペプチド水溶液(0.1μMのmiPEP164a)を用いて処置した根におけるAtmiR164a蓄積のノザンブロット分析の結果を示す。RNA U6は、AtmiR164a量の定量を可能にするローディングコントロールとして用いる。
この実験を独立して4回繰り返したところ、類似の結果が得られた。
0.1 μMの miPEP164aを用いてのA. タリアナの芽の処置は、miR164aの蓄積増大をもたらす。

0235

図24.アラビドプシスタリアナの成長に対するAtmiPEP164aを用いる処置の効果
写真は、3週間成長後の2つの植物(上面及び側面)を示す:水で散水したコントロール植物(A)及びAtmiPEP164aに相当する合成ペプチドの組成物(0.1 μM)で散水した植物(B)。AtmiPEP164aをアラビドプシス タリアナ種植物に散水することにより植物の成長が著しく良くなる。

0236

図25.A.タリアナにおけるAtmiR165aの発現に対するAtmiPEP165aを用いる処置の効果
写真は、水(コントロール、左側の写真)又はAtmiPEP165aのものと同一の配列を有する合成ペプチドの0.1 μM水溶液(0.1μMのmiPEP165a)で処置された根におけるAtmiR165a蓄積のノザンブロット分析の結果を示す。RNA U6は、AtmiR165a量の定量を可能にするローディングコントロールとして用いる。
この実験を独立して4回繰り返したところ、類似の結果が得られた。
0.1μMの miPEP165aを用いてのA. タリアナの芽の処置は、miR165aの蓄積増大をもたらす。

0237

図26.A.タリアナにおけるAtmiR319aの発現に対するAtmiPEP319a1の過剰発現の効果
Y軸は、コントロール植物(左カラム)又はAtmiPEP319a1を過剰発現する植物(右カラム)におけるAtmiR319aの相対的発現を示す。エラーバーは、平均の標準誤差(個体数=10)に相当する。AtmiPEP319a1の過剰発現は、AtmiR319aの蓄積増大を誘導する。

0238

図27.アラビドプシスタリアナの成長に対するAtmiPEP319aを用いる処置の効果
写真は、3週間成長後の2つの植物(上面及び側面)を示す:水で散水したコントロール植物(A)、及びAtmiPEP319a1に相当する合成ペプチド0.1 μMの組成物で散水された植物(B)。AtmiPEP319a1をアラビドプシス タリアナ種植物に散水することにより植物の成長が著しく良くなる。

0239

図28.免疫染色
GUSタンパク質(青色)と、miPEP171bのATG (PromiR171b-ATG1:GUS)又はATG2 (miPEPの後の前駆体に位置する2番目のATG) (PromiR171b-ATG2:GUS)との融合物を発現させるために、メディカゴトランカツラの根を形質転換した。また、抗miPEP171b抗体(miPEP171b)を用いて標識した。M. トランカツラの根におけるmiPEP171bの免疫染色は、側根の開始部分におけるmiPEP171bの存在を明らかにし、このことは、マイクロRNAと、対応するmiPEPとの共局在を示している。

0240

図29.A.タリアナにおけるAtmiR160bの発現に対するAtmiPEP160b1の過剰発現の効果
Y軸は、コントロール植物(左カラム)又はAtmiPEP160b1を過剰発現する植物(右カラム)におけるAtmiR160bの相対的発現を示す。エラーバーは、平均の標準誤差(個体数=10)に相当する。AtmiPEP160b1の過剰発現は、AtmiR160bの相対的発現の増大を誘導する。

0241

図30.AtmiR164aの発現に対するAtmiPEP164a1の効果
Y軸は、コントロール植物(左カラム)又は0.1μMのAtmiPEP164a1を1日1回散水した植物(右カラム)におけるAtmiR164aの相対的発現を示す。エラーバーは、平均の標準誤差(個体数=10)に相当する。
AtmiPEP164a1の添加は、AtmiR164aの相対的発現の増大を誘導する。

0242

図31.A.タリアナにおけるAtmiR319aの発現に対するAtmiPEP319a1の過剰発現の効果
Y軸は、コントロール植物(左カラム)又はAtmiPEP319a1を過剰発現する植物(右カラム)におけるAtmiR319aの相対的発現を示す。エラーバーは、平均の標準誤差(個体数=10)に相当する。
AtmiPEP319a1の過剰発現は、AtmiR319aの相対的発現の増大を誘導する。

0243

図32.M.トランカツラにおけるMtmiR169dの発現に対するMtmiPEP169dの効果
Y軸は、コントロール植物(左カラム)又は0.1 μMのMtmiPEP169dを1日1回散水した植物(右カラム)におけるMtmiR169dの相対的発現を示す。
エラーバーは、平均の標準誤差(個体数=10)に相当する。
MtmiPEP169dの添加は、MtmiR169dの相対的発現の増大を誘導する。

0244

図33.M.トランカツラにおけるMtmiR171eの発現に対するMtmiPEP171eの過剰発現の効果
Y軸は、コントロール植物(左カラム)又はMtmiPEP171eを過剰発現する植物(右カラム)におけるMtmiR171eの相対的発現を示す。エラーバーは、平均の標準誤差(個体数=10)に相当する。
MtmiPEP171eの過剰発現は、MtmiR171eの相対的発現の増大を誘導する。

0245

図34.野生型M.トランカツラ種植物におけるMtmiPEP171b1の局在
MtmiPEP171b1に特異的な抗体を用いる免疫ブロッティングにより、様々な量(1、0.5又は0.1 nmol)の合成ペプチドMtmiPEP171b1及びM. トランカツラの根の全抽出物を分析した。
MtmiPEP171b1は、M. トランカツラの根において天然に産生される。

0246

図35.野生型A.タリアナ種植物におけるAtmiPEP165aの存在
上側の写真は、野生型A. タリアナCol-0の若(左側)及びAtmiPEP165aを過剰発現するA. タリアナの若苗(右側)におけるAtmiPEP165a量のウェスタンブロット分析に相当する。下側の写真は、野生型A. タリアナCol-0の若苗(左側)及びAtmiPEP165aを過剰発現するA. タリアナの若苗(右側)におけるコントロールタンパク質チューブリン)量のウェスタンブロット分析に相当する。AtmiPEP165aは、A. タリアナにおいて天然に産生され、AtmiPEP165aを過剰発現する植物において、より大量に存在する。

0247

図36.A.タリアナにおけるAtmiPEP165aの作用
(A) Y軸は、コントロールの根(左カラム)又は10 μMのAtmiPEP165aを1日1回散水した根(右カラム)におけるpri-miR165aの相対的発現を示す。エラーバーは、平均の標準誤差(個体数=10)に相当する。
AtmiPEP165aの添加は、AtmiR165aの相対的発現の増大を誘導する。
(B) Y軸は、コルジセピンRNA合成阻害剤)の存在下における、コントロールの根(灰色の曲線)又は10 μMのAtmiPEP165aを1日1回散水した根(黒色の曲線)におけるpri-miR165aの相対的発現を示す。X軸は、コルジセピンで処置した時間を示す。
AtmiPEP165aの添加は、pri-miR165aのより良好な安定性を誘導しない。
(C) Y軸は、野生型植物(Col-0)又はRNAポリメラーゼIIの第2のラージサブユニット(la seconde grande sous-unite)の劣性対立遺伝子(un allele faible)が変異した植物(nrpb2-3)におけるpri-miR165aの相対的発現を示す。X軸は、植物が水で散水されたか、又は10 μMのAtmiPEP165aで散水されたかを示す。
野生型植物とは異なり、変異した植物は、AtmiPEP165aに応答してAtmiR165aを蓄積することができない。

0248

図37.M.トランカツラにおける側根数に対するpri-miR171bの効果
Y軸は、コントロール植物(白色カラム)又はpri-miR171bを過剰発現する植物(黒色カラム)において観察された側根の平均数を示す。エラーバーは、平均の標準誤差(個体数=100)に相当する。
pri-miR171bの過剰発現は、側根数の減少を誘導する。

0249

図38.ドロソフィラメラノガスター細胞におけるDmmiPEP8翻訳の可能性
DmmiPEP8 (miPEP8::GFP)又はその開始コドンが変異したDmmiPEPmt(miPEP8 mt::GFP)を発現するように、いくつかのドロソフィラ メラノガスター細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションのコントロールとして、モエシン-RFPタンパク質を産生するプラスミド(下側の写真)を、DmmiPEP8をコードするプラスミド(左側の写真)及びDmmiPEP8 mtをコードするプラスミド(右側の写真)と共にコトランスフェクトした。DmmiPEP8配列の開始コドンは、GFPの合成を可能にするので機能的である一方(左上の写真)、ATG変異を有する構築物はGFPを殆ど産生しない(右上の写真)ことが観察される。
よって、これらの結果は、miPEPのORFが機能的であることを示唆する。

0250

A: 植物におけるmiPEPの分析
実施例1‐モデル植物メディカゴトランカツラにおける特徴決定
a) MtmiPEP171b1(メディカゴ トランカツラにおいて同定されたmiPEP171b1)の同定及び特徴決定
マイクロRNAであるMtmiR171bは、根の分裂組織領域において発現する。このマイクロRNAの過剰発現は、特に、HAM1遺伝子(アクセッション番号MtGI9- TC114268)及びHAM2遺伝子(アクセッション番号MtGI9- TC120850)の発現減少(図1A)並びに側根数の減少(図1B)をもたらす。また、pri-miR171bの過剰発現は、側根数の減少を誘導する(図37)。

0251

MtmiR171bの一次転写産物の配列を、RACE-PCR法を用いて決定した。一次転写産物の配列解析により、完全に予想されていなかったいくつかの小さなオープンリーディングフレーム(sORF)の存在を同定することが可能となった。これらのsORFを、miORF(「マイクロRNA ORF」の略)と称した。これらのmiORFは、約4〜100アミノ酸の短鎖ペプチドをコードしている可能性がある。これらのmiORFと著しい相同性を有するものはデータベースでは見つからなかった。

0252

MtmiR171bの過剰発現において既に観察されたように、MtmiORF171bと称される第1のmiORFの過剰発現は、MtmiR171bの蓄積増大と、HAM1遺伝子及びHAM2遺伝子の発現減少(図2A参照)並びに側根数の減少(図2B)をもたらす。

0253

MtmiORF171bが実際にペプチドの産生をもたらすか否か、及び上記で観察された調節性機能が実際に当該ペプチドによるものなのか否かを決定するために、その配列がMtmiORF171bによってコードされる可能性のあるものと同一である合成ペプチドをメディカゴトランカツラの根に適用した。このペプチドの適用は、MtmiORF171bの過剰発現について上記で既に観察された表現型、すなわちMtmiR171bの蓄積増大、HAM1遺伝子及びHAM2遺伝子の発現減少(図3A参照)、及び側根数の減少(図3B)をもたらす。

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