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技術 親水性活性化合物のナノカプセル化

出願人 イッサムリサーチディベロップメントカンパニーオブザヘブライユニバーシティーオブエルサレムリミテッド
発明者 ベニータ,サイモンナセル,タヘルコハヴィ-ソウドリー,リアト
出願日 2015年1月26日 (5年1ヶ月経過) 出願番号 2016-548118
公開日 2017年2月2日 (3年0ヶ月経過) 公開番号 2017-503836
状態 不明
技術分野
  • -
主要キーワード 揮発性蒸気 レンズ検出器 循環システム中 二次微粒子 球形形態 円形通路 平均直径サイズ TEM格子
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図面 (20)

課題・解決手段

本発明は、水溶性タンパク質グルカン及び親水性活性作用物質を含むナノ粒子を提供し、該グルカンはメタリン酸塩により少なくとも部分的に架橋されている。

概要

背景

ペプチド及びタンパク質薬剤の大部分は、未だに毎日の注射により投与されており、したがってコンプライアンスの問題、疼痛に関連する問題及び患者にとって大きな不便を伴う。それ故、そのような薬剤のための長期にわたる注入送達ステム又は非侵襲的送達システムのいずれかが必要とされる。

経口経路は、高い患者の容認及びコンプライアンスと共に自己投与の利点を提供する。

ペプチド及びタンパク質の経口及び注射による長期放出送達は、依然として挑戦すべき課題であり、毎日の投与を必要とする非経口的な従来の送達に対する最も魅力的代替法であることに変わりはない。最近20年にわたり投入された集中的な努力にも拘わらず、親水性の有効な高分子の経口送達のための実現性がある解決は、これらの親水性高分子の貧弱な腸膜透過率制約された経口バイオアベイラビリティー消化管における不安定性及び徹底的で急速な代謝と関連する幾つかの欠点及び障害のために出現していない。

顕著なバイオアベイラビリティーを有する経口タンパク質送達システムを開発する目的のために、
(a)高分子の物理化学的性質改変
(b)高分子の新規官能化;又は
(c)ナノキャリアの使用による改善された積載物送達
という3通りの手法を採用することができる。

上記手法に関わりなくやはり、タンパク質の当初の生物学的活性を維持することは必須である。経口送達システムは、さらなる臨床試験の可能性があると考えられる機会を有するために、そのような高分子の腸膜透過率を大きく増大させる必要がある。多くのナノ及びミクロ粒子送達システムが、親水性高分子の経口吸収を改善するために使用されて有望な結果を示したが、腸吸収及び薬剤の安定性保護に関して限界に未だ苦しんでいる。

ナノサイズのシステム(例えば、リポソーム、脂質及びポリマーナノ粒子ミセル、その他)は、タンパク質送達のための伝統的剤形よりも有利であることが見出されている。バイオ医薬は、近い将来において治療薬の主要な供給源になると予想されている[1]。それにも拘わらず、そのような分子治療活用は、それらを使用する固有の限界;即ち、低い経口バイオアベイラビリティー及び生物学的及び物理化学的不安定性を申し分なく克服できる適当な剤形を開発する可能性にかかっている。しかしながら、タンパク質薬剤の経口投与は、それらのタンパク質分解という不安定性及び生物学的障壁を越える能力の限界に基づく多くの困難に遭遇した。リポソーム及びミセルに基づく送達システムは、消化管の管腔で安定でなく、繊細な高分子に対する適切な保護をもたらすことができない。

それ故、薬学的剤形の中で、ナノ粒子は、ペプチド薬剤薬剤送達のための探査成功した[2〜4]。ナノ粒子、より具体的に生分解性ポリマーのナノ粒子は、それらを種々の用途に適したものにする、優れた組織への生体適合性生分解性組成柔軟性及び小さいサイズを有する。さらに、これらの剤形は、経口投与後の薬剤バイオアベイラビリティーを増大させることが示された[5]。

生分解性ポリマーを用いるカプセル化は、非常に魅力的であるが、それでも製造プロセスが複雑であり親水性高分子は高価である。タンパク質薬剤をこれらのシステムに効率よく包埋する手法の場合に、ポリマーを使用するカプセル化は、(a)タンパク質の貯蔵及び送達中の分解からの保護、及び(b)所望のときに徐放性プロファイルを提供することができる。[6〜8]。
引用文
[1]Tsuji,K.,Tsutani,K.Eur.J.Pharm.Biopharm.,2008,68,496〜502
[2]Joshi,M.D.,Muller,R.H.Eur.J.Pharm.Biopharm.,2009,71,161〜172
[3]Kluge,J.,Fusaro,F.,Muhrer,G.,Thakur,R.,Mazzotti,M.,/.Supercrit.Fluids
2009,48,176〜182
[4]Mehnert,W.,Mader,K.Adv.Drug Deliv.Rev.,2001,47,165〜196
[5]Gursoy RN,Benita S.,Biomed Pharmacother他,2004,58,173〜82
[6]Almeida,A.J.,Souto,E.Adv.Drug Deliv.Rev.,2007,59,478〜490
[7]Bilati,U.,Allemann,E.,Doelker,E.Eur.J.Pharm.Biopharm.,2005,59,375−388
[8]Mundargi,R.C.,Babu,V.R.,Rangaswamy,V.,Patel,P.,Aminabhavi,T.M./.Control.Release,2008,125,193〜209
[9]WO2012/101639

概要

本発明は、水溶性タンパク質グルカン及び親水性の活性作用物質を含むナノ粒子を提供し、該グルカンはメタリン酸塩により少なくとも部分的に架橋されている。なし

目的

経口経路は、高い患者の容認及びコンプライアンスと共に自己投与の利点を提供する

効果

実績

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請求項1

水溶性タンパク質グルカン及び親水性活性作用物質を含むナノ粒子であって、前記グルカンはメタリン酸塩により少なくとも部分的に架橋されているナノ粒子。

請求項2

前記水溶性タンパク質がアルブミンである、請求項1に記載のナノ粒子。

請求項3

前記アルブミンがヒト血清アルブミンHSA)及びウシ血清アルブミンBSA)から選択される、請求項2に記載のナノ粒子。

請求項4

前記グルカンがα−グルカンである、請求項1から3のいずれか一項に記載のナノ粒子。

請求項5

前記α−グルカンが、デキストラングリコーゲンプルランデンプン、グリコーゲン、リケニンマンナンガラクトマンナンアラビノキシラン、及びガラクトンから選択される、請求項4に記載のナノ粒子。

請求項6

前記グルカンが約5KDaと2,000KDaの間の分子量を有する、請求項1から4のいずれか一項に記載のナノ粒子。

請求項7

前記メタリン酸塩が、トリメタリン酸ナトリウムSTMP)、五塩基性トリリン酸ナトリウム(STPP)及びオキシ塩化リン(POCl3)から選択される、請求項1から6のいずれか一項に記載のナノ粒子。

請求項8

前記メタリン酸塩がトリメタリン酸ナトリウムである、請求項7に記載のナノ粒子。

請求項9

前記親水性の活性作用物質が、−NH2末端部分又は−NH2側鎖部分を含む、請求項1から8のいずれか一項に記載のナノ粒子。

請求項10

前記親水性の活性作用物質が、ビタミンタンパク質抗酸化性物質ペプチドポリペプチド、脂質、炭水化物ホルモン、抗体、モノクローナル抗体ワクチン予防薬診断薬造影剤核酸栄養補助剤、分子量が約1,000Da未満又は約500Da未満の低分子量物質電解質、薬剤免疫学的作用物質及び任意のそれらの組合せから選択される、請求項1から9のいずれか一項に記載のナノ粒子。

請求項11

前記親水性の活性作用物質が、インスリンエキセナチド成長ホルモンオクトレオチド酢酸塩ランレオチド酢酸塩、ゴセロリン酢酸塩、コパキソンエタネルセプト、及びモノクローナル抗体から選択される、請求項10に記載のナノ粒子。

請求項12

前記親水性の活性作用物質が、インスリン及びエキセナチドから選択される、請求項10又は11のいずれか一項に記載のナノ粒子。

請求項13

最大で500nmの直径を有する、請求項1から12のいずれか一項に記載のナノ粒子。

請求項14

約50nmと250nmの間の直径を有する、請求項13に記載のナノ粒子。

請求項15

ナノスフェア又はナノカプセルである、請求項1から14のいずれか一項に記載のナノ粒子。

請求項16

請求項1から15のいずれか一項に記載の疎水性ポリマー及び複数のナノ粒子を含む担体であって、前記複数のナノ粒子が、(i)前記疎水性ポリマーによりカプセル化されているか、又は(ii)前記疎水性ポリマーで形成されたマトリックス中に埋め込まれている、担体。

請求項17

前記疎水性ポリマーが、ポリ乳酸グリコール酸)(PLGA)、ポリメチルメタクリレートPMMA)、ヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC)、ポリ(乳酸)(PLA)、ポリ(ラクト−co−グリコリド)(PLG)、ポリ(ラクチド)、ポリグリコール酸PGA)、及びポリ(ヒドロキシブチレート)から選択される、請求項16に記載の担体。

請求項18

ナノ粒子が約200から900nmの間の直径を有する、請求項16又は17のいずれか一項に記載の担体。

請求項19

前記ナノ粒子が1ミクロンと30ミクロンの間の直径を有するナノカプセル中に埋め込まれている、請求項18に記載の担体。

請求項20

請求項1から15のいずれか一項に記載のナノ粒子及び/又は請求項16から19のいずれか一項に記載の担体を含む医薬組成物

請求項21

前記親水性の活性作用物質の局所、経口、吸入内、経皮、眼内又は非経口的投与適合した、請求項20に記載の医薬組成物。

請求項22

前記親水性の活性作用物質の経口投与に適合した、請求項21に記載の医薬組成物。

請求項23

前記親水性の活性作用物質の注射による投与に適合した、請求項21に記載の医薬組成物。

請求項24

疎水性ポリマー、及び前記疎水性ポリマー内にカプセル化された、項1から15のいずれか一項に記載の複数のナノ粒子を含む、親水性の活性作用物質の送達ステム

請求項25

マトリックスを形成する疎水性ポリマー、及び前記マトリックス内に埋め込まれた、請求項1から15のいずれか一項に記載の複数のナノ粒子を含む、親水性の活性作用物質の送達システム。

請求項26

生分解性カプセル内にさらにカプセル化された、請求項24又は25のいずれか一項に記載の送達システム。

請求項27

前記生分解性カプセルが、腸用にコートされたカプセルの形態にある、請求項26に記載の送達システム。

請求項28

前記送達システムが、目標とされる治療用物質の容易な送達及び前記親水性の活性作用物質の制御された放出管理のために適応可能である、請求項24から27のいずれか一項に記載の送達システム。

請求項29

疾患、障害又は慢性状態治療するための医薬組成物を調製するための、請求項1から15のいずれか一項に記載のナノ粒子又は請求項16から19のいずれか一項に記載の担体の使用。

請求項30

前記医薬組成物が、親水性の活性作用物質を、局所に、経口的に、吸入により、鼻内に、経皮的に、眼内に又は非経口的に対象者循環システム中輸送するための送達システムとして適合された、請求項29に記載の使用。

請求項31

水溶性球状タンパク質、グルカン及び親水性の活性作用物質を含むナノ粒子を調製するプロセスであって、前記グルカンは、メタリン酸塩により少なくとも部分的に架橋されており:−前記水溶性球状タンパク質及び前記グルカンを含む第1の水溶液と前記親水性の活性作用物質を含む第2の水溶液とを混合して、混合物を形成すること;−有機溶媒を前記混合物中に注入すること;及び−前記ナノ粒子を得るために、前記メタリン酸塩を前記混合物に加えてそれにより前記グルカンを少なくとも部分的に架橋することを含むプロセス。

技術分野

0001

本発明は、親水性活性化合物を含むナノ粒子及びそれらを調製するナノカプセル化プロセスに一般的に関する。

背景技術

0002

ペプチド及びタンパク質薬剤の大部分は、未だに毎日の注射により投与されており、したがってコンプライアンスの問題、疼痛に関連する問題及び患者にとって大きな不便を伴う。それ故、そのような薬剤のための長期にわたる注入送達ステム又は非侵襲的送達システムのいずれかが必要とされる。

0003

経口経路は、高い患者の容認及びコンプライアンスと共に自己投与の利点を提供する。

0004

ペプチド及びタンパク質の経口及び注射による長期放出送達は、依然として挑戦すべき課題であり、毎日の投与を必要とする非経口的な従来の送達に対する最も魅力的代替法であることに変わりはない。最近20年にわたり投入された集中的な努力にも拘わらず、親水性の有効な高分子の経口送達のための実現性がある解決は、これらの親水性高分子の貧弱な腸膜透過率制約された経口バイオアベイラビリティー消化管における不安定性及び徹底的で急速な代謝と関連する幾つかの欠点及び障害のために出現していない。

0005

顕著なバイオアベイラビリティーを有する経口タンパク質送達システムを開発する目的のために、
(a)高分子の物理化学的性質改変
(b)高分子の新規官能化;又は
(c)ナノキャリアの使用による改善された積載物送達
という3通りの手法を採用することができる。

0006

上記手法に関わりなくやはり、タンパク質の当初の生物学的活性を維持することは必須である。経口送達システムは、さらなる臨床試験の可能性があると考えられる機会を有するために、そのような高分子の腸膜透過率を大きく増大させる必要がある。多くのナノ及びミクロ粒子送達システムが、親水性高分子の経口吸収を改善するために使用されて有望な結果を示したが、腸吸収及び薬剤の安定性保護に関して限界に未だ苦しんでいる。

0007

ナノサイズのシステム(例えば、リポソーム、脂質及びポリマーのナノ粒子、ミセル、その他)は、タンパク質送達のための伝統的剤形よりも有利であることが見出されている。バイオ医薬は、近い将来において治療薬の主要な供給源になると予想されている[1]。それにも拘わらず、そのような分子治療活用は、それらを使用する固有の限界;即ち、低い経口バイオアベイラビリティー及び生物学的及び物理化学的不安定性を申し分なく克服できる適当な剤形を開発する可能性にかかっている。しかしながら、タンパク質薬剤の経口投与は、それらのタンパク質分解という不安定性及び生物学的障壁を越える能力の限界に基づく多くの困難に遭遇した。リポソーム及びミセルに基づく送達システムは、消化管の管腔で安定でなく、繊細な高分子に対する適切な保護をもたらすことができない。

0008

それ故、薬学的剤形の中で、ナノ粒子は、ペプチド薬剤薬剤送達のための探査成功した[2〜4]。ナノ粒子、より具体的に生分解性ポリマーのナノ粒子は、それらを種々の用途に適したものにする、優れた組織への生体適合性生分解性組成柔軟性及び小さいサイズを有する。さらに、これらの剤形は、経口投与後の薬剤バイオアベイラビリティーを増大させることが示された[5]。

0009

生分解性ポリマーを用いるカプセル化は、非常に魅力的であるが、それでも製造プロセスが複雑であり親水性高分子は高価である。タンパク質薬剤をこれらのシステムに効率よく包埋する手法の場合に、ポリマーを使用するカプセル化は、(a)タンパク質の貯蔵及び送達中の分解からの保護、及び(b)所望のときに徐放性プロファイルを提供することができる。[6〜8]。
引用文
[1]Tsuji,K.,Tsutani,K.Eur.J.Pharm.Biopharm.,2008,68,496〜502
[2]Joshi,M.D.,Muller,R.H.Eur.J.Pharm.Biopharm.,2009,71,161〜172
[3]Kluge,J.,Fusaro,F.,Muhrer,G.,Thakur,R.,Mazzotti,M.,/.Supercrit.Fluids
2009,48,176〜182
[4]Mehnert,W.,Mader,K.Adv.Drug Deliv.Rev.,2001,47,165〜196
[5]Gursoy RN,Benita S.,Biomed Pharmacother他,2004,58,173〜82
[6]Almeida,A.J.,Souto,E.Adv.Drug Deliv.Rev.,2007,59,478〜490
[7]Bilati,U.,Allemann,E.,Doelker,E.Eur.J.Pharm.Biopharm.,2005,59,375−388
[8]Mundargi,R.C.,Babu,V.R.,Rangaswamy,V.,Patel,P.,Aminabhavi,T.M./.Control.Release,2008,125,193〜209
[9]WO2012/101639

0010

本発明は、ペプチドの薬剤放出を保護及び制御するための親水性バイオ高分子のナノカプセル化を提供する。この新規な戦略は、溶解した薬剤の放出ではなく、ポリマーのブレンド内にミクロカプセル化されたときに、又は別法で、すでに記載されたナノ噴霧乾燥技法[9]を使用して二重にナノカプセル化されたときに非経口投与の後、ナノ粒子内に搭載された小さいペプチドの薬剤種を粘膜の近傍に制御して放出することを可能にする。そのようなカプセル化は、経口投与の場合に繊細な高分子の酸性環境から、及び投与経路に関らずタンパク質分解酵素による分解からの保護も提供する。

0011

したがって、その態様の1つで、本発明は、水溶性タンパク質メタリン酸塩により少なくとも部分的に架橋されたグルカン及び親水性の活性作用物質を含むナノ粒子を提供する。

0012

本明細書において使用する本発明の「ナノ粒子」は、粒子状物質であり、生体適合性であり、充分量のナノ粒子がヒト又は動物体内に投与された後、所望の標的組織器官)に到達し得るために充分な時間実質的に完全なままであるように、化学的及び/又は物理破壊に対して充分に抵抗性であるナノカプセル(NC)又はナノスフェア(NS)である。概して、ナノ粒子は球形の形状であり、700nmまでの平均直径を有する。粒子の形状が球形でない場合には、直径には粒子の最長寸法を当てはめる。

0013

親水性の活性作用物質と関連する種々のパラメーター(例えば、溶解度、分子量、極性電荷反応性、化学的安定性、及び生物学的活性等)に依存して、作用物質は、前記ナノ粒子中に含有され(カプセル化され)、及び/又はナノ粒子を構成するマトリックス中に埋め込まれ得る。それ故、選択された用途のために、ナノ粒子は、ポリマーのシェル及び少なくとも1種の親水性の活性作用物質を含有するコアを有するコア/シェルの形態(この後、ナノカプセルとも称する)であることができる。

0014

あるいは、ナノ粒子は、はっきりしたコア/シェル構造を特色としない実質的に均一な組成であってもよい。これらのナノ粒子は、本明細書ではナノスフェア(NS)とも称される。

0015

幾つかの実施形態では、ナノ粒子はナノスフェア及びナノカプセルから選択される。

0016

他の実施形態では、平均直径は約100から200nmの間である。他の実施形態では、平均直径は約200から300nmの間である。さらなる実施形態では、平均直径は約300から400nmの間であり、平均直径は400から500nmの間である。さらなる実施形態では、平均直径は約600から700nmの間である。

0017

幾つかの他の実施形態では、平均直径は約50から700nmの間である。他の実施形態では、平均直径は約50から500nmの間である。他の実施形態では、平均直径は約50から400nmの間である。さらなる実施形態では、平均直径は約50から300nmの間である。さらなる実施形態では、平均直径は約50から200nmの間である。さらなる実施形態では、平均直径は約50から100nmの間である。

0018

ナノ粒子は、各々実質的に同じ形状及び/又はサイズであってもよい。幾つかの実施形態では、ナノ粒子は、粒子の0.01パーセント以下から10パーセントまでが上で示した平均直径を超えるか又はそれ未満の10パーセントを超える直径を有するような、また、幾つかの実施形態では、ナノ粒子の0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1、2、3、4、5、6、7、8、又は9パーセント以下が上で示した平均直径を超えるか又はそれ未満の10パーセントを超える直径を有するような直径分布を有する。

0019

「水溶性タンパク質」とは、溶媒和媒体、即ち水との双極子−双極子相互作用の形成が可能で、タンパク質を水溶性にする構造を有するタンパク質のクラスに属するタンパク質である。該タンパク質は、線状構造であることも、又は球状構造であることもある(即ち、疎水性アミノ酸が構造の内部に向かって配向し、それに対して親水性アミノ酸が外側に向かって配向している球形の4要素からなる構造を有する)。

0020

幾つかの実施形態では、水溶性タンパク質はアルブミンである。

0021

他の実施形態では、アルブミンは、ヒト血清アルブミンHSA)及びウシ血清アルブミンBSA)から選択されてもよい。

0022

本明細書において使用する「グルカン」とは、グリコシド結合により連結されて一緒になった糖モノマー多糖包含することを意味する。グルカンは、α−グルカンであっても又はβ−グルカンであってもよく、天然、合成又は半合成起源であってもよい。

0023

幾つかの実施形態では、グルカンはα−グルカンである。

0024

少なくとも1種のグルカンは、2種以上のグルカンの組合せ(例えば、混合物)であってもよい。少なくとも1種のグルカンは、当技術分野において知られた1種又は複数種のグルカンであってもよい。少なくとも1種のグルカンの例は、酸化されたセルロースプルランデンプングリコーゲンデキストランリケニンマンナンガラクトマンナンアラビノキシランガラクトン及びそれらの任意の誘導体であるが、これらに限定されない。

0025

幾つかの実施形態では、少なくとも1種のグルカンはデキストランである。

0026

他の実施形態では、グルカンは、約5KDa(キロドルトン)と2,000KDaの間の分子量を有していてもよい。

0027

本発明のナノ粒子において、グルカンは、「少なくとも部分的に架橋され」ており;グルカン分子の少なくとも幾つかは、架橋剤により相互に接続されて3次元構造を形成する。グルカンは、少なくとも1%架橋され(即ち、グルカンの全−OH基の1%が架橋剤に結合している)、少なくとも2%架橋され、少なくとも5%架橋され、少なくとも10%架橋され、少なくとも20%架橋され、又はさらに少なくとも30%架橋されていてもよい。

0028

架橋は、任意の知られている架橋剤によることができる。幾つかの実施形態では、架橋は、メタリン酸塩の使用により達成される。幾つかの実施形態では、架橋は、少なくとも1つはメタリン酸塩作用物質である架橋剤の組合せを使用することにより達成することができる。

0029

幾つかの実施形態では、1種又は複数種のメタリン酸塩がグルカンを少なくとも部分的に架橋するための架橋剤として使用される。用語「メタリン酸塩」は、実験式ΡO3−を有するオキシアニオンを包含することを意味し、PO4構造単位が構成された構造を有すると記載することができる。幾つかの実施形態では、メタリン酸塩は、トリメタリン酸ナトリウムSTMP)、五塩基性トリリン酸ナトリウム(STPP)、及びオキシ塩化リン(POCl3)から選択される。

0030

幾つかの実施形態では、メタリン酸塩は、式:

を有するトリメタリン酸ナトリウム(STMP)である。

0031

理論により束縛されることは望まず、STMPは、グルカンのヒドロキシル(−OH)基とだけ反応する。同様なシステムのために使用されるグルタルアルデヒドなどの典型的な架橋剤とは異なり、STMPは、−NH2基に結合しない。それにより、望ましくない結合に基づく親水性の活性作用物質の活性の障害は防止され、一方、活性化合物のための担体及び/又は保護容器として使用される架橋されナノ粒子の形成は維持される。したがって、架橋されたグルカンは、タンパク質(即ち、アルブミン)を輸送するための粒子状構造を形成し;一方、タンパク質は、順送りで、親水性の活性作用物質の担体及び保護層として役立つ。

0032

幾つかの実施形態では、グルカン(例えばデキストラン)とメタリン酸塩(例えばSTMP)との比は1:10から3:4w/wの間である。他の実施形態では、この比は、1:1、1:2、1:4、1:10、2:1及び3:4(w/w)(グルカン(例えばデキストラン):メタリン酸塩(例えばSTMP))であってもよい。

0033

上記のように、本発明のナノ粒子は、少なくとも1種の「親水性の活性作用物質」も含む。親水性の活性作用物質は、対象者(ヒト又は非ヒト)における疾患又は障害の治療又は予防のために使用される活性親水性薬剤から選択することができる。その活性薬剤は、ビタミン、タンパク質、酸化防止剤:、ペプチド、ポリペプチド、脂質、炭水化物ホルモン、抗体、モノクローナル抗体ワクチン予防薬診断薬造影剤核酸栄養補助食品、分子量が約1,000Da未満又は約500Da未満の低分子、電解質、薬剤、免疫学的作用物質及び上記の任意の組合せから選択することができるが、これらに限定されない。

0034

幾つかの実施形態では、親水性の活性作用物質は、ホルモンの中から選択することができる。

0035

幾つかの実施形態では、親水性の活性作用物質は、インスリンエキセナチド成長ホルモン(例えばソマトトロピン)、オクトレオチド酢酸塩ランレオチド酢酸塩、ゴセロリン酢酸塩、コパキソンエタネルセプト、又はモノクローナル抗体、例えば、セツキシマブトラツズマブ、アダリムマブベバシズマブなどから選択される。

0036

幾つかの実施形態では、親水性の活性作用物質は、−NH2末端部分又は−NH2側鎖部分を有する。STMPは、そのような親水性の活性作用物質の−NH2基と反応しないので、STMPと活性作用物質の間の架橋又は如何なる化学反応も架橋プロセス中に起こり得ない。この結果、活性作用物質はナノ粒子内にカプセル化されて、その活性及び/又は構造は損傷されず又は影響されない。

0037

本発明のナノ粒子は、広範囲の親水性の活性作用物質のための送達媒質として、局所で、眼で、経口的に、吸入により、で、又は非経口的に循環システム中で使用することができる。本発明のナノ粒子送達システムは、目標とされる薬剤送達及び制御された放出の適用を容易にして、クレアランスの低下にも基づいて作用の部位における薬剤バイオアベイラビリティーを増大させ、投薬頻度を減少させ、副作用を最小にする。本発明のナノ粒子は、乾燥粉末の形態で使用することができ(そのまま、例えば、吸入できる組成として投与される)、又は水性媒体再構成されて注射用剤形を形成することができる。

0038

必要な場合には、さまざまな環境に対する活性化合物のさらなる保護及び安定化を提供するために、本発明のナノ粒子をより大きい粒子、即ち、非経口的投与のためのナノカプセル又は経口投与のための微粒子中にさらにカプセル化することができる。

0039

したがって、別の1つの態様で、本発明は、本明細書で定義された本発明の疎水性ポリマー及び複数のナノ粒子を含む担体を提供し、該複数のナノ粒子は、(i)疎水性ポリマー、例えばPLGAによりカプセル化されているか(即ち、二重ナノカプセル化を形成);又は(ii)疎水性ポリマーのブレンドなどで形成されたマトリックス中に埋め込まれている。そのようなポリマーのブレンドは、オイドラギット:HPMCブレンドであってもよく、該ブレンドでオイドラギットはpH依存性の溶解度を有し、一方、HPMCはpHに関わらず水溶性である。

0040

そのようなさらなるカプセル化は、ナノ粒子を含む種々の構造を生じ得る。例えば、ナノ粒子がナノスフェアである場合、疎水性ポリマーは、ナノスフェアを外側のシェルの形成によりカプセル化することができ、即ち、ナノスフェアを含むナノカプセル(二次NC中の一次NS)を形成する。あるいは、該疎水性ポリマーは、中にナノスフェアが埋め込まれているマトリックスの形態(二次ミクロスフェア中の一次NS)であってもよい。

0041

同様に、ナノ粒子がナノカプセルである場合、疎水性ポリマーは、ナノカプセルをカプセル化することができ(二次NC中の一次NS)、又はマトリックスの形態(二次ミクロスフェア中の一次NS)であってもよい。

0042

幾つかの実施形態では、薬剤担体は、ナノカプセル、ナノスフェア及びそれらの混合物から選択される形態であってもよい。

0043

用語「疎水性ポリマー」は、水を吸収する傾向が殆ど又は全くないポリマー材料を指す。理論により束縛されることは望まず、そのようなポリマーは、水性環境における親水性の活性作用物質の送達のための保護層又はマトリックスとして役立つ。疎水性ポリマーは、本発明の担体に、所定の様式で親水性の活性作用物質を放出する徐放性又は制御放出特性を付与するためにも使用することができる。

0044

幾つかの実施形態では、疎水性ポリマーは、ポリ乳酸グリコール酸)(PLGA)、ポリメチルメタクリレートPMMA)、ヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC)、ポリ(乳酸)(PLA)、ポリ(ラクト−co−グリコリド)(PLG)、ポリ(ラクチド)、ポリグリコール酸PGA)及びポリ(ヒドロキシブチレート)から選択される。

0045

幾つかの実施形態では、疎水性ポリマーは、ポリ(乳酸グリコール酸)(PLGA)、ポリ乳酸(PLA)及びポリ(ラクト−co−グリコリド)(PLG)から選択される。

0046

担体は、典型的には概して球形形状であってもよく、幾つかの実施形態では、約200から900nmの間の直径を有する。他の実施形態では、担体の直径は、約200から800nmの間、約200から700nmの間、約200から600nmの間、又は200及び500nmの間であってもよい。幾つかの他の実施形態では、担体の直径は、約300から900nmの間、約400から900nmの間、約500から900nmの間、約600から900nmの間又は約700から900nmの間であってもよい。

0047

本発明のナノ粒子及び/又は担体は、医薬組成物中に剤形化することができる。したがって、別の態様において本発明は、本発明の本明細書で記載されたナノ粒子及び/又は担体を含む医薬組成物を提供する。

0048

別の態様において、親水性の活性作用物質の送達システムが提供され、該送達システムは、疎水性ポリマー及び前記疎水性ポリマー内にカプセル化された本明細書に記載された複数のナノ粒子を含む。

0049

本発明のさらなる態様により、マトリックスを形成する疎水性ポリマー、及び前記マトリックス内に埋め込まれた本明細書に記載された複数のナノ粒子を含む、親水性の活性作用物質の送達システムが提供される。

0050

本発明の送達システムは、少なくとも約12時間、又は幾つかの実施形態では、少なくとも約24時間、少なくとも7日、又はさらに少なくとも2週間などの時間にわたって作用物質の制御された放出を可能にする速度で活性作用物質を送達するために適する。それなりに、該送達システムは、限定されないが、薬剤送達、遺伝子療法医学診断などの種々の用途のために、及び例えば、皮膚病、癌、病原体によって運ばれる疾患、ホルモン関連疾患、臓器移植、及び他の異常細胞又は組織の増殖と関連する反応生成物のための医学的療法のために使用することができる。

0051

医薬組成物中におけるナノ粒子及び/又は担体の濃度は、所望の有効量の親水性活性作用物質を対象者に送達するのに充分な量であるように、及び選択された投与の特定の様式に従って選択することができる。知られているように、本発明における目的のための「有効量」は、当技術分野において知られたそのような考慮により決定することができる。その量は、とりわけ、治療されるべき疾患のタイプ及び重症度及び治療計画に応じて、所望の治療効果を達成するために効果的でなければならない。有効量は、典型的には、適切に設計された臨床試験(用量範囲の検討)で決定され、当業者は、有効量を決定するためにそのような試験を適切に実施する方法を知っているであろう。一般的に知られているように、有効量は、種々の要因、とりわけ、その体内分布プロファイル、体内における半減期などの種々の薬理学的パラメーターに、もしあれば望ましくない副作用に、年齢及び性別などの要因に依存する。

0052

医薬組成物は、薬学的に許容される添加剤をさらに含むことができて、それらは、例えば、媒質、補助剤賦形剤、又は希釈剤であってもよく、当業者に周知であり、公開で容易に入手できる。薬学的に許容される添加剤は、活性作用物質に対して化学的に不活性なもの及び使用条件下で有害な副作用又は毒性を有しないものであることが注意事項である。それに加えて、上記組成物は、皮膚軟化剤加湿剤、増粘剤乳化剤中和剤着色剤香料吸収剤又はフィルター防腐剤及び/又はゲル化剤などの他の標準的添加剤を含んでいてもよい。

0053

幾つかの実施形態では、医薬組成物は、前記親水性の活性作用物質の局所、経口、吸入、鼻内、経皮、眼内又は非経口的投与に適合されている。他の実施形態では、医薬組成物は、前記親水性の活性作用物質の経口投与に適合されている。幾つかの他の実施形態では、医薬組成物は、前記親水性の活性作用物質の注射による投与に適合されている

0054

添加剤の選択は、特定の活性作用物質により、並びに上記組成物を投与するために使用される特定の方法又は送達システムにより一部は決定されるであろう。

0055

経口投与のために適当な医薬組成物は、(a)水、食塩水、又はオレンジジュースなどの希釈剤に溶解された有効量の化合物などの液体溶液;(b)所定量の活性成分を、固体又は顆粒として各々含有するカプセルサシェ錠剤ロゼンジ、及びトローチ;及び(c)散剤からなることができる、カプセルの形態は、例えば、界面活性剤潤滑剤、及び不活性な賦形剤、例えば、ラクトーススクロースリン酸カルシウム、及びトウモロコシデンプンなどを含有する通常の硬質又は軟質のシェル入りゼラチンタイプであることができる。錠剤形態は、ラクトース、スクロース、マンニトール、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプンアルギン酸微結晶性セルロースアラビアゴム、ゼラチン、グアーガムコロイド状二酸化ケイ素タルクステアリン酸マグネシウムステアリン酸カルシウムステアリン酸亜鉛ステアリン酸、及び他の賦形剤、着色剤、希釈剤、緩衝液剤、崩壊剤、加湿剤、防腐剤、着香剤、及び薬理学的に適合性の担体の1種又は複数種を含むことができる。ロゼンジ形態は、香味料、通常スクロース及びアラビアゴム又はトラガカント中に活性成分を含むことができ、トローチ(pastille)も同様に、ゼラチン及びグリセリン、又はスクロース及びアラビアゴム、エマルションゲルなどの不活性基剤中に活性成分を含み、同様なものも活性成分に加えて、当技術分野において知られているような担体を含有する。

0056

本発明のナノ粒子は、単独で又は他の適当な構成要素との組合せで、吸入により投与されるべきエアロゾル剤形に作製することができる。これらのエアロゾル剤形は、ジクロロジフルオロメタンプロパン窒素などの加圧された許容される噴射剤中に入れることができる。それらは、ネブライザー又は噴霧器などにおける加圧されていない製剤のための医薬として剤形化することもできる。

0057

非経口的投与に適した組成には、抗酸化剤、緩衝液剤、静菌剤、及び剤形を意図される受容者の血液と等張にする溶質、及び懸濁剤可溶化剤、増粘剤、安定剤、及び防腐剤を含む水性滅菌懸濁液を含有することができる等張の滅菌注射用水溶液が含まれる。該非経口的剤形は、典型的には、溶液中に約0.5から約25重量%の活性成分を含むであろう。適当な防腐剤及び緩衝剤は、そのような剤形で使用することができる。注射部位における刺激を最小化又は排除するために、そのような組成は、約12から約17の親水性疎水性バランスHLB)を有する1種又は複数種の非イオン性界面活性剤を含有することができる。そのような剤形中における界面活性剤の量は、約5から約15重量%の範囲にある。適当な界面活性剤には、ソルビタンモノオレエートなどのポリエチレンソルビタン脂肪酸エステル及びエチレンオキシドと、プロピレンオキシドプロピレングリコールとの縮合により形成された疎水性基剤との高分子量付加物が含まれる。非経口的剤形は、単位用量又は複数回使用の、アンプル及びバイアルなどの密封された容器で提供することができ、凍結乾燥された(lyophilized)条件下で貯蔵できて、使用直前無菌液体担体、例えば、注射用の水を単に添加することが必要なだけである。

0058

本発明の組成は、注射用剤形に作製することができる。注射用組成物のための効果的な薬学的担体にとっての要件は、当業者に周知である。

0059

本明細書において使用する用語「局所の」とは、本発明による組成を、対象者の皮膚(ヒトの又は非ヒトの皮膚)の少なくとも一部分に、所望の効果、部位で例えば、化粧用の又は治療の効果を得るために直接適用することを指す。

0060

本発明のナノ粒子、担体及び/又は送達システムは、生体適合性水溶液中で投与することができる。この溶液は、食塩水、水又は薬学的に許容される媒体を含むことができるが、これらに限定されない。

0061

送達システム剤形の投与は、単回用量又はある一定の間隔後に1回若しくは数回繰り返される用量で実施することができる。適当な投薬量は、治療されている個体、投与様式、治療剤の固有の特性及び達成されるべき特定の治療効果により、及びそれに直接依存して左右される治療的に有効な投薬量のようなパラメーターによって変化し得る。適当な用量は、当業者によって確立することができる。

0062

幾つかの実施形態では、送達システムは、典型的には経口投与のために生分解性カプセル内にさらにカプセル化することができる。そのような実施形態では、前記生分解性カプセルは、腸用にコートされたカプセルの形態である。

0063

幾つかの他の実施形態では、送達システムは、目標の治療剤送達の促進及び前記親水性の活性作用物質の制御された放出投与に適応可能である。

0064

本発明の別の態様により、疾患、障害又は慢性状態を治療するための医薬組成物を調製するための本明細書に記載された本発明のナノ粒子又は担体の使用が提供される。慢性状態の例は、糖尿病肥満症、ホルモン欠乏症、タンパク質欠乏症その他であるが、これらに限定されない。本発明の粒子は、活性作用物質(例えば、ホルモン又はタンパク質)の長期放出を提供するので、本発明のこれらのナノ粒子の投与は、必要とされる日常処置の数を減らすことができて、それにより患者の生活の質を改善し、並びに患者の治療に対するコンプライアンスを増進する結果になる。

0065

本明細書において使用する用語「治療」又はその任意の言い換えは、疾患と関連する望ましくない症状を和すること、そのような症状の発現をそれらが起こる前に防止すること、該疾患の進行を遅らせること、症状の悪化を遅らせること、慢性状態を安定化すること、寛解期間の発現を増強すること、疾患の進行性慢性ステージで引き起こされる不可逆的損傷を遅らせること、前記進行性ステージの発症を遅らせること、重症度を軽減し若しくは該疾患を治癒させること、生存率を向上させ若しくはより急速な回復を誘発すること、又は疾患の発生を予防すること又は上記の2種以上の組合せに効果的な本発明のナノ粒子又は送達システムの治療剤の量を投与することを指す。

0066

別の態様では、水溶性タンパク質、グルカン及び親水性の活性作用物質を含むナノ粒子の調製プロセスが提供され、グルカンはメタリン酸塩により少なくとも部分的に架橋されており、該プロセスは:
有機溶媒を、前記水溶性タンパク質及び前記グルカンを含む第1の水溶液と前記親水性の活性作用物質を含む第2の水溶液とを含有する混合物中に送達する(例えば、注射により)こと;及び
−前記ナノ粒子を得るために、前記メタリン酸塩を前記混合物に添加してそれにより前記グルカンを少なくとも部分的に架橋させることを含む。

0067

幾つかの実施形態では、該プロセスは:
−前記水溶性タンパク質及び前記グルカンを含む第1の水溶液と前記親水性の活性作用物質を含む第2の水溶液との混合物を得ること;
−有機溶媒を、前記混合物中に送達すること(例えば、注射する);及び
−前記ナノ粒子を得るために、前記メタリン酸塩を前記混合物に添加して前記グルカンをそれにより少なくとも部分的に架橋すること
を含む。

0068

さらなる実施形態では、該プロセスは:
−前記水溶性タンパク質及び前記グルカンを含む第1の水溶液と前記親水性の活性作用物質を含む第2の水溶液とを混合して混合物を得ること;
−有機溶媒を、前記混合物中に送達する(例えば、注射する)こと;及び
−前記ナノ粒子を得るために、前記メタリン酸塩を前記混合物に添加してそれにより前記グルカンを少なくとも部分的に架橋すること
を含む。

0069

さらなる実施形態では、有機溶媒は注射により混合物中に送達される。

図面の簡単な説明

0070

本明細書で開示された主題の事柄をよりよく理解するために、及び如何にしてそれが実際に実施され得るかを例示するために、ここで、実施形態を、限定にならない単なる例によって添付図面を参照して説明することにする。該図面において:
図1Aは、STMPによるデキストランの架橋機構の模式的説明である。
図2Bは、架橋され粒子の模式的説明である。
図2は、アルブミンを水溶液で不溶性にするアルブミンの架橋反応を示す。
図3は、エキセナチドの異なった剤形(FI−V)及びバイエッタに対する体重の結果を示す。
図4は、バイエッタを用いた予備実験による血中グルコースレベルを示す。
図5は、エキセナチドの異なった剤形(FI−V)及びバイエッタによる血中グルコースレベルを示す。
図6は、異なった日における異なった群の血漿インスリンレベルを示す。
図7Aは、異なった日における異なった群のグリコレーヘモグロビンレベルを示す。
図7Bは、10日間治療におけるグリコシレートヘモグロビンレベルの全平均を示す。
図8Aは、DX−50NP剤形の冷凍TEM像を示す。
図8Bは、DX−150NP剤形の冷凍TEM像を示す。
図9Aは、Glut−1MPのXHR−SEM像を示す。
図9Bは、DX−50MPのXHR−SEM像を示す。
図9Cは、DX−150MP剤形のXHR−SEM像を示す。
図10は、バイエッタ(商標)及びエキセナチド溶液の20μg/ラット(56μg/kg)の用量における皮下注射及び種々の剤形の50μg/ラットの用量(DEX50及びDEX150についてそれぞれ165及び65μg/kg)における経口投与後のラットにおけるエキセナチドの薬物動態学的プロファイルを示す。
図11A−Cは、二重カプセル化BSA/インスリンNPの冷凍保護プロセス後に凍結破砕したSEM像である。
図12は、種々のインスリン搭載ナノ粒子剤形の絶食条件における皮下投与後の血中グルコースレベル(N=3)を示す。
図13は、h−インスリン搭載ナノ粒子剤形の非絶食条件における皮下投与後の血中グルコースレベル(N=3)を示す。

実施例

0071

エキセナチドは、グルコース代謝及びインスリン分泌制御因子であるヒトグルカゴン様ペプチド−1(GLP−1)に類似の生物学的性質を示すアメリカドクトカゲ唾液中で見出されたホルモンのエクセンジン−4の合成品である。インクレチンホルモン、GLP−1及びグルコース依存性のインスリン指向性ペプチドGIP)は、食物摂取後に結腸のL及びK内分泌細胞により産生される。GLP−1及びGIPは、中のランゲルハンス島β細胞からのインスリン分泌を刺激する。GLP−1のみが糖尿病性状態でインスリン分泌を生じさせるが、それは生体内の半減期が非常に短い(2〜3分)ので、糖尿病の臨床的治療としては有効でない。

0072

エキセナチドは、39アミノ酸のペプチドで、効果を有するインスリン分泌促進薬である。該薬物は、充填されたペン型デバイスを使用して皮下に1日に2回注射される。エキセナチドは、GLP−1に対して50%アミノ酸相同性を有し、構造的にGLP−1と類似であり、生体内でより長い半減期(2.4時間)を有する。したがって、それを、哺乳動物でインスリン分泌を刺激して血中グルコースを低下させる性能について試験して、糖尿病性状態に効果的であることが見出された。齧歯類についての検討で、それは、膵中のβ細胞の数を増加させることも示された。

0073

エキセナチドは、インスリンレベルを速やかに(投与後約10分以内)上昇させ、インスリンレベルは、実質的にその後1時間又は2時間にわたって低下する。エキセナチドは、経口抗糖尿病薬による血糖症制御の達成に成功していない2型糖尿病を有する患者のための補助療法として承認されている。食事後にとられる用量は、前以てとられる用量よりも血糖に対する効果がはるかに小さい。血糖に対する効果は6から8時間後に減少する。該医薬は2通りの用量:5μg及び10μgで利用できる。治療は、しばしば5μgの用量で始めて、有害な効果が重要でなければ用量は増加される。メーカーによれば、自己注射器は、最初の使用の前に冷蔵庫中に2から8℃の間で、次に2から25℃の間の温度で貯蔵しなければならない。それ故、暑い気候では、それは連続的に冷蔵されるべきである。エキセナチドの臨床用途において可能性のある不利点は、高頻度の皮下(SC)注射が必要なことであることは強調されるべきである。皮下注射は、注射部位における疼痛、副作用及び可能な感染の原因となり得るので、患者のコンプライアンスに悪影響を及ぼし得る。

0074

エキセナチドの長時間作用性放出形態が、1週間に1回の注射として使用されるように開発された。この徐放性剤形は、エキセナチド及び吸収性縫合糸及び長期放出医薬における使用が確立された、制御された速度でゆるやかな薬剤送達を可能にする一般的な生分解性ポリマーであるポリ(D,L乳酸−co−グリコール酸)の注射用ミクロスフェアからなる。したがって、エキセナチドの徐放性放出は、特に体重減少が個々の患者管理に必須の態様である2型糖尿病の治療のための有用な選択肢である。しかしながら患者では、それは、未だ注射であり、1週間に1回注射される必要がある。

0075

エキセナチド及びインスリンは、動物で再生されたデータからの外挿によれば、低い(2%未満と見積もられる)を示す親水性生体高分子であり、この低い経口ヒトバイオアベイラビリティーは、タンパク質分解の不安定性及び生体膜を通して透過する限定された能力に帰せられた。

0076

本発明においては、親水性高分子のカプセル化が、エキセナチド及びインスリンのために実証される。第1の目的は、最終の散剤剤形における薬剤含有率が、可能な最高であることを確実にするために、経口投与のための微粒子へのナノ粒子搭載を増大させる目的で、妥当なレベルでナノ粒子のマトリックス中にエキセナチドを包埋することである。

0077

本発明は、より大きいナノカプセル中にさらに埋め込まれて、非経口経路を使用する長期放出のための外部環境の有害な効果からペプチドを保護するように設計されている、二重コートされたナノ粒子送達システムの形成を生ずる一次ナノカプセル又はナノ粒子中へのペプチドの薬剤組み込みをさらに提供する。ペプチド搭載一次ナノカプセルは、より大きい二次ナノカプセル内にカプセル化される。体積計算に基づいて、直径が400又は600nmのナノカプセルには、それぞれ少なくとも64及び216個の直径が100nmのナノカプセルを組み込むことが理論的に可能であることが注目されるべきである。

0078

二次微粒子、即ち、本発明の一次ナノ粒子をカプセル化している担体は、噴霧乾燥技法により得た。噴霧乾燥は、連続した単一ステップのプロセスで液体又は懸濁液を乾燥粉末に変換するプロセスである。噴霧乾燥は、1000nmから20μmの範囲のサイズの微粒子を、少ない試料量(2〜3ミリグラム又はミリリットル)に対して高収率(>70%)で生成させて、それにより比較的高い収率で微粒子を形成させることができるBuchi社の実験室規模噴霧乾燥機を使用することにより実施した。該二次微粒子は、概して1から30ミクロンの間のサイズ(直径)を有する。

0079

材料
ウシ血清アルブミン(BSA)及び12KDaのデキストランは、Sigma−Aldrich社(Rehovot、イスラエル)から購入した。エキセナチドは、Teva Pharmaceuticals社(Jerusalem、イスラエル)の好意供与された。水中8%のグルタルアルデヒドは、Sigma−Aldrich社(Rehovot、イスラエル)から購入した。トリメタリン酸ナトリウム(STMP)は、AlfaAesar社(Haverther chemicals and hill、マサチューセッツ州、米国)から購入した。ポリ(メタクリル酸エチルアクリレート1:1(オイドラギット(登録商標)L100〜55)は、Rohm社(Dramstadt.GmbH、ドイツ)から得た。ヒドロキシプロピルメチルセルロース(Methocel E4M Premium)は、Dow Chemical社(Midland、ミシガン州、米国)から購入した。一塩基性リン酸ナトリウム一水和物はMallinckrodt chemicals社(Phillipsburg、ニュージャージー州、米国)から購入した。全ての有機溶媒はHPLC規格であり、J.T.Baker社(Deventer、オランダ)から購入した。

0080

一次NPの調製
繊細な生体高分子であるエキセナチドの保護に最も重要なことは、該ペプチドを一次BSA NPに搭載することにより達成した。2つの異なるタイプのNPを調製した:8%グルタルアルデヒドで架橋されたBSA NP、及びSTMPで架橋された12KDaのデキストランNPと組み合わされたBSA。

0081

グルタルアルデヒドで架橋されたBSA NP
グルタルアルデヒドで架橋されたBSA NPを、Weberら[ref−Desolvation process and surface characterisation of protein nanoparticles]によって前に記載された確立された脱溶媒方法により調製した。200mgのBSA及び4mg又は8mgのエキセナチドを20mlの再蒸留水DDW)に溶解した。0.5時間後に、溶液のpHを0.1MのNaOHにより8.5に調節した。次に、40mlのアセトンを、ゆっくり水性相に加えた。分散媒体における乳光の急速な形成により明らかなように、o/wエマルションが形成された。次にBSA NPを、12.5μ1のグルタルアルデヒドの8%溶液を使用して2時間かけて架橋した。架橋反応が完結した後、アセトンを、空気の層流下で蒸発させた。この剤形をGlut−1と命名した。

0082

STMPで架橋されたBSA/デキストランNP
BSA/デキストランNPを、20mlのDDW中に、以下の化合物を溶解することにより同様に調製した:200mgのBSA、50mgの12KDaのデキストラン及び必要なときには4mg又は8mgのエキセナチド。0.5時間後に、該溶液のpHを0.1MのNaOHにより8.5に調節して、デキストラン上で隣接するヒドロキシル基がSTMP架橋剤との反応に使用できるようにした。次に、20mlのアセトンを、該水性相にゆっくり加えた。次にBSA/デキストランNPを、50mgのSTMPを使用して3時間かけて架橋させ、アセトンを上で記載したように蒸発させた。予備剤形を調製してプロセスパラメーターを変化させることにより評価した。デキストラン量が異なる2通りの剤形(50mg及び150mg)をさらなる動物実験のために選択した。50mgの剤形をDX−50と、及び150mgの剤形をDX−150と名付けた。

0083

ミクロスフェア(MP)調製
エキセナチドを含有するNPを噴霧乾燥技法を使用してマイクロカプセル化することにより、ミクロスフェア(MP)を形成させた。マイクロカプセル化の目的で、100mlのNaH2PO4緩衝液を調製した。緩衝液のpHは、1MのNaOH溶液により6.5に調節した。pHを6.5に保っているその溶液に、750mgの量のオイドラギットを溶解した。それに加えて、100mlの予備加熱した(約80℃)DDWに、1000mgのヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC)を添加することにより、1%w/vのHPMC溶液を調製した。次に、上記オイドラギット溶液を、gazaバンド付きの漏斗を用いて(溶解しなかったオイドラギット粒子を濾過するために)HPMC溶液に加えた。

0084

アセトンを該NP懸濁液から蒸発させたら、微粒子ポリマーの集めた溶液をNP懸濁液に加えた。該懸濁液を、次にBuchi社のミニ噴霧乾燥機B−190装置(Flawil、スイス)で以下の条件下に噴霧乾燥した:導入口温度160℃;排出口温度85℃;吸引100%;懸濁液の供給速度は7ml/分であった;粉末サイクロン分離機で集めて排出口収率を計算した。

0085

NPの物理化学的キャラクタリゼーション及びそれに続くMP
NPキャラクタリゼーション
種々のNPの平均直径及びゼータ電位を、MalvernのZetasizer(ナノシリーズ、Nanos−ZS社、英国)を25℃で使用して、水を希釈剤として使用して特徴づけた。形態学的評価を、冷凍透過電子顕微鏡(冷凍TEM)を使用して実施した。冷凍TEM方法では、1滴の該溶液を、300メッシュのCu格子(TedPella社、Redding、カリフォルニア州、米国)に支持された炭素でコートされた穴のあるポリマーフィルム上に置いて、該検体をVitrobot(FEI)を使用して液体エタン中で−170℃に急冷することにより自動的にガラス化する。該試料をFEI Tecnai 12G2 TEMを使用して、−180℃に保ったGatan冷凍ホルダーを用いて120kVで検査し、像を低速走査の冷却した電荷結合素子カメラで記録した。

0086

MPの超高分解走査電子顕微鏡(SEM)による検査
噴霧乾燥されたMPの形態及びサイズの評価を、超高分解走査電子顕微鏡(モデル:Magellan 400L、FEI、ドイツ)を使用して実施した。試料をSEM用試料台上に両面粘着テープを使用して固定して、次に真空で金スパッタリング(Pilaron E5100)手順による標準的コーティングによって電気的に導電性にした。

0087

薬剤含有率
散剤中のエキセナチドの合計量を、試料を2mlの水に溶解して終夜置くことにより分析した。その後、該混合物を14000rpmで2分間遠心分離した。上清からの1mlをHPLCに以下の条件で注入した:カラムRestek Viva C4(5μm)、250/4.6mm。カラム温度は45℃に保った。移動相Aはアセトニトリル(ACN)、及び移動相Bはリン酸によりpH2.5に調節されたリン酸二水素カリウム(KH2PO4、20mmol/L)であった。KH2PO4緩衝液を使用前に0.2μm膜フィルターを通して濾過した。以下の勾配条件をエキセナチドのために使用した:移動相をA15分で30%から45%に、及び移動相Aを30%で3分間再平衡させた。流速は1.5mL/分であった。注入体積は20μlであった。UVシグナルは215nmで検出した。エキセナチド含有率は、0から20μg/mlの間の範囲のエキセナチド濃度で構成したて相関関係を生じた(r2=0.999)較正曲線を使用して計算した。

0088

ラットにおける薬物動態学の検討
全ての動物実験は、エルサレムのヘブライ大学における学内のEthical Committee of Laboratory Animal Careにより承認された(MD−13575〜4)。Sprague Dawley雄ラット(300〜350g)をこの検討に使用した。動物はSPF条件で収容して絶食させ、飲み水には自由に利用させた。無作為に分割した3匹のラットの7群について、経口吸収によりエキセナチドの血漿レベルを経時的に評価した。エキセナチドを溶液として又はバイエッタ(登録商標)に剤形化して65g/kgの用量(20μg/ラット)で皮下に注射した。第3及び第4群のラットに、エキセナチドを外部で加えた31mgのブランクMP又はエキセナチド溶液のいずれかで、165μg/kg(50μg/ラット)の用量で経口的に投与してブランク剤形が効果を有するか否かを決定した。最終的に、35、33及び32mgのGlut−1、DX−50及びDX−150を、それぞれ、経口的に165μg/kg(50μg/ラット)の用量で投与した。全ての経口懸濁液は、2mLのDDWに分散させたが、それに対して皮下注射の体積は200μ1であった。

0089

血液試料(500μl)をラット尾部から0、0.5、1、2、4、6、8及び24時間に採血した。血液試料はEDTA及びアプロチニンを含有するチューブ中に集めた。試料を10,000rpm、4℃で10分間遠心分離して、その後250μlの血漿試料を新しいチューブに移して、分析するまで−80℃で貯蔵した。エキセナチドレベルは、CEK−0130−01ELISAキット(AB Biolabs社、米国)を使用して同社により提案されたプロトコルに従って決定した。

0090

バイオアベイラビリティーの計算
薬物動態学パラメーターを、AUCの計算のための台形ルール適用するWinNonlinソフトウェアを使用して計算した。AUC値はサイズ用量補正に従って調節した。

0091

異なる経口剤形相対バイオアベイラビリティーを、標準マーカーを入れて皮下注射されたバイエッタ(登録商標)剤形と比較して、以下の方程式を使用して計算した:

エキセナチド剤形
剤形F−l:BSA及び架橋されデキストランによるエキセナチドの一次ナノカプセル化
200mgのBSA(Sigma−A7906)及び50mgの12KDaのデキストラン(Sigma−31418)を10mlのDDWに溶解した。4mgのエキセナチドを10mlのDDWに別に溶解した。アルブミン/デキストラン溶液をエキセナチド溶液に加えてペプチド溶解を完了させた(溶液A)。6.8のpHを0.1MのNaOHでpH約8.5になるまで調節した。20mlのアセトンを溶液−Aに強く攪拌しながら注入してエキセナチドの大部分を含むBSΑ−デキストランNPの形成を誘発した。デキストラン架橋は5%(1ml)のトリメタリン酸ナトリウム(STMP)の添加により得て、該溶液を、900rpm、室温で3時間攪拌した。剤形F−lの合成の模式的描写を図1Α〜1Bに示す。

0092

剤形F−2:BSA及び架橋したグルタルアルデヒドによるエキセナチドの一次ナノカプセル化
200mgのBSA(Sigma−A7906)を、10mlのDDWに溶解した。4mgのエキセナチドを10mlのDDWに別に溶解した。アルブミン溶液をエキセナチド溶液に加えてペプチドの溶解を完了させた。pHを0.1MのNaOHでpH8.5の間になるように調節した。15mlのアセトンを、溶液−Aにボルテックスで強く攪拌しながら注入して、エキセナチドの大部分を含むBSΑ−エキセナチドNPの形成を誘発した。BSA架橋は25μ1の4%グルタルアルデヒドの添加により得て、該溶液を900rpm、室温で3時間攪拌した。剤形F−2の架橋の模式的描写を図2に示す。

0093

剤形F−3:エキセナチドのナノ粒子表面への結合
エキセナチド活性化を、4mgのエキセナチドを、スペーサースルホSMCC(スルホスクシンイミジル−4−(N−マレイミドメチルシクロヘキサン−1−カルボキシレート)と2時間室温で反応させることにより実施した。

0094

ナノ粒子を調製するために、150mgのPLGA(50K)(Resomer RG 504H、Boehringen Inge1heim社)、150mgのPLGΑ−co−PEG(45K及び5K)(Resomer RG Pd 50105)及び10mgのオレイルシステインアミドを50mlのアセトンに溶解した。100mgのSolutol HS15(BASF社)を100mlのDDWに攪拌しながら溶解させた。該有機相を該水性相に攪拌下で(900rpm)加えて15分間かけて混合させた。剤形を37℃で減圧下にロータリーエバポレーターを使用して10ml未満に蒸発させた。pHを0.1MのNaOHを使用して6.7〜6.8に調節し、体積を10mlに調節した。剤形を4000rpmで遠心分離して大きい粒子(3〜4%)を沈降させた。コロイド状上清だけを最終の剤形として使用した。

0095

活性化されたエキセナチドを直ちに、予備成形された剤形と共にインキュベートした。インキュベーションは、室温で終夜、磁性攪拌機上で実施した。LC−SMCCのマレイミド基がオレイルシステインアミドのスルフヒドリル基とpH=6.5〜7.5で反応して安定なチオエーテル結合を形成した。

0096

剤形F−4:エキセナチドの二重カプセル化
100mgのBSA(Sigma−A7906)を2mlのDDWに溶解した。5mgのエキセナチドを3mlのDDWに別に溶解した。アルブミン溶液をエキセナチド溶液に加えてペプチド溶解を完了させた。pHを1MのNaOHで7.4〜8に調節した。10mlのアセトンを該溶液に強く攪拌しながら注入してエキセナチドの大部分を含むBSAナノ粒子の形成を誘発した。

0097

128mgのPLGA(50K)を93mlのアセトニトリルに溶解した。6mlのBSAナノ粒子剤形を攪拌しながら加えて二重カプセルを形成させた(ナノ噴霧条件:4μmメッシュ、温度:50℃)。

0098

オイドラギットL及びHPMCによる剤形F1〜F4のマイクロカプセル化
500mgのHPMCを100mlの予め加熱されてDDWに溶解して、500mgのオイドラギット(アニオン性)を100mlのPBSに溶解した。

0099

ナノ粒子溶液に、オイドラギット溶液及びHPMC溶液を加えた。組み合わされた溶液を30分間500rpm、室温で攪拌した;組み合わされた分散液を噴霧乾燥機により以下の条件で蒸発させた:導入口温度=160℃;排出口温度=100℃。薬剤搭載ナノ粒子を含む微粒子が得られた。

0100

薬剤搭載ナノ粒子の物理化学的キャラクタリゼーションを表1に示す。

0101

表1:エキセナチド剤形の物理化学的性質。*2バッチを合わせた。
**合わされた剤形について

0102

OB/OBマウスにおける種々の剤形(F1〜F5)中のエキセナチドのグルコース低下効果の評価
マウスの順化を、2〜3日の間グルコースを与えてグルコースレベルを6時間にわたってモニターすることにより実施した。その後、全てのマウスにバイエッタ(市販のエキセナチド注射用剤形)を20μg/kgの用量で注射して血中グルコースレベルを6時間にわたってモニターした。

0103

OB/OBマウスにおける種々の剤形中のエキセナチドのグルコースを低下させる効果の評価を、動物の1群当たりn=8の群サイズについて実施した。OB/OBマウスの各群に以下の1つを与えた:
i)食塩水+空媒質(F−5)
ii)バイエッタの注射
iii)エキセナチド(F−l)
iv)エキセナチド(F−2)
v)エキセナチド(F−3)
vi)エキセナチド(F−4)

0104

第1日には、実験に先立って全ての動物を18時間絶食させて、次に絶食後に、血中グルコースをモニターした。グルコースを全ての動物の腹腔に注射して(18mm/kg);グルコース注射後60分に以下のパラメーターを検査した:血中グルコース測定、Elisaのための血液収集体重測定。次に、剤形F1〜F5を経口的に投与した(バイエッタは皮下に投与した)。投与後、血中グルコースレベルを、投与から30分、1時間、1.5時間、2時間、3時間及び6時間にモニターした。

0105

第2日から第9日まで、体重を時間ゼロに測定して血液をELISAのために収集した。これに続いて上記剤形を投与して、薬剤投与(並びに血液ELISAのための血液収集)から1時間以内に血中グルコースレベルを測定した。

0106

第10日に、試験される剤形の最後の用量の投与に先立って、グルコースを再び与え、続いて体重を測定し、ELISAのために血液を収集した。この後、剤形を2倍の用量で(これらの剤形の増強作用を確認するために)、それぞれの動物に投与して、次に薬剤投与の1時間後に、血中グルコースレベルを測定し、血液をELISAのために収集した。

0107

体重測定
各マウスについて体重測定を同時に実施した。エキセナチド(F1〜F5)及びバイエッタの異なる剤形の結果を図3に示す。

0108

血中グルコースレベル測定
血液試料を1日目から10日目まで収集した。15〜19週齢の動物を、血中グルコース測定手順前に、マウスを、清浄の材料の底面にそれらの古いケージからの少量の汚れた敷きわら及び環境を加えたクリーンケージに移すことにより、終夜絶食させた(16時間まで)。ケージ及び敷きわらを変えることにより、マウスがこぼれ食物を利用する可能性を未然に防いだ。水は、全絶食期間を通して自由に利用できるままにした。食物は、最終の血液試料の収集後に元に戻した。1滴の血液を、抑制されていないマウスから尾の先端をカミソリ切開することにより取った。測定は、携帯式の.血中グルコース計(Accu−chek Aviva、Roche Diagnostics社、英国)を使用して行った。バイエッタを用いた予備実験からの血中グルコースレベルを図4に示し、一方、エキセナチド(F1〜F5)及びバイエッタの異なる剤形についての血中グルコースレベルを図5に示す。

0109

血漿インスリンレベル
インスリン決定のために、150mlの血液を尾部静脈から採取した(血液は、3000サイクル/分で10分間及び5分間遠心分離機で処理した)。血液パラメーター及びインスリン測定のために、血漿を2本のヘパリンコートされたチューブに分けて入れた(各々30mL)。血漿インスリンレベルを、マウスインスリン酵素結合免疫吸着剤アッセイキット(Mercodia社、Sylveniusgatan、Sweden)を使用して測定した。異なる日における異なる群の血漿インスリンレベルを図6に示す。

0110

グリコシレートヘモグロビンレベル
EDTAを抗凝血剤として使用して血漿を収集する。試料を、収集の30分以内に1000×gで15分間遠心分離した。血漿を取り出して直ちにアッセイするか又は試料を分割して−20℃又は−80℃で貯蔵する。グリコシレートヘモグロビンレベルをマウスインスリン酵素結合免疫吸着剤アッセイキット(Life Science社、フロリダ州、米国)を使用して測定した。異なる日における異なる群のグリコシレートヘモグロビンレベルを図7に示す。

0111

NP及びそれ続いてMPの物理化学的キャラクタリゼーション
ウシ血清アルブミン(BSA)は周知であり、経口薬剤送達のための豊富タンパク質担体である(ペプチド及びタンパク質は除く)。その主要な利点は、生分解性、生適合性、安全性、非抗原性、望ましい許容性及び入手し易さである。さらに、ペプチド及びタンパク質の一次NPへの組み込みは、コーティングポリマーの大部分が水に可溶であるから難題であり、充分な量の溶解媒体を使用して試験される条件下におけるペプチドのin−vitroの長期放出を誘発するために架橋される必要がある。ナノキャリアとして広く許容されているBSA NPの場合には、問題はさらにより複雑である。グルタルアルデヒドによる架橋、熱による変性又は有機溶媒の使用を含むアルブミンの如何なる変性プロセスも、本研究においても観察されるように、ペプチド又はタンパク質の化学的完全性に明らかに影響する。

0112

そのような欠点を回避するために、図8に示すように、BSAマトリックスを、反応性ヒドロキシル基により架橋することができる多糖デキストランと組み合わせた[**ナノ治療剤のための構築ブロックとしての多糖類]。安定なナノ粒子システムを達成するために、デキストランの反応性ヒドロキシル基を、適当なpH条件でTSMPを使用して架橋した。

0113

pH、分子の架橋タイプ、TSMP量、デキストラン量などの異なるパラメーターを変化させることにより種々の剤形を調製した。グルタルアルデヒドを架橋剤として調製したエキセナチドを含有するBSA NPは、3回の測定に基づいて59.34±0.32nmという平均直径サイズと共に狭いサイズ範囲を反映する0.138という多分散指数PDI)値及び50.3±3.03mVというゼータ電位値を示した。BSAで構成されたNP剤形:デキストランブレンドの性質を表2に示す。表2に書かれたデータに基づいて、デキストラン量が50mg及び150mgと異なる2通りの剤形を以前に言及したように選択した。NPの平均直径は、剤形とは無関係に、190から210nmの範囲にあり、観測された比較的低いPDI値により反映されるように比較的狭い分布範囲を有した。

0114

表2:BSA及びデキストランのブレンドから調製した異なるNP剤形の組成及び性質

0115

BSA/デキストランブレンドで構成された一次NPの可視化は、CryoTEM(図1Α〜B)を使用して実施した。像は、組成の相違に関わらず球形形態のNPを示し、直径サイズはZetasizer測定で観察された範囲と同様な範囲値にある。

0116

種々のNP搭載MPのキャラクタリゼーションを、主としてXHR SEM分析(図9A、B、C)により可視化した。マイクロカプセル化されたNPは、MPのコーティングが1から15μmの範囲のサイズで定性的に平滑であり、MPは、SEM可視化のために適用された真空の結果として収縮していることを示した。

0117

Glut−1、DX−50及びDX−150中における最終のエキセナチド含有率は、それぞれ0.147、0.153及び0.158%w/wであり、剤形に関わらず約40%のカプセル化収率の効率になった。

0118

ラットの薬物動態及び吸収の検討
各治療剤について、3匹のラットからのエキセナチドの血漿レベルを図10に示す。

0119

8時間及び24時間に、エキセナチド血漿濃度は、剤形に関わらずキットの検出限界未満であり、それ故データを示していない。さらに、図10に示された結果から、経口的に投与された、エキセナチド溶液を加えたブランクMP剤形(エキセナチドを含まずにDX−50NPを用いて調製された)、Glut−1剤形及び遊離のエキセナチド溶液は、如何なる検出可能なエキセナチド血漿レベルも誘発しなかったということに注目することができる。現行のエキセナチドは市販のバイエッタ(商標)製品のプロファイルに近い血漿プロファイルを誘発し、それに対して剤形DX−50がDX−150よりも高い薬物動態学的プロファイルを誘発したことが観察されたが、両者は、注射用製剤よりはるかに高い用量で投与されたのである(それぞれ165μg/kg対65μgkg)。

0120

実際、薬物動態学的パラメーターの計算により、用量の規格化によって、最高のAUC値は、バイエッタ注射により誘発され、それにエキセナチドの注射された溶液、DX−50及びDX−150剤形が続くことを明確に認めることができる。さらに、用量に関わらず、全ての剤形は、1,000ng/mlを超えるCmax値を誘発し、Tmax値には差がなかった。より重要なことは、ANOVA分析により、バイエッタ及びエキセナチド溶液とDEX−50経口用懸濁液との間の規格化されたAUC値の間に有意の差がないことが指摘された。46.5%の相対的経口バイオアベイラビリティーを誘発したDEX10〜50についてのみ有意の差があった。

0121

表3:65μg/kgの用量におけるバイエッタ及びエキセナチド溶液の皮下注射(Exe.Sol.)又は165μg/kgの用量におけるDX−50及びDX−150の経口投与の後の平均PKパラメーター値(平均±SE)、N=3

0122

観察
この検討における動物の取り扱い、世話、及び処置に関する全ての手順は、Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care(AAALAC)の指針に従うInstitutional Animal Care and Use Committee(IACUC)により承認された指針に従って実施した。

0123

図及び本文中の全ての値は、n回観察の平均の平均標準誤差(s.e.m.)として表されている。in vivoの検討について、nは、検討された動物の数を表す。組織検査を含む実験では、示された図は、各群中の全動物から収集された組織切片について異なる実験日に実施した、少なくとも3回の実験(組織染色)の代表的なものである。データの組は、変動及び個々の群の平均の1元又は2元配置分析により検査して、次にスチューデントの対応のないt検定で比較した。0.05未満のp値を有意とみなした。

0124

考察
エキセナチドの異なる剤形(Fl〜F5)の治療の効力及び安全性を、OB/OBマウスで評価した。特に、エキセナチド(F1〜F5)及びバイエッタを投与後の体重において有意の差はなかった(図3)。

0125

バイエッタによる予備実験では、図4に示すように、グルコース注射の1時間後に、マウスにバイエッタを投与して;血中グルコースレベルにおける低下を6時間まで示す。この結果により、バイエッタは、糖尿病の治療において標準的目標を代表するという考えが支持される。それに加えて、エキセナチドの異なる剤形(F1〜F4)をバイエッタによる治療と比較した。エキセナチド剤形(F1〜F4)は経口的に投与されたが、それに対してバイエッタ組成物は注射により投与されたことに注目する。結果は、F−l及びF−2の毎日の経口投与は、OB/OBマウスにおける血中グルコースレベルの上昇を抑えることができることを示した(図5)。この根拠により、これらの2種の剤形が最も興味ある結果を示すと推測される。

0126

図6におけるデータは、異なる日における異なる群の血漿インスリンレベルを示す。観察されるように、エキセナチドの異なる剤形(F1〜F5)を用いた治療は、バイエッタによる治療と同様にインスリンレベルを上昇させ得る。

0127

それに加えて、10日間の治療中に、バイエッタ注射は、OB/OBマウスにおいてグリコシル化されたヘモグロビンHbAlc)のレベルを低下させることが見出された(図7〜11)。グリコシル化されたヘモグロビンが浄化される速度は、図5と比較して、エキセナチドF−l及びF−2の2種の剤形だけがグリコシル化されたヘモグロビンレベルの低下に効果を示すことを示す。

0128

このことから、エキセナチドF−lの毎日の経口投与は(及びF−2の経口投与は、ペプチドがグルタルアルデヒドにより架橋されてその活性の一部が失われるので、はるかに低い程度で)、糖尿病の症状の治療に有益な効果を有し得ると結論した。

0129

h−インスリンの二重ナノカプセル化
h−インスリンを含む二重ナノカプセル化された試料を、in vivoにおけるペプチドの長期放出を誘発するための注射用乾燥散剤を得るために調製した。

0130

HASを用いるh−インスリンの一次ナノカプセル化:
200mgのヒト血清アルブミン(HSA)を5mlのDDWに攪拌下で溶解した。それとは別に、20mgのヒト又はウシインスリンを5mlのDDWに溶解して、30秒間ボルテックスで攪拌した。次にh−インスリン溶液をHSA溶液に加えて30分間攪拌し、ペプチド溶解を完了させた。生じた溶液のpHを、0.1MのNaOHで7.4〜8に調節した。次に、20mlのアセトンを速やかに(20秒以内)激しく攪拌しながら(900rpm)注入してh−インスリンを搭載したHSAナノカプセルの形成を誘発した(溶液A)。溶液Aをアセトンの蒸発を避けるためにアルミニウム箔で覆って1時間900rpmで攪拌した。試料(50〜100μ1)を、ゼータ電位及びサイズ測定のために、1時間攪拌後に抜き出した。別に、PLGA100Kの溶液(50:50)を80mlのアセトニトリルに溶解して溶液Aに加えた。

0131

ナノ噴霧乾燥機を使用するPLGAによるその中へのHSA/h−インスリンナノ粒子のナノカプセル化−有機様式
ナノカプセルを閉じたループ様式で作動する、それ故、空気の代わりにN2(g)及びCO2(g)をシステム中に流したNSDB−90で、噴霧乾燥により調製した。全ての実験において、ガス流は約120l/分であった。空気に揮発性蒸気及び湿気を加えて、乾燥及び凝縮するために除湿器に移し、次に円形通路中のシステムに乾燥して戻した。噴霧乾燥は、低温(T;n=30℃〜60℃)で4μmメッシュのサイズの膜を用いて実施した。異なるHSA/h−インスリン/PLGA比の種々の剤形を調製した。乱流で作動する従来の噴霧乾燥機と異なって、NSDB−90は層流で作動し、それ故穏やかな加熱を達成することができて、したがって該システムを熱に敏感な生物薬剤生成物に対して適合性にする。

0132

薬剤搭載一次ナノカプセルの物理化学的キャラクタリゼーション
一次ナノカプセル中のインスリン含有率
HPLCによる適当な分析方法を以下の条件で開発した。
c4カラムを、分離のために及びh−インスリンを分析するために使用した(RESTEKviva内径4.6mm×250mm、5μmの粒子、Bellefonte、ペンシルニア州、米国)。カラム温度は45℃に保った。移動相Aはアセトニトリル(ACN)であり、移動相Bはリン酸二水素カリウム(KH2PO4、20mmol/L)であり、リン酸でpH2.5に調節した。移動相は0.45μmの膜フィルターを通して濾過して、使用前に真空により脱ガスした。

0133

以下の勾配条件を、h−インスリンのために使用した:15分で30%から45%の移動相A、及び3分間で再平衡して30%に戻る移動相A。流速は1.5mL/分であった。注射体積は20μLであった。UVシグナルを215nmで検出した。

0134

表4:種々の剤形中のh−インスリン含有率

表5:種々の剤形の一次ナノカプセルのゼータ電位及び粒子サイズ

0135

流体界面におけるナノカプセルの凍結破砕SEM像
試料を超純水+vortexで懸濁して、次に少なくとも30分間震盪した後凍結した。1.5μmの体積の懸濁液を、間にスペーサーとして200メッシュのTEM格子を有する2枚の小さいアルミニウム平板の間にサンドイッチした。次に試料をHPM010高圧凍結機(Bal−Tec、Liechtenstein)で高圧凍結した。凍結した試料を支持台に載せ、VCT 100 Vacuum Cryo Transfer device(Bal−Tec)を使用してBAF60凍結破砕デバイス(Bal−Tec)に移した。−120℃の温度で破砕した後、試料を−110℃で5分間エッチングして二軸回転シャドーイングにより3nmのPt/Cでコートした。VCT100を使用して試料をUltra 55 SEM(Zeiss、ドイツ)に移し、二次電子インレンズ検出器を1.5kV、−120℃の温度で使用して観察した。そのSEM像を図11Α〜11Cに示す。

0136

真性糖尿病DM)の誘発
0.05Mクエン酸塩緩衝液希釈した(50mg/kg体重ストレプトゾトシン(STZ)の静脈注射により、ラットにDMを誘発した。2週間後に、糖尿病性として選択された動物は、250mg/dLを超える空腹時血糖を示したものであった。血糖は、グルコースオキシダーゼ法(Bergmeyer及びBernt、1974)により臨床用グルコース計(Contour(商標)、BAYER社)を使用して測定した。

0137

次に糖尿病性ラットを使用して、異なる条件(絶食及び非絶食)で、1匹の動物当たり、経口供給によるインスリンナノカプセルを含有する異なった剤形で、5;10国際単位/(175;350μg)の、及び皮下注射の5国際単位(175μg)の低血糖症効果を評価した。

0138

図12〜13に、絶食及び非絶食条件における種々のインスリン搭載ナノ粒子剤形の皮下投与後それぞれの血中グルコースレベル(N=3)を示す。

0139

SEM像からh−インスリンの一次HSAナノカプセルがPLGAのより大きいナノカプセル中にナノカプセル化されていることを見ることができる。これらの一次ナノカプセルは、内部でもポリマーPLAによりコートされており、インスリン放出筋肉注射又は皮下注射で制御できることが示唆される。この仮定は、二重ナノカプセル内の両タイプのインスリンの注射が、絶食条件で血中グルコースにおいて24時間にわたる顕著な長期低下を誘発するので検証されたが、それに対して非絶食条件では、効果がより短い(図12〜13で見られるように)。上記新規な技法は、インスリンの薬理学的活性に少なくとも著しく影響することはないと結論することができる。

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