図面 (/)

この項目の情報は公開日時点(2017年1月12日)のものです。
また、この項目は機械的に抽出しているため、正しく解析できていない場合があります

図面 (10)

課題・解決手段

本発明は、特定の性質を有するイヌ化抗体を開示する。本発明はまた、イヌPD−1に高い結合親和性を有する、イヌPD−1に対するイヌ化マウス抗体も開示する。本発明はさらに、イヌの癌の処置における本発明のイヌ化抗体の使用を開示する。

概要

背景

イヌ抗体免疫グロブリンGまたはIgGとも称される)は、約150Kdの大きな四量体タンパク質である。各々のIgGタンパク質は、それぞれ約25Kdの2本の同一の軽鎖およびそれぞれ約50Kdの2本の同一の重鎖から成る。イヌIgGの4つの公知のIgG重鎖サブクラスが存在し、それらはIgGA、IgGB、IgGCおよびIgGDと称される。2種類の軽鎖:κ鎖およびλ鎖が存在する。κ軽鎖およびλ軽鎖の各々は、1つの可変ドメイン(VL)および1つの定常ドメイン(CL)から成る。2本の重鎖の各々は、1つの可変ドメイン(VH)ならびにCH−1、CH−2およびCH−3と称される3つの定常ドメインから成る。CH−1ドメインは、「ヒンジ」または選択的に「ヒンジ領域」と称されるアミノ酸配列によってCH−2ドメインに連結されている。ヒトでは、IgGは、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4と称される4つのサブクラスの1つに存在する。IgGのサブクラスは主としてヒンジ領域の配列によって決定され、ヒンジ領域の配列はIgGの4つのサブクラスの間で異なる。2本の重鎖はジスルフィド結合によって互いに連結され、各々の重鎖は同じくジスルフィド結合を介して軽鎖の1つに連結されている。

酵素パパインでのIgG抗体消化はヒンジ領域で抗体分子を切断し、3つのフラグメントの形成をもたらす。これらのフラグメントのうち2つは同一であり、各々は、重鎖のVHおよびCH1ドメインと結合された軽鎖から成る。これらのフラグメントは「Fab」フラグメントと呼ばれ、抗体の抗原結合部位を含有する。パパインでの消化から生じる3番目のフラグメントは「Fc」と呼ばれ、ジスルフィド結合によって結び付けられた2本の重鎖の残りの部分を含有する。したがってFcは、2本の重鎖の各々のCH2およびCH3ドメインから成る二量体を含有する。Fabは、抗体がその同種エピトープに結合することを可能にし、一方Fcは、抗体が免疫エフェクター機能、例えば抗体依存性細胞傷害ADCC)、抗体依存性食作用ADCP)および補体依存性細胞傷害(CDC)を媒介することを可能にする。

IgG抗体は、そのFc部分がFcγ受容体として知られるタンパク質のファミリーに結合することを通してADCCおよびADCPなどのエフェクター機能を媒介することは当分野で周知であるが、CDCは、補体の第一成分、C1qへのFcの結合を通して媒介される。異なるIgGサブクラスはこれらのエフェクター機能を媒介する能力が異なることも当分野で周知である。例えば、ヒトIgG1は強力なADCCおよびCDCを示し、IgG4は弱いADCCおよびCDCを示すかまたはADCCおよびCDCを全く示さない。加えて、いずれのIgGサブクラスがエフェクター機能を示すかまたは欠如しているかを同定するための方法は当分野で周知である。

治療目的でのモノクローナル抗体の使用に基づくアプローチは、所望の治療応答を達成するための目的にかなった抗体または抗体フラグメントの設計を必要とする。例えば、癌のための一部の治療アプローチは、治療用抗体が増強されたエフェクター機能を有することを必要とし、また別のアプローチは、エフェクター機能が有意に低いまたはエフェクター機能が完全に除去されていることを必要とする。エフェクター機能の増強または除去は、Fcγ受容体および補体の第一成分への結合を増強または低減するために抗体のFc部分に1またはそれ以上のアミノ酸突然変異置換)を導入することを通して達成され得る。抗体のエフェクター機能を改変するために抗体分子に導入され得るアミノ酸置換を述べた、先行技術の数多くの報告がある。例えばShieldset al.,[J.of Biol.Chem.,276(9):6591−6604(2001)]は、アスパラギンアラニンへの(N297A)置換を開示しており、これは非グリコシル化抗体をもたらし、いくつかのFcγ受容体への抗体結合を有意に低減させた。加えて、Shields et al.,は、アスパラギン酸のアラニンへの(D265A)置換もFcγ受容体への抗体の結合を有意に低減させることを開示した。N297AおよびD265A置換の各々はCDCも有意に低下させることが示された。抗体におけるエフェクター機能を低減または除去する潜在的な置換を同定する他の同様の報告が存在する[例えばSazinsky et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.,105:20167−20172(2008)、Alegre et al.,Transplantation,57:1537−1543(1994)、Hutchins et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.92:11980−11984(1994)、McEarchem et al.,Blood,109:1185−1192(2007)]。

主として活性化TおよびB細胞上で発現される免疫阻害性受容体である、プログラム死受容体1(PD−1)とも称されるプログラム細胞死受容体1は、CD28およびCTLA−4に関連する免疫グロブリンスーパーファミリー成員である。PD−1および同様のファミリー成員は、そのリガンドに結合する細胞外Ig可変型(V型)ドメインおよびシグナル伝達分子に結合する細胞質尾部を含有するI型膜貫通糖タンパク質である。PD−1の細胞質尾部は2つのチロシンベースシグナル伝達モチーフ、ITIM免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ)およびITSM(免疫受容体チロシンベーススイッチモチーフ)を含有する。

PD−1は、プログラム死リガンド1(PD−L1)とも称されるプログラム細胞死リガンド1および/またはプログラム死リガンド2(PD−L2)とも称されるプログラム細胞死リガンド2に結合した場合、T細胞応答減弱させる。これらのリガンドのいずれかのPD−1への結合は抗原受容体シグナル伝達を負に調節する。PD−L1のPD−1への結合をブロックすることは、免疫系による腫瘍細胞クリアランスを助けつつ、腫瘍特異的CD8+T細胞免疫を増強する。マウスPD−1の三次元構造ならびにヒトPD−L1とマウスPD−1の共結晶構造が報告されている[Zhang et al.,Immunity 20:337−347(2004);Lin et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105:3011−3016(2008)]。

PD−L1およびPD−L2は、公知のシグナル伝達モチーフを有さない短い細胞質領域と共に細胞外領域内にIgV様ドメインおよびIgC様ドメインの両方を含むI型膜貫通リガンドである。PD−L1およびPD−L2はどちらも、構成的に発現されるかまたは非造血組織ならびに種々の腫瘍型を含む様々な細胞型において誘導され得る。PD−L1はB細胞、T細胞骨髄性細胞および樹状細胞(DC)上で発現されるだけでなく、末梢細胞、例えば微小血管内皮細胞および非リンパ系器官、例えば心臓またはでも発現される。これに対し、PD−L2はマクロファージおよびDC上でのみ認められる。PD−1リガンドの発現パターンは、PD−1が末梢性免疫寛容を維持するうえで役割を果たし、さらに末梢における自己反応性T細胞およびB細胞応答を調節するのに役立ち得ることを示唆する。

いずれの場合も、PD−1が、おそらく免疫回避を媒介することにより、少なくとも特定のヒト癌において非常に重要な役割を果たすことは今や極めて明らかである。したがって、PD−L1は多くのマウスおよびヒト腫瘍で発現されることが示されており、PD−L1陰性腫瘍細胞株の大部分ではIFN−γによって誘導され得る[Iwai et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99:12293−12297(2002);Strome et al.,Cancer Res.,63:6501−6505(2003)]。さらに、リンパ球浸潤する腫瘍でのPD−1の発現および/または腫瘍細胞でのPD−L1の発現は、多数の原発性ヒト腫瘍生検において同定されている。そのような腫瘍組織としては、肺、肝臓卵巣子宮頸、皮膚、結腸神経膠腫膀胱乳房腎臓食道口腔扁平上皮細胞尿路上皮細胞および膵臓の癌ならびに頭頸部の腫瘍が含まれる[Brown et al.,J.Immunol.170:1257−1266(2003);Dong et al.,Nat.Med.8:793−800(2002);Wintterle et al.,Cancer Res.63:7462−7467(2003);Strome et al.,Cancer Res.,63:6501−6505(2003);Thompson et al.,Cancer Res.66:3381−5(2006);Thompson et al.,Clin.Cancer Res.13:1757−1761(2007);Nomi et al.,Clin.Cancer Res.13:2151−2157.(2007)]。より顕著には、腫瘍細胞でのPDリガンドの発現は複数の腫瘍型にわたってヒト癌患者の予後不良と相関している[Okazaki and Honjo,Int.Immunol.19:813−824(2007)において総説されている]。

さらに、Nomi et al.[Clin.Cancer Res.13:2151−2157.(2007)]は、PD−1またはPD−L1に対する抗体を投与することを介して、侵襲性膵癌のマウスモデルにおいてPD−L1のPD−1への結合をブロックすることの治療効果を明らかにした。これらの抗体は、腫瘍反応性CD8+T細胞の腫瘍への浸潤を有効に促進し、IFN−γ、グランザイムBおよびパーフォリンを含む抗腫瘍エフェクター上方調節を生じさせた。同様に、PD−L1およびPD−1の結合をブロックする抗体の使用は、マウス扁平上皮癌のモデルにおいて腫瘍増殖を有意に阻害した[Tsushima et al.,Oral Oncol.42:268−274(2006)]。

他の研究において、PD−L1でのマウス肥満細胞腫株のトランスフェクションは、腫瘍特異的CTLクローン共培養した場合、腫瘍細胞の溶解の減少をもたらした。抗PD−L1モノクローナル抗体を添加した場合、溶解が回復した[Iwai et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99:12293−12297(2002)]。インビボでは、PD−1/PD−L1相互作用をブロックすることは、マウス腫瘍モデルにおいて養子T細胞移入療法の効果を増大させることが示された[Strome et al.,Cancer Res.63:6501−6505(2003)]。癌処置におけるPD−1の役割についてのさらなる証拠は、PD−1ノックアウトマウスで実施された実験によってもたらされ、この実験では、PD−L1を発現する骨髄腫細胞野生型動物においてのみ増殖し(腫瘍増殖および関連する動物死を生じさせる)、PD−1欠損マウスでは増殖しなかった[Iwai Y.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99:12293−12297(2002)]。ごく最近、PD−1に対する抗体(ヒトPD−1に対するヒト化マウスモノクローナル抗体を含む)が、ヒトでの癌療法において少なくとも初期成功を示した[例えば米国特許第8,354,509号、米国特許第8,008,449号および米国特許第7,595,048号参照]。

抗PD−1抗体はまた、慢性ウイルス感染においても有用であり得る。急性ウイルス感染後に生成された記憶CD8+T細胞は高度に機能性であり、防御免疫の重要な成分を構成する。これに対し、慢性感染はしばしばウイルス特異的T細胞応答の様々な程度の機能障害疲弊)を特徴とし、この欠陥が、宿主が残存する病原体を除去できないことの主たる理由である。機能性エフェクターT細胞は感染の初期段階で最初に生成されるが、慢性感染の過程でそれらは徐々に機能を喪失する。Barber et al.[Nature 439:682−687(2006)]は、LCMVの研究室株に感染させたマウスが、血液および他の組織中で高レベルウイルスを生じさせる慢性感染を発症することを示した。これらのマウスは、最初は堅固なT細胞応答を発現したが、T細胞の疲弊後最終的には感染に屈した。Barber et al.は、慢性感染マウスにおけるエフェクターT細胞の数および機能の低下を、PD−1とPD−L1との間の相互作用をブロックする抗体を注射することによって逆転させ得ることを見出した。

明細書中のいかなる参考文献の引用も、そのような参考文献が本出願の「先行技術」として使用可能であることの承認解釈されるべきではない。

概要

本発明は、特定の性質を有するイヌ化抗体を開示する。本発明はまた、イヌPD−1に高い結合親和性を有する、イヌPD−1に対するイヌ化マウス抗体も開示する。本発明はさらに、イヌの癌の処置における本発明のイヌ化抗体の使用を開示する。

目的

本発明は、抗体のイヌ結晶性フラグメント領域(cFc領域)が1またはそれ以上のエフェクター機能を増大させる、減少させるまたは除去するように遺伝的に修飾されている、抗体のcFc領域を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

この技術が所属する分野

(分野番号表示ON)※整理標準化データをもとに当社作成

ライセンス契約や譲渡などの可能性がある特許掲載中! 開放特許随時追加・更新中 詳しくはこちら

請求項1

列番号:130および配列番号:132から成る群より選択されるアミノ酸配列を含有するイヌ結晶性フラグメント領域(cFc領域)であって、1から7個のアミノ酸残基がP4、D31、N63、G64、T65、A93およびP95から成る群より選択される指示位置置換されている、イヌ結晶性フラグメント領域(cFc領域)。

請求項2

置換されている前記1から7個のアミノ酸残基の置換が、P4A、D31A、N63A、G64A、T65A、A93GおよびP95Aから成る群より選択される、請求項1に記載のFc領域。

請求項3

請求項1または2に記載のcFc領域を含有するイヌ化抗体

請求項4

前記イヌ化抗体がイヌプログラム死受容体1(イヌPD−1)に特異的に結合する、請求項3に記載のイヌ化抗体またはその抗原結合フラグメント

請求項5

前記cFc領域が、配列番号:109、配列番号:110、配列番号:111および配列番号:112から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むヒンジ領域をさらに含有する、請求項4に記載のイヌ化抗体またはその抗原結合フラグメント。

請求項6

配列番号:27、配列番号:28、配列番号:29および配列番号:30から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域1(VHCDR1);配列番号:31、配列番号:32、配列番号:33、配列番号:34および配列番号:35から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域2(VHCDR2);ならびに配列番号:36、配列番号:37、配列番号:38および配列番号:146から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域3(VHCDR3)をさらに含有する、請求項4または5に記載のイヌ化抗体またはその抗原結合フラグメント。

請求項7

配列番号:13、配列番号:14および配列番号:15から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域1(VLCDR1);配列番号:16、配列番号:17、配列番号:18、配列番号:19、配列番号:20および配列番号:21から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域2(VLCDR2);ならびに配列番号:22、配列番号:23、配列番号:24、配列番号:25および配列番号:26から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域3(VLCDR3)をさらに含有する、請求項4、5または6に記載のイヌ化抗体またはその抗原結合フラグメント。

請求項8

配列番号:40、配列番号:42、配列番号:44、配列番号:46、配列番号:48、配列番号:50、配列番号:52、配列番号:54、配列番号:56、配列番号:58、配列番号:60、配列番号:62、配列番号:64および配列番号:66から成る群より選択されるアミノ酸配列を含有する、請求項3に記載のイヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記イヌ化抗体が、cFc領域の指示位置で配列番号:130または配列番号:132のP4、D31、N63、G64、T65、A93およびP95から成る群より選択される7個のアミノ酸残基の少なくとも1個が異なるアミノ酸残基によって置換されている配列番号:130または配列番号:132のアミノ酸配列を含むcFc領域を含有する、請求項3に記載のイヌ化抗体またはその抗原結合フラグメント。

請求項9

配列番号:72、配列番号:78、配列番号:84、配列番号:90、配列番号:96、配列番号:102および配列番号:108から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むイヌ軽鎖をさらに含有する、請求項8に記載のイヌ化抗体またはその抗原結合フラグメント。

請求項10

ヒンジ領域を有するイヌ結晶性フラグメント領域(cFc領域)であって、前記cFc領域およびヒンジ領域が、配列番号:6、配列番号:8、配列番号:10および配列番号:12から成る群より選択されるアミノ酸配列を含有する、イヌ結晶性フラグメント領域(cFc領域)。

請求項11

請求項10に記載のcFc領域およびヒンジ領域を含有するイヌ化抗体。

請求項12

前記イヌ化抗体がイヌプログラム死受容体1(イヌPD−1)に特異的に結合する、請求項11に記載のイヌ化抗体またはその抗原結合フラグメント。

請求項13

配列番号:68、配列番号:70、配列番号:74、配列番号:76、配列番号:80、配列番号:82、配列番号:86、配列番号:88、配列番号:92、配列番号:94、配列番号:98、配列番号:100、配列番号:104および配列番号:106から成る群より選択されるアミノ酸配列を含有する、請求項12に記載の単離されたイヌ化抗体またはその抗原結合フラグメント。

請求項14

配列番号:72、配列番号:78、配列番号:84、配列番号:90、配列番号:96、配列番号:102および配列番号:108から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むイヌ軽鎖をさらに含有する、請求項13に記載のイヌ化抗体またはその抗原結合フラグメント。

請求項15

以下の特性:(i)1×10−5Mから1×10−12Mの解離定数(Kd)でイヌPD−1に結合する;(ii)1×102M−1秒−1から1×107M−1秒−1のオン速度(kon)でイヌPD−1に結合する;(iii)1×10−3秒−1から1×10−8秒−1のオフ速度(koff)でイヌPD−1に結合する;(iv)腫瘍または病原体に対する抗原特異的記憶応答刺激する;(v)インビボ抗体応答を刺激する;および(vi)動物被験体における免疫応答を刺激するのうちの1、2、3、4、5または全部を示す、請求項4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、または14に記載のイヌ化抗体またはその抗原結合フラグメント。

請求項16

イヌプログラム死受容体1(イヌPD−1)に特異的に結合する単離された哺乳動物抗体およびその抗原結合フラグメントであって、イヌPD−1に結合する場合、前記抗体が配列番号:144内の少なくとも1個のアミノ酸残基に結合し、前記抗体およびその抗原結合フラグメントがイヌPD−1に結合し、およびイヌPD−1のイヌプログラム死リガンド1(PD−L1)への結合をブロックする、単離されたイヌ化抗体およびその抗原結合フラグメント。

請求項17

請求項4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14または15に記載のイヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントであって、イヌPD−1に結合する場合、前記抗体が配列番号:144内の少なくとも1個のアミノ酸残基に結合し、前記抗体およびその抗原結合フラグメントが、イヌPD−1に結合し、およびイヌPD−1のイヌプログラム死リガンド1(PD−L1)への結合をブロックする、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメント。

請求項18

前記抗体が、配列番号:138、配列番号:139、配列番号:140、配列番号:141、配列番号:142、配列番号:143および配列番号:145から成る群より選択される1またはそれ以上のアミノ酸配列内の少なくとも1個のアミノ酸残基に結合する、請求項16または17に記載のイヌ化抗体またはその抗原結合フラグメント。

請求項19

前記抗体が、配列番号:145内の少なくとも1個のアミノ酸残基に結合する、請求項16、17または18に記載のイヌ化抗体またはその抗原結合フラグメント。

請求項20

前記抗体が、配列番号:114のR62、R69、R72、R75およびR90から成る群より選択される1個またはそれ以上のアミノ酸残基に結合する、請求項16、17、18または19に記載のイヌ化抗体またはその抗原結合フラグメント。

請求項21

請求項4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20に記載の1またはそれ以上のイヌ化抗体と、イヌPD−1との結合に関して交差競合するモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記抗体およびその抗原結合フラグメントが、イヌPD−1に結合し、およびイヌPD−1のPD−L1への結合をブロックする、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメント。

請求項22

請求項4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20または21に記載のイヌ化抗体の重鎖または軽鎖をコードする核酸

請求項23

配列番号:13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38および146から成る群より選択される1またはそれ以上のアミノ酸配列をコードする、請求項22に記載の核酸。

請求項24

請求項23または24に記載の単離された核酸を含有する発現ベクター

請求項25

請求項24に記載の1またはそれ以上の発現ベクターを含有する宿主細胞

請求項26

請求項4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20または21に記載の抗体または抗原結合フラグメントおよび医薬的に許容される担体または希釈剤を含有する医薬組成物

請求項27

免疫細胞活性を増大させる方法であって、それを必要とする被験体に、請求項26に記載の医薬組成物の治療有効量を投与することを含む方法。

請求項28

前記方法が、a.癌を処置する;b.感染もしくは感染性疾患を処置する;またはc.ワクチンアジュバントとして働くために使用される、請求項27に記載の方法。

技術分野

0001

関連出願の相互参照
本出願は、2014年7月30日出願の米国特許仮出願第62/030,812号、2013年12月20日出願の米国特許仮出願第61/918,847号および2014年12月20日出願の米国特許仮出願第61/918,946号の優先権を主張するものであり、これらすべての内容が全体として参照により本明細書に組み込まれる。

0002

本発明は、特定の性質を有するイヌ化抗体に関する。本発明はまた、特定の配列を有し、およびイヌPD−1に高い結合親和性を有する、イヌPD−1に対するイヌ化抗体に関する。本発明はさらに、癌の処置を含む、イヌの処置における本発明の抗体の使用に関する。

背景技術

0003

イヌ抗体免疫グロブリンGまたはIgGとも称される)は、約150Kdの大きな四量体タンパク質である。各々のIgGタンパク質は、それぞれ約25Kdの2本の同一の軽鎖およびそれぞれ約50Kdの2本の同一の重鎖から成る。イヌIgGの4つの公知のIgG重鎖サブクラスが存在し、それらはIgGA、IgGB、IgGCおよびIgGDと称される。2種類の軽鎖:κ鎖およびλ鎖が存在する。κ軽鎖およびλ軽鎖の各々は、1つの可変ドメイン(VL)および1つの定常ドメイン(CL)から成る。2本の重鎖の各々は、1つの可変ドメイン(VH)ならびにCH−1、CH−2およびCH−3と称される3つの定常ドメインから成る。CH−1ドメインは、「ヒンジ」または選択的に「ヒンジ領域」と称されるアミノ酸配列によってCH−2ドメインに連結されている。ヒトでは、IgGは、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4と称される4つのサブクラスの1つに存在する。IgGのサブクラスは主としてヒンジ領域の配列によって決定され、ヒンジ領域の配列はIgGの4つのサブクラスの間で異なる。2本の重鎖はジスルフィド結合によって互いに連結され、各々の重鎖は同じくジスルフィド結合を介して軽鎖の1つに連結されている。

0004

酵素パパインでのIgG抗体消化はヒンジ領域で抗体分子を切断し、3つのフラグメントの形成をもたらす。これらのフラグメントのうち2つは同一であり、各々は、重鎖のVHおよびCH1ドメインと結合された軽鎖から成る。これらのフラグメントは「Fab」フラグメントと呼ばれ、抗体の抗原結合部位を含有する。パパインでの消化から生じる3番目のフラグメントは「Fc」と呼ばれ、ジスルフィド結合によって結び付けられた2本の重鎖の残りの部分を含有する。したがってFcは、2本の重鎖の各々のCH2およびCH3ドメインから成る二量体を含有する。Fabは、抗体がその同種エピトープに結合することを可能にし、一方Fcは、抗体が免疫エフェクター機能、例えば抗体依存性細胞傷害ADCC)、抗体依存性食作用ADCP)および補体依存性細胞傷害(CDC)を媒介することを可能にする。

0005

IgG抗体は、そのFc部分がFcγ受容体として知られるタンパク質のファミリーに結合することを通してADCCおよびADCPなどのエフェクター機能を媒介することは当分野で周知であるが、CDCは、補体の第一成分、C1qへのFcの結合を通して媒介される。異なるIgGサブクラスはこれらのエフェクター機能を媒介する能力が異なることも当分野で周知である。例えば、ヒトIgG1は強力なADCCおよびCDCを示し、IgG4は弱いADCCおよびCDCを示すかまたはADCCおよびCDCを全く示さない。加えて、いずれのIgGサブクラスがエフェクター機能を示すかまたは欠如しているかを同定するための方法は当分野で周知である。

0006

治療目的でのモノクローナル抗体の使用に基づくアプローチは、所望の治療応答を達成するための目的にかなった抗体または抗体フラグメントの設計を必要とする。例えば、癌のための一部の治療アプローチは、治療用抗体が増強されたエフェクター機能を有することを必要とし、また別のアプローチは、エフェクター機能が有意に低いまたはエフェクター機能が完全に除去されていることを必要とする。エフェクター機能の増強または除去は、Fcγ受容体および補体の第一成分への結合を増強または低減するために抗体のFc部分に1またはそれ以上のアミノ酸突然変異置換)を導入することを通して達成され得る。抗体のエフェクター機能を改変するために抗体分子に導入され得るアミノ酸置換を述べた、先行技術の数多くの報告がある。例えばShieldset al.,[J.of Biol.Chem.,276(9):6591−6604(2001)]は、アスパラギンアラニンへの(N297A)置換を開示しており、これは非グリコシル化抗体をもたらし、いくつかのFcγ受容体への抗体結合を有意に低減させた。加えて、Shields et al.,は、アスパラギン酸のアラニンへの(D265A)置換もFcγ受容体への抗体の結合を有意に低減させることを開示した。N297AおよびD265A置換の各々はCDCも有意に低下させることが示された。抗体におけるエフェクター機能を低減または除去する潜在的な置換を同定する他の同様の報告が存在する[例えばSazinsky et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.,105:20167−20172(2008)、Alegre et al.,Transplantation,57:1537−1543(1994)、Hutchins et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.92:11980−11984(1994)、McEarchem et al.,Blood,109:1185−1192(2007)]。

0007

主として活性化TおよびB細胞上で発現される免疫阻害性受容体である、プログラム死受容体1(PD−1)とも称されるプログラム細胞死受容体1は、CD28およびCTLA−4に関連する免疫グロブリンスーパーファミリー成員である。PD−1および同様のファミリー成員は、そのリガンドに結合する細胞外Ig可変型(V型)ドメインおよびシグナル伝達分子に結合する細胞質尾部を含有するI型膜貫通糖タンパク質である。PD−1の細胞質尾部は2つのチロシンベースシグナル伝達モチーフ、ITIM免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ)およびITSM(免疫受容体チロシンベーススイッチモチーフ)を含有する。

0008

PD−1は、プログラム死リガンド1(PD−L1)とも称されるプログラム細胞死リガンド1および/またはプログラム死リガンド2(PD−L2)とも称されるプログラム細胞死リガンド2に結合した場合、T細胞応答減弱させる。これらのリガンドのいずれかのPD−1への結合は抗原受容体シグナル伝達を負に調節する。PD−L1のPD−1への結合をブロックすることは、免疫系による腫瘍細胞クリアランスを助けつつ、腫瘍特異的CD8+T細胞免疫を増強する。マウスPD−1の三次元構造ならびにヒトPD−L1とマウスPD−1の共結晶構造が報告されている[Zhang et al.,Immunity 20:337−347(2004);Lin et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105:3011−3016(2008)]。

0009

PD−L1およびPD−L2は、公知のシグナル伝達モチーフを有さない短い細胞質領域と共に細胞外領域内にIgV様ドメインおよびIgC様ドメインの両方を含むI型膜貫通リガンドである。PD−L1およびPD−L2はどちらも、構成的に発現されるかまたは非造血組織ならびに種々の腫瘍型を含む様々な細胞型において誘導され得る。PD−L1はB細胞、T細胞骨髄性細胞および樹状細胞(DC)上で発現されるだけでなく、末梢細胞、例えば微小血管内皮細胞および非リンパ系器官、例えば心臓またはでも発現される。これに対し、PD−L2はマクロファージおよびDC上でのみ認められる。PD−1リガンドの発現パターンは、PD−1が末梢性免疫寛容を維持するうえで役割を果たし、さらに末梢における自己反応性T細胞およびB細胞応答を調節するのに役立ち得ることを示唆する。

0010

いずれの場合も、PD−1が、おそらく免疫回避を媒介することにより、少なくとも特定のヒト癌において非常に重要な役割を果たすことは今や極めて明らかである。したがって、PD−L1は多くのマウスおよびヒト腫瘍で発現されることが示されており、PD−L1陰性腫瘍細胞株の大部分ではIFN−γによって誘導され得る[Iwai et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99:12293−12297(2002);Strome et al.,Cancer Res.,63:6501−6505(2003)]。さらに、リンパ球浸潤する腫瘍でのPD−1の発現および/または腫瘍細胞でのPD−L1の発現は、多数の原発性ヒト腫瘍生検において同定されている。そのような腫瘍組織としては、肺、肝臓卵巣子宮頸、皮膚、結腸神経膠腫膀胱乳房腎臓食道口腔扁平上皮細胞尿路上皮細胞および膵臓の癌ならびに頭頸部の腫瘍が含まれる[Brown et al.,J.Immunol.170:1257−1266(2003);Dong et al.,Nat.Med.8:793−800(2002);Wintterle et al.,Cancer Res.63:7462−7467(2003);Strome et al.,Cancer Res.,63:6501−6505(2003);Thompson et al.,Cancer Res.66:3381−5(2006);Thompson et al.,Clin.Cancer Res.13:1757−1761(2007);Nomi et al.,Clin.Cancer Res.13:2151−2157.(2007)]。より顕著には、腫瘍細胞でのPDリガンドの発現は複数の腫瘍型にわたってヒト癌患者の予後不良と相関している[Okazaki and Honjo,Int.Immunol.19:813−824(2007)において総説されている]。

0011

さらに、Nomi et al.[Clin.Cancer Res.13:2151−2157.(2007)]は、PD−1またはPD−L1に対する抗体を投与することを介して、侵襲性膵癌のマウスモデルにおいてPD−L1のPD−1への結合をブロックすることの治療効果を明らかにした。これらの抗体は、腫瘍反応性CD8+T細胞の腫瘍への浸潤を有効に促進し、IFN−γ、グランザイムBおよびパーフォリンを含む抗腫瘍エフェクター上方調節を生じさせた。同様に、PD−L1およびPD−1の結合をブロックする抗体の使用は、マウス扁平上皮癌のモデルにおいて腫瘍増殖を有意に阻害した[Tsushima et al.,Oral Oncol.42:268−274(2006)]。

0012

他の研究において、PD−L1でのマウス肥満細胞腫株のトランスフェクションは、腫瘍特異的CTLクローン共培養した場合、腫瘍細胞の溶解の減少をもたらした。抗PD−L1モノクローナル抗体を添加した場合、溶解が回復した[Iwai et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99:12293−12297(2002)]。インビボでは、PD−1/PD−L1相互作用をブロックすることは、マウス腫瘍モデルにおいて養子T細胞移入療法の効果を増大させることが示された[Strome et al.,Cancer Res.63:6501−6505(2003)]。癌処置におけるPD−1の役割についてのさらなる証拠は、PD−1ノックアウトマウスで実施された実験によってもたらされ、この実験では、PD−L1を発現する骨髄腫細胞野生型動物においてのみ増殖し(腫瘍増殖および関連する動物死を生じさせる)、PD−1欠損マウスでは増殖しなかった[Iwai Y.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99:12293−12297(2002)]。ごく最近、PD−1に対する抗体(ヒトPD−1に対するヒト化マウスモノクローナル抗体を含む)が、ヒトでの癌療法において少なくとも初期成功を示した[例えば米国特許第8,354,509号、米国特許第8,008,449号および米国特許第7,595,048号参照]。

0013

抗PD−1抗体はまた、慢性ウイルス感染においても有用であり得る。急性ウイルス感染後に生成された記憶CD8+T細胞は高度に機能性であり、防御免疫の重要な成分を構成する。これに対し、慢性感染はしばしばウイルス特異的T細胞応答の様々な程度の機能障害疲弊)を特徴とし、この欠陥が、宿主が残存する病原体を除去できないことの主たる理由である。機能性エフェクターT細胞は感染の初期段階で最初に生成されるが、慢性感染の過程でそれらは徐々に機能を喪失する。Barber et al.[Nature 439:682−687(2006)]は、LCMVの研究室株に感染させたマウスが、血液および他の組織中で高レベルウイルスを生じさせる慢性感染を発症することを示した。これらのマウスは、最初は堅固なT細胞応答を発現したが、T細胞の疲弊後最終的には感染に屈した。Barber et al.は、慢性感染マウスにおけるエフェクターT細胞の数および機能の低下を、PD−1とPD−L1との間の相互作用をブロックする抗体を注射することによって逆転させ得ることを見出した。

0014

明細書中のいかなる参考文献の引用も、そのような参考文献が本出願の「先行技術」として使用可能であることの承認解釈されるべきではない。

0015

米国特許第8,354,509号明細書
米国特許第8,008,449号明細書
米国特許第7,595,048号明細書

先行技術

0016

Shieldset al.,[J.of Biol.Chem.,276(9):6591−6604(2001)
Sazinsky et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.,105:20167−20172(2008)
Alegre et al.,Transplantation,57:1537−1543(1994)
Hutchins et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.92:11980−11984(1994)
McEarchem et al.,Blood,109:1185−1192(2007)
Zhang et al.,Immunity 20:337−347(2004)
Lin et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105:3011−3016(2008)
Iwai et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99:12293−12297(2002)
Strome et al.,Cancer Res.,63:6501−6505(2003)
Brown et al.,J.Immunol.170:1257−1266(2003)
Dong et al.,Nat.Med.8:793−800(2002)
Wintterle et al.,Cancer Res.63:7462−7467(2003)
Thompson et al.,Cancer Res.66:3381−5(2006)
Thompson et al.,Clin.Cancer Res.13:1757−1761(2007)
Nomi et al.,Clin.Cancer Res.13:2151−2157.(2007)
Okazaki and Honjo,Int.Immunol.19:813−824(2007)
Tsushima et al.,Oral Oncol.42:268−274(2006)
Barber et al.,Nature 439:682−687(2006)

課題を解決するための手段

0017

本発明は、抗体のイヌ結晶性フラグメント領域(cFc領域)が1またはそれ以上のエフェクター機能を増大させる、減少させるまたは除去するように遺伝的に修飾されている、抗体のcFc領域を提供する。本発明の1つの態様では、遺伝的に修飾されたcFcは1またはそれ以上のエフェクター機能を減少させるまたは除去する。本発明の別の態様では、遺伝的に修飾されたcFcは1またはそれ以上のエフェクター機能を増大させる。

0018

ある実施形態では、遺伝的に修飾されたcFc領域は、遺伝的に修飾されたイヌIgGB Fc領域である。別のそのような実施形態では、遺伝的に修飾されたcFc領域は、遺伝的に修飾されたイヌIgGC Fc領域である。特定の実施形態では、エフェクター機能は抗体依存性細胞傷害(ADCC)であり、これが増大、減少または除去されている。別の実施形態では、エフェクター機能は補体依存性細胞傷害(CDC)であり、これが増大、減少または除去されている。さらに別の実施形態では、cFc領域は、ADCCおよびCDCの両方を増大させる、減少させるまたは除去するように遺伝的に修飾されている。

0019

本発明はさらに、遺伝的に修飾されたcFc領域を含有するイヌフレームおよび/または完全長重鎖を提供する。したがって、本発明は、完全長重鎖が本発明の遺伝的に修飾されたcFc領域を含有する、抗体の完全長重鎖を提供する。そのような完全長重鎖はまた、対応するイヌ軽鎖(κまたはλ鎖)と結合して完全な抗体を形成することもできる。この種の特定の実施形態では、生じる抗体は特定のイヌ抗原に特異的に結合する。あるそのような実施形態では、イヌ抗原はイヌPD−1である。さらに他の実施形態では、イヌ抗原はイヌPD−L1である。さらに他の実施形態では、イヌ抗原はIL−4受容体のα鎖である。さらに他の実施形態では、イヌ抗原は、イヌ胸腺間質性リンパ球新生因子タンパク質(cTSLP)である[例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第7,718,772号参照]。

0020

ある実施形態では、遺伝的に修飾されたcFc領域は、以下のアミノ酸残基:P4、D31、N63、G64、T65、A93またはP95の1個から7個が指示されている位置で別のアミノ酸残基によって置き換えられている配列番号:130(または配列番号:132)のアミノ酸配列を含有する。P4、D31、N63、G64、T65、A93および/またはP95を置換するアミノ酸は、以下の表1に列挙する、その他の19個の標準的な天然に存在するアミノ酸の1つから個別に選択される。本発明はさらに、そのような遺伝的に修飾されたcFc領域のアミノ酸配列と90%、95%、98%または99%同一であるアミノ酸配列を含有し、ならびに以下のアミノ酸残基、すなわちP4、D31、N63、G64、T65、A93またはP95の1個またはそれ以上が置換された配列番号:130(または配列番号:132)のアミノ酸配列を含有する遺伝的に修飾されたcFc領域としてADCCおよび/またはCDCの少なくとも50%、75%、90%、95%またはそれ以上の増大、減少または除去を保持する、遺伝的に修飾されたcFc領域の変異体を提供する。

0021

他の実施形態では、以下のアミノ酸残基:P4、D31、N63、G64、T65、A93またはP95の2個から5個が指示されている位置で別のアミノ酸残基によって置き換えられている。この種の特定の実施形態では、遺伝的に修飾されたcFc領域は、以下の置換:P4A、D31A、N63A、A93GおよびP95Aを有する配列番号:130または配列番号:132のアミノ酸配列を含有する。関連実施形態では、遺伝的に修飾されたcFc領域は、以下の置換:P4A、D31A、N63AおよびP95Aを有する配列番号:130または配列番号:132のアミノ酸配列を含有する。他の実施形態では、遺伝的に修飾されたcFc領域は、D31およびN63における置換を有する配列番号:130または配列番号:132のアミノ酸配列を含有する。この種の特定の実施形態では、31位のアスパラギン酸残基グルタミン酸残基アスパラギン残基またはアラニン残基で置換され、63位のアスパラギン残基はグルタミン残基ヒスチジン残基またはアラニン残基で置換されている。この種のより特定の実施形態では、遺伝的に修飾されたcFc領域は、以下の置換:D31AおよびN63Aを有する配列番号:130または配列番号:132のアミノ酸配列を含有する。特定の実施形態では、遺伝的に修飾されたcFc領域は、配列番号:129または配列番号:131のヌクレオチド配列によってコードされ、前記ヌクレオチド配列は、それらがコードするアミノ酸配列に対応するヌクレオチド変化を含有する。

0022

別の実施形態では、遺伝的に修飾されたcFc領域は、A93に置換を有する配列番号:130または配列番号:132のアミノ酸配列を含有する。この種の特定の実施形態では、置換はA93Gである。関連実施形態では、置換はA93Sである。以下の実施例4で示すように、A93Gの置換は、CDC活性を増大させることを示す、補体C1q結合の増強をもたらす。

0023

関連実施形態では、遺伝的に修飾されたcFc領域は、配列番号:109のアミノ酸配列を含むヒンジ領域をさらに含有する。他の実施形態では、遺伝的に修飾されたFc領域は、配列番号:110のアミノ酸配列を含むヒンジ領域をさらに含有する。さらに他の実施形態では、遺伝的に修飾されたFc領域は、配列番号:111のアミノ酸配列を含むヒンジ領域をさらに含有する。さらに他の実施形態では、遺伝的に修飾されたFc領域は、配列番号:112のアミノ酸配列を含む遺伝的に修飾されたヒンジ領域をさらに含有する。

0024

選択的な実施形態では、本発明は、イヌIgGD抗体由来の遺伝的に修飾されたヒンジ領域、イヌIgGA抗体由来のヒンジ領域、イヌIgGB抗体由来のヒンジ領域、またはイヌIgGC抗体由来のヒンジ領域を有するイヌIgGDFc領域を提供する。さらに、本発明は、抗体の完全長重鎖が、イヌIgGD抗体由来の遺伝的に修飾されたヒンジ領域、イヌIgGA抗体由来のヒンジ領域、イヌIgGB抗体由来のヒンジ領域、またはイヌIgGC抗体由来のヒンジ領域を有する本発明のイヌIgGD Fc領域を含有する、抗体の完全長重鎖を提供する。そのような完全長重鎖はまた、対応するイヌ軽鎖(κまたはλ鎖)と結合して完全な抗体を形成することもできる。

0025

したがって、本発明は、イヌIgGD抗体由来の遺伝的に修飾されたヒンジ領域をさらに含有するイヌIgGDFc領域を提供する。この種の特定の実施形態では、イヌIgGD Fc領域および遺伝的に修飾されたヒンジ領域は、10位にプロリン残基(P10)を含む、配列番号:6のアミノ酸配列または配列番号:6のアミノ酸配列と90%、95%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を含有する。より特定の実施形態では、イヌIgGD Fc領域および遺伝的に修飾されたヒンジ領域は、配列番号:5のヌクレオチド配列によってコードされる。他の実施形態では、イヌIgGD Fc領域は、イヌIgGA抗体由来のヒンジ領域をさらに含有する。この種の特定の実施形態では、イヌIgGD Fc領域およびヒンジ領域は、配列番号:8のアミノ酸配列または配列番号:8のアミノ酸配列と90%、95%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を含有する。より特定の実施形態では、イヌIgGD Fc領域およびヒンジ領域は、配列番号:7のヌクレオチド配列によってコードされる。さらに他の実施形態では、イヌIgGD Fc領域は、イヌIgGB抗体由来のヒンジ領域をさらに含有する。この種の特定の実施形態では、イヌIgGD Fc領域およびヒンジ領域は、配列番号:10のアミノ酸または配列番号:10のアミノ酸配列と90%、95%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を含有する。より特定の実施形態では、イヌIgGD Fc領域およびヒンジ領域は、配列番号:9のヌクレオチド配列によってコードされる。さらに他の実施形態では、イヌIgGD Fc領域は、イヌIgGC抗体由来のヒンジ領域をさらに含有する。この種の特定の実施形態では、イヌIgGD Fc領域およびヒンジ領域は、配列番号:12のアミノ酸配列または配列番号:12のアミノ酸配列と90%、95%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を含有する。より特定の実施形態では、イヌIgGD Fc領域およびヒンジ領域は、配列番号:11のヌクレオチド配列によってコードされる。本発明はさらに、これらのイヌIgGD Fc領域およびヒンジ領域を含有するイヌ化抗体を提供する。特定の実施形態では、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、イヌプログラム死受容体1(イヌPD−1)に特異的に結合する。

0026

本発明は、それゆえ、イヌPD−1に特異性を有するおよび/またはイヌPD−1に高い結合親和性を有するイヌ化抗イヌPD−1抗体を提供する。特定の実施形態では、イヌ化抗イヌPD−1抗体はまた、イヌPD−1のイヌPD−L1への結合をブロックする能力も備える。具体的な実施形態では、イヌ化抗イヌPD−1抗体は、イヌPD−1に高い結合親和性を有し、ならびにイヌPD−1のイヌPD−L2への結合もブロックする能力を備える。イヌPD−1に特異的に結合するイヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、本発明のイヌIgG重鎖およびイヌκまたはλ軽鎖を含有し得る。特定の実施形態では、イヌ化抗イヌPD−1抗体は、イヌ化マウス抗イヌPD−1抗体である。本発明はまた、癌および/または感染に起因する疾患などの疾患の処置におけるそのようなイヌ化抗体の使用に関する。

0027

特定の実施形態では、イヌ化抗イヌPD−1抗体は、本発明の遺伝的に修飾されたcFc領域を含有する。選択的な実施形態では、イヌ化抗イヌPD−1抗体は、イヌIgGD抗体由来の遺伝的に修飾されたヒンジ領域、イヌIgGA抗体由来のヒンジ領域、イヌIgGB抗体由来のヒンジ領域、またはイヌIgGC抗体由来のヒンジ領域を有するイヌIgGD Fc領域を含有する。本発明はさらに、マウス抗イヌPD−1抗体から得たCDR、すなわち3つの軽鎖CDR:CDR軽鎖1(CDRL1)、CDR軽鎖2(CDRL2)およびCDR軽鎖3(CDRL3)ならびに3つの重鎖CDR:CDR重鎖1(CDRH1)、CDR重鎖2(CDRH2)およびCDR重鎖3(CDRH3)と組み合わせて本発明のイヌフレームを含有するそのようなイヌ化抗イヌPD−1抗体を提供する。

0028

特定の実施形態では、イヌ化マウス抗イヌPD−1抗体は、本発明のIgGBまたはIgGCの遺伝的に修飾されたcFc領域あるいはイヌIgGD Fc領域を、マウス抗イヌPD−1抗体から得たCDRと組み合わせたイヌIgGD抗体由来の遺伝的に修飾されたヒンジ領域、イヌIgGA抗体由来のヒンジ領域、イヌIgGB抗体由来のヒンジ領域、またはイヌIgGC抗体由来のヒンジ領域と共に含有する。さらに、本発明は、本明細書で詳述する特異的CDRを有するイヌ化マウス抗イヌPD−1抗体を提供するだけでなく、さらにそれらのCDRの保存的に修飾された変異体ならびに同じ正準構造を有する(例えば共有する)変異体を含有するイヌ化マウス抗イヌPD−1抗体も提供する。

0029

したがって特定の実施形態では、イヌ化抗イヌPD−1抗体は、相補性決定領域(CDR)が、重鎖のCDR1、CDR2およびCDR3に関してそれぞれH1−1、H2−1およびH3−6の正準構造を有する、すなわち重鎖のCDR1が正準構造クラス1を有し、重鎖のCDR2が正準構造クラス1を有し、および重鎖のCDR3が正準構造クラス6を有するCDRをさらに含有する。さらにより特定の実施形態では、対応する軽鎖についてのCDRは、軽鎖のCDR1、CDR2およびCDR3に関してそれぞれL1−3、L2−1およびL3−1の正準構造を有する。他の実施形態では、イヌ化抗イヌPD−1抗体は、相補性決定領域(CDR)が、重鎖のCDR1、CDR2およびCDR3に関してそれぞれH1−1、H2−1およびH3−11の正準構造を有するCDRをさらに含有する。この種のさらにより特定の実施形態では、対応する軽鎖についてのCDRは、軽鎖のCDR1、CDR2およびCDR3に関してそれぞれL1−2A、L2−1およびL3−1の正準構造を有する。さらに他の実施形態では、イヌ化抗イヌPD−1抗体は、相補性決定領域(CDR)が、重鎖のCDR1、CDR2およびCDR3に関してそれぞれH1−1、H2−2AおよびH3−11の正準構造を有するCDRをさらに含有する。この種のさらにより特定の実施形態では、対応する軽鎖についてのCDRは、軽鎖のCDR1、CDR2およびCDR3に関してそれぞれL1−2A、L2−1およびL3−1の正準構造を有する。さらに他の実施形態では、イヌ化抗イヌPD−1抗体は、相補性決定領域(CDR)が、重鎖のCDR1、CDR2およびCDR3に関してそれぞれH1−1、H2−2AおよびH3−13の正準構造を有するCDRをさらに含有する。この種のさらにより特定の実施形態では、対応する軽鎖についてのCDRは、軽鎖のCDR1、CDR2およびCDR3に関してそれぞれL1−4、L2−1およびL3−1の正準構造を有する。

0030

より特定の実施形態では、本発明のイヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号:27、配列番号:28、配列番号:29または配列番号:30のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域1(VHCDR1)の1つまたはそれ以上を含む。別の実施形態では、重鎖相補性決定領域2(VH CDR2)は、配列番号:31、配列番号:32、配列番号:33、配列番号:34または配列番号:35のアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態では、重鎖相補性決定領域3(VH CDR3)は、配列番号:36、配列番号:37、配列番号:38または配列番号:146のアミノ酸配列を含む。この種の特定の実施形態では、イヌ化抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号:27、配列番号:28、配列番号:29または配列番号:30のアミノ酸配列を含むVH CDR1および配列番号:31、配列番号:32、配列番号:33、配列番号:34または配列番号:35のアミノ酸配列を含むVH CDR2の両方を含有する。別のそのような実施形態では、イヌ化抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号:27、配列番号:28、配列番号:29または配列番号:30のアミノ酸配列を含むVH CDR1および配列番号:36、配列番号:37、配列番号:38または配列番号:146のアミノ酸配列を含むVH CDR3の両方を含有する。さらに別のそのような実施形態では、イヌ化抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号:31、配列番号:32、配列番号:33、配列番号:34または配列番号:35のアミノ酸配列を含むVH CDR2および配列番号:36、配列番号:37、配列番号:38または配列番号:146のアミノ酸配列を含むVH CDR3の両方を含有する。さらに別のそのような実施形態では、イヌ化抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号:27、配列番号:28、配列番号:29または配列番号:30のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号:31、配列番号:32、配列番号:33、配列番号:34または配列番号:35のアミノ酸配列を含むVH CDR2および配列番号:36、配列番号:37、配列番号:38または配列番号:146のアミノ酸配列を含むVH CDR3を含有する。

0031

特定の実施形態では、イヌ化抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号:13、配列番号:14または配列番号:15のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域1(VLCDR1)も含有する。関連実施形態では、軽鎖相補性決定領域2(VL CDR2)は、配列番号:16、配列番号:17、配列番号:18、配列番号:19、配列番号:20または配列番号:21のアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態では、軽鎖相補性決定領域3(VL CDR3)は、配列番号:22、配列番号:23、配列番号:24、配列番号:25または配列番号:26のアミノ酸配列を含む。この種の特定の実施形態では、イヌ化抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号:13、配列番号:14または配列番号:15のアミノ酸配列を含むVL CDR1および配列番号:16、配列番号:17、配列番号:18、配列番号:19、配列番号:20または配列番号:21のアミノ酸配列を含むVL CDR2の両方を含有する。

0032

別のそのような実施形態では、イヌ化抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号:13、配列番号:14または配列番号:15のアミノ酸配列を含むVLCDR1および配列番号:22、配列番号:23、配列番号:24、配列番号:25または配列番号:26のアミノ酸配列を含むVL CDR3の両方を含有する。さらに別のそのような実施形態では、イヌ化抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号:16、配列番号:17、配列番号:18、配列番号:19、配列番号:20または配列番号:21のアミノ酸配列を含むVL CDR2および配列番号:22、配列番号:23、配列番号:24、配列番号:25または配列番号:26のアミノ酸配列を含むVL CDR3の両方を含有する。さらに別のそのような実施形態では、イヌ化抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号:13、配列番号:14または配列番号:15のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号:16、配列番号:17、配列番号:18、配列番号:19、配列番号:20または配列番号:21のアミノ酸配列を含むVL CDR2および配列番号:22、配列番号:23、配列番号:24、配列番号:25または配列番号:26のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含有する。

0033

本発明はさらに、配列番号:40のアミノ酸配列または配列番号:40のアミノ酸配列と90%、95%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列、配列番号:42のアミノ酸配列または配列番号:42のアミノ酸配列と90%、95%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列、配列番号:44のアミノ酸配列または配列番号:44のアミノ酸配列と90%、95%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列、配列番号:46のアミノ酸配列または配列番号:46のアミノ酸配列と90%、95%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列、配列番号:48のアミノ酸配列または配列番号:48のアミノ酸配列と90%、95%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列、配列番号:50のアミノ酸配列または配列番号:50のアミノ酸配列と90%、95%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列、配列番号:52のアミノ酸配列または配列番号:52のアミノ酸配列と90%、95%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列、配列番号:54のアミノ酸配列または配列番号:54のアミノ酸配列と90%、95%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列、配列番号:56のアミノ酸配列または配列番号:56のアミノ酸配列と90%、95%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列、配列番号:58のアミノ酸配列または配列番号:58のアミノ酸配列と90%、95%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列、配列番号:60のアミノ酸配列または配列番号:60のアミノ酸配列と90%、95%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列、配列番号:62のアミノ酸配列または配列番号:62のアミノ酸配列と90%、95%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列、配列番号:64のアミノ酸配列または配列番号:64のアミノ酸配列と90%、95%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列、配列番号:66のアミノ酸配列または配列番号:66のアミノ酸配列と90%、95%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列、またはこれらのイヌ化抗体の抗原結合フラグメントを含有するイヌ化抗体を提供する。

0034

特定の実施形態では、抗体の重鎖は、(i)239位にP、A、GまたはS、(ii)266位にA、GまたはS、(iii)298位にA、GまたはS、(iv)299位にG、PまたはA、(v)300位にT、A、GまたはS、(vi)328位にA、GまたはS、および(vii)330位にP、A、GまたはSを含む、配列番号:40、52、56または64(または配列番号:40、52、56もしくは64と90%、95%、98%もしくは99%同一)のアミノ酸配列を含有する。他の実施形態では、抗体の重鎖は、(i)237位にP、A、GまたはS、(ii)264位にA、GまたはS、(iii)296位にA、GまたはS、(iv)297位にG、PまたはA、(v)298位にT、A、GまたはS、(vi)326位にA、GまたはS、および(vii)328位にP、A、GまたはSを含む、配列番号:42、54、58または66(または配列番号:42、54、58もしくは66と90%、95%、98%もしくは99%同一)のアミノ酸配列を含有する。さらに他の実施形態では、抗体の重鎖は、(i)244位にP、A、GまたはS、(ii)271位にA、GまたはS、(iii)303位にA、GまたはS、(iv)304位にG、PまたはA、(v)305位にT、A、GまたはS、(vi)333位にA、GまたはS、および(vii)335位にP、A、GまたはSを含む、配列番号:44、50または60(または配列番号:44、50もしくは60と90%、95%、98%もしくは99%同一)のアミノ酸配列を含有する。さらに他の実施形態では、抗体の重鎖は、(i)242位にP、A、GまたはS、(ii)269位にA、GまたはS、(iii)301位にA、GまたはS、(iv)302位にG、PまたはA、(v)303位にT、A、GまたはS、(vi)331位にA、GまたはS、および(vii)333位にP、A、GまたはSを含む、配列番号:46または62(または配列番号:46もしくは62と90%、95%、98%もしくは99%同一)のアミノ酸配列を含有する。さらに他の実施形態では、抗体の重鎖は、(i)246位にP、A、GまたはS、(ii)273位にA、GまたはS、(iii)305位にA、GまたはS、(iv)306位にG、PまたはA、(v)307位にT、A、GまたはS、(vi)335位にA、GまたはS、および(vii)337位にP、A、GまたはSを含む、配列番号:48(または配列番号:48と90%、95%、98%もしくは99%同一)のアミノ酸配列を含有する。

0035

さらに他の実施形態では、抗体の重鎖は、(i)239位にP、A、GまたはS、(ii)266位にA、(iii)298位にA、(iv)299位にG、PまたはA、(v)300位にT、A、GまたはS、(vi)328位にA、GまたはS、および(vii)330位にP、A、GまたはSを含む、配列番号:40、52、56または64(または配列番号:40、52、56もしくは64と90%、95%、98%もしくは99%同一)のアミノ酸配列を含有する。他の実施形態では、抗体の重鎖は、(i)237位にP、A、GまたはS、(ii)264位にA、(iii)296位にA、(iv)297位にG、PまたはA、(v)298位にT、A、GまたはS、(vi)326位にA、GまたはS、および(vii)328位にP、A、GまたはSを含む、配列番号:42、54、58または66(または配列番号:42、54、58もしくは66と90%、95%、98%もしくは99%同一)のアミノ酸配列を含有する。さらに他の実施形態では、抗体の重鎖は、(i)244位にP、A、GまたはS、(ii)271位にA、(iii)303位にA、(iv)304位にG、PまたはA、(v)305位にT、A、GまたはS、(vi)333位にA、GまたはS、および(vii)335位にP、A、GまたはSを含む、配列番号:44、50または60(または配列番号:44、50もしくは60と90%、95%、98%もしくは99%同一)のアミノ酸配列を含有する。さらに他の実施形態では、抗体の重鎖は、(i)242位にP、A、GまたはS、(ii)269位にA、(iii)301位にA、(iv)302位にG、PまたはA、(v)303位にT、A、GまたはS、(vi)331位にA、GまたはS、および(vii)333位にP、A、GまたはSを含む、配列番号:46または62(または配列番号:46もしくは62と90%、95%、98%もしくは99%同一)のアミノ酸配列を含有する。さらに他の実施形態では、抗体の重鎖は、(i)246位にP、A、GまたはS、(ii)273位にA、(iii)305位にA、(iv)306位にG、PまたはA、(v)307位にT、A、GまたはS、(vi)335位にA、GまたはS、および(vii)337位にP、A、GまたはSを含む、配列番号:48(または配列番号:48と90%、95%、98%もしくは99%同一)のアミノ酸配列を含有する。

0036

さらに他の実施形態では、抗体の重鎖は、(i)239位にA、(ii)266位にA、(iii)298位にA、(iv)299位にP、(v)300位にA、(vi)328位にG、および(vii)330位にAを含む、配列番号:40、52、56または64(または配列番号:40、52、56もしくは64と90%、95%、98%もしくは99%同一)のアミノ酸配列を含有する。他の実施形態では、抗体の重鎖は、(i)237位にA、(ii)264位にA、(iii)296位にA、(iv)297位にP、(v)298位にA、(vi)326位にG、および(vii)328位にAを含む、配列番号:42、54、58または66(または配列番号:42、54、58もしくは66と90%、95%、98%もしくは99%同一)のアミノ酸配列を含有する。さらに他の実施形態では、抗体の重鎖は、(i)244位にA、(ii)271位にA、(iii)303位にA、(iv)304位にP、(v)305位にA、(vi)333位にG、および(vii)335位にAを含む、配列番号:44、50または60(または配列番号:44、50もしくは60と90%、95%、98%もしくは99%同一)のアミノ酸配列を含有する。さらに他の実施形態では、抗体の重鎖は、(i)242位にA、(ii)269位にA、(iii)301位にA、(iv)302位にP、(v)303位にA、(vi)331位にG、および(vii)333位にAを含む、配列番号:46または62(または配列番号:46もしくは62と90%、95%、98%もしくは99%同一)のアミノ酸配列を含有する。さらに他の実施形態では、抗体の重鎖は、(i)246位にA、(ii)273位にA、(iii)305位にA、(iv)306位にP、(v)307位にA、(vi)335位にG、および(vii)337位にAを含む、配列番号:48(または配列番号:48と90%、95%、98%もしくは99%同一)のアミノ酸配列を含有する。

0037

さらに他の実施形態では、抗体の重鎖は、(i)239位にP、(ii)266位にA、G、またはS、(iii)298位にA、GまたはS、(iv)299位にG、(v)300位にT、(vi)328位にA、および(vii)330位にPを含む、配列番号:40、52、56または64(または配列番号:40、52、56もしくは64と90%、95%、98%もしくは99%同一)のアミノ酸配列を含有する。他の実施形態では、抗体の重鎖は、(i)237位にP、(ii)264位にA、GまたはS、(iii)296位にA、GまたはS、(iv)297位にG、(v)298位にT、(vi)326位にA、および(vii)328位にPを含む、配列番号:42、54、58または66(または配列番号:42、54、58もしくは66と90%、95%、98%もしくは99%同一)のアミノ酸配列を含有する。さらに他の実施形態では、抗体の重鎖は、(i)244位にP、(ii)271位にA、GまたはS、(iii)303位にA、GまたはS、(iv)304位にG、(v)305位にT、(vi)333位にA、および(vii)335位にPを含む、配列番号:44、50または60(または配列番号:44、50もしくは60と90%、95%、98%もしくは99%同一)のアミノ酸配列を含有する。さらに他の実施形態では、抗体の重鎖は、(i)242位にP、(ii)269位にA、GまたはS、(iii)301位にA、GまたはS、(iv)302位にG、(v)303位にT、(vi)331位にA、および(vii)333位にPを含む、配列番号:46または62(または配列番号:46もしくは62と90%、95%、98%もしくは99%同一)のアミノ酸配列を含有する。さらに他の実施形態では、抗体の重鎖は、(i)246位にP、(ii)273位にA、GまたはS、(iii)305位にA、GまたはS、(iv)306位にG、(v)307位にT、(vi)335位にA、および(vii)337位にPを含む、配列番号:48(または配列番号:48と90%、95%、98%もしくは99%同一)のアミノ酸配列を含有する。

0038

さらに他の実施形態では、抗体の重鎖は、(i)239位にP、(ii)266位にA、(iii)298位にA、(iv)299位にG、(v)300位にT、(vi)328位にA、および(vii)330位にPを含む、配列番号:40、52、56または64(または配列番号:40、52、56もしくは64と90%、95%、98%もしくは99%同一)のアミノ酸配列を含有する。他の実施形態では、抗体の重鎖は、(i)237位にP、(ii)264位にA、(iii)296位にA、(iv)297位にG、(v)298位にT、(vi)326位にA、および(vii)328位にPを含む、配列番号:42、54、58または66(または配列番号:42、54、58もしくは66と90%、95%、98%もしくは99%同一)のアミノ酸配列を含有する。さらに他の実施形態では、抗体の重鎖は、(i)244位にP、(ii)271位にA、(iii)303位にA、(iv)304位にG、(v)305位にT、(vi)333位にA、および(vii)335位にPを含む、配列番号:44、50または60(または配列番号:44、50もしくは60と90%、95%、98%もしくは99%同一)のアミノ酸配列を含有する。さらに他の実施形態では、抗体の重鎖は、(i)242位にP、(ii)269位にA、(iii)301位にA、(iv)302位にG、(v)303位にT、(vi)331位にA、および(vii)333位にPを含む、配列番号:46または62(または配列番号:46もしくは62と90%、95%、98%もしくは99%同一)のアミノ酸配列を含有する。さらに他の実施形態では、抗体の重鎖は、(i)246位にP、(ii)273位にA、(iii)305位にA、GまたはS、(iv)306位にG、(v)307位にT、(vi)335位にA、および(vii)337位にPを含む、配列番号:48(または配列番号:48と90%、95%、98%もしくは99%同一)のアミノ酸配列を含有する。

0039

他の実施形態では、抗体の重鎖は、(i)239位にP、A、GまたはS、(ii)266位にA、GまたはS、(iii)298位にA、GまたはS、(iv)299位にG、(v)300位にT、(vi)328位にA、GまたはS、および(vii)330位にP、A、GまたはSを含む、配列番号:40、52、56または64(または配列番号:40、52、56もしくは64と90%、95%、98%もしくは99%同一)のアミノ酸配列を含有する。他のそのような実施形態では、抗体の重鎖は、(i)237位にP、A、GまたはS、(ii)264位にA、GまたはS、(iii)296位にA、GまたはS、(iv)297位にG、(v)298位にT、(vi)326位にA、GまたはS、および(vii)328位にP、A、GまたはSを含む、配列番号:42、54、58または66(または配列番号:42、54、58もしくは66と90%、95%、98%もしくは99%同一)のアミノ酸配列を含有する。さらに他の実施形態では、抗体の重鎖は、(i)244位にP、A、GまたはS、(ii)271位にA、GまたはS、(iii)303位にA、GまたはS、(iv)304位にG、(v)305位にT、(vi)333位にA、GまたはS、および(vii)335位にP、A、GまたはSを含む、配列番号:44、50または60(または配列番号:44、50もしくは60と90%、95%、98%もしくは99%同一)のアミノ酸配列を含有する。さらに他の実施形態では、抗体の重鎖は、(i)242位にP、A、GまたはS、(ii)269位にA、GまたはS、(iii)301位にA、GまたはS、(iv)302位にG、(v)303位にT、(vi)331位にA、GまたはS、および(vii)333位にP、A、GまたはSを含む、配列番号:46または62(または配列番号:46もしくは62と90%、95%、98%もしくは99%同一)のアミノ酸配列を含有する。さらに他の実施形態では、抗体の重鎖は、(i)246位にP、A、GまたはS、(ii)273位にA、GまたはS、(iii)305位にA、GまたはS、(iv)306位にG、(v)307位にT、(vi)335位にA、GまたはS、および(vii)337位にP、A、GまたはSを含む、配列番号:48(または配列番号:48と90%、95%、98%もしくは99%同一)のアミノ酸配列を含有する。

0040

さらに他の実施形態では、抗体の重鎖は、(i)239位にP、A、GまたはS、(ii)266位にA、(iii)298位にA、(iv)299位にG、(v)300位にT、(vi)328位にA、GまたはS、および(vii)330位にP、A、GまたはSを含む、配列番号:40、52、56または64(または配列番号:40、52、56もしくは64と90%、95%、98%もしくは99%同一)のアミノ酸配列を含有する。他のそのような実施形態では、抗体の重鎖は、(i)237位にP、A、GまたはS、(ii)264位にA、(iii)296位にA、(iv)297位にG、(v)298位にT、(vi)326位にA、GまたはS、および(vii)328位にP、A、GまたはSを含む、配列番号:42、54、58または66(または配列番号:42、54、58もしくは66と90%、95%、98%もしくは99%同一)のアミノ酸配列を含有する。さらに他の実施形態では、抗体の重鎖は、(i)244位にP、A、GまたはS、(ii)271位にA、(iii)303位にA、(iv)304位にG、(v)305位にT、(vi)333位にA、GまたはS、および(vii)335位にP、A、GまたはSを含む、配列番号:44、50または60(または配列番号:44、50もしくは60と90%、95%、98%もしくは99%同一)のアミノ酸配列を含有する。さらに他の実施形態では、抗体の重鎖は、(i)242位にP、A、GまたはS、(ii)269位にA、(iii)301位にA、(iv)302位にG、(v)303位にT、(vi)331位にA、GまたはS、および(vii)333位にP、A、GまたはSを含む、配列番号:46または62(または配列番号:46もしくは62と90%、95%、98%もしくは99%同一)のアミノ酸配列を含有する。さらに他の実施形態では、抗体の重鎖は、(i)246位にP、A、GまたはS、(ii)273位にA、(iii)305位にA、(iv)306位にG、(v)307位にT、(vi)335位にA、GまたはS、および(vii)337位にP、A、GまたはSを含む、配列番号:48(または配列番号:48と90%、95%、98%もしくは99%同一)のアミノ酸配列を含有する。

0041

さらに他の実施形態では、抗体の重鎖は、(i)239位にA、(ii)266位にA、(iii)298位にA、(iv)299位にG、(v)300位にT、(vi)328位にG、および(vii)330位にAを含む、配列番号:40、52、56または64(または配列番号:40、52、56もしくは64と90%、95%、98%もしくは99%同一)のアミノ酸配列を含有する。他のそのような実施形態では、抗体の重鎖は、(i)237位にA、(ii)264位にA、(iii)296位にA、(iv)297位にG、(v)298位にT、(vi)326位にG、および(vii)328位にAを含む、配列番号:42、54、58または66(または配列番号:42、54、58もしくは66と90%、95%、98%もしくは99%同一)のアミノ酸配列を含有する。さらに他の実施形態では、抗体の重鎖は、(i)244位にA、(ii)271位にA、(iii)303位にA、(iv)304位にG、(v)305位にT、(vi)333位にG、および(vii)335位にAを含む、配列番号:44、50または60(または配列番号:44、50もしくは60と90%、95%、98%もしくは99%同一)のアミノ酸配列を含有する。さらに他の実施形態では、抗体の重鎖は、(i)242位にA、(ii)269位にA、(iii)301位にA、(iv)302位にG、(v)303位にT、(vi)331位にG、および(vii)333位にAを含む、配列番号:46または62(または配列番号:46もしくは62と90%、95%、98%もしくは99%同一)のアミノ酸配列を含有する。さらに他の実施形態では、抗体の重鎖は、(i)246位にA、(ii)273位にA、(iii)305位にA、(iv)306位にG、(v)307位にT、(vi)335位にG、および(vii)337位にAを含む、配列番号:48(または配列番号:48と90%、95%、98%もしくは99%同一)のアミノ酸配列を含有する。

0042

加えて、本発明は、配列番号:72、配列番号:78、配列番号:84、配列番号:90、配列番号:96、配列番号:102または配列番号:108のアミノ酸配列を含むイヌ軽鎖をさらに含有するイヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。

0043

したがって、本発明はさらに、配列番号:68のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号:72のアミノ酸配列を含む軽鎖を含有するイヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。関連実施形態では、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号:70のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号:72のアミノ酸配列を含む軽鎖を含有する。別の実施形態では、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号:74のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号:78のアミノ酸配列を含む軽鎖を含有する。関連実施形態では、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号:76のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号:78のアミノ酸配列を含む軽鎖を含有する。さらに別の実施形態では、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号:80のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号:84のアミノ酸配列を含む軽鎖を含有する。関連実施形態では、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号:82のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号:84のアミノ酸配列を含む軽鎖を含有する。さらに別の実施形態では、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号:86のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号:90のアミノ酸配列を含む軽鎖を含有する。関連実施形態では、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号:88のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号:90のアミノ酸配列を含む軽鎖を含有する。さらに別の実施形態では、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号:92のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号:96のアミノ酸配列を含む軽鎖を含有する。関連実施形態では、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号:94のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号:96のアミノ酸配列を含む軽鎖を含有する。さらに別の実施形態では、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号:98のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号:102のアミノ酸配列を含む軽鎖を含有する。関連実施形態では、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号:100のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号:102のアミノ酸配列を含む軽鎖を含有する。さらに別の実施形態では、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号:104のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号:108のアミノ酸配列を含む軽鎖を含有する。関連実施形態では、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号:106のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号:108のアミノ酸配列を含む軽鎖を含有する。

0044

本発明はさらに、配列番号:40のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号:72のアミノ酸配列を含む軽鎖を含有するイヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。関連実施形態では、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号:42のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号:72のアミノ酸配列を含む軽鎖を含有する。別の実施形態では、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号:44のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号:78のアミノ酸配列を含む軽鎖を含有する。関連実施形態では、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号:46のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号:78のアミノ酸配列を含む軽鎖を含有する。さらに別の実施形態では、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号:48のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号:84のアミノ酸配列を含む軽鎖を含有する。関連実施形態では、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号:50のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号:84のアミノ酸配列を含む軽鎖を含有する。さらに別の実施形態では、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号:52のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号:90のアミノ酸配列を含む軽鎖を含有する。関連実施形態では、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号:54のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号:90のアミノ酸配列を含む軽鎖を含有する。さらに別の実施形態では、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号:56のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号:96のアミノ酸配列を含む軽鎖を含有する。関連実施形態では、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号:58のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号:96のアミノ酸配列を含む軽鎖を含有する。

0045

さらに別の実施形態では、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号:60のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号:102のアミノ酸配列を含む軽鎖を含有する。関連実施形態では、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号:62のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号:102のアミノ酸配列を含む軽鎖を含有する。さらに別の実施形態では、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号:64のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号:108のアミノ酸配列を含む軽鎖を含有する。関連実施形態では、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号:66のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号:108のアミノ酸配列を含む軽鎖を含有する。

0046

本発明はさらに、本発明のイヌ化抗体のCDR、cFc領域、ヒンジ領域を有するcFc領域ならびに重鎖および軽鎖を含む本発明のアミノ酸配列のいずれかをコードする核酸を提供する。本発明はさらに、本発明の核酸の1またはそれ以上を含有する発現ベクターを提供する。本発明はさらに、本発明の1またはそれ以上の発現ベクターを含有する宿主細胞ならびにそのような宿主細胞を使用して本発明のイヌ化抗体のCDRおよび/またはcFc領域および/またはヒンジ領域を有するcFc領域および/または重鎖および/または軽鎖を発現するための方法を提供する。本発明はまた、そのようなベクター不在下で本発明のイヌ化抗体のCDRおよび/またはcFc領域および/またはヒンジ領域を有するcFc領域および/または重鎖および/または軽鎖を発現するように遺伝的に操作されている宿主細胞も提供する。特定の実施形態では、本発明のこれらの核酸、発現ベクター、ポリペプチドまたは宿主細胞は、抗体を作製する方法において有用である。

0047

特定の実施形態では、抗体は、組換え抗体またはその抗原結合フラグメントである。関連実施形態では、可変重鎖ドメインおよび可変軽鎖ドメインは、柔軟なリンカーによって連結されて一本鎖抗体を形成する。

0048

特定の実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントはFabフラグメントである。

0049

他の実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントはFab’フラグメントである。他の実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは(Fab’)2フラグメントである。さらに他の実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントはダイアボディである。特定の実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントはドメイン抗体である。特定の実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントはラクダ単一ドメイン抗体である。

0050

特定の実施形態では、イヌ化マウス抗イヌPD−1抗体または抗原結合フラグメントは、処置されるイヌ被験体免疫応答を増大させる。

0051

ある実施形態では、イヌPD−1に結合する場合、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号:138、配列番号:139、配列番号:140、配列番号:141、配列番号:142、配列番号:143、配列番号:144および/または配列番号:145の1またはそれ以上のアミノ酸配列内の少なくとも1個のアミノ酸残基に結合する。

0052

さらに、本発明は、本明細書で提供される対応する正準構造を有し、および/または配列番号:144のアミノ酸配列に結合する本発明のCDRの変異体を含有する、イヌPD−1に対するイヌ化抗体を提供する。この種の特定の実施形態では、イヌ化抗体−イヌPD−1結合についての解離定数(Kd)は1×10−5Mから1×10−12Mである。より特定の実施形態では、イヌPD−1に対するイヌ化抗体は、本明細書で提供される対応する正準構造を有し、および配列番号:145のアミノ酸配列に結合する本発明のCDRの変異体を含有する。本発明は、それゆえ、イヌPD−1に特異的に結合するイヌ化抗体およびその抗原結合フラグメントであって、それらがイヌPD−1に結合する場合、抗体が配列番号:144内の少なくとも1個のアミノ酸残基に結合する、イヌ化抗体およびその抗原結合フラグメントを包含する。この種の特定の実施形態では、抗体およびその抗原結合フラグメントは、イヌPD−1に結合し、およびイヌPD−1のイヌプログラム死リガンド1(PD−L1)への結合をブロックする。

0053

したがって、特定の実施形態では、イヌPD−1に結合する場合、イヌ化抗体(1またはそれ以上の変異体CDR、例えば保存的に修飾された変異体および/または定義された正準構造クラスを構成する変異体を包含する変異体)は、配列番号:138、配列番号:139、配列番号:140、配列番号:141、配列番号:142、配列番号:143および/または配列番号:145の1またはそれ以上のアミノ酸配列内の少なくとも1個のアミノ酸残基に結合する。さらにより特定の実施形態では、イヌPD−1に結合する場合、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、次のアルギニン残基:配列番号:114のR62、R69、R72、R75およびR90の1またはそれ以上のアミノ酸残基に結合する。具体的な実施形態では、イヌPD−1に結合する場合、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは配列番号:145内の少なくとも1個のアミノ酸残基に結合する。より具体的な実施形態では、イヌPD−1に結合する場合、抗体またはその抗原結合フラグメントは、次のアルギニン残基:配列番号:114のR62、R69、R72およびR75の1またはそれ以上のアミノ酸残基に結合する。さらにより具体的な実施形態では、イヌPD−1に結合する場合、抗体またはその抗原結合フラグメントは配列番号:114のR75に結合する。

0054

本発明は、1×10−12Mより低い(例えば1×10−13Mまたはそれ未満)解離定数(Kd)でイヌPD−1に結合するイヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントをさらに提供する。特定の実施形態では、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、1×10−5Mから1×10−12Mの解離定数でイヌPD−1に結合する。より特定の実施形態では、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、1×10−7Mから1×10−11Mの解離定数でイヌPD−1に結合する。さらにより特定の実施形態では、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、1×10−8Mから1×10−11Mの解離定数でイヌPD−1に結合する。さらにより特定の実施形態では、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、1×10−8Mから1×10−10Mの解離定数でイヌPD−1に結合する。

0055

本発明はまた、1×107M−1秒−1を上回るオン速度(kon)でイヌPD−1に結合するイヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントも提供する。特定の実施形態では、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、1×102M−1秒−1から1×107M−1秒−1のオン速度でイヌPD−1に結合する。より特定の実施形態では、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、1×103M−1秒−1から1×106M−1秒−1のオン速度でイヌPD−1に結合する。さらにより特定の実施形態では、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、1×103M−1秒−1から1×105M−1秒−1のオン速度でイヌPD−1に結合する。さらにより特定の実施形態では、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、1×104M−1秒−1から1×105M−1秒−1のオン速度でイヌPD−1に結合する。

0056

本発明はさらに、1×10−7秒−1より緩やかなオフ速度(koff)でイヌPD−1に結合するイヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。特定の実施形態では、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、1×10−3秒−1から1×10−8秒−1のオフ速度でイヌPD−1に結合する。より特定の実施形態では、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、1×10−4秒−1から1×10−7秒−1のオフ速度でイヌPD−1に結合する。さらにより特定の実施形態では、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、1×10−5秒−1から1×10−7秒−1のオフ速度でイヌPD−1に結合する。

0057

関連実施形態では、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、腫瘍または病原体に対する抗原特異的記憶応答刺激する。特定の実施形態では、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントはインビボで抗体応答を刺激する。他の特定の実施形態では、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、動物被験体における免疫応答を刺激する。より具体的な実施形態では、動物被験体はイヌである。関連実施形態では、動物被験体はネコである。

0058

したがって、本発明のイヌ化抗体のいずれもが、1、2、3、4、5またはこれらすべての特性、すなわちイヌPD−1との前記解離定数、イヌPD−1との結合に関する前記オン速度、イヌ化抗体−イヌPD−1結合複合体から解離するための前記オフ速度、腫瘍または病原体に対する抗原特異的記憶応答の刺激、インビボでの抗体応答の刺激、および/または動物被験体における免疫応答の刺激を示すことができる。

0059

より特定の実施形態では、本発明のイヌ化抗体およびその抗原結合フラグメントは、イヌPD−1に結合し、およびまたイヌPD−1のPD−L1への結合もブロックする。さらにより特定の実施形態では、本発明のイヌ化抗体およびその抗原結合フラグメントは、イヌPD−1に結合し、イヌPD−1のPD−L1への結合をブロックし、およびまたイヌPD−1のPD−L2への結合もブロックする。

0060

本発明はさらに、本発明のイヌ化マウス抗イヌPD−1抗体またはその部分をコードする核酸を提供する。関連実施形態では、そのような抗体または抗原結合フラグメントは、イヌ被験体における癌を処置する薬剤の調製のために使用することができる。あるいはまたは合わせて、本発明は、診断用途のための本発明の抗体または抗体フラグメントのいずれかの使用を提供する。さらに付加的な実施形態では、本明細書で開示されるイヌ化抗体または抗原結合フラグメントのいずれかを含有するキットが提供される。

0061

本発明はさらに、医薬的に許容される担体または希釈剤と共に、抗イヌ抗原抗体またはその結合フラグメント(例えば抗イヌPD−1抗体またはその抗原結合フラグメント)を含有する医薬組成物を包含する。本発明はまた、免疫細胞の活性を増大させる方法であって、それを必要とする被験体(例えばイヌ)に本発明の医薬組成物の治療有効量を投与することを含む方法も提供する。ある実施形態では、この方法は癌の処置のために使用される。他の実施形態では、この方法は感染または感染性疾患の処置において使用される。さらに他の実施形態では、本発明のイヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントはワクチンアジュバントとして使用される。さらに別の実施形態では、イヌ化抗TSLP抗体は、アトピー性皮膚炎を処置するためにイヌに投与される。

0062

本発明のこれらや他の態様は、以下の「図面の簡単な説明」および「発明を実施するための形態」を参照することによってより良く理解される。

図面の簡単な説明

0063

図1は、イヌPD−1の細胞外ドメインに対するイヌ化モノクローナル抗体(mAb)の反応性を、対数mAb(nM)に対するOD650/490の関数として示す。様々なイヌ化mAbをイヌPD−1の細胞外ドメインへのそれらの結合に関してELISAによって試験した。試験した4つのmAbを:2H9 VH4IgGB/VL3、3B6 VH3 IgGB/VL3、2H9 VH4 IgGB(YZZ1062)/VL3および2H9 VH4 IgGB(YZZ1068)/VL3と称した。
図2は、細胞表面に発現されたイヌPD−1に対するイヌ化mAbの反応性を示す。様々なマウスmAbを、CHO細胞上に発現されたイヌPD−1へのそれらの結合に関して、対数mAb(nM)に対するOD450/540の関数としてCELISAによって試験した。試験した6つのmAbを:3B6 VH3/VL4、3B6 VH3/VL1、3B6 VH3/VL3、3B6 VH3/VL2、3B6 VH1/VL1および3B6 m−c Chimeraと称した。
図3は、イヌPD−1に対するイヌ化mAbでのリガンド遮断を示す。様々なイヌ化mAbを、CHO細胞上に発現されたPD−1のPD−L1への結合を阻害するそれらの能力に関して、対数mAb(nM)に対するOD450/540の関数として試験した。試験した6つのmAbを:3B6 VH3/VL4、3B6 VH3/VL1、3B6 VH3/VL3、3B6 VH3/VL2、3B6 VH1/VL1および3B6 m−c Chimeraと称した。
図4は、イヌPD−1に対するイヌ化mAbによって誘導されるサイトカイン分泌を示す。様々なイヌ化mAbおよびそれらの変異体を、健常イヌ由来のPBMCからのサイトカイン分泌を誘導するそれらの能力に関して試験した。
図5Aは、イヌ化mAbおよびそれらの変異体(1μg/mlから開始する)のFcγRIへの結合を示す。様々なmAbを、FcRIに結合するそれらの能力に関して試験した。抗体を、can 2H9ADCC(1062)VH4/VL3、can 2H9 ADCC mut1 VH4/VL3、can 2H9 ADCC mut2 VH4/VL3、can 2H9 IgGD VH4/VL3、can 2H9 VH4/VL3およびcan 3B6 VH4/VL4と称する。
図5Bは、イヌ化mAbおよびそれらの変異体(1μg/mlから開始する)のFcγRIへの結合を示す。様々なmAbを、FcRIに結合するそれらの能力に関して試験した。抗体を、can 2H9 ADCC(1059)VH4/VL3、can 2H9 ADCC(1060)VH4/VL3、can 2H9 ADCC(1061)VH4/VL3、can 2H9 IgGB ADCC(1068)VH4/VL3、can 2H9 VH4/VL3およびcan 3B6 VH4/VL4と称する。
図6Aは、イヌ化mAbおよびそれらの変異体(1μg/mlから開始する)のC1Qへの結合を示す。様々なmAbを、C1Qに結合するそれらの能力に関して試験した。抗体を、can 2H9 VH4 IgGB ADCC(1062)/VL3、can 2H9 VH4 IgGB ADCC(mut1)/VL3、can 2H9 VH4 IgGB ADCC(mut2)/VL3、can 2H9 VH4 IgGD/VL3、can 2H9 VH4/VL3およびcan 3B6 VH4/VL4 IgGBと称する。
図6Bは、イヌ化mAbおよびそれらの変異体(1μg/mlから開始する)のC1Qへの結合を示す。様々なmAbを、C1Qに結合するそれらの能力に関して試験した。抗体を、can 2H9 VH4 IgGB ADCC(1059)/VL3、can 2H9 VH4 IgGB ADCC(1060)/VL3、can 2H9 VH4 IgGB ADCC(1061)/VL3、can 2H9 VH4 IgGB ADCC(1068)/VL3、can 2H9 VH4/VL3 IgGBおよびcan 3B6 VH4/VL4 IgGBと称する。
図7Aは、イヌPD−1とイヌ化抗体2G9との間の界面の特徴付けを示す。アミノ酸位置は、シグナル配列を有さないPD−1アミノ酸配列、すなわち配列番号:114に関するものである。測定は、化学架橋、高質量MALDI質量分析法およびnLC−Orbitrap質量分析法によって実施した。
図7Bは、イヌPD−1とイヌ化抗体3B6との間の界面の特徴付けを示す。アミノ酸位置は、シグナル配列を有さないPD−1アミノ酸配列、すなわち配列番号:114に関するものである。測定は、化学架橋、高質量MALDI質量分析法およびnLC−Orbitrap質量分析法によって実施した。

実施例

0064

略語
本発明の「発明を実施するための形態」および「実施例」全体を通して以下の略語を使用する:
ADCC抗体依存性細胞傷害
CDC補体依存性細胞傷害
CDRKabatナンバリングシステムを用いてヒト抗体に関して定義された、免疫グロブリン可変領域内の相補性決定領域
CHOチャイニーズハムスター卵巣
EC50 50%の効果または結合を生じさせる濃度
ELISA酵素結合免疫吸着法
FR 抗体フレームワーク領域:CDR領域を除く免疫グロブリン可変領域
HRPホースラディッシュペルオキシダーゼ
IFNインターフェロン
IC50 50%の阻害を生じさせる濃度
IgG免疫グロブリンG
Kabat Elvin A.Kabat[Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)]によって開発されたヒト抗体に関する免疫グロブリンアラインメントおよびナンバリングシステム
mAbモノクローナル抗体(MabまたはMAbとも略す)
ES2−(N−モルホリノエタンスルホン酸
OA作用機序
NHS正常ヒト血清
PCRポリメラーゼ連鎖反応
PK薬物動態
SEBブドウ球菌エンテロトキシン
TT破傷風トキソイド
V領域 異なる抗体の間で配列が可変であるヒトIgG鎖のセグメント。軽鎖内のKabat残基109および重鎖内のKabat残基113までに及ぶ。

0065

VH免疫グロブリン重鎖可変領域
VK免疫グロブリンκ軽鎖可変領域
定義
本発明をより容易に理解し得るように、特定の技術および学術用語を以下で明確に定義する。本書類の別の箇所で明確に定義されない限り、本明細書で使用される他のすべての技術および学術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。

0066

付属の特許請求の範囲を含む、本明細書で使用される場合、「a、an(1つの)」および「the(その)」などの語の単数形は、文脈上そうでないとする明らかな指示がない限り、それらの対応する複数の言及を包含する。

0067

細胞または受容体に適用される「活性化」は、文脈上または明白に異なる指示がない限り、リガンドによる細胞または受容体の活性化または処置を指す。「リガンド」は、天然および合成リガンド、例えばサイトカイン、サイトカイン変異体、類似体ムテインおよび抗体由来の結合化合物を包含する。「リガンド」はまた、低分子、例えばサイトカインのペプチドミメティックおよび抗体のペプチドミメティックも包含する。「活性化」は、内部機構によってならびに外部または環境因子によって調節される細胞活性化を指すことができる。

0068

分子の「活性」は、リガンドまたは受容体への分子の結合、触媒活性遺伝子発現または細胞のシグナル伝達、分化もしくは成熟を刺激する能力、抗原活性、他の分子の活性の調節等を表し得るもしくは指し得る。分子の「活性」はまた、細胞間相互作用、例えば接着を調節するもしくは維持するうえでの活性、または細胞の構造、例えば細胞膜もしくは細胞骨格を維持するうえでの活性も指し得る。「活性」はまた、比活性、例えば[触媒活性]/[mgタンパク質]または[免疫学的活性]/[mgタンパク質]、生物学的区画内の濃度等も意味することができる。「活性」は、先天性または適応免疫系の成分の調節も指し得る。

0069

「投与」および「処置」は、動物、例えばイヌ実験被験体、細胞、組織、器官または生体液に適用される場合、動物、例えばイヌ被験体、細胞、組織、器官または生体液への外因性医薬、治療薬診断薬または組成物の接触を指す。細胞の処置は、細胞への試薬の接触ならびに液体が細胞と接触している場合はその液体への試薬の接触を包含する。「投与」および「処置」はまた、試薬、診断薬、結合化合物による、または別の細胞による、例えば細胞の、インビトロおよびエクスビボ処置も意味する。

0070

「被験体」という用語は、任意の生物、好ましくは動物、より好ましくは哺乳動物(例えばイヌ、ネコまたはヒト)、最も好ましくはイヌを包含する。

0071

本明細書で使用される場合、「ネコ」という用語は、ネコ科(Felidae)の任意の成員を指す。この科の成員としては、野生動物園および家畜成員、例えばネコ亜科(Felinae)の任意の成員、例えばネコ、ライオントラピューマジャガーヒョウ、ユキヒョウ、クロヒョウ、北米山岳ライオン、チータ、オオヤマネコボブキャットカラカルまたはそれらの任意の交雑種が含まれる。ネコにはまた、家庭ネコ、純血種および/または雑種コンパニオンネコ、ショーキャット、実験用ネコ、クローンネコならびに野生または野良ネコも含まれる。

0072

本明細書で使用される場合、アミノ酸配列内の別のアミノ酸残基による「アミノ酸残基の置換」は、別のアミノ酸残基で「アミノ酸残基を置き換えること」に等しく、アミノ酸配列内の特定の位置の特定のアミノ酸残基が異なるアミノ酸によって置き換えられている(または置換されている)ことを意味する。例えば、1つのそのような置換(置き換え)は、IgGBまたはIgGCアミノ酸配列のFc領域のP4Aと表され、この場合、IgGBのFc領域またはIgGCのFc領域のアミノ酸配列のアミノ酸位置4でプロリン残基がアラニン残基によって置換されている(置き換えられている)。

0073

したがって、そのようなアミノ酸置換は、個別に設計することができ、すなわち意図的に、例えば組換えDNA技術によって、アミノ酸配列内の特定の位置でアラニンをセリンで置き換えることができる。あるいは、抗体の特定のアミノ酸残基または一連のアミノ酸残基を、より自然な選択過程を通して、例えば細胞によって産生された抗体がその抗原、例えばエピトープもしくはその部分を含有するものの所与の領域に結合する結合する能力に基づいて、および/または抗体が、置換しているCDRと同じ正準構造を保持する特定のCDRを含有するように、1またはそれ以上のアミノ酸残基によって置き換えることができる。そのような置換/置き換えは、「変異体」CDRおよび/または抗体をもたらすことができる。

0074

「処置する」または「処置すること」は、治療薬、例えば本発明の抗体または抗原結合フラグメントのいずれかを含有する組成物を、1またはそれ以上の疾患症状を有する、または治療薬が治療活性を有する疾患を保有することが疑われるイヌ被験体または患者に、内部にまたは外部から投与することを意味する。

0075

典型的には、治療薬は、処置される被験体または集団において、臨床的測定可能な程度にそのような(1または複数の)症状の後退を誘導するまたは(1または複数の)症状の進行を阻止することによって、1またはそれ以上の疾患症状を軽減するおよび/または改善するのに有効な量で投与される。何らかの特定の疾患症状を軽減するのに有効な治療薬の量(「治療有効量」とも称される)は、疾患の状態、被験体(例えばイヌ)の年齢および体重、ならびに被験体において所望の応答を引き出す医薬組成物の能力などの因子によって異なり得る。疾患症状が軽減または改善されたかどうかは、その症状の重症度または進行状態を評価するために獣医(veteranarian)または他の熟達した医療提供者によって典型的に使用される任意の臨床測定によって評価することができる。本発明(例えば処置方法または製造の項)の実施形態は、すべての被験体において(1または複数の)標的疾患症状を軽減するのに有効であるとは限らないかもしれないが、当分野で公知の任意の統計的検定、例えばスチューデントt検定カイ二乗検定マンホイットニーU検定、クラスカルウォリス検定(H検定)、ヨンキー−タプストラ検定およびウィルコクソン検定などによって決定される、統計的に有意の数の被験体において(1または複数の)標的疾患症状を軽減するはずである。

0076

「処置」は、ヒト、獣医学(例えばイヌ)または研究用被験体に適用される場合、治療的処置ならびに研究および診断適用を指す。ヒト、獣医学(例えばイヌ)もしくは研究用被験体または細胞、組織もしくは器官に適用される「処置」は、イヌまたは他の動物被験体、細胞、組織、生理学的区画または生理学的流体への本発明のイヌ化抗体または抗原結合フラグメントの接触を包含する。

0077

イヌPD−1は、配列番号:114[その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、2013年12月20日出願の米国特許仮出願第61/918,946号]のアミノ酸配列を含有することが認められている。具体的な実施形態では、イヌPD−1は、配列番号:113のヌクレオチド配列を含有する核酸によってコードされる。

0078

イヌPD−L1は、配列番号:120[2013年12月20日出願の米国特許仮出願第61/918,946号、前出]のアミノ酸配列を含有することが認められている。具体的な実施形態では、イヌPD−L1は、配列番号:119を含有するヌクレオチド配列によってコードされる。

0079

「免疫応答」という用語は、例えば、癌細胞、病原体に感染した細胞もしくは組織または侵入病原体の哺乳動物身体(例えばイヌ身体)への選択的損傷、その破壊または哺乳動物身体(例えばイヌ身体)からの除去をもたらす、リンパ球、抗原提示細胞食細胞顆粒球および前記細胞または肝臓によって産生される可溶性高分子の作用を指す。

0080

イヌ化抗イヌ抗原抗体
本明細書で使用される場合、「イヌ」という用語は、特に指示されない限り、すべての家庭イヌ、イエイヌ(Canis lupus familiaris)またはイヌ科イヌ属(Canis familiaris)を包含する。

0081

本明細書で使用される場合、抗体は、イヌ化抗体、例えばイヌPD−1のアミノ酸配列の一部分を含有するポリペプチドに結合するが、イヌ化抗体、例えばイヌPD−1の配列のその部分を欠く他のイヌタンパク質には結合しない場合、所与の抗原配列(この場合はイヌ化抗体、例えばイヌPD−1のアミノ酸配列の一部分)を含有するポリペプチドに特異的に結合すると言われる。例えば、イヌPD−1を含有するポリペプチドに特異的に結合する抗体は、FLAG(登録商標)タグ形態のイヌPD−1に結合し得るが、他のFLAG(登録商標)タグイヌタンパク質には特異的に結合しない。抗体または抗体の抗原結合部位に由来する結合化合物は、試験される他のいずれのイヌ抗原に対する親和性よりも少なくとも10倍高い、より好ましくは少なくとも20倍高い、さらにより好ましくは少なくとも100倍高い、そのイヌ抗原またはその変異体もしくはムテインに対する親和性を有する場合、そのイヌ抗原またはその変異体もしくはムテインに「特異的に」結合する。

0082

本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、所望の生物学的活性を示す任意の形態の抗体を指す。したがって、これは最も広義に使用され、具体的にはモノクローナル抗体(完全長モノクローナル抗体を含む)、ポリクローナル抗体多重特異性抗体(例えば二重特異性抗体)、イヌ化抗体、完全イヌ抗体、キメラ抗体およびラクダ化単一ドメイン抗体をカバーするが、これらに限定されない。「親抗体」は、意図される用途のための抗体の修飾、例えばイヌの治療用抗体としての使用のための抗体のイヌ化に先立つ、抗原への免疫系の暴露によって得られる抗体である。

0083

本明細書で使用される場合、特に指示されない限り、「抗体フラグメント」または「抗原結合フラグメント」は、抗体の抗原結合フラグメント、すなわち完全長抗体によって結合される抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体フラグメント、例えば1またはそれ以上のCDR領域を保持するフラグメントを指す。抗原結合フラグメントの例としては、Fab、Fab’、F(ab’)2およびFvフラグメント、ダイアボディ、線状抗体、一本鎖抗体分子、例えばsc−Fv、ナノボディおよび抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が含まれるが、これらに限定されない。

0084

「Fabフラグメント」は、1本の軽鎖および1本の重鎖のCH1領域および可変領域から成る。Fab分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成することができない。「Fabフラグメント」は抗体のパパイン切断の産物であり得る。

0085

「結晶性フラグメント」(「Fc」)領域は、抗体のCH2およびCH3ドメインを含む2つの重鎖フラグメント(すなわち2つの同一のポリペプチド)を含有する。これら2つの重鎖フラグメントは、2またはそれ以上のジスルフィド結合によっておよびCH3ドメインの疎水性相互作用によって結び付けられている。本発明において、4つのイヌIgGFcフラグメントの各々についてのアミノ酸配列は、Tang et al.[Vet.Immunol.Immunopathol.80:259−270(2001)]によって決定された、CH1ドメインとCH2ドメインの同定された境界に基づく。

0086

「Fab’フラグメント」は、1本の軽鎖ならびにVHドメインとCH1ドメインおよびまた、2つのFab’フラグメントの2本の重鎖間に鎖間ジスルフィド結合が形成されてF(ab’)2分子を形成することができるように、CH1ドメインとCH2ドメインとの間の領域も含む1本の重鎖の一部分またはフラグメントを含有する。

0087

「F(ab’)2フラグメント」は、2本の軽鎖および、2本の重鎖間で鎖間ジスルフィド結合が形成されるように、CH1ドメインとCH2ドメインとの間の定常領域の一部分を含む2本の重鎖を含有する。F(ab’)2フラグメントは、したがって、2本の重鎖間のジスルフィド結合によって結び付けられている2つのFab’フラグメントから成る。「F(ab’)2フラグメント」は抗体のペプシン切断の産物であり得る。

0088

「Fv領域」は、重鎖および軽鎖の両方に由来する可変領域を含有するが、定常領域を欠く。

0089

一本鎖Fv」または「scFv」抗体という用語は、抗体のVHおよびVLドメインを含有する抗体フラグメントを指し、これらのドメインは1本のポリペプチド鎖内に存在する。一般にFvポリペプチドは、scFvが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にするVHドメインとVLドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含有する[Pluckthun,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113 Rosenburg and Moore eds.,Springer−Verlag,New York,pp.269−315(1994);国際公開第88/01649号;ならびに米国特許第4,946,778号および米国特許第5,260,203号参照]。

0090

本明細書で使用される場合、「正準構造」という用語は、抗体の重鎖および軽鎖の超可変領域の各々が、それらが存在するフレームワーク内で取ることができる局所立体配座を指す。各々の超可変領域に関して、対応する超可変領域のアミノ酸配列(特に対応するイヌ化マウス抗イヌPD−1可変ドメインに関して以下で提供するような、そのフレームワークのアミノ酸配列の状況内の)から高い精度で予測され得る、少数の正準構造(一般に1または2、等のような簡単な整数で表される)が存在する。これらの正準構造は、所与のCDRのアミノ酸配列の修飾がその抗原結合パートナーに結合する能力の保持をもたらすかまたは喪失をもたらすかに関して決定的であり得る[Chothia and Lesk,Canonical Structures for the hypervariable regions of immunoglobulins,J.Mol.Biol.196:901−917(1987);Chothia et al.,Conformation of immunoglobulin hypervaribale regions,Nature,34:877−883(1989);およびAl−Lazikani et al.,Standard Conformations for the canonical structures of immunoglobulins,J.Mol.Biol.273:927−948(1997)参照]。

0091

「ドメイン抗体」は、重鎖の可変領域または軽鎖の可変領域だけを含有する免疫学的に機能性の免疫グロブリンフラグメントである。一部の場合には、2またはそれ以上のVH領域がペプチドリンカー共有結合的に連結されて、二価ドメイン抗体を創出する。二価ドメイン抗体の2つのVH領域は、同じまたは異なる抗原を標的とし得る。

0092

二価抗体」は2つの抗原結合部位を含有する。一部の場合には、2つの結合部位は同じ抗原特異性を有する。しかし、二価抗体は二重特異性であり得る(下記参照)。

0093

ある実施形態では、本明細書中のモノクローナル抗体はラクダ化単一ドメイン抗体も包含する。[例えばMuyldermans et al.,TrendsBiochem.Sci.26:230(2001);Reichmann et al.,J.Immunol.Methods 231:25(1999);国際公開第94/04678号;国際公開第94/25591号;米国特許第6,005,079号参照]。1つの実施形態では、本発明は、単一ドメイン抗体が形成されるように修飾を有する2つのVHドメインを含有する単一ドメイン抗体を提供する。

0094

本明細書で使用される場合、「ダイアボディ」という用語は、2つの抗原結合部位を有する小さな抗体フラグメントを指し、前記フラグメントは、同じポリペプチド鎖内に、軽鎖可変ドメイン(VL)に連結された重鎖可変ドメイン(VH)を含有する(VH−VLまたはVL−VH)。同じ鎖上の2つのドメインの間で対合を可能とするには短すぎるリンカーを使用することにより、ドメインは別の鎖の相補的ドメインと対合することを余儀なくされ、2つの抗原結合部位を創出する。[欧州特許第0404097号;国際公開第93/11161号;およびHolliger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444−6448(1993)参照]。改変された抗体変異体の総説については、[一般にHolliger and Hudson Nat.Biotechnol.23:1126−1136(2005)参照]。

0095

典型的には、本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、そのイヌPD−1結合活性モルベースで表される場合、その活性の少なくとも10%(親抗体と比較した場合)を保持する。好ましくは、本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、親抗体としてのイヌ化抗体(例えばPD−1)結合親和性の少なくとも20%、50%、70%、80%、90%、95%または100%またはそれ以上を保持する。また、本発明のイヌ化抗体または抗原結合フラグメントは、その生物学的活性を実質的に変化させない保存的または非保存的アミノ酸置換(抗体の「保存的変異体」または「機能保存的変異体」とも称される)を含有することができることも意図されている。

0096

「単離された抗体」は精製状態を指し、そのような状況で分子が他の生物学的分子、例えば核酸、タンパク質、脂質、炭水化物または他の物質、例えば細胞デブリおよび増殖培地などを実質的に含まないことを意味する。一般に、「単離された」という用語は、そのような物質または水、緩衝剤もしくは塩が本明細書で述べる結合化合物の実験的または治療的使用を実質的に妨げる量で存在しない限り、そのような物質が完全に存在しないことまたは水、緩衝剤もしくは塩が存在しないことを指すことを意図しない。

0097

本明細書で使用される場合、「キメラ抗体」は、第一抗体由来の可変ドメインおよび第二抗体由来の定常ドメインを有する抗体であって、第一抗体と第二抗体が異なる種に由来する抗体である。[米国特許第4,816,567号;およびMorrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851−6855(1984)]。典型的には、可変ドメインは、げっ歯動物などの実験動物由来の抗体(「親抗体」)から得られ、定常ドメイン配列は、動物被験体抗体、例えばイヌから得られ、生じるキメラ抗体がイヌ被験体において親(例えばげっ歯動物)抗体よりも有害な免疫応答を引き起こす可能性がより低くなるように、前記動物被験体抗体から得られる。

0098

本明細書で使用される場合、「イヌ化抗体」という用語は、イヌおよび非イヌ(例えばマウス)抗体の両方に由来する配列を含有する抗体の形態を指す。一般に、イヌ化抗体は、超可変ループの全部または実質的に全部が非イヌ免疫グロブリンのものに対応する(例えば以下で例示するように6つのマウス抗イヌPD−1CDRを含有する)、少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質的に全部を含有し、ならびにイヌフレームの全部または実質的に全部を含有する。

0099

「完全イヌ抗体」という用語は、イヌ免疫グロブリンタンパク質配列だけを含有する抗体を指す。完全イヌ抗体は、マウスにおいて、マウス細胞においてまたはマウス細胞由来ハイブリドーマにおいて作製された場合、マウス糖鎖を含有し得る。同様に、「マウス抗体」は、マウス免疫グロブリン配列だけを含有する抗体を指す。あるいは、完全イヌ抗体は、ラットにおいて、ラット細胞においてまたはラット細胞由来のハイブリドーマにおいて作製された場合、ラット糖鎖を含有し得る。同様に、「ラット抗体」は、ラット免疫グロブリン配列だけを含有する抗体を指す。

0100

各々の軽鎖/重鎖対の可変領域は抗体結合部位を形成する。したがって、一般に、無傷抗体は2つの結合部位を有する。二機能性または二重特異性抗体における場合を除き、2つの結合部位は、一般に、同じである。

0101

典型的には、重鎖および軽鎖の両方の可変ドメインは、比較的保存されたフレームワーク領域(FR)内に位置する、相補性決定領域(CDR)とも呼ばれる3つの超可変領域を含有する。CDRは通常フレームワーク領域によって隣接され、特定のエピトープへの結合を可能にする。一般に、N末端からC末端に向かって、軽鎖および重鎖の可変ドメインはどちらも、FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3およびFR4を含有する。ヒト抗体の各ドメインへのアミノ酸の割当ては、一般に、Sequences of Proteins of Immunological Interest,Kabat,et al.;National Institutes of Health,Bethesda,Md.;5th ed.;NIH Publ.No.91−3242(1991);Kabat,Adv.Prot.Chem.32:1−75(1978);Kabat,et al.,J.Biol.Chem.252:6609−6616(1977);Chothia,et al.,J.Mol.Biol.196:901−917(1987)またはChothia,et al.,Nature 342:878−883(1989)]の定義に従う。

0102

本明細書で使用される場合、「超可変領域」という用語は、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、「相補性決定領域」または「CDR」(すなわち軽鎖可変ドメイン内のCDRL1、CDRL2およびCDRL3ならびに重鎖可変ドメイン内のCDRH1、CDRH2およびCDRH3)由来のアミノ酸残基を含有する。[配列によってヒト抗体のCDR領域を定義する、Kabat et al.Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)参照;また、構造によって抗体のCDR領域を定義する、Chothia and Lesk,J.Mol.Biol.196:901−917(1987)も参照のこと]。本明細書で使用される場合、「フレームワーク」または「FR」残基という用語は、CDR残基として本明細書で定義される超可変領域残基以外の可変ドメイン残基を指す。

0103

本明細書で使用される場合、「イヌフレーム」という用語は、本明細書でCDR残基として定義される超可変領域残基以外のイヌ抗体の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列を指す。両方の鎖において、天然イヌCDRのアミノ酸配列は対応する異種CDR(例えばマウス抗体由来のもの)で置き換えられている。イヌ抗体の重鎖および/または軽鎖は、例えば、以下で例示するように、イヌ抗体内の異種CDRの立体配座を保存するためおよび/またはFc機能を改変するために、いくつかの異種非CDR残基を含有していてもよい。

0104

本明細書で使用される場合、「抗イヌPD−1抗体」は、イヌPD−1に対して(マウスまたはウサギなどの哺乳動物において)惹起された抗体であって、イヌPD−1に特異的に結合する抗体を指す。「イヌPD−1に特異的に結合する」抗体、または「配列番号:114のアミノ酸配列を含有するポリペプチドに特異的に結合する」抗体は、他の抗原と比較してイヌPD−1への選択的な結合を示す、例えばイヌPD−1に「特異的に」結合する抗体である。この結合は、絶対的な結合特異性を必要としない。抗イヌPD−1抗体は、その結合が試料中のイヌPD−1の存在を決定する場合、またはイヌ試料中の他の分子の活性を過度に妨げることなく、例えば診断状況における偽陽性もしくは治療状況での副作用などの望ましくない結果を生じさせることなくイヌPD−1の活性を変化させることができる場合、イヌPD−1に「特異的」と見なされる。抗イヌPD−1抗体に必要な特異性の程度は抗体の意図される用途に依存してよく、いずれにせよ意図される目的のための使用への適切性によって定義される。

0105

したがって本発明は、イヌPD−1に結合する(例えば特異的に)イヌ化抗イヌPD−1抗体またはその抗原結合フラグメント(単離された形態を含む)およびそのような抗体またはそのフラグメントの使用を提供する。具体的な実施形態では、イヌPD−1に結合することおよびイヌPD−1の、そのリガンドの少なくとも1つ、例えばイヌPD−L1への結合をブロックすることの両方が示されている、マウス抗イヌPD−1抗体由来のマウス抗イヌPD−1CDRが提供される。本明細書で例示するように、これらのCDRを本発明の修飾されたイヌフレームに挿入して、イヌ化マウス抗イヌPD−1抗体を作製することができる。

0106

より具体的には、本発明の「イヌ化マウス抗PD−1抗体」は、マウス抗イヌPD−1抗体由来の3つの重鎖CDRおよび3つの軽鎖CDRをイヌフレームまたは修飾されたイヌフレームと共に含有する抗体を指す。修飾されたイヌフレームは、イヌ化抗体の有効性をさらに最適化する、例えば、抗体エフェクター機能を増大させる、減少させるまたは除去する、イヌ抗原、例えばイヌPD−1へのその結合を増大させる、および/またはイヌ抗原、例えばイヌPD−1のその天然結合パートナー(例えば抗原がイヌPD−1である場合はイヌPD−L1)への結合をブロックするその能力を増大させる、本明細書で例示するような1またはそれ以上のアミノ酸変化を含有する。

0107

相同性」は、最適に整列した場合の2つのポリヌクレオチド配列間または2つのポリペプチド配列間の配列類似性を指す。2つの比較配列の両方におけるある位置が同じ塩基またはアミノ酸モノマーサブユニットによって占有されている場合、例えば2つのDNA分子の各々におけるある位置がアデニンによって占有されている場合、これらの分子はその位置において相同である。相同性のパーセントは、2つの配列によって共有される相同な位置の数を、比較した位置の総数で除して、100を乗じたものである。例えば、2つの配列を最適に整列した場合に2つの配列中の10の位置のうち6の位置が一致するかまたは相同である場合、2つの配列は60%相同である。一般に、比較は、最大の相同性パーセントを与えるように2つの配列を整列した場合に行われる。

0108

「単離された核酸分子」は、単離されたポリヌクレオチドが自然界で見出されるポリヌクレオチドの全部または一部分と結合していない、または自然界では連結されていないポリヌクレオチドに連結されている、ゲノムmRNAcDNAもしくは合成起源のDNAまたはRNAまたはそれらの何らかの組合せを意味する。本開示のために、特定のヌクレオチド配列「を含有する核酸分子」は無傷の染色体を包含しないことが理解されるべきである。指定された核酸配列「を含有する」単離された核酸分子は、指定配列に加えて、10個までまたはさらには20個までまたはそれ以上の他のタンパク質またはその部分もしくはフラグメントについてのコード配列を含有してよく、または列挙される核酸配列のコード領域の発現を制御する作動可能に連結された調節配列を含有してよく、および/またはベクター配列を含有してもよい。

0109

制御配列」という語句は、特定の宿主生物における作動可能に連結されたコード配列の発現のために必要なDNA配列を指す。原核生物に適切な制御配列としては、例えばプロモーターが含まれ、オペレーター配列が含まれてもよく、およびリボソーム結合部位が含まれる。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーを使用することが公知である。

0110

核酸は、別の核酸配列と機能的関係に置かれている場合、「作動可能に連結されて」いる。例えば、プレ配列または分泌リーダーに関するDNAは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、ポリペプチドについてのDNAに作動可能に連結されている;プロモーターまたはエンハンサーは、それがコード配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結されている;またはリボソーム結合部位は、それが翻訳を促進するように位置付けられている場合、コード配列に作動可能に連結されている。一般に、「作動可能に連結された」は、連結されているDNA配列が隣接していること、および分泌リーダーの場合は、隣接しておりかつ読み取り相内にあることを意味する。しかし、エンハンサーは隣接している必要はない。連結は、好都合制限部位でのライゲーションによって達成される。そのような部位が存在しない場合は、従来の慣例に従って合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを使用する。

0111

本明細書で使用される場合、「細胞」、「細胞株」および「細胞培養物」という表現交換可能に使用され、すべてのそのような指定語子孫を包含する。したがって、「形質転換体」および「形質転換細胞」という語は、一次被験体細胞および継代の数を考慮せずにそれに由来する培養物を包含する。また、意図的なまたは不慮の突然変異に起因して、必ずしもすべての子孫が正確に同じDNA含量を有さないことも理解される。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングされたのと同じ機能または生物学的活性を有する突然変異体子孫は包含される。異なる指定語が意図される場合は、文脈から明らかになる。

0112

本明細書で使用される場合、「生殖細胞系配列」は、再構成されていない免疫グロブリンDNA配列の配列を指す。再構成されていない免疫グロブリン配列の任意の適切な供給源を使用し得る。ヒト生殖細胞系配列は、例えばアメリカ国立衛生研究所の関節炎および筋骨格系皮膚疾患国立研究機構(National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases of the United States National Institutes of Health)のウエブサイト上のJOINSOLVER(登録商標)生殖細胞系データベースから入手し得る。マウス生殖細胞系配列は、例えばGiudicelli et al.[Nucleic AcidsRes 33:D256−D261(2005)]に記載されているように入手し得る。

0113

イヌ化抗体の特性
イヌにおいては、A、B、CおよびDと称される4つのIgG重鎖が存在する。これらの重鎖は、IgGA、IgGB、IgGCおよびIgGDと称される、イヌIgGの4つの異なるサブクラスを示す。これら4つの重鎖のDNAおよびアミノ酸配列は、Tang et al.[Vet.Immunol.Immunopathol.80:259−270(2001)]によって初めて同定された。これらの重鎖についてのアミノ酸およびDNA配列はGenBankデータベースからも入手可能である。例えば、IgGA重鎖のアミノ酸配列はアクセッション番号AAL35301.1を有し、IgGBはアクセッション番号AAL35302.1を有し、IgGCはアクセッション番号AAL35303.1を有し、およびIgGDはアクセッション番号(AAL35304.1)を有する。イヌ抗体はまた、2種類の軽鎖、κおよびλも含有する。これらの軽鎖のDNAおよびアミノ酸配列はGenBankデータベースから入手できる。例えばκ軽鎖のアミノ酸配列はアクセッション番号ABY 57289.1を有し、λ軽鎖はアクセッション番号ABY 55569.1を有する。本発明では、4つのイヌIgGFcフラグメントの各々についてのアミノ酸配列は、Tang et al.前出によって決定されたCH1およびCH2ドメインの同定された境界に基づく。

0114

治療用モノクローナル抗体の開発は、所望の抗体を生成するための複雑なセットの活動の調整を必要とする複雑な工程である。これらには、抗体の特異性、親和性、機能的活性、操作された細胞株における発現レベル、長期的な安定性、エフェクター機能の除去または増強ならびに商業的に実行可能な製造および精製方法の開発の最適化が含まれる。本発明の目的を考慮しておよび免疫系の細胞を活性化する能力を別にして、イヌPD−1に対するイヌ化またはイヌモノクローナル抗体は、最適には3つの付加的な属性を有する:
1.抗体依存性細胞傷害(ADCC)および補体依存性細胞傷害(CDC)などのエフェクター機能の欠如、
2.インビボでの比較的長い半減期;ならびに
3.プロテインAクロマトグラフィに基づくもののような業界標準技術を用いて大規模で容易に精製される。

0115

天然に存在するイヌIgGサブクラスはいずれも、これらの基準全部は満たさない。例えば、IgGBはプロテインAを使用して精製することができるが、高レベルのADCC活性を有する。IgGCもかなりのADCC活性を有する。他方で、IgGAはプロテインAに弱く結合するが、望ましくないADCC活性を示す。さらに、IgGDはADCC活性を示さないが、IgGCまたはIgGDのいずれもがプロテインAカラムでは精製することができない。加えて、IgGCは、イヌFcRn受容体に結合しないので、血清半減期が短い。本発明は、イヌ抗原、例えばイヌPD−1に特異的な修飾されたイヌIgG抗体を提供することによってこの困難を克服する;そのような抗体はADCCおよびCDCなどのエフェクター機能を欠き、比較的長い半減期を示し、業界標準のプロテインAクロマトグラフィを用いて容易に精製することができる。

0116

これまで、ADCCおよびCDCエフェクター機能の両方を有さず、および加えて、プロテインAクロマトグラフィによって精製することができる遺伝的に修飾されたイヌIgGは記述されていなかった。本明細書で開示するように、ヒトおよびマウスIgGのものに類似するイヌIgG内の位置での単一置換、例えばN297AまたはD265Aは、対応するイヌ抗体においてADCCおよびCDCエフェクター機能の両方を完全に除去するわけではない。例えば、ヒトまたはマウス抗体における置換N297およびD265の各々は、Fcγ受容体およびC1qへの結合の排除をもたらすが、いずれの置換も単独ではイヌ抗体のC1qへの結合を完全には排除しなかった。その代わりに、以下でさらに開示するように、IgGBまたはIgGCサブクラスのイヌ抗体においてADCCおよびCDCの両方を除去するためには、アスパラギンからアラニンへの置換およびアスパラギン酸からアラニンへの置換の両方を組み合わせたイヌ抗体のFcにおける二重置換を行う必要があることが判明した。さらに、全く予想外のことに、ヒト抗体においてエフェクター機能を低減させることが示されていた1つの置換が、実際には対応するイヌIgGのFcγRおよびC1qへの結合の増大を生じさせた。

0117

エフェクター機能を欠くイヌIgGBおよびIgGCの変異体を作製するために、修飾されたイヌIgGBまたは修飾されたイヌIgGC重鎖を生成することができる。これらのイヌ結晶性フラグメント領域(cFc)の両方に存在する合計7個のアミノ酸残基を、そのような可能性のある置換のために同定した。これら7個のアミノ酸残基は、イヌIgGBのFcについては配列番号:130のアミノ酸配列およびイヌIgGCのFcについては配列番号:132のアミノ酸配列の両方に関して:P4、D31、N63、G64、T65、A93およびP95である。したがって、配列番号:2のアミノ酸配列は、4、31、63、64、65、93および95の位置に前記アミノ酸残基を有することによって配列番号:130のものと異なり、それらは、7つすべての位置について「X」(または3文字コードでは「Xaa」)として配列番号:130のアミノ酸配列においてそれぞれプロリン(P)、アスパラギン酸(D)、アスパラギン(N)、グリシン(G)、トレオニン(T)、アラニン(A)およびプロリン(P)であり、これら7つのアミノ酸位置が20個の天然アミノ酸のいずれかであり得ることを示す(以下の表1の縦の列1のリスト参照)。同様に、配列番号:4のアミノ酸配列は、7つすべての位置について「X」(または3文字コードでは「Xaa」)として列挙される4、31、63、64、65、93および95の位置に前記アミノ酸残基を有することによって配列番号:132のものと異なり、これら7つのアミノ酸位置が20個の天然アミノ酸のいずれかであり得ることを示す。配列番号:2のアミノ酸配列は配列番号:1のヌクレオチド配列によってコードされ、配列番号:4のアミノ酸配列は配列番号:3のヌクレオチド配列によってコードされる。

0118

1つの実施形態では、cFcは、以下の置換:P4(A、GまたはS)、D31(A、GまたはS)、N63(A、GまたはS)、G64(AまたはP)、T65(A、GまたはS)、A93(GまたはS)およびP95(A、GまたはS)を有する配列番号:130のアミノ酸配列を含有し;ここでP4(A、GまたはS)は、4位のプロリン残基がアラニン、グリシンまたはセリン残基のいずれかによって置き換えられていることを示し、同様にG64(PまたはA)は、64位のグリシン残基がプロリンまたはアラニン残基のいずれかによって置き換えられていることを示す、等である)。特定の実施形態では、cFcは、以下の置換:P4A、D31A、N63A、G64P、T65A、A93GおよびP95Aを有する配列番号:130のアミノ酸配列を含有する。

0119

関連実施形態では、cFcは、以下のアミノ酸残基:A4、A31、A63、G64、T65、G93およびA95を有する、Xaaと称される7個のアミノ酸を含有する配列番号:4のアミノ酸配列、すなわち以下の5つのアミノ酸残基変化:P4A、D31A、N63A、A93GおよびP95Aを有し、ならびに7個のうち残りの2個のアミノ酸残基、G64およびT65は配列番号:132のアミノ酸配列から保持されている、配列番号:132のアミノ酸配列を含有する。

0120

配列番号:40、配列番号:42、配列番号:44、配列番号:46、配列番号:48、配列番号:50、配列番号:52、配列番号:54、配列番号:56、配列番号:58、配列番号:60、配列番号:62、配列番号:64および配列番号:66のアミノ酸配列はすべて、7つのアミノ酸位置に「X」(または3文字コードでは「Xaa」)を含有し、これら7つのアミノ酸位置が以下の表1の縦の列1に列挙される20個の天然アミノ酸のいずれかであり得ることを示す。特に配列番号:40、配列番号:42、配列番号:44、配列番号:46、配列番号:48、配列番号:50、配列番号:52、配列番号:54、配列番号:56、配列番号:58、配列番号:60、配列番号:62、配列番号:64および配列番号:66は、それらのそれぞれの配列内に配列番号:2のアミノ酸配列または配列番号:4のアミノ酸配列のいずれかを含有する。アミノ配列のこれら7つの位置の1またはそれ以上におけるアミノ酸残基の具体的な例は、上記および下記に記述されており、それゆえ、配列番号:2、配列番号:4、配列番号:40、配列番号:42、配列番号:44、配列番号:46、配列番号:48、配列番号:50、配列番号:52、配列番号:54、配列番号:56、配列番号:58、配列番号:60、配列番号:62、配列番号:64および配列番号:66、ならびにこれらの配列を含有するイヌ化抗体内の個々のアミノ酸配列の属中に含まれる。

0121

以下に示す表10は、cIgGB Fc(配列番号:130および配列番号:2)ならびにcIgGC Fc(配列番号:132および配列番号:4)の、本明細書で開示するように置換することができる7つのアミノ酸位置を、これらのcFcアミノ酸配列、すなわち配列番号:40、配列番号:42、配列番号:44、配列番号:46、配列番号:48、配列番号:50、配列番号:52、配列番号:54、配列番号:56、配列番号:58、配列番号:60、配列番号:62、配列番号:64および配列番号:66を含有する完全長イヌ重鎖のものと具体的に関連付けている。したがって、完全長配列IgGBまたはIgGCにおける実際の位置を、以下の表10の使用を通して、それが含有するcFcのものと容易に適合させることができる。

0122

特定の実施形態では、抗体の重鎖は、(i)239位にP、A、GまたはS、(ii)266位にD、A、GまたはS、(iii)298位にN、A、GまたはS、(iv)299位にG、PまたはA、(v)300位にT、A、GまたはS、(vi)328位にA、GまたはS、および(vii)330位にP、A、GまたはSを含む配列番号:40、52、56または64のアミノ酸配列を含有する。他の実施形態では、抗体の重鎖は、(i)237位にP、A、GまたはS、(ii)264位にD、A、GまたはS、(iii)296位にN、A、GまたはS、(iv)297位にG、PまたはA、(v)298位にT、A、GまたはS、(vi)326位にA、GまたはS、および(vii)328位にP、A、GまたはSを含む配列番号:42、54、58または66のアミノ酸配列を含有する。さらに他の実施形態では、抗体の重鎖は、(i)244位にP、A、GまたはS、(ii)271位にD、A、GまたはS、(iii)303位にN、A、GまたはS、(iv)304位にG、PまたはA、(v)305位にT、A、GまたはS、(vi)333位にA、GまたはS、および(vii)335位にP、A、GまたはSを含む配列番号:44、50または60のアミノ酸配列を含有する。さらに他の実施形態では、抗体の重鎖は、(i)242位にP、A、GまたはS、(ii)269位にD、A、GまたはS、(iii)301位にN、A、GまたはS、(iv)302位にG、PまたはA、(v)303位にT、A、GまたはS、(vi)331位にA、GまたはS、および(vii)333位にP、A、GまたはSを含む配列番号:46または62のアミノ酸配列を含有する。さらに他の実施形態では、抗体の重鎖は、(i)246位にP、A、GまたはS、(ii)273位にD、A、GまたはS、(iii)305位にN、A、GまたはS、(iv)306位にG、PまたはA、(v)307位にT、A、GまたはS、(vi)335位にA、GまたはS、および(vii)337位にP、A、GまたはSを含む配列番号:48のアミノ酸配列を含有する。

0123

本発明はまた、天然のIgGDヒンジ領域の代わりにIgGA、IgGBまたはIgGCのいずれか由来のヒンジ領域を含有する修飾されたイヌIgGDも提供する。あるいは、IgGDヒンジ領域を、表5に示すようにセリン残基をプロリン残基で置き換えることによって遺伝的に修飾することができる。そのような修飾は、fabアーム交換を欠くイヌIgGDをもたらすことができる。修飾されたイヌIgGDは、組換えDNA技術の標準的な方法を用いて構築することができる[例えばManiatis et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual(1982)]。これらの変異体を構築するために、イヌIgGDのアミノ酸配列をコードする核酸を、修飾されたIgGDをコードするように修飾することができる。次に修飾された核酸配列をタンパク質発現のために発現プラスミドクローニングする。代替ヒンジ領域を有するイヌIgGD Fcをコードする核酸は、配列番号:8、10および12のアミノ酸配列をコードする配列番号:7、9および11のヌクレオチド配列によって例示される。修飾されたIgGDヒンジ領域を有するイヌIgGD Fcをコードする核酸は、配列番号:6のアミノ酸配列をコードする配列番号:5のヌクレオチド配列を含有する。

0124

本発明はさらに、対応する軽鎖とマッチしてイヌ化抗体を作製することができる完全長イヌ重鎖を提供する。したがって、本発明はさらに、イヌ化マウス抗イヌ抗原抗体(単離されたイヌ化マウス抗イヌPD−1抗体を含む)および疾患の処置、例えばイヌの癌の処置における前記抗体またはその抗原結合フラグメントの使用の方法を提供する。

0125

さらに、本発明は、イヌPD−1に結合し、およびイヌPD−1のイヌPD−L1への結合をブロックするイヌ化マウス抗イヌPD−1抗体または抗原結合フラグメントを提供する。ある実施形態では、イヌ化マウス抗イヌPD−1抗体は、修飾されたイヌIgGB Fc、修飾されたイヌIgGC Fcまたは本明細書で述べるfabアーム交換を欠く修飾されたイヌIgGDを含有する。

0126

イヌ化抗体、例えばイヌPD−1に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントは、本明細書で述べるマウス抗イヌ抗体の相補性決定領域(CDR)の1、2、3、4、5または6個を含有することができる。1、2、3、4、5または6個のCDRは、以下で提供されるCDR配列から独立して選択され得る。さらなる実施形態では、イヌPD−1に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントは、マウス軽鎖CDR−1、CDR−2および/またはCDR−3を含むイヌ抗体κ軽鎖ならびにマウス重鎖CDR−1、CDR−2および/またはCDR−3を含むイヌ抗体重鎖IgGを含有する。したがって、本発明はさらに、完全長イヌ重鎖を提供し、その後、例えば対応する軽鎖とマッチさせてイヌ化抗体を作製することができる[マウス抗イヌPD−1のCDRの7つのセットの配列、例えば1B5、2G9、2H9、3B6、4D12、5G5および7C9が提供される、以下の表2参照]。

0127

他の実施形態では、本発明は、まだ所望の結合特性および機能特性を示す一方で、PD−1に特異的に結合し、ならびに配列番号:13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25および/または26のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、98%または99%の配列同一性を含む1から6個の異なるCDRを含有するイヌ抗体κ軽鎖ならびに配列番号:27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38および/または146のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、98%または99%の配列同一性を含む1から6個の異なるCDRを含有するイヌ抗体重鎖IgGを有する、抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。別の実施形態では、本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、まだ所望の結合特性および機能特性を示す一方で、0、1、2、3、4または5個の保存的または非保存的アミノ酸置換を有する前述したCDRアミノ酸配列の1またはそれ以上を有するκ軽鎖とIgG重鎖配列の組合せから成るイヌフレームを含有する。

0128

配列同一性は、2つの配列を最適に整列した場合に2つのポリペプチドのアミノ酸が等しい位置において同じである程度を指す。本明細書で使用される場合、あるアミノ酸配列は、2番目のアミノ酸配列に対して、両方の配列のアミノ酸残基が同一である場合100%「同一」である。したがって、2つのアミノ酸配列のアミノ酸残基の50%が同一である場合、あるアミノ酸配列は2番目のアミノ酸配列に50%「同一」である。配列比較は、所与のタンパク質、例えば比較されるタンパク質またはポリペプチドの一部分に含まれるアミノ酸残基の連続するブロックにわたって実施される。特定の実施形態では、さもなければ2つのアミノ酸配列の間の対応性を変化させ得る選択された欠失または挿入を考慮に入れる。

0129

配列類似性は、同一の残基および非同一の生化学的に関連するアミノ酸を包含する。類似の特性を共有し、交換可能であり得る生化学的に関連するアミノ酸が考察される。

0130

「保存的に修飾された変異体」または「保存的置換」は、タンパク質中のアミノ酸の、類似の性質(例えば電荷、側鎖サイズ疎水性親水性骨格立体配座および剛性等)を有する他のアミノ酸による置換であって、変化がしばしばタンパク質の生物学的活性を変化させずに行われ得る置換を指す。当業者は、一般に、ポリペプチドの非必須領域内の1個のアミノ酸置換は生物学的活性を実質的に改変しないことを認識する。[例えばWatson et al.,Molecular Biology of the Gene,The Benjamin/Cummings Pub.Co.,p.224(4th Ed.;1987)参照]。加えて、構造的または機能的に類似のアミノ酸の置換は生物学的活性を破壊する可能性がより低い。例示的な保存的置換をすぐ下の表Iに示す。

0131

本発明の抗体の機能保存的変異体も本発明によって企図される。「機能保存的変異体」は、本明細書で使用される場合、1またはそれ以上のアミノ酸残基が所望の特性、例えば(such an)抗原親和性および/または特異性を改変することなく変化している抗体またはフラグメントを指す。そのような変異体としては、上記表Iの保存的アミノ酸置換のような、あるアミノ酸の、類似特性を有するアミノ酸による置換が含まれるが、これに限定されない。

0132

核酸
本発明はさらに、本明細書で開示されるイヌ化マウス抗イヌPD−1抗体およびその抗原結合フラグメントの免疫グロブリン鎖をコードする核酸を包含する(以下の「実施例」参照)。

0133

また、BLASTアルゴリズムによって比較を実施した場合、本明細書で提供されるCDRおよび/またはイヌcFcおよび/または抗体のアミノ酸配列と少なくとも約70%同一、好ましくは少なくとも約80%同一、より好ましくは少なくとも約90%同一、最も好ましくは少なくとも約95%同一(例えば95%、96%、97%、98%、99%、100%)であるアミノ酸配列を含有する免疫グロブリンポリペプチドをコードする核酸も本発明に包含され、ここで前記アルゴリズムのパラメータは、それぞれの参照配列全長にわたってそれぞれの配列間で最大のマッチを与えるように選択される。本発明はさらに、BLASTアルゴリズムで比較を実施した場合、参照アミノ酸配列のいずれかと少なくとも約70%類似、好ましくは少なくとも約80%類似、より好ましくは少なくとも約90%類似、最も好ましくは少なくとも約95%類似(例えば95%、96%、97%、98%、99%、100%)するアミノ酸配列を含有する免疫グロブリンポリペプチドをコードする核酸を提供し、ここで前記アルゴリズムのパラメータは、それぞれの参照配列の全長にわたってそれぞれの配列間で最大のマッチを与えるように選択される。

0134

本明細書で使用される場合、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の同一性パーセントは、アラインメントのデフォルトパラメータおよび同一性についてのデフォルトパラメータでC,MacVector(MacVector,Inc.Cary,NC27519)、VectorNTI(Informax,Inc.MD)、Oxford Molecular GroupPLC(1996)およびClustal Wアルゴリズムを使用して決定することができる。これらの市販のプログラムはまた、同じまたは類似のデフォルトパラメータを使用して配列類似性を決定するためにも使用できる。あるいは、例えばデフォルトパラメータを用いたGCG(Genetics Computer Group,Program Manual for the GCG Package,Version 7,Madison,Wisconsin)パイルアッププログラムを使用して、デフォルトフィルター条件下でのAdvanced Blast検索を用いることができる。

0135

以下の参考文献は、配列解析のためにしばしば使用されるBLASTアルゴリズムに関する:BLASTALGORITHMS:Altschul,S.F.,et al.,J.Mol.Biol.215:403−410(1990);Gish,W.,et al.,Nature Genet.3:266−272(1993);Madden,T.L.,et al.,Meth.Enzymol.266:131−141(1996);Altschul,S.F.,et al.,Nucleic AcidsRes.25:3389−3402(1997);Zhang,J.,et al.,Genome Res.7:649−656(1997);Wootton,J.C.,et al.,Comput.Chem.17:149−163(1993);Hancock,J.M.et al.,Comput.Appl.Biosci.10:67−70(1994);ALIGNMENTSCORING SYSTEMS:Dayhoff,M.O.,et al.,「A model of evolutionary change in proteins.」in Atlas of Protein Sequence and Structure,vol.5,suppl.3.M.O.Dayhoff(ed.),pp.345−352,(1978);Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,DC;Schwartz,R.M.,et al.,「Matrices for detecting distant relationships.」in Atlas of Protein Sequence and Structure,vol.5,suppl.3.」(1978),M.O.Dayhoff(ed.),pp.353−358(1978),Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,DC;Altschul,S.F.,J.Mol.Biol.219:555−565(1991);States,D.J.,et al.,Methods 3:66−70(1991);Henikoff,S.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915−10919(1992);Altschul,S.F.,et al.,J.Mol.Evol.36:290−300(1993);ALIGNMENT STATISTICS:Karlin,S.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264−2268(1990);Karlin,S.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873−5877(1993);Dembo,A.,et al.,Ann.Prob.22:2022−2039(1994);およびAltschul,S.F.「Evaluating the statistical significance of multiple distinct local alignments.」in Theoretical and Computational Methods in Genome Research(S.Suhai,ed.),pp.1−14,Plenum,New York(1997)。

0136

本発明はまた、本発明の核酸(単離された核酸を含む)を含有する発現ベクターも提供し、ここで前記核酸は、宿主細胞をベクターでトランスフェクトした場合に宿主細胞によって認識される制御配列に作動可能に連結されている。また、本発明の発現ベクターを含有する宿主細胞ならびに本明細書で開示される抗体またはその抗原結合フラグメントを作製する方法であって、抗体または抗原結合フラグメントをコードする発現ベクターを保有する宿主細胞を培地で培養することおよび抗原またはその抗原結合フラグメントを宿主細胞または培地から単離することを含む方法も提供される。

0137

例えば、イヌ化マウス抗イヌPD−1抗体は、当分野で公知の方法によって組換え技術で作製することができる。本明細書で開示される抗体またはフラグメントの発現のための宿主として使用可能な哺乳動物細胞株は当分野で周知であり、アメリカ培養細胞系統保存機関(American Type Culture Collection)(ATCC)から入手可能な多くの不死化細胞株が含まれる。これらには、中でも特に、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、NSO、SP2細胞、HeLa細胞ベビーハムスター(BHK)細胞、サル腎細胞(COS)、ヒト肝細胞癌細胞(例えばHep G2)、A549細胞、3T3細胞、HEK−293細胞および多くの他の細胞株が含まれる。哺乳動物宿主細胞としては、ヒト、マウス、ラット、イヌ、サルブタヤギウシウマおよびハムスター細胞が含まれる。特に好ましい細胞株は、いずれの細胞株が高発現レベルを有するかを測定することを通して選択される。使用し得る他の細胞株は、昆虫細胞、例えばSf9細胞、両生類細胞、細菌細胞植物細胞および真菌細胞である。重鎖またはその抗原結合部分もしくはフラグメント、軽鎖および/またはその抗原結合フラグメントをコードする組換え発現ベクターを哺乳動物宿主細胞に導入する場合、宿主細胞における抗体の発現または、より好ましくは宿主細胞が増殖する培地中への抗体の分泌を可能にするのに十分な期間宿主細胞を培養することによって抗体が産生される。

0138

抗体は、標準的なタンパク質精製方法を用いて培地から回収することができる。さらに、産生細胞株からの本発明の抗体(またはそれに由来する他の成分)の発現は、多くの公知の技術を用いて増強することができる。例えばグルタミンシンテターゼ遺伝子発現系(GS系)は、特定の条件下で発現を増強するための一般的なアプローチである。GS系は、欧州特許第0216846号、同第0256055号および同第0323997号ならびに欧州特許出願第89303964.4号に関連して全体的にまたは部分的に考察される。

0139

一般に、特定の細胞株またはトランスジェニック動物において産生される糖タンパク質は、その細胞株またはトランスジェニック動物で産生される糖タンパク質に特徴的なグリコシル化パターンを有する。それゆえ、抗体の特定のグリコシル化パターンは、抗体を作製するのに使用される特定の細胞株またはトランスジェニック動物に依存する。しかし、本明細書で提供される核酸分子によってコードされるまたは本明細書で提供されるアミノ酸配列を含有するすべての抗体は、抗体が有し得るグリコシル化パターンに関わりなく、本発明を構成する。同様に、特定の実施形態では、非フコシル化N−グリカンだけを含むグリコシル化パターンを有する抗体は、これらの抗体が、典型的にはインビトロおよびインビボの両方でそれらのフコシル化対応物よりも強力な効果を発揮することが示されているため、好都合であり得る[例えばShinkawa et al.,J.Biol.Chem.278:3466−3473(2003);米国特許第6,946,292号および同第7,214,775号参照]。

0140

本発明はさらに、本明細書で開示されるイヌ化マウス抗イヌPD−1抗体の抗体フラグメントを包含する。抗体フラグメントには、例えばペプシンによるIgGの酵素切断によって生成し得るF(ab)2フラグメントが含まれる。Fabフラグメントは、例えばジチオトレイトールまたはメルカプトエチルアミンでのF(ab)2の還元によって生成し得る。Fabフラグメントは、ジスルフィド架橋によってVH−CH1鎖に付加されたVL−CL鎖である。F(ab)2フラグメントは、今度は2つのジスルフィド架橋によって付加された2つのFabフラグメントである。F(ab)2分子のFab部分は、その間にジスルフィド架橋が位置するFc領域の一部分を含む。FVフラグメントはVLまたはVH領域である。

0141

1つの実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは、重鎖定常領域、例えばイヌ定常領域、例えばIgGA、IgGB、IgGCおよびIgGDイヌ重鎖定常領域またはその変異体を含有する。別の実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは、軽鎖定常領域、例えばイヌ軽鎖定常領域、例えばλまたはκイヌ軽鎖領域またはその変異体を含有する。限定ではなく例として、イヌ重鎖定常領域はIgGBに由来することができ、イヌ軽鎖定常領域はκに由来し得る。

0142

抗体エンジニアリング
本発明のイヌ化マウス抗イヌPD−1抗体は、以下で詳述するように、例えば抗体の特性を改善するために、親(すなわちイヌ)モノクローナル抗体のイヌフレーム内に修飾を含有するように操作することができる。

0143

本明細書で論じる交差ブロックイヌ化抗体およびその抗原結合フラグメントは、標準的な結合アッセイ(例えば以下で例示するようなBIACore(登録商標)、ELISA、またはフローサイトメトリ)においてIB5、3B6、4D12、7C9、2H9、5G5および/または2G9のいずれかと交差競合するそれらの能力に基づいて同定することができる。例えば標準的なELISAアッセイが使用でき、このアッセイでは、組換えイヌPD−1タンパク質をプレート上に固定化し、抗体の1つを蛍光標識して、標識抗体の結合を競合除去する非標識抗体の能力を評価する。加えてまたは選択的に、BIACore(登録商標)分析を使用して交差競合する抗体の能力を評価することができる。例えばIB5、3B6、4D12、7C9、2H9、5G5および/または2G9のイヌPD−1への結合を阻害する試験抗体の能力は、試験抗体がイヌPD−1への結合に関してIB5、3B6、4D12、7C9、2H9、5G5および/または2G9と競合することができ、したがって、一部の場合には、IB5、3B6、4D12、7C9、2H9、5G5および/または2G9と同じイヌPD−1上のエピトープに結合し得ることを明らかにする。前述したように、本発明の抗イヌPD−1抗体またはフラグメントのいずれかと同じエピトープに結合する抗体およびフラグメントも、本発明の一部を形成する。

0144

医薬組成物および投与
イヌ化マウス抗イヌPD−1抗体またはその抗原結合フラグメントの医薬または滅菌組成物を調製するために、イヌ化マウス抗イヌPD−1抗体またはその抗原結合フラグメントを医薬的に許容される担体または賦形剤と混合することができる。[例えばRemington’s Pharmaceutical SciencesおよびU.S.Pharmacopeia:National Formulary,Mack Publishing Company,Easton,PA(1984)参照]。

0145

治療薬および診断薬の製剤は、例えば凍結乾燥粉末スラリー水溶液または懸濁液の形態で許容される担体、賦形剤または安定剤と混合することによって調製し得る[例えばHardman,et al.(2001)Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics,McGraw−Hill,New York,NY;Gennaro(2000)Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Lippincott,Williams,and Wilkins,New York,NY;Avis,et al.(eds.)(1993)Pharmaceutical Dosage Forms:Parenteral Medications,Marcel Dekker,NY;Lieberman,et al.(eds.)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms:Tablets,Marcel Dekker,NY;Lieberman,et al.(eds.)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms:Disperse Systems,Marcel Dekker,NY;Weiner and Kotkoskie(2000)Excipient Toxicity and Safety,Marcel Dekker,Inc.,New York,NY参照]。1つの実施形態では、本発明の抗PD−1抗体を酢酸ナトリウム溶液pH5〜6中で適切な濃度に希釈し、張度のためにNaClまたはスクロースを添加する。安定性を高めるためにポリソルベート20またはポリソルベート80などの付加的な作用物質を添加してもよい。

0146

単独でまたは別の作用物質と併用して投与される、抗体組成物の毒性および治療効果は、例えばLD50(母集団の50%に致死的な用量)およびED50(母集団の50%において治療的に有効な用量)を決定するために、細胞培養物または実験動物において標準的な薬学手順によって決定することができる。毒性作用と治療効果の用量比治療指数(LD50/ED50)である。特定の態様では、高い治療指数を示す抗体が望ましい。これらの細胞培養アッセイおよび動物試験から得られるデータは、イヌにおける使用のための投与量範囲を設定するのに使用できる。そのような化合物の投与量は、好ましくはほとんどまたは全く毒性を伴わないED50を含む循環濃度の範囲内にある。投与量は、使用される剤形および投与経路に依存してこの範囲内で変化させ得る。

0147

投与の方法は様々であり得る。適切な投与経路には、経口、直腸、経粘膜、腸、非経口筋肉内、皮下、皮内、内、髄腔内、直接脳室内静脈内、腹腔内、内、眼内、吸入通気、局所、皮膚、経皮または動脈経路が含まれる。

0148

特定の実施形態では、イヌ化マウス抗イヌPD−1抗体またはその抗原結合フラグメントは、注射などの侵襲的経路によって投与することができる。本発明のさらなる実施形態では、マウス抗イヌPD−1抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはその医薬組成物は、静脈内、皮下、筋肉内、動脈内、腫瘍内経路で、または吸入、エアロゾル送達によって投与される。非侵襲的経路(例えば経口的に;例えば丸剤カプセルまたは錠剤中で)による投与も本発明の範囲内である。

0149

本明細書で開示される医薬組成物は注入によっても投与し得る。医薬組成物を投与するための(form)周知のインプラントおよびモジュールの例としては:薬剤を制御された速度で投与するための移植可能マイクロ注入ポンプを開示する米国特許第4,487,603号、薬剤を正確な注入速度で送達するための薬剤注入ポンプを開示する米国特許第4,447,233号、持続的な薬剤送達のための可変流量の移植可能な注入装置を開示する米国特許第4,447,224号、多チャンバー区画を有する浸透圧薬物送達システムを開示する米国特許第4,439,196号が含まれる。多くの他のそのようなインプラント、送達システムおよびモジュールは当業者に周知である。

0150

あるいは、しばしばデポー製剤または持続放出製剤中で、例えば関節炎の関節または免疫病理学によって特徴付けられる病原体誘発性病変内に抗体を直接注入することによって、イヌ化マウス抗イヌPD−1抗体を全身的にではなく局所的に投与し得る。さらに、例えば関節炎の関節または免疫病理学によって特徴付けられる病原体誘発性病変を標的とする、標的化薬物送達システム、例えば組織特異的抗体被覆されたリポソーム中で抗体を投与し得る。リポソーム罹患組織を標的とし、罹患組織によって選択的に取り込まれる。

0151

投与レジメンは、治療用抗体の血清または組織代謝回転速度、症状のレベル、治療用抗体の免疫原性、および生物学的マトリックス中の標的細胞の接近可能性を含む、いくつかの因子に依存する。好ましくは、投与レジメンは、同時に望ましくない副作用を最小限に抑えつつ、標的疾患部位において改善を生じさせるのに十分な治療用抗体を送達する。したがって、送達される生物学的製剤の量は、一部には特定の治療用抗体および処置される状態の重症度に依存する。治療用抗体の適切な用量を選択するうえでの指針が入手可能である[例えばWawrzynczak Antibody Therapy,Bios Scientific Pub.Ltd,Oxfordshire,UK(1996);Kresina(ed.)Monoclonal Antibodies,Cytokines and Arthritis,Marcel Dekker,New York,NY(1991);Bach(ed.)Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases,Marcel Dekker,New York,NY(1993);Baert,et al.New Engl.J.Med.348:601−608(2003);Milgrom et al.New Engl.J.Med.341:1966−1973(1999);Slamon et al.New Engl.J.Med.344:783−792(2001);Beniaminovitz et al.New Engl.J.Med.342:613−619(2000);Ghosh et al.New Engl.J.Med.348:24−32(2003);Lipsky et al.New Engl.J.Med.343:1594−1602(2000)参照]。

0152

適切な用量の決定は、例えば処置に影響を及ぼすことが当分野で公知であるまたは影響を及ぼすと推測されるパラメータまたは因子を使用して、獣医(veteranarian)によって行われる。一般に、用量は、最適用量よりいくぶん低い量から開始して、その後負の副作用と比較して所望のまたは最適の効果が達成されるまで少しずつ増量する。重要な診断尺度には、例えば炎症の症状の尺度または産生される炎症性サイトカインのレベルが含まれる。

0153

本明細書で開示される抗体またはその抗原結合フラグメントは、持続注入によって、または例えば1日1回、週に1〜7回、週1回、隔週に1回、月1回、隔月に1回、3か月に1回、半年に1回、年1回等で投与される用量によって提供され得る。用量は、例えば静脈内、皮下、局所、経口、経鼻、直腸、筋肉内、大脳内、髄腔内投与または吸入によって提供され得る。1週間の総用量は、一般に少なくとも0.05μg/kg体重、より一般的には少なくとも0.2μg/kg、0.5μg/kg、1μg/kg、10μg/kg、100μg/kg、0.25mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg、5.0mg/ml、10mg/kg、25mg/kg、50mg/kgまたはそれ以上である[例えばYang,et al.New Engl.J.Med.349:427−434(2003);Herold,et al.New Engl.J.Med.346:1692−1698(2002);Liu,et al.J.Neurol.Neurosurg.Psych.67:451−456(1999);Portielji,et al.Cancer Immunol.Immunother.52:133−144(2003)参照]。用量はまた、被験体の血清中でイヌ化マウス抗イヌPD−1抗体のあらかじめ定められた標的濃度、例えば0.1、0.3、1、3、10、30、100、300μg/mlまたはそれ以上を達成するように提供され得る。他の実施形態では、本発明のイヌ化マウス抗イヌPD−1抗体は週1回、隔週に1回、「4週間に1回」、月1回、隔月に1回または3か月に1回ベースで、10、20、50、80、100、200、500、1000または2500mg/被験体で皮下または静脈内経路によって投与される。

0154

本明細書で使用される場合、「阻害する」または「処置する」または「処置」は、障害に関連する症状の発現の先送りおよび/またはそのような障害の症状の重症度の軽減を包含する。これらの用語は、既存の制御されないまたは望ましくない症状を改善すること、付加的な症状を予防すること、およびそのような症状の基礎となる原因を改善または予防することをさらに包含する。したがって、これらの用語は、障害、疾患もしくは症状を有する、またはそのような障害、疾患もしくは症状を発現する潜在的可能性を有する脊椎動物被験体に有益な結果が与えられていることを意味する。

0155

本明細書で使用される場合、「治療有効量」、「治療有効用量」および「有効量」という用語は、単独でまたは付加的な治療薬と併用して細胞、組織または被験体に投与された場合、疾患もしくは状態の1もしくはそれ以上の症状またはそのような疾患もしくは状態の進行の測定可能な改善を生じさせるのに有効な、本発明のイヌ化マウス抗イヌPD−1抗体またはその抗原結合フラグメントの量を指す。治療有効用量はさらに、症状の少なくとも部分的な改善、例えば関連する医学的状態の処置、治癒、予防もしくは改善、またはそのような状態の処置、治癒、予防もしくは改善の速度の増大をもたらすのに十分な結合化合物の量を指す。単独で投与される個々の有効成分に適用される場合、治療有効用量はその成分単独を指す。組合せに適用される場合、治療有効用量は、併用して、連続的にまたは同時に投与されるかどうかにかかわらず、治療効果をもたらす有効成分の総計量を指す。治療薬の有効量は、診断尺度またはパラメータの少なくとも10%、通常は少なくとも20%、好ましくは少なくとも約30%、より好ましくは少なくとも40%、最も好ましくは少なくとも50%の改善をもたらす。有効量はまた、疾患の重症度を評価するのに主観的尺度を用いる場合は、主観的尺度の改善ももたらすことができる。

0156

他の併用療法
先に述べたように、イヌ化マウス抗イヌPD−1抗体もしくはその抗原結合フラグメントは、1またはそれ以上の他の治療薬(例えば化学療法剤)と同時投与し得る。抗体を他の治療薬に連結してもよく(免疫複合体として)または他の治療薬とは別に投与することができる。後者(別々の投与)の場合は、抗体を他の治療薬の前、後もしくは治療薬と同時に投与することができるかまたは他の公知の療法と同時投与することができる。

0157

キット
さらに、PD−1に特異的に結合する、本明細書で論じる抗体または抗原結合フラグメント(例えばイヌ化マウス抗イヌPD−1抗体またはその抗原結合フラグメント)を含むがこれらに限定されない1またはそれ以上の成分を、本明細書で論じる、医薬的に許容される担体および/または化学療法剤を含むがこれらに限定されない1またはそれ以上の付加的な成分と共に含有するキットが提供される。結合組成物および/または化学療法剤は、純粋な組成物としてまたは医薬的に許容される担体と組み合わせて医薬組成物に製剤することができる。

0158

1つの実施形態では、キットは、本発明の結合組成物(例えば、1つの容器中(例えば滅菌ガラスまたはプラスチックバイアル中)にイヌ化マウス抗イヌPD−1抗体またはその医薬組成物ならびに別の容器中(例えば滅菌ガラスまたはプラスチックバイアル中)にその医薬組成物および/または化学療法剤を含有する。

0159

キットが被験体への非経口投与用の医薬組成物を含む場合、キットは、そのような投与を実施するための装置も含有することができる。例えばキットは、上記で論じた1またはそれ以上の皮下針または他の注射装置を含有し得る。キットはまた、キット中の医薬組成物および剤形に関する情報を含む添付文書も含有することができる。一般に、そのような情報は、ペット飼い主および獣医(veteranarian)が同封されている医薬組成物および剤形を有効かつ安全に使用するのに役立つ。例えば本発明の組合せに関する以下の情報が添付文書中で提供され得る:薬物動態、薬力学臨床試験効果パラメータ適応症および用法、禁忌、警告、使用上の注意有害反応、過量、適切な用量および投与、供給方法、適切な保存条件、参考文献、製造者配給者情報ならびに特許情報

0160

便宜上、本明細書で開示される抗体または特定の結合物質は、キット中で、すなわち診断または検出アッセイを実施するための指示書と共に所定量の試薬の包装された組合せで提供され得る。抗体が酵素で標識されている場合、キットは、基質および酵素が必要とする補因子(例えば検出可能な発色団または発蛍光団を提供する基質前駆体)を含有する。加えて、他の添加物、例えば安定剤、緩衝液(例えばブロック緩衝液または溶解緩衝液)等が含まれてもよい。様々な試薬の相対的な量は、アッセイの感受性を実質的に最適化する試薬の溶液中の濃度を提供するように広く異なり得る。特に、試薬は、溶解後に適切な濃度を有する試薬溶液を提供する賦形剤を含有する、通常は凍結乾燥された、乾燥粉末として提供され得る。

0161

[実施例]
[実施例1]
イヌPD−1およびPD−L1
イヌPD−1およびPD−L1:
その全体が参照により本明細書に組み込まれる、2013年12月20日出願の米国特許仮出願第61/918,946号は、配列番号:113のイヌPD−1(cPD−1)についての完全長ヌクレオチド配列[配列番号:133はシグナル配列を含む];配列番号:114の対応する翻訳されたアミノ酸配列[配列番号:134はシグナル配列を含む];イヌPD−1の細胞外ドメイン(ECD)をコードするヌクレオチド配列、配列番号:115;イヌPD−1のECDのアミノ酸配列、配列番号:116;配列番号:117の、イヌPD−1 ECDプラスGTリンカーおよびヒトIgG1 Fc遺伝子のFc部分のヌクレオチド配列;ならびにイヌPD−1 ECDプラスGTリンカーおよびヒトIgG1 Fc遺伝子のFc部分のアミノ酸配列、配列番号:118[配列番号:137はシグナル配列を含む]を提供する。

0162

米国特許仮出願第61/918,946号はさらに、配列番号:119のイヌPD−L1(cPD−L1)についての完全長ヌクレオチド配列[配列番号:135はシグナル配列を含む];配列番号:120の対応する翻訳されたアミノ酸配列[配列番号:136はシグナル配列を含む];イヌPD−L1の細胞外ドメイン(ECD)をコードするヌクレオチド配列、配列番号:121;イヌPD−L1のECDのアミノ酸配列、配列番号:122;イヌPD−L1 ECDプラスGTリンカーおよびヒトIgG1 Fc遺伝子のFc部分のヌクレオチド配列、配列番号:123;ならびにイヌPD−L1 ECDプラスGTリンカーおよびヒトIgG1 Fc遺伝子のFc部分のアミノ酸配列、配列番号:124を提供する。

0163

[実施例2]
マウス抗イヌPD−1抗体
抗イヌPD−1モノクローナル抗体の作製:
合計3匹のBalb/cマウスを17日間にわたって複数回免疫した(毎回10μgで)。免疫する抗原はイヌPD−1 ECD−Fc融合タンパク質であった。免疫後、各々のマウスから血清を採取し、イヌPD−1 ECD−HISタグタンパク質との反応性に関して試験した。最も高い血清抗PD−1 ECD−HIS力価を有するマウスの脾細胞骨髄腫P3X63Ag8.653細胞株に融合した。融合の約2週間後に、推定上のハイブリドーマ細胞からの上清を、PD−1 ECD−HISタグタンパク質に対するそれらの反応性に関してELISAによって試験した。ELISAにおいて強い陽性シグナルを生じるハイブリドーマを限界希釈によってサブクローニングし、イヌPD−1 ECD−HISタグタンパク質に対する反応性に関して再び試験した。

0164

イヌPD−1に対するモノクローナル抗体の反応性の確認:
ハイブリドーマによって分泌される抗体の、イヌPD−1のECDに対する反応性をELISAによって確認した。ハイブリドーマ細胞を、CELLineバイオリアクター(Integra−biosciences)を使用して10〜30日間培養した。細胞を最初に、4mM L−グルタミンおよびGibcoからの10%Ultra LowIgGウシ胎仔血清(FBS)を添加したDMEM中で維持した。ハイブリドーマ細胞を、FBS濃度を20%に増加した同じ培地15mL中約2×106細胞/mLの細胞密度でCELLineバイオリアクターの細胞チャンバー接種した。外側チャンバー栄養培地(4mM L−グルタミンおよび2%標準FBSを添加したDMEM)1Lを満たした。細胞チャンバー中のハイブリドーマ細胞を3〜7日間かけて約2.5×107細胞/mLに増殖させた。次に、細胞懸濁液10mLを細胞チャンバーから採取し、新鮮培地と交換して、細胞を再増殖させ、その後採取した。この手順を必要に応じて反復し、各ハイブリドーマクローンから適切な量のmAbを得た。採取した細胞懸濁液を遠心分離し、上清を0.2ミクロンフィルター膜でろ過した。抗体精製のために、各クローンの上清を、Protein G Sepharose 4 Fast flow 5mLカラム(GE Healthcare)を使用して重力流によって精製した。Tris−EDTA(TE)緩衝液pH8.0で洗浄した後、0.1Mグリシン緩衝液、pH2.7を使用して結合抗体溶出し、次いで1M Tris、pH8.0を使用してpHを中和した。抗体を濃縮し、Centriprep YM−10、10kDa NMWL遠心分離フィルタユニット(Millipore)を使用して緩衝液をリン酸緩衝生理食塩水PBS)に交換した。分光測光法を用いて抗体濃度を定量した。

ページトップへ

この技術を出願した法人

この技術を発明した人物

ページトップへ

関連する挑戦したい社会課題

関連する公募課題

該当するデータがありません

ページトップへ

技術視点だけで見ていませんか?

この技術の活用可能性がある分野

分野別動向を把握したい方- 事業化視点で見る -

(分野番号表示ON)※整理標準化データをもとに当社作成

ページトップへ

おススメ サービス

おススメ astavisionコンテンツ

新着 最近 公開された関連が強い技術

この 技術と関連性が強い人物

関連性が強い人物一覧

この 技術と関連する社会課題

関連する挑戦したい社会課題一覧

この 技術と関連する公募課題

該当するデータがありません

astavision 新着記事

サイト情報について

本サービスは、国が公開している情報(公開特許公報、特許整理標準化データ等)を元に構成されています。出典元のデータには一部間違いやノイズがあり、情報の正確さについては保証致しかねます。また一時的に、各データの収録範囲や更新周期によって、一部の情報が正しく表示されないことがございます。当サイトの情報を元にした諸問題、不利益等について当方は何ら責任を負いかねることを予めご承知おきのほど宜しくお願い申し上げます。

主たる情報の出典

特許情報…特許整理標準化データ(XML編)、公開特許公報、特許公報、審決公報、Patent Map Guidance System データ