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技術 菌体外多糖産生量の促進方法

出願人 日清食品ホールディングス株式会社国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構
発明者 大羽哲郎植村邦彦鍋谷浩志
出願日 2016年6月7日 (4年6ヶ月経過) 出願番号 2016-113250
公開日 2017年12月14日 (3年0ヶ月経過) 公開番号 2017-216926
状態 特許登録済
技術分野 微生物による化合物の製造 酵素,微生物の固定化,処理
主要キーワード 移送スピード 致命傷 背圧バルブ 外側絶縁 パルス回数 充電用抵抗 電界処理 電界パルス
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2017年12月14日)のものです。
また、この項目は機械的に抽出しているため、正しく解析できていない場合があります

図面 (8)

課題

微生物における菌体外多糖産生量を促進させるための方法を提供する。

解決手段

微生物における菌体外多糖産生量を促進させるための方法は、菌体外多糖産生微生物パルス電界処理を行う。このとき、パルス電界処理の条件として、電界強度が10kV/cm未満であり、培養液1lあたりのパルス幅パルス回数との積算値が1400〜1500[μs・回]が好ましい。また微生物としては、菌体外多糖産生能を有する乳酸菌であって、球菌であることが好ましい。

概要

背景

近年、乳酸菌菌体外に産生する多糖(exopolysaccharide;EPS)の生理活性作用に注目が集まっている。

EPSの有する生理活性としては、ビフィズス菌などの栄養源となるプレバイオティクス効果や、免疫系の賦活効果などが知られている。ここで、プレバイオティクスとは、イヌリンなどの多糖、フルクトオリゴ糖ガラクトオリゴ糖のことである。プレバイオティクスは有用なビフィズス菌の生育を促して短鎖脂肪酸の生成を増進させる効果を有する。

ところで、EPSは乳酸菌の発酵過程において産生される。EPSの産生量を増やすためには、適当な発酵条件を整えるか、特殊な発酵調整剤を用いるなどして、発酵を制御する必要がある。しかし、発酵物をそのまま製品として用いる場合、特殊な発酵調整剤を用いることはできない。また、適当な発酵条件とは言っても、発酵温度や発酵時間を制御する程度が限界であった。

概要

微生物における菌体外多糖産生量を促進させるための方法を提供する。微生物における菌体外多糖産生量を促進させるための方法は、菌体外多糖産生微生物パルス電界処理を行う。このとき、パルス電界処理の条件として、電界強度が10kV/cm未満であり、培養液1lあたりのパルス幅パルス回数との積算値が1400〜1500[μs・回]が好ましい。また微生物としては、菌体外多糖産生能を有する乳酸菌であって、球菌であることが好ましい。なし

目的

効果

実績

技術文献被引用数
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牽制数
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請求項1

微生物における菌体外多糖産生量を促進させるための方法であって、菌体外多糖産生微生物パルス電界処理を行う、菌体外多糖産生量の促進方法

請求項2

パルス電界処理の条件において、電界強度が10kV/cm未満であり、培養液1lあたりのパルス幅と総パルス回数との積算値が1400〜1500[μs・回]である、請求項1記載の菌体外多糖産生量の促進方法。

請求項3

パルス電界処理を前記菌体外多糖産生微生物の対数増殖期中期から後期にかけて行う、請求項1または2に記載の菌体外多糖産生量の促進方法。

請求項4

パルス電界処理時間が2時間以上4時間以下である、請求項1乃至3のいずれか一項に記載の菌体外多糖産生量の促進方法。

請求項5

前記菌体外多糖産生微生物の菌体外多糖産生量が、パルス電界処理を行わない場合に比べて、1.5倍以上である、請求項1乃至4のいずれか一項に記載の菌体外多糖産生量の促進方法。

技術分野

0001

本発明は、菌体外多糖産生量の促進方法に関する。

背景技術

0002

近年、乳酸菌菌体外に産生する多糖(exopolysaccharide;EPS)の生理活性作用に注目が集まっている。

0003

EPSの有する生理活性としては、ビフィズス菌などの栄養源となるプレバイオティクス効果や、免疫系の賦活効果などが知られている。ここで、プレバイオティクスとは、イヌリンなどの多糖、フルクトオリゴ糖ガラクトオリゴ糖のことである。プレバイオティクスは有用なビフィズス菌の生育を促して短鎖脂肪酸の生成を増進させる効果を有する。

0004

ところで、EPSは乳酸菌の発酵過程において産生される。EPSの産生量を増やすためには、適当な発酵条件を整えるか、特殊な発酵調整剤を用いるなどして、発酵を制御する必要がある。しかし、発酵物をそのまま製品として用いる場合、特殊な発酵調整剤を用いることはできない。また、適当な発酵条件とは言っても、発酵温度や発酵時間を制御する程度が限界であった。

先行技術

0005

特開2009−225722号公報

発明が解決しようとする課題

0006

本発明は上記問題点を鑑みてなされたものである。本発明者らは、EPSの産生量を増やすための新たな手法について、鋭意検討を行った。そして、発酵中の菌体外多糖産生微生物に対してパルス電界処理を与えることでEPSの産生量を増やすことができることを見出し、本発明を完成させるに至った。

課題を解決するための手段

0007

前記した目的を達成するため、微生物における菌体外多糖産生量を促進させるための方法であって、前記菌体外多糖産生微生物にパルス電界処理を行うことを特徴とする。

0008

かかる構成によれば、複雑な装置を必要としない一工程を追加するだけで、菌体外多糖産生量を増加させることができる。また、発酵調整剤を用いないため、発酵物をそのまま製品として用いることができる。

0009

ここで、本発明でいう「発酵」とは、代謝過程のみならず、微生物の増殖過程も含みうる概念である。

0010

前記した菌体外多糖産生量の促進方法においては、パルス電界処理の条件が、電界強度が10kV/cm未満であり、培養液1lあたりのパルス幅パルス回数との積算値が1400〜1500[μs・回]である。

0011

かかる構成によれば、菌体外多糖産生微生物における電気穿孔を低く抑えながら、なおかつ菌体外多糖を増産させることができる。これは、菌体外多糖産生微生物にとって致命傷ではないが、静電気的な刺激となって菌体外多糖類の産生が促進されたものと考えられる。

0012

前記した菌体外多糖産生量の促進方法は、パルス電界処理を前記菌体外多糖産生微生物の対数増殖期中期から後期にかけて行うことが望ましい。

0013

かかる構成によれば、ある程度増殖が進行して多糖が活発に産生されている最中にパルス処理による静電気的な刺激を与えることで、その生合成メカニズムを促進させることができるためと考えられる。

発明の効果

0014

本発明によれば、新たに一工程増やすだけでEPSの産生量を増やすことができる。また、特殊な発酵調整剤を用いないので、発酵物をそのまま製品として用いることができる。

図面の簡単な説明

0015

本発明で用いるパルス電界処理装置の概略説明図である。
本発明で用いるパルス電界フローセルの分解斜視図である。
実験1において、菌体数の変化を経時的に測定した結果である。
実験1において、多糖産生量を経時的に測定した結果である。
実験2において、菌体数の変化を経時的に測定した結果である。
実験2において、多糖産生量を経時的に測定した結果である。
実験3において、菌体数の変化を経時的に測定した結果である。
実験3において、多糖産生量を経時的に測定した結果である。

0016

以下、本発明を実施するための好適な形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものである。

0017

本発明に用いることができる微生物としては、菌体外多糖を産生する能力を有する微生物であることが好ましく、さらに球菌であることが好ましい。菌体外多糖を産生する能力を有する微生物としては、Streptococcus属やLactococcus属が挙げられる。このうち、球菌であるLactococcus属が特に好ましい。

0018

本発明で用いる微生物は、対数増殖期中期から後期かけて多糖を活発に生産しているものであることが好ましい。一例としてLactococcus lactisを例に挙げると、14〜24時間発酵させたものに対して行うことが好ましく、16〜22時間発酵させたものに対して行うことがより好ましい。14時間未満の微生物では、菌体外多糖の産生量が少なくなってしまう。これは、菌体の代謝が多糖の生合成へとシフトしていないために効果が十分に得られないか、そもそもパルス電界処理によって効果を発揮する菌体数が少ないためと考えられる。

0019

次に、本発明で用いるパルス電界処理装置について、図1および図2を参照しながら説明する。なお、図1は本発明にかかるパルス電界処理装置の概略説明図である。図2は、パルス発生装置の構成を示す分解斜視図である。

0020

図1に示すように、本発明に用いるパルス電界処理装置1は、送液ポンプ10と、パルス発生装置20と、冷却コイル30と、背圧バルブ40と、各装置をつなぐホース50と、で構成される。

0021

また、本発明においては、パルス発生装置20にCR放電回路を用いた。この回路は、主に充電用抵抗コンデンサ、スイッチ、パルス電界フローセル200で構成される。

0022

本発明で用いるパルス電界フローセル200は、図2に示すように、7枚の板(金属板4枚と絶縁板3枚)から構成されている。具体的には、絶縁プレート210を中心に、電極プレート220、外側絶縁プレート230、ホールドプレート240の順に絶縁板と金属板が交互に配置されている。そして、電極プレート220に電圧負荷される構造となっている。

0023

ここで、金属板の組成としては、各種の金属を用いることができる。このうち、耐電食性耐酸性、また金属が有する殺菌作用を考慮すると鉄やステンレスが好ましい。また、絶縁板は絶縁できて、耐腐食性を備えるものであれば特に制限されない。絶縁板はテフロン登録商標)加工されていることが好ましい。

0024

また、電極プレート220、外側絶縁プレート230、ホールドプレート240の厚みについては特に制限されず、電気の絶縁とスパークの防止ができる程度の厚みがあれば良い。一方、絶縁プレート210の厚みは電極間の距離を決めるものであり、菌体に付与する電界を決定する上で重要となる。本発明においては、1mmあたり1.0kV未満の電圧を印加できるように、パルス発生装置1の電圧出力能力に応じて絶縁プレートの厚みを適宜決定することが好ましい。

0025

図2に示すように、本発明にかかるパルス電界フローセル200には、電極内に微生物を導くための切欠きが設けられている。すなわち、電極プレート220に挟まれた絶縁プレート210の切欠き構造が電界チャンバー役割を果たす。本発明では、微生物が電極間を通過する際にパルス電界処理が行われる。

0026

また、微生物を電極内へ注入する注入口は、板の中心よりもやや下に設けられている。一方、微生物を電極内から排出する排出口は、板の中心よりもやや上に設けられている。このような構成とすることで確実に微生物にパルス電界処理を施すことができる。なお、切欠きの上下方向における各末端は、注入口の下端および排出口の上端を超えない範囲にあることが好ましい。好ましくは切欠きの上下方向における各末端と、注入口の下端および排出口の上端が同じ位置にあることが好ましい。

0027

ここで、微生物注入口の上端と微生物排出口の下端との高低差は、電極間通過中に印加するパルス回数や、パルス周期により定めることができる。本発明においては10mm〜15mm程度あることが好ましい。

0028

次に、図1を参照しながらパルス電界処理方法について説明する。まず、タンク内で微生物を発酵させる。このとき、微生物の対数増殖期中期から後期まで発酵させることが好ましい。次に、発酵した微生物を送液ポンプ10で吸引し、パルス発送装置20に移送する。このとき、送液ポンプ10の速度としては、電界チャンバーの容量と電極間通過中に印加するパルスの回数に応じて速度をコントロールする。本発明では60〜70ml/minの範囲であることが好ましい。

0029

次に、パルス発生装置20に送られた微生物に対してパルス電界処理を行う。パルス電界処理条件の一例としては、印加電圧7〜9kV/cm、パルス幅1μs、1回のセル通過当たり25回のパルス照射が挙げられる。なお、「1回のセル通過」とは、タンク内の培養液全てをパルス電界フローセル200に通過させることを意味する。

0030

ここで、パルス幅や処理回数は特に制限されず、パルス幅と総パルス処理回数との積算値が1400〜1500[μs・回]を満たす範囲で適宜変更可能である。また、パルス処理により菌体の細胞膜透過性が10%程度の上昇に留められるパルス幅とパルス処理回数であることが好ましい。例えば、10μsのパルス幅を用いる場合には、培養液1lあたりの総パルス回数を140〜150回とすればよい。一方、1psのパルス幅を用いる場合には、総パルス回数を14×108〜15×108回とすればよい。なお、パルス幅と総パルス回数との積算値が1400〜1500[μs・回]を超えない範囲において、パルス電界処理中にパルス電界処理条件を変更しても良い。

0031

本発明で用いるパルス波形は特に制限されず、正弦波矩形波三角波鋸歯状波波形であってもよい。さらに、パルス電界処理は、単極処理でも双極処理で行ってもよい。

0032

次に、パルス電界処理された微生物は冷却コイルへ30と導かれ、冷却される。冷却温度は、最適培養条件と同じ温度であることが好ましい。冷却された微生物はタンク内に戻され、パルス発生装置20へと再び送られる。これを繰り返し行い、培養液1lあたりのパルス幅と総パルス処理回数との積算値が1400〜1500[μs・回]になるまで繰り返し処理することが好ましい。なお、所定のパルス回数を処理するまでの時間(パルス電界処理時間)は送液ポンプ10の速度で調整可能であり、微生物の対数増殖スピードに応じて決めることができる。本発明においては、増殖が定常期に至るまでの2〜4時間にかけて行うことが好ましい。

0033

以下、実施例に基づいて本発明を更に詳細に説明する。

0034

(菌の同定)
本実施例では、まず用いる菌の同定を行った。市販のカスピ海ヨーグルトスターターカルチャーから菌を単離した。次に、単離した菌から多糖類産生能の高い菌を選び、16SrRNAとgadB geneの塩基配列を調べ、相同性から菌の同定を行った。次に、同定した菌(Lactococcus lactis ssp. cremoris株)が産生する多糖類を精製し、PMP誘導体化法によるHPLCで多糖類の組成を調べ、リン酸化多糖類を産生する菌株であることを確認した。

0035

(パルス電界処理条件の選定
次に最適な印加電圧とパルス回数について検討を行った。Lactococcus lactis ssp. cremoris株を、完全合成培地(含乳糖1%)1000mlに対して104CFU/mlとなるように植菌を行い、25℃で18時間培養した。
次に、上述の電界処理装置を用いて、パルス電界処理を1回のみ行った。このとき、パルス電界処理の条件として、電界チャンバー容積22.4μl、送液ポンプの速度を60ml/min、パルス幅1μsに固定し、印加電圧(7〜11kV/cm)とパルス回数(100〜400回/1回のセル通過)を変化させて多糖産生量の変化を調べた。なお、パルス電界処理による菌体への損傷を調べるために、プロピジウムヨウ素を用いて菌体の細胞透過性についても測定した。

0036

その結果、印加電圧8kv/cm、パルス回数200回/1回のセル通過の条件下において、多糖産生量が最も高くなった。また、菌体の細胞透過性は、8kv/cm未満で10%以下であった。そこで、以下の実験においては、印加電圧8kv/cm、パルス回数200回/1回のセル通過の条件下でパルス電界処理を行うこととした。

0037

(実験1)
Lactococcus lactis ssp. cremoris株を、完全合成培地(含乳糖1%)1000mlに対して104CFU/mlとなるように植菌を行い、25℃で18時間培養した。
次に、半量の500mlに対して上述の電界処理装置を用いて、電界処理を行った。このとき、パルス電界処理の条件は、送液ポンプの速度は60ml/min、パルス幅1μs、印加電圧8kV/cm、パルス回数25回/1回のセル通過、電界チャンバー容積22.4μl、冷却温度25℃とした。そして発酵18時間から20時間の2時間に亘ってパルス電界処理を行った。このとき、送液ポンプの移送スピードと培養液の量から、培養液は計29回セルを循環し、730回のパルス処理を受けたこととなる。20時間経過後は、28時間まで25℃で発酵させた。

0038

パルス電界処理を行った系と行っていない系の2時間ごとの菌数変化と多糖産生量の経時変化について調べた。結果を図3、4に示す。

0039

図3から明らかなように、発酵18時間以降の菌数変化はパルス処理の有無にかかわらず、ほぼ同じであった。一方、図4から明らかなように、多糖産生量の経時変化を見ると、パルス電界処理を行った系は、多糖産生量が高まっていることがわかる。具体的には、20時間以降から多糖の産生効率が高まり、発酵終点である28時間では64%産生量が高まっていた。このことから、パルス電界処理が多糖産生能に有利に作用していることが確認された。

0040

(実験2)
次に、パルス処理時間(平均パルス回数)の影響について検討を行った。実験1と同様の条件で18時間培養を行なった。このとき、完全合成培地(含乳糖1%)は1500mlであった。次に、培養液をパルス電界未処理の系、パルス電界処理を2時間(平均パルス回数365回;18〜20時間)行った系およびパルス電界処理を4時間(平均パルス回数730回;18〜22時間)行った系の3つに分けて、菌数変化と多糖類産生量の経時変化について調べた。結果を図5,6に示す。

0041

図5から明らかなように、菌数変化はパルス処理の有無にかかわらず、ほぼ同じであった。一方、多糖産生量の経時変化を見ると、図6から明らかなように、パルス処理時間が長いほど、未処理菌体と比べて多糖産生量が増加していた。具体的には、2時間処理の系では最大52%、4時間処理の系では最大94%産生量が高まっていた。このことから、パルス処理時間(平均パルス回数)が長いほど、多糖産生能に有利に作用していることが確認された。

0042

(実験3)
次に、パルス処理開始時間の影響について検討を行った。実験2と同様、完全合成培地(含乳糖1%)は1500mlを3つに分け、培養液をパルス電界未処理の系、パルス電界処理を4時間(平均パルス回数730回;16〜20時間)行った系およびパルス電界処理を4時間(平均パルス回数730回;18〜22時間)行った系の3つに分けて、菌数変化と多糖類産生量の経時変化について調べた。結果を図7,8に示す。

0043

図7から明らかなように、菌数変化はパルス処理の有無にかかわらず、ほぼ同じであった。多糖産生量の経時変化を見ると、図8から明らかなように、発酵16時間からパルス電界処理を行ったものよりも、発酵18時間を超えてからパルス電界処理を行ったものの方が、20時間以降から多糖産生効率が高まっていることがわかる。これは、発酵16時間から18時間までは菌体の代謝が多糖の生合成へと十分にシフトしていないためと考えられる。

実施例

0044

一方、発酵18時間を経過した微生物は菌体の代謝が多糖の生合成へとシフトしており、また、多糖産生の生合成のメカニズムが電界パルス処理によって促進されたことも相まって、多糖産生量が高くなったものと考えられる。なお、パルス電界未処理の系と比較すると、20時間以降から多糖産生効率が高まり、発酵終点である28時間では95%産生量が高まっていた。

0045

1パルス電界処理装置
10 送液ポンプ
20パルス発生装置
30冷却コイル
40背圧バルブ
50ホース
200パルス電界フローセル
210絶縁プレート
220電極プレート
230外側絶縁プレート
240 ホールドプレート

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