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課題

解決手段

1個もしくは複数の転写活性化因子様エフェクター(TALE)リピートドメインおよび/または1個もしくは複数のTALEリピートドメインのうち1個もしくは複数の部分をコードする配列を有する第1、及び第2の組の核酸を用意するステップと、第1の核酸を第1の酵素と、第2の核酸を第2の酵素と接触させ、各々の酵素がライゲーション可能な末端を形成し、第1および第2のライゲーション可能な末端を介して第1の核酸と第2の核酸とをライゲーションして第1のライゲーションされた核酸を作製し、第1のライゲーションされた核酸が固体支持体に連結され、第1のライゲーションされた核酸が前記第1および第2の組を含むポリペプチドをコードするステップとを含む方法。

概要

背景

キサントモナス属植物病原性細菌のTALEタンパク質は、宿主DNAに結合し、エ
フェクター特異的宿主遺伝子を活性化することによって、病害において重要な役割を果た
す、または防御を誘発する(例えば、Guら、2005、Nature 435:1122;Yangら、2006 Proc
. Natl. Acad. Sci. USA 103:10503;Kayら、2007、Science 318:648;Sugioら、2007、P
roc. Natl. Acad. Sci. USA 104:10720;およびRomerら、2007、Science 318:645を参照
のこと)。核酸配列に対する特異性は、エフェクター(様々な数の不完全な、通常約33
〜35アミノ酸リピート)に依存する(Schornackら、2006、J. Plant Physiol. 163:2
56)。各リピートは標的配列中の1個のヌクレオチドに結合し、そのヌクレオチドに対す
る各リピートの特異性は前後配列に殆ど左右されないので、専用の配列特異的TALEタ
ンパク質の開発が可能となる(Moscouら、2009、Science 326:1501;Bochら、2009、Scie
nce 326:1509-1512)。

概要

複数の転写様活性因子エフェクター(TALE)リピートドメインをコードするポリペプチド作製方法の提供。1個もしくは複数の転写活性化因子様エフェクター(TALE)リピートドメインおよび/または1個もしくは複数のTALEリピートドメインのうち1個もしくは複数の部分をコードする配列を有する第1、及び第2の組の核酸を用意するステップと、第1の核酸を第1の酵素と、第2の核酸を第2の酵素と接触させ、各々の酵素がライゲーション可能な末端を形成し、第1および第2のライゲーション可能な末端を介して第1の核酸と第2の核酸とをライゲーションして第1のライゲーションされた核酸を作製し、第1のライゲーションされた核酸が固体支持体に連結され、第1のライゲーションされた核酸が前記第1および第2の組を含むポリペプチドをコードするステップとを含む方法。なし

目的

本明細書に記載の方法は、TALEリピートの多量のPCR増幅を回避し、それによっ
PCRエラーによる変異の導入を回避することを含めた、いくつかの利点をも提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

(a)1個もしくは複数の転写活性化因子エフェクター(TALEリピートドメインおよび/または1個もしくは複数のTALEリピートドメインのうち1個もしくは複数の部分を含む第1の組をコードしている配列を含む第1の核酸を用意するステップと;(b)第1の核酸を第1の酵素と接触させ、第1の酵素が第1のライゲーション可能な末端を形成するステップと;(c)1個もしくは複数のTALEリピートドメインおよび/または1個もしくは複数のTALEリピートドメインのうち1個もしくは複数の部分を含む第2の組をコードしている配列を含む第2の核酸を用意するステップと;(d)第2の核酸を第2の酵素と接触させ、第2の酵素が第2のライゲーション可能な末端を形成し、第1および第2のライゲーション可能な末端が対合可能であるステップと;(e)第1および第2のライゲーション可能な末端を介して第1の核酸と第2の核酸とをライゲーションして第1のライゲーションされた核酸を作製し、第1のライゲーションされた核酸が固体支持体に連結され、第1のライゲーションされた核酸が前記第1および第2の組を含むポリペプチドをコードするステップとを含む方法。

請求項2

第1の組が、ポリペプチド中で第2の組に対してN末端側にある、請求項1に記載の方法。

請求項3

第2の組が、ポリペプチド中で第1の組に対してN末端側にある、請求項1に記載の方法。

請求項4

第1および第2の酵素が第1および第2の制限エンドヌクレアーゼであり、第1の制限エンドヌクレアーゼが第1の核酸中の部位で切断して第1の切断末端を形成し、第2の制限エンドヌクレアーゼが第2の核酸中の部位で切断して第2の切断末端を形成し、第1および第2のライゲーション可能な末端が第1および第2の切断末端である、請求項1に記載の方法。

請求項5

第1のライゲーションされた核酸が、第1の制限エンドヌクレアーゼに認識される制限部位を含まない、請求項4に記載の方法。

請求項6

(f)第1のライゲーションされた核酸を第3の酵素と接触させ、第3の酵素が第3のライゲーション可能な末端を形成するステップと;(g)1個もしくは複数のTALEリピートドメインおよび/または1個もしくは複数のTALEリピートドメインのうち1個もしくは複数の部分を含む第3の組をコードしている配列を含む第3の核酸を用意するステップと;(h)第3の核酸を第4の酵素と接触させ、第4の酵素が第4のライゲーション可能な末端を形成し、第3および第4のライゲーション可能な末端が対合可能であるステップと;(i)第3および第4のライゲーション可能な末端を介して第1のライゲーションされた核酸と第3の核酸とをライゲーションして、固体支持体に連結された第2のライゲーションされた核酸を作製し、第2のライゲーションされた核酸が前記第1、第2および第3の組を含むポリペプチドをコードするステップとをさらに含む、請求項1または4に記載の方法。

請求項7

第3および第4の酵素が、第3および第4の制限エンドヌクレアーゼであり、第3の制限エンドヌクレアーゼが第1のライゲーションされた核酸中の部位で切断して第3の切断末端を形成し、第4の制限エンドヌクレアーゼが第3の核酸中の部位で切断して第4の切断末端を形成し、第3および第4のライゲーション可能な末端が第3および第4の切断末端である、請求項6に記載の方法。

請求項8

ライゲーションされた核酸が、第1のエンドヌクレアーゼに認識される制限部位を含まず、第1および第3の制限エンドヌクレアーゼが同一である、請求項7に記載の方法。

請求項9

第2および第4の制限エンドヌクレアーゼが同一である、請求項7または8に記載の方法。

請求項10

(j)第2のライゲーションされた核酸を第5の酵素と接触させ、第5の酵素が第5のライゲーション可能な末端を形成するステップと;(k)1個もしくは複数のTALEリピートドメインおよび/または1個もしくは複数のTALEリピートドメインのうち1個もしくは複数の部分を含む第4の組をコードしている配列を含む第4の核酸を用意するステップと;(l)第4の核酸を第6の酵素と接触させ、第6の酵素が第6のライゲーション可能な末端を形成し、第5および第6のライゲーション可能な末端が対合可能であるステップと;(m)第5および第6のライゲーション可能な末端を介して第2のライゲーションされた核酸と第4の核酸とをライゲーションして、固体支持体に連結された第3のライゲーションされた核酸を作製し、第3のライゲーションされた核酸が前記第1、第2、第3および第4の組を含むポリペプチドをコードするステップとをさらに含む、請求項6または7に記載の方法。

請求項11

第5および第6の酵素が第5および第6の制限エンドヌクレアーゼであり、第5の制限エンドヌクレアーゼが第2のライゲーションされた核酸中の部位で切断して第5の切断末端を形成し、第6の制限エンドヌクレアーゼが第4の核酸中の部位で切断して第6の切断末端を形成し、第5および第6のライゲーション可能な末端が第5および第6の切断末端である、請求項10に記載の方法。

請求項12

第2のライゲーションされた核酸が、第1のエンドヌクレアーゼに認識される制限部位を含まず、第1、第3および第5の制限エンドヌクレアーゼが同一である、請求項11に記載の方法。

請求項13

第2、第4および第6の制限エンドヌクレアーゼが同一である、請求項11または12に記載の方法。

請求項14

第2の組が、1〜4個のTALEリピートドメインを含む、請求項1に記載の方法。

請求項15

第1および第2のライゲーション可能な末端がそれぞれ、1〜10ヌクレオチドの突出を含む、請求項1から14のいずれか一項に記載の方法。

請求項16

第1の酵素がIIS型制限エンドヌクレアーゼである、請求項1から14のいずれかに記載の方法。

請求項17

第1のライゲーションされた核酸を前記固体支持体から分離し、第1のライゲーションされた核酸をベクターに挿入することをさらに含む、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。

請求項18

第2のライゲーションされた核酸を固体支持体から分離し、第2のライゲーションされた核酸をベクターに挿入することをさらに含む、請求項6から9のいずれか一項に記載の方法。

請求項19

第3のライゲーションされた核酸を固体支持体から分離し、第3のライゲーションされた核酸をベクターに挿入することをさらに含む、請求項10から13のいずれか一項に記載の方法。

請求項20

ベクターが発現ベクターである、請求項17から19のいずれか一項に記載の方法。

請求項21

発現ベクターが、エフェクタードメインをコードしている配列を含み、ベクターがポリペプチドとエフェクタードメインとの融合タンパク質をコードしている配列を含むように第1、第2または第3のライゲーションした核酸がベクターに挿入される、請求項20に記載の方法。

請求項22

エフェクタードメインがヌクレアーゼドメインである、請求項21に記載の方法。

請求項23

細胞に発現ベクターを挿入することをさらに含む、請求項20から22のいずれか一項に記載の方法。

請求項24

ポリペプチドまたは融合タンパク質を発現させることをさらに含む、請求項23に記載の方法。

請求項25

ポリペプチドまたは融合タンパク質を精製することをさらに含む、請求項24に記載の方法。

請求項26

表7に開示されている標的ヌクレオチド配列に結合する転写活性化因子様エフェクター(TALE)ドメインを含むポリペプチド。

請求項27

標的ヌクレオチド配列が半部位である、請求項26に記載のポリペプチド。

請求項28

ヌクレアーゼドメインを含む、請求項26に記載のポリペプチド。

請求項29

実施例7に開示されているアミノ酸配列を含むポリペプチド。

請求項30

請求項26から29のいずれかに記載のポリペプチドをコードする核酸。

請求項31

請求項30に記載の核酸を含むベクター。

請求項32

請求項30に記載の核酸または請求項31に記載のベクターを含む細胞。

請求項33

1、2、3および4個のTALEリピートドメインまたはその部分をコードしている配列を含む核酸のライブラリ

技術分野

0001

優先権主張
本出願は2011年7月15日に出願された米国特許仮出願第61/508,366号
、および2012年2月21日に出願された第61/601,409号、および2012
年3月13日に出願された第61/610,212号の利益を主張し、上述した各出願の
全内容を参照により本明細書に組み込む。

0002

連邦政府による資金提供を受けた研究についての記載
この発明は、米国国立衛生研究所によって裁定された補助金番号DPOD0068
62のもとに政府援助で行われた。政府は、本発明に特定の権利を有する。

0003

配列表
本出願は、EFS−Webを通してASCII形式提出された配列表を含み、その全
体を参照により本明細書に組み込む。2012年7月11日に作成された前記ASCII
コピーは、2953936W.txtと命名され、サイズは459,673バイトである

0004

この発明は、ペプチドをコードする核酸および複数の転写様活性因子エフェクター
ALEリピートドメインをコードするポリペプチドを作製する方法ならびにそのタン
パク質自体に関する。

背景技術

0005

キサントモナス属植物病原性細菌のTALEタンパク質は、宿主DNAに結合し、エ
フェクター特異的宿主遺伝子を活性化することによって、病害において重要な役割を果た
す、または防御を誘発する(例えば、Guら、2005、Nature 435:1122;Yangら、2006 Proc
. Natl. Acad. Sci. USA 103:10503;Kayら、2007、Science 318:648;Sugioら、2007、P
roc. Natl. Acad. Sci. USA 104:10720;およびRomerら、2007、Science 318:645を参照
のこと)。核酸配列に対する特異性は、エフェクター(様々な数の不完全な、通常約33
〜35アミノ酸リピート)に依存する(Schornackら、2006、J. Plant Physiol. 163:2
56)。各リピートは標的配列中の1個のヌクレオチドに結合し、そのヌクレオチドに対す
る各リピートの特異性は前後配列に殆ど左右されないので、専用の配列特異的TALEタ
ンパク質の開発が可能となる(Moscouら、2009、Science 326:1501;Bochら、2009、Scie
nce 326:1509-1512)。

0006

本出願は、少なくとも一部において、専用TALEリピートアレイタンパク質をコード
する核酸を組み立てるための迅速、簡単かつ容易に自動化可能な方法の開発に基づいてい
る。

0007

したがって、この開示は、(a)1個もしくは複数(例えば、2個以上、3個以上、4
個以上、5個以上、6個以上、1〜6個、2〜6個、3〜6個、4〜6個、5個または6
個、1、2〜5個、3〜5個、4個または5個、1〜4個、2〜4個、3個または4個、
1〜3個、2個または3個、1個または2個、1、2、3、4、5個または6個)の転写
活性化因子様エフェクター(TALE)リピートドメインおよび/または1個もしくは複
数のTALEリピートドメインのうち1個もしくは複数の部分を含む第1の組をコードし
ている配列を有する第1の核酸を用意するステップと;(b)第1の核酸を第1の酵素
接触させ、第1の酵素が第1のライゲーション可能な末端を形成するステップと;(c)
1個もしくは複数(例えば、2個以上、3個以上、4個以上、5個以上、6個以上、1〜
6個、2〜6個、3〜6個、4〜6個、5個または6個、1、2〜5個、3〜5個、4個
または5個、1〜4個、2〜4個、3個または4個、1〜3個、2個または3個、1個ま
たは2個、1、2、3、4、5個または6個)のTALEリピートドメインおよび/また
は1個もしくは複数のTALEリピートドメインのうち1個もしくは複数の部分を含む第
2の組をコードしている配列を有する第2の核酸を用意するステップと;(d)第2の核
酸を第2の酵素と接触させ、第2の酵素が第2のライゲーション可能な末端を形成し、第
1および第2のライゲーション可能な末端が対合可能であるステップと;(e)第1およ
び第2のライゲーション可能な末端を介して第1の核酸と第2の核酸とをライゲーション
して第1のライゲーションされた核酸を作製し、第1のライゲーションされた核酸が固体
支持体に連結され、第1のライゲーションされた核酸が前記第1および第2の組を含むポ
リペプチドをコードするステップとを含む方法を特徴とする。

0008

いくつかの実施形態において、本方法は、(b)第1の核酸を第1の酵素と接触させる
前にまたは(e)第1および第2の核酸をライゲーションする前に、固体支持体に第1の
核酸を連結させることを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、固体支持体に第
1のライゲーションされた核酸を連結することを含む。

0009

いくつかの実施形態において、第1の組は、ポリペプチド中で第2の組に対してN末端
側にある。いくつかの実施形態において、第2の組は、ポリペプチド中で第1の組に対し
てN末端側にある。

0010

いくつかの実施形態において、第1および第2の酵素は第1および第2の制限エンド
クレアーゼであり、第1の制限エンドヌクレアーゼは第1の核酸中の部位で切断して第1
切断末端を形成し、第2の制限エンドヌクレアーゼは第2の核酸中の部位で切断して第
2の切断末端を形成し、第1および第2のライゲーション可能な末端は第1および第2の
切断末端である。制限エンドヌクレアーゼを使用するとき、第1のライゲーションされた
核酸は、第1の制限エンドヌクレアーゼに認識される制限部位を含むことができない。

0011

本方法は、(f)第1のライゲーションされた核酸を第3の酵素と接触させ、第3の酵
素が第3のライゲーション可能な末端を形成するステップと;(g)1個もしくは複数(
例えば、2個以上、3個以上、4個以上、5個以上、6個以上、1〜6個、2〜6個、3
〜6個、4〜6個、5個または6個、1、2〜5個、3〜5個、4個または5個、1〜4
個、2〜4個、3個または4個、1〜3個、2個または3個、1個または2個、1、2、
3、4、5個または6個)のTALEリピートドメインおよび/または1個もしくは複数
のTALEリピートドメインのうち1個もしくは複数の部分を含む第3の組をコードして
いる配列を含む第3の核酸を用意するステップと;(h)第3の核酸を第4の酵素と接触
させ、第4の酵素が第4のライゲーション可能な末端を形成し、第3および第4のライ
ション可能な末端が対合可能であるステップと;(i)第3および第4のライゲーショ
ン可能な末端を介して第1のライゲーションされた核酸と第3の核酸とをライゲーション
して、固体支持体に連結された第2のライゲーションされた核酸を作製し、第2のライゲ
ーションされた核酸が前記第1、第2および第3の組を含むポリペプチドをコードするス
テップとをさらに含むことができる。

0012

いくつかの実施形態において、第3および第4の酵素は、第3および第4の制限エンド
ヌクレアーゼであり、第3の制限エンドヌクレアーゼは第1のライゲーションされた核酸
中の部位で切断して第3の切断末端を形成し、第4の制限エンドヌクレアーゼは第3の核
酸中の部位で切断して第4の切断末端を形成し、第3および第4のライゲーション可能な
末端は第3および第4の切断末端である。

0013

いくつかの実施形態において、ライゲーションされた核酸は、第1のエンドヌクレアー
ゼに認識される制限部位を含まず、第1および第3の制限エンドヌクレアーゼは同一であ
る。いくつかの実施形態において、第2および第4の制限エンドヌクレアーゼは同一であ
る。

0014

本方法は、(j)第2のライゲーションされた核酸を第5の酵素と接触させ、第5の酵
素が第5のライゲーション可能な末端を形成するステップと;(k)1個もしくは複数(
例えば、2個以上、3個以上、4個以上、5個以上、6個以上、1〜6個、2〜6個、3
〜6個、4〜6個、5個または6個、1、2〜5個、3〜5個、4個または5個、1〜4
個、2〜4個、3個または4個、1〜3個、2個または3個、1個または2個、1、2、
3、4、5個または6個)のTALEリピートドメインおよび/または1個もしくは複数
のTALEリピートドメインのうち1個もしくは複数の部分を含む第4の組をコードして
いる配列を有する第4の核酸を用意するステップと;(l)第4の核酸を第6の酵素と接
触させ、第6の酵素が第6のライゲーション可能な末端を形成し、第5および第6のライ
ゲーション可能な末端が対合可能であるステップと;(m)第5および第6のライゲーシ
ョン可能な末端を介して第2のライゲーションされた核酸と第4の核酸とをライゲーショ
ンして、固体支持体に連結された第3のライゲーションされた核酸を作製し、第3のライ
ゲーションされた核酸が前記第1、第2、第3および第4の組を含むポリペプチドをコー
ドするステップとをさらに含むことができる。当業者は、同様の付加のステップを用いて
、本方法を繰り返すことができることを認識できよう。そのような方法は、この開示に含
まれる。

0015

いくつかの実施形態において、第5および第6の酵素は第5および第6の制限エンドヌ
クレアーゼであり、第5の制限エンドヌクレアーゼは第2のライゲーションされた核酸中
の部位で切断して第5の切断末端を形成し、第6の制限エンドヌクレアーゼは第4の核酸
中の部位で切断して第6の切断末端を形成し、第5および第6のライゲーション可能な末
端は第5および第6の切断末端である。

0016

いくつかの実施形態において、第2のライゲーションされた核酸は、第1のエンドヌク
レアーゼに認識される制限部位を含まず、第1、第3および第5の制限エンドヌクレアー
ゼは同一である。

0017

いくつかの実施形態において、第2、第4および第6の制限エンドヌクレアーゼは同一
である。

0018

いくつかの実施形態において、固体支持体および連結されている核酸は、例えば、上記
のステップ(a)〜(m)のいずれかの後に単離される。

0019

いくつかの実施形態において、第2、第3または第4の組は、1〜4個のTALEリピ
トドメインを含む。

0020

いくつかの実施形態において、ライゲーション可能な末端は、1〜10ヌクレオチドの
突出を含む。いくつかの実施形態において、ライゲーション可能な末端は、平滑末端であ
る。いくつかの実施形態において、突出は、1つまたは複数のヌクレオチドの存在下でエ
キソヌクレアーゼおよびポリメラーゼを使用して生成できる。

0021

いくつかの実施形態において、上記の方法において使用される酵素または制限エンドヌ
クレアーゼは、IIS型制限エンドヌクレアーゼである。

0022

本方法は、ライゲーションされた核酸を固体支持体から分離し、ライゲーションされた
核酸(またはTALEリピートアレイコード配列を含めたその処理された誘導体)をベク
ター、例えば、発現ベクターに挿入することをさらに含むことができる。発現ベクターは
、ポリペプチドとエフェクタードメインとの融合タンパク質をコードしている配列を形成
するように構成されているエフェクタードメイン(例えば、ヌクレアーゼドメイン)をコ
ードしている配列を含むことができる。細胞に発現ベクターを挿入して、細胞に直接に影
響を及ぼすか、またはポリペプチドもしくは融合タンパク質を発現させることができる。
ポリペプチドまたは融合タンパク質を発現させる場合、本方法は、ポリペプチドまたは融
合タンパク質を発現させ、精製することをさらに含むことができる。

0023

別の態様において、この開示は、本明細書に開示されている標的ヌクレオチド配列(例
えば、表6または表7)(例えば、「半部位(half site)」)に結合するTALEタン
パク質、TALEタンパク質を含むTALEヌクレアーゼ、本明細書に開示されている標
的部位(例えば、表6または表7)に結合するTALEタンパク質対(例えば、TALE
Ns)および上記のいずれかをコードする核酸を特徴とする。いくつかの実施形態におい
て、TALEタンパク質、TALEヌクレアーゼおよびTALEタンパク質対(例えば、
TALENs)は、実施例7に開示されているものである。TALEタンパク質、TAL
EヌクレアーゼおよびTALEタンパク質対(例えば、TALENs)をコードする核酸
は、実施例7に開示されているものまたは実施例7に開示したタンパク質をコードする他
の配列でもよい。本開示は、本明細書に開示されているTALEタンパク質、TALEヌ
クレアーゼまたはTALEタンパク質対(例えば、TALENs)をコードする核酸を含
ベクターおよび細胞、ならびにTALEタンパク質、TALEヌクレアーゼまたはTA
LEタンパク質対(例えば、TALENs)を発現させる、細胞培養を含めた方法も含む
。TALEタンパク質、TALEヌクレアーゼまたはTALEタンパク質対(例えば、T
ALENs)を発現させる本方法は、細胞培養からTALEタンパク質、TALEヌクレ
アーゼまたはTALEタンパク質対(例えば、TALENs)を単離することも含み得る

0024

別の態様において、本発明は、1個または複数のTALEドメインをコードしている配
列を含む核酸(例えば、プラスミド)の組、アーカイブまたはライブラリを特徴とする。
いくつかの実施形態において、組、アーカイブまたはライブラリは、1、2、3および/
または4個の(または、4個より多い(例えば、5個、6個またはそれより多い))TA
LEリピートドメインをコードしている配列を含む。いくつかの実施形態において、核酸
の組、ライブラリまたはアーカイブは、1、2、3、4個の(または、4個より多い(例
えば、5個、6個またはそれより多い))ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列に結合
するTALEリピートドメインをコードしている配列を含む。いくつかの実施形態におい
て、組、ライブラリまたはアーカイブは、TALEリピートドメインをコードする配列を
囲んで制限部位(例えば、IIS型制限エンドヌクレアーゼの部位)を含む。

0025

本明細書に記載の方法は、TALEリピートの多量のPCR増幅を回避し、それによっ
PCRエラーによる変異の導入を回避することを含めた、いくつかの利点をも提供する
。さらに、任意の望ましい長さのTALEリピートアレイを構築することができ、その方
法は容易に多重化および/または自動化できる。

0026

別段の規定がない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は
、この発明が属する分野の当業者であれば一般的に理解される意味と同じ意味を有する。
本明細書に記載の方法および材料に類似したまたは同等のそれは、本発明の実施または試
験に使用することができるが、適切な方法および材料については後述される。本明細書に
記載の全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、その全体を参照により組み
込む。不一致がある場合、用語の定義を含めて、本願明細書が優先されることになる。加
えて、材料、方法および例は単なる例示であり、制限することを意図するものではない。

0027

本発明の1つまたは複数の実施形態の詳細については、添付の図面および下記の説明に
記載されている。本発明の他の特徴、目的および利点については、説明および図面、なら
びに特許請求の範囲から明らかになる。

図面の簡単な説明

0028

TALEタンパク質をコードする核酸を組み立てる典型的な方法を示す模式図である。
単一(1マー)、2マー、3マーおよび4マーのTALEリピートドメインをコードする核酸の典型的なアーカイブを示す模式図である。
pUC57−ΔBsaIプラスミドの配列である。このプラスミドは、BsaI制限部位を破壊する単一塩基の変異(太字下線を引いた、小文字)を除いてプラスミドpUC57と同一である。
α/ε、β、γおよびδ型の典型的なTALEリピートのポリペプチド配列である。各型に特有多形残基が、太字およびイタリックで表される。Aに結合するための超可変トリプレットSNIが下線で表される。
図4Aの典型的なTALEリピートのポリヌクレオチド配列である。
発現プラスミドpJDS70、pJDS71、pJDS74、pJDS76およびpJDS78の共通配列である。可変配列の領域は、XXXXXXXXX(下線を引いた太字)として図示される。
発現プラスミドpJDS70、pJDS71、pJDS74、pJDS76およびpJDS78の共通配列である。可変配列の領域は、XXXXXXXXX(下線を引いた太字)として図示される。
増強緑色蛍光タンパク質(eGFP)遺伝子および本明細書に記載の合成TALEタンパク質に対する結合部位の位置の概念図である。
eGFPレポーター遺伝子に結合し、切断するように設計されたTALEヌクレアーゼをコードするプラスミドでトランスフェクションした2日後および5日後の、TALEヌクレアーゼ修飾eGFP陰性細胞の%を表す棒グラフである。
TALEヌクレアーゼによって誘導されるeGFPの挿入−欠失変異体の配列である。欠失した塩基破線で表し、挿入された塩基を二重下線で表す;TALEN標的半部位に一本線の下線を引く。挿入または欠失した塩基の正味の数が、右に示される。
17マーTALEアレイ調製物をコードしている組み立てられたDNA断片電気泳動ゲルを示す図である。
16マーTALEアレイ調製物の電気泳動ゲルを示す図である。
改変DR−TALE−0003のヌクレオチド配列である。
改変DR−TALE−0003のポリペプチド配列である。
改変DR−TALE−0006のヌクレオチド配列である。
改変DR−TALE−0006のポリペプチド配列である。
改変DR−TALE−0005のヌクレオチド配列である。
改変DR−TALE−0005のポリペプチド配列である。
改変DR−TALE−0010のヌクレオチド配列である。
改変DR−TALE−0010のポリペプチド配列である。
改変DR−TALE−0023のヌクレオチド配列である。
改変DR−TALE−0023のポリペプチド配列である。
改変DR−TALE−0025のヌクレオチド配列である。
改変DR−TALE−0025のポリペプチド配列である。
改変DR−TALE−0020のヌクレオチド配列である。
改変DR−TALE−0020のポリペプチド配列である。
改変DR−TALE−0022のヌクレオチド配列である。
改変DR−TALE−0022のポリペプチド配列である。
GFP遺伝子破壊アッセイにおける48個のTALEN対および4個のZFN対の活性を表す棒グラフである。染色体に組み込まれたEGFPレポーター遺伝子を持つU2OS細胞を、ヌクレアーゼをコードしているプラスミドを用いてトランスフェクションした2日後および5日後に測定したEGFP陰性細胞のパーセンテージが示される。3つの独立したトランスフェクションのEGFP破壊の平均パーセントおよび平均値標準誤差が示される。
TALENsの長さによってグループ化した、図19Aの平均EGFP破壊活性を表す棒グラフである。
2日後〜5日後の平均パーセントEGFP破壊値の比を表すグラフである。図19Bのデータを使用して、各TALEN長のグループについて比が算出された。1より大きい値は、2日後と比較して、5日後のEGFP破壊細胞の平均の減少を表す。
TALENsの様々な長さによってグループ化した2日後〜5日後の平均tdTomato陽性細胞の比を表すグラフである。0日目に、tdTomatoをコードする対照プラスミドを、ヌクレアーゼをコードするプラスミドと一緒トランスフェクトした。
内在性ヒト遺伝子で、組み立てられたTALENに誘導される変異のDNA配列および頻度を表す図である。各内在性遺伝子標的について、TALEN標的半部位に下線を引き、遺伝子の翻訳開始コドン(ATG)を箱で囲んで、野生型(WT)配列を一番上の行に表す。欠失は破線で、挿入は小文字と二重下線で表される。挿入(+)または欠失(Δ)のサイズが、各変異部位の右に表される。各変異体が単離された回数が、括弧内に示される。変異頻度は、分析した配列の合計数で除した同定された変異体の数として算出される。いくつかの遺伝子について、TALEN標的部位の配列を超えて広がるより大きな欠失も同定したことに留意されたい。
内在性ヒト遺伝子で、組み立てられたTALENに誘導される変異のDNA配列および頻度を表す図である。各内在性遺伝子標的について、TALEN標的半部位に下線を引き、遺伝子の翻訳開始コドン(ATG)を箱で囲んで、野生型(WT)配列を一番上の行に表す。欠失は破線で、挿入は小文字と二重下線で表される。挿入(+)または欠失(Δ)のサイズが、各変異部位の右に表される。各変異体が単離された回数が、括弧内に示される。変異頻度は、分析した配列の合計数で除した同定された変異体の数として算出される。いくつかの遺伝子について、TALEN標的部位の配列を超えて広がるより大きな欠失も同定したことに留意されたい。
内在性ヒト遺伝子で、組み立てられたTALENに誘導される変異のDNA配列および頻度を表す図である。各内在性遺伝子標的について、TALEN標的半部位に下線を引き、遺伝子の翻訳開始コドン(ATG)を箱で囲んで、野生型(WT)配列を一番上の行に表す。欠失は破線で、挿入は小文字と二重下線で表される。挿入(+)または欠失(Δ)のサイズが、各変異部位の右に表される。各変異体が単離された回数が、括弧内に示される。変異頻度は、分析した配列の合計数で除した同定された変異体の数として算出される。いくつかの遺伝子について、TALEN標的部位の配列を超えて広がるより大きな欠失も同定したことに留意されたい。
内在性ヒト遺伝子で、組み立てられたTALENに誘導される変異のDNA配列および頻度を表す図である。各内在性遺伝子標的について、TALEN標的半部位に下線を引き、遺伝子の翻訳開始コドン(ATG)を箱で囲んで、野生型(WT)配列を一番上の行に表す。欠失は破線で、挿入は小文字と二重下線で表される。挿入(+)または欠失(Δ)のサイズが、各変異部位の右に表される。各変異体が単離された回数が、括弧内に示される。変異頻度は、分析した配列の合計数で除した同定された変異体の数として算出される。いくつかの遺伝子について、TALEN標的部位の配列を超えて広がるより大きな欠失も同定したことに留意されたい。
内在性ヒト遺伝子で、組み立てられたTALENに誘導される変異のDNA配列および頻度を表す図である。各内在性遺伝子標的について、TALEN標的半部位に下線を引き、遺伝子の翻訳開始コドン(ATG)を箱で囲んで、野生型(WT)配列を一番上の行に表す。欠失は破線で、挿入は小文字と二重下線で表される。挿入(+)または欠失(Δ)のサイズが、各変異部位の右に表される。各変異体が単離された回数が、括弧内に示される。変異頻度は、分析した配列の合計数で除した同定された変異体の数として算出される。いくつかの遺伝子について、TALEN標的部位の配列を超えて広がるより大きな欠失も同定したことに留意されたい。
TALEリピートドメインまたはTALEリピートドメインの一部を含有する、TALEタンパク質をコードする核酸を組み立てる典型的な方法の模式図である。

0029

本明細書に記載の方法を使用して、対象の特異的配列に結合するためのTALEリピー
トドメインを含有する改変タンパク質を組み立てることができる。リピートは、高度に保
存されている約33〜35アミノ酸の共通配列内では少数のアミノ酸しか異ならないので
、TALEリピートドメインリピートの長いアレイ(例えば、12個以上)を組み立てる
ことが難しい場合がある。PCR組立てをすると、不要な変異が導入されることがある。
これら構築物の高度な反復性により構築物が不安定化し、組換えが起こりやすくなる可能
性があるので、およびこれらの中間構築物を継代する必要性によりこれらの手法を自動化
することが困難になるので、大腸菌(E. coli)における中間プラスミド構築物の継代を
1回または複数回含む階層的な組立て方法も問題を含む可能性がある。

0030

TALエフェクター
キサントモナス属の植物病原性細菌のTALエフェクターは、宿主DNAに結合し、エ
フェクター特異的宿主遺伝子を活性化することによって、病害において重要な役割を果た
す、または防御を誘発する。特異性は、エフェクター(様々な数の不完全な、通常約33
〜35アミノ酸のリピート)に依存する。主にリピートの12位および13位に多形が存
在し、本明細書において「リピート可変二残基(diresidue)」(RVD)と称する。T
ALエフェクターのRVDは、直接的に、線型様式で、1つのヌクレオチドに対して1つ
のRVDで、多少の縮重を伴い、明らかな前後配列の依存性無しにその標的部位中のヌク
レオチドに対応する。いくつかの実施形態において、ヌクレオチド特異性を付与する多形
領域は、三残基(triresidue)またはトリプレットとして発現されてよく、例えば、残基
11、12および13を包含する。

0031

各DNA結合リピートは、標的DNA配列中の塩基対の認識を決定するRVDを含むこ
とができ、各DNA結合リピートは標的DNA配列中の1つの塩基対の認識に関与し、R
VDは:C認識用のHA;C認識用のND;C認識用のHI;G認識用のHN;G認識用
のNA;GもしくはA認識用のSN;T認識用のYG;およびG認識用のNK、のうちの
1つまたは複数、ならびにC認識用のHD;T認識用のNG;A認識用のNI;Gもしく
はA認識用のNN;AもしくはCもしくはGもしくはT認識用のNS;CもしくはT認識
用のN*(*はRVDの第2位におけるギャップを表す);T認識用のHG;T認識用の
H*(*はRVDの第2位におけるギャップを表す);およびT認識用のIG、のうちの
1つまたは複数を含むが、これに限定されるものではない。

0032

TALEタンパク質は、(例えば、植物において生物燃料またはバイオ再生可能なエネ
ルギーに有用な形質を付加するまたは強化するための)ゲノム工学において、相同組換え
を促進可能な標的したキメラヌクレアーゼとして研究および生物工学に役立つ。これらの
タンパク質は、例えば、転写因子として、特に、非限定例としては、病原体(例えば、ウ
イルス)に対する治療法など非常に高いレベルの特異性を必要とする治療適用にも有用で
ある。

0033

組立て方法
TALEリピートドメインアレイを組み立てる本明細書に記載の方法の例は、図1に示
されており、(1)固体支持体への付着に適したリンカーを有する、単一のN末端TAL
Eリピートドメイン(1マー)をコードしている単一のビオチン化PCR産物を用意する
ステップと(ここで示す例では、ストレプトアビジンコーティング磁気ビーズを使用する
が、他の固体支持体およびその固体支持体に最初のDNA断片を係留する他の方法も利用
可能である);(2)(例えば、IIS型制限酵素を使用して)1マーDNAの3’末端
に突出を作成するステップと;(3)4個のTALEリピートドメイン(すなわち、予め
組み立てられた4マー)を含有する第2の断片をライゲーションして、5マーを形成する
ステップと;(4)固体支持体へ5マーを付着させるステップと;(5)追加的な予め組
み立てられたTALEリピートドメイン(例えば、望ましい最終的なアレイ長に応じて1
、2、3または4個のTALEリピートドメインをコードしているDNAの断片(複数可
))をライゲーションして、長いアレイを形成するステップと、(6)(例えば、最初の
ビオチン化DNA産物の5’末端に部位が組み込まれているIIS型制限酵素を使用する
ことにより)TALEリピートをコードしている伸長したDNAを固体支持体から遊離
せるステップとを含む。次いで、最終的な断片は、適切な発現プラスミドにライゲーショ
ンするように調製できる。

0034

別法として、本方法は、(1)固体支持体に単一のN末端TALEリピートドメインを
コードする単一のビオチン化PCR産物を付着させるステップと(ここで示す例では、ス
トレプトアビジンコーティング磁気ビーズを使用するが、マルチウェルプレートストレ
プトアビジンコーティングしたウェルなど他の固体支持体およびその固体支持体に最初の
DNA断片を係留する他の方法も利用可能である)、(2)(例えば、IIS型制限酵素
を使用して)固定されているDNAの3’末端に突出を作成するステップと、(3)4個
のTALEリピートドメインを含有する第2の断片をライゲーションするステップと、(
4)ステップ(2)および(3)のサイクルを追加して長いアレイを形成するステップと
、(5)最終サイクルにおいて、望ましい最終的なアレイ長に応じて1、2、3または4
個のTALEリピートドメインをコードするDNAの断片のライゲーションを実施するス
テップと、(6)(例えば、最初のビオチン化DNA産物の5’末端に部位が組み込まれ
ているIIS型制限酵素を使用することにより)TALEリピートをコードしている伸長
したDNAを固体支持体から遊離させるステップの通り進められる。

0035

本明細書に記載の方法に基づいてTALEリピートドメインアレイを組み立てる方法の
別の例は、図22に示されており、(1)固体支持体への付着に適したリンカーを有する
単一のN末端TALEリピートドメインの一部(部分的1マー)をコードする単一のビオ
チン化PCR産物を用意するステップと(ここで示す例では、ストレプトアビジンコーテ
ィング磁気ビーズを使用するが、他の固体支持体およびその固体支持体に最初のDNA断
片を係留する他の方法も利用可能である);(2)(例えば、IIS型制限酵素を使用し
て)部分的な1マーDNAの3’末端に突出を作成するステップと;(3)2個の部分的
および3個の完全なTALEリピートからなるを含有する第2の断片をライゲーションす
るステップと;(4)固体支持体へ第2の断片を付着させるステップと;(5)追加的な
予め組み立てられたTALEリピートドメインまたはTALEリピートドメインの一部(
例えば、望ましい最終的なアレイ長に応じて1、2、3または4個のTALEリピートド
メイン(またはTALEリピートドメインの一部)をコードするDNAの断片(複数可)
)をライゲーションして、長いアレイを形成するステップと、(6)(例えば、最初のビ
オチン化DNA産物の5’末端に部位が組み込まれているIIS型制限酵素を使用するこ
とにより)TALEリピートをコードしている伸長したDNAを固体支持体から遊離させ
るステップとを含む。次いで、最終的な断片は、適切な発現プラスミドにライゲーション
するように調製できる。

0036

1個または複数のTALEリピートドメイン(または一部)をコードしている最初の核
酸は、固体支持体に連結される。最初の核酸は、任意の手段(例えば、化学合成、PCR
またはプラスミドからの切断)によって調製できる。加えて、核酸は、任意の手段、例え
ば、共有結合または非共有結合によって固体支持体に連結できる。

0037

いくつかの実施形態において、結合対の一方のメンバーで修飾された核酸を使用し、結
合対の他方のメンバーを固体支持体に組み込むことにより、核酸は非共有結合的に連結さ
れる。結合対の一メンバーは、第1および第2部分のうちの一方になり、前記第1および
前記第2部分は互いに対して特異的な結合親和性を有する。本発明において使用する適切
な結合対には、それだけには限らないが、抗原/抗体(例えば、ジゴキシゲニン/抗ジゴ
キシゲニンジニトロフェニルDNP)/抗DNP、ダンシル−X/抗ダンシル、フル
オレセイン/抗フルオレセインルシファーイエロー/抗ルシファーイエロー、ペプチド
抗ペプチドリガンド受容体およびローダミン/抗ローダミン)、ビオチンアビ
ン(または、ビオチン/ストレプトアビジン)およびカルモジュリン結合タンパク質(C
BP)/カルモジュリンがある。他の適切な結合対には、FLAG−ペプチドなどのポリ
ペプチド(Hoppら、1988、BioTechnology、6:1204 10);KT3エピトープペプチド(Ma
rtinら、Science 255:192 194(1992));チューブリンエピトープペプチド(Skinnerら
、J. Biol. Chem. 266:15163-66(1991));およびT7遺伝子10タンパク質ペプチド
タグ(Lutz-Freyerinuthら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、87:6393 97(1990))と、そ
れらに対する各抗体がある。

0038

いくつかの実施形態において、1個または複数のTALEリピートドメインをコードし
ている個々の核酸は、プラスミドのアーカイブまたはライブラリ中に存在する(図2を参
照のこと)。1〜4個のTALEリピートドメインをコードしている核酸を示すが、プラ
スミドのライブラリは、4個より多い(例えば、5個、6個またはそれより多い)TAL
Eリピートドメインをコードしている核酸を含有できる。別法として、図22に示される
通り、1個または複数のTALEリピートドメインの部分または一部をコードしている核
酸を結合させて、TALEリピートドメインの望ましい全長アレイをコードする最終的な
DNA断片を形成することもできる。特定のヌクレオチドまたはヌクレオチドの組に対し
て結合特異性を持つ多くのTALEリピートドメイン配列が、当技術分野において公知で
あり、当業者は、これら公知の配列および本明細書の開示に基づいてプラスミドライブラ
リを設計し、調製することができる。

0039

本明細書では、固体支持体とは、核酸を連結可能な任意の固体もしくは半固体または不
溶性支持体のことを指す。そのような材料には、それだけに限らないが、ポリスチレン
ポリカーボネートポリプロピレンナイロンガラスデキストランキチン、砂、軽
石、アガロース多糖デンドリマーバッキーボールポリアクリルアミドシリコン
ゴムならびに固相合成、親和性分離および精製、ハイブリダイゼーション反応、免疫測
定法および他のそのような用途の支持体として使用される他の材料など、生物化学的分子
の合成および分析のための支持体として使用される任意の材料がある。固体支持体は、微
粒子であることができ、あるいはマイクロタイターディッシュもしくはウェル、スライド
ガラス、シリコンチップニトロセルロースシートナイロンメッシュまたは他のそのよ
うな材料など連続平面状であることができる。微粒子の場合、通常、粒子は、5〜10m
mの範囲またはより小さい少なくとも1つの大きさを有する。本明細書において、そのよ
うな粒子は、「ビーズ」と総称され、多くの場合球状であるが必ずしもそうではない。し
かし、そのような言及は基材幾何学的形状を限定するものではなく、ランダム形状、針
状、繊維状および細長い形状を含めた任意の形状であることができる。また、おおよそ球
状の「ビーズ」、特に液相で使用可能な微小球体も意図される。追加的な成分が本明細書
に記載の方法に干渉しない限り、「ビーズ」は、磁石を使用して分離するための磁性また
常磁性粒子(例えば、Dynabeads(Dynal、Oslo、Norway)を
参照のこと)などの追加的な成分を含むことができる。

0040

制限エンドヌクレアーゼ(例えば、II型もしくはIIS型制限エンドヌクレアーゼ)
で切断することによって、または1つまたは複数のヌクレオチドの存在下でエキソヌクレ
アーゼ活性およびポリメラーゼ活性を持つ酵素(複数可)を使用して末端を「削り込む(
chewing back)」ことによって、ライゲーション可能な末端を作製できる(Aslanidisら
、1990、Nucl. AcidsRes.、18:6069-74を参照のこと)。適切な酵素は、当業者に公知で
ある。制限エンドヌクレアーゼを使用する場合、核酸は、適切な位置に酵素のための制限
部位を含むように設計できる。

0041

ライゲーション反応の後に、5’または3’突出を持つライゲーションされていない任
意の末端は、ポリメラーゼ(例えば、3’→5’エキソヌクレアーゼ活性と5’→3’ポ
メラゼ活性の両方を持つDNAポリメラーゼ)の使用により「平滑化」できる。この
平滑化ステップにより、望ましくないまたは部分的な組立て産物の出現を減らすことがで
きる。別法として、これらの末端は、対合可能な突出を持つ「ヘアピンオリゴ(Briggs
ら、2012、Nucleic AcidsRes、PMID: 22740649)を使用してまたは1方の末端に対合可
能な突出を持ち、他方の末端に平滑末端を持つ短い二本鎖DNAによってキャップするこ
とができる。

0042

さらに下流で処理するためのライゲーションした核酸を調製するために、期待されるサ
イズの核酸を選抜し、不完全なライゲーションによって形成される少量の産物の存在量を
減らすことが有益な場合がある。サイズによって核酸を選抜する方法は、当技術分野にお
いて公知であり、ゲル電気泳動(例えば、スラブゲル電気泳動またはキャピラリーゲル
泳動(例えば、Carusoら、2003、Electrophoresis、24:1-2:78-85を参照のこと))、
液体クロマトグラフィー(例えば、サイズ除外クロマトグラフィーまたは逆相クロマト
ラフィー(例えば、Huberら、1995、Anal. Chem.、67:578-585を参照のこと))、および
ラボオンチップシステム(例えば、LabChip(登録商標)XTシステム、Cali
per Life Sciences、Hopkinton、MA)がある。いくつかの
実施形態において、サイズ除外ステップは、自動化システム、例えば、自動化ゲル電気
動システム(例えば、Pippin Prep(商標)自動化DNAサイズ選抜システム
、Sage Science、Beverly、MA)を使用して実施できる。

0043

自動化
本明細書に開示されている本方法は、手作業で実施することができ、または本明細書に
記載の新規な方法にしたがってプログラムされている適合するソフトウェアパッケージ
例えば、Maestro(商標)液体処理ソフトウェア)もしくは本明細書に記載の特定
の方法ステップを実施するために設計され実行される新規なソフトウェアパッケージによ
って制御される実験室自動化ハードウェア(例えば、SciClone G3 Liqu
id Handling Workstation、Caliper Life Sci
ences、Hopkinton、MA)により実行することができる。実験室自動化ハ
ドウェアによって実施されるとき、本方法は、本明細書に記載の方法ステップにしたが
った標準的なプログラミング技法を使用するコンピュータプログラムによって実行できる

0044

自動化実験室システムロボットの例には、Sciclone(商標)G3液体処理ワー
クステーション(Caliper Life Sciences、Hopkinton、
MA)、Biomek(登録商標)FX液体処理システム(Beckman−Coult
er、Fullerton、California)、TekBench(商標)自動化
液体処理プラットフォーム(TekCel、Hopkinton、Massachuse
tts)、およびFreedomEVO(登録商標)自動化プラットフォーム(Tec
an Trading AG、Switzerland)がある。

0045

プログラムは、少なくとも1台のプロセッサ、少なくとも1つのデータ記憶システム
揮発性および不揮発性メモリならびに/または記憶素子、例えば、RAMおよびROMを
含む)、コンピュータキーボード電話、またはワイヤレス携帯デバイス(PDAなど
)などのデバイスに対してアクセス可能になる少なくとも1つの通信ポート、および場合
によってはモニタプリンタまたはウェブサイトなど少なくとも1つの出力デバイスを含
む、プログラム可能コンピュータで実行するように設計できる。中央コンピュータは、
研究室自動化ハードウェアの制御を可能にするクロックおよび通信ポートも含む。これら
は全て、公知の技術、ソフトウェアおよびデバイスを使用して実行される。システムは、
データ(例えば、本明細書に記載の1つまたは複数の方法ステップの手順を記載している
データ)を含むデータベースも含む。

0046

プログラムコードは、利用者によるデータ入力(例えば、処理しようとするサンプルの
位置、操作のタイミングおよび頻度、分注または吸引される液体の量、システム中のある
位置から別の位置へのサンプルの移動)およびデータベース中のデータに適用されて、本
明細書に記載の機能が実施される。システムは、質問を生成することも、利用者にメッセ
ージを提供することもできる。本明細書に記載の通り、出力情報は、反応物を含有する容
器を操作、加熱、撹拌などする機器(例えば、ロボット)に適用される。加えて、そのシ
ステムは、電話、プリンタもしくはモニタなど1つもしくは複数の出力デバイス、または
合成および/もしくはその進捗に関する情報を利用者に提供するためのウェブサイトにア
クセス可能な、コンピュータモニタ上のウェブページを含むことができる。

0047

好ましくは、新規な方法を実現する各プログラムは、高いレベルの手続き的またはオブ
ジェクト指向プログラミング言語により実行されて、コンピュータシステム通信する
。しかし、プログラムは、必要に応じてアセンブリ言語または機械語で実行することもで
きる。どんな場合でも、言語は、コンパイラ型またはインタプリタ型言語であることがで
きる。

0048

記憶媒体またはデバイスをコンピュータによって読み込み、本明細書に記載の手順を実
施する場合、好ましくは、一般的なまたは特殊用途のプログラム可能なコンピュータによ
って読取り可能な記憶媒体もしくはデバイス(例えば、RAM、ROM、光学的、磁気
)にそのような各コンピュータプログラムを記憶させて、コンピュータを設定し、動作さ
せる。システムはまた、プログラムで設定されている、コンピュータ読取り可能なまたは
機械読取り可能な記憶媒体(電子装置で読取り可能な媒体)として実行できると考えられ
、それにより、こうして設定された記憶媒体は、コンピュータまたは機械を特定のおよび
所定の方法で動作させて、本明細書に記載の機能を実施する。

0049

新規な方法は、データ記憶の様々な手段を使用して実行できる。ファイルは、記録可能
な媒体で物理的に、または専用のイントラネットもしくはインターネット電子的に(例
えば電子メールによって)転送することができる。ファイルは、RSA Securit
y(Bedford、Massachusetts)およびBaltimore(登録商
標)のような会社の標準的な暗号化ソフトウェアを使用して暗号化することができる。フ
ァイルは、様々な形式、例えば、スプレッドシートまたはデータベースで記憶することが
できる。

0050

本明細書では、「電子装置」という用語は、任意の適切なコンピューティングもしくは
処理装置、またはデータもしくは情報を記憶するために設定または適合されている他のデ
バイスを含むことを意図する。本発明とともに使用するのに適した電子装置の例には、独
立型コンピューティング装置ローカルエリアネットワーク(LAN)、広域ネットワ
ク(WAN)、インターネット、イントラネットおよびエクストラネットを含めた通信ネ
トワーク;例えばパーソナル携帯情報機器(PDA)、携帯電話、「スマートフォン
ポケットベルなどの電子機器;ならびに局所型および分散型処理システムがある。

0051

本明細書では、「記憶される」とは、電子装置で読取り可能な媒体に情報をコードする
ための方法のことを指す。当業者は、公知の媒体に情報を記録するための現在公知の方法
のいずれかを容易に採用して、配列情報を含む製品を生成することができる。

0052

様々なソフトウェアプログラムおよび形式を使用して、電子装置で読取り可能な媒体に
方法データを記憶することができる。例えば、データおよび機械命令は、自動化システム
に備わっているソフトウェアのシステムに組み込みことができ、WordPerfect
(登録商標)およびMicrosoft(登録商標)Word(登録商標)など市販のソ
トウェアで書式化される文書処理テキストファイルで表示でき、または例えばMicr
osoft Access(登録商標)、MicrosoftSQLServer(
登録商標)、Sybase(登録商標)、Oracle(登録商標)などのデータベース
アプリケーションに記憶されるASCIIファイルの形態で、ならびに他の形態で表示で
きる。任意の数のデータ処理装置構築形式(例えば、テキストファイルまたはデータベ
ス)を利用して、適切なデータおよび機械命令を記録した媒体を得るかまたは形成し、そ
れによって本明細書に記載の方法を実行することができる。

0053

電子装置で読取り可能な形態で情報を提供することにより、プログラム可能なコンピュ
ータは、研究室自動化ハードウェアと通信し、制御して、本明細書に記載の方法を実施す
ることができる。当業者は、電子装置で読取り可能な形態(または電子装置で読取り可能
な形態に変換される形態)でデータを入力して、研究室自動化ハードウェアによる様々な
方法ステップの完了について記述することができる。

0054

ポリペプチド発現系
本発明の改変タンパク質を使用するには、通常、改変タンパク質をコードする核酸から
それを発現させる必要がある。これは、様々な方法で実施できる。例えば、通常、改変T
ALEリピートタンパク質をコードしている核酸を原核生物もしくは真核生物細胞への形
転換用中間ベクターにクローニングして、複製および/または発現させる。改変TAL
Eタンパク質をコードしている核酸を格納もしくは操作するまたはタンパク質を産生させ
るための中間ベクターは、通常、原核生物ベクター、例えばプラスミドもしくはシャトル
ベクターまたは昆虫ベクターである。改変TALEリピートタンパク質をコードしている
核酸も、通常、発現ベクターにクローニングされて、植物細胞動物細胞、好ましくは哺
乳動物細胞もしくはヒト細胞真菌細胞細菌細胞または原生動物細胞に施与される。

0055

クローニングした遺伝子または核酸を発現させるために、通常、改変TALEリピート
タンパク質は転写を指令するためのプロモーターを含有する発現ベクターにサブクローニ
ングされる。適切な細菌および真核生物プロモーターは、当技術分野で周知であり、例え
ば、Sambrookら、Molecular Cloning, A Laboratory Manual(第3版 2001);Kriegler、
Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual(1990);およびCurrent Protoco
ls in Molecular Biology(Ausubelら編、2010)に記載されている。改変TALEリピー
トタンパク質を発現させるための細菌発現系は、例えば、大腸菌(E. coli)、バチルス
属種、およびサルモネラ属において利用可能である(Palvaら、1983、Gene 22:229-235)
。そのような発現系用キットは、市販されている。哺乳動物細胞酵母および昆虫細胞
用の真核生物発現系は、当技術分野で周知であり、市販もされている。

0056

改変TALEリピートタンパク質核酸の発現を指令するために使用されるプロモーター
は、具体的な用途によって決まる。例えば、通常、強い構成的プロモーターを使用して、
改変TALEリピートタンパク質を発現させ精製する。それに対し、改変TALEリピー
トタンパク質をin vivoで施与して、遺伝子調節する場合、改変TALEリピート
タンパク質の具体的な用途に応じて構成的なまたは誘導可能なプロモーターのいずれかを
使用することができる。加えて、改変TALEリピートタンパク質を施与するのに好まし
いプロモーターは、HSVTKなどの弱いプロモーターまたは類似の活性を有するプロ
モーターであり得る。通常、プロモーターは、トランス活性化応答する要素、例えば、
低酸素応答要素、Gal4応答要素、lacリプレッサー応答要素ならびにtet調節系
およびRU−486系などの小分子制御系を含むこともできる(例えば、Gossen & Bujar
d、1992、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、89:5547;Oliginoら、1998、Gene Ther.、5:491
-496;Wangら、1997、Gene Ther.、4:432-441;Neeringら、1996、Blood、88:1147-55;
およびRendahlら、1998、Nat. Biotechnol.、16:757-761を参照のこと)。

0057

通常、プロモーターに加えて、発現ベクターは、宿主細胞(原核生物または真核生物の
いずれか)における核酸の発現に必要な全ての追加の要素を含有する転写ユニットまたは
発現カセットを含有する。したがって、通常の発現カセットは、例えば転写産物の効率的
ポリアデニル化、転写終結リボゾーム結合部位または翻訳終結に必要な、例えばTA
LEリピートタンパク質シグナルをコードしている核酸配列に動作可能に連結されたプロ
モーターを含有する。カセットの追加の要素には、例えば、エンハンサーおよび異種スプ
ライシングされるイントロンシグナル(heterologous spliced intronic signals)があ
り得る。

0058

細胞に遺伝情報運搬するのに使用される具体的な発現ベクターは、改変TALEリピ
ートタンパク質の使用目的(例えば、植物、動物、細菌、真菌、原生動物、などにおける
発現)に応じて選択される。標準的な細菌発現ベクターには、pBR322ベースとし
たプラスミド、pSKF、pET23DならびにGSTおよびLacZなど市販の融合発
現系などのプラスミドがある。好ましい融合タンパク質は、マルトース結合タンパク質
「MBP」である。そのような融合タンパク質を使用して、改変TALEリピートタンパ
ク質を精製できる。便利な単離方法を可能にし、発現をモニターし、細胞および細胞内の
局在をモニターするために、組換えタンパク質エピトープタグ(例えば、c−mycま
たはFLAG)を付加することもできる。

0059

真核生物ウイルス由来調節要素を含有する発現ベクターは、真核生物発現ベクター(
例えば、SV40ベクター、乳頭腫ウイルスベクターおよびエプスタインバーウイルス
ら得られるベクター)にしばしば使用される。他の典型的な真核生物ベクターには、pM
SG、pAV009/A+、pMTO10/A+、pMAMneo−5、バキュロウイル
スpDSVE、およびSV40初期プロモーター、SV40後期プロモーターメタロ
オネインプロモーター、マウス乳癌ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモ
ター、ポリヘドリンプロモーターまたは真核生物細胞における発現に対して有効であるこ
とが示されている他のプロモーターの指示の下でタンパク質の発現を可能にする他の任意
のベクターがある。

0060

いくつかの発現系は、安定にトランスフェクトされた細胞系の選択用マーカー(チミジ
キナーゼハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼおよびジヒドロ葉酸還元酵素
など)を有する。昆虫細胞において、ポリヘドリンプロモーターまたは他の強力なバキュ
ロウイルスプロモーターの指示の下に、改変TALEリピートタンパク質をコードしてい
る配列を含むバキュロウイルスベクターを使用するなど、高収率な発現系も適している。

0061

通常発現ベクターに含まれる要素には、大腸菌(E. coli)において機能するレプリ
ン、組換えプラスミドを保有する細菌の選抜を可能にする抗生物質耐性をコードしている
遺伝子、およびプラスミドの非必須領域への組換え配列の挿入を可能にする固有の制限部
位もある。

0062

標準的なトランスフェクション法を使用して、大量のタンパク質を発現する細菌、哺乳
動物、酵母または昆虫細胞系を作製し、次いで標準的な技術を使用してそのタンパク質を
精製する(例えば、Colleyら、1989、J. Biol. Chem.、264:17619-22;Guide to Protein
Purification、Methodsin Enzymology、182巻(Deutscher編、1990)を参照のこと)。
真核生物および原核生物細胞形質転換は、標準的な技術にしたがって実施される(例え
ば、Morrison、1977、J. Bacteriol. 132:349-351;Clark-Curtiss & Curtiss、Methods
in Enzymology 101:347-362(Wuら編、1983)を参照のこと)。

0063

宿主細胞に外来のヌクレオチド配列を導入するためのどんな周知の手順も使用できる。
これらは、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレンプロトプラスト融合
エレクトロポレーションリポソームマイクロインジェクション、ネイキッドDNA、
プラスミドベクターウイルスベクターエピソーム性および組み込み型の両方、ならび
にクローニングされたゲノムDNA、cDNA、合成DNAまたは他の外来の遺伝物質
宿主細胞に導入するための任意の他の周知の方法の使用を含む(例えば、Sambrookら、上
記を参照のこと)。使用される特定の遺伝子工学手順は、最良のタンパク質を発現可能な
宿主細胞に、少なくとも1つの遺伝子を成功裏に導入できればよい。

0064

TALEタンパク質の特徴づけ
本発明の方法を使用して設計した改変TALEリピートアレイタンパク質をさらに特徴
づけて、選択した用途にとって望ましい特徴を有することを確認できる。例えば、TAL
Eリピートアレイタンパク質は、細菌2ハイブリッド、細菌プロモーター抑制、ファージ
ディスプレイもしくはリボゾームディスプレイシステムを使用してまたは電気泳動移動度
シフトアッセイもしくは「EMSA」を使用してアッセイすることができる(Buratowski
& Chodosh、Current Protocols in Molecular Biology 12.2.1-12.2.7ページ)。同様に
、当技術分野において公知の他の任意のDNA結合アッセイを使用して、選択したタンパ
ク質のDNA結合特性を検証することができる。

0065

一実施形態において、細菌「2ハイブリッド」システムを使用して、本発明のTALE
リピートタンパク質を発現させ、試験する。細菌2ハイブリッドシステムには、タンパク
質発現とDNA結合「アッセイ」が同じ細胞の中で起こるというさらなる利点が有り、し
たがって、別々のDNA結合アッセイを組み立てない。

0066

細菌2ハイブリッドシステムを使用してDNA結合タンパク質を発現させ、アッセイす
る方法については、Joungら、2000、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、97:7382;Wrightら、
2006、Nat. Protoc、1:1637-52;Maederら、2008、Mol. Cell、31:294-301;Maederら、2
009、Nat. Protoc.、4:1471-1501;および米国特許出願番号第2002/0119498
号に記載されており、参照によりその内容を本明細書に組み込む。概略説明すると、細菌
2ハイブリッドシステムにおいて、DNA結合タンパク質は、レポーター遺伝子(例えば
ヒスチジン3(HIS3)、ベータラクタマーゼ抗生物質耐性遺伝子、またはベータ
ガラクトシダーゼ(lacZ)遺伝子)の発現を制御する弱いプロモーターの上流に対象
の配列を持つ細菌株中で発現される。細胞によって発現されるDNA結合タンパク質が標
的部位配列に結合する細胞において、レポーター遺伝子の発現が起こる。したがって、レ
ポーター遺伝子に関連した活性(例えば、選択培地上での成長、ベータ−ガラクトシダ
ゼの発現)を検出することによって、標的部位に結合するDNA結合タンパク質を発現し
ている細菌細胞が同定される。

0067

いくつかの実施形態において、結合親和性および特異性の算出も行われる。これは、様
々な方法で行うことができる。選択されたTALEリピートアレイタンパク質が対象の配
列に結合する親和性を測定し、そのKDを単位として定量化できる。TALEリピートア
レイタンパク質の実際のKDを正確に測定する限り、任意のアッセイ系を使用することが
できる。一実施形態において、TALEリピートアレイタンパク質がその標的に結合する
KDは、EMSAを使用して測定される。

0068

一実施形態において、EMSAを使用して、選択されたTALEリピートアレイタンパ
ク質が対象の配列(すなわち、特異的なKD)および非特異的DNA(すなわち、非特異
的KD)の両方に結合するKDを決定する。当技術分野において公知の、任意の適切な非
特異的または「競合」二本鎖DNAを使用できる。いくつかの実施形態において、仔ウシ
胸腺DNAまたはヒト胎盤DNAが使用される。特異的なKDに対する非特異的KDの比
が、特異性比である。高い特異性で結合するTALEリピートアレイタンパク質の特異性
比は高い。選択したTALEのグループのどれを所与の目的に使用すべきか決める際に、
この測定は非常に有用である。例えば、in vivoでTALEリピートアレイタンパ
ク質を使用するには、高い親和性結合だけでなく高い特異性結合も必要である。

0069

キメラTALEタンパク質の構築
多くの場合、専用設計のTALEリピートアレイDNA結合ドメインを作製する目的は
、ある機能を実施するのに使用可能なTALEリピートアレイタンパク質を得ることにあ
る。TALEリピートアレイDNA結合ドメインを単独で使用して、例えば遺伝子上の特
異的部位に結合させて、それにより他のDNA結合ドメインの結合を遮断することができ
る。しかし、いくつかの実施形態において、TALEリピートアレイタンパク質は、TA
LEリピートアレイDNA結合ドメインおよびいくつかの望ましい特異的機能(例えば、
遺伝子活性化)または酵素活性を有する追加的なドメイン、すなわち、「機能的ドメイン
」を含有するキメラTALEタンパク質の構築に使用される。

0070

本明細書に記載の方法を使用して設計され、作製されるキメラTALEリピートアレイ
タンパク質を使用して任意の機能を実施することができ、例えば、特定のDNA配列に対
するいくつかの特定の酵素活性、および他の型の合成または改変DNA結合分子に関して
既に記載されている任意の機能を標的することが望ましい。改変TALEリピートアレイ
DNA結合ドメインは、疾病の治療(例えば、米国特許出願第2002/0160940
号および米国特許第6,511,808号、第6,013,453号および第6,007
,988号ならびに国際特許出願公開第WO02/057308号を参照のこと)に、ま
たはさもなければ所与の遺伝子の構造または機能をin vivoで変更するのに有用な
キメラタンパク質の構築に使用できる。本発明の改変TALEリピートアレイタンパク
質は、研究ツールとして、例えば、in vivoまたはin vitroいずれにおけ
る機能的ゲノム学研究の実施にも有用である(例えば、米国特許第6,503,717号
および米国特許出願第2002/0164575号を参照のこと)。

0071

機能的な組換えタンパク質を生成するために、通常、改変TALEリピートアレイDN
結合ドメインは、少なくとも1つの「機能的」ドメインに融合されることになる。合成
のTALEリピートアレイタンパク質に機能的なドメインを融合して機能的転写因子を形
成することは、当業者によって一般的に実践されている日常分子生物学技術しか含まな
い、例えば、米国特許第6,511,808号、第6,013,453号、第6,007
,988号、第6,503,717号および米国特許出願第2002/0160940号
を参照のこと)。

0072

機能的なドメインは、TALEタンパク質のC末端またはN末端を含めた任意の好適な
位置で改変TALEリピートアレイドメインと結合することができる。本発明の方法を使
用して作製される改変タンパク質に付加するのに適切な「機能的」ドメインについては、
米国特許第6,511,808号、第6,013,453号、第6,007,988号お
よび第6,503,717号ならびに米国特許出願第2002/0160940号に記載
されている。

0073

一実施形態において、機能的ドメインは、核に移行されるタンパク質を規定する核局在
化ドメインである。いくつかの核局在化配列(NLS)は公知であり、任意の適切なNL
Sを使用できる。例えば、多くのNLSは、二連塩基性(bipartitebasic)リピートと
呼ばれる複数の塩基性アミノ酸を有する(Garcia-Bustosら、1991、Biochim. Biophys. A
cta、1071:83-101に概説されている)。二連塩基性リピートを含有するNLSは、キメラ
タンパク質の任意の部分に配置することができ、核の内側に局在化するキメラタンパク質
を得られる。通常、本発明のキメラタンパク質の最終的な機能が、核に局在化するタンパ
ク質を必要とするように、核局在化ドメインは常に最終的なキメラタンパク質に組み込ま
れることが好ましい。しかし、改変TALEリピートアレイドメイン自体または最終的な
キメラタンパク質中の別の機能的ドメインが固有の核移行機能を有する場合、別の核局在
化ドメインを付加する必要がない場合がある。

0074

別の実施形態において、機能的ドメインは、キメラタンパク質を使用して対象とする遺
伝子の転写を活性化できるような転写活性化ドメインである。当技術分野において公知の
任意の転写活性化ドメイン、例えば、VP16ドメインは単純ヘルペスウイルスを形成し
(Sadowskiら、1988、Nature、335:563-564)または細胞性転写因子NF−kappaB
のp65ドメイン(Rubenら、1991、Science、251:1490-93)などを使用することができ
る。

0075

さらに別の実施形態において、機能的ドメインは、キメラタンパク質を使用して対象と
する遺伝子の転写を抑制できるような転写抑制ドメインである。当技術分野において公知
の任意の転写抑制ドメイン、例えば、多くの天然に存在するKRABタンパク質中に見ら
れるKRAB(クルッペル関連ボックス(Kruppel-associated box))ドメイン(Thiese
nら、1991、Nucleic AcidsRes.、19:3996)などを使用することができる。

0076

さらなる実施形態において、機能的ドメインは、メチル基転移酵素(または、メチラー
ゼ)ドメイン、脱メチル化ドメイン、デアミナーゼドメイン、ヒドロキシラーゼドメイン
アセチル化ドメイン、または脱アセチル化ドメインなどのDNA修飾ドメインである。
そのようなドメインの多くは当技術分野において公知であり、得られるキメラタンパク質
の望ましい機能に応じて、任意のそのようなドメインを使用できる。例えば、DNAメチ
ル化ドメインを、TALEリピートアレイDNA結合タンパク質に融合させることができ
、このドメインを使用して、特定のDNA配列を標的にしてメチル化できることが示され
た(Xuら、1997、Nat. Genet.、17:376-378)。遺伝子のメチル化の状態は、その発現お
よび調節に影響を及ぼし、さらに、DNAメチル化の欠陥に関連付けられたいくつかの疾
病がある。

0077

なお、さらなる実施形態において、機能的ドメインは、ヒストンアセチラーゼまたはヒ
ストンデアセチラーゼ(またはHDAC)ドメインなどのクロマチン修飾ドメインである
。そのようなドメインの多くは当技術分野において公知であり、得られるキメラタンパク
質の望ましい機能に応じて、任意のそのようなドメインを使用できる。ヒストンデアセチ
ラーゼ(HDAC1およびHDAC2など)は、遺伝子抑制に関与している。したがって
、改変TALEタンパク質を使用して対象とする特定の遺伝子にHDAC活性を標的する
ことにより、対象とする遺伝子の発現を抑制することができる。

0078

他の実施形態において、機能的ドメインは、制限エンドヌクレアーゼ(または制限酵素
)ドメインなどのヌクレアーゼドメインである。適切な改変TALEリピートアレイDN
A結合ドメインにヌクレアーゼ酵素を融合させることによって、そのDNA切断活性は、
特定の標的配列を標的にすることができる。この方法で、配列特異的キメラ制限酵素を作
製できる。いくつかのヌクレアーゼドメインが当技術分野において公知であり、任意の適
切なヌクレアーゼドメインを使用できる。例えば、Kimら、1996、Proc. Natl. Acad. Sci
. USA、6:1156-60によって教示されるように、IIS型制限エンドヌクレアーゼ(例えば
、FokI)のエンドヌクレアーゼドメインを使用できる。いくつかの実施形態において
、エンドヌクレアーゼは、US2008/0131962に記載の通り、改変FokIバ
リアントである。組換えDNA分子を構築する実験室手順において、または相同組換えを
促進するためのゲノムDNAにおける二本鎖DNA切断の作製においてなど、特定のDN
A配列の切断が要求されるどんな状況においても、そのようなキメラエンドヌクレアーゼ
を使用することができる(Kimら、1996、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、6:1156-60;Bibi
kovaら、2001、Mol. Cell. Biol.、21:289-297;Porteus & Baltimore、2003、Science、
300:763;Millerら、2011、Nat. Biotechnol.、29:143-148;Cermakら、2011、Nucl. Aci
dsRes.、39:e82)。間違いを起こしやすい非相同末端結合によるTALEヌクレアーゼ
誘導二本鎖切断DSB)を修復することにより、DSB部位に挿入または欠失変異を効
率的に導入できる(Millerら、2011、Nat. Biotechnol.、29:143-148;Cermakら、2011、
Nucl. Acids Res.、39:e82)。別法として、外生的に導入した「ドナーテンプレート(do
nor template)」を用いる相同組換え修復によるDSBの修復により、切断部位における
正確な塩基変更または挿入を高効率で導入できる(Bibikovaら、2003、Science、300:764
;Urnovら、2005、Nature、435:646-651;Porteusら、2003、Science、300:763;Miller
ら、2011、Nat. Biotechnol.、29:143-148)。

0079

いくつかの実施形態において、機能的ドメインは、キメラタンパク質を使用して、例え
ヒトゲノムの特定の位置に外生的なDNAを挿入できるようなインテグラーゼドメイン
である。

0080

他の適切な機能的なドメインには、サイレンサードメイン、核ホルモン受容体、レゾル
バーゼドメイン癌遺伝子転写因子(例えば、myc、jun、fos、myb、max、
mad、rel、ets、bcl、myb、mosファミリーメンバーなど)、キナーゼ
ホスファターゼ、ならびにDNAの構造および/または遺伝子の発現を修飾するその他
のタンパク質がある。転写調節に関与するキナーゼに由来する適切なキナーゼドメイン
ついては、Davis、1995、Mol. Reprod. Dev.、42:459-67に概説されている。適切なホス
ファターゼドメインについては、例えばSchonthal & Semin、1995、Cancer Biol. 6:239-
48に概説されている。

0081

機能的ドメインへのTALEリピートアレイの融合は、当業者に周知の標準的な組換え
DNA技術によって実施でき、例えば、Sambrookら、Molecular Cloning; A Laboratory
Manual 第3版(2001)などの基礎的な実験教科書、ならびに米国特許第6,511,80
8号、第6,013,453号、第6,007,988号および第6,503,717号
ならびに米国特許出願第2002/0160940号に記載されている。

0082

いくつかの実施形態において、2個以上の改変TALEリピートアレイタンパク質を連
結して、最終的なDNA結合ドメインを作製する。2個以上の改変タンパク質の連結は、
共有結合または非共有結合手段によって実施できる。共有結合の場合、改変タンパク質は
アミノ酸リンカーを使用して共有結合できる(例えば、米国特許出願第2002/01
60940号ならびに国際出願WO02/099084およびWO01/53480を参
照のこと)。このリンカーは、所望のアミノ酸の任意の列であることができる。一実施形
態において、リンカーは、標準的なTGEKPリンカーである。どのようなリンカーを使
用しても、標準的な組換えDNA技術(例えば、Sambrookら、Molecular Cloning; A Lab
oratory Manual 第3版(2001)に記載のものなど)を使用して、そのような連結タンパク
質を作製することができる。

0083

改変タンパク質がキメラエンドヌクレアーゼの生成に使用される実施形態において、キ
メラタンパク質は二量体化ドメインを保有することができ、したがってエンドヌクレアー
ゼはダイマーとして機能すると考えられる。任意の適切な二量体化ドメインを使用できる
。一実施形態において、エンドヌクレアーゼドメイン自体が、二量体化活性を保有する。
例えば、固有の二量体化活性を有するFokIのヌクレアーゼドメインを使用できる(Ki
mら、1996、Proc. Natl. Acad. Sci.、93:1156-60)。

0084

改変タンパク質による遺伝子発現調節を決定するためのアッセイ
様々なアッセイを使用して、改変TALEリピートタンパク質による遺伝子発現調節の
レベルを決定できる、例えば米国特許第6,453,242号を参照のこと。個々の改変
TALEリピートタンパク質の活性は、様々なin vitroおよびin vivoア
ッセイを使用して、例えば、免疫測定法(例えば、抗体を用いるELISAおよび免疫組
化学的アッセイ)、ハイブリダイゼーションアッセイ(例えば、RNaseプロテク
ョン、ノーザン、in situハイブリダイゼーション、オリゴヌクレオチドアレイ
験)、比色アッセイ、増幅アッセイ、酵素活性アッセイ、腫瘍成長アッセイ、表現型アッ
セイ、などを使用して、例えば、タンパク質もしくはmRNAレベル、産物レベル、酵素
活性、腫瘍成長;レポーター遺伝子の転写活性化もしくは抑制;二次メッセンジャーレベ
ル(例えば、cGMPcAMP、IP3、DAG、Ca2+);サイトカインおよびホ
ルモン産生レベル;ならびに血管新生を測定することにより、評価できる。

0085

TALEタンパク質は、例えば、293細胞、CHO細胞VERO細胞BHK細胞
HeLa細胞、COS細胞などの培養細胞を使用してin vitroで最初に活性を
試験することができる。いくつかの実施形態において、ヒト細胞が使用される。多くの場
合、改変TALEリピートアレイタンパク質は、レポーター遺伝子を用いる一過性の発現
系を使用して最初に試験され、次いで標的内在性遺伝子の調節が細胞および動物において
、in vivoとex vivoの両方で試験される。改変TALEリピートアレイタ
ンパク質を細胞において組換えにより発現させる、動物に移植した細胞において組換えに
より発現させる、またはトランスジェニック動物において組換えにより発現させることが
でき、および後述する送達媒体を使用してタンパク質として動物または細胞に投与するこ
ともできる。細胞は、固定化することも、溶液中に存在させることも、動物に注射するこ
とも、またはトランスジェニックもしくは非トランスジェニック動物中に天然に存在する
こともできる。

0086

本明細書に記載のin vitroまたはin vivoアッセイの1つを使用して、
遺伝子発現の変調が試験される。サンプルまたはアッセイを、改変TALEリピートアレ
イタンパク質で処理し、未処理の対照サンプルと比較して、変調の程度を調べる。内在性
遺伝子の発現を調節するためには、TALEリピートアレイタンパク質のKDは、理想
には200nM以下、より好ましくは100nM以下、より好ましくは50nM、最も好
ましくは25nM以下である。改変TALEリピートアレイタンパク質の効果は、上述の
パラメータのいずれかを調べることによって測定できる。任意の適切な遺伝子発現、表現
型または生理的変化を使用して、改変TALEリピートアレイタンパク質の影響を評価で
きる。無傷の細胞または動物を使用して機能的結果を決定する場合、腫瘍成長、血管新生
ホルモン放出、既知のおよび特徴づけられていない両方の遺伝子マーカーに対する転写
変化(例えば、ノーザンブロットまたはオリゴヌクレオチドアレイ実験)、細胞成長また
はpH変化などの細胞代謝における変化、ならびにcGMPなど細胞内二次メッセンジャ
ーの変化など様々な効果も測定できる。

0087

内在性遺伝子発現を調節するための好ましいアッセイは、in vitroで実施でき
る。1つのin vitroアッセイ形式において、ELISAアッセイを使用してタン
パク質の産生を調べることにより、培養細胞において内在性遺伝子発現の改変TALEリ
ピートアレイタンパク質調節が測定される。試験サンプルは、空のベクターまたは別の遺
伝子を標的にしている無関係なTALEリピートアレイタンパク質で処理した対照細胞
比較される。

0088

別の実施形態において、標的遺伝子mRNAの発現レベルを測定することにより、内在
性遺伝子発現の調節をin vitroで決定する。遺伝子発現のレベルは、増幅(例え
ば、RT−PCR、LCRを使用して)、またはハイブリダイゼーションアッセイ(例え
ば、ノーザンハイブリダイゼーション、RNaseプロテクションドットブロット)を
使用して測定される。一実施形態において、RNaseプロテクションが使用される。タ
ンパク質またはmRNAのレベルは、本明細書に記載の通り、直接的または間接的に標識
した検出薬剤(例えば、蛍光または放射性標識された核酸、放射性または酵素標識された
抗体、など)を使用して検出される。

0089

別法として、レポーター遺伝子(ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、CATまたは
ベータ−ガラクトシダーゼなど)に動作可能に連結された標的遺伝子プロモーターを使用
して、レポーター遺伝子系を考案できる。通常、レポーター構築物は、培養細胞に共トラ
スフェクトされる。TALEリピートアレイタンパク質で処理した後、レポーター遺伝
子の転写、翻訳または活性の量が、当業者に公知の標準的な技術にしたがって測定される

0090

内在性遺伝子発現の調節をモニターするのに有用なアッセイ形式の別の例は、in v
ivoで実施される。このアッセイは、腫瘍促進遺伝子、血管新生など腫瘍支持に関与す
る遺伝子(例えば、VEGF)の発現を阻害する、またはp53など癌抑制遺伝子を活性
化する、TALEリピートアレイタンパク質を調べるのに特に有用である。このアッセイ
において、改変TALEタンパク質を発現している培養腫瘍細胞を、免疫不全マウス(無
胸腺マウス放射線照射マウスまたはSCIDマウスなど)に皮下注射する。適切な期間
の後、好ましくは4〜8週間後に、例えば、体積によってまたは2つの最大寸法(two la
rgest dimensions)によって腫瘍成長を測定し、対照と比較する。(例えば、Stude
ntのt検定を使用して)統計的に有意に縮小した腫瘍は、成長が阻害されたと考えられ
る。別法として、腫瘍血管新生の程度も測定できる。内皮細胞特異的抗体を使用する免疫
測定法を使用して、腫瘍の血管新生および腫瘍内の血管の数を染色する。(例えばStu
dentのt検定を使用して)統計的に有意に血管の数が減少した腫瘍は、血管新生が阻
害されたと考えられる。

0091

トランスジェニックおよび非トランスジェニック動物を使用して、in vivoで内
在性遺伝子発現の調節を調べることもできる。トランスジェニック動物は、改変TALE
リピートアレイタンパク質を発現できる。別法として、改変TALEリピートアレイタン
パク質を一過性に発現する動物、または送達媒体の形で改変TALEリピートアレイタン
パク質が投与された動物を使用することができる。内在性遺伝子発現の調節は、本明細書
に記載のアッセイのうちいずれか1つを使用して試験される。

0092

遺伝子治療における改変TALEリピート含有タンパク質の使用
同様に、遺伝子治療適用において、本発明の改変タンパク質を使用して、遺伝子発現を
調節するまたは遺伝子配列を変更することができる。類似の方法が、合成ジンフィンガ
ータンパク質について記載されている、例えば米国特許第6,511,808号、米国特
許第6,013,453号、米国特許第6,007,988号、米国特許第6,503,
717号、米国特許出願第2002/0164575号および米国特許出願第2002/
0160940号を参照のこと。

0093

従来通りのウイルスおよび非ウイルスに基づく遺伝子導入方法を使用して、哺乳動物
胞または標的組織に、改変TALEリピートアレイタンパク質をコードしている核酸を導
入できる。そのような方法を使用して、改変TALEリピートアレイタンパク質をコード
している核酸を、in vitroで細胞に投与できる。好ましくは、改変TALEリピ
ートアレイタンパク質をコードしている核酸が、in vivoまたはex vivoで
の遺伝子治療適用のために投与される。非ウイルスベクター送達系には、DNAプラス
ド、ネイキッド核酸、およびリポソームなどの送達媒体と複合化した核酸がある。ウイル
スベクター送達系にはDNAおよびRNAウイルスがあり、それらは細胞への送達後に、
エピソームゲノムまたは組み込みゲノムのいずれかを有する。遺伝子治療の手順の総説
ついては、Anderson、1992、Science、256:808-813;Nabel & Felgner、1993、TIBTECH、
11:211-217;Mitani & Caskey、1993、TIBTECH、11:162-166;Dillon、1993、TIBTECH、1
1:167-175;Miller、1992、Nature、357:455-460;Van Brunt、1988、Biotechnology、6:
1149-54;Vigne、1995、Restorat. Neurol. Neurosci.、8:35-36;Kremer & Perricaudet
、1995、Br. Med. Bull.、51:31-44;Haddadaら、Current Topics in Microbiology and
Immunology DoerflerおよびBohm(編)(1995);およびYuら、1994、Gene Ther.、1:13-
26を参照のこと。

0094

改変TALEリピートアレイタンパク質をコードしている核酸の非ウイルス送達の方法
には、リポフェクション、マイクロインジェクション、微粒子銃ビロソームリポソー
ム、免疫リポソームポリカチオンもしくは脂質:核酸コンジュゲート、ネイキッドDN
AもしくはRNA、人工ビリオン、およびDNAもしくはRNAの薬剤で強化された取込
みがある。リポフェクションについては、例えば、米国特許第5,049,386号、第
4,946,787号および第4,897,355号に記載されており、リポフェクシ
試薬は、商業的に販売されている(例えば、Transfectam(商標)およびL
ipofectin(商標))。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクショ
ンに適している陽イオン性および中性脂質には、Felgnerのそれ、WO91/17
424、WO91/16024がある。細胞に(ex vivo投与)または標的組織に
(in vivo投与)送達できる。

0095

免疫脂質複合体など標的となるリポソームを含めた、脂質:核酸複合体の調製について
は当業者に周知である(例えば、Crystal、1995、Science、270:404-410;Blaeseら、199
5、Cancer Gene Ther.、2:291-297;Behrら、1994、Bioconjugate Chem. 5:382-389;Rem
yら、1994、Bioconjugate Chem.、5:647-654;Gaoら、Gene Ther.、2:710-722;Ahmadら
、1992、Cancer Res.、52:4817-20;米国特許第4,186,183号、第4,217,
344号、第4,235,871号、第4,261,975号、第4,485,054号
、第4,501,728号、第4,774,085号、第4,837,028号および第
4,946,787号を参照のこと)。

0096

改変TALEリピートアレイタンパク質をコードしている核酸を送達するためのRNA
またはDNAウイルスに基づく系の使用は、体内の特定の細胞にウイルスを標的し、核に
ウイルスペイロード(viral payload)を輸送するための高度に進化した方法を利用する
。ウイルスベクターは患者に直接投与すること(in vivo)も、またはそのベクタ
ーを使用してin vitroで細胞を処理し、その修飾された細胞を患者に投与するこ
と(ex vivo)もできる。TALEリピートアレイタンパク質を送達するための従
来通りのウイルスに基づく系には、遺伝子導入用の、レトロウイルスレンチウイルス
アデノウイルスアデノ随伴センダイ、および単純ヘルペスウイルスベクターがあり得
る。現在、ウイルスベクターは、標的細胞および組織における遺伝子導入に最も効率的で
汎用性が高い方法である。宿主ゲノムへの組み込みはレトロウイルス、レンチウイルスお
よびアデノ随伴ウイルス遺伝子導入法を用いて可能になり、多くの場合、挿入した導入遺
伝子の長期にわたる発現が得られる。加えて、多くの異なる細胞型および標的組織におい
て、高い形質導入効率が観察された。

0097

外来のエンベロープタンパク質を組み込むことによってレトロウイルスの指向性を変更
し、標的細胞の潜在的標的集団を広げることができる。レンチウイルスベクターとは、非
分裂細胞形質導入するまたはそれを感染させ、通常、高いウイルス力価を産生すること
ができるレトロウイルスベクターである。したがって、レトロウイルス遺伝子導入系の選
択は、標的組織によって決まる。レトロウイルスベクターは、6〜10kbまでの外来配
列に対するパッケージング能を有するシス作用性の長い末端リピートから構成される。最
小のシス作用性LTRはベクターの複製およびパッケージングに十分であり、次いでこの
ベクターを使用して標的細胞に治療的な遺伝子を組み込み、それによって導入遺伝子の永
続的な発現を得る。広く使用されているレトロウイルスベクターには、マウス白血病ウイ
ルス(Murine leukemia virus)(MuLV)、テナガザル白血病ウイルス(Gibbon ape
leukemia virus)(GaLV)、サル免疫不全ウイルス(Simian immunodeficiency viru
s)(SIV)、ヒト免疫不全ウイルス(Human immunodeficiency virus)(HIV)お
よびその組合せに基づくものがある(例えば、Buchscherら、1992、J. Virol.、66:2731-
39;Johannら、1992、J. Virol.、66:1635-40;Sommerfeltら、1990、Virololgy、176:58
-59;Wilsonら、1989、J. Virol.、63:2374-78;Millerら、1991、J. Virol.、65:2220-2
4;WO94/26877を参照のこと)。

0098

改変TALEリピートアレイタンパク質の一過性の発現が好ましい適用においては、ア
デノウイルスに基づく系が使用できる。アデノウイルスに基づくベクターは、多くの細胞
型において非常に高い形質導入効率の能力があり、細胞分裂を必要としない。そのような
ベクターでは、高い力価と発現レベルが得られた。このベクターは、比較的単純な系にお
いて大量に作製できる。例えば、核酸およびペプチドのin vitro産生において、
ならびにin vivoおよびex vivoでの遺伝子治療手順のために、アデノ随伴
ウイルス(「AAV」)ベクターも使用して、標的核酸で細胞を形質導入する(例えば、
Westら、1987、Virology 160:38-47;米国特許第4,797,368号;WO93/24
641;Kotin、1994、Hum. Gene Ther.、5:793-801;Muzyczka、1994、J. Clin. Invest
.、94:1351を参照のこと)。組換えAAVベクターの構築については、米国特許第5,1
73,414号;Tratschinら、1985、Mol. Cell. Biol. 5:3251-60;Tratschinら、1984
、Mol. Cell. Biol.、4:2072-81;Hermonat& Muzyczka、1984、Proc. Natl. Acad. Sci.
USA、81:6466-70;およびSamulskiら、1989、J. Virol.、63:3822-28を含めた多数の刊
行物に記載されている。

0099

具体的には、臨床試験における遺伝子導入用として最も頻繁に使用されている系である
レトロウイルスベクターを用いて、現在のところ少なくとも6つのウイルスベクター手法
が利用可能である。これらのウイルスベクターは全て、ヘルパー細胞系に挿入された遺伝
子による欠損ベクターの補完を含む手法を利用して、形質導入作用物質を生成する。

0100

pLASNおよびMFG−Sは、臨床試験において使用されたレトロウイルスベクター
の例である(Dunbarら、1995、Blood、85:3048;Kohnら,1995、Nat. Med.、1:1017;Male
chら、1997、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、94:12133-38)。PA317/pLASNは
、遺伝子治療の臨床試験において使用された最初の治療ベクターであった(Blaeseら、19
95、Science、270:475-480)。MFG−Sパッケージ化ベクターに関しては、50%以上
の形質導入効率が観察された(Ellemら、1997、Immunol Immunother.、44:10-20;Dranof
fら、1997、Hum. Gene Ther.、1:111-112)。

0101

組換えアデノ随伴ウイルスベクター(rAAV)は、欠損非病原性パルボウイルス
デノ随伴2型ウイルスに基づく遺伝子送達システムの有望な代替手段である。通常、ベク
ターは、導入遺伝子発現カセットに隣接しているAAVの145bp逆方向末端反復しか
保持しないプラスミドから得られる。形質導入細胞ゲノムに組み込むことによる、効率的
な遺伝子導入および導入遺伝子の安定した送達は、このベクター系にとって重要な特徴で
ある(Wagnerら、1998、Lancet、351:1702-1703;Kearnsら、1996、Gene Ther.、9:748-5
5)。

0102

複製欠損組換えアデノウイルスベクター(Ad)は、高力価で産生することができ、
多数の異なる細胞型を容易に感染させるので、大腸ガン遺伝子療法に主に使用される。
大部分のアデノウイルスベクターは、導入遺伝子がAd E1a、E1bおよびE3遺伝
子を置きかえ;その後、複製欠損ベクターは、欠失している遺伝子機能トランス補填
するヒト293細胞中で増殖するように改変される。Adベクターは、肝臓腎臓および
筋肉系組織などに見られる分裂しない分化した細胞を含めた複数の型の組織をin vi
voに形質導入することができる。従来通りのAdベクターは、高い輸送力を有する。臨
床試験におけるAdベクターの使用の例には、筋肉注射を用いて抗腫瘍免疫化するための
ポリヌクレオチド療法が含まれる(Stermanら、1998、Hum. Gene Ther. 7:1083-89)。臨
床試験における遺伝子導入用アデノウイルスベクターの使用のさらなる例には、Roseneck
erら、1996、Infection、24:15-10;Stermanら、1998、Hum. Gene Ther.、9:7 1083-89;
Welshら、1995、Hum. Gene Ther.、2:205-218;Alvarezら、1997、Hum. Gene Ther. 5:59
7-613;Topfら、1998、Gene Ther.、5:507-513;Stermanら、1998、Hum. Gene Ther.、7:
1083-89がある。

0103

パッケージング細胞を使用して、宿主細胞を感染させる能力があるウイルス粒子を形成
する。そのような細胞には、アデノウイルスをパッケージングする293細胞、およびレ
トロウイルスをパッケージングするΨ2細胞またはPA317細胞がある。遺伝子治療に
使用されるウイルスベクターは、通常、ウイルス粒子に核酸ベクターをパッケージングす
プロデューサー細胞系によって生成される。通常、ベクターは、パッケージングおよび
その後の宿主への組み込みに必要とされる最小限のウイルス配列を含有しており、他のウ
イルス配列は、発現させようとするタンパク質のための発現カセットと置きかえられてい
る。失ったウイルス機能は、パッケージング細胞系によってトランスに補填される。例え
ば、遺伝子治療に使用されるAAVベクターは、通常、パッケージングおよび宿主ゲノム
への組み込みに必要とされるAAVゲノム由来のITR配列しか保有しない。ウイルスD
NAは細胞系にパッケージングされ、その細胞系は他のAAV遺伝子、すなわち、rep
およびcapをコードしているがITR配列を欠いているヘルパープラスミドを含有する
。細胞系は、ヘルパーとしてのアデノウイルスにも感染する。ヘルパーウイルスは、AA
Vベクターの複製およびヘルパープラスミド由来AAV遺伝子の発現を促進する。ヘルパ
ープラスミドはITR配列を欠くため、大量にパッケージングされない。アデノウイルス
による汚染は、例えば、アデノウイルスがAAVより感受性である熱処理によって低減で
きる。

0104

多くの遺伝子治療適用において、遺伝子治療ベクターは、高い特異性を保持して特定の
組織型に送達されることが望ましい。通常、ウイルスベクターを修飾して、ウイルス外表
面にあるウイルスコートタンパク質との融合タンパク質としてリガンドを発現させること
により、所与の細胞型に対する特異性を持たせる。対象の細胞型に存在する既知の受容体
に対して親和性を有するように、リガンドは選ばれる。例えば、モロニーマウス白血病ウ
イルス(Moloney murine leukemia virus)を修飾して、gp70と融合したヒトヘレグ
リンを発現させることができ、組換えウイルスが、ヒト上皮細胞増殖因子受容体を発現し
ている特定のヒト乳癌細胞に感染することを、Hanら、1995、Proc. Natl. Acad. Sci. US
A、92:9747-51は報告した。この原理は、リガンド融合タンパク質を発現しているウイル
スと受容体を発現している標的細胞といった他の対にも拡張できる。例えば、線状ファー
ジを改変して、実質的に任意の選ばれた細胞受容体に対して特異的結合親和性を有する抗
体断片(例えば、FabまたはFv)を提示することができる。前記説明は、主にウイル
スベクターに適用されるが、同じ原理を非ウイルスベクターに適用することもできる。特
定の標的細胞による取り込みに有利に働くと考えられる特定の取り込み配列を含むように
、そのようなベクターを改変することができる。

0105

後述するように、遺伝子治療ベクターは、通常、全身性投与(例えば、静脈内、腹膜
、筋肉内、皮下もしくは頭蓋内点滴)または局所適用によって個々の患者に投与すること
により、in vivoで送達できる。別法として、個々の患者から外植された細胞(例
えば、リンパ球骨髄穿刺液、組織生検)または幹細胞(例えば、万能ドナー造血幹細胞
胚性幹細胞ES)、部分的に分化した幹細胞、非多能性幹細胞、多能性幹細胞、人工
多能性幹細胞(iPS細胞)(例えば、Sipioneら、Diabetologia、47:499-508、2004を
参照のこと))などの細胞に、ベクターをex vivoで送達することができ、その後
、通常、ベクターを組み込んだ細胞を選抜した後に、患者にその細胞を再移植する。

0106

診断、研究または遺伝子治療のためのex vivo細胞トランスフェクション(例え
ば、宿主生物にトランスフェクトした細胞を再注入することによる)は、当業者に周知で
ある。好ましい実施形態において、細胞は、対象生物から単離され、改変TALEリピー
トアレイタンパク質をコードしている核酸(遺伝子またはcDNA)でトランスフェクト
され、対象生物(例えば、患者)に再注入して戻される。ex vivoトランスフェク
ションに適している様々な細胞型は、当業者に周知である(例えば、Freshneyら、Cultur
e of Animal Cells、A Manual of Basic Technique(第5版 2005)および患者から細胞を
単離し培養する方法の考察についてその中で引用している参考文献を参照のこと)。

0107

一実施形態において、幹細胞(例えば万能ドナー造血幹細胞、胚性幹細胞(ES)、部
分的に分化した幹細胞、非多能性幹細胞、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞(iPS細胞
)(例えば、Sipioneら、Diabetologia、47:499-508、2004)を参照のこと)が、細胞の
トランスフェクションおよび遺伝子治療の、ex vivo手順に使用される。幹細胞を
使用する利点は、それらをin vitroで他の細胞型に分化させられること、または
骨髄移植する哺乳動物(細胞のドナーなど)に導入できることである。GMCSF、I
FNガンマおよびTNF−アルファなどのサイトカインを使用して、in vitroで
CD34+細胞を臨床的に重要な免疫細胞型へと分化させる方法は、公知である(Inaba
ら、1992、J. Exp. Med.、176:1693-1702を参照のこと)。

0108

幹細胞は、既知の方法を使用して、形質導入および分化のために単離できる。例えば、
CD4+およびCD8+(T細胞)、CD45+(panB細胞)、GR−1(顆粒球
、ならびに1ad(分化抗原提示細胞)など不要な細胞に結合する抗体を用いて骨髄細胞
パニングすることによって、骨髄細胞から幹細胞を単離することができる(Inabaら、1
992、J. Exp. Med.、176:1693-1702を参照のこと)。

0109

生物に改変TALEリピートアレイタンパク質をコードしている核酸を含有するベクタ
ー(例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、リポソーム、など)を直接投与して、i
n vivoで細胞に形質導入することもできる。別法として、ネイキッドDNAを投与
することができる。投与は、分子を血液または組織細胞と最終的に接触させるために通常
使用している経路のうちいずれかによる。そのような核酸を投与するのに適した方法が利
用可能であり、当業者に周知である、また、2つ以上の経路を使用して特定の組成物を投
与できるが、特定の経路は多くの場合別の経路よりも迅速であり、より有効な反応をもた
らすことができる。別法として、改変TALEリピートアレイタンパク質の安定な処方を
投与することもできる。

0110

医薬として許容される担体は、投与される特定の組成物によって、およびその組成物を
投与するのに使用される特定の方法によって、ある程度決定される。したがって、後述す
るように、幅広い種類の適切な処方の医薬組成物が利用可能である(例えば、Remington
:The Science and Practice of Pharmacy、第21版、2005を参照のこと)。

0111

送達媒体
本発明の改変TALEリピートアレイタンパク質などのポリペプチド化合物を投与する
のに重要な因子は、ポリペプチドが、細胞の原形質膜または核などの細胞内区画の膜を横
断できるということを確認することである。細胞膜は脂質−タンパク質二重層から構成さ
れ、小さい、非イオン性親油性化合物を自由に透過させるが、極性化合物高分子および
治療的または診断用薬剤を本質的に透過しない。しかし、改変TALEリピートアレイタ
ンパク質などのポリペプチドを、細胞膜を通って移行させる能力を有する、タンパク質お
よびリポソームなど他の化合物が記載されている。

0112

例えば、「膜移行ポリペプチド」のアミノ酸の部分配列は、膜移行担体として機能する
能力を持つ両親媒性または疎水性である。一実施形態において、ホメオドメインタンパク
質は、細胞膜を通って移行する能力を有する。ホメオドメインタンパク質(アンテナペデ
ィア)の最も短い内在化可能なペプチドは、アミノ酸43〜58位からなるタンパク質の
第3へリックスであることが判明した(例えば、Prochiantz、1996、Curr. Opin. Neurob
iol.、6:629-634を参照のこと)。別の部分配列、シグナルペプチドのh(疎水性)ドメ
インが、類似の細胞膜移行特性を有することが判明した(例えば、Linら、1995、J. Biol
. Chem.、270:14255-58を参照のこと)。

0113

タンパク質の細胞への取り込みを促進するのに、タンパク質に連結可能なペプチド配列
の例には、それだけには限らないが:HIVのtatタンパク質のペプチド断片(Endoh
ら、2010、MethodsMol. Biol.、623:271-281;Schmidtら、2010、FEBSLett.、584:1806
-13;Futaki、2006、Biopolymers、84:241-249);p16タンパク質のアミノ酸84〜1
03位に対応する20残基のペプチド配列(Fahraeusら、1996、Curr. Biol.、6:84を参
照のこと);アンテナペディアの60アミノ酸長のホメオドメインの第3へリックス(De
rossiら、1994、J. Biol. Chem.、269:10444);カポジ線維芽細胞成長因子(K−FGF
)h領域などのシグナルペプチドのh領域(上記Linら);または、HSV由来VP22
移行ドメイン(Elliot & O'Hare、1997、Cell、88:223-233)がある。また、例えば、Car
onら、2001、Mol Ther.、3:310-318;Langel、Cell-Penetrating Peptides: Processes a
nd Applications(CRCPress、Boca RatonFL2002);El-Andaloussiら、2005、Curr. P
harm. Des.、11:3597-3611;およびDeshayesら、2005、Cell. Mol. Life Sci.、62:1839-
49を参照のこと。細胞の取り込みを向上させる他の適切な化学的部分を、本明細書に記載
のTALEリピートアレイタンパク質に化学的に連結することもできる。

0114

毒素分子も、細胞膜を通ってポリペプチドを輸送する能力を有する。多くの場合、その
ような分子は、少なくとも2つの要素(「二成分毒素」と呼ばれる):移行もしくは結合
ドメインまたはポリペプチド、および別の毒素ドメインまたはポリペプチドから構成され
る。通常、移行ドメインまたはポリペプチドは細胞受容体に結合し、次いで、毒素が細胞
内に輸送される。細胞質ゾルにペプチドを送達する試みにおいて、ウェルシュ菌(Clostr
idium perfringens)イオタ毒素、ジフテリア毒素(DT)、シュードモナス外毒素A(
PE)、百日咳毒素(PT)、炭疽菌(Bacillus anthracis)毒素および百日咳アデニル
シクラーゼ(CYA)を含めたいくつかの細菌毒素が、内部またはアミノ末端との融合
物として使用された(Aroraら、1993、J. Biol. Chem.、268:3334-41;Perelleら、1993
、Infect. Immun.、61:5147-56;Stenmarkら、1991、J. Cell Biol.、113:1025-32;Donn
ellyら、1993、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、90:3530-34;Carbonettiら、1995、Abstr.
Annu. Meet. Am. Soc. Microbiol. 95:295;Seboら、1995、Infect. Immun.、63:3851-5
7;Klimpelら、1992、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、89:10277-81;およびNovakら、1992
、J. Biol. Chem.、267:17186-93)。

0115

そのような部分配列を使用して、改変TALEリピートアレイタンパク質を、細胞膜を
通って移行させることができる。改変TALEリピートアレイタンパク質は、そのような
配列に都合よく融合することができまたはそれを用いて誘導体化することができる。通常
移行配列は、融合タンパク質の一部として提供される。任意選択で、リンカーを使用し
て、改変TALEリピートアレイタンパク質と移行配列とを連結できる。任意の適切なリ
ンカー、例えば、ペプチドリンカーを使用できる。

0116

改変TALEリピートアレイタンパク質を、リポソーム、および免疫リポソームなどの
リポソーム誘導体を介して動物細胞、好ましくは哺乳動物細胞に導入することもできる。
「リポソーム」という用語は、水相封入している1つまたは複数の同心円状に秩序立っ
脂質二重層から構成される小胞のことを指す。通常、水相は、細胞に送達される化合物
(すなわち、改変TALEリピートアレイタンパク質)を含有する。

0117

リポソームは原形質膜と融合し、それによって、細胞質ゾル中に化合物を放出する。別
法として、リポソームは、細胞によって輸送小胞に貪食されるまたは取り込まれる。一旦
エンドソームまたはファゴソームに入ると、リポソームは、分解されるかまたは輸送小胞
の膜と融合し、その内容物を放出する。

0118

現行のリポソームによる薬物送達方法において、リポソームは最終的に透過性になり、
封入されている化合物(例えば、改変TALEリピートアレイタンパク質または同じもの
をコードしている核酸)を標的組織または細胞で放出する。全身的または組織特異的送達
のためには、例えば、体内の様々な作用物質の作用によってリポソーム二重層が経時的に
分解する受動的な方法でこれは達成され得る。別法として、活性化合物の放出は、薬剤を
使用してリポソーム小胞の透過性変化を誘導することを含む。環境がリポソーム膜の近く
酸性になるときにそれらが不安定化するように、リポソーム膜を構築することができる
(例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、84:7851(1987);Biochemistry、28:908(198
9)を参照のこと)。標的細胞によってリポソームが飲食運動されるとき、例えば、その
リポソームは不安定化され、内容物を放出する。この不安定化は、フソジェネシス(fuso
genesis)と称される。ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンDOPE)は、
多くの「膜融合」系の主成分である。

0119

通常、そのようなリポソームは、改変TALEリピートアレイタンパク質および脂質成
分(例えば、中性および/またはカチオン性脂質)を含み、場合によっては、予め定めら
れた細胞表面受容体またはリガンド(例えば、抗原)に結合する抗体などの受容体認識分
子を含む。例えば、Szokaら、1980、Annu. Rev. Biophys. Bioeng.、9:467、米国特許第
4,186,183号、第4,217,344号、第4,235,871号、第4,26
1,975号、第4,485,054号、第4,501,728号、第4,774,08
5号、第4,837,028号、第4,235,871号、第4,261,975号、第
4,485,054号、第4,501,728号、第4,774,085号、第4,83
7,028号、第4,946,787号、PCT公開番号WO91/17424、Deamer
& Bangham、1976、Biochim. Biophys. Acta、443:629-634;Fraleyら、1979、Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA、76:3348-52;Hopeら、1985、Biochim. Biophys. Acta、812:55-65;
Mayerら、1986、Biochim. Biophys. Acta、858:161-168;Williamsら、1988、Proc. Natl
. Acad. Sci. USA、85:242-246;Liposomes(Ostro(編、1983(第1章));Hopeら、198
6、Chem. Phys. Lip.、40:89;Gregoriadis、Liposome Technology (1984)およびLasic、
Liposomes: from Physics to Applications(1993))に記載のとおり、様々な方法がリ
ポソームの調製に利用可能である。適当な方法には、例えば、超音波処理押出加工、高
圧/均質化微小流動化界面活性剤透析、小さいリポソーム小胞のカルシウム誘導性
合およびエーテル−融合方法があり、その全てが当技術分野で周知である。

0120

特定の実施形態において、特定の細胞型、組織などに特異的な標的化部分を使用して、
リポソームを標的することが望ましい。様々な標的化部分(例えば、リガンド、受容体お
よびモノクローナル抗体)を使用するリポソームの標的化については、以前に記載されて
いる(例えば、米国特許第4,957,773号および第4,603,044号を参照の
こと)。

0121

標的化部分の例には、新生物前立腺癌特異的抗原およびMAGEなど)と関連する抗
原に特異的なモノクローナル抗体がある。癌遺伝子(rasまたはc−erbB2など)
の活性化または過剰発現の結果生じる遺伝子産物を検出することによって、腫瘍を診断す
ることもできる。加えて、多くの腫瘍は、アルファフェトプロテインAFP)および癌
抗原(CEA)など、通常は胎児の組織によって発現される抗原を発現する。B型肝炎
コアおよび表面抗原HBVc、HBV)、C型肝炎抗原、エプスタインバーウイルス抗
原、ヒト免疫不全1型ウイルス(Human immunodeficiency type-1 virus)(HIV1)
ならびに乳頭腫ウイルス抗原などの様々なウイルス抗原を使用して、ウイルス感染の部位
を診断できる。例えばインテグリン(例えば、VCAM−1)、セレクチン受容体(例え
ば、ELAM−1)など、炎症部位で発現する表面分子によって特異的に認識される分子
を使用して、炎症を検出することができる。

0122

リポソームに標的化薬剤を結合させるための標準的な方法を使用できる。一般に、これ
らの方法は、リポソーム脂質成分(例えば、ホスファチジルエタノールアミン)への組み
込みを含み、その脂質成分を、標的化薬剤を付着させるために活性化する、または脂質誘
導体ブレオマイシンなどの親油性化合物を誘導体化できる。例えば、プロテインAを組
み込んだリポソームを使用して、抗体を標的したリポソームを構築できる(Renneisenら
、1990、J. Biol. Chem.、265:16337-42およびLeonettiら、1990、Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA、87:2448-51を参照のこと)。

0123

用量
治療適用の場合、ジンクフィンガータンパク質について記載されたのと類似の方法で、
患者に投与すべき改変TALEリピートアレイタンパク質の用量が算出される、例えば米
国特許第6,511,808号、米国特許第6,492,117号、米国特許第6,45
3,242号、米国特許出願第2002/0164575号および米国特許出願第200
2/0160940号を参照のこと。本開示において、用量は、患者において経時的に有
益な治療応答をもたらすのに十分であるべきである。加えて、特定の用量計画は、実験設
定における(例えば、機能的ゲノム学研究、および細胞または動物モデルにおける)表現
型変化を決定するのに有用な場合がある。用量は、利用される特定の改変TALEリピー
トアレイタンパク質の有効性、特異性およびKD、標的細胞の核容積および患者の状態、
ならびに治療される患者の体重または表面積によって決定されることになる。特定の患者
への特定の化合物またはベクターの投与に付随する任意の有害副作用の存在、性質および
程度によっても、用量サイズは決定されることになる。

0124

医薬組成物および投与
本発明の改変TALEリピートアレイタンパク質を投与するのに適切な医薬組成物は、
ジンクフィンガータンパク質について記載されたように決定できる、例えば米国特許第6
,511,808号、米国特許第6,492,117号、米国特許第6,453,242
号、米国特許出願第2002/0164575号および米国特許出願第2002/016
0940号を参照のこと。遺伝子発現の変調のためおよび治療または予防適用(例えば、
癌、虚血糖尿病性網膜症黄斑変性慢性関節リウマチ乾癬HIV感染鎌状赤血
球性貧血アルツハイマー病筋ジストロフィー神経変性疾患血管系疾患嚢胞性
維症、脳卒中など)のために、改変TALEリピートアレイタンパク質、および改変TA
LEリピートアレイタンパク質をコードしている発現ベクターを患者に直接投与すること
ができる。TALEリピートアレイタンパク質に媒介される遺伝子治療によって阻害でき
微生物の例には、病原性細菌、例えば、クラミジアリケッチア細菌、マイコバクテ
ア、ブドウ球菌連鎖球菌肺炎球菌髄膜炎菌およびコノコッキ(conococci)、クレ
ブシエラプロテウスセラチアシュードモナスレジオネラジフテリア、サルモネ
ラ、桿菌コレラ破傷風ボツリヌス菌中毒、炭疽菌、ペストレプトスピラ症および
ライム病細菌;感染性真菌、例えば、アスペルギルス属カンジダ属胞子虫(例えば、
マラリア原虫)、根足虫(例えば、エントアメーバ属)および鞭毛虫トリパノソーマ属
リーシュマニア属トリコモナス属ジアルジア属など)などの原生動物;ウイルス性
疾患、例えば、肝炎(A、BまたはC)、ヘルペスウイルス(例えば、VZV、HSV−
1、HSV−6、HSV−II、CMVおよびEBV)、HIV、エボラアデノウイル
ス、インフルエンザウイルスフラビウイルスエコーウイルスライノウイルスコク
サッキーウイルス、コモウイルス、RSウイルス流行性耳下腺炎ウイルスロータウイ
ルス、麻疹ウイルス風疹ウイルス、パルボウイルス、牛痘ウイルスHTLVウイルス
デング熱ウイルス、乳頭腫ウイルス、ポリオウイルス狂犬病ウイルスおよびアルボウ
イルス脳炎ウイルスなどがある。

0125

治療上有効な量の投与は、TALEリピートアレイタンパク質を治療しようとする組織
と最終的に接触させるために通常使用している経路のうちいずれかによる。TALEリピ
ートアレイタンパク質は、任意の適切な方法で、好ましくは、医薬として許容される担体
と共に投与される。そのような変調物質を投与するのに適した方法が利用可能であり、当
業者に周知である、また、2つ以上の経路を使用して特定の組成物を投与できるが、特定
の経路は多くの場合別の経路よりも迅速であり、より有効な反応をもたらすことができる

0126

医薬として許容される担体は、投与される特定の組成物によって、およびその組成物を
投与するのに使用される特定の方法によって、ある程度決定される。したがって、後述す
るように、幅広い種類の適切な処方の医薬組成物が利用可能である(例えば、Remington:
The Science and Practice of Pharmacy、第21版、2005を参照のこと)。

0127

改変TALEリピートアレイタンパク質は、単独でまたは他の適切な成分と組合せて、
吸入によって投与される噴霧処方にできる(すなわち、「霧状」にできる)。エアロゾル
処方は、ジクロロジフルオロメタンプロパン窒素など加圧された許容し得る噴霧剤
入れることができる。

0128

例えば、静脈内、筋肉内、皮内および皮下経路などによる非経口投与用として好適な処
方には、水性および非水性の等張無菌注射溶液酸化防止剤緩衝液静菌剤、および処
方を対象とするレシピエントの血液と等張にする溶質を含有することができる)、ならび
に水性および非水性の無菌懸濁液(懸濁化剤可溶化剤増粘剤、安定剤および防腐剤
含むことができる)がある。開示されている組成物は、例えば、静脈内注入、経口的、局
所的、腹膜内、膀胱内でまたはクモ膜下腔内によって投与できる。化合物の処方は、アン
プルおよびバイアルなど、単位用量または複数用量の密封容器中に存在できる。注入用液
および懸濁液を、前述の種類の無菌の粉末顆粒および錠剤から調製できる。

0129

TALEヌクレアーゼの使用
例えば、2つの部位で切断しその間の配列を欠失させることによって、単一部位での切
断とそれに続く非相同な末端の結合によって、および/またはある部位で切断して1もし
くは2または数ヌクレオチドを取り除くまたは置きかえることによって、本明細書に記載
の方法を使用して改変されたTALEヌクレアーゼを使用してゲノム配列に変異を誘導で
きる。いくつかの実施形態において、TALEヌクレアーゼを使用して、動物、植物、菌
類または細菌ゲノムに変異を誘導する。標的した切断を使用して、(例えば、機能的ゲノ
ム学または標的検証のために)遺伝子ノックアウトを形成することも、(例えば、細胞工
学またはタンパク質過剰発現のために)標的化したゲノムへの配列挿入(すなわち、遺伝
ノックイン)を促進することもできる。挿入は、相同組換えによる染色体配列の置きか
えによって、または標的した組み込みによって可能であり、染色体中の対象領域と相同
配列に隣接している新規な配列(すなわち、対象領域に存在しない配列)を使用して、相
同組換えにより予め定められた目的部位に新規な配列を挿入する。外生的なDNAも、隣
接する相同性配列を必要とせずにTALEヌクレアーゼ誘導二本鎖切断部に挿入できる(
Orlandoら、2010、Nucl. AcidsRes.、1-15、doi:10.1093/nar/gkq512参照のこと)。

0130

下記の実施例3において実証されているように、本明細書に記載の方法によって作製さ
れるTALEヌクレアーゼは、哺乳動物細胞において部位特異的突然変異生成を誘導する
ことができた。本明細書に記載の方法によって作製されるTALEヌクレアーゼが、他の
細胞型および生物においても機能して、効率的な部位特異的突然変異生成を誘導し得るこ
とは、熟練した専門家には容易に認識されよう(例えば、Cadeら、2012、Nucleic Acids
Res.、PMID: 22684503およびMooreら、2012、PLoS One、PMID: 22655075を参照のこと)

0131

同じ方法を使用して、野生型配列を変異体配列と置きかえる、または1つの対立遺伝子
を異なる対立遺伝子に変換することもできる。

0132

感染しているまたは組み込まれたウイルスゲノムを標的にした切断は、宿主におけるウ
イルス感染症の治療に使用することができる。加えて、ウイルス受容体をコードしている
遺伝子の標的した切断を使用して、そのような受容体の発現を遮断し、それによって、宿
主生物におけるウイルスの感染および/またはウイルス拡散を予防することができる。ウ
イルス受容体(例えば、HIVに対するCCR5およびCXCR4受容体)をコードして
いる遺伝子を標的にした突然変異生成を使用して、受容体をウイルスと結合できなくし、
それによって、新たな感染を予防し、既存の感染の拡散を遮断することができる。標的に
できるウイルスまたはウイルス受容体の非限定的な例には、HSV−1およびHSV−2
などの単純ヘルペスウイルス(HSV)、水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)、エプスタイ
ンバーウイルス(EBV)ならびにサイトメガロウイルス(CMV)、HHV6およびH
HV7がある。ウイルスの肝炎科には、A型肝炎ウイルスHAV)、B型肝炎ウイルス
(HBV)、C型肝炎ウイルス(HCV)、Δ肝炎ウイルス(HDV)、E型肝炎ウイル
ス(HEV)および肝炎Gウイルス(HGV)がある。標的され得る他のウイルスまたは
それらの受容体には、ピコルナウイルス科(例えば、ポリオウイルスなど);カリチウイ
ルス科;トガウイルス(例えば、風疹ウイルス、デング熱ウイルスなど);フラビウイル
ス科;コロナウイルス科レオウイルス科ビルナウイルス科;ラボドウイルス科(例え
ば、狂犬病ウイルスなど);フィロウイルス科パラミクソウイルス科(例えば、流行性
耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、RSウイルスなど);オルソミクソウイルス科(例え
ば、インフルエンザウイルスA型、B型およびC型など);ブニヤウイルス科;アレナ
イルス科;レトロビラ科;レンチウイルス(例えば、HTLV−I;HTLV−II;H
IV−1(別名HTLV−III、LAV、ARV、hTLRなど)HIV−II);サ
ル免疫不全ウイルス(SIV)、ヒト乳頭腫ウイルス(HPV)、インフルエンザウイル
スおよびダニ媒介性脳炎ウイルスがあるが、それだけには限らない。これらのおよび他の
ウイルスの説明については、例えば、Virology, 3rd Edition (W. K. Joklik編、1988);
Fundamental Virology, 4th Edition(KnipeおよびHowley編、2001)を参照のこと。HI
Vに対する受容体には、例えば、CCR−5およびCXCR−4がある。

0133

類似の様式で、標的したDNAの切断とそれに続く非相同な末端の結合によって、感染
している細菌のゲノムに突然変異を起こして、細菌の感染を遮断するまたは改善すること
ができる。

0134

開示されている、標的した組換えについての方法を使用して、任意のゲノム配列を相同
だが同一でない配列と置きかえることができる。例えば、変異体ゲノム配列をその野生型
の対応配列と置きかえることができ、それによって、例えば、遺伝的疾患遺伝病、癌お
よび自己免疫疾患治療方法を提供できる。同様の様式において、本明細書に開示されて
いる、標的した組換え方法を使用して、ある遺伝子の1つの対立遺伝子を、異なる対立
伝子と置きかえることができる。

0135

典型的な遺伝的疾患には、それだけには限らないが、軟骨形成不全色盲、酸性マル
ーゼ欠損症アデノシンデアミナーゼ欠損症(OMIM番号102700)、副腎白質
ストロフィーアイカルディ症候群、アルファ−1抗トリプシン欠乏症、アルファ−サラ
セミア、アンドロゲン不応症候群、アペール症候群不整脈源性右室異形成毛細血管
拡張性運動失調症バース症候群、ベータサラセミア、青色ゴムまり様母斑症候群、カナ
バン病、慢性肉芽腫症CGD)、ネコ鳴き症候群、嚢胞性線維症有痛脂肪症、外胚
葉性形成異常ファンコニ貧血進行性骨化線維異形成症脆弱エックス症候群、ガラ
クトース血症ゴーシェ病、全身性ガングリオシドーシス(例えば、GM1)、血色素
着症、ベータ−グロビンの第6コドンにおけるヘモグロビンC変異(HbC)、血友病
ハンチントン舞踏病フルラー症候群低ホスファターゼ症クラインフェルター症候群
クラッベ病ランガー−ギーディオン症候群、白血球接着不全症(LAD、OMIM番
号116920)、白質萎縮症、QT延長症候群、マルファン症候群メビウス症候群、
ムコ多糖症(MPS)、爪膝蓋骨症候群、腎性尿崩症神経線維腫症ニーマンピック病
骨形成不全症ポルフィリン症プラダーウィリ症候群、早老症、プロテウス症候群、
網膜芽腫レット症候群、ルビンシュタインテイビ症候群、サンフィリポ症候群重症
合型免疫不全症(SCID)、シュバッハマン症候群、鎌状赤血球疾病(鎌状赤血球性貧
血)、スミスマニス症候群、スティックラー症候群、テイサックス病、血小板減少性
骨欠損(TAR)症候群、トレチャーコリンズ症候群、トリソミー結節硬化症、ターナ
ー症候群、尿素サイクル異常症、フォンヒッペルリンドウ病、ワーデンブルグ症候群、ウ
ィリアムズ症候群、ウィルソン病、ウィスコット−アルドリッチ症候群、X連鎖リンパ球
増殖性症候群(XLP、OMIM番号308240)がある。

0136

標的されたDNA切断および/または相同組換えによって治療できるさらなる典型的な
疾病には、後天性免疫不全症リソソーム蓄積症(例えば、ゴーシェ病、GM1、ファブ
リー病およびテイサックス病)、ムコ多糖症(例えば、ハンター病、ハーラー病)、異常
血色素症(例えば、鎌状赤血球症、HbC、アルファ−サラセミア、ベータ−サラセミア
)および血友病がある。

0137

特定の場合には、多能性細胞(例えば、造血幹細胞)におけるゲノム配列の変更が望ま
れる。造血幹細胞の可動化濃縮および培養の方法は、当技術分野において公知である。
例えば、米国特許第5,061,620号;第5,681,559号;第6,335,1
95号;第6,645,489号および第6,667,064号を参照のこと。SCID
および鎌状赤血球貧血症を含むがこれに限らない様々な疾患を治療するために、治療した
幹細胞を患者に戻すことができる。

0138

多くの場合、対象の領域は変異を含み、ドナーポリヌクレオチドは対応する野生型配列
を含む。同様に、望む場合には、野生型ゲノム配列を変異体配列によって置きかえること
ができる。例えば、遺伝子を変異させるか、または制御配列をより低く非病的な発現レベ
ルを支持する配列と置きかえるかいずれかによって、癌遺伝子の過剰発現を反転させるこ
とができる。別の例として、ApoAI遺伝子の野生型対立遺伝子をApoAI Mil
ano対立遺伝子によって置きかえて、アテローム性動脈硬化症を治療することができる
。実際、特定のゲノム配列に依存するどんな病理も、本明細書に開示されている方法およ
び組成物を使用して、任意の様式で修正または軽減することができる。

0139

標的した切断および標的した組換えを使用して、非コード配列(例えば、マイクロRN
Aおよび長鎖非コードRNAをコードしている配列、ならびにプロモーター、エンハンサ
ー、イニシエーターターミネータースプライス部位などの調節配列)を変更し、それ
によって遺伝子産物の発現のレベルを変更することもできる。そのような方法は、例えば
、治療目的、機能的ゲノム学および/または標的検証研究用として使用できる。

0140

本明細書に記載の組成物および方法は、同種異系移植に対する宿主の免疫反応を解決す
るための新規な手法および系も可能にする。特に、同種異系幹細胞(または、任意の型の
同種異系細胞)が宿主レシピエントに移植されるときに直面する主要な問題は、主に移植
した細胞の表面にある主要組織適合複合体MHC)の認識によって媒介される宿主免疫
系による拒絶反応の高い危険性である。MHCは、共通のベータサブユニットおよび可変
アルファサブユニットから構成されるヘテロ二量体として機能するHLAクラスIタン
パク質(複数可)を含む。HLAがない幹細胞から得られる組織移植片は、宿主の免疫応
答を逃れることが実証された。例えば、Coffmanら、1993、J. Immunol.、151:425-35;Ma
rkmannら、1992、Transplantation、54:1085-89;Kollerら、1990、Science、248:1227-3
0を参照のこと。本明細書に記載の組成物および方法を使用して、組織不適合性に関与す
るHLAタンパク質をコードしている遺伝子を、そのコード配列もしくは調節配列のいず
れかにおいて、組換えによって切断、突然変異または変更することができ、それによって
その遺伝子の発現を遮断するまたは機能しない産物を発現させる。例えば、本明細書に記
載の通りTALEヌクレアーゼ融合タンパク質を使用して共通のベータサブユニット遺伝
子(ベータ2ミクログロブリン)をコードしている遺伝子を不活性化することにより、H
LAクラスIを細胞から取り除いて、任意のドナーからHLAクラスIヌル幹細胞を迅速
かつ確実に生成することができ、それによって、幹細胞移植中にドナー/レシピエントM
HCハプロタイプを厳密に適合させる必要性が低下する。

0141

任意の遺伝子(例えば、ベータ2ミクログロブリン遺伝子)の不活化は、例えば、単一
の切断事象によって、切断とそれに続く非相同な末端の結合によって、2つの部位での切
断とそれに続く結合により2つの切断部位の間の配列を欠失させることによって、ミス
ンスまたはナンセンスコドンの組換えをコード領域に標的することによって、または無関
係な配列(すなわち、「スタッファー」配列("stuffer" sequence))の組換えを遺伝子
もしくはその調節領域に標的して、その遺伝子もしくはその調節領域を破壊することによ
って、達成できる。

0142

WO01/83793にて開示されているように、標的したクロマチン構造の修飾を使
用して、細胞のクロマチンへの融合タンパク質の結合を促進できる。

0143

さらなる実施形態において、TALE結合ドメインとリコンビナーゼ(または、その機
能的な断片)との1つまたは複数の融合物を使用して、本明細書に開示されているTAL
E−切断ドメイン融合物に加えてまたはそれの代わりに、標的した組換えを促進できる。
例えば、共有されている米国特許第6,534,261号およびAkopianら (2003) Proc. N
atl. Acad. Sci. USA 100:8688-8691を参照のこと。

0144

さらなる実施形態において、開示されている方法および組成物を使用して、活性に二量
体化(ホモ二量体化またはヘテロ二量体化のいずれか)を必要とする転写活性化または抑
制ドメインを含むTALEリピートDNA結合ドメインの融合物を提供する。これらの場
合、融合ポリペプチドは、TALEリピートDNA結合ドメインと機能的ドメインモノマ
ー(例えば、二量体転写活性化または抑制ドメインからのモノマー)を含む。適切な状態
にある標的部位にそのような2つの融合ポリペプチドが結合することによって二量体化が
可能になり、それによって機能的な転写活性化または抑制ドメインが再構成される。

0145

植物における遺伝子発現の調節
改変TALEリピートアレイタンパク質を使用して、例えば耐病性の増大、構造的多糖
貯蔵多糖風味、タンパク質ならびに脂肪酸の修飾、果実成熟、収量、色、栄養学的
特徴、保存能力の改善などの形質について植物を加工できる。特に、油の産生の強化(例
えば、脂肪種子において産生される脂肪酸の修飾)に対する作物種の加工は対象のもので
ある。

0146

種子油は主にトリアシルグリセロール(TAG)で構成され、それは脂肪酸のグリセリ
エステルである。これらの植物油商業生産は、主に、6種の主要な油料植物大豆
アブラヤシ菜種ヒマワリ綿実およびピーナッツ)で占められている。植物油は大部
分(90%)が、マーガリンショートニングサラダ油および揚げ油としてヒト食用
使用されている。残りの10%は、潤滑剤、油脂化学品、生物燃料、界面活性剤および他
産業用途などの非食品用途に使用されている。

0147

これら用途のそれぞれにおいて使用される油の望ましい特徴は、特に、鎖長およびTA
Gを構成する脂肪酸中に存在する二重結合の数の点で大きく異なる。これらの特性は、膜
流動性および温度感受性を制御するために、植物によって操作されている。TALEリピ
ートアレイタンパク質を使用して同じ特性を制御し、それによって食用および工業用とし
て改善された特徴を持つ油を産生することができる。

0148

脂肪種子作物のTAG中にある主要な脂肪酸は、長さが16〜18個の炭素であり、0
〜3個の二重結合を含有する。パルミチン酸(16:0[16個の炭素:0個の二重結合
])、オレイン酸(18:1)、リノール酸(18:2)およびリノレン酸(18:3)
が主要である。二重結合の数または飽和度は、得られる油の溶融温度反応性料理の仕
上がりおよび健康性状を決定する。

0149

オレイン酸(18:1)からリノール酸(18:2)への転換(その後18:3の形成
の前駆体になる)に関与する酵素は、デルタ−12−オレイン酸デサチュラーゼオメガ
−6デサチュラーゼとも呼ばれる)である。脂肪酸不飽和化経路におけるこのステップを
遮断することにより、ポリ不飽和脂肪酸の代わりにオレイン酸が蓄積するはずである。

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