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図面 (6)

課題

本発明は、一般的な治療使用に好適な脂質−治療用核酸組成物を提供することを目的とする。

解決手段

本発明は、新規陽イオン性脂質、並びにそれを含む脂質粒子を提供する。これらの脂質粒子は、活性薬剤をさらに含むことができ、細胞に活性薬剤を送達するために、本発明の関連方法に従って使用することができる。

概要

背景

関連技術の説明
治療用核酸には、例えば、低分子干渉RNA(siRNA)、マイクロRNA(miRNA)、アンチセンスオリゴヌクレオチドリボザイムプラスミド免疫刺激核酸アンチセンスアンタゴmir(antagomir)、抗mir(antimir)、マイクロRNA模倣体スーパーmir(supermir)、U1アダプター、及びアプタマーが含まれる。これらの核酸は、様々な機序により作用する。siRNA又はmiRNAの場合、これらの核酸は、RNA干渉(RNAi)と名付けられたプロセスにより、特定タンパク質細胞内レベル下方制御することができる。siRNA又はmiRNAが細胞質に導入された後、これらの二本鎖RNA構築体は、RISCと名付けられたタンパク質に結合することができる。siRNA又はmiRNAのセンスDNAは、RISC複合体から解離し、結合siRNA又はmiRNAの配列に相補的な配列を有するmRNAを認識及び結合することができるテンプレートをRISC内に提供する。相補的mRNAが結合すると、RISC複合体は、そのmRNAを切断し、切断された鎖を放出する。RNAiは、タンパク質合成をコードする対応するmRNAの特異的破壊を標的とすることにより、特定タンパク質の下方制御を提供することができる。

siRNA及びmiRNA構築体は、標的タンパク質に対する任意のヌクレオチド配列を用いて合成することができるため、RNAiの治療用途は非常に広範である。現在まで、siRNA構築体は、インビトロ及びインビボモデルの両方において、標的タンパク質を特異的に下方制御する能力を示している。加えて、siRNA構築体は、臨床研究で現在評価中である。

しかしながら、siRNA又はmiRNA構築体が現在直面している2つの問題は、第1には、それらが血漿中でのヌクレアーゼ消化に対して感受性であること、第2には、遊離siRNA又はmiRNAとして全身性投与される場合、それらがRISCに結合することができる細胞内区画への接近を得る能力に制限があることである。化学的に修飾されたヌクレオチドリンカー、例えばホスホチオアート基を分子内に組み込むことにより、これらの二本鎖構築体を安定化することができる。しかしながら、これらの化学的修飾は、ヌクレアーゼ消化からの限定的な保護を提供するに過ぎず、構築体の活性を減少させる場合がある。siRNA又はmiRNAの細胞内送達は、ポリマー陽イオン性リポソームなどの担体系を使用することにより、又は構築体を化学的に修飾することにより、例えばコレステロール分子共有結合で結合させることにより促進することができる。しかしながら、改良された送達系には、siRNA及びmiRNA分子効力を増加させ、化学的修飾の必要性を低減又は排除することが必要とされている。

アンチセンスオリゴヌクレオチド及びリボザイムは、mRNAがタンパク質に翻訳されることを阻害することもできる。アンチセンス構築体の場合、これらの一本鎖デオキシ核酸は、標的タンパク質mRNAの配列に相補的な配列を有しており、ワトソンクリック塩基対によりmRNAに結合することができる。この結合は、標的mRNAの翻訳を防止するか、及び/又はmRNA転写物RNaseH消化を誘発するかのいずれかである。結果的に、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、作用特異性(つまり、特定の疾患関連タンパク質の下方制御)に非常に大きな可能性を有する。現在まで、これらの化合物は、炎症性疾患、癌、及びHIVのモデルを含む幾つかのインビトロ及びインビボモデルにおいて将来性を示している(Agrawal, Trendsin Biotech. 14:376−87 (1996)に概説されている)。アンチセンスは、染色体DNAと特異的にハイブリダイズすることにより細胞活動に影響を与えることもできる。幾つかのアンチセンス薬物の先端的ヒト臨床評価が、現在進行中である。これらの薬物の標的には、bcl2及びアポリポタンパク質B遺伝子並びにmRNA産物が含まれる。

免疫刺激核酸には、デオキシリボ核酸及びリボ核酸が含まれる。デオキシリボ核酸の場合、特定の配列又はモチーフは、哺乳動物中で不正な免疫刺激を示す。これらの配列又はモチーフには、CpGモチーフピリミジン富む配列、及びパリンドローム配列が含まれる。デオキシリボ核酸中のCpGモチーフは、エンドソーム受容体トール様受容体9(TLR−9)により特異的に認識され、その後それにより先天性及び後天性の免疫刺激経路両方とも誘発されると考えられている。特定の免疫刺激リボ核酸配列も報告されている。これらのRNA配列は、トール様受容体6及び7(TLR−6及びTLR−7)に結合することにより、免疫活性化を誘発すると考えられている。加えて、二本鎖RNAは、免疫刺激性であることも報告されており、TLR−3に結合することにより活性化すると考えられている。

治療用核酸の使用に関する1つの周知の問題は、リン酸ジエステルヌクレオチド間結合の安定性、及びこのリンカーのヌクレアーゼに対する感受性に関する。血清中エキソヌクレアーゼ及びエンドヌクレアーゼが存在すると、リン酸ジエステルリンカーを有する核酸の迅速な消化がもたらされ、したがって、治療用核酸は、血清の存在下又は細胞内で非常に短い半減期を示す場合がある。(Zelphati, O., et al., Antisense. Res. Dev. 3:323−338 (1993);及びThierry, A.R., et al., pp147−161 in Gene Regulation: Biology of Antisense RNA and DNA (Eds. Erickson, RP and Izant,JG; Raven Press, NY (1992))。現在開発中の治療用核酸は、これらの及び他の既知の問題のため、天然核酸に見出される基本的リン酸ジエステル化学を使用しない。

この問題は、血清又は細胞内消化を低減する化学的修飾により部分的に克服されている。ヌクレオチド間リン酸ジエステル結合における修飾(例えば、ホスホチオアートメチルホスホネート、又はホスホルアミダート結合を使用して)、ヌクレオチド塩基における修飾(例えば、5−プロピニル−ピリミジン)、又は糖における修飾(例えば、2’修飾糖)が試験されている(Uhlmann E., et al. Antisense: Chemical Modifications. Encyclopedia of Cancer, Vol. X., pp 64−81 Academic Press Inc. (1997))。他には、2’−5’糖結合を使用して安定性を向上させる試みがなされている(例えば米国特許第5,532,130号を参照)。他の変更が試みられている。しかしながら、これらの解決策はいずれも、完全に満足のいくものではないことが判明しており、インビボ遊離治療用核酸は、依然として効力が限定的である。

加えて、siRNA及びmiRNAに関して上記で注記されているように、治療用核酸には細胞膜を通過する能力に制限があると共に(Vlassov, et al., Biochim. Biophys. Acta 1197:95−1082 (1994)を参照)、補体媒介アナフィラキシーなどの全身毒性、凝固特性の変更、及び血球減少に関する問題が残されている(Galbraith, et al., Antisense Nucl. Acid Drug Des. 4:201-206 (1994))。

効力の向上を試みるために、研究者らは、化学修飾された又は未修飾の核酸を送達するための脂質に基づくの担体系も使用してきた。Zelphati, O and Szoka, F.C., J. Contr. Rel. 41:99−119 (1996)において、著者らは、陰イオン性従来型リポソーム、pH感受性リポソーム、免疫リポゾーム膜融合性リポソーム、及び陽イオン性脂質/アンチセンス凝集体に言及している。同様に、陽イオン性リポソーム中のsiRNAが、全身性に投与されており、これらの核酸−脂質粒子は、非ヒト霊長類を含む哺乳動物で標的タンパク質の下方制御の向上を提供することが報告されている(Zimmermann et al., Nature 441: 111−114 (2006))。

概要

本発明は、一般的な治療使用に好適な脂質−治療用核酸組成物を提供することを目的とする。本発明は、新規な陽イオン性脂質、並びにそれを含む脂質粒子を提供する。これらの脂質粒子は、活性薬剤をさらに含むことができ、細胞に活性薬剤を送達するために、本発明の関連方法に従って使用することができる。なし

目的

本発明は、核酸のインビボ送達のために、並びにインビボ治療使用に好適な核酸−脂質粒子組成物のために有利である脂質を含む陽イオン性脂質及び脂質粒子を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
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請求項1

式Iの構造を有し、式中、R1及びR2は、各存在において各々独立して、随意置換されたC10〜C30アルキル、随意に置換されたC10〜C30アルコキシ、随意に置換されたC10〜C30アルケニル、随意に置換されたC10〜C30アルケニルオキシ、随意に置換されたC10〜C30アルキニル、随意に置換されたC10〜C30アルキニルオキシ、又は随意に置換されたC10〜C30アシル、又は−リンカーリガンドであり、R3は、各存在において独立して、H、随意に置換されたC1〜C10アルキル、随意に置換されたC2〜C10アルケニル、随意に置換されたC2〜C10アルキニル、随意に置換されたアルキルヘテロ環、随意に置換されたヘテロ環アルキル、随意に置換されたアルキルホスフェート、随意に置換されたホスホアルキル、随意に置換されたアルキルホスホロチオアート、随意に置換されたホスホロチオアルキル、随意に置換されたアルキルホスホロジチオアート、随意に置換されたホスホロジチオアルキル、随意に置換されたアルキルホスホネート、随意に置換されたホスホノアルキル、随意に置換されたアミノ、随意に置換されたアルキルアミノ、随意に置換されたジ(アルキル)アミノ、随意に置換されたアミノアルキル、随意に置換されたアルキルアミノアルキル、随意に置換されたジ(アルキル)アミノアルキル、随意に置換されたヒドロキシアルキル、随意に置換されたポリエチレングリコール(PEG、分子量:100〜40K)、随意に置換されたmPEG(分子量:120〜40K)、随意に置換されたへテロアリール、又は随意に置換されたヘテロ環、又はリンカー−リガンドであり、X及びYは、各々独立して、−O−、−S−、アルキレン、−N(Q)−、−C(O)−、−O(CO)、−OC(O)N(Q)−、−N(Q)C(O)O−、−C(O)O、−OC(O)O−、−OS(O)(Q2)O−、又は−OP(O)(Q2)O−であり、Qは、H、アルキル、ω−アミノアルキル、ω−(置換)アミノアルキル、ω−ホスホアルキル、又はω−チオホスホアルキルであり、Q1は、各存在において独立して、O又はSであり、Q2は、各存在において独立して、O、S、N(Q)(Q)、アルキル、又はアルコキシであり、A1及びA2は、各々独立して、−O−、−S−、−CH2−、−CHR5−、−CR5R5−、−CHF−、又は−CF2−であり、Zは、N又はC(R3)であり、及びm及びnは、各々独立して0〜5であり、ここでm及びnは一緒になって、3、4、5、6、7、又は8員環をもたらす、脂質、その塩又は異性体。

請求項2

式XXXVの構造を有し、式中、R1及びR2は、各存在において各々独立して、随意に置換されたC10〜C30アルキル、随意に置換されたC10〜C30アルコキシ、随意に置換されたC10〜C30アルケニル、随意に置換されたC10〜C30アルケニルオキシ、随意に置換されたC10〜C30アルキニル、随意に置換されたC10〜C30アルキニルオキシ、又は随意に置換されたC10〜C30アシル、又は−リンカー−リガンドであり、R3は、各存在において独立して、H、随意に置換されたC1〜C10アルキル、随意に置換されたC2〜C10アルケニル、随意に置換されたC2〜C10アルキニル、随意に置換されたアルキルヘテロ環、随意に置換されたヘテロ環アルキル、随意に置換されたアルキルホスフェート、随意に置換されたホスホアルキル、随意に置換されたアルキルホスホロチオアート、随意に置換されたホスホロチオアルキル、随意に置換されたアルキルホスホロジチオアート、随意に置換されたホスホロジチオアルキル、随意に置換されたアルキルホスホネート、随意に置換されたホスホノアルキル、随意に置換されたアミノ、随意に置換されたアルキルアミノ、随意に置換されたジ(アルキル)アミノ、随意に置換されたアミノアルキル、随意に置換されたアルキルアミノアルキル、随意に置換されたジ(アルキル)アミノアルキル、随意に置換されたヒドロキシアルキル、随意に置換されたポリエチレングリコール(PEG、分子量:100〜40K)、随意に置換されたmPEG(分子量:120〜40K)、随意に置換されたへテロアリール、若しくは随意に置換されたヘテロ環、若しくはリンカー−リガンドであり、又は各R3は、それらが結合している原子と一緒になって、3〜8員の随意に置換されたシクロアルキル基若しくは3〜8員の随意に置換されたヘテロ環基であり、X及びYは、各々独立して、−O−、−S−、アルキレン、−N(Q)−、−C(O)−、−O(CO)−、−OC(O)N(Q)−、−N(Q)C(O)O−、−C(O)O−、−OC(O)O−、−OS(O)(Q2)O−、又は−OP(O)(Q2)O−であり、Qは、H、アルキル、ω−アミノアルキル、ω−(置換)アミノアルキル、ω−ホスホアルキル、又はω−チオホスホアルキルであり、Q1は、各存在において独立して、O又はSであり、及びQ2は、各存在において独立して、O、S、N(Q)(Q)、アルキル、又はアルコキシである、脂質、その塩又は異性体。

技術分野

0001

政府支援
本明細書に記載されている研究は、少なくとも部分的には、国立アレルギー感染症研究所により授与されたグラント番号HHSN266200600012Cに基づく米国政府からの資金を使用して行われた。したがって、米国政府は、本発明に一定の権利を有し得る。

0002

優先権
本出願は、2008年11月10日に出願された、米国特許出願第61/113,179号、2009年2月20日に出願された米国特許出願第61/154,350号、2009年4月21日に出願された米国特許出願第61/171,439号、2009年6月9日に出願された米国特許出願第61/185,438号、2009年7月15日に出願された米国特許出願第61/225,898号、及び2009年8月14日に出願された米国特許出願第61/234,098号に対する優先権を主張するものであり、これらの各々の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

0003

本発明は、脂質粒子を使用した治療薬送達の分野に関する。具体的には、本発明は、核酸インビボ送達のために、並びにインビボ治療使用に好適な核酸−脂質粒子組成物のために有利である脂質を含む陽イオン性脂質及び脂質粒子を提供する。加えて、本発明は、これらの組成物を製作する方法、並びに例えば、種々の疾患状態治療するために、これらの組成物を使用して核酸を細胞に導入する方法を提供する。

背景技術

0004

関連技術の説明
治療用核酸には、例えば、低分子干渉RNA(siRNA)、マイクロRNA(miRNA)、アンチセンスオリゴヌクレオチドリボザイムプラスミド免疫刺激核酸アンチセンスアンタゴmir(antagomir)、抗mir(antimir)、マイクロRNA模倣体スーパーmir(supermir)、U1アダプター、及びアプタマーが含まれる。これらの核酸は、様々な機序により作用する。siRNA又はmiRNAの場合、これらの核酸は、RNA干渉(RNAi)と名付けられたプロセスにより、特定タンパク質の細胞内レベル下方制御することができる。siRNA又はmiRNAが細胞質に導入された後、これらの二本鎖RNA構築体は、RISCと名付けられたタンパク質に結合することができる。siRNA又はmiRNAのセンスDNAは、RISC複合体から解離し、結合siRNA又はmiRNAの配列に相補的な配列を有するmRNAを認識及び結合することができるテンプレートをRISC内に提供する。相補的mRNAが結合すると、RISC複合体は、そのmRNAを切断し、切断された鎖を放出する。RNAiは、タンパク質合成をコードする対応するmRNAの特異的破壊を標的とすることにより、特定タンパク質の下方制御を提供することができる。

0005

siRNA及びmiRNA構築体は、標的タンパク質に対する任意のヌクレオチド配列を用いて合成することができるため、RNAiの治療用途は非常に広範である。現在まで、siRNA構築体は、インビトロ及びインビボモデルの両方において、標的タンパク質を特異的に下方制御する能力を示している。加えて、siRNA構築体は、臨床研究で現在評価中である。

0006

しかしながら、siRNA又はmiRNA構築体が現在直面している2つの問題は、第1には、それらが血漿中でのヌクレアーゼ消化に対して感受性であること、第2には、遊離siRNA又はmiRNAとして全身性投与される場合、それらがRISCに結合することができる細胞内区画への接近を得る能力に制限があることである。化学的に修飾されたヌクレオチドリンカー、例えばホスホチオアート基を分子内に組み込むことにより、これらの二本鎖構築体を安定化することができる。しかしながら、これらの化学的修飾は、ヌクレアーゼ消化からの限定的な保護を提供するに過ぎず、構築体の活性を減少させる場合がある。siRNA又はmiRNAの細胞内送達は、ポリマー陽イオン性リポソームなどの担体系を使用することにより、又は構築体を化学的に修飾することにより、例えばコレステロール分子共有結合で結合させることにより促進することができる。しかしながら、改良された送達系には、siRNA及びmiRNA分子効力を増加させ、化学的修飾の必要性を低減又は排除することが必要とされている。

0007

アンチセンスオリゴヌクレオチド及びリボザイムは、mRNAがタンパク質に翻訳されることを阻害することもできる。アンチセンス構築体の場合、これらの一本鎖デオキシ核酸は、標的タンパク質mRNAの配列に相補的な配列を有しており、ワトソンクリック塩基対によりmRNAに結合することができる。この結合は、標的mRNAの翻訳を防止するか、及び/又はmRNA転写物RNaseH消化を誘発するかのいずれかである。結果的に、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、作用特異性(つまり、特定の疾患関連タンパク質の下方制御)に非常に大きな可能性を有する。現在まで、これらの化合物は、炎症性疾患、癌、及びHIVのモデルを含む幾つかのインビトロ及びインビボモデルにおいて将来性を示している(Agrawal, Trendsin Biotech. 14:376−87 (1996)に概説されている)。アンチセンスは、染色体DNAと特異的にハイブリダイズすることにより細胞活動に影響を与えることもできる。幾つかのアンチセンス薬物の先端的ヒト臨床評価が、現在進行中である。これらの薬物の標的には、bcl2及びアポリポタンパク質B遺伝子並びにmRNA産物が含まれる。

0008

免疫刺激核酸には、デオキシリボ核酸及びリボ核酸が含まれる。デオキシリボ核酸の場合、特定の配列又はモチーフは、哺乳動物中で不正な免疫刺激を示す。これらの配列又はモチーフには、CpGモチーフピリミジン富む配列、及びパリンドローム配列が含まれる。デオキシリボ核酸中のCpGモチーフは、エンドソーム受容体トール様受容体9(TLR−9)により特異的に認識され、その後それにより先天性及び後天性の免疫刺激経路両方とも誘発されると考えられている。特定の免疫刺激リボ核酸配列も報告されている。これらのRNA配列は、トール様受容体6及び7(TLR−6及びTLR−7)に結合することにより、免疫活性化を誘発すると考えられている。加えて、二本鎖RNAは、免疫刺激性であることも報告されており、TLR−3に結合することにより活性化すると考えられている。

0009

治療用核酸の使用に関する1つの周知の問題は、リン酸ジエステルヌクレオチド間結合の安定性、及びこのリンカーのヌクレアーゼに対する感受性に関する。血清中エキソヌクレアーゼ及びエンドヌクレアーゼが存在すると、リン酸ジエステルリンカーを有する核酸の迅速な消化がもたらされ、したがって、治療用核酸は、血清の存在下又は細胞内で非常に短い半減期を示す場合がある。(Zelphati, O., et al., Antisense. Res. Dev. 3:323−338 (1993);及びThierry, A.R., et al., pp147−161 in Gene Regulation: Biology of Antisense RNA and DNA (Eds. Erickson, RP and Izant,JG; Raven Press, NY (1992))。現在開発中の治療用核酸は、これらの及び他の既知の問題のため、天然核酸に見出される基本的リン酸ジエステル化学を使用しない。

0010

この問題は、血清又は細胞内消化を低減する化学的修飾により部分的に克服されている。ヌクレオチド間リン酸ジエステル結合における修飾(例えば、ホスホチオアートメチルホスホネート、又はホスホルアミダート結合を使用して)、ヌクレオチド塩基における修飾(例えば、5−プロピニル−ピリミジン)、又は糖における修飾(例えば、2’修飾糖)が試験されている(Uhlmann E., et al. Antisense: Chemical Modifications. Encyclopedia of Cancer, Vol. X., pp 64−81 Academic Press Inc. (1997))。他には、2’−5’糖結合を使用して安定性を向上させる試みがなされている(例えば米国特許第5,532,130号を参照)。他の変更が試みられている。しかしながら、これらの解決策はいずれも、完全に満足のいくものではないことが判明しており、インビボ遊離治療用核酸は、依然として効力が限定的である。

0011

加えて、siRNA及びmiRNAに関して上記で注記されているように、治療用核酸には細胞膜を通過する能力に制限があると共に(Vlassov, et al., Biochim. Biophys. Acta 1197:95−1082 (1994)を参照)、補体媒介アナフィラキシーなどの全身毒性、凝固特性の変更、及び血球減少に関する問題が残されている(Galbraith, et al., Antisense Nucl. Acid Drug Des. 4:201-206 (1994))。

0012

効力の向上を試みるために、研究者らは、化学修飾された又は未修飾の核酸を送達するための脂質に基づくの担体系も使用してきた。Zelphati, O and Szoka, F.C., J. Contr. Rel. 41:99−119 (1996)において、著者らは、陰イオン性従来型リポソーム、pH感受性リポソーム、免疫リポゾーム膜融合性リポソーム、及び陽イオン性脂質/アンチセンス凝集体に言及している。同様に、陽イオン性リポソーム中のsiRNAが、全身性に投与されており、これらの核酸−脂質粒子は、非ヒト霊長類を含む哺乳動物で標的タンパク質の下方制御の向上を提供することが報告されている(Zimmermann et al., Nature 441: 111−114 (2006))。

発明が解決しようとする課題

0013

こうした進歩にもかかわらず、一般的な治療使用に好適な脂質−治療用核酸組成物の向上は、当該技術分野で依然として必要とされている。好ましくは、これらの組成物は、核酸を高効率で封入化し、高い薬物:脂質比率を有し、血清中での分解及びクリアランスから封入化核酸を保護し、全身性送達に好適であり、封入化核酸の細胞内の送達を提供するだろう。加えて、これらの脂質−核酸粒子は、十分に耐用性であり、適切な治療指数を提供すべきであり、したがって有効用量の核酸による患者治療は、患者に対する著しい毒性及び/又はリスクを伴わない。本発明は、そのような組成物、組成物を製作する方法、及び疾患を治療する目的を含む、核酸を細胞に導入するための組成物の使用方法を提供する。

課題を解決するための手段

0014

本発明は、新規な陽イオン性脂質、並びにそれを含む脂質粒子を提供する。これらの脂質粒子は、活性薬剤をさらに含むことができ、細胞に活性薬剤を送達するために、本発明の関連方法に従って使用することができる。

0015

1つの態様では、本発明は、式Iの構造を有する脂質、その塩又は異性体を提供する:



式中、
R1及びR2は、各存在において各々独立して、随意置換されたC10〜C30アルキル、随意に置換されたC10〜C30アルコキシ、随意に置換されたC10〜C30アルケニル、随意に置換されたC10〜C30アルケニルオキシ、随意に置換されたC10〜C30アルキニル、随意に置換されたC10〜C30アルキニルオキシ、又は随意に置換されたC10〜C30アシル、又は−リンカー−リガンドであり、
R3は、各存在において独立して、H、随意に置換されたC1〜C10アルキル、随意に置換されたC2〜C10アルケニル、随意に置換されたC2〜C10アルキニル、随意に置換されたアルキルヘテロ環、随意に置換されたヘテロ環アルキル、随意に置換されたアルキルホスフェート、随意に置換されたホスホアルキル、随意に置換されたアルキルホスホロチオアート、随意に置換されたホスホロチオアルキル、随意に置換されたアルキルホスホロジチオアート、随意に置換されたホスホロジチオアルキル、随意に置換されたアルキルホスホネート、随意に置換されたホスホノアルキル、随意に置換されたアミノ、随意に置換されたアルキルアミノ、随意に置換されたジ(アルキル)アミノ、随意に置換されたアミノアルキル、随意に置換されたアルキルアミノアルキル、随意に置換されたジ(アルキル)アミノアルキル、随意に置換されたヒドロキシアルキル、随意に置換されたポリエチレングリコール(PEG、分子量:100〜40K)、随意に置換されたmPEG(分子量:120〜40K)、随意に置換されたへテロアリール、又は随意に置換されたヘテロ環、又はリンカー−リガンドであり、
X及びYは、各々独立して、−O−、−S−、アルキレン、−N(Q)−、−C(O)−、−O(CO)−、−OC(O)N(Q)−、−N(Q)C(O)O−、−C(O)O、−OC(O)O−、−OS(O)(Q2)O−、又は−OP(O)(Q2)O−であり、
Qは、H、アルキル、ω−アミノアルキル、ω−(置換)アミノアルキル、ω−ホスホアルキル、又はω−チオホスホアルキルであり、
Q1は、各存在において独立して、O又はSであり、
Q2は、各存在において独立して、O、S、N(Q)(Q)、アルキル、又はアルコキシであり、
A1及びA2は、各々独立して、−O−、−S−、−CH2−、−CHR5−、−CR5R5−、−CHF−、又は−CF2−であり、
Zは、N又はC(R3)であり、及び
m及びnは、各々独立して0〜5であり、ここでm及びnは一緒になって、3、4、5、6、7、又は8員環をもたらす。

0016

別の態様では、本発明は、式XXXVの構造を有する脂質、その塩又は異性体を提供する:



式中、
R1及びR2は、各存在において各々独立して、随意に置換されたC10〜C30アルキル、随意に置換されたC10〜C30アルコキシ、随意に置換されたC10〜C30アルケニル、随意に置換されたC10〜C30アルケニルオキシ、随意に置換されたC10〜C30アルキニル、随意に置換されたC10〜C30アルキニルオキシ、又は随意に置換されたC10〜C30アシル、又は−リンカー−リガンドであり、
R3は、各存在において独立して、H、随意に置換されたC1〜C10アルキル、随意に置換されたC2〜C10アルケニル、随意に置換されたC2〜C10アルキニル、随意に置換されたアルキルヘテロ環、随意に置換されたヘテロ環アルキル、随意に置換されたアルキルホスフェート、随意に置換されたホスホアルキル、随意に置換されたアルキルホスホロチオアート、随意に置換されたホスホロチオアルキル、随意に置換されたアルキルホスホロジチオアート、随意に置換されたホスホロジチオアルキル、随意に置換されたアルキルホスホネート、随意に置換されたホスホノアルキル、随意に置換されたアミノ、随意に置換されたアルキルアミノ、随意に置換されたジ(アルキル)アミノ、随意に置換されたアミノアルキル、随意に置換されたアルキルアミノアルキル、随意に置換されたジ(アルキル)アミノアルキル、随意に置換されたヒドロキシアルキル、随意に置換されたポリエチレングリコール(PEG、分子量:100〜40K)、随意に置換されたmPEG(分子量:120〜40K)、随意に置換されたへテロアリール、若しくは随意に置換されたヘテロ環、若しくはリンカー−リガンドであり、又は
各R3は、それらが結合している原子と一緒になって、3〜8員の随意に置換されたシクロアルキル基若しくは3〜8員の随意に置換されたヘテロ環基であり、
X及びYは、各々独立して、−O−、−S−、アルキレン、−N(Q)−、−C(O)−、−O(CO)−、−OC(O)N(Q)−、−N(Q)C(O)O−、−C(O)O、−OC(O)O−、−OS(O)(Q2)O−、又は−OP(O)(Q2)O−であり、
Qは、H、アルキル、ω−アミノアルキル、ω−(置換)アミノアルキル、ω−ホスホアルキル、又はω−チオホスホアルキルであり、
Q1は、各存在において独立して、O又はSであり、及び
Q2は、各存在において独立して、O、S、N(Q)(Q)、アルキル、又はアルコキシである。

0017

別の態様では、本発明は、本発明の脂質を含む脂質粒子を提供する。ある実施形態では、脂質粒子は、中性脂質、及び粒子凝集を低減することが可能な脂質をさらに含む。1つの実施形態では、脂質粒子は、(i)本発明の少なくとも1つの脂質、(ii)DSPC、DPPC、POPC、DOPE、及びSMから選択される中性脂質、(iii)ステロール、例えばコレステロール、及び(iv)peg−脂質、例えば、PEG−DMG又はPEG−DMAから本質的になり、モル比は、約20〜60%陽イオン性脂質:5〜25%中性脂質:25〜55%ステロール;0.5〜15%PEG−脂質である。1つの実施形態では、本発明の脂質は光学的に純粋である。

0018

1つの実施形態では、脂質粒子は、本明細書に開示されている少なくとも2つの脂質を含む。例えば、陽イオン性脂質の混合物を脂質粒子に使用することができ、混合物は、モルに基づき20〜60%の総脂質含量を含む。

0019

さらなる関連実施形態では、本発明は、治療薬をさらに含む本発明の脂質粒子を含む。1つの実施形態では、治療薬は核酸である。1つの実施形態では、核酸は、プラスミド、免疫賦活化オリゴヌクレオチド一本鎖オリゴヌクレオチド、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、アンタゴmir;二本鎖オリゴヌクレオチド、例えばsiRNA;アプタマー、又はリボザイムである。

0020

さらに別の関連実施形態では、本発明は、本発明の脂質粒子及び薬学的に許容される賦形剤希釈剤担体を含む医薬組成物を含む。

0021

本発明は、他の関連実施形態では、細胞における標的遺伝子発現を調節する方法であって、細胞に本発明の脂質粒子又は医薬組成物を提供することを含む方法をさらに含む。標的遺伝子は、野生型遺伝子であってもよい。別の実施形態では、標的遺伝子は、1つ以上の突然変異を含有している。特定の実施形態では、本方法は、1つ以上の突然変異を含有する標的遺伝子の発現を特異的に調節することを含む。特定の実施形態では、脂質粒子は、免疫賦活化オリゴヌクレオチド、一本鎖オリゴヌクレオチド、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、アンタゴmir;二本鎖オリゴヌクレオチド、例えばsiRNA、アプタマー、リボザイムから選択される治療薬を含む。1つの実施形態では、核酸は、siRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマー、又はリボザイムをコードするプラスミドである。

0022

本発明の1つの態様では、標的遺伝子は、第VII因子、Eg5、PCSK9、TPX2、apoB、SAA、TTR、RSV、PDGFベータ遺伝子、Erb−B遺伝子、Src遺伝子、CRK遺伝子、GRB2遺伝子、RAS遺伝子、MEKK遺伝子、JNK遺伝子、RAF遺伝子、Erk1/2遺伝子、PCNA(p21)遺伝子、MYB遺伝子、JUN遺伝子、FOS遺伝子、BCL−2遺伝子、サイクリンD遺伝子VEGF遺伝子、EGFR遺伝子、サイクリンA遺伝子、サイクリンE遺伝子、WNT−1遺伝子、ベータカテニン遺伝子、c−MET遺伝子PKC遺伝子、NFKB遺伝子、STAT3遺伝子、サバイビン遺伝子、Her2/Neu遺伝子、SORT1遺伝子、XBP1遺伝子、トポイソメラーゼI遺伝子、トポイソメラーゼIIアルファ遺伝子、p73遺伝子、p21(WAF1/CIP1)遺伝子、p27(KIP1)遺伝子、PPM1D遺伝子、RAS遺伝子、カベオリンI遺伝子、MIB I遺伝子、MTAI遺伝子、M68遺伝子、腫瘍抑制遺伝子中の突然変異、p53腫瘍抑制遺伝子、及びそれらの組合せからなる群から選択される。

0023

別の実施形態では、核酸は、ポリペプチド又はその機能的変異体若しくは断片をコードするプラスミドであり、そのためポリペプチド又はその機能的変異体若しくは断片の発現が増加される。

0024

またさらなる関連実施形態では、本発明は、対象体でポリペプチドが過剰発現されることを特徴とする疾患又は障害を治療する方法であって、対象体に、本発明の脂質粒子又は医薬組成物を提供することを含み、治療薬が、siRNA、マイクロRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、及びsiRNA、マイクロRNA、又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現可能なプラスミドから選択され、siRNA、マイクロRNA、又はアンチセンスRNAが、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと特異的に結合するポリヌクレオチド又はその相補体を含む方法を含む。

0025

別の関連実施形態では、本発明は、対象体でポリペプチドが過小発現されることを特徴とする疾患又は障害を治療する方法であって、対象体に、本発明の医薬組成物を提供することを含み、治療薬が、ポリペプチド又はその機能的変異体若しくは断片をコードするプラスミドである方法を含む。

0026

さらなる実施形態では、本発明は、対象体において免疫応答誘導する方法であって、対象体に、本発明の医薬組成物を提供することを含み、治療薬が免疫賦活化オリゴヌクレオチドである方法を含む。特定の実施形態では、医薬組成物は、ワクチン又は抗原と組み合わせて患者に提供される。

0027

関連実施形態では、本発明は、本発明の脂質粒子と、疾患又は病原体に関連する抗原とを含むワクチンを含む。1つの実施形態では、脂質粒子は、免疫賦活化核酸又はオリゴヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、抗原は、腫瘍抗原である。別の実施形態では、抗原は、ウイルス抗原細菌抗原、又は寄生虫抗原である。

0028

本発明は、本発明の脂質粒子及び医薬組成物を調製する方法、並びにこれらの脂質粒子及び医薬組成物の調製に有用なキットをさらに含む。

0029

別の態様では、本発明は、作用剤、例えば治療薬又は診断薬、及び本発明の脂質を含む組成物を評価する方法を提供する。

図面の簡単な説明

0030

標的指向性リガンドが結合された光学的純粋な脂質の模式図である。
標的指向性リガンドが結合された光学的純粋な脂質の模式図である。
標的指向性リガンドが結合されたラセミ脂質の模式図である。
脂質506、512、又は519を含む製剤を使用したFVII遺伝子のインビボ調節の結果を示す図である。
本発明の脂質の特徴を示す模式図である。
様々な陽イオン性脂質を含有する0.05又は0.005mg/kgの脂質粒子を投与した動物中の相対的FVIIタンパク質レベルを例示するグラフを示す図である。

実施例

0031

本発明は、治療薬をインビボ送達するための脂質粒子で使用される際に利点を提供する陽イオン性脂質の発見に部分的に基づく。特に、添付の実施例により例示されているように、本発明は、本発明による陽イオン性脂質を含む核酸−脂質粒子組成物を提供する。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されている組成物は、核酸の活性亢進及び/又はインビボでの組成物の耐用性の向上を提供し、それにより、以前に記載されている脂質−核酸粒子組成物と比較して、治療指数の著しい増加をもたらすことができる。加えて、特定の治療用核酸−脂質粒子で観察される毒性の軽減を提供することができる組成物及び使用方法が開示される。

0032

ある実施形態では、本発明は、siRNA分子を送達するための改良された組成物を提供する。本明細書では、これらの組成物は、タンパク質レベル及び/又は標的タンパク質のmRNAレベルを下方制御するのに有効であることが示される。さらに、これらの改良された組成物の活性は、特定の陽イオン性脂質の存在に依存し、製剤中の陽イオン性脂質のモル比は、活性に影響を及ぼす場合があることが示される。

0033

本発明の脂質粒子及び組成物は、インビトロ及びインビボの両方で、結合された又は封入された治療薬を細胞に送達すること含む、様々な目的に使用することができる。したがって、本発明は、好適な治療薬に結合した本発明の脂質粒子と対象体を接触させることにより、その必要性のある対象体の疾患又は障害を治療する方法を提供する。

0034

本明細書に記載されているように、本発明の脂質粒子は、例えば、siRNA分子及びプラスミドを含む核酸の送達に特に有用である。したがって、本発明の脂質粒子及び組成物は、標的遺伝子発現(例えば、siRNA)を低減させる核酸、又は所望のタンパク質の発現を増加させるために使用することができる核酸(例えば、所望のタンパク質をコードするプラスミド)に結合された本発明の脂質粒子を細胞と接触させることにより、インビトロ及びインビボの両方で、標的遺伝子及びタンパク質の発現を調節するために使用することができる。

0035

本発明の陽イオン性脂質並びにそれを含む脂質粒子及び組成物、並びに治療薬を送達し遺伝子及びタンパク質発現を調節するためのそれらの使用に関する種々の例示的実施形態は、下記でさらに詳細に記載されている。

0036

脂質
本発明は、特定の設計特徴を有する新規な脂質を提供する。図5に示されているように、脂質の設計特徴には、以下のうちの少なくとも1つが含まれる:様々なpKaを有する頭部基陽イオン性一級二級、及び三級モノアミンジアミン、及びトリアミンオリゴアミンポリアミン、低pKaの頭部基−イミダゾール及びピリジングアニジウム、陰イオン性、双性イオン性、及び疎水性尾部は、対称鎖及び/又は非対称鎖、長鎖及び短鎖飽和鎖及び不飽和鎖を含有していてもよく、骨格は、骨格グリセリド及び非環式類似体エーテルエステルホスフェート及び類似体、スルホネート及び類似体、ジスルフィドアセタール及びケタールのようなpH感受性結合、イミン及びヒドラゾン、並びにオキシムとの環式スピロ二環式、及び多環式結合。

0037

本発明は、治療薬を細胞にインビボ送達するための本発明の脂質粒子に有利に使用される、以下の構造を有する脂質、その塩又は異性体を含む新規な脂質を提供する。



式中、
cyは、随意に置換された環式、随意に置換されたヘテロ環式若しくはヘテロ環、随意に置換されたアリール、又は随意に置換されたへテロアリールであり、
R1及びR2は、各存在において各々独立して、随意に置換されたC10〜C30アルキル、随意に置換されたC10〜C30アルケニル、随意に置換されたC10〜C30アルキニル、随意に置換されたC10〜C30アシル、又は−リンカー−リガンドであり、
X及びYは、各々独立して、O又はS、アルキル又はN(Q)であり、及び
Qは、H、アルキル、アシル、ω−アムニノアキル(amninoalkyl)、ω−(置換)アムニノアルキル、ω−ホスホアルキル、又はω−チオホスホアルキルである。

0038

1つの実施形態では、本脂質、以下の構造、その塩又は異性体を有する:



式中、
R1及びR2は、各存在において各々独立して、随意に置換されたC10〜C30アルキル、随意に置換されたC10〜C30アルケニル、随意に置換されたC10〜C30アルキニル、随意に置換されたC10〜C30アシル、又は−リンカー−リガンドであり、
X及びYは、各々独立して、O又はS、アルキル又はN(Q)であり、
Qは、H、アルキル、アシル、アルキルアミノ、又はアルキルホスフェートであり、及び
RA及びRBは、各々独立して、H、R3、−Z’−R3、−(A2)j−Z’−R3、アシル、スルホネート、又は



であり、
Q1は、各存在において独立して、O又はSであり、
Q2は、各存在において独立して、O、S、N(Q)、アルキル、又はアルコキシであり、
Qは、H、アルキル、ω−アムニノアルキル、ω−(置換)アムニノアルキル、ω−ホスホアルキル、又はω−チオホスホアルキルであり、
A1、A4、及びA5は、各々独立して、O、S、CH2、CHR、又はCF2であり、
Z’は、O、S、N(Q)、又はアルキルであり、
i及びjは、独立して0〜10であり、及び
R3は、H、随意に置換されたC1〜C10アルキル、随意に置換されたC2〜C10アルケニル、随意に置換されたC2〜C10アルケニル、アルキルヘトロ環(alkylhetrocycle)、アルキルホスフェート、アルキルホスホロチオアート、アルキルホスホネート、アルキルアミン、ヒドロキシアルキル、ω−アミノアルキル、ω−(置換)アミノアルキル、ω−ホスホアルキル、ω−チオホスホアルキル、ポリエチレングリコール(PEG、分子量:100〜40K)、mPEG(分子量:120〜40K)、へテロアリール、ヘテロ環、又はリンカー−リガンドである。

0039

別の態様では、本脂質は、以下の構造、その塩又は異性体のうちの1つを有する:






式中、
R1及びR2は、各存在において各々独立して、随意に置換されたC10〜C30アルキル、随意に置換されたC10〜C30アルケニル、随意に置換されたC10〜C30アルキニル、随意に置換されたC10〜C30アシル、又は−リンカー−リガンドであり、
R3は、各存在において独立して、H、随意に置換されたC1〜C10アルキル、随意に置換されたC2〜C10アルケニル、随意に置換されたC2〜C10アルキニル、アルキルヘトロ環、アルキルホスフェート、アルキルホスホロチオアート、アルキルホスホロジチオアート、アルキルホスホネート、アルキルアミン、ヒドロキシアルキル、ω−アミノアルキル、ω−(置換)アミノアルキル、ω−ホスホアルキル、ω−チオホスホアルキル、随意に置換されたポリエチレングリコール(PEG、分子量:100〜40K)、随意に置換されたmPEG(分子量:120〜40K)、へテロアリール、ヘテロ環、又はリンカー−リガンドであり、
R4は、各存在において独立して、H、=O、OR3、又はR3であり、
X及びYは、各々独立して、O、S、アルキル、又はN(Q)であり、
Qは、H、アルキル、ω−アムニノアルキル、ω−(置換)アムニノアルキル、ω−ホスホアルキル、又はω−チオホスホアルキルであり、
Q1は、各存在において独立して、O又はSであり、
Q2は、各存在において独立して、O、S、N(Q)、アルキル、又はアルコキシであり、
A1、A2、A3、A4、A5、及びA6は、各々独立して、O、S、CH2、CHR、又はCF2であり、
A7は、O、S、又はN(Q)であり、
A8は、各存在において独立して、CH2、CHF、又はCF2であり、
A9は、−C(O)−又は−C(H)(R3)−であり、
E及びFは、各存在において各々独立して、O、S、N(Q)、C(O)、C(O)O、C(O)N、S(O)、S(O)2、SS、O=N、アリール、へテロアリール、環式、又はヘテロ環であり、
Zは、N、C(R3)であり、
Z’は、O、S、N(Q)、又はアルキルであり、
kは、0、1、又は2であり、
m及びnは、0〜5であり、ここでm及びnは一緒になって、3、4、5、6、7、又は8員環をもたらし、
pは、1〜5であり、
qは、0〜5であり、ここでp及びqは一緒になって、3、4、5、6、7、又は8員環をもたらし、
i及びjは、0〜10であり、及び
a及びbは、0〜2である。

0040

1つの実施形態では、X及びYは、独立して(CO)、O(CO)、O(CO)N、N(CO)O、(CO)O、O(CO)O、スルホネート、又はホスフェートであってもよい。

0041

1つの実施形態では、R1及びR2は、各存在において互いに独立して、随意に置換されたC10〜C30アルキル、随意に置換されたC10〜C30アルコキシ、随意に置換されたC10〜C30アルケニル、随意に置換されたC10〜C30アルケニルオキシ、随意に置換されたC10〜C30アルキニル、随意に置換されたC10〜C30アルキニルオキシ、又は随意に置換されたC10〜C30アシル、又は−リンカー−リガンドである。

0042

1つの実施形態では、R3は、各存在において独立して、H、随意に置換されたC1〜C10アルキル、随意に置換されたC2〜C10アルケニル、随意に置換されたC2〜C10アルキニル、随意に置換されたアルキルヘテロ環、随意に置換されたヘテロ環アルキル、随意に置換されたアルキルホスフェート、随意に置換されたホスホアルキル、随意に置換されたアルキルホスホロチオアート、随意に置換されたホスホロチオアルキル、随意に置換されたアルキルホスホロジチオアート、随意に置換されたホスホロジチオアルキル、随意に置換されたアルキルホスホネート、随意に置換されたホスホノアルキル、随意に置換されたアミノ、随意に置換されたアルキルアミノ、随意に置換されたジ(アルキル)アミノ、随意に置換されたアミノアルキル、随意に置換されたアルキルアミノアルキル、随意に置換されたジ(アルキル)アミノアルキル、随意に置換されたヒドロキシアルキル、随意に置換されたポリエチレングリコール(PEG、分子量:100〜40K)、随意に置換されたmPEG(分子量:120〜40K)、随意に置換されたへテロアリール、又は随意に置換されたヘテロ環、又はリンカー−リガンドである。

0043

1つの実施形態では、X及びYは、各々独立して、−(O)−、−S−、アルキレン、−N(Q)−、−C(O)−、−O(CO)−、−OC(O)N(Q)−、−N(Q)C(O)O−、−C(O)O、−OC(O)O−、−OS(O)(Q2)O−、又は−OP(O)(Q2)O−である。

0044

1つの実施形態では、Qは、H、アルキル、ω−アミノアルキル、ω−(置換)アミノアルキル、ω−ホスホアルキル、又はω−チオホスホアルキルである。

0045

1つの実施形態では、Q2は、各存在において独立して、O、S、N(Q)(Q)、アルキル、又はアルコキシである。

0046

1つの実施形態では、A1、A2、A3、A4、A5、及びA6は、各々独立して、−(O)−、−S−、−CH2−、−CHR5−、−CR5R5−、−CHF−、又は−CF2−である。

0047

1つの実施形態では、A8は、各存在において各々独立して、−CH2−、−CHR5−、−CR5R5−、−CHF−、又は−CF2−である。

0048

1つの実施形態では、E及びFは、各存在において各独立して、−O−、−S−、−N(Q)−、−C(O)−、−C(O)O−、−OC(O)−、−C(O)N(Q)−、−N(Q)C(O)−、−S(O)−、−S(O)2−、−SS−、−O−N=、=N−O−、アリーレンヘテロアリーレンシクロアルキルエン、又はヘテロシクリレン(heterocyclylene)である。

0049

1つの実施形態では、Zは、N、又はC(R3)である。

0050

1つの実施形態では、Z’は、−O−、−S−、−N(Q)−、又はアルキレンである。

0051

1つの実施形態では、R5は、H、ハロシアノ、ヒドロキシ、アミノ、随意に置換されたアルキル、随意に置換されたアルコキシ、又は随意に置換されたシクロアルキルである。

0052

1つの実施形態では、i及びjは、各々独立して、0〜10である。

0053

1つの実施形態では、a及びbは、各々独立して、0〜2である。

0054

幾つかの状況では、R3は、ω−アミノアルキル、ω−(置換)アミノアルキル、ω−ホスホアルキル、又はω−チオホスホアルキルであり、これらの各々は、随意に置換されている。ω−(置換)アミノアルキル基の例には、2−(ジメチルアミノエチル、3−(ジイソプロピルアミノプロピル、又は3−(N−エチル−N−イソプロピルアミノ)−1−メチルプロピルが含まれる。

0055

1つの実施形態では、X及びYは、独立して−O−、−S−、アルキレン、又は−N(Q)−であってもよい。

0056

飽和アルキル鎖を含む陽イオン性脂質が、膜流動性の増加した脂質核酸粒子を形成するのに特に有用であることを見出した。1つの実施形態では、R1又はR2の少なくとも1つは、少なくとも1つの、少なくとも2つの、又は少なくとも3つの、不飽和、例えば二重結合又は三重結合の部位を含む。

0057

1つの実施形態では、R1又はR2の1つのみが、少なくとも1つの、少なくとも2つの、又は少なくとも3つの不飽和部位を含む。

0058

1つの実施形態では、R1又はR2は両方とも、少なくとも1つの、少なくとも2つの、又は少なくとも3つの不飽和部位を含む。

0059

1つの実施形態では、R1及びR2は、異なる数の不飽和を含み、例えば、R1及びR2のうちの1つは、1つの部位の不飽和を有し、他方は、2つ又は3つの不飽和部位を有する。

0060

1つの実施形態では、R1及びR2は両方とも、同じ数の不飽和部位を含む。

0061

1つの実施形態では、R1及びR2は、異なるタイプの不飽和を含み、例えば、R1及びR2のうちの1つの不飽和は二重結合であり、他方の不飽和は三重結合である。

0062

1つの実施形態では、R1及びR2は両方とも、同じタイプの不飽和、例えば、二重結合又は三重結合を含む。

0063

1つの実施形態では、R1又はR2のうちの少なくとも1つは、少なくとも1つの二重結合及び少なくとも1つの三重結合を含む。

0064

1つの実施形態では、R1又はR2のうちの1つのみが、少なくとも1つの二重結合及び少なくとも1つの三重結合を含む。

0065

1つの実施形態では、R1及びR2は両方とも、少なくとも1つの二重結合及び少なくとも1つの三重結合を含む。

0066

1つの実施形態では、R1及びR2は両方とも同じであり、例えば、R1及びR2は両方とも、リノレイル(C18)であるか、又はR1及びR2は両方とも、ヘプタデカ−9−エニルである。

0067

1つの実施形態では、R1及びR2は互いに異なる。

0068

1つの実施形態では、R1及びR2のうちの少なくとも1つは、コレステロールである。

0069

1つの実施形態では、R1及びR2のうちの1つは、−リンカー−リガンドである。

0070

1つの実施形態では、R1及びR2のうちの1つは、−リンカー−リガンドであり、リガンドは脂肪親和性である。

0071

1つの実施形態では、R1又はR2のうちの少なくとも1つは、1つ又は両方のHがFにより置換されている少なくとも1つのCH2基、例えばCHF又はCF2を含む。1つの実施形態では、R1及びR2は両方とも、1つ又は2つのHがFにより置換されている少なくとも1つのCH2基、例えばCHF又はCF2を含む。

0072

1つの実施形態では、R1及びR2のうちの1つのみが、1つ又は両方のHがFにより置換されている少なくとも1つのCH2基を含む。

0073

1つの実施形態では、R1又はR2のうちの少なくとも1つは、CH2F、CHF2、又はCF3が末端にある。1つの実施形態では、R1又はR2は両方とも、CH2F、CHF2、又はCF3が末端にある。

0074

1つの実施形態では、R1又はR2のうちの少なくとも1つは、−(CF2)y−Z’’−(CH2)y−CH3であり、ここで各yは、独立して1〜10であり、Z’’は、O、S、又はN(Q)である。

0075

1つの実施形態では、R1及びR2は両方とも、−(CF2)y−Z’’−(CH2)y−CH3であり、ここで各yは、独立して1〜10であり、Z’’は、O、S、又はN(Q)である。

0076

1つの実施形態では、R1又はR2のうちの少なくとも1つは、−(CF2)y−Z’’−(CH2)y−CH3であり、ここで各yは、独立して1〜10であり、Z’’は、O、S、又はN(Q)である。

0077

1つの実施形態では、R1及びR2は両方とも、−(CF2)y−Z’’−(CH2)y−CH3であり、ここで各yは、独立して1〜10であり、Z’’は、O、S、又はN(Q)である。

0078

1つの実施形態では、R1又はR2のうちの少なくとも1つは、−(CF2)y−(CF2)y−CF3であり、ここで各yは独立して1〜10である。

0079

1つの実施形態では、R1又はR2は両方とも、−(CF2)y−(CF2)y−CF3であり、ここで各yは独立して1〜10である。

0080

1つの実施形態では、下記式は、



以下のものからなる群から選択される:

0081

1つの実施形態では、R3は、メチル、エチル、ポリアミン、−(CH2)h−へテロアリール、−(CH2)h−N(Q)2、−O−N(Q)2、−(CH2)h−Z’−(CH2)h−へテロアリール、リンカー−リガンド、−(CH2)h−ヘテル環(hetercycle)、及び−(CH2)h−Z’’−(CH2)h−ヘテロ環からなる群から選択され、ここで各hは、独立して0〜13であり、Z’’は、O、S、又はN(Q)である。

0082

1つの実施形態では、ZがC(R3)である場合、少なくとも1つのR3は、ω−アミノアルキル又はω−(置換)アミノアルキルである。

0083

1つの実施形態では、Z’が、O、S、又はアルキルである場合、少なくとも1つのR3は、ω−アミノアルキル又はω−(置換)アミノアルキルである。

0084

1つの実施形態では、Qは、リンカー−リガンドである。

0085

1つの実施形態では、リガンドは、膜融合性ペプチドである。

0086

1つの実施形態では、脂質は、ラセミ混合物である。

0087

1つの実施形態では、脂質は、1つのジアステレオマー濃縮されており、例えば脂質は、少なくとも95%、少なくとも90%、少なくとも80%、又は少なくとも70%のジアステレオマー的過剰を示す。

0088

1つの実施形態では、脂質は、1つの鏡像異性体が濃縮されており、例えば脂質は、少なくとも95%、少なくとも90%、少なくとも80%、又は少なくとも70%の鏡像異性体的過剰を示す。

0089

1つの実施形態では、脂質はキラル的に純粋であり、例えば単一の光学異性体である。

0090

1つの実施形態では、脂質は、1つの光学異性体が濃縮されている。

0091

二重結合が存在する場合(例えば、炭素炭素二重結合又は炭素−窒素二重結合)、二重結合に関する立体配置に異性が存在する場合がある(つまり、cis/trans又はE/Z異性)。二重結合の立体配置が化学構造に示される場合、対応する異性体も存在する場合があることが理解される。異性体が存在する量は、異性体の相対的安定性及び異性体間の変換に必要なエネルギーに依存して様々であり得る。したがって、幾つかの二重結合は、実用的な目的では、単一の立体配置だけで存在するが、他の二重結合は(例えば、相対的安定性が類似しており、変換エネルギーが低い場合)、不可分な立体配置の平衡混合物として存在する場合がある。

0092

別の態様では、本発明は、式XXXIVa、XXXIVb、XXXIVc、XXXIVd、又はXXXIVeの化合物、その塩又は異性体を特色とする:



式中、
R1及びR2は、各存在において各々独立して、随意に置換されたC10〜C30アルキル、随意に置換されたC10〜C30アルケニル、又は随意に置換されたC10〜C30アルキニルであり、
R3は、各存在において独立して、H、随意に置換されたC1〜C10アルキル、随意に置換されたC2〜C10アルケニル、随意に置換されたC2〜C10アルキニル、随意に置換されたアルキルヘテロ環、随意に置換されたヘテロ環アルキル、随意に置換されたアルキルホスフェート、随意に置換されたホスホアルキル、随意に置換されたアルキルホスホロチオアート、随意に置換されたホスホロチオアルキル、随意に置換されたアルキルホスホロジチオアート、随意に置換されたホスホロジチオアルキル、随意に置換されたアルキルホスホネート、随意に置換されたホスホノアルキル、随意に置換されたアミノ、随意に置換されたアルキルアミノ、随意に置換されたジ(アルキル)アミノ、随意に置換されたアミノアルキル、随意に置換されたアルキルアミノアルキル、随意に置換されたジ(アルキル)アミノアルキル、随意に置換されたヒドロキシアルキル、随意に置換されたポリエチレングリコール(PEG、分子量:100〜40K)、随意に置換されたmPEG(分子量:120〜40K)、随意に置換されたへテロアリール、又は随意に置換されたヘテロ環であり、及び
nは1、2、又は3である。

0093

幾つかの実施形態では、R3は、随意に置換されたヘテロ環アルキル、随意に置換されたアミノ、随意に置換されたアルキルアミノ、随意に置換されたジ(アルキル)アミノ、随意に置換されたアミノアルキル、随意に置換されたアルキルアミノアルキル、随意に置換されたジ(アルキル)アミノアルキル、又は随意に置換されたヘテロ環である。

0094

1つの態様では、脂質は、式XIIIaの化合物である:



式中、
R1及びR2は、各存在において各々独立して、随意に置換されたC10〜C30アルキル、随意に置換されたC10〜C30アルケニル、又は随意に置換されたC10〜C30アルキニルであり、
R3及びR3’は、各存在において独立して、H、随意に置換されたC1〜C10アルキル、随意に置換されたC2〜C10アルケニル、随意に置換されたC2〜C10アルキニル、随意に置換されたアルキルヘテロ環、随意に置換されたヘテロ環アルキル、随意に置換されたアルキルホスフェート、随意に置換されたホスホアルキル、随意に置換されたアルキルホスホロチオアート、随意に置換されたホスホロチオアルキル、随意に置換されたアルキルホスホロジチオアート、随意に置換されたホスホロジチオアルキル、随意に置換されたアルキルホスホネート、随意に置換されたホスホノアルキル、随意に置換されたアミノ、随意に置換されたアルキルアミノ、随意に置換されたジ(アルキル)アミノ、随意に置換されたアミノアルキル、随意に置換されたアルキルアミノアルキル、随意に置換されたジ(アルキル)アミノアルキル、随意に置換されたヒドロキシアルキル、随意に置換されたポリエチレングリコール(PEG、分子量:100〜40K)、随意に置換されたmPEG(分子量:120〜40K)、随意に置換されたへテロアリール、又は随意に置換されたヘテロ環であり、
又は、R3及びR3’は、それらが結合している原子と一緒になって、随意に置換されたカルボシクリル、随意に置換されたヘテロシクリル、随意に置換されたアリール、又は随意に置換されたへテロアリールを形成してもよく、これらの各々は、0〜4つのR4の存在で置換されており、
各R4は、随意に置換されたC1〜C10アルキル、随意に置換されたC2〜C10アルケニル、随意に置換されたC2〜C10アルキニル、随意に置換されたアミノ、随意に置換されたアルキルアミノ、随意に置換されたジ(アルキル)アミノ、随意に置換されたアミノアルキル、随意に置換されたアルキルアミノアルキル、随意に置換されたジ(アルキル)アミノアルキル、随意に置換されたヒドロキシアルキル、随意に置換されたアリール、随意に置換されたへテロアリール、又は随意に置換されたヘテロ環から独立して選択され、
X及びYは、各々独立して、−O−、−S−、アルキレン、又は−N(Q)−であり、
Qは、H、アルキル、ω−アミノアルキル、ω−(置換)アミノアルキル、ω−ホスホアルキル、又はω−チオホスホアルキルであり、
A1及びA2は、各々独立して、−O−、−S−、又は−CR5R5−であり、及び
R5は、H、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、アミノ、随意に置換されたアルキル、随意に置換されたアルコキシ、又は随意に置換されたシクロアルキルであり、及び
Z及びZ’は、−O−、−S−、−N(Q)−、アルキレン、又は非存在から各々独立して選択され、及び
a及びbは、各々独立して、0〜2である。

0095

幾つかの実施形態では、X及びYは、各々独立してOである。

0096

幾つかの実施形態では、a及びbの合計は、1、2、又は3である。

0097

幾つかの実施形態では、A1及びA2は、各々独立して−CR5R5−である。

0098

幾つかの実施形態では、Z及びZ’は各々、結合である。

0099

幾つかの実施形態では、R3及びR3’は、それらが結合している原子と一緒になって、随意に置換されたカルボシクリル、随意に置換されたヘテロシクリル、随意に置換されたアリール、又は随意に置換されたへテロアリールを形成してもよい。

0100

幾つかの実施形態では、R3及びR3’は、それらが結合している原子と一緒になって、随意に置換されたカルボシクリル(例えば、随意に置換されたアミノ、アルキルアミノ、又はジアルキルアミノ)を形成してもよい。

0101

幾つかの実施形態では、R3及びR3’は、それらが結合している原子と一緒になって、随意に置換されたヘテロシクリル(例えば、含窒素ヘテロシクリル)を形成してもよい。

0102

幾つかの実施形態では、R3及びR3’は、一緒になって、0〜3つのR4の存在で置換された炭素環(例えば、シクロヘキシル)を形成する。

0103

幾つかの実施形態では、R3及びR3’は、一緒になって、0〜3つのR4の存在で置換されたヘテロ環(例えば、ピペリジン)を形成する。

0104

幾つかの実施形態では、各R4は、随意に置換されたアミノ、随意に置換されたアルキルアミノ、随意に置換されたジ(アルキル)アミノ、随意に置換されたアミノアルキル、随意に置換されたアルキルアミノアルキル、随意に置換されたジ(アルキル)アミノアルキル、及び随意に置換されたヒドロキシアルキルから独立して選択される。

0105

1つの態様では、脂質は、式XXXIXの化合物、その塩又は異性体である:



式中、
R1及びR2は、各存在において各々独立して、随意に置換されたC10〜C30アルキル、随意に置換されたC10〜C30アルケニル、随意に置換されたC10〜C30アルキニル、随意に置換されたC10〜C30アシル、又は−リンカー−リガンドであり、
R3は、各存在において独立して、H、随意に置換されたC1〜C10アルキル、随意に置換されたC2〜C10アルケニル、随意に置換されたC2〜C10アルキニル、アルキルヘトロ環、アルキルホスフェート、アルキルホスホロチオアート、アルキルホスホロジチオアート、アルキルホスホネート、アルキルアミン、ヒドロキシアルキル、ω−アミノアルキル、ω−(置換)アミノアルキル、ω−ホスホアルキル、ω−チオホスホアルキル、随意に置換されたポリエチレングリコール(PEG、分子量:100〜40K)、随意に置換されたmPEG(分子量:120〜40K)、へテロアリール、ヘテロ環、又はリンカー−リガンドであり、
X及びYは、各々独立して、O、C(CO)O、S、アルキル、又はN(Q)であり、
Qは、H、アルキル、ω−アムニノアルキル、ω−(置換)アムニノアルキル、ω−ホスホアルキル、又はω−チオホスホアルキルである。

0106

1つの態様では、脂質は、式XXXIIIの化合物、その塩又は異性体である:



式中、
R1及びR2は、各存在において各々独立して、随意に置換されたC10〜C30アルキル、随意に置換されたC10〜C30アルケニル、随意に置換されたC10〜C30アルキニル、随意に置換されたC10〜C30アシル、又は−リンカー−リガンドであり、
R3は、H、随意に置換されたC1〜C10アルキル、随意に置換されたC2〜C10アルケニル、随意に置換されたC2〜C10アルキニル、アルキルヘトロ環、アルキルホスフェート、アルキルホスホロチオアート、アルキルホスホロジチオアート、アルキルホスホネート、アルキルアミン、ヒドロキシアルキル、ω−アミノアルキル、ω−(置換)アミノアルキル、ω−ホスホアルキル、ω−チオホスホアルキル、随意に置換されたポリエチレングリコール(PEG、分子量:100〜40K)、随意に置換されたmPEG(分子量:120〜40K)、へテロアリール、ヘテロ環、又はリンカー−リガンドであり、
Eは、O、S、N(Q)、C(O)O、C(O)、N(Q)C(O)、C(O)N(Q)、(Q)N(CO)O、O(CO)N(Q)、S(O)、NS(O)2N(Q)、S(O)2、N(Q)S(O)2、SS、O=N、アリール、へテロアリール、環式、又はヘテロ環であり、及び
Qは、H、アルキル、ω−アムニノアルキル、ω−(置換)アムニノアルキル、ω−ホスホアルキル、又はω−チオホスホアルキルである。

0107

1つの実施形態では、R1及びR2は、各存在において各々独立して、随意に置換されたC10〜C30アルキル、随意に置換されたC10〜C30アルコキシ、随意に置換されたC10〜C30アルケニル、随意に置換されたC10〜C30アルケニルオキシ、随意に置換されたC10〜C30アルキニル、随意に置換されたC10〜C30アルキニルオキシ、又は随意に置換されたC10〜C30アシルである。

0108

別の実施形態では、R3は、H、随意に置換されたC1〜C10アルキル、随意に置換されたC2〜C10アルケニル、随意に置換されたC2〜C10アルキニル、随意に置換されたアルキルヘテロ環、随意に置換されたヘテロ環アルキル、随意に置換されたアルキルホスフェート、随意に置換されたホスホアルキル、随意に置換されたアルキルホスホロチオアート、随意に置換されたホスホロチオアルキル、随意に置換されたアルキルホスホロジチオアート、随意に置換されたホスホロジチオアルキル、随意に置換されたアルキルホスホネート、随意に置換されたホスホノアルキル、随意に置換されたアミノ、随意に置換されたアルキルアミノ、随意に置換されたジ(アルキル)アミノ、随意に置換されたアミノアルキル、随意に置換されたアルキルアミノアルキル、随意に置換されたジ(アルキル)アミノアルキル、随意に置換されたヒドロキシアルキル、随意に置換されたポリエチレングリコール(PEG、分子量:100〜40K)、随意に置換されたmPEG(分子量:120〜40K)、随意に置換されたへテロアリール、随意に置換されたヘテロ環、又はリンカー−リガンドである。

0109

さらに別の実施形態では、Eは、−O−、−S−、−N(Q)−、−C(O)O−、−OC(O)−、−C(O)−、−N(Q)C(O)−、−C(O)N(Q)−、−N(Q)C(O)O−、−OC(O)N(Q)−、S(O)、−N(Q)S(O)2N(Q)−、−S(O)2−、−N(Q)S(O)2−、−SS−、−O−N=、=N−O−、−C(O)−N(Q)N=、−N(Q)−N=、−N(Q)−O−、−C(O)S、アリーレン、ヘテロアリーレン、シクルアルキレン(cyclalkylene)、又はヘテロシクリレン。

0110

別の実施形態では、Qは、H、アルキル、ω−アミノアルキル、ω−(置換)アミノアルキル、ω−ホスホアルキル、又はω−チオホスホアルキルである。

0111

1つの実施形態では、脂質は式XXXIIIの化合物であり、ただしEがC(O)Oであり、R3が下記式:



である場合、R1及びR2は、同時にリノレイルではない。

0112

別の実施形態では、脂質は、式XXXIIIの化合物であり、式中Eは、O、S、N(Q)、C(O)、N(Q)C(O)、C(O)N(Q)、(Q)N(CO)O、O(CO)N(Q)、S(O)、NS(O)2N(Q)、S(O)2、N(Q)S(O)2、SS、O=N、アリール、へテロアリール、環式、又はヘテロ環である。

0113

1つの実施形態では、脂質は、式XXXIIIの化合物であり、式中R3は、H、随意に置換されたC2〜C10アルケニル、随意に置換されたC2〜C10アルキニル、アルキルヘトロ環、アルキルホスフェート、アルキルホスホロチオアート、アルキルホスホロジチオアート、アルキルホスホネート、アルキルアミン、ヒドロキシアルキル、ω−アミノアルキル、ω−(置換)アミノアルキル、ω−ホスホアルキル、ω−チオホスホアルキル、随意に置換されたポリエチレングリコール(PEG、分子量:100〜40K)、随意に置換されたmPEG(分子量:120〜40K)、へテロアリール、ヘテロ環、又はリンカー−リガンドである。

0114

さらに別の実施形態では、脂質は、式XXXIIIの化合物であり、式中R1及びR2は、各存在において各々独立して、随意に置換されたC10〜C30アルキル、随意に置換されたC10〜C30アルキニル、随意に置換されたC10〜C30アシル、又は−リンカー−リガンドである。

0115

1つの実施形態では、本発明は、式XXXVIIIの脂質を特色とする:



式中、
Eは、O、S、N(Q)、C(O)O、C(O)、N(Q)C(O)、C(O)N(Q)、(Q)N(CO)O、O(CO)N(Q)、S(O)、NS(O)2N(Q)、S(O)2、N(Q)S(O)2、SS、O=N、アリール、へテロアリール、環式、又はヘテロ環であり、
Qは、H、アルキル、ω−アムニノアルキル、ω−(置換)アムニノアルキル、ω−ホスホアルキル、又はω−チオホスホアルキルであり、
R1、R2、及びRxは、各存在において各々独立して、H、随意に置換されたC1〜C10アルキル、随意に置換されたC10〜C30アルキル、随意に置換されたC10〜C30アルケニル、随意に置換されたC10〜C30アルキニル、随意に置換されたC10〜C30アシル、又はリンカー−リガンドであり、ただしR1、R2、及びRxの少なくとも1つはHではなく、
R3は、H、随意に置換されたC1〜C10アルキル、随意に置換されたC2〜C10アルケニル、随意に置換されたC2〜C10アルキニル、アルキルヘトロ環、アルキルホスフェート、アルキルホスホロチオアート、アルキルホスホロジチオアート、アルキルホスホネート、アルキルアミン、ヒドロキシアルキル、ω−アミノアルキル、ω−(置換)アミノアルキル、ω−ホスホアルキル、ω−チオホスホアルキル、随意に置換されたポリエチレングリコール(PEG、分子量:100〜40K)、随意に置換されたmPEG(分子量:120〜40K)、へテロアリール、ヘテロ環、又はリンカー−リガンドであり、
nは、0、1、2、又は3である。

0116

1つの実施形態では、脂質は、式XXXVIIIの化合物であり、ただし、EがC(O)Oであり、R3が下記式:



であり、R1、R2、又はRxのうちの1つがHである場合、残りのR1、R2、又はRxは、同時にリノレイルではない。

0117

幾つかの実施形態では、R1及びR2の各々は、各存在において独立して、随意に置換されたC10〜C30アルキル、随意に置換されたC10〜C30アルケニル、随意に置換されたC10〜C30アルキニル、随意に置換されたC10〜C30アシル、又はリンカー−リガンドである。

0118

幾つかの実施形態では、Rxは、H又は随意に置換されたC1〜C10アルキルである。

0119

幾つかの実施形態では、Rxは、随意に置換されたC10〜C30アルキル、随意に置換されたC10〜C30アルケニル、随意に置換されたC10〜C30アルキニル、随意に置換されたC10〜C30アシル、又はリンカー−リガンドである。

0120

1つの態様では、本発明は、下記式XLの脂質であることを特徴とし、



式中、
Q1は、O、S、CH2、CHMe、CMe2、N(R)であり、
Q2は、O、S、CH2、CHMe、CMe2、N(R)、C(H)=N−N(R)−、N(R)−N=C(H)、−C(H)=N−O−、−O−N=C(H)、C(H)=N−N(R)−C(O)−、−C(O)−N(R)−N=C(H)であり、
Q3及びQ4は、O、S、N(R)、Q1−C(=Z)Q2、C(H)=N−N(R)−、N(R)−N=C(H);−C(H)=N−O−、−O−N=C(H);C(H)=N−N(R)−C(O)−、−C(O)−N(R)−N=C(H)であり、
Z=O、S、N(R)、又は非存在であり、Zが存在しない場合、C(=Z)はC(Rn)2であり、
pは0〜20であり、qは0〜10であり、rは0〜6であり、sは0〜6である。
R’及び/又はR’は、鎖の炭素原子数が4〜30の範囲のアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、及びそれらの組合せである。アルケニル鎖を有するR’及び/又はR’’は、少なくとも1つのC=C又は置換されたC=C部分を有し、複数のC=C部分が存在する場合、それらは少なくとも1つのメチレン又は置換メチレン基により隔てられている。アルキニル鎖を有するR’及び/又はR’’は、少なくとも1つのC=C部分を有し、複数のC=C部分が存在する場合、それらは少なくとも1つのメチレン又は置換メチレン基により隔てられている。メチレン又は置換メチレンの1つ以上は、O、S、又はN(R)などのヘテロ原子により中断されている。アルキル鎖の1つ以上の二重結合は全て、cis−又はtrans−配置であるか、又は両方の組合せである。式XLのキラル中心立体化学は、R、S、又はラセミである。
Rは、H、鎖の炭素原子数が1〜30の範囲のR’、ω−置換アミノアルキル、ω−置換アミノアルケニル、ω−置換アミノアルキニルであり、
R1〜Rnは、各存在においてRであり、
Xは、R、C(O)−NH(R)、C(O)NR2、C(=NR)NH(R)、C(=NR)NR2、N(R)−C(O)Yであり、及びYは、独立してXである。

0121

1つの態様では、本発明は、下記式XLIの脂質であることを特徴とし、



式中、
Q1は、O、S、CH2、CHMe、CMe2、N(R)であり、
Q2は、O、S、CH2、CHMe、CMe2、N(R)、C(H)=N−N(R)−、N(R)−N=C(H)、−C(H)=N−O−、−O−N=C(H)、C(H)=N−N(R)−C(O)−、−C(O)−N(R)−N=C(H)であり、
Q3及び/又はQ4は、O、S、N(R)、CH2、置換メチレンであり、
Q5及び/又はQ6は、O、S、N(R)、CH2、置換メチレンであり、
Z=O、S、N(R)、又は非存在であり、Zが存在しない場合、C(=Z)はC(Rn)2であり、
pは0〜20であり、qは0〜10であり、rは0〜6であり、sは0〜6である。
R’及び/又はR’は、鎖の炭素原子数が4〜30の範囲のアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、及びそれらの組合せである。アルケニル鎖を有するR’及び/又はR’’は、少なくとも1つのC=C又は置換されたC=C部分を有し、複数のC=C部分が存在する場合、それらは少なくとも1つのメチレン又は置換メチレン基により隔てられている。アルキニル鎖を有するR’及び/又はR’’は、少なくとも1つのC=C部分を有し、複数のC=C部分が存在する場合、それらは少なくとも1つのメチレン又は置換メチレン基により隔てられている。メチレン又は置換メチレンの1つ以上は、O、S、又はN(R)などのヘテロ原子により中断されている。アルキル鎖の1つ以上の二重結合は全て、cis−又はtrans−配置であるか、又は両方の組合せである。式XLIのキラル中心の立体化学は、R、S、又はラセミである。
Rは、H、鎖の炭素原子数が1〜30の範囲のR’、ω−置換アミノアルキル、ω−置換アミノアルケニル、ω−置換アミノアルキニルであり、
R1〜Rnは、各存在においてRであり、
Xは、R、C(O)−NH(R)、C(O)NR2、C(=NR)NH(R)、C(=NR)NR2、N(R)−C(O)Yであり、及びYは、独立してXである。

0122

別の態様では、本発明は、下記式XLII、XLIII、XLIV、XLV、XLVI、XLVII、XLVIII、又はXLIXのうちの1つの脂質であることを特徴とし、






式中、上記に列挙されている変数は、本明細書に記載されている通りであり、上記式の化合物の場合、pは0〜20であり、qは0〜10であり、rは0〜6であり、sは0〜6であり、tは0〜6であり、uは0〜10であり、他の変数は上記に記載されている通りである。

0123

本発明は、本明細書に記載されている脂質を、ラセミ体並びに光学的に純粋な形態で合成することを含む。

0124

1つの態様では、本発明は、下記に提供されている式の脂質であることを特徴とし、



X=O、S、CH2、N(Q3)であり、ここでQは、H、Me、Et、−(CH2)r−N(Q3、Q4)であり; Y=O、S、CH2、N(Q3)であり、ここでQは、H、Me、Et、−(CH2)r−N(Q3、Q4)であり;Z=N、CH、C(Me)、C(Et)であり;Q1=O又はSであり;Q2=O又はSであり;A1、A2=CH2、CHF、CF2であり;m、n、p、及び/又はqは、独立して0〜5である。

0125

本発明は、上記に記載されている陽イオン性脂質を、ラセミで並びに光学的に純粋な形態で合成することを含む。
R1、R2、及びR4は、約10〜30個の炭素原子を有するアルキル基からなる群から各々独立して選択され、そこではR1、R2、及びR4は、独立して、完全に飽和したアルキル鎖、少なくとも1つの二重結合、少なくとも1つの三重結合、少なくとも1つのヘテロ原子、少なくとも1つのCF2、少なくとも1つのCHF、又は少なくとも1つのペルフルオロアルキル化鎖を含む。CF2/CHFは、脂質アンカーに存在してもよく又はコアに存在してもよい。R3は、H、及びC1〜C10アルキル、C1〜C10アルケニル、C1〜C10アルキニル、アルキルヘテロ環、アルキルホスペート(alkylphospates)、アルキルホスホロチオアート、アルキルホスホネート、アルキルアミン、ヒドロキシアルキル、ω−アミノアルキル、ω−(置換)アミノアルキル、ω−ホスホアルキル、ω−チオホスホアルキル、100〜40000の分子量範囲を有するPEG、120〜40000の分子量範囲を有するmPEG、イミダゾール、トリアゾール、ピリジン、ピリミジン、プリン置換ピリジンなどのヘテロ環、GalNAc、葉酸マンノースフコースナプロキセンイブプロフェンなどの受容体標的指向性リガンドを含有するアルキル/PEGスペーサーからなる群から独立して選択され、リガンドには、ケモカインインテグリンソマトスタチンアンドロゲン、及びCNS受容体に結合する低分子が含まれる。R3は、脂質コアアンカー間のスペーサーを有していない上記のリガンドも包含する。

0126

1つの実施形態では、陽イオン性脂質は、下記の表1に示されている脂質からなる群から選択される。

0127

脂質のジアステレオマーは全てが示されているとは限らないが、本発明の1つの態様は、全てのジアステレオマーを提供するものであり、したがって、キラル的に純粋な脂質及びジアステレオマー的に濃縮された脂質も、本発明の一部である。

0128

1つの実施形態では、R3は、−リンカー−リガンドである。

0129

1つの実施形態では、脂質は、標的指向性陽イオン性脂質であり、下記の表2に示されている脂質からなる群から選択される。



脂質のジアステレオマーは全てが示されているとは限らないが、本発明の1つの態様は、全てのジアステレオマーを提供するものであり、したがって、キラル的に純粋な脂質及びジアステレオマー的に濃縮された脂質も、本発明の一部である。

0130

特定の実施形態では、本発明の脂質は、陽イオン性脂質である。本明細書で使用されるとき、「陽イオン性脂質」という用語は、1つ又は2つの脂肪酸又は脂肪アルキル鎖及び生理学的なpHでプロトン化されて陽イオン性脂質を形成することができるアミノ頭部基(アルキルアミノ又はジアルキルアミノ基を含む)を有する脂質を含むことが意図されている。幾つかの実施形態では、陽イオン性脂質は、「アミノ脂質」と呼ばれる。

0131

他の陽イオン性脂質には、アルキル置換基が異なるもの(例えば、N−エチル−N−メチルアミノ−、N−プロピル−N−エチルアミノ−など)を含む、代替的な脂肪酸基及び他のジアルキルアミノ基を有するものが含まれるだろう。R1及びR2が両方とも長鎖アルキル又はアシル基である実施形態の場合、それらは、同じであってもよく又は異なっていてもよい。一般的に、より低飽和アシル鎖を有する脂質(例えば、陽イオン性脂質)は、特に複合体がろ過滅菌するために約0.3マイクロメートル未満にサイズ化される場合、より容易にサイズ化することができる。C10〜C20の範囲の炭素鎖長を有する不飽和脂肪酸を含有する陽イオン性脂質が典型的である。他の骨格を使用して、アミノ基(例えば、陽イオン性脂質のアミノ基)と、陽イオン性脂質の脂肪酸又は脂肪アルキル部分とを分離することもできる。好適な骨格は当業者に公知である。

0132

ある実施形態では、本発明の陽イオン性脂質は、少なくとも1つのプロトン化可能な基又は脱プロトン化可能な基を有しており、そのため脂質は、生理学的なpH(例えば、pH7.4)以下で正に荷電され、第2のpHで、好ましくは生理学的なpHで又はそれを超えたpHで中性である。そのような脂質も、陽イオン性脂質と呼ばれる。無論、pHの関数としてのプロトンの付加又は脱離が、平衡プロセスであり、荷電脂質又は中性脂質への言及は、支配的な種の性質を指し、脂質の全てが荷電形態又は中性形態にあることを必要としないことが理解されるだろう。複数のプロトン化可能な基又は脱プロトン化可能な基を有するか、又は双性イオンである脂質は、本発明における使用から除外されない。

0133

ある実施形態では、本発明によるプロトン化可能な脂質(つまり、陽イオン性脂質)は、プロトン化可能な基のpKaが約4〜約11の範囲である。典型的には、脂質は、脂質粒子に組み込まれた際に、約4〜約7のpKa、例えば約5.5〜6.8など、約4〜約7のpKaを有するだろう。そのような脂質は、より低いpHの製剤段階では陽イオン性であるが、粒子は、pH7.4付近の生理学的なpHでは、表面がほとんど(完全でないが)中性化されるだろう。約4〜7の範囲のpKaの有益性の1つは、粒子の外側表面に結合している少なくともある程度の核酸が、生理学的なpHでその静電的相互作用喪失し、簡単な透析により除去されるということであり、したがってクリアランスに対する粒子の感受性が大幅に低減される。脂質粒子内の脂質のpKa測定は、例えば、Cullis et al., (1986) Chem Phys Lipids40, 127−144に記載されている方法を使用して、蛍光プローブである2−(p−トルイジノ)−6−ナフタレンスルホン酸(TNS)を使用することにより実施することができる。

0134

1つの実施形態では、本発明の製剤は、少なくとも75%、少なくとも80%、又は少なくとも90%が封入される。

0135

1つの実施形態では、本発明の製剤は、アポリポタンパク質をさらに含む。本明細書で使用されるとき、「アポリポタンパク質」又は「リポタンパク質」という用語は、当業者に公知のアポリポタンパク質並びにその変異体及び断片、並びに下記に記載されているアポリポタンパク質アゴニスト、その類似体又は断片を指す。

0136

好適なアポリポタンパク質には、これらに限定されないが、ApoA−I、ApoA−II、ApoA−IV、ApoA−V、及びApoE、並びに活性多形型形態アイソフォーム、変異体、及び突然変異体、並びにそれらの断片又は切断型形態が含まれる。ある実施形態では、アポリポタンパク質は、チオール含有アポリポタンパク質である。「チオール含有アポリポタンパク質」は、少なくとも1つのシステイン残基を含有するアポリポタンパク質、変異体、断片、又はアイソフォームを指す。最も一般的なチオール含有アポリポタンパク質は、1つのシステイン残基を含有するApoA−I Milano(ApoA−IM)及びApoA−I Paris(ApoA−IP)である(Jia et al., 2002, Biochem. Biophys. Res. Comm. 297: 206−13;Bielicki and Oda, 2002, Biochemistry 41: 2089−96)。ApoA−II、ApoE2、及びApoE3も、チオール含有アポリポタンパク質である。その組換え的に産生された形態を含む単離されたApoE及び/又はその活性断片及びポリペプチド類似体は、米国特許第5,672,685号;同第5,525,472号;同第5,473,039号;同第5,182,364号;同第5,177,189号;同第5,168,045号;同第5,116,739号に記載されており、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。ApoE3は、Weisgraber, et al., “Human E apoprotein heterogeneity: cysteine−arginine interchanges in the amino acid sequence of the apo−E isoforms,” J. Biol. Chem. (1981) 256: 9077−9083;及びRall, et al., “Structural basis for receptor binding heterogeneity of apolipoprotein E from type III hyperlipoproteinemic subjects,” Proc. Nat. Acad. Sci. (1982) 79: 4696−4700に記載されている。GenBank受入番号K00396も参照されたい。

0137

ある実施形態では、アポリポタンパク質は、その成熟形態であってもよく、そのプレプロアポリポタンパク質形態であってもよく、又はそのプロアポリタンパク質形態であってもよい。プロApoA−I及び成熟ApoA−I(可能な場合)(Duverger et al., 1996, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 16(12):1424−29)、ApoA−I Milano(Klon et al. , 2000, Biophys. J. 79:(3)1679−87;Franceschini et al., 1985, J. Biol. Chem. 260: 1632−35)、ApoA−I Paris(Daum et al., 1999, J. Mol. Med. 77:614−22)、ApoA−II(Shelness et al., 1985, J. Biol. Chem. 260(14):8637−46; Shelness et al., 1984, J. Biol. Chem. 259(15):9929−35)、ApoA−IV(Duverger et al., 1991, Euro. J. Biochem. 201(2):373−83)、及びApoE(McLean et al., 1983, J. Biol. Chem. 258(14):8993−9000)のホモダイマー及びヘテロダイマーも、本発明の範囲内で使用することができる。

0138

ある実施形態では、アポリポタンパク質は、アポリポタンパク質の断片、変異体、又はアイソフォームであってもよい。「断片」という用語は、天然アポリポタンパク質のアミノ酸配列よりも短いアミノ酸配列を有する任意のアポリポタンパク質を指し、断片は、脂質結合特性を含む天然アポリポタンパク質の活性を保持する。「変異体」とは、アポリポタンパク質のアミノ酸配列における置換又は変更を意味し、置換又は変更、例えばアミノ酸残基の付加及び欠失は、脂質結合特性を含む天然アポリポタンパク質の活性を消失させない。したがって、変異体は、1つ以上のアミノ酸残基が化学的に類似しているアミノ酸保守的に置換された本明細書で提供される天然アポリポタンパク質と、実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチドを含むことができる。保存的置換の例には、イソロイシンバリンロイシン、又はメチオニンなどの少なくとも1つの疎水性残基を別の残基に置換することが含まれる。同様に、例えば、本発明は、例えばアルギニンリジンとの間、グルタミンアスパラギンとの間、及びグリシンセリンとの間などの、少なくとも1つの親水性残基の置換を企図する(米国特許第6,004,925号、同第6,037,323号、及び同第6,046,166号を参照)。「アイソフォーム」という用語は、同じ機能、より大きな機能、又は部分的な機能、及び類似した配列、同一の配列、又は部分的な配列を有するタンパク質を指し、同じ遺伝子の産物であってもよいか、なくてもよい、通常は組織特異的である(Weisgraber 1990, J. Lipid Res. 31(8):1503−11;Hixson and Powers 1991, J. Lipid Res. 32(9):1529−35;Lackner et al., 1985, J. Biol. Chem. 260(2):703−6;Hoeg et al., 1986, J. Biol. Chem. 261(9):3911−4;Gordon et al., 1984, J. Biol. Chem. 259(1):468−74;Powell et al., 1987, Cell 50(6):831−40;Aviram et al., 1998, Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 18(10):1617−24;Aviram et al., 1998, J. Clin. Invest. 101(8):1581−90;Billecke et al., 2000, Drug Metab. Dispos. 28(11):1335−42;Draganov et al., 2000, J. Biol. Chem. 275(43):33435−42;Steinmetz and Utermann 1985, J. Biol. Chem. 260(4):2258−64;Widler et al., 1980, J. Biol. Chem. 255(21):10464−71;Dyer et al., 1995, J. Lipid Res. 36(1):80−8; Sacre et al., 2003, FEBSLett. 540(1−3):181−7;Weers, et al., 2003, Biophys. Chem. 100(1−3):481−92;Gong et al., 2002, J. Biol. Chem. 277(33):29919−26;Ohta et al., 1984, J. Biol. Chem. 259(23):14888−93、及び米国特許第6,372,886号)。

0139

ある実施形態では、本発明の方法及び組成物は、アポリポタンパク質のキメラ構築体の使用を含む。例えば、アポリポタンパク質のキメラ構築体は、虚血再灌流保護特性を有するアポリポタンパク質ドメインに結合している、高い脂質結合力を有するアポリポタンパク質ドメインで構成されていてもよい。アポリポタンパク質のキメラ構築体は、アポリポタンパク質内にある個別の領域を含む構築体(つまり、相同性構築体)であってもよく、又はキメラ構築体は、アポリポタンパク質間で異なる個別の領域を含む構築体(つまり、異種性構築体)であってもよい。キメラ構築体を含む組成物は、特定の特徴(例えば、脂質結合、受容体結合、酵素性、酵素活性化抗酸化特性、又は酸化還元特性)を有するように設計されたアポリポタンパク質変異体又はセグメントであるセグメントを含むこともできる(Weisgraber 1990, J. Lipid Res. 31(8):1503−11;Hixson and Powers 1991, J. Lipid Res. 32(9):1529−35;Lackner et al., 1985, J. Biol. Chem. 260(2):703−6;Hoeg et al, 1986, J. Biol. Chem. 261(9):3911−4;Gordon et al., 1984, J. Biol. Chem. 259(1):468−74;Powell et al., 1987, Cell 50(6):831−40;Aviram et al., 1998, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 18(10):1617−24;Aviram et al., 1998, J. Clin. Invest. 101(8):1581−90;Billecke et al., 2000, Drug Metab. Dispos. 28(11):1335−42;Draganov et al., 2000, J. Biol. Chem. 275(43):33435−42;Steinmetz and Utermann 1985, J. Biol. Chem. 260(4):2258−64;Widler et al., 1980, J. Biol. Chem. 255(21):10464−71;Dyer et al., 1995, J. Lipid Res. 36(1):80−8;Sorenson et al., 1999, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 19(9):2214−25;Palgunachari 1996, Arterioscler. Throb. Vasc. Biol. 16(2):328−38:Thurberg et al., J. Biol. Chem. 271(11):6062−70;Dyer 1991, J. Biol. Chem. 266(23):150009−15;Hill 1998, J. Biol. Chem. 273(47):30979−84を参照)。

0140

本発明で使用されるアポリポタンパク質には、組換え、合成、半合成、又は精製されたアポリポタンパク質も含まれる。本発明により使用されるアポリポタンパク質又はその等価物を取得するための方法は、当該技術分野で周知である。例えば、アポリポタンパク質は、例えば密度勾配遠心分離又は免疫親和性クロマトグラフィーで血漿又は天然産物から分離してもよく、又は合成的に、半合成的に、若しくは当業者に公知の組換えDNA技術を使用して生成してもよい(例えば、Mulugeta et al., 1998, J. Chromatogr. 798(1−2): 83−90;Chung et al., 1980, J. Lipid Res. 21(3):284−91;Cheung et al., 1987, J. Lipid Res. 28(8):913−29;Persson, et al., 1998, J. Chromatogr. 711:97−109;米国特許第5,059,528号、同第5,834,596号、同第5,876,968号、及び同第5,721,114号;並びに国際公開第86/04920号及び国際公開第87/02062号を参照)。

0141

本発明で使用されるアポリポタンパク質には、ApoA−I、ApoA−I Milano(ApoA−IM)、ApoA−I Paris(ApoA−IP)、ApoA−II、ApoA−IV、及びApoEの活性を模倣するペプチド及びペプチド類似体などのアポリポタンパク質アゴニストをさらに含む。例えば、アポリポタンパク質は、米国特許第6,004,925号、同第6,037,323号、同第6,046,166号、及び同第5,840,688号に記載されているもののいずれかであってもよく、それらの内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

0142

アポリポタンパク質アゴニストペプチド又はペプチド類似体は、例えば、米国特許第6,004,925号、同第6,037,323号、及び同第6,046,166号に記載されている技術などの、当該技術分野で公知である任意のペプチド合成技術を使用して、合成又は製造することができる。例えば、ペプチドは、Merrifield(1963, J. Am. Chem. Soc. 85:2149−2154)により最初に記載されている固相合成技術を使用して調製することができる。他のペプチド合成技術は、Bodanszky et al., Peptide Synthesis, John Wiley & Sons, 2d Ed., (1976)、及び当業者が容易に入手可能な他の文献に見出すことができる。ポリペプチド合成技術の要約は、Stuart and Young, Solid Phase Peptide. Synthesis, Pierce Chemical Company, Rockford, Ill., (1984)に見出すことができる。ペプチドは、The Proteins, Vol. II, 3d Ed., Neurath et. al., Eds., p. 105−237, Academic Press, New York, N.Y. (1976)に記載されているような溶液法により合成することもできる。様々なペプチド合成に使用するための適切な保護基は、前述の文献並びにMcOmie, Protective Groups in Organic Chemistry, Plenum Press, New York, N.Y. (1973)に記載されている。本発明のペプチドは、例えば、アポリポタンパク質A−Iのより大きな部分から、化学的に又は酵素的に切断することにより調製することもできる。

0143

ある実施形態では、アポリポタンパク質は、アポリポタンパク質の混合物であってもよい。1つの実施形態では、アポリポタンパク質は、均質な混合物、すなわち単一のタイプのアポリポタンパク質であってもよい。別の実施形態では、アポリポタンパク質は、アポリポタンパク質の異種性混合物、すなわち2つ以上の異なるアポリポタンパク質の混合物であってもよい。アポリポタンパク質の異種性混合物の実施形態は、例えば、動物供給源由来するアポリポタンパク質及び半合成的供給源に由来するアポリポタンパク質の混合物を含むことができる。ある実施形態では、異種性混合物は、例えば、ApoA−I及びApoA−I Milanoの混合物を含むことができる。ある実施形態では、異種性混合物は、例えば、ApoA−I Milano及びApoA−I Parisの混合物を含むことができる。本発明の方法及び組成物に使用するための好適な混合物は、当業者であれば明白であろう。

0144

アポリポタンパク質が天然供給源から取得される場合、アポリポタンパク質は、植物又は動物供給源から取得することができる。アポリポタンパク質が動物供給源から取得される場合、アポリポタンパク質は、任意の種に由来してよい。ある実施形態では、アポリポタンパク質は、動物供給源から取得することができる。ある実施形態では、アポリポタンパク質は、ヒト供給源から取得することができる。本発明の好ましい実施形態では、アポリポタンパク質は、アポリポタンパク質が投与される個体と同じ種に由来する。

0145

脂質粒子
本発明は、上述の陽イオン性脂質の1つ以上を含む脂質粒子も提供する。脂質粒子には、リポソームが含まれるが、これに限定されない。本明細書で使用されるとき、リポソームとは、水性の内部を取り囲む脂質含有膜を有する構造である。リポソームは、1つ以上の脂質膜を有していてもよい。本発明は、単層膜と呼ばれる単一層状リポソーム及び多重層膜と呼ばれる複数層状リポソームの両方を企図する。また、脂質粒子は、核酸と複合体化した際に、例えば、Felgner, Scientific Americanに記載されているような、DNA層の間に挟まれた陽イオン性脂質二分子膜で構成されるリポプレックスであってもよい。

0146

本発明の脂質粒子は、1つ以上のさらなる脂質及び/又はコレステロールなどの他の成分をさらに含んでいてもよい。他の脂質が、脂質酸化を防止するため又はリポソーム表面にリガンドを結合させるためなどの様々な目的で、本発明のリポソーム組成物に含まれていてもよい。両親媒性、中性、陽イオン性、及び陰イオン性脂質を含む多数の脂質のいずれが、本発明のリポソーム中に存在していてもよい。そのような脂質は、単独で又は組合せで使用することができる。存在していてもよいさらなる脂質成分の特定の例は、下記に記載されている。

0147

本発明の脂質粒子に存在していてもよいさらなる成分には、ポリアミドオリゴマーなどの二分子膜安定化成分(例えば、米国特許第6,320,017号を参照)、ペプチド、タンパク質、界面活性剤ホスファチジルエタノールアミンに結合されたPEG及びセラミドに結合されたPEGなどの脂質誘導体(米国特許第5,885,613号を参照)が含まれる。

0148

特定の実施形態では、脂質粒子には、第2のアミノ脂質又は陽イオン性脂質、中性脂質、ステロール、及び形成中の脂質粒子の凝集を低減するために選択される脂質のうちの1つ以上が含まれ、凝集の低減は、形成中の電荷誘導性凝集を防止する粒子の立体安定化の結果であり得る。

0149

形成中の粒子の凝集を低減する脂質の例には、ポリエチレングリコール(PEG)修飾脂質モノシアロガングリオシドGm1、及びポリアミドオリゴマー(「PAO」)(米国特許第6,320,017号に記載されているものなど)が含まれる。PEG、Gm1、又はATTAのような製剤中の凝集を防止する無荷電で親水性立体障害部分を有する他の化合物を、本発明の方法及び組成物に使用するための脂質に結合させることもできる。ATTA脂質は、例えば米国特許第6,320,017号に記載されており、PEG脂質結合体は、例えば米国特許第5,820,873号、同第5,534,499号、及び同第5,885,613号に記載されている。典型的には、凝集を低減するために選択される脂質成分の濃度は、約1〜15%である(脂質のモルパーセントによる)。

0150

本発明に有用なPEG修飾脂質(又は脂質−ポリオキシエチレン結合体)の特定の例は、脂質小胞の表面にPEG部分を固定するための様々な「係留脂質部分を有することができる。好適なPEG修飾脂質の例には、PEG修飾ホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジン酸、参照により本明細書に組み込まれる同時係属の米国特許出願第08/486,214号に記載されているPEG−セラミド結合体(例えば、PEG−CerC14又はPEG−CerC20)、PEG修飾ジアルキルアミン、及びPEG修飾1,2−ジアシルオキシプロパン−3−アミンが含まれる。特に、PEG修飾ジアシルグリセロール及びジアルキルグリセロールが好ましい。

0151

PEG又はATTAなどの立体的に大きな部分が、脂質アンカーに結合される実施形態では、脂質アンカーの選択は、結合体が脂質粒子と共に有することになる結合のタイプに依存する。mPEG(分子量2000)−ジアステアイルホスファチジルエタノールアミン(PEG−DSPE)は、粒子が循環から排除されるまで、おそらくは数日間程度、リポソームと結合したままであることは周知である。PEG−CerC20などの他の結合体は、同様の滞留能力を有する。しかしながら、PEG−CerC14は、幾つかのアッセイでは、血清と接触した際に60分未満のT1/2で迅速に交換して製剤から外へと出ていく。米国特許出願第08/486,214号に例示されているように、少なくとも3つの特徴:アシル鎖の長さ、アシル鎖の飽和度、及び立体障害性頭部基のサイズが、交換速度に影響を及ぼす。これらの特徴の好適な変異を有する化合物は、本発明に有用であり得る。幾つかの治療用途の場合、PEG修飾脂質は、インビボで核酸−脂質粒子から迅速に失われることが好ましい場合があり、したがってPEG修飾脂質は比較的短い脂質アンカーを有するだろう。他の治療用途では、核酸−脂質粒子は、より長い血漿循環寿命を示すことが好まましい場合があり、したがってPEG修飾脂質は、比較的より長い脂質アンカーを有するだろう。

0152

凝集防止化合物は、適切に機能するために脂質結合を必ずしも必要としないことに留意すべきである。溶液中の遊離PEG又は遊離ATTAは、凝集を防止するのに十分であり得る。粒子が製剤後に安定している場合、PEG又はATTAは、対象体に投与する前に透析して取り除くことができる。

0153

中性脂質は、脂質粒子に存在する場合、生理学的なpHで無荷電の又は中性の双性イオン形態のいずれかで存在する多くの脂質種のいずれであってもよい。そのような脂質には、例えば、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリンジヒドロスフィンゴミエリン、ケファリン、及びセレブロシドが含まれる。本明細書に記載されている粒子に使用するための中性脂質の選択は、一般的には、例えばリポソームのサイズ及び血流中のリポソームの安定性を考慮することにより導かれる。好ましくは、中性脂質成分は、2つのアシル基を有する脂質である(つまり、ジアシルホスファチジルコリン及びジアシルホスファチジルエタノールアミン)。様々な鎖長及び様々な飽和度のアシル鎖基を有する脂質は、入手可能であるか、又は周知の技術により単離又は合成することができる。1つの群の実施形態では、C10〜C20の範囲の炭素鎖長を有する飽和脂肪酸を含有する脂質が好ましい。別の群の実施形態では、C10〜C20の範囲の炭素鎖長を有するモノ飽和又はジ飽和脂肪酸を有する脂質が使用される。加えて、飽和及び不飽和脂肪酸鎖の混合物を有する脂質を使用することができる。好ましくは、本発明で使用される中性脂質は、DOPE、DSPC、POPC、DPPC、又は任意の関連ホスファチジルコリンである。本発明に有用な中性脂質は、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、又はセリン及びイノシトールなどの他の頭部基を有するリン脂質で構成されていてもよい。

0154

脂質混合物ステロール成分は、存在する場合、リポソーム、脂質小胞、又は脂質粒子調製の分野で従来使用されているステロールのいずれであってもよい。好ましいステロールはコレステロールである。

0155

具体的に上述されているものに加えて、生理学的pH付近で正味正電荷担持する他の陽イオン性脂質も、本発明の脂質粒子に含まれ得る。そのような陽イオン性脂質には、これらに限定されないが、以下のものが含まれる:N,N−ジオレイル−N,N−ジメチルアンモニウムクロリド(「DODAC」);N−(2,3−ジオレイルオキシ)プロピル−N,N−N−トリエチルアンモニウムクロリド(「DOTMA」);N,N−ジステアリル−N,N−ジメチルアンモニウムブロミド(「DDAB」);N−(2,3−ジオレオイルオキシ)プロピル)−N,N,N−トリメチルアンモニウムクロリド(「DOTAP」);1,2−ジオレイルオキシ−3−トリメチルアミノプロパンクロリド塩(「DOTAP.Cl」);3−(N−(N’,N’−ジメチルアミノエタン)−カルバモイル)コレステロール(「DC−Chol」)、N−(1−(2,3−ジオレイルオキシ)プロピル)−N−2−(スペルミンカルボキサミド)エチル)−N,N−ジメチルアンモニウムトリフルオルアセテート(「DOSPA」)、ジオクタデシルアミドグリシルカルボキシスペルミン(「DOGS」)、1,2−ジレオイル−sn−3−ホスホエタノールアミン(「DOPE」)、1,2−ジオレオイル−3−ジメチルアンモニウムプロパン(「DODAP」)、N、N−ジメチル−2,3−ジオレイルオキシ)プロピルアミン(「DODMA」)、及びN−(1,2−ジミリスチルオキシプロプ−3−イル)−N,N−ジメチル−N−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド(「DMRIE」)。加えて、例えば、LIPOFECTIN(DOTMA及びDOPEを含む、GIBCO/BRL社から入手可能)、及びLIPOFECTAMINE(DOSPA及びDOPEを含む、GIBCO/BRL社から入手可能)などの、多くの市販の陽イオン性脂質調製物を使用することができる。特定の実施形態では、陽イオン性脂質は、アミノ脂質である。

0156

本発明の脂質粒子に使用するのに好適な陰イオン性脂質には、これらに限定されないが、ホスファチジルグリセロールカルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、N−ドデカノイホスファチジルエタノロアミン(N−dodecanoyl phosphatidylethanoloamine)、N−スクシニルホスファチジルエタノールアミン、N−グルタリルホスファチジルエタノールアミン、リシルホスファチジルグリセロール、及び中性脂質に結合された他の陰イオン性修飾基が含まれる。

0157

多くの実施形態では、両親媒性脂質が、本発明の脂質粒子に含まれる。「両親媒性脂質」は、脂質物質の疎水性部分が疎水性相に向けて配置され、親水性部分が水相に向けて配置されている任意の好適な物質を指す。そのような化合物には、これらに限定されないが、リン脂質、アミノ脂質、及びスフィンゴ脂質が含まれる。代表的なリン脂質には、スフィンゴミエリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、パルミトイルオレオイルホスファトルコリン(palmitoyloleoyl phosphatdylcholine)、リゾフォスファチジルコリン、リゾフォスファチジルエタノールアミンジパルミトイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、又はジリノレオイルホスファチジルコリンが含まれる。スフィンゴ脂質、スフィンゴ糖脂質ファミリー、ジアシルグリセロール、及び −アシルオキシ酸などの他のリン欠失化合物を使用することもできる。加えて、そのような両親媒性脂質は、トリグリセリド及びステロールなどの他の脂質と、容易に混合することができる。

0158

また、本発明の脂質粒子への包含に好適なのは、プログラム可能な融合脂質である。そのような脂質粒子は、所定のシグナル事象が生じるまで、細胞膜と融合してそれらのペイロードを送達する傾向をほとんど示さない。これにより、脂質粒子は、生物又は疾患部位に注射された後、細胞との融合を開始する前に、より均一に分布することが可能になる。シグナル事象は、例えば、pH、温度、イオン環境、又は時間の変化であってもよい。後者の場合、ATTA−脂質結合体又はPEG−脂質結合体などの、融合遅延成分又は「被覆(cloaking)」成分は、単に時間の経過と共に交換して脂質粒子膜から外に出ていくことができる。脂質粒子は、体内で適切に分布するまでに、十分な被覆剤を失って膜融合性になる。他のシグナル事象を用いる場合、炎症部位での温度上昇などの、疾患部位又は標的細胞に関連するシグナルを選択することが望ましい。

0159

ある実施形態では、細胞タイプ又は組織に特異的な標的指向性部分を使用して、本発明の脂質粒子を標的指向性にすることが望ましい。リガンド、細胞表面受容体糖タンパク質ビタミン(例えば、リボフラビン)、及びモノクローナル抗体などの様々な標的指向性部分を使用して、脂質粒子を標的指向性にすることは、以前に記載されている(例えば、米国特許第4,957,773号及び同第4,603,044号を参照)。標的指向性部分は、タンパク質全体又はその断片を含むことができる。標的指向性機序では、一般的に、標的指向性物質は、標的部分が標的、例えば細胞表面受容体との相互作用利用可能なように、脂質粒子の表面に配置されていることが必要である。様々な異なる標的指向性物質及び方法は、例えば、Sapra, P. and Allen, TM, Prog. Lipid Res. 42(5):439−62 (2003);及びAbra, RM et al., J. Liposome Res. 12:1−3, (2002)に記載されているものを含み、当該技術分野において公知であり、入手可能である。

0160

ポリエチレングリコール(PEG)鎖などの親水性ポリマー鎖で表面がコーティングされている脂質粒子、つまりリポソームの使用が、提唱されている(Allen, et al., Biochimica et Biophysica Acta 1237: 99−108 (1995);DeFrees, et al., Journal of the American Chemistry Society 118: 6101−6104 (1996);Blume, et al., Biochimica et Biophysica Acta 1149: 180−184 (1993);Klibanov, et al., Journal of Liposome Research 2: 321−334 (1992);米国特許第5,013556号;Zalipsky, Bioconjugate Chemistry 4: 296−299 (1993);Zalipsky, FEBSLetters 353: 71−74 (1994);Zalipsky, in Stealth Liposomes Chapter 9 (Lasic and Martin, Eds)CRCPress, Boca Raton Fl (1995))。1つの手法では、脂質粒子を標的指向性にするための、抗体などのリガンドを、脂質粒子を形成する脂質の極性頭部基に結合させる。別の手法では、親水性ポリマーコーティングを形成するPEG鎖遠位端部に標的指向性リガンドを結合させる(Klibanov, et al., Journal of Liposome Research 2: 321−334 (1992);Kirpotin et al., FEBS Letters 388: 115−118 (1996))。

0161

標的指向性物質を結合させるためには、標準的方法を使用することができる。例えば、標的指向性物質を結合するために活性化することができるホスファチジルエタノールアミン、又は脂質誘導体化ブレオマイシンなどの誘導体化親油性化合物を使用することができる。抗体標的化リポソームは、例えば、プロテインAが組み込まれているポソームを使用して構築することができる(Renneisen, et al., J. Bio. Chem., 265:16337−16342 (1990) and Leonetti, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 87:2448−2451 (1990)を参照)。抗体結合の他の例は、米国特許第6,027,726号に開示されており、それらの教示は、参照により本明細書に組み込まれる。標的指向性部分の例には、新生物又は腫瘍に関連する抗原を含む細胞成分に特異的な他のタンパク質も含まれ得る。標的指向性部分として使用されるタンパク質は、共有結合によりリポソームに結合することができる(Heath, Covalent Attachment of Proteins to Liposomes, 149 Methodsin Enzymology 111−119 (Academic Press, Inc. 1987)を参照)。他の標的指向化法には、ビオチンアビジン系が含まれる。

0162

1つの例示的な実施形態では、脂質粒子は、本発明の陽イオン性脂質、中性脂質(陽イオン性脂質以外)、ステロール(例えば、コレステロール)、及びPEG修飾脂質(例えば、PEG−DMG又はPEG−DMA)の混合物を含む。ある実施形態では、脂質混合物は、本発明の陽イオン性脂質、中性脂質、コレステロール、及びPEG修飾脂質からなるか、又は本質的にからなる。さらなる好ましい実施形態では、脂質粒子は、約20〜70%アミノ脂質:5〜45%中性脂質:20〜55%コレステロール:0.5〜15%PEG修飾脂質のモル比の上記脂質混合物からなるか、又は本質的にからなる。

0163

特定の実施形態では、脂質粒子は、表1又は表2から選択される陽イオン性脂質、DSPC、Chol、及びPEG−DMG又はPEG−DMAのいずれかからなるか、又は本質的にからなり、モル比は、例えば約20〜60%陽イオン性脂質:5〜25%DSPC:25〜55%Chol:0.5〜15%PEG−DMG又はPEG−DMAである。特定の実施形態では、脂質モル比は、およそ40/10/40/10(モル% 陽イオン性脂質/DSPC/Chol/PEG−DMG又はPEG−DMA)、35/15/40/10(モル%陽イオン性脂質/DSPC/Chol/PEG−DMG又はPEG−DMA)、又は52/13/30/5(モル% 陽イオン性脂質/DSPC/Chol/PEG−DMG又はPEG−DMA)である。1つの実施形態では、陽イオン性脂質は、









である。
1つの実施形態では、陽イオン性脂質は、



である。

0164

別の群の実施形態では、これらの組成物中の中性脂質、DSPCは、POPC、DPPC、DOPE、又はSMと置換される。

0165

治療薬−脂質粒子組成物及び製剤
本発明は、本発明の脂質粒子及び活性作用剤を含む組成物を含み、活性作用剤は脂質粒子に結合している。特定の実施形態では、活性作用剤は治療薬である。特定の実施形態では、活性作用剤は、脂質粒子の水性内部内に封入されている。他の実施形態では、活性作用剤は、脂質粒子の1つ以上の脂質層内に存在する。他の実施形態では、活性作用剤は、脂質粒子の外部又は内部脂質表面に結合している。

0166

本明細書で使用されるとき、「完全封入」とは、粒子中の核酸が、遊離核酸を著しく分解するであろう血清又はヌクレアーゼアッセイと接触した後で、著しくは分解されないことを示す。完全封入系では、好ましくは粒子核酸の25%未満が、通常は遊離核酸を100%分解する処理で分解され、より好ましくは粒子核酸の10%未満が分解され、最も好ましくは粒子核酸の5%未満が分解される。あるいは、完全封入化は、Oligreen(登録商標)アッセイにより決定することができる。Oligreen(登録商標)は、溶液中のオリゴヌクレオチド及び一本鎖DNA定量化するための超高感度蛍光核酸染色法である(Invitrogen Corporation社、カールバッドカリフォルニア州から入手可能)。完全封入化は、粒子が、血清安定性であり、すなわちインビボ投与時にそれらの構成成分へと急速には分解しないことも示唆する。

0167

活性作用剤には、本明細書で使用されるとき、細胞、組織、器官、又は対象体に所望の効果を及ぼすことができる任意の分子又は化合物が含まれる。そのような効果は、例えば、生物学的であってもよく、生理学的であってもよく、又は美容的であってもよい。活性作用剤は、任意のタイプの分子又は化合物であってもよく、それらには、例えば核酸、ペプチド、及びポリペプチドが含まれ、例えば、それらには、例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、抗体断片などの抗体;ヒト化抗体組換え抗体組換えヒト抗体、及びPrimatized(商標)抗体、サイトカイン増殖因子アポトーシス因子分化誘導因子、細胞表面受容体、及びそれらのリガンド;ホルモン;及び有機低分子又は化合物を含む低分子が含まれる。

0168

1つの実施形態では、活性作用剤は、治療薬、又はその塩若しくは誘導体である。治療薬誘導体は、それら自体が治療的に活性であってもよく、又はさらに修飾された際に活性となるプロドラッグであってもよい。したがって、1つの実施形態では、治療薬誘導体は、未修飾の作用剤と比較して治療活性の幾つか又は全てを保持し、別の実施形態では、治療薬誘導体は治療活性を欠如する。

0169

種々の実施形態では、治療薬には、抗炎症化合物抗うつ薬刺激剤鎮痛薬抗生物質避妊薬解熱薬血管拡張薬抗血管新生薬、細胞血管薬(cytovascular agent)、シグナル伝達阻害剤心血管薬、例えば抗不整脈薬血管収縮薬、ホルモン、及びステロイドなどの、任意の治療上有効な作用剤又は薬物が含まれる。
ある実施形態では、治療薬は、抗腫瘍薬抗癌薬腫瘍薬、又は抗悪性腫瘍薬などとも呼ばれる腫瘍学的薬物である。本発明により使用することができる腫瘍学的薬物の例には、これらに限定されないが、以下のものが含まれる:アドリアマイシンアルケラン、アロプリノール、アルトレタミンアミホスチンアナストロゾール、araC、三酸化二砒素アザチオプリンベキサロテン、biCNU、ブレオマイシン、静脈ブスルファン、経口ブスルファン、カペシタビン(Xeloda)、カルボプラチンカルマスティン、CCNU、セレコキシブクロラムブシルシスプラチンクラドリビンサイクロスポリンAシタラビン、サイトシンアラビノサイドダウノルビシンシトキサン、ダウノルビシン、デキサメタゾンデクスラゾキサン、ドデタキセルドキソルビシン、ドキソルビシン、DTIC、エピルビシンエストラムスチンエトポシドホスフェート、エトポシド及びVP−16、エキセメスタン、FK506、フルダラビンフルオロウラシル、5−FU、ゲムシタビンジェムザール)、ジェムツマブ−オゾガミシン酢酸ゴセレリンハイドレアヒドロキシ尿素イダルビシンイホスファミドメシル酸イマチニブインターフェロンイリノテカンカンプトスター(Camptostar)、CPT−111)、レトロゾールロイコボリン、ロイスタチン、ロイプロリドレバミソール、リトレチノインメガストロール(megastrol)、メルファラン、L−PAM、メスナメトトレキサートメトキサレンミトラマイシンミトマイシン、ミトキサントロンナイトロジェンマスタードパクリタキセルパミドロネート、ペガデマーゼ、ペントスタチンポルフィマーナトリウムプレドニゾンリツキサンストレプトゾシン、STI−571、タモキシフェンタキソテール、テモゾロルアミド(temozolamide)、テニポシド、VM−26、トポテカンハイカムチン)、トレミフェン、トレチノイン、ATRA、バルルビシン、ベルバンビンブラスチンビンクリスチン、VP16、及びビノレルビン。本発明により使用することができる腫瘍学的薬物の他の例は、エリプチシン及びエリプチシン類似体又は誘導体、エポチロン、細胞内キナーゼ阻害剤、並びにカンプトテシン

0170

核酸−脂質粒子
ある実施形態では、本発明の脂質粒子は、核酸と結合しており、核酸−脂質粒子がもたらされる。特定の実施形態では、核酸は、脂質粒子に完全に封入されている。本明細書で使用されるとき、「核酸」という用語は、任意のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含むことが意図されている。50個までのヌクレオチドを含有する断片は、一般的にオリゴヌクレオチドと呼ばれ、より長い断片はポリヌクレオチドと呼ばれる。特定の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、15〜50個のヌクレオチドの長さである。

0171

本発明の状況では、「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」という用語は、天然塩基、糖、及び糖間(骨格)結合で構成されるヌクレオチド又はヌクレオシドモノマーのポリマー又はオリゴマーを指す。「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」という用語は、同様に機能する非天然モノマー又はその部分を含むポリマー又はオリゴマーも指す。そのような修飾又は置換オリゴヌクレオチドは、例えば、細胞取り込みの増強及びヌクレアーゼの存在下での安定性の増加などの特性があるため、天然形態より好ましいことが多い。

0172

本発明による脂質−核酸粒子に存在する核酸は、既知のあらゆる形態の核酸を含む。本明細書で使用される核酸は、一本鎖DNA若しくはRNA、又は二本鎖DNA若しくはRNA、又はDNA‐RNAハイブリッドであってもよい。二本鎖DNAの例には、構造遺伝子、制御領域及び終止領域を含む遺伝子、及びウイルスDNA又はプラスミドDNAなどの自己複製系が含まれる。二本鎖RNAの例には、siRNA及び他のRNA干渉試薬が含まれる。一本鎖核酸には、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、マイクロRNA、三重鎖形成オリゴヌクレオチドが含まれる。本発明の脂質−核酸粒子に存在する核酸は、下記に記載されているオリゴヌクレオチド修飾の1つ以上を含んでいてもよい。

0173

本発明の核酸は、種々の長さであってもよく、一般的に核酸の特定形態に依存する場合がある。例えば、特定の実施形態では、プラスミド又は遺伝子は、約1,000〜100,000個のヌクレオチド残基の長さであってもよい。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、約10〜100個のヌクレオチドの範囲の長さであってもよい。種々の関連実施形態では、一本鎖、二本鎖、三本鎖のオリゴヌクレオチドは、約10〜約50個のヌクレオチド、約20〜約50個のヌクレオチド、約15〜約30個のヌクレオチド、約20〜約30個のヌクレオチドの範囲の長さであってもよい。

0174

特定の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド(又はその鎖)は、標的ポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズするか、又は相補的である。「特異的にハイブリダイズ可能な」及び「相補的な」とは、DNA又はRNA標的とオリゴヌクレオチドとの間に安定的で特異的な結合が生じるような、十分な度合いの相補性を示すために使用される用語である。オリゴヌクレオチドは、特異的にハイブリダイズ可能なその標的核酸配列に100%相補的である必要はないことが理解される。標的に対するオリゴヌクレオチドの結合が、標的分子の正常機能を妨害して、有用性又は標的分子からの発現の喪失を引き起こし、特異的結合が望ましい条件化で、つまりインビボアッセイ又は治療的処置の場合は生理学的条件下で、又はインビトロアッセイの場合はアッセイが実施される状態下で、非標的配列に対するオリゴヌクレオチドの非特異的結合を回避するのに十分な程度の相補性が存在する場合、オリゴヌクレオチドは、特異的にハイブリダイズ可能である。したがって、他の実施形態では、このオリゴヌクレオチドは、それが標的とするか又はそれが特異的にハイブリダイズする遺伝子又はmRNA配列の領域と比較して、1、2、又は3塩基置換、例えばミスマッチを含む。

0175

RNA干渉核酸
特定の実施形態では、本発明の核酸−脂質粒子は、RNA干渉(RNAi)分子と結合している。RNAi分子を使用するRNA干渉法は、目的の遺伝子又はポリヌクレオチドの発現を妨害するために使用することができる。低分子干渉RNA(siRNA)は、本質的に、開発中の次世代標的化オリゴヌクレオチド薬として、アンチセンスODN及びリボザイムに取って代わった。

0176

SiRNAsは、RNAi誘導サイレンシング複合体(RISC)として知られている細胞質多タンパク質複合体と結合することができる通常16〜30個のヌクレオチド長のRNA二本鎖である。siRNAが負荷されたRISCは、相同性mRNA転写物の分解を媒介し、したがってsiRNAは、タンパク質発現を高度な特異性でノックダウンするように設計することができる。他のアンチセンスの技術とは異なり、siRNAは、非コードRNAによって遺伝子発現を制御するように進化した天然機序を介して機能する。これは、それらの活性が、インビトロ及びインビボで、アンチセンスODN又はリボザイムのいずれよりも強力である理由であると一般的に考えられている。臨床的に関連する標的を標的とするsiRNAsを含む様々なRNAi試薬が、例えば、de Fougerolles, A. et al., Nature Reviews 6:443−453 (2007)に記載されているように、現在医薬開発中である。

0177

最初に記載されたRNAi分子は、RNAセンス鎖及びRNAアンチセンス鎖の両方を含むRNA:RNAハイブリッドであったが、DNAセンス:RNAアンチセンスのハイブリッド、RNAセンス:DNAアンチセンスのハイブリッド、及びDNA:DNAハイブリッドは、RNAiを媒介可能であることが、今では実証されている(Lamberton, J.S. and Christian, A.T., (2003) Molecular Biotechnology 24:111−119)。したがって、本発明は、これらの異なるタイプの二本鎖分子のいずれかを含むRNAi分子の使用を含む。加えて、RNAi分子は、様々な形態で使用及び細胞に導入することができることが理解される。したがって、本明細書で使用されるとき、RNAi分子は、これらに限定されないが以下のものを含む、細胞でのRNAi応答を誘導可能なありとあらゆる分子を包含する:2つの別々の鎖、つまりセンス鎖及びアンチセンス鎖を含む二本鎖オリゴヌクレオチド、例えば低分子干渉RNA(siRNA);非ヌクレオチジルリンカーにより共に結合された2つの別々の鎖を含む二本鎖オリゴヌクレオチド;二本鎖領域を形成する相補的配列ヘアピンループを含むオリゴヌクレオチド、例えばshRNAi分子;及び単独で又は別のポリヌクレオチドと組み合わせて二本鎖ポリヌクレオチドを形成可能な1つ以上のポリヌクレオチドを発現する発現ベクター

0178

本明細書で使用されるとき、「一本鎖siRNA化合物」は、単一分子で構成されるsiRNA化合物である。一本鎖siRNA化合物は、鎖内対合により形成された二本鎖領域を含み、例えば、ヘアピン又はパンハンドル構造であってもよく、又は含んでいてもよい。一本鎖siRNA化合物は、標的分子に関してアンチセンスであってもよい。

0179

一本鎖siRNA化合物は、RISCに進入し、RISC媒介性の標的mRNA切断に関与し得るのに十分な長さであり得る。一本鎖siRNA化合物は、少なくとも14個のヌクレオチドの長さであり、他の実施形態では、少なくとも15、20、25、29、35、40又は50個のヌクレオチドの長さである。ある実施形態では、一本鎖siRNA化合物は、200、100、又は60個未満のヌクレオチドの長さである。

0180

ヘアピンsiRNA化合物は、17、18、19、29、21、22、23、24、若しくは25個のヌクレオチド対と等しいか、又は少なくとも17、18、19、29、21、22、23、24、若しくは25個のヌクレオチド対である二本鎖領域を有するだろう。二本鎖領域は、200、100、又は50以下の長さであってもよいだろう。ある実施形態では、二本鎖領域の範囲は、15〜30、17〜23、19〜23、及び19〜21個のヌクレオチド対の長さである。ヘアピンは、一本鎖突出又は末端未対合領域を有してもよい。ある実施形態では、突出は、2〜3個のヌクレオチドの長さである。幾つかの実施形態では、突出は、ヘアピンのセンス側にあり、幾つかの実施形態では、ヘアピンのアンチセンス側にある。

0181

「二本鎖siRNA化合物」は、本明細書で使用されるとき、鎖間ハイブリダイゼーション二本鎖構造の領域を形成することができる、複数の、幾つかの場合は2本の鎖を含むsiRNA化合物である。

0182

二本鎖siRNA化合物のアンチセンス鎖は、14、15、16、17、18、19、25、29、40、若しくは60個のヌクレオチドの長さと等しいか、又は少なくとも14、15、16、17、18、19、25、29、40、若しくは60個のヌクレオチドであってもよい。二本鎖siRNA化合物のアンチセンス鎖は、200、100、又は50個以下のヌクレオチドの長さであってもよい。範囲は、17〜25、19〜23、及び19〜21個のヌクレオチドの長さであってもよい。本明細書で使用されるとき、「アンチセンス鎖」という用語は、標的分子、例えば標的RNAに十分相補的なsiRNA化合物の鎖を意味する。

0183

二本鎖siRNA化合物のセンス鎖は、14、15、16、17、18、19、25、29、40、若しくは60個のヌクレオチドの長さと等しいか、又は少なくとも14、15、16、17、18、19、25、29、40、若しくは60個のヌクレオチドであってもよい。二本鎖siRNA化合物のセンス鎖は、200、100、又は50個以下のヌクレオチドの長さであってもよい。範囲は、17〜25、19〜23、及び19〜21個のヌクレオチドの長さであってもよい。

0184

二本鎖siRNA化合物の二本鎖部分は、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、29、40、若しくは60個のヌクレオチドの長さと等しいか、又は少なくとも14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、29、40、若しくは60個のヌクレオチドであってもよい。二本鎖siRNA化合物の二本鎖部分は、200、100、又は50個以下のヌクレオチドの長さであってもよい。範囲は、15〜30、17〜23、19〜23、及び19〜21個のヌクレオチドの長さであってもよい。

0185

多くの実施形態では、siRNA化合物は、十分に大きいため、内因性分子、例えばダイサーにより切断されて、より小さなsiRNA化合物、例えばsiRNAs作用剤を産生することができる。

0186

センス鎖及びアンチセンス鎖は、二本鎖siRNA化合物が、分子の1つの末端又は両端で一本鎖又は未対合領域を含むように選択してもよい。したがって、二本鎖siRNA化合物は、対になって突出、例えば、1〜3個のヌクレオチドの1つ若しくは2つの5’突出若しくは3’突出、又は3’突出を含有するセンス鎖及びアンチセンス鎖を含む。突出は、1本の鎖が他方より長いための結果であってもよく、又は同じ長さの2本の鎖がずれて配置された結果であってもよい。幾つかの実施形態は、少なくとも1つの3’突出を有するだろう。1つの実施形態では、siRNA分子の両端は3’突出を有するだろう。幾つかの実施形態では、突出は2個のヌクレオチドである。

0187

ある実施形態では、二本鎖領域は、15〜30、又は18、19、20、21、22、及び23個のヌクレオチドの長さ、例えば上記で考察されたssiRNA化合物の範囲にある。ssiRNA化合物は、天然ダイサーにより長鎖dsiRNAsからプロセスされた産物と長さ及び構造が類似している場合がある。ssiRNA化合物の2本の鎖が結合している、例えば共有結合で結合している実施形態も含まれる。必要な二本鎖領域及び3’突出を提供するヘアピン又は他の一本鎖構造も、本発明内にある。

0188

二本鎖siRNA化合物及び一本鎖siRNA化合物を含む、本明細書に記載されているsiRNA化合物は、標的RNA、例えばmRNA、例えばタンパク質をコードする遺伝子の転写物サイレンシングを媒介することができる。便宜上、そのようなmRNAも、本明細書ではサイレンシングされるmRNAと呼ばれる。そのような遺伝子も、標的遺伝子と呼ばれる。一般的に、サイレンシングされるRNAは、内因性遺伝子又は病原体遺伝子である。加えて、mRNA以外のRNA、例えばtRNA及びウイルスRNAも標的とすることができる。

0189

本明細書で使用されるとき、「RNAiを媒介する」という語句は、配列特異的な様式で標的RNAをサイレンシングする能力を指す。理論により束縛されることは望まないが、サイレンシングでは、RNAi機構又はプロセス、及びガイドRNA、例えば21〜23個のヌクレオチドのssiRNA化合物が使用されると考えられている。

0190

1つの実施形態では、siRNA化合物は、標的RNA、例えば標的mRNAに対して「十分に相補的」であり、そのためsiRNA化合物は、標的mRNAによりコードされたタンパク質の産生をサイレンシングする。別の実施形態では、siRNA化合物は、標的RNA、例えば標的RNAに対して「正確に相補的」であり、siRNA化合物はアニーリングして、例えば、正確な相補性領域において排他的にワトソンクリック塩基対で作られているハイブリッドを形成する。「十分に相補的」な標的RNAは、標的RNAに対して正確に相補的な内部領域(例えば、少なくとも10個のヌクレオチド)を含むことができる。さらに、ある実施形態では、siRNA化合物は、単一ヌクレオチドの相違を特異的に識別する。この場合、siRNA化合物は、正確な相補性が、その領域(例えば、単一ヌクレオチド相違が7個のヌクレオチド以内)に見出される場合にのみRNAiを媒介する。

0191

マイクロRNA
マイクロRNA(miRNA)は、動物及び植物のゲノムにあるDNAから転写されるが、タンパク質に翻訳されない高度に保存されたクラスの小型RNA分子である。プロセスされたmiRNAsは、RNA誘導サイレンシング複合体(RISC)に組み込まれており、発生、細胞増殖、アポトーシス、及び分化の重要な調節因子であると特定された、一本鎖の約17〜25個のヌクレオチド(nt)のRNA分子である。それらは、特定のmRNAの3’−非翻訳領域に結合することにより、遺伝子発現の制御に役割を果たすと考えられている。RISCは、翻訳阻害、転写物切断、又はその両方により、遺伝子発現の下方制御を媒介する。RISCは、広範囲真核生物の核における転写サイレンシングにも関与している。

0192

現在までに多数のmiRNA配列が特定され、その数は増加しており、それらの例示的な例は、例えば、“miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature” Griffiths−Jones S, Grocock RJ, van Dongen S, Bateman A, Enright AJ. NAR, 2006, 34, Database Issue, D140−D144;“The microRNA Registry” Griffiths−Jones S. NAR, 2004, 32, Database Issue, D109−D111に見出すことができ、http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/にも見出すことができる。

0193

アンチセンスオリゴヌクレオチド
1つの実施形態では、核酸は、標的ポリヌクレオチドに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。「アンチセンスオリゴヌクレオチド」又は単に「アンチセンス」という用語は、標的ポリヌクレオチド配列に相補的なオリゴヌクレオチドを含むことを意味する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、選択された配列、例えば標的遺伝子mRNAに相補的なDNA又はRNAの一本鎖である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、相補的mRNAと結合することにより遺伝子発現を阻害すると考えられる。標的mRNAとの結合は、それに結合することにより相補的mRNAの翻訳を防止するか、又は標的mRNAの分解に結びつくかのいずれかにより、遺伝子発現の阻害に結びつく場合がある。アンチセンスDNAは、特定の相補的な(コード又は非コード)RNAを標的とするために使用することができる。結合が生じる場合、このDNA/RNAハイブリッドは、酵素RNaseHで分解することができる。特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、約10〜約50個のヌクレオチド、より好ましくは約15〜約30個のヌクレオチドを含む。この用語は、所望の標的遺伝子に正確には相補的でない場合があるアンチセンスオリゴヌクレオチドも包含する。したがって、本発明は、アンチセンスとの非標的特異的活性が見出される場合、又は標的配列との1つ以上のミスマッチを含有するアンチセンス配列が、特定の使用において最も好ましい場合、利用することができる。

0194

アンチセンスオリゴヌクレオチドは、タンパク質合成の有効な標的阻害剤であることが実証されており、結果的に、標的遺伝子によるタンパク質合成を特異的に阻害するために使用することができる。タンパク質合成を阻害するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの効力は、十分に確立されている。例えば、ポリガラタウロナーゼ(polygalactauronase)の合成、及び2型ムスカリンアセチルコリン受容体は、それらのそれぞれのmRNA配列に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドにより阻害される(米国特許第5,739,119号及び米国特許第5,759,829号)。さらに、アンチセンス阻害の例は、核タンパク質サイクリン、多剤耐性遺伝子(MDG1)、ICAM−1、E−セレクチン、STK−1、線条体GABAA受容体、及びヒトEGFで実証されている(Jaskulski et al. , Science. 1988 Jun 10;240(4858):1544−6;Vasanthakumar and Ahmed, Cancer Commun. 1989;1(4):225−32;Peris et al., Brain Res Mol Brain Res. 1998 Jun 15;57(2):310−20;米国特許第5,801,154号;米国特許第5,789,573号;米国特許第5,718,709号、及び米国特許第5,610,288号)。さらに、アンチセンス構築体は、様々な異常細胞増殖(例えば、癌)を阻害及び治療するために使用できることも記載されている(米国特許第5,747,470号、米国特許第5,591,317号、及び米国特許第5,783,683号)。

0195

アンチセンスオリゴヌクレオチドを生成する方法は、当該技術分野で公知であり、任意のポリヌクレオチド配列を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを生成するために容易に適用することができる。所与の標的配列に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドの選択は、選択された標的配列、及び二次構造の決定、Tm、結合エネルギー、及び相対的安定性の分析に基づく。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、宿主細胞中で標的mRNAに対する特異的結合を低減又は阻害することになる二量体、ヘアピン、又は他の二次構造を形成しないそれらの相対的能力に基づいて選択することができる。mRNAの高度に好ましい標的部位は、AUG翻訳開始コドンの領域又はその付近の領域、及びmRNAの5’領域に対して実質的に相補的な配列を含む。これらの二次構造の分析及び標的部位選択に関する考慮は、例えば、OLIGOプライマー分析ソフトウェア(Molecular Biology Insights社製)のv.4、及び/又はBLASTN 2.0.5アルゴリズムソフトウェア(Altschul et al., Nucleic AcidsRes. 1997, 25(17):3389−402)を使用して実施することができる。

0196

アンタゴmir
アンタゴmirは、RNAse保護、並びに組織及び細胞取り込みの増強などの薬理学的特性に関する種々の修飾を内包するRNA様オリゴヌクレオチドである。アンタゴmirは、例えば、糖の完全な2’−O−メチル化、ホスホロチオアート骨格、及び例えば3’末端のコレステロール部分により、通常のRNAと区別される。アンタゴmirは、アンタゴmir及び内因性miRNAを含む二本鎖を形成することにより内因性miRNAsを効率的にサイレンシングするために使用するができ、それによりmiRNA誘導性遺伝子サイレンシングを防止する。アンタゴmir媒介性miRNAサイレンシングの一例は、参照によりその全体が明示的に本明細書に組み込まれるKrutzfeldt et al, Nature, 2005, 438: 685−689に記載されているmiR−122のサイレンシングである。アンタゴmir RNAは、標準的固相オリゴヌクレオチド合成プロトコールを使用して合成することができる。米国特許出願第11/502,158号、及び米国特許出願第11/657,341号を参照されたい(これらの各々の開示は、参照により本明細書に組み込まれる)。

0197

アンタゴmirは、オリゴヌクレオチド合成用のリガンド結合モノマーサブユニット及びモノマーを含んでいてもよい。例示的なモノマーは、2004年8月10日に出願された米国特許出願第10/916,185号に記載されている。アンタゴmirは、2004年3月8日に出願された国際出願第PCT/US2004/07070号に記載されているものなどの、ZXY構造を有していてもよい。アンタゴmirは、両親媒性部分と複雑体化されていてもよい。オリゴヌクレオチド作用剤と共に使用するための例示的な両親媒性部分は、2004年3月8日に出願された国際出願第PCT/US2004/07070号に記載されている。

0198

アプタマー
アプタマーは、高親和性及び高特異性で目的の特定分子と結合する核酸又はペプチド分子である(Tuerk and Gold, Science 249:505 (1990);Ellington and Szostak, Nature 346:818 (1990))。大型タンパク質から小さな有機分子までの多数の異なる物質に結合するDNA又はRNAアプタマーの生成が成功している。Eaton, Curr. Opin. Chem. Biol. 1:10−16 (1997)、Famulok, Curr. Opin. Struct. Biol. 9:324−9(1999)、及びHermann and Patel, Science 287:820−5 (2000)を参照されたい。アプタマーは、RNA又はDNAに基づていてもよく、リボスイッチを含んでいてもよい。リボスイッチは、小型標的分子に直接結合することができ、標的との結合が遺伝子活性に影響を及ぼすmRNA分子の一部である。したがって、リボスイッチを含有するmRNAは、その標的分子が存在するか又は存在しないかに応じて、それ自体の活性の制御に直接的に関与する。一般的に、アプタマーは、低分子、タンパク質、核酸などの種々の分子標的に、並びに細胞、組織、及び生物にさえ結合するように、インビトロ選択法の数巡の繰り返し、又は同様にSELEX(指数関数的な濃縮による系統的なリガンド進化)により操作される。アプタマーは、合成、組換え、及び精製法を含む任意の公知な方法により調製することができ、単独で又は同じ標的に特異的な他のアプタマーと組み合わせて使用することができる。さらに、本明細書により詳しく記載されているように、「アプタマー」という用語は、具体的には、所与の標識に対する複数の公知なアプタマーを比較することに由来するコンセンサス配列を含有する「第2のアプタマー」を含む。

0199

リボザイム
本発明の別の実施形態によると、核酸−脂質粒子は、リボザイムに結合している。リボザイムは、エンドヌクレアーゼ活性を有する特異的触媒ドメインを有するRNA分子複合体である(Kim and Cech, Proc Natl Acad Sci U S A. 1987 Dec;84(24):8788−92;Forster and Symons, Cell. 1987 Apr 24;49(2):211−20)。例えば、多くのリボザイムは、高度な特異性でリン酸エステル転移反応加速し、オリゴヌクレオチド基質にある幾つかのリン酸エステルのうちの1つのみを切断することが多い(Cech et al., Cell. 1981 Dec;27(3 Pt 2):487−96;Michel and Westhof, J Mol Biol. 1990 Dec 5;216(3):585−610;Reinhold−Hurek and Shub, Nature. 1992 May 14;357(6374):173−6)。この特異性は、化学反応の前に、基質が、特異的な塩基対合相互作用によりリボザイムの内部ガイド配列(「IGS」)に結合する必要があることに起因している。

0200

天然酵素性RNAの少なくとも6塩基多様性が、現在のところ知られている。各々は、生理学的条件下で、trans位にあるRNAリン酸ジエステル結合の加水分解触媒することができる(したがって、他のRNA分子を切断することができる)。一般的に、酵素性核酸は、まず標的RNAと結合することにより作用する。そのような結合は、標的RNAを切断するように作用する分子の酵素性部分に近接近して保持される酵素性核酸の標的結合部分を介して生じる。したがって、酵素性核酸は、相補的塩基対合によりまず標的RNAを認識しその後標的RNAと結合し、正しい部位に結合すると酵素的に作用して標的RNAを切断する。このような標的RNAの戦略的切断により、コードされたタンパク質の合成を指図する標的RNAの能力が破壊されることになる。酵素性核酸は、そのRNA標的と結合しRNA標的を切断した後、そのRNAから放出されて別の標的を探索し、新しい標的への結合及び切断を繰り返すことができる。

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