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技術 合成メッセンジャーRNAを使用したヒト人工多能性幹細胞のフィーダーフリー誘導

出願人 アリールバイオテクノロジーアンドファーマシューティカルズ,インコーポレイテッド
発明者 ジウワンルイージウォーレンユフィニー
出願日 2017年7月14日 (3年4ヶ月経過) 出願番号 2017-137655
公開日 2017年10月12日 (3年1ヶ月経過) 公開番号 2017-184766
状態 特許登録済
技術分野 動物,微生物物質含有医薬 化合物または医薬の治療活性 突然変異または遺伝子工学 微生物、その培養処理
主要キーワード 損耗率 選択群 実例的 集団密度 初期密度 密度増加 種生物学 クルッ
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2017年10月12日)のものです。
また、この項目は機械的に抽出しているため、正しく解析できていない場合があります

図面 (5)

課題

解決手段

本開示は、全般的には、動態的に調節されたプロセスによる人工多能性幹細胞(iPSC)の作製に、操作された再プログラム化因子複数可)を使用するための新規方法および組成物に関する。具体的には、本開示は、様々な種類の細胞再プログラム化に最適化された、従来の再プログラム化因子とトランス活性化ドメイン融合体を含む、再プログラム化因子の組合せの確立に関する。より具体的には、本明細書に開示されている例示的な方法は、ヒト線維芽細胞を含む様々な哺乳動物細胞型から人工多能性幹細胞を作製するのに使用することができる。合成メッセンジャーRNAを使用するヒト人工多能性幹細胞のフィーダーフリー誘導の例示的な方法も開示されている。

概要

背景

以下は、本開示の様々な態様および実施形態の理解において有用となり得る情報を含む
。これは、本明細書に提供されている情報のいずれかが、現下記載または特許請求されて
いる発明の先行技術であるまたはこれに関連することも、あるいは明確にまたは暗に参照
されているいずれかの刊行物または文書が、先行技術であることも承認しない。

人工多能性幹細胞(iPSC)の治療上の潜在能力は、多能性状態への再プログラム化
を引き起こすために体細胞遺伝子改変する必要を回避する再プログラム化方法を開発す
る取り組みを促した。この点において成功を収めるための第1の「非組み込み」アプロー
チ(タンパク質形質導入、プラスミドトランスフェクションおよびアデノウイルスベクタ
ーの使用)は、得られるiPSC転換の効率が低いために応用が限定されていた。最近に
なって、エピソームDNA、センダイウイルスおよび合成メッセンジャーRNA(mRN
A)を用いる技法は、組み込み型ウイルスベクターを使用して得られるiPSCに匹敵
るまたはこれに勝る効率で、「フットプリントフリー(footprint−free)
」iPSCを生成することを示した。RNAトランスフェクションは、ベクターの残渣痕
跡を一掃するために再プログラム化された細胞を「クリーンアップ」する必要を完全にな
くしつつ、再プログラム化因子(RF)発現時間経過にわたって正確な調節をもたらす
ため、原則として、これらの方法の中で最も魅力的である。しかし、mRNAに基づく再
プログラム化のための現在のプロトコールは、ヒト細胞における多能性の誘導に要求され
る、ほぼ2週間にわたり毎日トランスフェクトを行う必要があるため、相対的に労働
約的である。これらの手順はまた、フィーダー細胞の使用に依拠し、プロセスに複雑さと
技術的変動性を加える一方、非ヒト由来の(「異種」)生物材料により汚染の潜在的な供
給源を導入する可能性がある。

人工多能性幹細胞(iPSC)産生の主要な困難は、分化細胞多能性細胞へと再プロ
グラム化する際の低効率であった。Sox2、Klf4およびc−Myc(SKM)と共
に、Oct4およびMyoDのトランス活性化ドメイン(M3Oと呼ばれる)で構成され
融合遺伝子により形質導入した場合、マウス胚線維芽細胞(MEF)の5%がiPS
Cへと再プログラム化されたことが以前に報告された。加えて、M3Oは、iPSCには
ならない細胞を含む形質導入されたMEFの大部分において、多能性遺伝子のクロマチン
リモデリングを容易にした。これらの観察は、より好ましい培養条件であれば、5%を超
える細胞がiPSCになる能力を獲得したであろう可能性を示唆した。

概要

合成メッセンジャーRNAを使用したヒト人工多能性幹細胞のフィーダーフリー誘導の提供。本開示は、全般的には、動態的に調節されたプロセスによる人工多能性幹細胞(iPSC)の作製に、操作された再プログラム化因子(複数可)を使用するための新規方法および組成物に関する。具体的には、本開示は、様々な種類の細胞の再プログラム化に最適化された、従来の再プログラム化因子とトランス活性化ドメインの融合体を含む、再プログラム化因子の組合せの確立に関する。より具体的には、本明細書に開示されている例示的な方法は、ヒト線維芽細胞を含む様々な哺乳動物細胞型から人工多能性幹細胞を作製するのに使用することができる。合成メッセンジャーRNAを使用するヒト人工多能性幹細胞のフィーダーフリー誘導の例示的な方法も開示されている。なし

目的

したがって、これらの問題点に取り組むために、本開示は、人体のあらゆる異なる組織
を産生することのできる幹細胞を作製するための方法および組成物を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

この技術が所属する分野

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請求項1

明細書に記載された発明。

技術分野

0001

関連出願
この出願は、2012年5月13日に出願された米国仮出願第61/646,292号
に対する優先権の利益を主張する。この内容は、全体が本明細書に援用される。

0002

本開示は、全般的には、動態的に調節されたプロセスによる人工多能性幹細胞(ind
uced pluripotent stem cell)(iPSC)の作製に、操作
された再プログラム化因子複数可)を使用するための新規方法および組成物に関する。
具体的には、本開示は、様々な種類の細胞再プログラム化に最適化された、従来の再プ
ログラム因子トランス活性化ドメイン融合体を含む、再プログラム化因子の組合
確立に関する。より具体的には、本明細書に開示されている例示的な方法は、ヒト線維
芽細胞を含む様々な哺乳動物細胞型から人工多能性幹細胞を作製するのに使用することが
できる。合成メッセンジャーRNAを使用するヒト人工多能性幹細胞のフィーダーフリー
誘導の例示的な方法も開示されている。

背景技術

0003

以下は、本開示の様々な態様および実施形態の理解において有用となり得る情報を含む
。これは、本明細書に提供されている情報のいずれかが、現下記載または特許請求されて
いる発明の先行技術であるまたはこれに関連することも、あるいは明確にまたは暗に参照
されているいずれかの刊行物または文書が、先行技術であることも承認しない。

0004

人工多能性幹細胞(iPSC)の治療上の潜在能力は、多能性状態への再プログラム化
を引き起こすために体細胞遺伝子改変する必要を回避する再プログラム化方法を開発す
る取り組みを促した。この点において成功を収めるための第1の「非組み込み」アプロー
チ(タンパク質形質導入、プラスミドトランスフェクションおよびアデノウイルスベクタ
ーの使用)は、得られるiPSC転換の効率が低いために応用が限定されていた。最近に
なって、エピソームDNA、センダイウイルスおよび合成メッセンジャーRNA(mRN
A)を用いる技法は、組み込み型ウイルスベクターを使用して得られるiPSCに匹敵
るまたはこれに勝る効率で、「フットプリントフリー(footprint−free)
」iPSCを生成することを示した。RNAトランスフェクションは、ベクターの残渣痕
跡を一掃するために再プログラム化された細胞を「クリーンアップ」する必要を完全にな
くしつつ、再プログラム化因子(RF)発現時間経過にわたって正確な調節をもたらす
ため、原則として、これらの方法の中で最も魅力的である。しかし、mRNAに基づく再
プログラム化のための現在のプロトコールは、ヒト細胞における多能性の誘導に要求され
る、ほぼ2週間にわたり毎日トランスフェクトを行う必要があるため、相対的に労働
約的である。これらの手順はまた、フィーダー細胞の使用に依拠し、プロセスに複雑さと
技術的変動性を加える一方、非ヒト由来の(「異種」)生物材料により汚染の潜在的な供
給源を導入する可能性がある。

0005

人工多能性幹細胞(iPSC)産生の主要な困難は、分化細胞多能性細胞へと再プロ
グラム化する際の低効率であった。Sox2、Klf4およびc−Myc(SKM)と共
に、Oct4およびMyoDのトランス活性化ドメイン(M3Oと呼ばれる)で構成され
融合遺伝子により形質導入した場合、マウス胚線維芽細胞(MEF)の5%がiPS
Cへと再プログラム化されたことが以前に報告された。加えて、M3Oは、iPSCには
ならない細胞を含む形質導入されたMEFの大部分において、多能性遺伝子のクロマチン
リモデリングを容易にした。これらの観察は、より好ましい培養条件であれば、5%を超
える細胞がiPSCになる能力を獲得したであろう可能性を示唆した。

課題を解決するための手段

0006

したがって、これらの問題点に取り組むために、本開示は、人体のあらゆる異なる組織
を産生することのできる幹細胞を作製するための方法および組成物を提供する。ある特定
の態様において、メッセンジャーRNA分子を使用して、ウイルスベクター、動物性生成
物またはフィーダー細胞を必要とせず、本明細書に開示されている方法を使用して、ヒト
線維芽細胞を人工多能性幹細胞(iPSC)に再プログラム化することができる。この例
示的な方法および組成物の使用は、以前に報告された細胞再プログラム化方法論に優る驚
くべき予想外効率改善をもたらした。

0007

したがって、特に、VP16およびMyoD等、公知の強力な転写因子トランス活性
ドメイン組み入れた、Oct4(Oct3/4とも称される)、Sox2等、従来の
再プログラム化因子の操作された改変体の適用により再プログラム化因子(RF)カクテ
ルを改善することにより、mRNA媒介性再プログラム化を加速させるのに有用な方法、
薬剤および/または組成物が提供される。本明細書に開示されている方法および組成物は
、mRNAに基づく再プログラム化に関与する時間、費用および労力を劇的に低下させる
フィーダーフリー、異種フリーのプロトコールをもたらす。

0008

一態様において、本開示は、体細胞を脱分化または再プログラム化するための方法であ
って、a)Oct4、Sox2、Klf4、cMyc、NanogおよびLin28から
選択される合成mRNA再プログラム化因子のうちいずれか1種または複数とトランス
性化ドメインとの融合産物を有効量含む組成物を、単離された体細胞にトランスフェクト
し、これにより体細胞を再プログラム化または脱分化するステップを含む方法を提供する

0009

一実施形態において、組成物が、N末端MyoDトランス活性化ドメインと融合したO
ct4を含む、請求項1に記載の方法が提供される。一実施形態において、Oct4は、
タンデムに3連でN末端MyoDトランス活性化ドメインと融合している。

0010

一態様において、請求項1に記載の再プログラム化因子の合成mRNAのうちいずれか
1種または複数を使用することにより哺乳動物細胞を再プログラム化するための方法であ
って、a)フィーダーフリー表面において標準ウェルプレートウェルあたり細胞25
k〜250kの密度標的細胞成長させるステップと、b)再プログラム化の間に各回
50ng〜800ng/mlで変動する用量のmRNAを細胞にトランスフェクトするス
テップとを含む方法が提供される。

0011

一実施形態において、標的細胞を、フィーダーフリー表面において標準6ウェルプレー
トのウェルあたり細胞50k、75k、100kまたは150kの密度で成長させ、b)
再プログラム化の間に各回50ng〜800ng/mlで変動する用量のmRNAを細胞
にトランスフェクトするステップであるが、より初期の時点においてより後期の時点より
も低い用量を使用するステップと、c)継代せずにiPSCを獲得するステップとを含む
方法が提供される。

0012

一実施形態において、標的細胞を、フィーダーフリー表面において標準6ウェルプレー
トのウェルあたり細胞50k、75k、100kまたは150kの密度で成長させるが、
各ウェルの容量を、0.5ml〜5mlの適切な培地となるよう調整し、b)再プログラ
ム化の間に各回50ng〜800ng/mlで変動する用量のmRNAを細胞にトランス
フェクトするステップであるが、より初期の時点においてより後期の時点よりも低い用量
を使用するステップと、c)継代せずにiPSCを獲得するステップとを含む方法が提供
される。

0013

一実施形態において、哺乳動物細胞は、ヒト細胞である。一実施形態において、その方
法は異種フリーである。

0014

一実施形態において、1種または複数の因子は、mRNA、制御性RNA、siRNA
、miRNAおよびこれらの組合せからなる群より選択される。

0015

一実施形態において、体細胞に、少なくとも2種の異なるRNAをトランスフェクトす
る。一実施形態において、体細胞は、単能性、複能性(multipotent)、多能
性および分化細胞からなる群より選択される。一実施形態において、1種または複数のR
NAは、体細胞から単能性細胞、複能性細胞または多能性細胞への脱分化を誘導する。

0016

一実施形態において、その因子のうち少なくとも1種は、OCT4、SOX2、NAN
OG、LIN28、KLF4およびMYCmRNAからなる群より選択される。一実施
形態において、OCT4、SOX2、NANOGおよびLIN28 mRNAを組み合わ
せて投与する。一実施形態において、OCT4、SOX2、KLF4およびMYC mR
NAを組み合わせて投与する。

0017

一実施形態において、トランスフェクトされた細胞は、培養において人工多能性(i
PS)細胞として維持される。一実施形態において、トランスフェクトされた細胞が、人
多能性幹細胞を形成し、分化細胞を形成するようにiPS細胞を誘導するステップをさ
らに含む。

0018

一態様において、患者における疾患または障害の1種または複数の症状を処置または阻
害するための方法であって、細胞をin vitroで脱分化させるステップと、細胞を
患者に投与するステップとを含む方法が提供される。一実施形態において、組成物は、R
argおよびLrH−1トランス活性化(transaction activatio
n)ドメインをさらに含む。一実施形態において、組成物は、VP16トランス活性化ド
メインと融合したOct4を含む。

0019

本明細書に記載および特許請求されている発明は、本概要表記または記載または参照されている特質および実施形態等を含むがこれらに限定されない、多くの特質および実施形態を有する。これは包括的であるようには企図されておらず、本明細書に記載および特許請求されている発明は、本概要に同定されている特色または実施形態に(よって)限定されず、これら特色または実施形態は、制限目的ではなく単なる説明目的で含まれている。後述する詳細な説明において、追加的な実施形態を開示することができる。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される:
項目1)
体細胞を脱分化または再プログラム化するための方法であって、
Oct4、Sox2、Klf4、cMyc、NanogおよびLin28から選択される再プログラム化因子の合成mRNAのうちいずれか1種または複数とトランス活性化ドメインとの融合産物を有効量含む組成物を、単離された前記体細胞にトランスフェクトし、これにより前記体細胞を再プログラム化または脱分化するステップ
を含む、方法。
(項目2)
前記組成物が、N末端MyoDトランス活性化ドメインと融合したOct4を含む、項目1に記載の方法。
(項目3)
Oct4が、タンデムに3連でN末端MyoDトランス活性化ドメインと融合している、項目2に記載の方法。
(項目4)
項目1に記載の再プログラム化因子の合成mRNAのうちいずれか1種または複数を使用することにより哺乳動物細胞を再プログラム化するための方法であって、
a)フィーダーフリー表面において標準6ウェルプレートのウェルあたり細胞25k〜250kの密度で、または他の表面領域のウェルにおいてウェル当たり比例して減らした数の細胞で、標的細胞を成長させるステップと、
b)再プログラム化の間に各回50ng〜800ng/mlで変動する用量のmRNAを細胞にトランスフェクトするステップと
を含む、方法。
(項目5)
標的細胞を、フィーダーフリー表面において標準6ウェルプレートのウェルあたり細胞50k、75k、100kまたは150kの密度で成長させ、
a)再プログラム化の間に各回50ng〜800ng/mlで変動する用量のmRNAを細胞にトランスフェクトするステップであって、より初期の時点においてより後期の時点よりも低い用量を使用する、ステップと、
b)継代せずにiPSCを獲得するステップと
を含む、項目4に記載の方法。
(項目6)
標的細胞を、フィーダーフリー表面において標準6ウェルプレートのウェルあたり細胞50k、75k、100kまたは150kの密度で成長させるが、各ウェルの容量を、0.5ml〜5mlの適切な培地となるよう調整し、
a)再プログラム化の間に各回50ng〜800ng/mlで変動する用量のmRNAを細胞にトランスフェクトするステップであって、より初期の時点においてより後期の時点よりも低い用量を使用する、ステップと、
b)継代せずにiPSCを獲得するステップと
を含む、項目4に記載の方法。
(項目7)
前記哺乳動物細胞が、ヒト細胞である、項目4に記載の方法。
(項目8)
異種フリーである、項目4に記載の方法。
(項目9)
前記1種または複数の因子が、mRNA、制御性RNA、siRNA、miRNAおよびこれらの組合せからなる群より選択される、項目1に記載の方法。
(項目10)
前記体細胞に、少なくとも2種の異なるRNAをトランスフェクトする、項目1に記載の方法。
(項目11)
前記体細胞が、単能性細胞、複能性細胞、多能性細胞および分化細胞からなる群より選択される、項目1に記載の方法。
(項目12)
前記1種または複数のRNAが、前記体細胞から単能性細胞、複能性細胞または多能性細胞への脱分化を誘導する、項目1に記載の方法。
(項目13)
前記因子のうち少なくとも1種が、OCT4、SOX2、NANOG、LIN28、KLF4およびMYC mRNAからなる群より選択される、項目4に記載の方法。
(項目14)
OCT4、SOX2、NANOGおよびLIN28 mRNAを組み合わせて投与する、項目4に記載の方法。
(項目15)
OCT4、SOX2、KLF4およびMYC mRNAを組み合わせて投与する、項目4に記載の方法。
(項目16)
前記トランスフェクトされた細胞が、培養において人工多能性幹(iPS)細胞として維持される、項目1に記載の方法。
(項目17)
前記トランスフェクトされた細胞が、人工多能性幹細胞を形成し、分化細胞を形成するように前記iPS細胞を誘導するステップをさらに含む、項目1に記載の方法。
(項目18)
患者における疾患または障害の1種または複数の症状を処置または阻害するための方法であって、項目1に記載の方法に従って細胞をin vitroで脱分化させるステップと、前記細胞を前記患者に投与するステップとを含む、方法。
(項目19)
前記組成物が、RargおよびLrH−1トランス活性化ドメインをさらに含む、項目2に記載の方法。
(項目20)
前記組成物が、VP16トランス活性化ドメインと融合したOct4を含む、項目1に記載の方法。

図面の簡単な説明

0020

図1は、M3Oに基づくmRNA再プログラム化カクテルによって派生したiPSCコロニーを示す図である。(A)第1のM3Oに基づくBJ再プログラム化試行由来する増殖したiPSCクローンのうち2種の10×明視野像。(B)多能性マーカーに対する増殖したクローンの免疫染色。
図2は、M3Oに基づくカクテルを使用したフィーダーフリー再プログラム化を示す図である。(A)c−MycおよびL−Mycに基づくカクテルならびに4時間および24時間トランスフェクションレジメンを比較する、50K XFF線維芽細胞におけるフィーダーフリー誘導由来のTRA−1−60+コロニー収量を示す免疫蛍光イメージング。全ウェルを9日間トランスフェクトした。染色のために実験15日目に4時間トランスフェクション培養物を固定し、11日目に24時間トランスフェクション培養物を固定した。(B)誘導9日目にこの培養物を追い越すほとんどコンフルエントなhESC様コロニーを示す、同じ実験由来の400ng/ml Stemfectウェルの10×明視野イメージング。(C)400ng/ml Stemfectレジメンを使用して100K XFFを9日間再度トランスフェクトした追跡調査試行における、マークした視野の10×明視野の時間経過であり、上皮化と、その後のhESC様コロニーの出現を示す。
図3は、4種の異なるmRNAカクテルを使用した再プログラム化効率の比較を示す図である。4カクテル比較実験をまとめるフローチャート
図4は、HDF−aフィーダーフリー再プログラム化培養物におけるhESC様コロニーを示す図である。Stemfectトランスフェクション試薬を使用して培地補充物として送達した400ng/ml mRNAカクテル(M3O+c−Myc+Nanog+)で9日間処理した、75K HDF−a成体線維芽細胞からのフィーダーフリー誘導9日目に出現したhESC様コロニーの10×明視野像。
図5は、合成mRNAカクテルの作製を示す図である。(A)mRNA再プログラム化カクテルを作製するための手順をまとめた模式図。(B)SYBR E−ゲルにおける、多数のRFおよび蛍光レポーターをコードする合成mRNA。1レーン当たり500ngのRNAをロードした。

0021

本発明の記載において、本明細書において定義されていないあらゆる用語は、本技術分
野において認識されているその一般的な意義を有する。次の記載が本発明の特異的な実施
形態または特定の使用の記載である程度まで、これは、単なる説明のために企図されてお
り、特許請求されている発明を限定するためのものではない。次の記載は、本発明の精神
および範囲に含まれているあらゆる代替物修正および均等物を網羅するよう企図されて
いる。

0022

分化細胞は、転写因子の選択群の発現により多能性状態に復帰することができ、この事
実は、患者特異的な細胞を使用して、in vitroにおける遺伝性疾患の研究のため
に、そして最終的には細胞補充療法のために、いかなる所望の種類の細胞も生成すること
ができるという見通しを切り開いた。再プログラム化因子の発現は、ゲノム組み込み型ウ
イルスベクターの適用により達成することができ、iPSC誘導は、通常、依然として組
込み型レトロウイルスまたはレンチウイルスにより行われる。付随するゲノム改変は、
iPSCの治療応用に対する重要なハードルを表し、一方、組み込まれたウイルスカセッ
トからの発現再活性化の可能性は、in vitro研究であっても懸念となる。近年、
ゲノム改変問題を軽減またはなくす新規発現ベクターの適用において相当な進歩が為され
た。現在、lox組換え部位に隣接した単一のポリシストロニックカセットにおいてiP
SC誘導に要求される複数の因子をコードするレンチウイルスベクターを利用することが
でき、これにより、Creリコンビナーゼ一過性発現により、再プログラム化後に導入
遺伝子をほぼシームレス切除することができる。導入遺伝子挿入とその後の切除は、ト
ランスポゾンベクターを使用し、続いてトランスポサーゼを短時間発現することにより達
成することもできる。アデノウイルス、プラスミドおよびエピソームDNAを含む、再プ
ログラム化因子を十分な時間一過性発現して多能性を誘導することのできる数種の異なる
種類の非組み込み型DNAベクターが用いられてきた。低効率ではあるが、細胞透過性
プチドを組み入れる組換えFタンパク質による細胞の反復的形質導入によりiPSCを
生成することが可能であることも判明した。現在、比較的効率的なiPSC転換は、完全
にRNAに基づく生殖周期を有するセンダイウイルスを使用して、また、山中(Yama
naka)因子をコードする合成mRNA転写物持続的トランスフェクションにより達
成することができる。

0023

再プログラム化(ならびに潜在的には、定方向分化および分化転換)へのmRNAトラ
スフクションの適用は魅力的である。なぜなら、この系は、再プログラム化カクテル
およびさらには個々の構成成分因子の発現を、どの転写物細胞培養培地に加えるか単純
に変化させることにより日々モジュレートできるからである。特定の因子のトランスフェ
クションが終了すると、細胞質におけるmRNAの急速な崩壊により、標的細胞内の異所
性発現が迅速に終わる。非組み込み型DNAベクターまたはRNAウイルスとは対照的に
、mRNAトランスフェクションに浄化(cleanup)は要求されず、ランダムゲノ
ム組み込みまたは持続性ウイルス感染のいかなるリスクもない。最終的に複数ラウンド
異所性RF発現を用いて、患者生検材料から、iPSC中間体を経て所望の種類の特殊
化した細胞を得ることができると想定する場合、これらの利点は、より大きな重要性を仮
定する。にもかかわらず、現在実施されているmRNAに基づく再プログラム化には弱点
が存在する。RFの発現は、典型的には、mRNAがトランスフェクトされてからおおよ
そ24時間は頑強であるが、ヒト細胞において多能性を誘導するためには約2週間の因子
発現を要し、そのため、この技法による細胞の再プログラム化に要求される実践時間は、
相対的に長い。あらゆる細胞型および培養培地が、効率的なmRNA送達に等しく貢献す
るとは限らず、これは現在、血液細胞を含む対象とするある特定の細胞型の、mRNAに
基づく再プログラム化に対する妨害となっている。また、現在のところ、mRNA方法を
使用してiPSCへの細胞の再プログラム化を成功させるために、有糸分裂を停止した線
維芽細胞フィーダー層を用いることが必要であると判明した。標的細胞は、iPSC誘
導に要求される延長された時間経過にわたって低い出発密度から成長させるため、このよ
うなフィーダー細胞は、培養物の集団密度緩衝し、RNAおよびトランスフェクション
試薬両方とも付随する毒性を有する)の送達される用量を一定にし、再プログラム化プ
ロセスによって生み出されるアポトーシス促進性および細胞増殖抑制性の力を前にして標
的細胞の生存能を支持する。この要件は、手順に複雑さおよび実践時間を加え、特に、フ
ィーダーそれ自体がトランスフェクションに付されることを考慮すると、技術的変動性の
重要な発生源を導入する。フィーダー層の存在はまた、再プログラム化プロセスのモニタ
ーおよび解析を妨げる。最後に、ヒトフィーダー細胞は現在、mRNA再プログラム化の
標準であるが、その誘導および増殖において非ヒト動物性製品が使用されている場合、係
る細胞は、異種生物学的汚染の潜在的な供給源でもある。

0024

したがって、以前より公知の手順に伴う課題に鑑みて、再プログラム化の効率が改善さ
れ、その結果得られる細胞の品質が改善された、iPSCを産生するための新規方法、材
料およびプロトコールが本明細書に提供されている。本発明の実施形態を首尾よく使用し
て、細胞に送達されるRFカクテルの増強により、著しい驚くべき予想外の改善を達成し
た。本発明の実施形態はまた、mRNA再プログラム化プロセスを圧縮および合理化し、
フィーダー細胞または他のいかなる潜在的に異種汚染された試薬も使用せずにヒト線維
細胞からフットプリントフリーiPSCの産生を支持する新規プロトコール(複数可)を
提供する。本明細書に提供されている新規方法および組成物は、以前から公知のmRNA
方法の利益を拡大させ、iPSC技術の治療応用に対する残りの障害物乗り越えるのに
役立つであろう。

0025

本開示は、全般的には、動態的に調節されたプロセスによる人工多能性幹細胞(iPS
C)の作製に、操作された再プログラム化因子(複数可)を使用する方法に関する。より
具体的には、本発明は、異なる種類の細胞の再プログラム化に最適化された、従来の再プ
ログラム化因子とトランス活性化ドメインの融合体を含む、再プログラム化因子の組合せ
を確立するステップと、適切なレベル導入遺伝子発現をもたらす方法により、これらの
因子を合成メッセンジャーRNA(mRNA)として好ましい密度の培養哺乳動物細胞に
導入するステップと、規定の条件下で細胞を維持して、以前には達成不可能な効率で再プ
ログラム化をもたらすステップとに関する。本技術分野において公知の他の方法と比較す
ると、本発明は、再プログラム化に関与する時間、費用および労力を劇的に低下させ、完
全にフィーダーフリーおよび異種フリーであり継代を伴わない選択肢を有する。本明細書
に開示されている材料および手順は、ヒト線維芽細胞を含む異なる種類の哺乳動物細胞か
らの人工多能性幹細胞の作製に有用である。

0026

本開示の態様はまた、ウイルスベクター、動物性製品またはフィーダー細胞を必要とし
ない、メッセンジャーRNA分子を使用することによる、人体の種々の異なる組織を産生
することのできる幹細胞を生成するための方法を提供する。本明細書に開示されている新
規方法を使用して、最適条件下において驚くべき予想外の効率で、ヒト線維芽細胞を人工
多能性幹細胞(iPSC)へと再プログラム化することができる。

0027

定義
本明細書において、本方法による使用に適した細胞として、初代細胞および樹立細胞株
胚性細胞免疫細胞、幹細胞および分化細胞が挙げられるがこれらに限定されず、その
例として、線維芽細胞、実質細胞造血細胞および上皮細胞を含む、外胚葉内胚葉およ
中胚葉に由来する細胞等が挙げられるがこれらに限定されない。本明細書において、幹
細胞は、造血幹細胞間葉系幹細胞上皮幹細胞および筋サテライト細胞等、単能性細胞
、複能性細胞および多能性細胞;胚性幹細胞および成体幹細胞を含む。一実施形態におい
て、体細胞は、脱分化または再プログラム化される。いかなる適した体細胞を使用しても
よい。代表的な体細胞として、線維芽細胞、ケラチノサイト、アディポサイト(adip
ocyte)、筋細胞臓器および組織細胞、ならびに造血幹細胞を含む造血細胞および
短期または長期造血生着をもたらす細胞等が挙げられるがこれらに限定されない様々な血
液細胞が挙げられる。最も好ましい細胞型として、ヒト線維芽細胞、ケラチノサイトおよ
び造血幹細胞が挙げられるがこれらに限定されない。本方法は、脱分化および任意選択
再分化細胞に特に有用であり、細胞ゲノム永続的な変更を生じない。

0028

開示されている方法において有用なRNAは、mRNA、制御性RNAまたはsiRN
AもしくはmiRNA等の低分子RNAを含み、1種または複数のmRNAは、細胞を脱
分化または再プログラム化するよう機能するポリペプチドをコードする。トランスフェク
ションの効率は高い。典型的には、トランスフェクトされた細胞集団の90%超が、導入
されたRNAを発現するであろう。したがって、細胞に1種または複数の別個のRNAを
トランスフェクトすることが可能である。例えば、細胞の集団に、1種もしくは複数の別
個のmRNA、1種もしくは複数の別個のsiRNA、1種もしくは複数の別個のmiR
NAまたはこれらの組合せをトランスフェクトすることができる。細胞の集団に、複数の
RNAを単一の投与において同時にトランスフェクトすることができ、あるいは複数の投
与を、数分間、数時間、数日間または数週間置いて交互に行うことができる。複数の別個
のRNAのトランスフェクションを交互に行うことができる。例えば、1種または複数の
追加的なRNAの発現に先立ち、第1のRNAが発現されることが望ましい場合に。

0029

インプットRNAの量を変化させて、各トランスフェクトされたRNAの発現レベル
個々に制御できるようにすることにより、トランスフェクトされたRNAの発現のレベル
広範囲にわたって操作することができる。インプットRNAの有効量は、所望の結果に
基づき決定される。さらに、PCRに基づくmRNA産生技法は、異なる構造およびドメ
イン組合せを有するmRNAの設計を容易にする。開示されている方法において有用なR
NAは、本技術分野において公知のものであり、標的宿主細胞型と、操作しようとする経
路もしくは細胞活性、または治療応用に基づき選択されるであろう。細胞の脱分化、例え
ば、成体の分化した体細胞を幹細胞へと転換するのに有用な構築物は、公知の遺伝子、m
RNAまたは他のヌクレオチドもしくはタンパク質配列に基づき構築することができる。

0030

本明細書において互換的に使用されている用語「ポリヌクレオチド」および「核酸」は
リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかである、いずれかの長さ
ポリマー型のヌクレオチドを指す。よって、この用語は、一本、二本または複数鎖DN
AまたはRNA、ゲノムDNA、cDNADNA−RNAハイブリッド、あるいはプリ
ンおよびピリミジン塩基または他の天然化学もしくは生化学的に修飾された非天然また
誘導体化ヌクレオチド塩基を含むポリマーを含むがこれらに限定されない。「オリゴ
クレオチド」は一般に、一本または二本鎖DNAである約5〜約100ヌクレオチドの間
のポリヌクレオチドを指す。しかし、本開示の目的において、オリゴヌクレオチドの長さ
に上限は存在しない。オリゴヌクレオチドは、オリゴマーまたはオリゴとしても公知のも
のであり、遺伝子から単離することができ、あるいは本技術分野において公知の方法によ
化学合成することができる。

0031

本明細書において、用語「マイクロRNA」は、いずれかの種類の干渉RNAを指し、
例として、内因性マイクロRNAおよび人工マイクロRNA(例えば、合成miRNA)
等が挙げられるがこれらに限定されない。内因性マイクロRNAは、mRNAの生産的利
用をモジュレートすることのできる、ゲノムにおいて天然にコードされている低分子RN
Aである。人工マイクロRNAは、mRNAの活性をモジュレートすることのできる、内
因性マイクロRNAを除くいかなる種類のRNA配列であってもよい。マイクロRNA配
列は、これらの配列のうちいずれか1種または複数で構成されたRNA分子となり得る。
マイクロRNA前駆体」(または「プレmiRNA」)は、マイクロRNA配列が組み
入れられたステムループ構造を有する核酸を指す。「成熟マイクロRNA」(または「
成熟miRNA」)は、マイクロRNA前駆体(「プレmiRNA」)から切断された、
あるいは合成された(例えば、無細胞合成により研究室において合成された)マイクロR
NAを含み、約19ヌクレオチド〜約27ヌクレオチドの長さを有する、例えば、成熟マ
クロRNAは、19nt、20nt、21nt、22nt、23nt、24nt、25
nt、26ntまたは27ntの長さを有し得る。成熟マイクロRNAは、標的mRNA
に結合し、標的mRNAの翻訳を阻害することができる。

0032

OCT4の例示的なゲノム、mRNA(cDNA)およびタンパク質配列は、本技術分
野において公知のものであり、例えば、(OCT4)POU5F1 POUクラス5ホメ
ボックス[Homo sapiens]遺伝子ID:5460を参照されたい。これは
、mRNA(cDNA)配列Genbank受託番号NM_001173531.1、標
題Homo sapiens POUクラス5ホメオボックス1(POU5F1)、転写
バリアント3、mRNA;Genbank受託番号NM_002701.4、標題Ho
mo sapiens POUクラス5ホメオボックス1(POU5F1)転写物バリ
ント1、mRNA;およびGenbank受託番号NM_203289.4、標題Hom
o sapiens POUクラス5ホメオボックス1(POU5F1)、転写物バリア
ント2、mRNAを提示する。SOX2の例示的なゲノム、mRNA(cDNA)および
タンパク質配列もまた、本技術分野において公知のものであり、例えば、SOX2 SR
Y(性決定領域Y)−box2[Homo sapiens]、遺伝子ID:6657を
参照されたい。これは、mRNA(cDNA)配列Genbank受託番号NM_003
106.2、標題mRNA配列Homo sapiens SRY(性決定領域Y)−b
ox2(SOX2)、mRNAを提示する。NANOGの例示的なゲノム、mRNA(c
DNA)およびタンパク質配列もまた、本技術分野において公知のものであり、例えば、
NANOG Nanogホメオボックス[Homo sapiens]、遺伝子ID:7
9923を参照されたい。これは、mRNA(cDNA)配列Genbank受託番号N
M_024865.2、標題Homo sapiens Nanogホメオボックス(N
ANOG)、mRNAを提示する。LIN28の例示的なゲノム、mRNA(cDNA)
およびタンパク質配列もまた、本技術分野において公知のものであり、例えば、LIN2
8AホモログA(C.elegans)[Homo sapiens]、遺伝子ID:7
9727を参照されたい。これは、mRNA(cDNA)配列Genbank受託番号N
M_024674.4、標題Homo sapiens lin−28ホモログA(C.
elegans)(LIN28A)、mRNAを提示する。KLF4の例示的なゲノム、
mRNA(cDNA)およびタンパク質配列は、本技術分野において公知のものであり、
例えば、KLF4クルッペル様因子4(腸)[Homo sapiens]、遺伝子ID
:9314を参照されたい。これは、mRNA(cDNA)配列Genbank受託番号
NM_004235.4、標題Homo sapiensクルッペル様因子4(腸)(K
LF4)、mRNAを提示する。MYCのmRNA配列もまた、本技術分野において公知
のものであり、例えば、MYC v−myc骨髄球腫症ウイルス癌遺伝子ホモログ(トリ
)[Homo sapiens]、遺伝子ID:4609を参照されたい。これは、mR
NA(cDNA)配列Genbank受託番号NM_002467.4、標題Homo
sapiens v−myc骨髄球腫症ウイルス癌遺伝子ホモログトリ)(MYC)、m
RNAを提示する。

0033

「ステム・ループ構造」は、主として一本鎖ヌクレオチドループ部分)の領域により
一側面において連結された二本鎖(ステム(step)部分)を形成することが公知また
予測されるヌクレオチドの領域を含む、二次構造を有する核酸を指す。用語「ヘアピン
」および「折り畳み」構造もまた、ステム・ループ構造を指すように本明細書において使
用されている。係る構造は、本技術分野において周知のものであり、これらの用語は、本
技術分野におけるその公知の意義と一貫して使用されている。二次構造が存在するのであ
れば、ステム・ループ構造内のヌクレオチドの実際の一次配列は、本発明の実施に決定的
ではない。本技術分野において公知の通り、二次構造は、正確な塩基対形成を要求しない
。よって、ステムは、1個または複数の塩基ミスマッチを含むことができる。あるいは、
塩基対形成は、正確であってもよい、即ち、いかなるミスマッチも含まない。

0034

本明細書において、用語「幹細胞」は、増殖するよう誘導することのできる未分化細胞
を指す。幹細胞は、自己保全を行うことができ、これは、各細胞分裂により、一方の
胞も幹細胞であることを意味する。幹細胞は、胚性胎児出生後若年期または成体組
織から得ることができる。用語「先駆細胞」は、本明細書において、幹細胞に由来する未
分化細胞を指し、これ自体は幹細胞ではない。一部の先駆細胞は、2種以上の細胞型に分
化することができる子孫を産生することができる。

0035

用語「人工多能性幹細胞」(または「iPS細胞」)は、本明細書において、体細胞、
例えば、分化した体細胞から誘導された幹細胞を指し、前記体細胞よりも高い潜在能力を
有する。iPS細胞は、自己再生し、成熟細胞、例えば、平滑筋細胞へと分化することが
できる。iPSは、平滑筋先駆細胞へと分化することもできる。

0036

本明細書において、細胞に関する用語「単離された」は、細胞が天然に存在する環境と
は異なる環境に存在する細胞を指し、例えば、細胞が多細胞生物において天然に存在し、
細胞がこの多細胞生物から取り出される場合、細胞は「単離された」。単離された遺伝子
改変宿主細胞は、遺伝子改変宿主細胞混合集団、または遺伝子改変宿主細胞および遺伝
子改変されていない宿主細胞を含む混合集団に存在し得る。例えば、単離された遺伝子改
変宿主細胞は、in vitroにおける遺伝子改変宿主細胞の混合集団、または遺伝子
改変宿主細胞および遺伝子改変されていない宿主細胞を含む混合in vitro集団に
存在し得る。

0037

「宿主細胞」は、本明細書において、in vivoまたはin vitro細胞(例
えば、単細胞実体として培養された真核細胞)を表示し、このような真核細胞は、核酸(
例えば、外因性核酸)のレシピエントとして使用することができ、あるいは使用されたこ
とがあり、核酸により遺伝子改変された元の細胞の子孫を含む。単一の細胞の子孫は、天
然、偶発的または意図的な変異によって、本来の親と形態またはゲノムまたは総DNA含
量(complement)が必ずしも完全に同一でなくてもよいことが理解される。

0038

用語「遺伝的改変」は、新たな核酸(即ち、細胞にとって外因性の核酸)の導入後に細
胞において誘導された、永続的なまたは一過性遺伝的変化を指す。遺伝的変化(「改変
」)は、新たな核酸を宿主細胞のゲノムへと組み入れることにより、あるいは新たな核酸
染色体外エレメントとして一過的または安定的に維持することにより達成することがで
きる。細胞が真核細胞である場合、永続的な遺伝的変化は、細胞のゲノムへの核酸の導入
により達成することができる。遺伝的改変の適した方法として、ウイルス感染、トランス
フェクション、コンジュゲーションプロトプラスト融合エレクトロポレーション、粒
(particle gun)技術、リン酸カルシウム沈殿、直接的マイクロインジ
ェクションその他が挙げられる。

0039

本明細書において、用語「外因性核酸」は、自然状態の細胞に通常または天然には見い
だされないおよび/もしくは産生されない、ならびに/または細胞に導入される(例えば
、エレクトロポレーション、トランスフェクション、感染、リポフェクションまたは細胞
へと核酸を導入するその他の手段による)核酸を指す。

0040

本明細書において、用語「処置」、「処置する」その他は、所望の薬理学および/また
生理学的効果を得ることを指す。効果は、疾患またはその症状の完全または部分的防止
の観点から予防的であっても、ならびに/または疾患および/もしくは疾患に起因し得る
有害な影響の部分的または完全治癒の観点から治療的であってもよい。「処置」は、本明
細書において、哺乳動物、特にヒトにおける疾患のいかなる処置も網羅し、(a)疾患の
素因を有する可能性があるが、それを有するとは未だ診断されていない被験体における疾
患発生の防止;(b)疾患の阻害、即ち、その発症の停止;および(c)疾患の緩和、即
ち、疾患を退行させることを含む。

0041

本明細書において互換的に使用されている用語「個体」、「被験体」、「宿主」および
「患者」は、ヒト、非ヒト霊長類齧歯類(例えば、マウスラット等)、有蹄動物、イ
ヌ、ウサギネコ等が挙げられるがこれらに限定されない哺乳動物を指す。一部の実施形
態において、目的の被験体はヒトである。一部の実施形態において、被験体は、齧歯類ま
たはウサギ等、非ヒト動物である。

0042

「治療有効量」または「効果的な量」は、疾患を処置するために被験体に投与されると
、疾患の係る処置をもたらすのに十分な化合物、核酸または多数の細胞の量を意味する。
「治療有効量」は、化合物または細胞、疾患およびその重症度、ならびに処置しようとす
る被験体の年齢、体重等に応じて変動するであろう。

0043

本発明をさらに説明する前に、当然ながらこれは変動し得るため、本発明は、記載され
ている特定の実施形態に限定されないことを理解されたい。本発明の範囲は、添付の特許
請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書に使用されている用語法は、単に特定
の実施形態を説明することを目的とし、限定を企図していないことも理解されたい。

0044

値の範囲が提示されている場合、文脈がそれ以外を明らかに指示しない限り、下限の単
位の10分の1までの該範囲の上限および下限の間の各介在値、ならびに該規定範囲にお
けるその他の規定値または介在値は、本発明の範囲内に包含されることが理解される。こ
のようなより小さい範囲の上限および下限は、より小さい範囲に独立的に含まれることが
でき、これもまた本発明の範囲内に包含され、規定範囲におけるいずれかの特に除外され
限界の対象となる。規定範囲が、限界の一方または両方を含む場合、含まれている限界
のいずれか一方または両方を除外する範囲もまた、本発明に含まれている。

0045

他に定めがなければ、本明細書に使用されているあらゆる技術および科学用語は、本発
明が属する技術分野の当業者に一般に理解されているものと同じ意義を有する。本発明の
実施または検査において、本明細書に記載されているものと類似または均等のいかなる方
法および材料を使用してもよいが、好ましい方法および材料は、本明細書に記載されてい
る。刊行物の引用に関連する方法および/または材料を開示および記載するために、本明
細書に言及されているあらゆる刊行物を、ここに本明細書の一部を構成するものとしてそ
の内容を援用する。

0046

本開示の一態様において、mRNAに基づく再プログラム化は、N末端MyoDトラン
活性化ドメイン(Hiraiら、Stem Cells、2011年)またはVP16
トランス活性化ドメインのC末端三重反復(Wangら、EMBO Reports、2
011年;この場合、VP16トランス活性化ドメインをOCT4(Pou5f1として
も公知)、NANOGおよびSOX2それぞれに融合することにより合成再プログラム化
因子を調製し、これら合成因子は、強化された効率かつ加速された動態でマウスおよびヒ
ト線維芽細胞の両方を再プログラム化することができた)を組み入れたOct4またはS
ox2の操作された改変体の使用により、あるいは2種の追加的な因子、Rargおよび
Lrh−1による「標準」RFカクテルの強化(Wangら、PNAS、2011年)に
より増強することができる。これら文献それぞれの内容を、参考として本明細書に援用す
る。強力な転写活性化因子は、DNAの特異的部位に結合すると、複数のクロマチンリモ
リング複合体を有効に動員することができる。良い一例として、分化細胞の運命をスイ
ッチすることができる骨格筋形成のマスター転写因子であるMyoDが挙げられる。Hi
raiらは、MyoDは、このように強力な転写因子であるため、一体に融合させた場合
にiPS因子のクロマチン到達性を増加させることができると推察した。Sox2および
Klf4と共にOct−MyoD TAD融合遺伝子を保有するレトロウイルスベクター
によりマウスまたはヒト細胞を形質導入すると、正準iPS因子と比較してiPSCコロ
ニー数がほぼ50倍増加された。同様に、頑強な転写活性化因子であると広く公知のVP
16は、異なるiPS因子に融合すると、再プログラム化において強力な刺激効果を提示
することができる。

0047

ヒトiPSCの例示的な調製
本方法を細胞の再分化または再プログラム化に広く使用して、例えば、造血幹細胞、間
葉系幹細胞、上皮幹細胞および筋サテライト細胞、または赤血球細胞リンパ球を含む白
血球細胞血小板ストローマ細胞脂肪細胞破骨細胞を含む骨細胞皮膚細胞を含む
上皮組織、平滑筋、骨格筋および心筋を含む筋組織内皮細胞を含む血管組織肝細胞
含む肝臓組織ならびにニューロンを含む神経組織等が挙げられるがこれらに限定されない
ヒト組織の分化細胞を形成するようさらにモジュレートすることのできるiPS細胞を産
生することもできる。心筋細胞、造血幹細胞、破骨細胞等の骨細胞、肝細胞、網膜細胞
よびニューロン等が挙げられるがこれらに限定されない様々な分化細胞型へとiPS細胞
の分化を誘導する方法。単離された胚性幹細胞、造血幹細胞および人工多能性幹細胞等が
挙げられるがこれらに限定されない幹細胞は、分化を誘導するRNAの一過性トランスフ
ェクションにより、分化するよう誘導することができる。その上またはその代わりに、細
胞型特異的条件下で細胞を培養することにより、細胞を再分化させることができる。例え
ば、iPS細胞は、CF−1フィーダーにおいて維持し、その後フィーダーフリー条件に
適応させることができる。ノギン、Dkk−1およびIGF−1の存在下で細胞を培養す
ることにより、iPS細胞を誘導して分化した網膜細胞を形成させることができる。

0048

以前に報告された方法論は、改変された因子を運ぶために、組み込み型ベクター、即ち
、ウイルスまたはプラスミドに利用していた。一実施形態において、mRNA再プログラ
ム化のための5種の因子(Oct4、Sox2、Klf4、cMyc−T58AおよびL
in28)の転写物を含む6種の異なるmRNA組合せカクテル、またはRargおよび
Lrh−1を含む7再プログラム化因子RFカクテルの性能を比較しつつ、再プログラム
化試行を行い、野生型Oct4ならびにMyoD−およびVP16−Oct4融合構築物
(それぞれM3OおよびVPx3と命名)に基づく3種の変種において各組合せを検査し
た。フィーダーに基づく再プログラム化培養物において11日間BJ線維芽細胞をトラン
スフェクトし、この時点までに、ウェルのいくつかにおいて進行した形態が明らかとなっ
た。続く数日間にわたって、野生型Oct4およびM3Oに基づくカクテルをトランスフ
ェクトしたウェルにおいて、特徴的なhESC形態を有するコロニーが出現した。VPx
3トランスフェクト培養物における標的細胞は、加速的な成長およびフォーカス凝集
る一部の傾向およびコロニーが出現しないことを示してはいたが、線維芽細胞の形態を保
持していた。野生型Oct4およびM3Oに基づくカクテルの5因子および7因子の実施
形態は、同様のコロニー生産性を示し、したがって、カクテルにおけるRargおよびL
rh−1の包含による利点は生じなかった。しかし、M3Oカクテルは、野生型Oct4
により産生された数の数倍のコロニーを生じた。この結果を踏まえ、増殖およびさらなる
解析のために、M3O 5因子ウェルからコロニーを採取した(図1)。核および細胞表
面マーカーの免疫染色により、また、3種の一次胚葉へのin vitro分化により、
M3O由来コロニーの多能性を確認した。6種の増殖させたiPSCクローンを、核型
析およびDNAフィンガープリント法に付したところ、全事例において細胞の核型の正常
性およびBJ系列が確認された。

0049

本方法を細胞の再分化または再プログラム化に広く使用して、例えば、造血幹細胞、間
葉系幹細胞、上皮幹細胞および筋サテライト細胞、または赤血球細胞、リンパ球を含む白
血球細胞、血小板、ストローマ細胞、脂肪細胞、破骨細胞を含む骨細胞、皮膚細胞を含む
上皮組織、平滑筋、骨格筋および心筋を含む筋組織、内皮細胞を含む血管組織、肝細胞を
含む肝臓組織ならびにニューロンを含む神経組織等が挙げられるがこれらに限定されない
ヒト組織の分化細胞を形成するようさらにモジュレートすることができるiPS細胞を産
生することもできる。心筋細胞、造血幹細胞、破骨細胞等の骨細胞、肝細胞、網膜細胞お
よびニューロン等が挙げられるがこれらに限定されない様々な分化細胞型へとiPS細胞
の分化を誘導する方法は、本技術分野において公知のものである(Songら(at a
l.)、Cell Res.、19巻(11号):1233〜42頁(2009年)、L
ambaら、PLoS One、5巻(1号):e8763頁(2010年)、Gaiら
、Cell Biol Int.200933巻(11号):1184〜93頁(200
9年)、Grigoriadisら、Blood、115巻(14号):2769〜76
頁(2010年))。単離された胚性幹細胞、造血幹細胞および人工多能性幹細胞等が挙
げられるがこれらに限定されない幹細胞は、分化を誘導するRNAの一過性トランスフェ
クションにより、分化するよう誘導することができる。その上またはその代わりに、細胞
型特異的条件下で細胞を培養することにより、細胞を再分化させることができる。例えば
、iPS細胞は、CF−1フィーダーにおいて維持し、その後フィーダーフリー条件に適
応させることができる。ノギン、Dkk−1およびIGF−1の存在下で細胞を培養する
ことにより、iPS細胞を誘導して分化した網膜細胞を形成させることができる。別の態
様において、mRNAカクテルの効力は、Nanog転写物の包含によりさらに増強させ
ることができる。本実施形態において、フィーダーにおいて50K BJ線維芽細胞を含
有する4個のウェルに、野生型Oct4またはM3Oに基づく5因子または6因子カクテ
ルを6日間トランスフェクトし、次に、各培養物を新鮮なフィーダーにおいて1:6継代
して、6ウェルプレート(4)に定着させた。各プレート内でさらに0〜5日間トランス
フェクションを継続した。iPSC生産性における異なるカクテルおよびトランスフェク
ション時間経過の影響を評価するために、18日目に(0日目は、第1のトランスフェク
ションに相当する)培養物を固定し、TRA−1−60抗体で染色した。結果は、カクテ
ルへのNanogの追加が、用いたOct4改変体に関係なく非常に有益であり、一方、
M3OおよびNanogを共に使用した場合に最大の転換効率が獲得されたことを示した

0050

一実施形態において、3種の追加的なヒト線維芽細胞株(HDF−f、HDF−nおよ
びXFF)を使用した追加的なフィーダーに基づく実験において、M3Oに基づく5因子
または6因子カクテルの有効性を確認した。再プログラム化動態および効率は、通常の増
殖培養においてBJよりも速い自然集団倍加時間を呈したこれら低継代株の全3種により
、顕著に改善された。一部の事例において、本発明者らは、早くもトランスフェクション
6日間からhESC様コロニーを得たが、収量は、さらに数日間トランスフェクションを
継続した実験においてはるかに高かった。新鮮な細胞の添加によるフィーダー層の定期的
補強に関与する実験は、この戦略いくらかの利益をもたらし得るが、得られたプロト
ールの複雑さにより相殺されるであろうことを示唆した。したがって、本発明者らは、合
理化されたフィーダーフリープロトコールの開発へと、より強力なカクテルを適用するこ
とに注力すると決断した。

0051

本開示は、フィーダーフリーiPSCの作製に関する。フィーダー非依存的iPSC誘
導は、一般に、用いられている再プログラム化技術に関係なく幾分厄介であるが、持続的
トランスフェクションレジメンの文脈において特殊な困難を生じることが判明した。細胞
生存能および増殖活性を損なうことなく線維芽細胞を蒔くことのできる密度には下限が存
在する。低密度培養において有糸分裂停止またはアポトーシスを行うという細胞の性向は
、再プログラム化因子のトランスフェクションおよび異所性発現により細胞にストレス
与えると増悪される。さらに、フィーダーに基づく再プログラム化に特徴的な高い細胞密
度において優れた耐容性を示すRNA用量は、より少ない細胞の間に分布させるとより深
刻な細胞毒性効果を生じる。同時に、mRNAトランスフェクションにより達成すること
ができる発現の浸透度は、線維芽細胞がコンフルエンスに達した後に激しく減退するが、
これはおそらく接触阻害およびG1停止に伴うエンドサイトーシス下方制御のためで
あろう。込み入った培養におけるトランスフェクションに対する寛容性のこのような低下
は、細胞が間葉系−上皮移行(MET)を行った後の再プログラム化において軽減される
と考えられる。しかし、本mRNAカクテルを使用した場合にヒト線維芽細胞がMETに
達するにはほぼ7日間が典型的に必要とされることは、細胞を最低生存可能初期密度
蒔いたとしても、線維芽細胞過成長の問題の阻止を困難にする。継代することにより細胞
を疎らにして、この運命を先延ばしにすることができるが、非常にストレスを与えられた
再プログラム化中間体のプレーティング効率は予測が難しく、いずれの場合においても、
継代に基づく誘導プロトコールは、簡便さを犠牲にし、ハイスループット適用への拡大が
うまくいかない。

0052

本開示は、METの表現型指標に関する(線維芽細胞プロセスの退行ならびにフォーカ
スおよび玉石形態の出現)。一実施形態において、METは、強化されたカクテルを使用
した本発明者らの発明により加速され、これは、6因子M3Oカクテルを使用し、継代な
しで、標的細胞を種々の低密度(ウェル当たり50K対100K対150K)で播種して
、フィーダーフリー再プログラム化を可能にした。

0053

本発明の一態様は、播種密度に対する高度な感受性が判明した再プログラム化培養物の
運命に関し、これはおそらく、過剰な細胞毒性および線維芽細胞過成長の効果の両方が、
トランスフェクションレジメンの過程にわたって自己補強しているためである。「標準」
RNA投薬(ウェル当たり1200ng)を使用する実験において、ウェル当たり100
Kで蒔いたHDF−nおよびXFF線維芽細胞から、数十個のhESC様コロニーを得た
が、相当する50Kおよび150K培養物は、それぞれ集団衝突および線維芽細胞過成長
に陥った後に、数個のコロニーのみを生じた。2種の他の線維芽細胞株BJおよびHDF
−aを用いて試みた誘導において、最も有望な(150K)培養物であっても、コンフル
エンスに達した直後に実質的に静止状態となり、その後、遅延した動態で孤発性コロニー
のみを生じた。

0054

本発明の特異的な一実施形態において、本発明者らは、ストレス誘導性細胞老化を最小
化する試みにおいて、周囲から5%酸素培養へと切り替え、トランスフェクションの最初
の4日間にわたり4分の1用量から完全RNA投薬へと徐々に増やした。

0055

これら新たな条件を使用した本発明の一例において、本発明者らは、c−MycをL−
Mycに置換することにより再プログラム化カクテルをさらに改善することができるか検
査した。

0056

別の実施形態において、本発明者らは、別々のステップにおいて4時間早く送達するの
ではなく、毎日の培地交換により細胞にRNAを添加する、単純化されたトランスフェク
ションスキームを評価した。「24時間トランスフェクション」ウェルにおいてRNA投
薬をスケールダウンして、予想される細胞毒性増加を代償し、2種の異なるトランスフェ
クション試薬を検査した(RNAiMAXおよびStemfect)。ウェル当たり50
KでXFF細胞を蒔き、9日間トランスフェクトした。従来の「4時間トランスフェクシ
ョン」レジメンは、c−Mycに基づくカクテルにより、ウェル当たりおおよそ百個のT
RA−1−60+コロニーを生じたが、一方、L−Mycカクテルの結果は同等に不十分
であった(図2)。「24時間トランスフェクション」培養の結果は、さらにまた印象
であった。これらのウェルのうち最も生産的なウェルにおいて(c−Myc 400ng
/ml Stemfect条件に相当する)、9日目、最後のトランスフェクションの2
4時間後に、培養物はほぼ過成長となり、hESC様細胞を有した。「24時間トランス
フェクション」のより優れた性能の機構基盤は、細胞により放出される拡散性因子を濃
縮することにより、疎らな培養の有効密度増加の効果を有したものと思われる。このよう
な好ましいプロトコール条件を別の実例的実験において適用した場合、ウェル当たり75
K細胞で播種した培養におけるHDF−a線維芽細胞を使用した誘導において、生産性は
、高度に増殖性のXFF細胞により達成されるものよりも注目に値しなかったが、早くも
プロトコール9日目までに多数のhESC様コロニーが再度出現した(図4)。

0057

特定の一実施形態において、一般に使用される容量よりも少ない培地容量で、例えば、
1ml、0.75ml、0.5mlまたは細胞培養を依然として持続することができる最
小量の培地で細胞を播種した場合、上に開示されている条件を使用した再プログラム化の
効率は明らかに改善される。これにより、再プログラム化における係る少容量条件を本発
明に組み入れる。

0058

本明細書に記載してきた実施形態は、決して本発明の唯一の適用ではない。当業者であ
れば、本開示が、やや変動性の条件下における、または再プログラム化、定方向分化もし
くは分化転換のための従来のもしくは操作された因子の同様の組合せによる、他の細胞の
再プログラム化にも有用であることを認識するであろう。

0059

他の実施形態において、因子の化学量論のさらなる最適化も、再プログラム化のペース
を強化する筈である。実際に、mRNA方法は、独立的にipPSC誘導の初期および後
期に取り組むカクテルを定義する機会を与える。M3Oの使用から得られる利益は、ip
sc生成への新規の操作された再プログラム化因子の最近の適用に関する新鮮な検証をも
たらす。その他の係る操作された再プログラム化因子は、SOX2、KLF4、CMYC
、LMYC、LIN28、NANOG等と、GAL4、GATA1、P53等、VP16
またはMYOD以外の因子由来のトランス活性化ドメインの融合を含む。mRNAの送達
に使用される試薬および方法論は、siRNAおよびmiRNAを同時トランスフェクト
するのに使用することもでき、これは、iPSC作製に有益であることが既に判明したこ
とに留意されたい。にもかかわらず、本明細書に開示されているフィーダーフリープロト
コールは、現在のプロトコールを上回る相当な進歩を表し、再プログラム化に要求される
時間を半分にまで低下させ、同等またはこれを超える労力および材料費の低下をもたらし
、手順から手間のかかるステップを取り除き、増殖因子またはサイトカインとほぼ同じ容
易さで、即ち、培地補充物としてmRNAを細胞に送達する。

0060

一部の実施形態において、細胞は、免疫応答をモジュレートするよう再プログラム化さ
れる。例えば、リンパ球は、再プログラム化されて制御性T細胞となり、それを必要とす
る患者にこれを投与して、免疫寛容、特に自己寛容を増加または移植することができる。
Foxp3陽性T細胞の誘導または投与は、移植片拒絶等、自己免疫応答の低下において
、および/または糖尿病多発性硬化症喘息炎症性腸疾患甲状腺炎腎臓疾患、関
リウマチ全身性エリテマトーデス円形脱毛症(alopecia greata)
強直性脊椎炎(anklosing spondylitis)、抗リン脂質症候群
自己免疫性アジソン病自己免疫性溶血性貧血自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患
自己免疫性リンパ球増殖性症候群(ALPS)、自己免疫性血小板減少性紫斑病ATP
)、ベーチェット病水疱性類天疱瘡心筋症セリアックスプルー皮膚炎慢性疲労
症候群・免疫不全症候群CFIDS)、慢性炎症脱髄性多発ニューロパチー瘢痕性
類天疱瘡寒冷凝集素症クレスト症候群クローン病ドゴー病皮膚筋炎、皮膚筋炎
若年性円板状エリテマトーデス本態性混合型クリオグロブリン血症線維筋痛症
線維筋炎グレーブス病ギランバレー橋本甲状腺炎特発性肺線維症特発性血小
減少性紫斑病ITP)、IgA腎症インスリン依存性糖尿病(I型)、若年性関節
炎、メニエール病混合性結合組織病、多発性硬化症、重症筋無力症尋常性天疱瘡、悪
貧血結節性多発動脈炎多発性軟骨炎、多腺性(polyglancular)症候
群、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎・皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原
発性胆汁性肝硬変乾癬レイノー現象ライター症候群リウマチ熱サルコイドーシ
ス、強皮症シェーグレン症候群スティッフマン症候群高安動脈炎側頭動脈炎/巨
細胞性動脈炎潰瘍性大腸炎、ぶどう膜炎、血管炎白斑およびウェゲナー肉芽腫症等、
自己免疫性疾患もしくは障害の1種もしくは複数の症状の低下、阻害もしくは抑制におい
て有用となり得る。

0061

本方法を使用して、パーキンソンアルツハイマー病創傷治癒および多発性硬化症等
の疾患等が挙げられるがこれらに限定されない、種々の疾患および障害の処置において有
用となり得る細胞を生成することができる。本方法は、臓器再生および免疫系の回復また
補給にも有用である。例えば、iPS細胞、造血幹細胞、複能性細胞または前駆体細胞
等の単能性細胞、例えば、上皮前駆体細胞その他等、異なる分化ステージの細胞は、静脈
内投与または局所外科手術により投与することができる。本方法は、処方薬レジメン、
外科手術、ホルモン療法化学療法および/または放射線療法等、他の従来方法と組み合
わせて使用することができる。

0062

一実施形態において、キットは、RNA、細胞、およびRNAを細胞にトランスフェク
トするための手段を含む。RNAは、凍結乾燥させても、溶液中にあってもよい。キット
は、細胞培養試薬等、他の材料を任意選択で含むことができる。代替的な実施形態におい
て、キットは、開示されている方法に従って調製され、後の使用のために冷蔵または冷凍
されて貯蔵および/または輸送された、再分化、脱分化または再プログラム化された細胞
を提供する。細胞は典型的に、溶液中に貯蔵されて、生存能を維持する。細胞を含有する
キットは、細胞が4℃より低く、好ましくは−20℃より低く維持されるように、ドライ
アイスを含有する冷却器内等、生存能に相応の方法を使用して貯蔵または輸送するべきで
ある。

0063

本キットは、次のうち1種または複数を任意選択で含む:生物活性剤、培地、賦形剤
よび次のうち1種または複数:シリンジ、針、糸、ガーゼ包帯消毒薬抗生物質、局
麻酔薬鎮痛剤外科用の糸、ハサミメス無菌流体および無菌容器。キットの構
成成分は、個々に包装することができ、無菌となり得る。キットは一般に、商業販売に適
した容器、例えば、プラスチックボール紙または金属の容器の中に提供される。キット
のいずれかは、使用説明書を含むことができる。本方法は、パーキンソン、アルハイ
ー病および多発性硬化症等、神経変性疾患等が挙げられるがこれらに限定されない、種々
の疾患および障害の処置において有用となり得る細胞の生成に使用することができる。本
方法は、臓器再生および免疫系の回復または補給にも有用である。例えば、iPS細胞、
造血幹細胞、複能性細胞または前駆体細胞等の単能性細胞、例えば、上皮前駆体細胞その
他等、異なる分化ステージの細胞は、静脈内投与または局所的外科手術により投与するこ
とができる。本方法は、処方薬レジメン、外科手術、ホルモン療法、化学療法および/ま
たは放射線療法等、他の従来方法と組み合わせて使用することができる。

0064

本開示の態様は、幹細胞の培養系、創傷処置のための皮膚組織細胞を産生するための分
化方法、ならびに関節炎狼瘡および他の自己免疫関連疾患の処置のための幹細胞療法
提供する。

0065

次に、以下の実施例を参照しつつ本発明を説明する。これらの実施例は、単なる説明目
的のために示されており、本発明は、これら実施例に限定されないが、それどころか、本
明細書に提示されている教示の結果明らかなあらゆる変種を包含する。

0066

実施例1−IVT鋳型の作製
ライゲーション非依存性クローニング(Ligation Independent
Cloning)(LIC)を使用して、直鎖状PCR産物in vitro転写(IV
T)鋳型を生成するためのプラスミド構築物を構築した。本発明者らは先ず、対象とする
タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム(ORF)インサート受け入れ
るよう設計された挿入部位に隣接する5’および3’非翻訳領域(UTR)を組み入れた
、親プラスミド(pIVT)を構築した。ORF隣接配列は、Warrenら、Cell
Stem Cell、2010年に記載されている通りのものであり、低二次構造リー
ダーおよび強力なコザック(Kozak)部位(5’UTR)ならびにマウスα−グロ
ン3’UTRを含む。テイルド(tailed)プライマーを使用してプラスミドから増
幅された2種のPCR産物の再アニーリングにより、5’オーバーハングを有する直鎖化
バージョンのpIVTベクターを産生した。相補的オーバーハングを有するORF PC
R産物を類似の手順により産生し、ベクターPCR産物と共にプールし、熱ショックによ
りDH5α細菌に形質転換して、遺伝子特異的構築物(pIVT−KLF4等)をクロー
ニングした。得られたプラスミドを鋳型PCR反応に使用して、Warrenら、Cel
l Stem Cell、2010年に記載されている通り、T7プロモーター、UTR
隣接ORF、およびポリAテイルの付加を駆動するためのT120テイルを組み入れた直
鎖状IVT鋳型を作製した。テイルドリバースプライマー(T120CTTCCTACT
CAGGCTTTATTCAAAGACCA)の使用により、T120テイル領域を導入
した。M3OおよびVPx3融合構築物に関して、トランス活性化ドメインをコードする
配列を、テイルドプライマーを使用したPCRによりORFに付け加えた。PCR産物鋳
ストックをほぼ100ng/uLの濃度で維持した。

0067

実施例2−mRNAカクテルの産生
mRNA合成プロセス図5にまとめる。4:1比のARCAキャップアナログGT
Pを使用したIVT反応において合成mRNAを生成して、高いパーセンテージのキャッ
ピングされた転写物を生成した。CTPを5m−CTPで、UTPをプソイド−UTPで
完全置換したヌクレオチド三リン酸NTP)ミックスを用いて、RNA産物の免疫原性
を低下させた。キャップアナログおよび修飾NTPは、Trilink Biotech
nologiesから購入した。2.5×NTPミックスを調製して(ARCA:ATP
:5m−CTP:GTP:プソイド−UTP、15:15:3.75:3.75:3.7
5mM)、IVT反応の実施に使用されるMEGAscript T7キット(Ambi
on)により提供された標準NTPを置き換えた。各40uLのIVT反応液は、16u
LのNTPミックス、4uLの10×T7バッファー、16uLのDNA鋳型および4u
LのT7酵素を含んだ。反応液を37℃で4〜6時間インキュベートし、次に2uLのT
URBO DNaseでさらに37℃で15分間処理し、その後、MEGAclear(
Ambion)スピンカラムにおいて精製し、100uLの容量においてRNA産物を溶
出した。キャッピングしていない転写物から免疫原性5’三リン酸部分を除去するため、
10uLのAntarcticホスファターゼ反応バッファーおよび3uLのAntar
cticホスファターゼ(NEB)を各プレップに加えた。ホスファターゼ反応液を37
℃で30分間インキュベートし、IVT産物を再精製した。Nanodrop(Ther
mo Scientific)によりRNA収量を定量化し、その結果、TE pH7.
0(Ambion)の添加によりプレップを標準化作業濃度100ng/uLに調整した
。所望の化学量論比において様々なRFを表すプレップをプールすることにより、RNA
カクテルを組み立てた。使用した各RFの割合は、それぞれの転写物の予測される分子量
を考慮し、3×モル濃度で含まれたOct4およびその誘導体以外の全RFは、等モル
度であった。短命の核化(nuclearized)単量体LanYFP蛍光タンパク質
をコードするmRNAの10%スパイクをカクテルに加えて、再プログラム化試行におけ
るトランスフェクション効力のモニターを容易にした。

0068

実施例3−細胞および培養培地
再プログラム化に標的化された細胞は、BJ新生児線維芽細胞(ATCC)、HDF−
胎児線維芽細胞、HDF−n新生児線維芽細胞およびHDF−a成体線維芽細胞(Sc
ienCell)およびXFF異種フリー新生児線維芽細胞(Millipore)を含
んだ。それぞれBJ、HDFおよびXFF細胞のために、BJ培地(DMEM+10%F
BS)、ScienCell線維芽細胞培地およびFibroGRO異種フリーヒト線維
芽細胞増殖培地(Millipore)において増殖培養を行った。使用したフィーダー
細胞は、3001G照射済み新生児ヒト包皮線維芽細胞(GlobalStem)および
FibroGROマイトマイシンC不活性化異種フリーヒト新生児線維芽細胞(Mill
ipore)であった。異種フリーフィーダーに基づくおよびフィーダーフリー再プログ
ラム化試行に該当する細胞継代ステップは、TrypLESelect(Gibco)
、動物性製品フリー細胞解離試薬を使用して行った。

0069

実施例4−ヒト線維芽細胞の再プログラム化
メーカー指示書に従って、CELLstart(Gibco)異種フリー培養基でコ
ティングされた6ウェル組織培養プレートにおいて、記載されている全再プログラム化
実験を行った。最初のBJ再プログラム化実験において、FBS含有BJ培地を使用して
、GlobalStemフィーダーをウェル当たり250Kで蒔いた。後のフィーダーに
基づく試行の一部において、播種密度を増加させ、新規RFカクテルを使用して直面する
高い損耗率に応じてほとんどコンフルエントなフィーダー層を持続する試みにおいて、培
交換の際に臨機応変にフィーダーを補充した。異種フリーフィーダーは、使用するので
あれば、血清を含まないPluritonに基づく再プログラム化培地に蒔いた。Plu
riton無血清培地(Stemgent)、ならびに抗生物質、Pluritonサプ
リメントおよび200ng/ml B18Rインターフェロン阻害剤(eBioscie
nce)に標的細胞を蒔いた。再プログラム化の間とその後に、培地を毎日交換し、最終
トランスフェクション翌日にB18R補給を中断した。再プログラム化の間に新鮮なフィ
ーダーにおいて細胞を分割した実験において、再プレーティングに使用される培地に10
uM Y27632(Stemgent)を含めた。標的細胞播種の翌日にトランスフェ
クションを開始し、これを本文に示す持続時間において24時間間隔で反復した。他に注
記されている場合を除き、毎日の培地交換の4時間前にRNAiMAX(Invitro
gen)を使用して、1200ngのRNA用量を各ウェルに送達した。100ng/u
LのRNAをカルシウムマグネシウム不含DPBSに5×希釈し、1ugのRNA当た
り5uLのRNAiMAXを同じ希釈液に10×希釈し、これらをプールして10ng/
uLのRNA/ビヒクル懸濁液を産生し、15分間の室温インキュベーション後に培養培
地に分注することにより、RNAiMAXに基づくトランスフェクションカクテルを作製
した。Stemfect試薬(Stemgent)を使用するトランスフェクションに関
して、RNAおよびStemfect(1ugのRNA当たり4uL)をStemfec
tバッファーにおいて混合して、10ng/uLのRNA濃度を得た。混合物を15分間
インキュベートし、次に培養培地に送達した、あるいは後の使用のために冷蔵した。

0070

実施例5−iPSCコロニーの特徴付け
iPSCコロニー生産性を評価するために、DPBS(カルシウム/マグネシウム含有
)中4%パラホルムアルデヒドを使用して再プログラム化培養物を固定し、DPBS(カ
ルシウム/マグネシウム含有)に100×希釈したStainAlive TRA−1−
60 Alexa488抗体(Stemgent)で免疫染色した。コロニーを採取し、
増殖し、その後に免疫染色して多能性の分子および機能検証のための三血球系分化アッセ
イを行った。DNAフィンガープリント法および核型解析を行った。奇形腫形成を行い、
2セット以上のマウスモデルにおいて確認した。これにより、幹細胞の多能性を実証した

実施例

0071

約9日間、場合によっては6日もの短さで、あるいはさらには5日間でiPSCが産生
され得るような方法で、操作された再プログラム化因子および操作されていない再プログ
ラム化因子の組合せと標的細胞とを接触させることによる、非幹細胞を多能性幹細胞へと
高度に効率的に再プログラム化するための新規方法を開示する。このようなiPS細胞は
、フィーダーフリー、異種フリーおよびフットプリントフリーのiPSCとして産生する
ことができる。考案されたプロセスによる再プログラム化の劇的な効率増加に加えて、新
規技術はまた、このように作製されたiPSCが、いかなるウイルス、ベクターにも接触
されていないことから「クリーン」であるという点において、あらゆる以前に公知の技術
とは異なる。本発明の有用性は、幹細胞樹立、分化、細胞および発生研究における有用性
ならびに臨床応用に関与する実質的にあらゆる分野において見出すことができる。同様の
手順は、定方向分化または分化転換において有用となることもできる。

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