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技術 耳鳴の重症度又は重症化リスクの診断方法

出願人 神崎晶
発明者 神崎晶
出願日 2016年3月29日 (4年8ヶ月経過) 出願番号 2016-066046
公開日 2017年10月5日 (3年1ヶ月経過) 公開番号 2017-175988
状態 未査定
技術分野 突然変異または遺伝子工学 酵素、微生物を含む測定、試験
主要キーワード 状態不安 ホイッスル音 再訓練 問診表 部分ポリ アデノシン三リン酸二ナトリウム 障害度 医療保険
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課題

本発明は、耳鳴重症度又は重症リスク診断するためのデータを収集する方法や、耳鳴の重症度又は重症化リスクの診断に利用するためのキット等を提供することを目的とする。

解決手段

米国国立生物工学情報センターNCBI)のSNPデータベースにおける登録番号rs131702で特定される一塩基多型を、耳鳴の重症度又は重症化リスクの遺伝子マーカーとして用いる。

概要

背景

耳鳴とは、「身体の内部以外には音源がないにもかかわらず、何らかの音の感覚が生じる異常な聴覚現象」と定義されている。耳鳴の音としては、例えば、ベル音ブザー音ホイッスル音うなり声などが挙げられ、耳鳴においては、これらの音が連続的又は断続的に聞こえるように感じられる。耳鳴を経験したことのある人は人口の約10〜15%ともいわれており、特に65以上の人の約30%が耳鳴の経験があるとの報告がある。一般に若年者の耳鳴は一過性のものであり、気が付いたら消えているといったように自然と軽快するものがほとんどである。一方、老年者の耳鳴は難聴を伴うことが多く、慢性化しやすい傾向がある。65歳以上の人の約20%が、ある一定期間以上持続する耳鳴を感じているともいわれている。慢性化した耳鳴は患者のQOL(quality of life:生活の質)を下げることがあり、特に耳鳴苦痛度が高い患者においては、感情乱れストレス不眠症、不安症などにつながる場合もあり、QOLが大きく損なわれることもある。

耳鳴は、大きく分けて、本人にしか聞こえない自覚的耳鳴と、外部から聴取可能な他覚的耳鳴に分類される。他覚的耳鳴は、の周囲の異常(顎関節の異常、耳周りの血管異常、高血圧等)に起因して生じる、耳の周囲の筋肉の音や、耳の周囲の関節の音や、耳の周囲の血管の血流の音などが原因となる。したがって、他覚的耳鳴は、その耳鳴の原因を改善するような外科的な治療を施すことや、耳の周囲の血行を促進することによって、改善されることが比較的多い。他方、自覚的耳鳴には、原因が不明の場合も多く、耳鳴の治療法によって耳鳴症状が改善する場合もあれば、ほとんど改善しない場合もあった。

耳鳴の治療法としては、経口の耳鳴改善薬投与が比較的多く用いられている。かかる耳鳴改善薬としては、内耳の血管を拡張して血液循環を改善するためのアデノシン三リン酸二ナトリウム水和物や、末梢神経栄養状態を改善するためのビタミンB12や、血液循環を改善するためのビタミンEや、内耳の血液循環を改善するための「ニコチン酸アミド及びパパベリン塩酸塩」などが挙げられる。これらの耳鳴改善薬によって、耳鳴が改善するかどうかは、その耳鳴改善薬を1〜2年間程度は患者に投与してみないと分からなかった。ある一種の耳鳴改善薬が効果を発揮しない場合、別種の耳鳴改善薬を試みるなどして、しかも結果としていずれの種類の耳鳴改善薬もその患者に効果を発揮しないケースもあった。このようなケースでは、患者や医療保険機関がその間に医療機関支払った費用や、その間に投与した耳鳴改善薬や、投与を行ったその期間は、結果として、用をなさないということになる。耳鳴改善薬がほとんど効果を発揮しない耳鳴患者などには、例えば、耳鳴再訓練療法(Tinnitus Retraining Therapy:TRT)と呼ばれる音響療法などを試みることができる。TRTは、補聴器のような形をした機械である耳鳴制御機器(Tinnitus Control Instrument:TCI)から発生させる雑音を患者に聞かせることによって、耳鳴が少し聞こえる程度にまで患者の耳鳴をかき消し、それによって、患者が耳鳴の音に順応馴化させるように脳を訓練する方法である。

以上のように、ある耳鳴患者に耳鳴改善薬が効果を発揮するかどうかは、耳鳴改善薬の投与を一定期間行わないと分からなかったため、その間に患者や医療保険機関が医療機関に支払う費用、その間に投与した耳鳴改善薬、投与を行ったその期間は、結果として、用をなさないという問題があった。

ところで、BCR(breakpoint cluster region)遺伝子は、ヒトの22番染色体長腕(22q11)に座位する遺伝子である。9番染色体長腕(9q34)に座位するABL(Abelson murine leukemia virus)遺伝子と、前述のBCR遺伝子とが相互転座して、BCR−ABLキメラ遺伝子が形成されると、チロシンキナーゼ活性亢進した異常タンパク質が産生され、白血病病態が形成されることが知られている(非特許文献1)。正常なBCR遺伝子産物であるBCRタンパク質は、セリントレオニンリン酸化酵素活性を有しており、p21racに対するGTPase活性タンパクである。BCRタンパク質の機能は明確ではないが、rs131702(NCBIのSNPデータベースにおける登録番号)を含む、BCR遺伝子の11個の一塩基多型(SNIPs)が双極性障害(いわゆる、躁うつ病)や大うつ病性障害(いわゆる、うつ病)の病態に関与している可能性が示唆されている(非特許文献2)。非特許文献2によれば、rs131702は、双極性障害との関連は示唆されているものの、大うつ病性障害との関連は否定されている(非特許文献2のTable 1)。

これまでにBCR遺伝子のSNPと耳鳴の重症度等との関連は知られておらず、ましてや、rs131702と耳鳴の重症度等との関連は知られていなかった。

概要

本発明は、耳鳴の重症度又は重症リスク診断するためのデータを収集する方法や、耳鳴の重症度又は重症化リスクの診断に利用するためのキット等を提供することを目的とする。米国国立生物工学情報センター(NCBI)のSNPデータベースにおける登録番号rs131702で特定される一塩基多型を、耳鳴の重症度又は重症化リスクの遺伝子マーカーとして用いる。なし

目的

本発明の課題は、耳鳴の重症度又は重症化リスクを診断するためのデータを収集する方法や、耳鳴の重症度又は重症化リスクの診断に利用するためのキット等を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
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牽制数
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請求項1

米国国立生物工学情報センターNCBI)のSNPデータベースにおける登録番号rs131702で特定される一塩基多型からなる、耳鳴重症度又は重症リスク診断用遺伝子マーカー

請求項2

遺伝子マーカーを用いて、耳鳴の重症度又は重症化リスクを診断するためのデータを収集する方法であって、(A)被験者から採取された核酸検体について、米国国立生物工学情報センター(NCBI)のSNPデータベースにおける登録番号rs131702で特定される一塩基多型のアレルを検出する工程;を有し、上記工程(A)で検出した、rs131702で特定される一塩基多型の遺伝子型がG/T型又はG/G型であることが、rs131702で特定される一塩基多型の遺伝子型がT/T型である場合よりも、耳鳴の重症度又は重症化リスクが高いことを示し、又は、上記工程(A)で検出した、rs131702で特定される一塩基多型の遺伝子型がG/G型であることが、rs131702で特定される一塩基多型の遺伝子型がG/T型又はT/T型である場合よりも、耳鳴の重症度又は重症化リスクが高いことを示し、又は、上記工程(A)で検出した、rs131702で特定される一塩基多型の遺伝子型がG/T型であることが、rs131702で特定される一塩基多型の遺伝子型がT/T型である場合よりも、耳鳴の重症度又は重症化リスクが高いことを示す、前記方法。

請求項3

上記工程(A)で検出した、rs131702で特定される一塩基多型の遺伝子型がG/G型、G/T型、T/T型の順で、耳鳴の重症度又は重症化リスクが高いことを示す、請求項2に記載の耳鳴の重症度又は重症化リスクを診断するためのデータを収集する方法。

請求項4

以下の(a)〜(d)のいずれかのヌクレオチド配列を有するか、又は、以下の(a)〜(d)のいずれかのヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する、耳鳴の重症度又は重症化リスクの診断用ポリヌクレオチドプローブであって、(a)配列番号1に示されるヌクレオチド配列;(b)上記(a)のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列;(c)配列番号1に示されるヌクレオチド配列における連続する15〜500個のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であって、かつ、配列番号1に示されるヌクレオチド配列の128436番目のヌクレオチドにおけるT又はGである一塩基多型部位を含むヌクレオチド配列;(d)上記(c)のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列;

請求項5

耳鳴の重症度又は重症化リスクの診断用ポリヌクレオチドプライマーであって、配列番号1に示されるBCR遺伝子のヌクレオチド配列の128436番目のヌクレオチドにおけるT又はGである一塩基多型部位を含むポリヌクレオチド断片増幅に用いることができるポリヌクレオチドプライマー。

請求項6

フォワードプライマー及びリバースプライマープライマー対である請求項5に記載の耳鳴の重症度又は重症化リスクの診断用ポリヌクレオチドプライマー。

技術分野

0001

本発明は、耳鳴耳鳴り)の重症度又は重症リスク診断に関し、より詳しくは、耳鳴の重症度又は重症化リスクを診断するためのデータを収集する方法や、耳鳴の重症度又は重症化リスクの診断に利用するためのキット等に関する。

背景技術

0002

耳鳴とは、「身体の内部以外には音源がないにもかかわらず、何らかの音の感覚が生じる異常な聴覚現象」と定義されている。耳鳴の音としては、例えば、ベル音ブザー音ホイッスル音うなり声などが挙げられ、耳鳴においては、これらの音が連続的又は断続的に聞こえるように感じられる。耳鳴を経験したことのある人は人口の約10〜15%ともいわれており、特に65以上の人の約30%が耳鳴の経験があるとの報告がある。一般に若年者の耳鳴は一過性のものであり、気が付いたら消えているといったように自然と軽快するものがほとんどである。一方、老年者の耳鳴は難聴を伴うことが多く、慢性化しやすい傾向がある。65歳以上の人の約20%が、ある一定期間以上持続する耳鳴を感じているともいわれている。慢性化した耳鳴は患者のQOL(quality of life:生活の質)を下げることがあり、特に耳鳴苦痛度が高い患者においては、感情乱れストレス不眠症、不安症などにつながる場合もあり、QOLが大きく損なわれることもある。

0003

耳鳴は、大きく分けて、本人にしか聞こえない自覚的耳鳴と、外部から聴取可能な他覚的耳鳴に分類される。他覚的耳鳴は、の周囲の異常(顎関節の異常、耳周りの血管異常、高血圧等)に起因して生じる、耳の周囲の筋肉の音や、耳の周囲の関節の音や、耳の周囲の血管の血流の音などが原因となる。したがって、他覚的耳鳴は、その耳鳴の原因を改善するような外科的な治療を施すことや、耳の周囲の血行を促進することによって、改善されることが比較的多い。他方、自覚的耳鳴には、原因が不明の場合も多く、耳鳴の治療法によって耳鳴症状が改善する場合もあれば、ほとんど改善しない場合もあった。

0004

耳鳴の治療法としては、経口の耳鳴改善薬投与が比較的多く用いられている。かかる耳鳴改善薬としては、内耳の血管を拡張して血液循環を改善するためのアデノシン三リン酸二ナトリウム水和物や、末梢神経栄養状態を改善するためのビタミンB12や、血液循環を改善するためのビタミンEや、内耳の血液循環を改善するための「ニコチン酸アミド及びパパベリン塩酸塩」などが挙げられる。これらの耳鳴改善薬によって、耳鳴が改善するかどうかは、その耳鳴改善薬を1〜2年間程度は患者に投与してみないと分からなかった。ある一種の耳鳴改善薬が効果を発揮しない場合、別種の耳鳴改善薬を試みるなどして、しかも結果としていずれの種類の耳鳴改善薬もその患者に効果を発揮しないケースもあった。このようなケースでは、患者や医療保険機関がその間に医療機関支払った費用や、その間に投与した耳鳴改善薬や、投与を行ったその期間は、結果として、用をなさないということになる。耳鳴改善薬がほとんど効果を発揮しない耳鳴患者などには、例えば、耳鳴再訓練療法(Tinnitus Retraining Therapy:TRT)と呼ばれる音響療法などを試みることができる。TRTは、補聴器のような形をした機械である耳鳴制御機器(Tinnitus Control Instrument:TCI)から発生させる雑音を患者に聞かせることによって、耳鳴が少し聞こえる程度にまで患者の耳鳴をかき消し、それによって、患者が耳鳴の音に順応馴化させるように脳を訓練する方法である。

0005

以上のように、ある耳鳴患者に耳鳴改善薬が効果を発揮するかどうかは、耳鳴改善薬の投与を一定期間行わないと分からなかったため、その間に患者や医療保険機関が医療機関に支払う費用、その間に投与した耳鳴改善薬、投与を行ったその期間は、結果として、用をなさないという問題があった。

0006

ところで、BCR(breakpoint cluster region)遺伝子は、ヒトの22番染色体長腕(22q11)に座位する遺伝子である。9番染色体長腕(9q34)に座位するABL(Abelson murine leukemia virus)遺伝子と、前述のBCR遺伝子とが相互転座して、BCR−ABLキメラ遺伝子が形成されると、チロシンキナーゼ活性亢進した異常タンパク質が産生され、白血病病態が形成されることが知られている(非特許文献1)。正常なBCR遺伝子産物であるBCRタンパク質は、セリントレオニンリン酸化酵素活性を有しており、p21racに対するGTPase活性タンパクである。BCRタンパク質の機能は明確ではないが、rs131702(NCBIのSNPデータベースにおける登録番号)を含む、BCR遺伝子の11個の一塩基多型(SNIPs)が双極性障害(いわゆる、躁うつ病)や大うつ病性障害(いわゆる、うつ病)の病態に関与している可能性が示唆されている(非特許文献2)。非特許文献2によれば、rs131702は、双極性障害との関連は示唆されているものの、大うつ病性障害との関連は否定されている(非特許文献2のTable 1)。

0007

これまでにBCR遺伝子のSNPと耳鳴の重症度等との関連は知られておらず、ましてや、rs131702と耳鳴の重症度等との関連は知られていなかった。

先行技術

0008

Blood. 1990 Jul 1;76(1):136-41.
Biol Psychiatry 2005; 57(10):1097-1102.

発明が解決しようとする課題

0009

本発明の課題は、耳鳴の重症度又は重症化リスクを診断するためのデータを収集する方法や、耳鳴の重症度又は重症化リスクの診断に利用するためのキット等を提供することにある。

課題を解決するための手段

0010

本発明者らは、耳鳴患者の治療に携わる中で、耳鳴苦痛度が比較的高い患者の中でも、うつ(鬱)又は不安に関連するとされている遺伝的背景を持つ患者には、それに配慮した医療行為を行うことが望ましいのではないかと考えた。そこで、本発明者らは、うつ又は不安に関連するとされる遺伝的背景と、耳鳴苦痛度との関連性について調査を試みた。

0011

かかる遺伝的背景の候補となるSNP(一塩基多型)としては、遺伝子とそれに関連する疾患についてのデータベースであるOMIM(Online Mendelian Inheritance in Man)において、うつ、不安障害又は強迫性障害との関連が報告されているもの中で、HapMap japanにおいてマイナーアレル頻度(Minor allele frequency:MAF)が0.1(10%)以上である8種類のSNPを選択した(実施例の表1)。耳鳴苦痛度の指標であるTHI(Tinnitus handicap inventory)スコアと、前述の8種類のSNPの遺伝子型相関関係の有無を解析したところ、BCR(breakpoint cluster region)遺伝子におけるrs131702(NCBIのSNPデータベースにおける登録番号)というSNPの遺伝子型が、THIスコアとの間に有意な相関関係を有することを見いだした。すなわち、本発明者らは、rs131702のSNPの少なくとも1つのアレルがGである(該SNPの遺伝子型がG/T型又はG/G型である)と、THIスコアが高いという相関関係、より詳しくは、該SNPの遺伝子型が、G/G型、G/T型、T/T型の順で、THIスコアが高いという相関関係を見いだし、本発明を完成するに至った。

0012

なお、耳鳴苦痛度は、その時点での耳鳴の重症度と評価することができる。また、耳鳴に罹患してからの期間を問わない患者のTHIスコアを用いて相関関係を解析しているため、rs131702のSNPの少なくとも1つのアレルがGであるとTHIスコアが全体の傾向として高いということは、かかるアレルを持つ患者でTHIスコアがまだあまり高くない患者は、耳鳴の重症化リスクが高いと評価することもできる。

0013

すなわち、本発明は、
(1)米国国立生物工学情報センター(NCBI)のSNPデータベースにおける登録番号rs131702で特定される一塩基多型からなる、耳鳴の重症度又は重症化リスクの診断用遺伝子マーカーに関する。

0014

また、本発明は、
(2)遺伝子マーカーを用いて、耳鳴の重症度又は重症化リスクを診断するためのデータを収集する方法であって、
(A)被験者から採取された核酸検体について、米国国立生物工学情報センター(NCBI)のSNPデータベースにおける登録番号rs131702で特定される一塩基多型のアレルを検出する工程;
を有し、
上記工程(A)で検出した、rs131702で特定される一塩基多型の遺伝子型がG/T型又はG/G型であることが、rs131702で特定される一塩基多型の遺伝子型がT/T型である場合よりも、耳鳴の重症度又は重症化リスクが高いことを示し、又は、
上記工程(A)で検出した、rs131702で特定される一塩基多型の遺伝子型がG/G型であることが、rs131702で特定される一塩基多型の遺伝子型がG/T型又はT/T型である場合よりも、耳鳴の重症度又は重症化リスクが高いことを示し、又は、
上記工程(A)で検出した、rs131702で特定される一塩基多型の遺伝子型がG/T型であることが、rs131702で特定される一塩基多型の遺伝子型がT/T型である場合よりも、耳鳴の重症度又は重症化リスクが高いことを示す、前記方法や、
(3)上記工程(A)で検出した、rs131702で特定される一塩基多型の遺伝子型がG/G型、G/T型、T/T型の順で、耳鳴の重症度又は重症化リスクが高いことを示す、上記(2)に記載の耳鳴の重症度又は重症化リスクを診断するためのデータを収集する方法に関する。

0015

さらに、本発明は、
(4)以下の(a)〜(d)のいずれかのヌクレオチド配列を有するか、又は、以下の(a)〜(d)のいずれかのヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する、耳鳴の重症度又は重症化リスクの診断用ポリヌクレオチドプローブであって、
(a)配列番号1に示されるヌクレオチド配列;
(b)上記(a)のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列;
(c)配列番号1に示されるヌクレオチド配列における連続する15〜500個のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であって、かつ、配列番号1に示されるヌクレオチド配列の128436番目のヌクレオチドにおけるT又はGである一塩基多型部位を含むヌクレオチド配列;
(d)上記(c)のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列;や、
(5)耳鳴の重症度又は重症化リスクの診断用ポリヌクレオチドプライマーであって、
配列番号1に示されるBCR遺伝子のヌクレオチド配列の128436番目のヌクレオチドにおけるT又はGである一塩基多型部位を含むポリヌクレオチド断片増幅に用いることができるポリヌクレオチドプライマーや、
(6)フォワードプライマー及びリバースプライマープライマー対である上記(5)に記載の耳鳴の重症度又は重症化リスクの診断用ポリヌクレオチドプライマーに関する。

発明の効果

0016

本発明によれば、耳鳴の重症度又は重症化リスクを診断するためのデータを収集する方法や、耳鳴の重症度又は重症化リスクの診断に利用するためのキット等を提供することができる。

0017

また、本発明によれば、その耳鳴患者の耳鳴の重症化リスクが高いこと、例えば、その耳鳴患者に従来の耳鳴改善薬があまり効果を発揮しない可能性が高いということをより早期に診断することができる。そのため、その耳鳴患者が従来の耳鳴改善薬をより長期間試みることにより生じる費用や、要する期間を減少させることができ、また、耳鳴再訓練療法(Tinnitus Retraining Therapy:TRT)や、他の将来的な治療法へより早期に切り替えることができる。

0018

1.<本発明の耳鳴の重症度又は重症化リスクの遺伝子マーカー>
本発明の「耳鳴の重症度又は重症化リスクの遺伝子マーカー」(以下、単に「本発明の遺伝子マーカー」とも表示する。)としては、米国国立生物工学情報センター(NCBI)のSNPデータベースにおける登録番号rs131702で特定される一塩基多型(以下、「本発明におけるSNP」とも表示する。)からなる限り特に制限されない。rs131702とは、ヒトの22番染色体の23308800番目のヌクレオチドのT/G多型である。

0019

後述の実施例の結果から分かるように、rs131702は、耳鳴苦痛度が重症・最重症であると評価される群(「重症・最重症耳鳴患者群」)と、耳鳴苦痛度が軽症・中等症であると評価される群(「軽症・中等症耳鳴患者群」)を比較したときに、重症・最重症耳鳴患者群において、TアレルよりもGアレルの頻度が有意に高い。したがって、rs131702は、耳鳴の重症度又は重症化リスク(以下、まとめて「耳鳴の重症度等」とも表示する。)の診断用マーカーとして有用である。

0020

また、後述の実施例の結果から分かるように、THIスコアは、rs131702のSNPがG/G型、G/T型、T/T型の順で高く、しかもこの傾向は有意であった。したがって、rs131702は、耳鳴の重症度等の診断用マーカーとして有用である。同様に、STAI(State-Trait Anxiety Inventory)状態不安検査で得られたSTAIスコアは、rs131702のSNPがG/G型、G/T型、T/T型の順で高く、しかもこの傾向は有意であった。したがって、rs131702は、耳鳴の重症化に伴う状態不安の診断用マーカーとしても有用である。

0021

本発明の遺伝子マーカーのアレル又は遺伝子型の情報は、該情報のみで、耳鳴の重症度又は重症化リスクを診断したり、前記情報のみを耳鳴の重症度等の診断のためのデータとしてもよいし、他の情報等と組み合わせて耳鳴の重症度等を診断したり、他の情報と組み合わせて耳鳴の重症度等のためのデータとしてもよい。

0022

本明細書における「耳鳴の重症度」とは、その時点での耳鳴の重症度を意味する。本明細書における「耳鳴の重症度」としては、耳鳴のいずれかの症状の重さの度合を表している限り特に制限されないが、耳鳴苦痛度の指標として汎用されているTHI(Tinnitus handicap inventory)のスコアの高さの度合が好ましく挙げられる。THIは25問の質問から構成されており、1つの質問に4点、2点又は0点が割り当てられている。各質問への回答に応じた得点を25問分合算した点が、その対象のTHIスコアとなる。THIスコアが高いほど耳鳴苦痛度が高く、THIスコアが低いほど耳鳴苦痛度が低いことを示す。

0023

本明細書における「耳鳴の重症化リスク」とは、耳鳴が将来的に重症化するリスク(危険度)を意味する。本明細書における「耳鳴の重症化リスク」としては、耳鳴の重症度が将来的に増加するリスク(危険度)である限り特に制限されないが、THIスコアが将来的に上昇するリスク(危険度)が好ましく挙げられる。ここで「将来的に」とは、その時期を特に制限するものではなく、例えば、1ヶ月後以降、3ヶ月後以降、6ヶ月後以降、1年後以降、2年後以降、3年後以降、5年後以降、10年後以降などが挙げられる。また、期間の上限は特に制限されないが、50年後以内、40年後以内、30年後以内などが挙げられる。

0024

耳鳴の重症化リスクの高さは、耳鳴の難治リスクや予後の悪さと関連するため、rs131702は、耳鳴の難治リスクや予後の悪さの診断用マーカーとしても用いることができる。

0025

本発明の遺伝子マーカーは、rs131702がGアレルを有している場合に、Gアレルを有していない場合よりも、耳鳴の重症度や重症化リスクが高いと評価することができる。また、本発明の遺伝子マーカーは、rs131702が、G/G型、G/T型、T/T型の順で、耳鳴の重症度又は重症化リスクが高いことを示す。したがって、被験者のrs131702の遺伝子型がG/T型である場合は、T/T型である場合よりも、耳鳴の重症度又は重症化リスクが高いことを示し、被験者のrs131702の遺伝子型がG/G型である場合は、G/T型である場合や、T/T型である場合よりも、耳鳴の重症度又は重症化リスクが高いことを示す。

0026

2.<本発明の耳鳴の重症度又は重症化リスクを診断するためのデータを収集する方法>
本発明の「耳鳴の重症度又は重症化リスクを診断するためのデータを収集する方法」(以下、単に「本発明のデータの収集方法」とも表示する。)としては、
(A)被験者から採取された核酸検体について、米国国立生物工学情報センター(NCBI)のSNPデータベースにおける登録番号rs131702で特定される一塩基多型のアレルを検出する工程;
を有し、
上記工程(A)で検出した、rs131702で特定される一塩基多型の遺伝子型がG/T型又はG/G型であることが、rs131702で特定される一塩基多型の遺伝子型がT/T型である場合よりも、耳鳴の重症度又は重症化リスクが高いことを示し、又は、
上記工程(A)で検出した、rs131702で特定される一塩基多型の遺伝子型がG/G型であることが、rs131702で特定される一塩基多型の遺伝子型がG/T型又はT/T型である場合よりも、耳鳴の重症度又は重症化リスクが高いことを示し、又は、
上記工程(A)で検出した、rs131702で特定される一塩基多型の遺伝子型がG/T型であることが、rs131702で特定される一塩基多型の遺伝子型がT/T型である場合よりも、耳鳴の重症度又は重症化リスクが高いことを示す、前記方法である限り特に制限されない。

0027

上記工程(A)としては、被験者から採取された核酸検体について、米国国立生物工学情報センター(NCBI)のSNPデータベースにおける登録番号rs131702で特定される一塩基多型のアレルを検出する工程である限り特に制限されない。

0028

上記の「核酸検体」としては、ヒトである被験者から採取された核酸であって、rs131702のSNP部位を有する核酸を含む検体である限り特に制限されず、被験者の例えば血液、皮膚細胞粘膜細胞毛髪等から公知の抽出方法精製方法を用いて調製することができる。

0029

本明細書において「アレル」とは、ある一塩基多型部位において取りうる、互いに異なる塩基(ヌクレオチド)を有するそれぞれの型を言う。本明細書において「遺伝子型」とは、ある一塩基多型部位において、対立するアレルの組み合わせを言う。rs131702で特定される一塩基多型において、対立するアレルの組合せである遺伝子型には、G/G型、G/T型、T/T型の3つの型がある。

0030

上記工程(A)における「一塩基多型のアレルを検出する」とは、その一塩基多型のアレルの塩基の種類を同定することを意味する。「一塩基多型のアレルを検出する」ことには、一塩基多型の一方のアレルを検出することも含まれるが、その一塩基多型の両方のアレルを検出し、その一塩基多型の遺伝子型を同定することが好ましく含まれる。

0031

上記工程(A)で検出した、rs131702で特定される一塩基多型のアレルや遺伝子型のデータは、耳鳴の重症度又は重症化リスクを診断するために用いることができる。具体的には、上記工程(A)で検出した、rs131702で特定される一塩基多型の遺伝子型がG/T型又はG/G型であることが、rs131702で特定される一塩基多型の両方のアレルがTである場合よりも、耳鳴の重症度又は重症化リスクが高いことを示し、上記工程(A)で検出した、rs131702で特定される一塩基多型の遺伝子型がG/G型であることが、rs131702で特定される一塩基多型の遺伝子型がG/T型又はT/T型である場合よりも、耳鳴の重症度又は重症化リスクが高いことを示し、上記工程(A)で検出した、rs131702で特定される一塩基多型の遺伝子型がG/T型であることが、rs131702で特定される一塩基多型の遺伝子型がT/T型である場合よりも、耳鳴の重症度又は重症化リスクが高いことを示す。また、上記工程(A)で検出した、rs131702で特定される一塩基多型の遺伝子型がG/G型、G/T型、T/T型の順で、耳鳴の重症度又は重症化リスクが高いことを示す。

0032

上記工程(A)における、rs131702で特定される一塩基多型のアレル(好ましくは遺伝子型)を検出する方法(解析する方法)としては、特に制限されず、例えばアレル特異的プライマー(及びプローブ)を用い、PCR法による増幅、及び増幅産物の多型を蛍光又は発光によって検出する方法や、PCR(polymerase chain reaction)法を利用したPCR−RFLP(restriction fragment length polymorphism:制限酵素断片長多型)法、PCR−SSCP(single strand conformation polymorphism:単鎖高次構造多型)法(Orita,M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 86, 2766-2770 (1989)等)、PCR−SSO(specific sequence oligonucleotide:特異的配列オリゴヌクレオチド)法、PCR−SSO法とドットハイブリダイゼーション法を組み合わせたASO(allele specific oligonucleotide:アレル特異的オリゴヌクレオチド)ハイブリダイゼーション法(Saiki, Nature, 324, 163-166 (1986)等)、TaqMan(登録商標、Roche Molecular Systems社)−PCR法(Livak, KJ, Genet Anal, 14, 143 (1999), Morris, T. et al., J. Clin. Microbiol., 34, 2933 (1996))、Invader(登録商標、Third Wave Technologies社)法(Lyamichev V et al., Nat Biotechnol, 17,292 (1999))、FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer)を利用した方法(Heller, Academic Press Inc, pp. 245-256 (1985)、Cardullo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8790-8794 (1988)、国際公開第99/28500号パンフレット、特開2004−121232号公報など)、ASP−PCR(Allele Specific Primer-PCR)法(国際公開第01/042498号公報など)、プライマー伸長法を用いたMALDI−TOF/MS(matrix)法(Haff LA, Smirnov IP, Genome Res 7, 378 (1997))、RCA(rolling cycle amplification)法(Lizardi PM et al., Nat Genet 19, 225 (1998))、DNAチップ又はマイクロアレイを用いた方法(Wang DG et al., Science 280, 1077 (1998)等)、プライマー伸長法、サザンブロットハイブリダイゼーション法、ドットハイブリダイゼーション法(Southern,E., J. Mol. Biol. 98, 503-517 (1975))等、公知の方法を採用できる。さらに、検出対象の一塩基多型部位を直接シークエンスすることにしてもよい。尚、これらの方法を任意に組み合わせて一塩基多型を検出してもよい。また、PCR法又はPCR法を応用した方法などの核酸増幅法により核酸試料を予め増幅(核酸試料の一部領域の増幅を含む)した後、上記いずれかの検出方法を適用することもできる。

0033

多数の核酸検体を検出する場合にはアレル特異的PCR法、アレル特異的ハイブリダイゼーション法、TaqMan−PCR法、Invader法、FRETを利用した方法、ASP−PCR法、プライマー伸長法を用いたMALDI−TOF/MS(matrix)法、RCA(rolling cycle amplification)法、又はDNAチップ又はマイクロアレイを用いた方法等、多数の検体を比較的短時間で検出可能な検出法を用いることが特に好ましい。

0034

以上の方法では、各方法に応じたプローブやプライマー等のポリヌクレオチドが使用される。このような耳鳴の重症度又は重症化リスクの診断用ポリヌクレオチドプローブや、耳鳴の重症度又は重症化リスクの診断用ポリヌクレオチドプライマーも、本発明に含まれる。

0035

(耳鳴の重症度又は重症化リスクの診断用ポリヌクレオチドプローブ)
本発明の「耳鳴の重症度又は重症化リスクの診断用ポリヌクレオチドプローブ」(以下、単に「本発明のポリヌクレオチドプローブ」とも表示する。)としては、以下の(a)〜(d)のいずれかのヌクレオチド配列を有するか、又は、以下の(a)〜(d)のいずれかのヌクレオチド配列に対して特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドプローブである限り特に制限されず、中でも、以下の(a)〜(d)のいずれかのヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドプローブや、以下の(a)〜(d)のいずれかのヌクレオチド配列に対して特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドプローブであることが好ましい。
(a)配列番号1に示されるヌクレオチド配列;
(b)上記(a)のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列;
(c)配列番号1に示されるヌクレオチド配列における連続する15〜500個のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であって、かつ、配列番号1に示されるヌクレオチド配列の128436番目のヌクレオチドにおけるT又はGである一塩基多型部位を含むヌクレオチド配列;
(d)上記(c)のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列;

0036

上記の「配列番号1に示されるヌクレオチド配列」は、ヒトのBCR(breakpoint cluster region)遺伝子のヌクレオチド配列である。配列番号1に示されるヌクレオチド配列の128436番目のヌクレオチドが、rs131702で特定される一塩基多型部位に該当する。

0037

上記(c)における連続するヌクレオチドの個数としては、15〜500個である限り特に制限されないが、18〜200個が好ましく、20〜60個がさらに好ましく、22〜50個がより好ましい。

0038

上記の「(a)〜(d)のいずれかのヌクレオチド配列に対して特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドプローブ」とは、(a)〜(d)のいずれかのヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと、そのポリヌクレオチドプローブとが特異的にハイブリダイズするようなヌクレオチド配列を、そのポリヌクレオチドプローブが有していることを意味する。

0039

本明細書において「特異的にハイブリダイズする」とは、ポリヌクレオチドプローブによる検出の際に通常採用されるハイブリダイゼーション条件(好ましくはストリンジェントな条件)の下、標的のポリヌクレオチド領域に対してハイブリダイズする一方で、他のポリヌクレオチド領域との間にクロスハイブリダイゼーションを有意に生じないことを意味する。なお、当業者であれば、例えばMolecular Cloning(Fourth Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)を参考にして、特異的なハイブリダイゼーションが生じるハイブリダイゼーション条件を容易に設定可能である。また、上記のストリンジェントな条件としては、例えば、1倍濃度のMES(2-(N-Morpholino)ethanesul fonic Acid及び塩化テトラメチルアンモニウム混合溶液緩衝液中(水素イオン濃度は6.5〜6.7)、49℃でハイブリダイズし、6倍濃度のSSC(塩化ナトリウムクエン酸ナトリウム混合溶液)(水素イオン濃度は8.0)、25℃、次いで0.6倍濃度のSSC(水素イオン濃度は8.0)、45℃で順次洗浄するような条件が挙げられる。

0040

上記の「(a)〜(d)のいずれかのヌクレオチド配列に対して特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドプローブ」には、(a)〜(d)のいずれかのヌクレオチド配列と95%以上、好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、さらに好ましくは99%以上、より好ましくは99.5%以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドプローブが含まれ、好ましくは、(a)〜(d)のいずれかのヌクレオチド配列と95%以上、好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、さらに好ましくは99%以上、より好ましくは99.5%以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドプローブが含まれる。また、上記の「(a)〜(d)のいずれかのヌクレオチド配列に対して特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドプローブ」には、(a)〜(d)のいずれかのヌクレオチド配列との間のミスマッチのヌクレオチドの個数が1〜10個、好ましくは1〜7個、より好ましくは1〜5個、さらに好ましくは1〜3個、より好ましくは1又は2個、さらに好ましくは1個が挙げられる。

0041

(耳鳴の重症度又は重症化リスクの診断用ポリヌクレオチドプライマー)
本発明の「耳鳴の重症度又は重症化リスクの診断用ポリヌクレオチドプライマー」(以下、単に「本発明のポリヌクレオチドプライマー」とも表示する。)としては、配列番号1に示されるBCR遺伝子のヌクレオチド配列の128436番目のヌクレオチドにおけるT又はGである一塩基多型部位を含むポリヌクレオチド断片の増幅(好ましくは、特異的な増幅)に用いることができるポリヌクレオチドプライマーである限り特に制限されない。

0042

本発明のポリヌクレオチドプライマーの例としては、検出対象の一塩基多型部位を含むポリヌクレオチド領域に相補的な配列を有し、当該一塩基多型部位を含むポリヌクレオチド断片(好ましくはDNA断片)を特異的に増幅できるように設計されたポリヌクレオチドを挙げることができる。本発明のポリヌクレオチドプライマーの他の例として、検出対象の一塩基多型部位がいずれかのヌクレオチドである場合にのみ当該一塩基多型部位を含むポリヌクレオチド断片(好ましくはDNA断片)を特異的に増幅するように設計されたポリヌクレオチドセットを挙げることができる。より具体的には、検出対象の一塩基多型部位を含むポリヌクレオチド断片(好ましくはDNA断片)を特異的に増幅するように設計されたポリヌクレオチドセットであって、一塩基多型部位がいずれかのヌクレオチドであるアンチセンス鎖の当該一塩基多型部位を含むポリヌクレオチド領域に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマーと、センス鎖の一部のポリヌクレオチド領域(一塩基多型部位の近傍領域)に対して特異的にハイブリダイズするアンチセンスプライマーとからなるポリヌクレオチドセットを例示することができる。ここで、増幅されるポリヌクレオチド断片のヌクレオチド数はその検出に適した範囲で適宜設定され、例えば15〜1000個の範囲内、好ましくは20〜500個の範囲内、更に好ましくは30〜200個の範囲内が挙げられる。

0043

上記の「ポリヌクレオチド領域に対して特異的にハイブリダイズする」ポリヌクレオチドプライマーには、該ポリヌクレオチド領域のヌクレオチド配列と95%以上、好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、さらに好ましくは99%以上、より好ましくは99.5%以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドプライマーが含まれ、好ましくは、上記ポリヌクレオチド領域のヌクレオチド配列と95%以上、好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、さらに好ましくは99%以上、より好ましくは99.5%以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドプライマーが含まれる。また、上記の「ポリヌクレオチド領域に対して特異的にハイブリダイズする」ポリヌクレオチドプライマーには、該ポリヌクレオチド領域のヌクレオチド配列との間のミスマッチのヌクレオチドの個数が1〜10個、好ましくは1〜7個、より好ましくは1〜5個、さらに好ましくは1〜3個、より好ましくは1又は2個、さらに好ましくは1個が挙げられる。

0044

本発明のポリヌクレオチドプローブや、本発明のポリヌクレオチドプライマーは、ホスホジエステル法など公知の方法によって合成することができる。なお、多型を検出するためのポリヌクレオチドプローブや、ポリヌクレオチドプライマーの設計、合成等に関しては成書(例えばMolecular Cloning,fourth Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press, New YorkやCurrent protocols in molecular biology(edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987))を参考にすることができる。

0045

本発明のポリヌクレオチドプローブや、本発明のポリヌクレオチドプライマーは、予め標識物質で標識しておくことができる。標識化ポリヌクレオチドプローブや、標識化ポリヌクレオチドプライマーを用いることにより例えば、増幅産物の標識量を指標として一塩基多型を検出することができる。また、一塩基多型を構成する各遺伝子型の遺伝子における部分ポリヌクレオチド領域をそれぞれ特異的に増幅するように設計された2種類のプライマーを互いに異なる標識物質で標識しておけば、増幅産物から検出される標識物質及び標識量によって核酸検体の遺伝子型を判別できる。このような標識化プライマーを用いた検出方法の具体例としては、一塩基多型を構成する各遺伝子型のセンス鎖にそれぞれ特異的にハイブリダイズする2種類のポリヌクレオチドプライマー(アレル特異的センスプライマー)をフルオレセインイソチオシアネートテキサスレッドでそれぞれ標識し、これら標識化プライマーとアンチセンス鎖に特異的にハイブリダイズするアンチセンスプライマーとを用いて一塩基多型部位を含む部分ポリヌクレオチド領域を増幅し、得られた増幅産物における各蛍光物質の標識量を測定して一塩基多型を検出する方法を挙げることができる。なお、ここでのアンチセンスプライマーを例えばビオチンで標識しておけば、ビオチンとアビジンとの特異的な結合を利用して増幅産物の分離を行うことができる。

0046

本発明のポリヌクレオチドプローブや、本発明のポリヌクレオチドプライマーの標識に用いられる標識物質としては7-AAD、Alexa Fluor(登録商標)488、Alexa Fluor(登録商標)350、Alexa Fluor(登録商標)546、Alexa Fluor(登録商標)555、Alexa Fluor(登録商標)568、Alexa Fluor(登録商標)594、Alexa Fluor(登録商標)633、Alexa Fluor(登録商標)647、Cy(登録商標)2、DsRED、EGFP、EYFP、FITC、PerCP(登録商標)、R-Phycoerythrin、Propidium Iodide、AMCA、DAPI、ECFP、MethylCoumarin、Allophycocyanin(APC)、Cy(登録商標)3、Cy(登録商標)5、Rhodamine-123、Tetramethylrhodamine、テキサスレッド(Texas Red(登録商標))、PE、PE-Cy(登録商標)5、PE-Cy(登録商標)5.5、PE-Cy(登録商標)7、APC-Cy(登録商標)7、オレゴングリーン(Oregon Green)、カルボキシフルオレセインカルボキシフルオレセインジアセテート量子ドットなどの蛍光色素、32P、131I、125Iなどの放射性同位元素、ビオチンを例示でき、標識方法としてはアルカリフォスファターゼ及びT4ポリヌクレオチドキナーゼを用いた5’末端標識法、T4DNAポリメラーゼやKlenow断片を用いた3’末端標識法、ニックトランスレーション法ランダムプライマー法(Molecular Cloning,third Edition,Chapter 9,Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)などを例示できる。

0047

本発明のポリヌクレオチドプローブや、本発明のポリヌクレオチドプライマーは、不溶性支持体固定化した状態で用いることもできる。固定化に使用する不溶性支持体をチップ状、ビーズ状などに加工しておけば、これら固定化ポリヌクレオチドを用いて一塩基多型の検出をより簡便に行うことができる。

0048

(耳鳴の重症度又は重症化リスクの診断用キット
本発明の「耳鳴の重症度又は重症化リスクの診断用キット」(以下、単に「本発明のキット」とも表示する。)としては、上記の本発明のポリヌクレオチドプローブ又は本発明のポリヌクレオチドプライマーを含んでいる限り特に制限されず、好ましくは、上記の本発明のポリヌクレオチドプローブ及び本発明のポリヌクレオチドプライマーを含んでいる。本発明のキットはその他に、核酸増幅用酵素バッファを含んでいてもよい。

0049

本発明は他の態様として、以下の発明を含む。
(耳鳴の重症度又は重症化リスクを診断する方法)
遺伝子マーカーを用いて、耳鳴の重症度又は重症化リスクを診断する方法であって、
(A)被験者から採取された核酸検体について、米国国立生物工学情報センター(NCBI)のSNPデータベースにおける登録番号rs131702で特定される一塩基多型のアレルを検出する工程;及び、
(B)検出した前記アレルに基づいて、被験者の耳鳴の重症度又は重症化リスクを診断する工程;を含み、
上記工程(A)で検出した、rs131702で特定される一塩基多型の遺伝子型がG/T型又はG/G型であることが、rs131702で特定される一塩基多型の遺伝子型がT/T型である場合よりも、耳鳴の重症度又は重症化リスクが高いことを示し、又は、
上記工程(A)で検出した、rs131702で特定される一塩基多型の遺伝子型がG/G型であることが、rs131702で特定される一塩基多型の遺伝子型がG/T型又はT/T型である場合よりも、耳鳴の重症度又は重症化リスクが高いことを示し、又は、
上記工程(A)で検出した、rs131702で特定される一塩基多型の遺伝子型がG/T型であることが、rs131702で特定される一塩基多型の遺伝子型がT/T型である場合よりも、耳鳴の重症度又は重症化リスクが高いことを示す、前記方法。

0050

(耳鳴の重症度又は重症化リスクを判定する方法)
遺伝子マーカーを用いて、耳鳴の重症度又は重症化リスクを判定する方法であって、
(A)被験者から採取された核酸検体について、米国国立生物工学情報センター(NCBI)のSNPデータベースにおける登録番号rs131702で特定される一塩基多型のアレルを検出する工程;
を有し、
上記工程(A)で検出した、rs131702で特定される一塩基多型の遺伝子型がG/T型又はG/G型であることが、rs131702で特定される一塩基多型の遺伝子型がT/T型である場合よりも、耳鳴の重症度又は重症化リスクが高いことを示し、又は、
上記工程(A)で検出した、rs131702で特定される一塩基多型の遺伝子型がG/G型であることが、rs131702で特定される一塩基多型の遺伝子型がG/T型又はT/T型である場合よりも、耳鳴の重症度又は重症化リスクが高いことを示し、又は、
上記工程(A)で検出した、rs131702で特定される一塩基多型の遺伝子型がG/T型であることが、rs131702で特定される一塩基多型の遺伝子型がT/T型である場合よりも、耳鳴の重症度又は重症化リスクが高いことを示す、前記方法。

0051

(耳鳴の重症度又は重症化リスクの診断に用いるためのポリヌクレオチドプローブ)
耳鳴の重症度又は重症化リスクの診断に用いるためのポリヌクレオチドプローブであって、
前記ポリヌクレオチドプローブは、以下の(a)〜(d)のいずれかのヌクレオチド配列を有するか、又は、以下の(a)〜(d)のいずれかのヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する。
(a)配列番号1に示されるヌクレオチド配列;
(b)上記(a)のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列;
(c)配列番号1に示されるヌクレオチド配列における連続する15〜500個のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であって、かつ、配列番号1に示されるヌクレオチド配列の128436番目のヌクレオチドにおけるT又はGである一塩基多型部位を含むヌクレオチド配列;
(d)上記(c)のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列;

0052

(耳鳴の重症度又は重症化リスクの診断に用いるためのポリヌクレオチドプライマー)
耳鳴の重症度又は重症化リスクの診断に用いるためのポリヌクレオチドプライマーであって、
前記ポリヌクレオチドプライマーは、配列番号1に示されるBCR遺伝子のヌクレオチド配列の128436番目のヌクレオチドにおけるT又はGである一塩基多型部位を含むポリヌクレオチド断片の増幅に用いることができる。

0053

以下に実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

0054

耳鳴苦痛度の重症度又は重症化リスクを診断し得るSNP(以下、「耳鳴診断用SNP」という)を同定することを目的として、耳鳴診断用候補SNPを選択し、慢性耳鳴患者について、かかる候補SNPと、耳鳴の重症度や状態不安との相関性分析を行った。

0055

[慢性耳鳴患者の特徴]
男性59名、及び女性79名の計138名の慢性耳鳴患者(平均年齢は61.31±13.12歳)は、3ヶ月以上継続する耳鳴に対する苦痛を主訴に2013年から2015年4月までに慶應義塾大学病院耳鼻咽喉科受診した慢性耳鳴患者で明らかな精神疾患を持たない患者のうち、初診時に耳鳴苦痛度の指標であるTHIスコアの確認のなされた者であった。これら患者からは、本研究における利用の承諾を取得している。

0056

[耳鳴診断用候補SNPの選択方法
遺伝子とそれに関連する疾患についてのデータベースであるOMIM(Online Mendelian Inheritance in Man)において、うつ、不安障害又は強迫性障害との関連が報告されているもの中で、HapMap japanにおいてマイナーアレル頻度(Minor allele frequency:MAF)が0.1(10%)以上のものを、耳鳴診断用候補SNPとして選択した。その結果、ヒトのフィラデルフィア染色体転座の結果形成される融合タンパク質(BCR−ABLタンパク質)を構成するタンパク質(BCR;breakpoint cluster region)をコードするBCR遺伝子のSNP3種(rs140504、rs131690、及びrs131702);精神疾患治療薬の標的であるセロトニントランスポーターをコードするSLC6A4/15遺伝子のSNP(rs1545843);セロトニン受容体をコードするHTR2A遺伝子のSNP(rs7997012);アデニル酸シクラーゼと共役し、その下流の代謝経路に影響を及ぼすADCYAP1R1遺伝子のSNP(rs2267735);抗老化遺伝子と考えられているSIRT1遺伝子のSNP(rs10997870);が選択された(表1参照)。なお、表中の「Major」及び「Minor」(アレル)の割合は、日本人平均値を示す。また、上記選択方法とは別に、MAOB遺伝子のSNP(rs1799836)を、耳鳴診断用候補SNPとして選択した。

0057

0058

慢性耳鳴患者由来血液試料から、Gentra Puregene Blood Kit(QIAGEN社製)を用いてゲノムDNAを抽出した。上記表1の8種類のSNP(rs1545843、rs7997012、rs140504、rs131690、rs131702、rs2267735、rs10997870、及びrs1799836)のタイピングには、TaqMan(登録商標)SNPGenotypingAssays(Life Technologies社製)およびKAPA PROBEFAST qPCRkit(Kapa Biosystems社製)を利用し、PRISMSequence Detection System 7900HT(Life Technologies社製)を用いて、TaqMan(登録商標)PCR法に従って行った。上記手順は、それぞれのキットおよび機器に添付のマニュアルに従って行った。

0059

[耳鳴の重症度の評価法
慢性耳鳴患者における耳鳴の重症度は、Newmanらが作成した「耳鳴りによる障害度についての問診表」(THI;Tinnitus Handicap Inventory)を基に評価した。すなわち、THIスコアが56以下である患者と、58以上である患者の2群に分け、THIスコア56以下である患者を、耳鳴苦痛度が軽症・中等症であると評価(軽症・中等症耳鳴患者群)し、THIスコア58以上である患者を、耳鳴苦痛度が重症・最重症であると評価(重症・最重症耳鳴患者群)した。軽症・中等症耳鳴患者群と、重症・最重症耳鳴患者群との間でSNPによる有意差があるかどうかは、Fisher正確確率検定により解析した(表2参照)。また、SNPとTHIスコアとの間に関連性があるかどうかは、トレンド検定により解析した(表3参照)。

0060

0061

0062

[状態不安の評価法]
慢性耳鳴患者における状態不安は、1970年スピールバーガー原著で、千葉大学医学部名誉教授水口公信、文京子大学教授 下仲順子、岩手県立大学教授 中里克治によって日本標準化されたSTAI(State-Trait Anxiety Inventory)状態不安検査で得られたSTAIスコアを基に評価した。SNPとSTAIスコアとの間に関連性があるかどうかは、トレンド検定により解析した(表4参照)。

0063

0064

[結果]
BCR遺伝子のSNP(rs131702)、すなわち、Genome Reference Consortium Human Build 38 patch release 2(GRCh38.p2)に登録されている22番染色体の23,308,800部位(フォワード鎖)におけるGアレル(G/G型、又はG/T型)の割合は、軽症・中等症耳鳴患者群よりも重症・最重症耳鳴患者群の方が高かった(表2参照)。また、上記のトレンド検定の結果から、THIスコアは、rs131702のSNPがG/G型、G/T型、T/T型の順で高いことが示された(表3参照)。すなわち、THIスコアは、rs131702のSNPがG/G型の耳鳴患者群で最も高く、G/T型の耳鳴患者群で2番目に高く、T/T型の耳鳴患者群で最も低かった(表3参照)。さらに、上記のトレンド検定の結果から、STAIスコアは、rs131702のSNPがG/G型、G/T型、T/T型の順で高いことが示された(表3参照)。すなわち、STAIスコアは、rs131702のSNPがG/G型の耳鳴患者群で最も高く、G/T型の耳鳴患者群で2番目に高く、T/T型の耳鳴患者群で最も低かった(表4参照)。

実施例

0065

これらの結果は、BCR遺伝子のSNP(rs131702)におけるGアレルの有無や程度、該SNPの遺伝子型を指標にして、耳鳴の重症化や、耳鳴の重症化に伴う状態不安を判定・評価できることを示している。一方、BCR遺伝子のSNP(rs131702)以外の7種類のSNP(rs140504、rs131690、rs1545843、rs7997012、rs2267735、rs10997870、及びrs1799836)については、耳鳴の重症化や、耳鳴の重症化に伴う状態不安との関連性は認められなかった(表2〜4参照)。

0066

本発明によれば、耳鳴の重症度又は重症化リスクを診断するためのデータを収集する方法や、耳鳴の重症度又は重症化リスクの診断に利用するためのキット等を提供することができる。

0067

また、本発明によれば、その耳鳴患者の耳鳴の重症化リスクが高いこと、例えば、その耳鳴患者に従来の耳鳴改善薬があまり効果を発揮しない可能性が高いということをより早期に診断することができる。そのため、その耳鳴患者が従来の耳鳴改善薬をより長期間試みることにより生じる費用や、要する期間を減少させることができ、また、耳鳴再訓練療法(Tinnitus Retraining Therapy:TRT)や、他の将来的な治療法へより早期に切り替えることができる。

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