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技術 好中球ゼラチナーゼ結合性リポカリンを含む多発性嚢胞腎の予防または治療用の医薬組成物

出願人 國立台湾師範大学
発明者 謝秀梅王怡人蒋思テツ鄭文義邱元佑
出願日 2016年12月19日 (3年4ヶ月経過) 出願番号 2016-245305
公開日 2017年9月14日 (2年7ヶ月経過) 公開番号 2017-160182
状態 拒絶査定
技術分野 蛋白脂質酵素含有:その他の医薬 突然変異または遺伝子工学 化合物または医薬の治療活性
主要キーワード グリッド交点 本発明者たち アニオンイオン 回復不能 パラメトリックデータ 急性腎障害 食用成分 生成レベル
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図面 (20)

課題

多発性嚢胞腎の予防および治療のために有用な医薬組成物の提供。

解決手段

好中球ゼラチナーゼ結合性リポカリン(NGAL)を含む、多発性嚢胞腎(PKD)の予防または治療用の医薬組成物。

概要

背景

常染色体優性多発性嚢胞腎ADPKD)は、最も一般的な遺伝子疾患で、その有症率は1:400から1:1000である。ADPKDの症例中、ほぼ85%が16番染色体PKD1の突然変異を原因としている(TorresVE,et al.,Lancet,369:1287−1301,2007;Grantham JJ,et al.,Nat Rev Nephrol,7:556−566,2011)。PKD1の遺伝子は、ポリシスチン1(PC1)をコードし、実験マウスでにおいて、PC1のダウンレギュレーションは、胎生期15.5日(E15.5)の初期嚢胞形成や、重症度に関連する。(Piontek K,et al.,Nat Med,13:1490−1495,2007;Hopp K,et al.,J Clin Invest,122:4257−4273,2012;FedelesSV,et al.,TrendsMol Med,20:251−260,2014;Lu W,et al.,Nat Genet,17:179−181,1997;MagenheimerBS,et al.,J Am Soc Nephrol,17:3424−3437,2006).

ADPKD患者は、大抵40になるころには症状が現れ始め、50歳になるころには腎不全へ進行し、生命を維持するためには、透析(例えば、血液透析腹膜透析)や、腎移植が必要となる。ADPKDは家族の常染色体優性形質として遺伝する。「常染色体優性」という言葉は、一方の親が罹患している場合、その子供に同じ病気が出る可能性が50%あるということを意味している。ADPKDは慢性腎不全の第4番目の主因であるが、世界中で約1200万人、アメリカ合衆国内では、60万人(約500人に1人のアメリカ人)が罹患している。ADPKD患者の約50%が、50歳になるころには腎不全となっている。

トルバプタン(Tolvaptan)は、大塚製薬によって、日本で発見・開発されたが、うっ血性心不全による低ナトリウム血症低レベルの血液ナトリウム)を治療するために使われる、パソプレシンV2受容体拮抗薬であった。その薬は、また、ラットおよびマウスを使った動物モデル成功により、ADPKDの治療に効果があると期待されていた。ADPKDの成人患者1445人の臨床試験国際的に行われ、ADPKDの治療法として支持されている。トルバプタンは、PKD患者の腎臓総体積の増加や腎機能の低下を実際に遅らせることが証明されている。しかしながら、ADPKD患者の臨床試験のデータから、回復不能な、さらには致命的な肝障害リスクが導き出された。そのため、米国食品医薬品局心血管肝臓諮問委員会は、常染色体優性多発性嚢胞腎(ADPKD)に対する大塚製薬のトルバプタン使用の承認控えている。

好中球ゼラチナーゼ結合性リポカリン(NGAL)は、22kDの分泌リポカリンタンパク質ファミリーであり、腎臓のネフロン発現する。NGALは、肝臓発生(Yang J,et al.,Mol Cell,10:1045−1056,2002)や、バクテリアによる感染に対する自然免疫反応(Flo TH,et al.,Nature,432:917−921,2004;Berger T,et al.,Proc Natl Acad Sci,103:1834−1839,2006)に関与している。NGALレベルの増加は、急性腎虚血(AKI)(Mishra J,et al.,J Am Soc Nephrol,14:2534−2543,2003;Mishra J,et al.,Lancet,365:1231−1238,2005;Urbschat A,et al.,Eur J Clin Invest,44:652−659,2014;Di Grande A,et al.,Eur Rev Med Pharmacol Sci,13:197−200,2009;Devarajan P,Biomark Med,8:217−219,2014)や、慢性腎臓病進行度CKD)(NickolasTL,et al.,Kidney Int,82:718−722,2012;Shen SJ,et al.,Nephrology (Carlton),19:129−135,2014)や、PKDの重症度(Parikh CR,et al.,Kidney Int,81:784−790,2012;Meijer E,et al.,Am J Kidney Dis,56:883−895,2010)に対して、クレアチン血液尿素窒素(BUN)と比較して、より早く、より敏感なバイオメーカーとみなされている。

NGAL受容体(NGAL−R,Slc22a17)は、遠位尿細管集合(尿細)管の頂端膜で発現し、細胞内の鉄供給に関係している(Langelueddecke C,et al.,J Biol Chem,287:159−169,2012)。NGALとNGAL−Rの結合は、細胞内の鉄の枯渇アポトーシス刺激分裂の減少の原因となる(Devireddy LR,et al.,Cell,123:1293−1305,2005;Schmidt−Ott KM,et al.,J Am Soc Nephrol,18:407−413,2007;Devarajan P.,Cancer Ther,5:463−470,2007)。

米国特許出願公開第2014/0079769号明細書には、Ngal遺伝子の発現レベルを測定することによって、慢性腎臓病(CKD)の進行を予測することや、Ngal遺伝子の発現を抑制することによって、CKDを予防したり治療できることが開示されている。加えて、米国特許出願公開第2009/0170143号明細書では、被験者体液サンプル中のNGALの濃度を測定することで、腎障害の可能性をモニターしたり、特定する方法を開示している。さらには、高分子量画分中のNGALの量を測定することで、CKDと急性腎障害急性腎不全(AKIやAKD)とを区別するための方法が、米国特許出願公開第2011/0091912号明細書には開示されている。

米国特許第8247376号明細書では、虚血虚血再灌流障害、又は、毒素による障害で苦しんでいる患者に対するNGALの静脈、皮下、腹腔内投与が開示されている。この、特許では、NGALが、近位尿細管細胞を直接的にターゲットにし、腎臓の再上皮化尿細管細胞増殖を高めること、そして、細管細胞のアポトーシスを減らし、虚血再灌流障害後の高レベル血清又は血漿クレアチンを減少させること、が記載されている。

治療薬としてのNGALの使用は、虚血、虚血再灌流障害、又は、毒素誘発性障害で苦しんでいる患者への治療法として開示されているにも関わらず、PKDへの副作用のない治療薬や治療法にはなっていない。

概要

多発性嚢胞腎の予防および治療のために有用な医薬組成物の提供。好中球ゼラチナーゼ結合性リポカリン(NGAL)を含む、多発性嚢胞腎(PKD)の予防または治療用の医薬組成物。なし

目的

効果

実績

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牽制数
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請求項1

請求項2

前記多発性嚢胞腎が、常染色体優性多発性嚢胞腎(ADPKD)である、請求項1に記載の医薬組成物。

請求項3

前記多発性嚢胞腎(PKD)の予防または治療が、嚢胞成長遅延させ、腎臓の嚢胞容積および腎臓重量を減少させ、腎糸球体線維症および腎間質線維症を減少させ、腎臓の尿細管間質区画低酸素状態を低下させ、腎尿細管嚢胞性上皮細胞アポトーシスを増加させ、腎尿細管の嚢胞性上皮細胞の増殖を減少させ、および、患者生存および生存期間統計学的に有意に改善する、という病態生理学的メカニズムを同時に改善する、請求項1または2に記載の医薬組成物。

請求項4

PKDの予防または治療において、前記NGALが、NGALおよびNGAL受容体(NGAL−R)の発現増加、および、活性カスパーゼ−3の増加およびプロカスパーゼ3の減少、の少なくとも1つを誘導する、請求項1または2に記載の医薬組成物。

請求項5

PKDの予防または治療において、前記NGALが、α−SMA、コラーゲン低酸素誘導因子1−α(HIF−1α)、プロカスパーゼ3、増殖細胞核抗原(PCNA)、Akt、哺乳類ラパマイシン標的タンパク質(mTOR)、および、S6K、の少なくとも1つの発現阻害する、請求項1または2に記載の医薬組成物。

請求項6

前記PKDの予防または治療が、患者に対するNGALを管理することで、α−SMA、低酸素誘導因子1−α(HIF−1α)、Akt、哺乳類ラパマイシン標的タンパク質(mTOR)、S6K、プロカスパーゼ3、増殖細胞核抗原(PCNA)の抑制、および、NGAL、NGAL受容体(NGAL−R)、活性カスパーゼ3の発現の増加、という病態生理学的メカニズムを同時に改善する、請求項3に記載の医薬組成物。

請求項7

前記NGALが用量依存性である、請求項1乃至6の何れか一項に記載の医薬組成物。

請求項8

前記PKDの予防または治療が、有効量のNGALの注射投与によるものである、請求項1乃至7の何れか一項に記載の医薬組成物。

請求項9

前記PKDの予防または治療が、毎日の有効量である5μg/体重(g)またはそれ以上のNGALを、腹腔内または皮下投与によるものである、請求項1乃至8の何れか一項に記載の医薬組成物。

技術分野

0001

関連出願の相互参照。本出願は、2015年12月23日出願の台湾特許出願第104143323号、および、2016年7月27日出願の米国特許出願第15/220,687号の優先権を主張する。

0002

本発明は、好中球ゼラチナーゼ結合性リポカリン(NGAL)を含む多発性嚢胞腎PKD)の予防または治療用医薬組成物に関連するものである。

背景技術

0003

常染色体優性多発性嚢胞腎(ADPKD)は、最も一般的な遺伝子疾患で、その有症率は1:400から1:1000である。ADPKDの症例中、ほぼ85%が16番染色体のPKD1の突然変異を原因としている(TorresVE,et al.,Lancet,369:1287−1301,2007;Grantham JJ,et al.,Nat Rev Nephrol,7:556−566,2011)。PKD1の遺伝子は、ポリシスチン1(PC1)をコードし、実験マウスでにおいて、PC1のダウンレギュレーションは、胎生期15.5日(E15.5)の初期嚢胞形成や、重症度に関連する。(Piontek K,et al.,Nat Med,13:1490−1495,2007;Hopp K,et al.,J Clin Invest,122:4257−4273,2012;FedelesSV,et al.,TrendsMol Med,20:251−260,2014;Lu W,et al.,Nat Genet,17:179−181,1997;MagenheimerBS,et al.,J Am Soc Nephrol,17:3424−3437,2006).

0004

ADPKD患者は、大抵40になるころには症状が現れ始め、50歳になるころには腎不全へ進行し、生命を維持するためには、透析(例えば、血液透析腹膜透析)や、腎移植が必要となる。ADPKDは家族の常染色体優性形質として遺伝する。「常染色体優性」という言葉は、一方の親が罹患している場合、その子供に同じ病気が出る可能性が50%あるということを意味している。ADPKDは慢性腎不全の第4番目の主因であるが、世界中で約1200万人、アメリカ合衆国内では、60万人(約500人に1人のアメリカ人)が罹患している。ADPKD患者の約50%が、50歳になるころには腎不全となっている。

0005

トルバプタン(Tolvaptan)は、大塚製薬によって、日本で発見・開発されたが、うっ血性心不全による低ナトリウム血症低レベルの血液ナトリウム)を治療するために使われる、パソプレシンV2受容体拮抗薬であった。その薬は、また、ラットおよびマウスを使った動物モデル成功により、ADPKDの治療に効果があると期待されていた。ADPKDの成人患者1445人の臨床試験国際的に行われ、ADPKDの治療法として支持されている。トルバプタンは、PKD患者の腎臓総体積の増加や腎機能の低下を実際に遅らせることが証明されている。しかしながら、ADPKD患者の臨床試験のデータから、回復不能な、さらには致命的な肝障害リスクが導き出された。そのため、米国食品医薬品局心血管肝臓諮問委員会は、常染色体優性多発性嚢胞腎(ADPKD)に対する大塚製薬のトルバプタン使用の承認控えている。

0006

好中球ゼラチナーゼ結合性リポカリン(NGAL)は、22kDの分泌リポカリンタンパク質ファミリーであり、腎臓のネフロン発現する。NGALは、肝臓発生(Yang J,et al.,Mol Cell,10:1045−1056,2002)や、バクテリアによる感染に対する自然免疫反応(Flo TH,et al.,Nature,432:917−921,2004;Berger T,et al.,Proc Natl Acad Sci,103:1834−1839,2006)に関与している。NGALレベルの増加は、急性腎虚血(AKI)(Mishra J,et al.,J Am Soc Nephrol,14:2534−2543,2003;Mishra J,et al.,Lancet,365:1231−1238,2005;Urbschat A,et al.,Eur J Clin Invest,44:652−659,2014;Di Grande A,et al.,Eur Rev Med Pharmacol Sci,13:197−200,2009;Devarajan P,Biomark Med,8:217−219,2014)や、慢性腎臓病進行度CKD)(NickolasTL,et al.,Kidney Int,82:718−722,2012;Shen SJ,et al.,Nephrology (Carlton),19:129−135,2014)や、PKDの重症度(Parikh CR,et al.,Kidney Int,81:784−790,2012;Meijer E,et al.,Am J Kidney Dis,56:883−895,2010)に対して、クレアチン血液尿素窒素(BUN)と比較して、より早く、より敏感なバイオメーカーとみなされている。

0007

NGAL受容体(NGAL−R,Slc22a17)は、遠位尿細管集合(尿細)管の頂端膜で発現し、細胞内の鉄供給に関係している(Langelueddecke C,et al.,J Biol Chem,287:159−169,2012)。NGALとNGAL−Rの結合は、細胞内の鉄の枯渇アポトーシス刺激分裂の減少の原因となる(Devireddy LR,et al.,Cell,123:1293−1305,2005;Schmidt−Ott KM,et al.,J Am Soc Nephrol,18:407−413,2007;Devarajan P.,Cancer Ther,5:463−470,2007)。

0008

米国特許出願公開第2014/0079769号明細書には、Ngal遺伝子の発現レベルを測定することによって、慢性腎臓病(CKD)の進行を予測することや、Ngal遺伝子の発現を抑制することによって、CKDを予防したり治療できることが開示されている。加えて、米国特許出願公開第2009/0170143号明細書では、被験者体液サンプル中のNGALの濃度を測定することで、腎障害の可能性をモニターしたり、特定する方法を開示している。さらには、高分子量画分中のNGALの量を測定することで、CKDと急性腎障害急性腎不全(AKIやAKD)とを区別するための方法が、米国特許出願公開第2011/0091912号明細書には開示されている。

0009

米国特許第8247376号明細書では、虚血虚血再灌流障害、又は、毒素による障害で苦しんでいる患者に対するNGALの静脈、皮下、腹腔内投与が開示されている。この、特許では、NGALが、近位尿細管細胞を直接的にターゲットにし、腎臓の再上皮化尿細管細胞増殖を高めること、そして、細管細胞のアポトーシスを減らし、虚血再灌流障害後の高レベル血清又は血漿クレアチンを減少させること、が記載されている。

0010

治療薬としてのNGALの使用は、虚血、虚血再灌流障害、又は、毒素誘発性障害で苦しんでいる患者への治療法として開示されているにも関わらず、PKDへの副作用のない治療薬や治療法にはなっていない。

発明が解決しようとする課題

0011

肝臓に副作用がなく、有効な抗PKD薬が不足している観点から、本発明の発明者らは、肝毒性のない抗PKD薬の開発に専念してきた結果、本発明を完成した。本発明では、PKDマウスモデル(Pkd1L3/L3)及びNGALマウスモデル(腎臓特異的NGALが過剰発現しているNgalTg/Tg)を確立させ、異種配合することで、PKDを有し、且つ、胚腎臓の尿細管及び成獣の腎臓でNGALが過剰発現するPkd1L3/L3;NgalTg/Tgマウスを作り出した。これらのマウスモデルは、PKDの進行上、外因性腎臓特異的NGALの過剰発現の効果を研究することにも用いられている。PKDの予防または治療に対する過剰発現した外因性腎臓特異的NGALの治療結果に基づいて、PKDの治療のためのタンパク質医薬品を首尾よく開発することができる。

0012

本発明は、好中球ゼラチナーゼ結合性リポカリン(NGAL)を含む多発性嚢胞腎(PKD)の予防または治療用の医薬組成物に関するものである。

0013

本発明は、PKDの遺伝子突然変異を有する被検者に有効量の好中球ゼラチナーゼ結合性リポカリン(NGAL)を投与する工程を含む、PKDの治療または予防方法に関する。さらに、本発明は、外因性NGALタンパク質の過剰発現のための外来遺伝子が、PKD遺伝子変異を有する被検者に遺伝子形質転換によって導入される、PKDを遺伝的に治療または予防する方法に関する。PKD遺伝子突然変異を有する被験者とは、まだ病気ではないがPKDを発症する可能性、または、PKDを発症するリスクのある潜在的な患者を含めPKDを発症する可能性を有する対象、及び、PKDと診断された患者を意味する。ここで、被験者は、人間でも動物でもよい。

0014

加えて、本発明は、低レベルの完全長PC1を発現し、外因性NGALを過剰発現するC57BL/6J遺伝的背景を有するPkd1L3/L3;NgalTg/Tgマウスモデルを確立する。ここで、外因性Ngal遺伝子は、腎臓管特異的カドヘリン16(Ksp−Cdh16)プロモーターの制御下で、NGALを発現することができる。Ngal遺伝子は、それが改変されているかどうかにかかわらず、完全に機能的なNGALを発現することができる既知生物の任意のNgal遺伝子であり得る。外因性NGALの過剰発現は、NGAL/β−アクチン比に基づく。例えば、Pkd1L3/L3;NgalTg/TgマウスのNGALの腎臓レベルは、Pkd1L3/L3とNgalTg/Tgマウスのものより、それぞれ1.8倍、3.7倍大きい。PC1の低レベルとは、野生型のPC1のレベルが20%以下、特に15%以下、より具体的には10%以下であることを意味する。動物モデルは、PKDに対する、NGALまたは他の酵素、受容体、因子または薬物の効果を調べるために使用することができる。

0015

さらに、Pkd1L3/L3;NgalTg/Tgマウスの寿命は、Pkd1L3/L3マウスと比較して、1.6−6倍長く、より詳細には2−5倍長い。また、Pkd1L3/L3;NgalTg/Tgマウスの体重に対する腎臓の重量比は、10−17%、より詳細には12.2%−15.5%になり得る。

0016

NGALは、動物の形質転換により、ミルクニワトリまたはアヒルにおいて過剰発現され得る。又は、植物の形質転換により、葉、果実、種子、根またはのような植物の食用成分に過剰発現され得る。あるいは、NGAL薬剤の製造において、NGAL発現ベクター大腸菌または酵母に形質転換するか、または、CHO細胞または他の生物を含む哺乳動物細胞トランスフェクトして大量にNGALを産生し、その後タンパク質精製することができる。

0017

NGALは、その投与様式において汎用性があり、例えば、経口投与静脈内注射腹腔内注射または皮下注射によって輸送することができる。静脈内注射により、NGALまたはそれに由来するタンパク質薬剤は、血液循環系に輸送され腎臓に吸収されることで、酵素分解または肝初回通過効果を減少させ、有効性を維持する。さらに、本発明によるNGALまたはそれから誘導されるタンパク質薬剤は、その高い特異性、副作用および毒性の低減、および高い生体適合性のために、トルバプタンなどの従来の小分子薬物よりも有利である。

0018

前記PKDには、常染色体優性多発嚢胞腎(ADPKD)および常染色体劣性多発性嚢胞腎(ARPKD)が含まれる。本発明の実施形態では、PKDはADPKDである。

0019

PKDの予防または治療は、疾患を予防、抑制、緩和、治療または改善することを意味する。本発明の実施形態によれば、嚢胞成長遅延間質線維症の減少、嚢胞性上皮細胞のアポトーシスの増加、および腎臓における嚢胞性上皮細胞の増殖の減少によって疾患を治療することで、患者の寿命を延ばすことができる。また、PKD遺伝子突然変異を有する被験者については、被験者がまだ病気でない場合、または内因性NGALの発現前の胚期にある場合に、PKDを発症する可能性のある被験者に外因性NGALを投与することによって、疾患を予防することができる。

0020

PKD患者への外因性NGALのデリバリーは、NGAL過剰発現のための遺伝子形質転換によって、または、NGALを含む医薬品を患者に直接投与することによって実現され得る。NGALは、PKDの予防または治療に有効であるが、その理由は、Akt−mTOR−S6Kシグナル伝達(すなわち、増殖細胞核抗原(PCNA)、Akt、ラパマイシン哺乳動物標的(mTOR)およびS6K)のダウンレギュレーションと同様に、活性カスパーゼ−3の増加、α−SMAの減少、および、低酸素誘導性因子1−α(HIF−1α)を誘導するためである。

0021

本発明の実施形態に基づいて、NGALは用量依存的に治療効果を示すことが認識され得る。換言すれば、PKDの予防または治療のためには、全NGALのレベルは、内因性NGALのレベルよりも高いことが好ましい。

図面の簡単な説明

0022

図1A−1Dは、Ngalノックアウト(KO)およびCdh16−mNgalトランスジェニック(Tg)マウスの作製を示す:<図1A相同組換えによるNgal遺伝子座の標的;<図1B>マウスCdh16腎臓特異的プロモーターによって過剰発現が制御されるNgal導入遺伝子概略地図;<図1Cおよび1D>Ngal-/-およびNgalTg/Tgの、PCRベース遺伝子型決定
図2A−2Dは、ウエスタンブロット解析によって同定されたPkd1L3/L3および野生型マウスの腎臓におけるNGALの一時的発現を示す:<図2A>Pkd1L3/L3マウスおよび野生型マウスの、腎臓、尿、血清におけるNGAL発現のウエスタンブロットの結果;<図2B、2C、および2D>ローディングコントロールとしてβ-アクチンを用いたウエスタンブロットの定量、データは、平均±SEM;n=6;*p<0.05;**p<0.01;***p<0.001)。
図3は、免疫組織化学分析によって同定されたPkd1L3/L3マウスおよび野生型マウスの腎臓におけるNGALの一時的発現を示しており、野生型およびホモ接合型の異なる年齢のマウスの腎臓切片NGAL抗体で染色した:(A−C)1日目(1D)の腎臓切片では、NGALの褐色染色が髄質では見られたが、野生型(WT)マウス(A)の糸球体および皮質細管、Pkd1L3/L3マウスの腎皮質(B)および髄質(C)では見られなかった;(D−F)14日目の腎臓切片では、NGALの発現量は、野生型マウス(D)では1日目より減少したが、Pkd1L3/L3マウスの腎皮質(E)および髄質(F)では1日目より上昇した;(G−I)28日目の腎臓切片では、Pkd1L3/L3マウスにおいて嚢胞肥大が14日目(E、F)よりも大きかった。なお、(i)嚢胞肥大間で扁平パターンに変換された立方上皮、および、NGALの発現も見られた(E,F,H,I)、(ii)全ての画像は、2つの独立した実験において遺伝子型当たり少なくとも3匹のマウスを代表するものであり、(iii)図(A−I)のバーは200μmであり、差し込み図(B、C、E、F、H、I)のバーは50μmである。
図4は、ADPKDおよびARPKD患者の腎組織におけるNGAL発現を示す:(A、B)は正常、(C、D)はADPKD、(E、F)はARPKDのヒト腎組織におけるNGAL発現を示す。なお、(i)ADPKDおよびARPKD切片の両方において、▲はNGALの暗褐色染色を示し、(ii)矢印は、ADPKD切片の間質領域における単核細胞中の内因性NGAL発現の染色を示し、(iii)バーの長さは、(A)は200μm、(B)は50μm、(C,E)は500μm、(D,F)は100μmである。
図5A−5Cは、Ngalの腎臓レベルが、Pkd1L3/L3およびNgalTg/Tgマウスより、Pkd1L3/L3;NgalTg/Tgの方が、大きいことを示す:<図5A生後21日(21D)の異なる遺伝子型のマウスにおける、NGAL、NGAL−R、およびβ−アクチン(コントロール)の代表的なウエスタンブロッティング;。<図5B及び5C>NGALおよびNGAL−Rのウエスタンブロッティング結果の定量化を示し、バーは、3つの個々のマウスの平均±標準誤差(SEM)を示す;***p<0.001。
図6A−6Fは、NgalTg/0マウスの腎臓、尿、及び血清におけるNGALの発現、異なるマウスの主要臓器におけるNGALの発現、野生型マウスと比較したNgalTg/TgおよびNgal-/-マウスの腎臓切片での糸球体の数を示す:<図6A>NgalTg/0マウスの、腎臓、尿、血清におけるNGAL発現のウエスタンブロッティングの結果を示す;<図6B,6C,6D,及び6E>野生型、Ngal-/-、NgalTg/Tg、及びPkd1L3/L3;NgalTg/Tgマウスの、主要臓器におけるNGAL発現のウエスタンブロッティングの結果を示している。ここで、嚢胞液は陽性ローディリングコントロール(+)である;<図6F>Kruskal−Wallis検定による、野生型(黒丸)、NgalTg/Tg(黒四角)、Ngal-/-(黒三角)マウスにおける21日齢および同性別の腎糸球体の数を示す。ここで、すべての結果は四分位範囲(25%−75%)の中央値を表す。
図7A−7Bは、外因性腎臓特異的NGALの過剰発現が、Pkd1L3/L3マウスの生存延長することを示している:<図7A>Pkd1L3/L3(白三角),Pkd1L3/L3;NgalTg/Tg(黒丸),及びPkd1L3/L3;Ngal-/-(白四角)マウスにおける、生存のカプラマイヤー分析を示す。ここで、ログランク検定は、Pkd1L3/L3;NgalTg/TgマウスとPkd1L3/L3マウスの間で、そして、Pkd1L3/L3;NgalTg/TgマウスとPkd1L3/L3;Ngal-/-マウスとの間で、顕著な違いを示した(両者とも、p<0.001);<図7B生存期間中央値は、Pkd1L3/L3(n=31,中央値=25日)、Pkd1L3/L3;NgalTg/Tg(n=45,46日)、Pkd1L3/L3;Ngal-/-(n=32,26日)であった。ここで、全ての結果は、四分位範囲(25%−75%)の中央値を表す;***p<0.001。
図8A−8Dは、外因性腎臓特異的NGALの過剰発現が、Pkd1L3/L3マウスの腎嚢胞を減少させることを示している:<図8A各遺伝子型の腎臓の代表的な画像を示す;<図8B>Dunnの複数比較検定による、21日のPkd1L3/L3マウス(n=10,中央値=23.1%),Pkd1L3/L3;NgalTg/Tgマウス(n=9,14.1%),及びPkd1L3/L3;Ngal-/-マウス(n=9,24.4%)における、体重に対する腎臓重量の中央値の百分率;<図8C>各マウスの腎嚢胞の大きさを示す。Pkd1L3/L3(430.1μm2),Pkd1L3/L3;NgalTg/Tg(124.0μm2),及びPkd1L3/L3;Ngal-/-(339.8μm2);<図8D>腎嚢胞の数を示す。ここで、全ての結果は、四分位範囲(25%−75%)の中央値を表す;***p<0.001。
図9A−9Eは、外因性腎臓特異的NGALの過剰発現が、Pkd1L3/L3マウスの間質性線維症を減少させることを示している:<図9Aヘマトキシリンおよびエオシン染色(上)、並びに、マッソントリクローム染色(下、スケールバーは200μm);<図9B>マッソントリクローム染色した腎臓から判定され、実施形態に記述されている通りに計算された腎線維症スコア。ここで、全ての結果は、四分位範囲(25%−75%)の中央値を表す;<図9C−9E>代表的なウエスタンブロッティング、および、α−SMAおよびHIF−1αについての結果の定量化。ここで、棒グラフは、3つの試料の平均±SEMを示す;*p<0.05;**p<0.01;***p<0.001。
図10A−10Cは、外因性腎臓特異的NGALの過剰発現が、Pkd1L3/L3マウスのPCNAおよびプロカスパーゼ3の腎臓レベルを低下させることを示す:<図10A>異なる遺伝子型の21日における、PCNA、カスパーゼ−3、および、グリセルアルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH、ローディングコントロール)の代表的なウエスタンブロッティングの結果;<図10B>ウエスタンブロッティングの結果の定量化(PCNA/GAPDH);<図10C>ウエスタンブロッティングの結果の定量化(プロカスパーゼ−3/GAPDH)、ここで、棒グラフは、3つの試料の平均±SEMを示す;**p<0.01;***p<0.001。
図11A−11Cは、外因性腎臓特異的NGALの過剰発現が、Pkd1L3/L3マウスのリン酸化−mTOR(p−mTOR)およびmTORのレベルを低下させることを示す:<図11A>異なる遺伝子型の21日における、リン酸化−mTOR(Ser2448)、mTOR、βアクチン(ローディングコントロール)の代表的なウエスタンブロッティングの結果;<図11Bおよび11C>ウエスタンブロッティングの結果の定量化(リン酸化−mTOR/βアクチン、および、mTOR/βアクチン)、ここで、棒グラフは、3つの試料の平均±SEMを示す;*p<0.05;**p<0.01;***p<0.001。
図12A−12Cは、外因性腎臓特異的NGALの過剰発現が、Pkd1L3/L3マウスのリン酸化−Akt、Akt、リン酸化−S6K、および、S6Kの腎臓レベルを低下させることを示す:<図12A>異なる遺伝子型の21日における、リン酸化−Akt(Ser473)、Akt、リン酸化−S6K(Thr389)、S6K、および、βアクチン(ローディングコントロール)の代表的なウエスタンブロッティングの結果;<図12Bおよび12C>ウエスタンブロッティング結果の定量化(リン酸化−Akt/βアクチン、および、リン酸化−S6K/βアクチン)、ここで、棒グラフは、3つの試料の平均±SEMを示す;*p<0.05;**p<0.01;***p<0.001。
図13A−13Cは、リン酸化−EGFRおよびEGFRの腎臓レベルが、Pkd1L3/L3;NgalTg/Tg、Pkd1L3/L3、および、Pkd1L3/L3;Ngal-/-マウスにおいて、より大きいことを示す:<図13A>異なる遺伝子型の21日における、リン酸化−EGFR(Tyr1068)、EGFR、GAPDH(ローディングコントロール)の代表的なウエスタンブロッティングの結果;<図13Bおよび13C>ウエスタンブロッティングの結果の定量化(リン酸化−EGFR/GAPDH、および、EGFR/GAPDH)、ここで、棒グラフは、3つの試料の平均±SEMを示す;**p<0.01;***p<0.001。
図14A−14Dは、精製された組換えmNGAL1ΔN(マウスN末端短縮型NGALAタンパク質)のSDS−PAGE、および、mNGAL注射の治療効果を示す:<図14A>Ni2+−NTクロマトグラフィーによる、組換えmNGALΔNの最初の精製;レーンM、タンパク質マーカー;レーンT、全細胞溶解物;レーンP、不溶性ペレット;レーンS、可溶画分;レーンFT、フロースルー;レーン3−39、溶出画分;<図14B>Qアニオン交換クロマトグラフィーによる、組換えmNGALΔNのさらなる精製;<図14C>Pkd1L3/L3(白三角),Pkd1L3/L3;NgalTg/Tg(黒丸)、Pkd1L3/L3;Ngal-/-(白四角)、mNGALを注射したPkd1L3/L3(黒三角)、および、mNGALを注射したPkd1L3/L3;Ngal-/-(黒四角)の各マウスにおける、生存のカプランマイヤー分析を示す;<図14D>(a)未処理のPkd1L3/L3マウス、(b−c)mNGAL−処理したPkd1L3/L3マウス、(d)未処理のPkd1L3/L3;Ngal-/-マウス、(e)mNGAL処理したPkd1L3/L3;Ngal-/-マウス、の代表的な腎臓の画像を示す。

実施例

0023

<<実施形態>>
臨床的ヒト腎臓標本および患者
すべての腎臓組織は、國立成功(National Cheng Kung)病院のヒトバイオバンクから得た。この研究は國立成功大學(National Cheng Kung University)のメディカルセンター治験審査委員会によって承認された(A−ER−101−228)。NGALタンパク質レベルは、台湾國立成功大學病院の病理学部から得られた3つのヒト腎臓標本(2例のPKD症例、1例の正常腎臓)における免疫組織化学によって検査した。正常な組織は、非尿生殖器系の病気がないことを検死確認済み死亡患者から得た。症例1は、重度尿細管間質性腎炎による慢性腎不全のADPKDである。一方、症例2は、妊娠30週で、多発性嚢胞巨大腎がある初期のARPKDと診断され、妊娠は終了している。

0024

免疫組織化学
腎臓を取り出し、4℃の10%ホルマリン中で一晩固定し、次に脱水およびパラフィン包埋を行い、免疫染色のために4μmの切片を作製した。NGALを検出するために、腎臓切片は、脱パラフィンおよび再水和後アビジンビオチンブロッキングキット(Vector Laboratories, Burlingame,CA)でブロックし、ウサギ抗NGAL抗体、または、ヤギ抗ヒトNGAL抗体とともに、4℃で一晩インキュベートした。他の免疫染色のために、標準免疫ペルオキシダーゼプロトコル(Vectastain ABC kit;Vector Laboratories)を使用した。ヤギ血清でブロックした後、切片を一次抗体と共に室温で一時間インキュベートし、PBSリンスし、ビオチン化ヤギ抗ウサギ抗体と共にインキュベートし、リンスし、次いでストレプトアビジン結合ペルオキシダーゼと共にインキュベートし、リンスし、次いで色素原として3−アミノ9−エチルカルバゾールと共にインキュベートし、ヘマトキシリンで対比染色し、光学顕微鏡で検査した。

0025

動物実験
全てのマウスは、台湾台市にある國立実験動物センター(NLAC)において12時間の明暗周期下で飼育され、全ての実験はNLACの動物実験委員会か認可した実験計画書に基づいて行われた。この研究において、本発明者たちは、実験の遂行に先立って、雄マウス雌マウス有意差がないことを確認した。いくつかの文献においても、雄雌の両方の動物を使って実験が行われていた。これは、動物の性別がPKDの病理学的および分子的分析にほとんど影響を与えないことを示唆している。従って、マウスの雄雌の両方を使用した。

0026

PKDマウス
本発明者たちの以前の研究では、PKDのマウスモデルについて記載した。Pkd1L3/L3マウスは、全長PC1の生成レベルが低く、次第に多発性嚢胞腎を進行した。(Jiang ST,et al.,Am J Pathol,168:205−220,2006)。オリジナルのPkd1L3/+マウスは、混合C57BL6−129バックグランドを有し、均一な遺伝的背景を得るために10世代以上にわたってC57BL/6Jマウスと戻し交配された。安定したC57BL/6Jの遺伝的背景を有するPkd1L3/+マウスを、ホモ接合変異体Pkd1L3/L3を作製するために用いた。

0027

Ngalノックアウトマウス
Ngalの従来のノックアウトマウスは、VelociGeneバイオテクノロジーを使って作製されていた。マウスのNgal遺伝子はPGK/Neoカセットによって破壊され、lacZがレポーター遺伝子として使用された。Ngal-/-マウスは、元々、混合C57BL6−129バックグランドで繁殖され、Ngal-/-を作製するために、交雑する前に10世代以上にわたってC57BL/6Jマウスと戻し交配し、均一的な遺伝的背景を確保した。NGALの従来のノックアウトは、PKDのNGALタンパク質の腎機能を特徴づけるために、腎臓や他の組織からのNGALの生成を防ぐことができる。

0028

Cdh16−mNgalトランスジェニックマウス
Cdh16−mNgalトランスジェニックマウスは、マウスCdh16プロモーターの制御下で、マウスNGALを過剰発現する(Shao X,et al.,J Am Soc Nephrol,13:1824−1836,2002)。Ksp−Cdh16−mNgalは、内因性NGALの発現およびADPKDにおける嚢胞形成の前に、外因性NGALの早期発現を確実にした。Cdh16−mNgalトランスジェニックマウスは、C57BL/6J遺伝的背景を有する。DNA組換プロトコルは、NLACのバイオ安全委員会で承認された。ここで、Ngalは、NCBI遺伝子No.16819、または、EMBL−EBI No.ENSMUSG00000026822である。

0029

遺伝子型決定
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用い、尾部から抽出したゲノムDNAから全ての変異マウスの遺伝子型決定を行った。各試料は20μLのPCR反応合物を含み、βアクチンは内部コントロールとして使用された。プライマー配列は、
・マウスNgalフォワードプライマー、配列番号1(5’−ATGGCCCTGAGTGTCATGTGTC−3’)、
・マウスNgalリバースプライマー、配列番号2(5’−GCTCCAGATGCTCCTTGGTATG−3’);
・β−アクチンフォワードプライマー、配列番号3(5’−GGCATGTACCAACTGGGACG−3’)、
・β−アクチンリバースプライマー、配列番号4(5’−AGGAAGGCTGGAAAAGAGCC−3’)
である。
Ngalノックアウト突然変異体を、以下のプライマーを用いて分析した。
・マウスNgal 5’UTRフォワードプライマー、配列番号5(5’−TTCCTCCTCCAGCACACATCAGAC−3’)、
・lacZリバースプライマー、配列番号6(5’−GAGTAACAACCCGTCGGATTCTC−3’)、
・マウスNgalリバースプライマー、配列番号7(5’−AGGGGTTACTGTCAGAGTGGCTATC−3’)。

0030

ウエスタンブロット解析
マウスの腎臓から抽出した全タンパク質(50μg)は、ウエスタンブロット解析に供した。pQEタンパク質発現系(Qiagen)を用いて、マウス全長NGALおよび精製NGALタンパク質を6×Hisタグで発現させた。そして、精製NGALは、マウスの全長NGALタンパク質を用いてウサギを免疫化することによって、NGAL抗体を生成するために使用された。その他の抗体は、Slc22A17に対するウサギポリクローナル抗体(GTX85032;GeneTex)、GAPDHに対するウサギポリクローナル抗体(631401;BioLegend)、α−平滑筋アクチン(α−SMA)に対するマウスモノクローナル抗体(A2547;Sigma−Aldrich)、低酸素誘導因子1−α(HIF−1α)に対するウサギポリクローナル抗体(GTX 127309;GeneTex)、mTOR(リン酸化Ser2448)に対するウサギモノクローナル抗体(5536;Cell Signaling Technology)、mTORに対するウサギモノクローナル抗体(2983;Cell Signaling Technology)、β−アクチン(8H10D10)に対するマウスモノクローナル抗体(12262;Cell Signaling Technology)、S6K1(リン酸化Thr389)に対するウサギポリクローナル抗体(ab2571;Abcam)、p70 S6キナーゼに対するウサギモノクローナル抗体(2708;Cell Signaling Technology)、Akt(リン酸化Ser473)に対するウサギポリクローナル抗体(9271;Cell Signaling Technology)、Aktに対するウサギポリクローナル抗体(9272;Cell Signaling Technology)、カスパーゼ−3に対するウサギポリクローナル抗体(9662;Cell Signaling Technology)、増殖細胞核抗原(PCNA)に対するマウスモノクローナル抗体(307902;Biolegend)、表皮成長因子受容体(EGFR)(リン酸化Tyr1068)に対するウサギポリクローナル抗体(2234;Cell Signaling Technology)、および、EGFRに対するウサギモノクローナル抗体(GTX61503;GeneTex)を用いた。

0031

組織学および組織形態分析
上記のとおり(Wang,E.et al.,J Pathol、222:238−248、2010)、標本をホルマリン中に固定し、パラフィン包埋し、4μm切片に切断し、光学顕微鏡(Eclipse E600ニコン、日本)で検査するため、ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)またはマッソントリクローム染色した。マウス遺伝子型を盲検化し、嚢胞数およびサイズ(H&E染色)およびコラーゲン線維(Masson’s trichrome)の染色を定量化した。平均クイックスコア(QSs)の計算には、Image−Pro Plus v.4.5.0.29ソフトウェア(Media Cybernetics,Rockville、MD、20850 USA)を使用した。各スライドについて、ソフトウェアは分析のために5つのフィールド(200×)をランダムに選択した。適切なホワイトバランスの後で、ソフトウェアは、オペレータデジタル画像つかむことによって特別な関心領域をゲートし、それらを別々に検査することを可能にする。各スライドを解析して、標識指数(LI;全領域に対する陽性染色された領域の比)、および、平均光学密度(MOD;陽性ピクセルカウントに基づく染色濃度)を決定した。QSは、LIとMODの数学的積として計算された。嚢胞の計数には、皮質、髄質および乳頭を含む、H&E染色された横断腎臓切片の代表的な画像を使用した。画像上にグリッドを配置し、嚢胞性および非嚢胞性領域を二分したグリッド交点の割合を計算した。

0032

統計分析
比較は3つの群:Pkd1L3/L3、Pkd1L3/L3;NgalTg/Tg、および、Pkd1L3/L3;Ngal-/-で行われた。パラメトリックデータは、すべての群でone−wayANOVA一元配置分散分析)を用いて行われ、続いて各ペアのターキー多重比較テストが行われた。生存時間は中央値および四分位範囲(25%〜75%)として示され、群は非パラメトリックKruskal−Wallis検定とDunnの複数比較検定によって比較された。生存曲線構築し、Kaplan−Meier推定値を用いて、対数ランク検定を用いて異なる群の生存率を比較した。0.05未満のp−値は統計学的に有意であると考えられる。

0033

<結果>
Ngal従来型ノックアウトおよびCdh16−mNgalトランスジェニックマウスの作製
マウスNgal標的化ストラテジー、および、Cdh16−mNgalトランスジーンは、それぞれ、図1Aおよび図1Bに示される。PCR分析により、これらのマウスの遺伝子型判定が確認された(図1C)。ヘテロ接合型NgalTg/oマウスの割合は、野生型C57BL/6Jマウスと戻し交配されたNgalTg/Tgマウスのホモ接合性も確認した。Ngalの発現レベルは、NgalTg/oとNgalTg/TgマウスのNgalのコピー数と正の相関があった(図1D)。

0034

NGALのレベルは、Pkd1L3/L3;NgalTg/Tgマウスの腎臓で増加する
Pkd1L3/L3;NgalTg/Tgマウスは、Pkd1L3/+;NgalTg/TgマウスとPkd1L3/+;NgalTg/Tgマウスを交雑することで作製した。ウエスタンブロット解析により、Pkd1L3/L3マウスおよび野生型マウスの、尿、血清、腎臓における内因性NGALの発現の差異を検出した(図2A−2D)。Pkd1L3/L3マウスでは、嚢胞拡大過程に沿って徐々にレベルが上昇したのに対し、野生型マウスでは年齢とともにそのレベルが低下した。免疫組織化学的分析により、野生型マウスおよびPkd1L3/L3マウスの両方において、1日目、14日目および28日目の腎臓NGALの一時的発現パターンが明らかになった(図3)。14日目と28日目のPkd1L3/L3マウスにおいて、内因性NGALは、主に嚢胞上皮の頂端膜側に局在し、Pkd1L3/L3マウスでは、年齢とともに腎臓髄質の嚢胞は大きくなった。ADPKDまたは常染色体劣性多発性嚢胞腎(ARPKD)患者の腎臓においても、同様のパターンが観察された(図4)。結果は、嚢胞性上皮における内因性NGALのアップレギュレーションは、異常な腎発達を引き起こす可能性があることを示し、この議論はPKDの重症度におけるNGALの役割によって支持される。次に、これら3つのPKDマウス(すなわち、Pkd1L3/L3マウス、Pkd1L3/L3;NgalTg/Tgマウス、Pkd1L3/L3;Ngal-/-マウス)の21日目おける、NGALおよびNGAL−Rの腎臓発現を、ウエスタンブロット解析した(図5A)。Pkd1L3/L3;NgalTg/TgマウスにおけるNGALの腎臓レベルは、Pkd1L3/L3およびNgalTg/Tgマウスより、それぞれ、1.8倍および3.7倍高かった(図5B)。さらに、これら3つのPKDマウスにおけるNGAL−Rの腎臓発現は、PKDなしのコントロール同腹子におけるものと比較して、有意に上方制御された(p<0.001)(図5Aおよび5C)。結果は、外因性NGALは、内因性NGALの発現前にKsp−Cdh16プロモーターの制御下で胚腎臓において連続的に過剰発現されることを示し、このことは、外因性NGALが胚期のPkd1L3/L3マウスにおけるPKDの進行を妨げることを示唆している。

0035

NgalTg/TgマウスおよびPkd1L3/L3;NgalTg/Tgマウスにおける、外因性NGALの腎臓特異的過剰発現
ウエスタンブロット解析で、NgalTg/0マウスの、尿、血清、腎臓における外因性NGALの発現を検出した(図6A)。野生型マウスとNgal-/-マウスを比べると、野生型(WT)マウスではおよび脾臓の組織でNGALが発現したが(図6B)、Ngal-/-マウスでは見られなかった(図6C)。加えて、外因性NGALの腎臓特異的過剰発現が、NgalTg/Tgマウス(図6D)、および、Pkd1L3/L3;NgalTg/Tgマウス(図6E)で検出された。さらに、野生型のマウスと比較して、NgalTg/TgマウスおよびNgal-/-マウスの腎臓切片における糸球体を計数することによって、NGALの腎臓発達に対する効果を調べた(図6F)。これらの結果は、腎糸球体の数は、年齢や性別が一致したマウスの間で、有意差がなかったことを示した(p=0.294)。

0036

Cdh16−mNgalの過剰発現は、Pkd1L3/L3;NgalTg/Tgマウスの生存および寿命を延長する
NGALの差次的発現によって、Pkd1L3/L3、Pkd1L3/L3;NgalTg/Tg、および、Pkd1L3/L3;Ngal-/-マウスの生存上のNGALの効果が観察された(図7A)。ログランクテストでは、Pkd1L3/L3マウス(中央値=25日、四分位範囲[IQR]23−26日)およびPkd1L3/L3;Ngal-/-マウス(中央値=26日,IQR24−31日)と比較して、Pkd1L3/L3;NgalTg/Tgマウスの寿命が著しく伸びた(中央値=46日、IQR37−60日)(Pkd1L3/L3;NgalTg/Tgに対して、両方ともp<0.001)(図7B)。さらに、Pkd1L3/L3およびPkd1L3/L3;Ngal-/-マウスの間で、寿命に有意差はなかった(p=0.2988)。

0037

Cdh16−mNgalの過剰発現は、Pkd1L3/L3;NgalTg/Tgマウスの嚢胞肥大を遅らせる
総腎臓体積(TKV)は、BUNの増加およびPKDの疾患進行と正の相関があることが知られていた。多発性嚢胞腎は、Pkd1L3/L3およびPkd1L3/L3;Ngal-/-マウスにおいて、21日で終末段階に進行した。Pkd1L3/L3;NgalTg/Tgマウスの腎臓は、Pkd1L3/L3およびPkd1L3/L3;Ngal-/-マウスの腎臓よりも小さい(図8A)。加えて、21日目の体重に対する腎臓重量の中央値は、Pkd1L3/L3マウス(中央値=23.1%、IQR20.9−27.6%)およびPkd1L3/L3;Ngal-/-マウス(中央値=24.4%、IQR22.7−27.7%)と比較して、Pkd1L3/L3;NgalTg/Tgマウス(中央値=14.1%、IQR12.2−15.5%)は明らか低かった(Pkd1L3/L3;NgalTg/Tgに対して、両方ともp<0.001)(図8B)。腎嚢胞サイズも、他の2種類のPKDマウスと比較して、Pkd1L3/L3;NgalTg/Tgマウスは有意に小さかった(Pkd1L3/L3;NgalTg/Tgに対して、両方ともp<0.001)(図8C)、一方、嚢胞数には有意な差はなかった(図8D)。これらの結果は、外因性腎臓特異的NGALの過剰発現が、嚢胞サイズを減少させることによってPKDの急速な進行を防止するが、Pkd1L3/L3;NgalTg/Tgマウスの嚢胞数を減少しないこと実証した。この結果に基づき、Ngalの欠失はPKDに影響を与えないことが認められ、このことから、NGALではなくPC1の減少がPKDの進行を決定することが示唆される。さらに、Pkd1L3/L3マウスの内因性NGALのアップレギュレーションは、マウスを早期死から保護することができない。

0038

Cdh16−mNgalの過剰発現は、Pkd1L3/L3;NgalTg/Tgマウスの間質性線維症を減らす
21日目の、ヘマトキシリンおよびエオシン染色(H&E、図9A、上部パネル)した腎臓切片、および、マッソントリクローム染色(図9A、下部パネル)した腎臓切片を検査した。次に、腎線維症およびNGAL投与の有効性を調べた。具体的には、糸球体線維症の評価のため、マッソントリクローム染色を用いてコラーゲンを染色し、糸球体線維症スコアを統計解析ソフトウェアによりさらに計算した。結果は、野生型マウスは、Pkd1L3/L3マウス(p=0.002)およびPkd1L3/L3;Ngal-/-マウス(p=0.015)マウスと比較して、有意に低い腎臓線維症のスコアを示したが、Pkd1L3/L3;NgalTg/Tgマウス(p=0.417)では有意差はなかった(図9B)。PKDの進行性線維症に関連するα−SMAの腎臓レベル、および、腎臓の尿細管間質区画における低酸素症に関連するHIF−1αの腎臓レベルをさらに調べた。ウエスタンブロット解析は、Pkd1L3/L3;NgalTg/Tgマウスにおけるα−SMAレベルは、野生型マウスのレベルに匹敵することを示した(図9C)。しかしながら、α−SMA、および、HIF−1αの発現は、他の2種類のPKDマウスより有意に低かった(Pkd1L3/L3;NgalTg/Tgに対して、両方ともp<0.001)(図9Dおよび9E)。上記の評価によれば、Pkd1L3/L3;NgalTg/Tgマウスの外因性NGALのレベルの増加は、腎臓線維症スコア、および、α−SMAとHIF−1αの発現を減らすことが証明された。したがって、これらの結果は、NGALが腎糸球体線維症、腎間質性線維症および腎臓の尿細管間質区画における低酸素症を改善することを示唆している。

0039

Pkd1L3/L3;NgalTg/Tgマウスにおける、増殖細胞核抗原(PCNA)およびカスパーゼ3の変化
増殖およびアポトーシスの両方が、多発性嚢胞の早期嚢胞形成において増加した。ウエスタンブロット解析(図10A)では、他の2種類のPKDマウスと比較して、プロカスパーゼ3およびPCNAの発現の両方が減少し、活性カスパーゼ3はPkd1L3/L3;NgalTg/Tgマウスにおいて増加していることが明らかとなった(Pkd1L3/L3;NgalTg/Tgに対して、両方ともp<0.001)(図10Bおよび10C)。

0040

哺乳類のラパマイシン標的(mTOR)の腎臓レベルは、Pkd1L3/L3;NgalTg/Tgマウスにおいて、AktおよびS6キナーゼシグナル伝達のダウンレギュレーションを伴い減少した
PKDを有しないそれぞれのコントロール同腹子と比較して、3つのPKDマウスの全てがmTORおよびp−mTORの発現を示した(図11A)。さらに、Pkd1L3/L3;NgalTg/Tgマウスは、Pkd1L3/L3マウスおよびPkd1L3/L3;Ngal-/-マウスと比較して、最も低いmTORおよびp−mTORレベルであった(Pkd1L3/L3;NgalTg/Tgに対して、両方ともp<0.001)(図11B−11C)。mTORの主要上流調節因子(Akt)および下流標的[リボソームタンパク質S6キナーゼ(S6K)]は、細胞増殖に関与する。その後のウエスタンブロット解析(図12A)により、他の2種類のPKDマウスと比較して、Pkd1L3/L3;NgalTg/Tgマウスは、リン酸化Akt(p−Akt)およびリン酸化S6K(p−S6K)の発現が有意に減少したことを確認した(Pkd1L3/L3;NgalTg/Tgに対して、両方ともp<0.001)(図12Bおよび12C)。

0041

Pkd1L3/L3;NgalTg/Tgマウスにおける、上皮増殖因子受容体(EGFR)およびリン酸化EGFR(p−EGFR)の腎臓レベル
EGFRおよびp−EGFRの過剰発現および頂端ミスロケーションは、嚢胞成長を促進すること、および、EGFRチロシンキナーゼ活性阻害はPKDの発達を減弱させうること、が知られている(Orellana SA,et al.,Kidney Int,47:490−499,1995;Du J,et al.,Am J Physiol,269:C487−495,1995;Sweeney WE,et al.,Kidney Int,57:33−40,2000;TorresVE,et al.,Kidney Int,64:1573−1579,2003)。ウエスタンブロット解析(図13A)は、PKDを有しないコントロールの同腹子と比較して、3種類のPKDマウスの何れもが、EGFRおよびp−EGFR(Tyr1068)の両方の発現が有意に増加したことを示した(コントロールに対して、p<0.001)(図13Bおよび13C)。しかし、p−EGFR/EGFRの比は、3つのPKDマウス間で差異を示さなかった。

0042

組換えマウスNgalタンパク質(mNGAL)の準備、および治療PKDマウス
我々の研究において、私たちは、嚢胞の成長の減少における、分泌Ngalの治療効果を強く主張した。我々は、組換えマウスNgalタンパク質(mNGAL)をさらに調製し、低内毒素(100μg/day)と高純度(32mg/ml)を持つ機能性組み換えmNgalタンパク質を、PKDマウスの腹腔内に注射した。mNGAL(23〜200残基)のコード配列は、精製を容易にするためのN末端His6タグを有するpET21aベクターサブクローンされた。続いて、配列決定による正しい構築物を、タンパク質発現のために大腸菌BL21(DE3)に形質転換した。単一の形質転換体の60mlの一晩培養物を、100μg/mlのアンピシリンを含有する6リットル新鮮LB培地接種した。細胞をA600nm=0.6〜1.0に増殖させ、20℃で0.5mMイソプロピルβ−チオガラクトピラノシドIPTG)で誘導した。16時間後、細胞を7,000×gで15分間遠心分離して、細胞ペースト回収した。20mM Tris−HCl、400mM NaCl、10mMイミダゾールを含むpH8.0の溶解緩衝液中に、細胞ペレットを直ちに再懸濁させた。細胞懸濁液をConstant Cell Disruption System(CONSTANTSYSTEMLtd.、UK)により破壊し、17,000×gで遠心分離して細胞破片を除去した。無細胞抽出物を、予め溶解緩衝液で平衡化しておいたNi2+−NTAカラムに導入した。カラムを溶解緩衝液で洗浄し、続いてHis6タグ付きmNGALを10mMから500mMイミダゾールの直線勾配溶出させた(図14A)。精製His6タグ付きmNGALを4倍の20mM Tris、pH8.0緩衝液希釈し、続いて、予め20mM Tris、pH8.0緩衝液で平衡化したQアニオンイオン交換カラムに導入した。His6タグ付きmNGALを含有する低リポ多糖類LPS)を、Qアニオン交換カラムを通過したフローから回収した(図14B)。最後に、His6タグ付きmNGALを濃縮し、−80℃で保存するため、Vivaspin 20(Sartorius、Germany)の10kDaカットオフサイズ膜を有するPBS緩衝液で交換した。皮下(SC)または腹腔内注射(IP)により、生後7日目に、Pkd1L3/L3マウス(n=3)、Pkd1L3/L3;Ngal-/-マウス(n=6)に、mNGAL(100μl/日)を注射した。我々のデータは、未処置群と比較して、mNGALを注入したPkd1L3/L3マウス(n=3、雄1匹、雌2匹)およびPkd1L3/L3;Ngal-/-マウス(n=6、雄3匹、雌3匹)において、生存率および日数が著しく増加したことを示した(図14C)。Pkd1L3/L3マウスの嚢胞腎も、未処置群と比較して、mNGAL処理Pkd1L3/L3マウスにおいて有意に遅延した(図14Dおよび表1)

0043

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