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技術 クロストリジウム・ディフィシレの主要な外毒素TcdA及びTcdBに対する中和抗体

出願人 ユセベファルマソシエテアノニム
発明者 ハンフリーズ、デイヴィッドポールライトウッド、ダニエルジョンタイソン、ケリールイーズナイト、デイヴィッドエドワードオーモンドエルヴェ、カリーヌジャンニーヌマデレーヌコンプソン、ジョアンエリザベスペイジ、マシュージョンティモシーペイン、アンドリューチャールズフィッシャー、ニコラルイーズマッケンジー、ブレンドンコックス、マシュー
出願日 2017年5月26日 (3年5ヶ月経過) 出願番号 2017-104698
公開日 2017年8月31日 (3年2ヶ月経過) 公開番号 2017-149773
状態 特許登録済
技術分野 突然変異または遺伝子工学 抗原、抗体含有医薬:生体内診断剤 特有な方法による材料の調査、分析 化合物または医薬の治療活性 生物学的材料の調査,分析 ペプチド又は蛋白質
主要キーワード 挿入プレート 非耐久性 熱蛍光 関連費用 傾斜率 キャリブレーションサンプル 構造的構成要素 微小操作
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図面 (20)

課題

本発明は、クロストリジウムディフィシレの主要な外毒素であるTcdA及びTcdBを中和することができる抗体の派生及び選択を提供する。本発明はまた、個々のMab及びその混合物新規な中和及び抗原結合特性を提供する。

解決手段

本発明は、クロストリジウム・ディフィシレの主要な外毒素であるTcdA及びTcdBを中和することができる抗体の派生及び選択を記載する。本発明はまた、個々のMab及びその混合物の新規な中和及び抗原結合特性を記載する。

概要

背景

2種の主要な外毒素TcdA及びTcdBが、多くのインビトロ及びインビボ研究において、クロストリジウムディフィシレの主要な病原性決定因子として確立されている。非毒素生成株は、動物及びヒトに対して、病原性ではない(1、2)。現在までに、二元毒素の役割の明らかな理解は、未だ確立されていない(3)。

両毒素は、腸毒性且つ細胞毒性であるが、証拠バランスは、TcdAがTcdBよりも強力な腸毒素であり、一方で、典型的には、TcdBは、TcdAよりも約1000倍以上高い細胞毒性が観察されることを示唆している(4)。両毒素とも炎症性応答誘導することができるが、TcdAは、より炎症性のTcdBが胃粘膜の中をより深くに移動するのを補助すると見られる(5)。

全体として、30年以上にわたって作成されたデータの膨大なコレクションは、あるモデルを支持しており、そのモデルでは、両毒素がヒト疾患プロセスにおいて重要である可能性が高くなっている。恐らく、TcdAは、タイトジャンクション喪失及び絨毛の先端の破壊を通した初期(すなわち、TcdBより前の)且つ迅速な(すなわち、1〜3時間)損傷、及びその後の、恐らくはアルブミン駆動の体液喪失を通した下痢を開始する。この胃の内壁完全性の損傷は、TcdBがその優れたモル力価(TcdBは、代表的に、TcdAよりも1000倍以上細胞毒性であると言及される)をより迅速且つより効率的に(すなわち、組織代替的な細胞標的及び有害な全身的に接近された器官内により深く)発揮することを可能にする。いずれの毒素も、インビトロでヒト又は動物の細胞及び組織上で、単独で有効であり得る。どちらの毒素も、他の誘発因子、例えば機械的損傷障壁過負荷及び宿主特異的感受性に依存して、動物においてインビボで、単独で有効であり得る。現在、ハムスターにおいて、クロストリジウム・ディフィシレ胃感染によって送達された少なくともTcdA又はTcdBのいずれか単独で、死をもたらし得ることは、明らかである(1)。A−B+株は、ヒトにおいて症状及び死をもたらし得ることは、十分に確立されている(6,7)。しかし、多く(約95%)の臨床株は、A+B+であり、従って、クロストリジウム・ディフィシレ感染(CDI)を処置することを目的とする薬物は、効率的に両毒素の活性中和し、そして除去できなければならない。

CDIは、高齢患者又は合併併存症を有する患者の、最も代表的な院内感染である。しかし、市中感染の増大が注目されている。感染は、ほぼ常に、広スペクトル抗生物質の使用に関連するか、又はこれによって誘導される。健康管理関連費用は、米国のみにおいて、年間10億ドルを超えると推定される。これらの費用は、主に、長期間入院する患者に起因する。現在の治療は、胃内のクロストリジウム・ディフィシレ細胞を殺傷するクリンダマイシンバンコマイシン又はフィダキソマイシンなどの抗生物質の使用を含む。現在の治療は、細菌感染には取り組むが、CDI症状及び死亡率に対する主な原因であるTcdA及びTcdBによって起こる重要な病因を直接的に対処することも、予防することもない。

ヒトにおけるCDI症状としては、軽度から重度の下痢、偽膜性大腸炎(PMC)及び劇症大腸炎又はいわゆる中毒性巨大結腸が挙げられる。死は、現在最善の手当を受ける患者の5〜15%において起こる。従って、現時点で、患者に対し感染後のC.ディフィシレ毒素によって生じる損傷及び傷害を予防可能な特定の治療は存在しない。

ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体ワクチン接種及び非経口投与を通した抗体応答惹起は、全て、下痢の症状及び死から動物を防御できることが示されている(8〜15)。ハムスターにおける初期研究は、TcdAに対する抗体だけで、防御のために十分であること示唆した。しかし、TcdA又はTcdBについて機能的に削除した株の使用は、どちらの毒素も、ハムスターにおいて疾患を引き起こし得るが、両毒素が一緒だと、より有効であることを実証した(1)。

治療適用のために、モノクローナル抗体(Mab)は、血清由来ポリクローナル抗体又は血清由来過免疫血清をしのぐ効力、安全性、製造利益及び規制利益を提供し得る。これらの理由により、Mabは、通常、治療製品の好ましい選択肢である。

TcdA及びTcdBに対し、防御Mabを作製する多くの試みがあった。診療所におけるこの試みの最も高度なものは、TcdA及びTcdBそれぞれに対する2つのIgG1 Mabの混合物であって、はじめCDA1と呼ばれており、MBL及びMedarexによって開発されたMDX1388であった。これらが急性又は再発性の感染のモデルにおいてハムスターを完全に防御できないことが実証された(15)。このMab組み合わせは、現在、Merck Inc.により、MK3415Aとして開発されている。ヒト第II相試験において、疾患の再発において、MK3415Aは、統計学的に有意な低下をもたらした(p=0.006)(Lowy et al., NEJM (2010) 362: 197-205もまた参照されたい)が、下痢の持続期間/重症度及び死亡率には影響しなかった(16)。このことは、これらの抗体は、感染の再発を予防するためにのみ有用であり得ることを意味し得る。感染の再発は、患者の約25%で生じる。従って、これらの抗体が有効でない多くの患者集団が存在する可能性が高い。

下痢(例えば、TcdAに起因する胃タイトジャンクションに対する急性損傷によるもの)及び死(例えば、長期に亘る貧しい栄養状態脱水ストレス及び炎症カスケードの開始、胃の内壁に対する広範な解剖学的損傷及びTcdAよりも全身性毒素TcdBに起因する遠位の器官に対する損傷の可能性からもたらされるもの)にはっきりと影響を及ぼすためには、Mabは、優れた親和性、毒素中和、TEER経上皮電気抵抗)の喪失の優れた予防、抗原装飾及び抗原免疫クリアランスを有する必要がある。

概要

本発明は、クロストリジウム・ディフィシレの主要な外毒素であるTcdA及びTcdBを中和することができる抗体の派生及び選択を提供する。本発明はまた、個々のMab及びその混合物の新規な中和及び抗原結合特性を提供する。本発明は、クロストリジウム・ディフィシレの主要な外毒素であるTcdA及びTcdBを中和することができる抗体の派生及び選択を記載する。本発明はまた、個々のMab及びその混合物の新規な中和及び抗原結合特性を記載する。なし

目的

しかし、多く(約95%)の臨床株は、A+B+であり、従って、クロストリジウム・ディフィシレ感染(CDI)を処置することを目的とする

効果

実績

技術文献被引用数
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請求項1

抗原TcdA又はTcdBに対して特異的なモノクローナル抗体であって、前記抗体が、標的抗原に対して高い親和性を有し、クロストリジウムディフィシレ(clostridiumdifficile)感染又は前記感染の危険にある患者において下痢持続期間及び/又は重症度罹患率及び/又は死亡率を低下するために好適である、上記抗体。

請求項2

前記抗体が、高い力価、例えば、毒素がLD80以上で使用された場合に、200ng/ml以下、例えば、150ng/ml以下、詳細には100ng/ml以下のEC50を有する、請求項1に記載のモノクローナル抗体。

請求項3

毒素がLD80以上で使用された場合に、前記抗体のEC50が0.1〜10ng/mlの間である、請求項2に記載のモノクローナル抗体。

請求項4

毒素がLD80以上で使用された場合に、毒素の最大阻害が50〜100%の間である、請求項2又は請求項3に記載のモノクローナル抗体。

請求項5

前記抗体が、標的抗原に複数回結合する、請求項1から4までのいずれか一項に記載のモノクローナル抗体。

請求項6

前記抗体が、標的抗原に2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14又は15回以上結合する、請求項5に記載のモノクローナル抗体。

請求項7

前記抗体が、TcdAに特異的である、請求項1から6までのいずれか一項に記載のモノクローナル抗体。

請求項8

前記抗体が、TcdBに特異的である、請求項1から6までのいずれか一項に記載のモノクローナル抗体。

請求項9

前記抗体が、1nM以下、例えば600pM、例えば50〜600pMの親和性を有する、請求項1から8までのいずれか一項に記載のモノクローナル抗体。

請求項10

前記抗体が、中和抗体であり、高濃度の毒素、特に、リボタイプ003、012、027及び078に対して有効なものを含む、請求項1から9までのいずれか一項に記載のモノクローナル抗体。

請求項11

前記抗体が、TEERアッセイにおいて、前記アッセイの開始の4時間後に測定した場合、60〜80ng/mlの範囲内のEC50を有する、請求項1から10までのいずれか一項に記載のモノクローナル抗体。

請求項12

TcdAに特異的に結合し、重鎖を含み、重鎖の可変ドメインは、CDR-H1用の配列番号44に示される配列を有するCDR、CDR-H2用の配列番号45に示される配列を有するCDR、及びCDR-H3用の配列番号46に示される配列を有するCDRのうち少なくとも1つを含む、請求項1に記載のモノクローナル抗体。

請求項13

さらに軽鎖を含み、軽鎖の可変ドメインは、CDR-L1用の配列番号41に示される配列を有するCDR、CDR-L2用の配列番号42に示される配列を有するCDR、及びCDR-L3用の配列番号43に示される配列を有するCDRのうち少なくとも1つを含む、請求項12に記載のモノクローナル抗体。

請求項14

配列番号49に示される配列を含む重鎖及び配列番号47に示される配列を含む軽鎖を有する、請求項13に記載のモノクローナル抗体。

請求項15

TcdAに特異的に結合し、重鎖を含み、重鎖の可変ドメインは、CDR-H1用の配列番号54に示される配列を有するCDR、CDR-H2用の配列番号55に示される配列を有するCDR、及びCDR-H3用の配列番号56に示される配列を有するCDRのうち少なくとも1つを含む、請求項1に記載のモノクローナル抗体。

請求項16

さらに軽鎖を含み、軽鎖の可変ドメインは、CDR-L1用の配列番号51に示される配列を有するCDR、CDR-L2用の配列番号52に示される配列を有するCDR、及びCDR-L3用の配列番号53に示される配列を有するCDRのうち少なくとも1つを含む、請求項15に記載のモノクローナル抗体。

請求項17

配列番号59に示される配列を含む重鎖及び配列番号57に示される配列を含む軽鎖を有する、請求項16に記載のモノクローナル抗体。

請求項18

TcdBに特異的に結合し、重鎖を含み、重鎖の可変ドメインは、CDR-H1用の配列番号124に示される配列を有するCDR、CDR-H2用の配列番号125に示される配列を有するCDR、及びCDR-H3用の配列番号126に示される配列を有するCDRのうち少なくとも1つを含む、請求項1に記載のモノクローナル抗体。

請求項19

さらに軽鎖を含み、軽鎖の可変ドメインは、CDR-L1用の配列番号121に示される配列を有するCDR、CDR-L2用の配列番号122に示される配列を有するCDR、及びCDR-L3用の配列番号123に示される配列を有するCDRのうち少なくとも1つを含む、請求項18に記載のモノクローナル抗体。

請求項20

配列番号129に示される配列を含む重鎖及び配列番号127に示される配列を含む軽鎖を有する、請求項19に記載のモノクローナル抗体。

請求項21

TcdBに特異的に結合し、重鎖を含み、重鎖の可変ドメインは、CDR-H1用の配列番号154に示される配列を有するCDR、CDR-H2用の配列番号155に示される配列を有するCDR、及びCDR-H3用の配列番号156に示される配列を有するCDRのうち少なくとも1つを含む、請求項1に記載のモノクローナル抗体。

請求項22

さらに軽鎖を含み、軽鎖の可変ドメインは、CDR-L1用の配列番号151に示される配列を有するCDR、CDR-L2用の配列番号152に示される配列を有するCDR、及びCDR-L3用の配列番号153に示される配列を有するCDRのうち少なくとも1つを含む、請求項21に記載のモノクローナル抗体。

請求項23

配列番号159に示される配列を含む重鎖及び配列番号157に示される配列を含む軽鎖を有する、請求項22に記載のモノクローナル抗体。

請求項24

TcdAに特異的に結合し、重鎖及び軽鎖を有し、重鎖可変領域は、配列番号9、配列番号19、配列番号29及び配列番号39からなる群より選択される配列を含み、軽鎖可変領域は、配列番号7、配列番号17、配列番号27及び配列番号37からなる群より選択される配列を含む、請求項1に記載のモノクローナル抗体。

請求項25

TcdBに特異的に結合し、重鎖及び軽鎖を有し、重鎖可変領域は、配列番号69、配列番号79、配列番号89、配列番号99、配列番号109、配列番号119、配列番号139、配列番号149及び配列番号159からなる群より選択される配列を含み、軽鎖可変領域は、配列番号67、配列番号77、配列番号87、配列番号97、配列番号107、配列番号117、配列番号137、配列番号147及び配列番号157からなる群より選択される配列を含む、請求項1に記載のモノクローナル抗体。

請求項26

1つ又は複数の請求項1から25までのいずれか一項に記載の抗体を含む、医薬組成物

請求項27

TcdBに特異的な2つ以上の抗体を含む、請求項26に記載の医薬組成物。

請求項28

TcdAに特異的な2つ以上の抗体を含む、請求項26に記載の医薬組成物。

請求項29

前記組成物中の少なくとも1つの抗体が、TcdAに対し特異的であり、前記組成物中の少なくとも1つの抗体が、TcdBに対し特異的である、請求項26に記載の医薬組成物。

請求項30

前記組成物が、TcdBに特異的な少なくとも第2の抗体をさらに含む、請求項29に記載の医薬組成物。

請求項31

前記組成物が、標的抗原(単数又は複数)に対する2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15種の異なる抗体、例えば2、3、4、又は5種の抗体を含む、請求項26から30までに記載の医薬組成物。

請求項32

請求項14、20及び23に記載の抗体を含む、医薬組成物又は混合物

請求項33

薬学的に許容可能な賦形剤をさらに含む、請求項26から32までのいずれか一項に記載の医薬組成物。

請求項34

処置、例えば、クロストリジウム・ディフィシレ(clostridiumdifficile)感染又はその合併症の処置又は予防における使用のための、請求項1から25までのいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、又は請求項26から33までに記載の医薬組成物。

請求項35

クロストリジウム・ディフィシレ(clostridiumdifficile)感染を有するか又はその危険にある患者を処置する方法であって、治療有効量の請求項1から25までのいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又は請求項26から33までのいずれか一項に記載の医薬組成物を投与することを含む、上記方法。

請求項36

前記処置が、クロストリジウム・ディフィシレ(Cclostridiumdifficile)処置のためのさらなる処置、例えば、メトロニダゾールバンコマイシンクリンダマイシンフィダキソマイシン及びこれらの組み合わせからなる群より選択される処置と組み合わせて使用される、請求項35に記載の処置の方法。

請求項37

クロストリジウム・ディフィシレ(clostridiumdifficile)感染又はその合併症の処置又は予防のための医薬の製造のための、請求項1から25までのいずれか一項に記載の抗体又は請求項26から33までのいずれか一項に記載の組成物の使用。

請求項38

TEER(経上皮電気抵抗)の喪失に対する防御を測定するアッセイを用いる、請求項1から11までのいずれか一項に記載の抗体を選択する方法。

請求項39

熱安定性(Tm)及び振盪凝集に対する抵抗性を測定するアッセイを用いる、請求項1から11までのいずれか一項に記載の抗体を選択する方法。

請求項40

毒素中和の測定、TEER測定、熱安定性測定(Tm)、振盪凝集測定及び共製剤化のために好適な等電点(pI)を組み合わせることによる、クロストリジウム・ディフィシレ(clostridiumdifficile)感染の処置のための抗体混合物を選択する方法。

請求項41

例えば、クロストリジウム・ディフィシレ(clostridiumdifficile)感染又はその合併症の処置又は予防などのワクチン接種における使用のための、トキソイド又はこれを含む医薬組成物と組み合わせた、請求項1から26までのいずれか一項に記載のモノクローナル抗体。

技術分野

0001

本発明は、クロストリジウムディフィシレ(Clostridium difficile)の外毒素、例えばTcdA及びTcdBに対する抗体、これを含む医薬組成物、前記抗体及び組成物を生成するプロセス、並びに処置及び/又は予防、詳細には、クロストリジウム・ディフィシレ感染偽膜性大腸炎劇症大腸炎及び/又は中毒性巨大結腸の処置又は予防におけるこの抗体及び組成物の使用に関する。

背景技術

0002

2種の主要な外毒素TcdA及びTcdBが、多くのインビトロ及びインビボ研究において、クロストリジウム・ディフィシレの主要な病原性決定因子として確立されている。非毒素生成株は、動物及びヒトに対して、病原性ではない(1、2)。現在までに、二元毒素の役割の明らかな理解は、未だ確立されていない(3)。

0003

両毒素は、腸毒性且つ細胞毒性であるが、証拠バランスは、TcdAがTcdBよりも強力な腸毒素であり、一方で、典型的には、TcdBは、TcdAよりも約1000倍以上高い細胞毒性が観察されることを示唆している(4)。両毒素とも炎症性応答誘導することができるが、TcdAは、より炎症性のTcdBが胃粘膜の中をより深くに移動するのを補助すると見られる(5)。

0004

全体として、30年以上にわたって作成されたデータの膨大なコレクションは、あるモデルを支持しており、そのモデルでは、両毒素がヒト疾患プロセスにおいて重要である可能性が高くなっている。恐らく、TcdAは、タイトジャンクション喪失及び絨毛の先端の破壊を通した初期(すなわち、TcdBより前の)且つ迅速な(すなわち、1〜3時間)損傷、及びその後の、恐らくはアルブミン駆動の体液喪失を通した下痢を開始する。この胃の内壁完全性の損傷は、TcdBがその優れたモル力価(TcdBは、代表的に、TcdAよりも1000倍以上細胞毒性であると言及される)をより迅速且つより効率的に(すなわち、組織代替的な細胞標的及び有害な全身的に接近された器官内により深く)発揮することを可能にする。いずれの毒素も、インビトロでヒト又は動物の細胞及び組織上で、単独で有効であり得る。どちらの毒素も、他の誘発因子、例えば機械的損傷障壁過負荷及び宿主特異的感受性に依存して、動物においてインビボで、単独で有効であり得る。現在、ハムスターにおいて、クロストリジウム・ディフィシレ胃感染によって送達された少なくともTcdA又はTcdBのいずれか単独で、死をもたらし得ることは、明らかである(1)。A−B+株は、ヒトにおいて症状及び死をもたらし得ることは、十分に確立されている(6,7)。しかし、多く(約95%)の臨床株は、A+B+であり、従って、クロストリジウム・ディフィシレ感染(CDI)を処置することを目的とする薬物は、効率的に両毒素の活性中和し、そして除去できなければならない。

0005

CDIは、高齢患者又は合併併存症を有する患者の、最も代表的な院内感染である。しかし、市中感染の増大が注目されている。感染は、ほぼ常に、広スペクトル抗生物質の使用に関連するか、又はこれによって誘導される。健康管理関連費用は、米国のみにおいて、年間10億ドルを超えると推定される。これらの費用は、主に、長期間入院する患者に起因する。現在の治療は、胃内のクロストリジウム・ディフィシレ細胞を殺傷するクリンダマイシンバンコマイシン又はフィダキソマイシンなどの抗生物質の使用を含む。現在の治療は、細菌感染には取り組むが、CDI症状及び死亡率に対する主な原因であるTcdA及びTcdBによって起こる重要な病因を直接的に対処することも、予防することもない。

0006

ヒトにおけるCDI症状としては、軽度から重度の下痢、偽膜性大腸炎(PMC)及び劇症型大腸炎又はいわゆる中毒性巨大結腸が挙げられる。死は、現在最善の手当を受ける患者の5〜15%において起こる。従って、現時点で、患者に対し感染後のC.ディフィシレ毒素によって生じる損傷及び傷害を予防可能な特定の治療は存在しない。

0007

ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体ワクチン接種及び非経口投与を通した抗体応答惹起は、全て、下痢の症状及び死から動物を防御できることが示されている(8〜15)。ハムスターにおける初期研究は、TcdAに対する抗体だけで、防御のために十分であること示唆した。しかし、TcdA又はTcdBについて機能的に削除した株の使用は、どちらの毒素も、ハムスターにおいて疾患を引き起こし得るが、両毒素が一緒だと、より有効であることを実証した(1)。

0008

治療適用のために、モノクローナル抗体(Mab)は、血清由来ポリクローナル抗体又は血清由来過免疫血清をしのぐ効力、安全性、製造利益及び規制利益を提供し得る。これらの理由により、Mabは、通常、治療製品の好ましい選択肢である。

0009

TcdA及びTcdBに対し、防御Mabを作製する多くの試みがあった。診療所におけるこの試みの最も高度なものは、TcdA及びTcdBそれぞれに対する2つのIgG1 Mabの混合物であって、はじめCDA1と呼ばれており、MBL及びMedarexによって開発されたMDX1388であった。これらが急性又は再発性の感染のモデルにおいてハムスターを完全に防御できないことが実証された(15)。このMab組み合わせは、現在、Merck Inc.により、MK3415Aとして開発されている。ヒト第II相試験において、疾患の再発において、MK3415Aは、統計学的に有意な低下をもたらした(p=0.006)(Lowy et al., NEJM (2010) 362: 197-205もまた参照されたい)が、下痢の持続期間/重症度及び死亡率には影響しなかった(16)。このことは、これらの抗体は、感染の再発を予防するためにのみ有用であり得ることを意味し得る。感染の再発は、患者の約25%で生じる。従って、これらの抗体が有効でない多くの患者集団が存在する可能性が高い。

0010

下痢(例えば、TcdAに起因する胃タイトジャンクションに対する急性損傷によるもの)及び死(例えば、長期に亘る貧しい栄養状態脱水ストレス及び炎症カスケードの開始、胃の内壁に対する広範な解剖学的損傷及びTcdAよりも全身性毒素TcdBに起因する遠位の器官に対する損傷の可能性からもたらされるもの)にはっきりと影響を及ぼすためには、Mabは、優れた親和性、毒素中和、TEER経上皮電気抵抗)の喪失の優れた予防、抗原装飾及び抗原免疫クリアランスを有する必要がある。

課題を解決するための手段

0011

本発明は、インビトロ及びインビボで非常に高いレベルの効力を有するMab(単数又は複数)を提供し、このMabは、クロストリジウム・ディフィシレ感染(CDI)に罹患するヒトにおける下痢の持続期間及び重症度並びに死亡率に対し効果を有する潜在能力がある。

0012

1つの実施形態において、抗原TcdA又はTcdBに特異的なモノクローナル抗体が提供され、この抗体は、標的抗原に対して高い親和性を有し、クロストリジウム・ディフィシレ感染を有するか又は前記感染の危険のある患者において下痢の持続期間及び重症度並びに罹患率を低下するために好適である。

0013

1つの実施形態において、TcdA又はTcdBに特異的なMab、又は少なくとも1つがTcdAに対して特異的であり、少なくとも1つがTcdBに対して特異的である少なくとも2つのMabの集団が提供され、ここで、その抗体、各抗体又は抗体の組み合わせのEC50は、200ng/ml以下、例えば150ng/ml以下、例えば100ng/mlである。

0014

本開示の抗体は、有用である。何故なら、これらは、疾患の症状の再発を予防するだけではなく、患者における一次感染の症状、例えば下痢の重症度及び持続期間を処置するか、又は死亡を予防する手段を提供する可能性が高いからである。

0015

少なくともいくつかの実施形態において、本開示に従う抗体は、高濃度の毒素の存在下で、効力の低減は示さない。

実施例

0016

ここで使用される場合、特異的は、特定の抗原のみを認識する抗体又は非特異的である抗原への結合と比較して特定の抗原に対して有意に高い結合親和性、例えば、5、6、7、8、9、10倍高い結合親和性を有する抗体を意味する。

0017

結合親和性は、標準アッセイ、例えば表面プラスモン共鳴、例えばBIAcoreによって測定され得る。

0018

1つの実施形態において、細胞培養アッセイ及び患者において、EC50は、75、70、60、65、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1.5ng/ml未満のクロストリジウム・ディフィシレ感染である。これは、公知の抗体よりも有意に低く(より力価が高く)、本開示の抗体が処置を受けた患者の生存に対し有意且つ明らかな効果を有する主な要因であると考えられる。

0019

ここで使用される場合、力価は、抗体が、所定の用量又は濃度において、適切な生物学的応答、例えば、有害な毒素効果の中和を誘発する能力である。力価の例としては、毒素活性の最大中和百分率(防御の程度)、抗原に対するMabの最低相対濃度(例えば、EC50)中和活性の速度及び耐久性が挙げられる。

0020

細胞培養アッセイにおいて、中和は、以下の1つ又は複数によって観察され得る:細胞に対する毒素の結合の予防、溶液からの毒素の免疫沈降細胞形態及び形状の喪失の予防、細胞骨格構造の喪失の予防、細胞単層タイトジャンクション及び経上皮電気抵抗の喪失の予防、細胞死アポトーシス及び炎症促進性サイトカイン、例えばTNFα、IL−1β、IL-6及びMIP1αの生成の予防。

0021

組織切片及び外植片アッセイにおいて、中和は、例えば、壊死及び/又は水腫液蓄積の予防として観察され得る。

0022

インビトロアッセイにおいて、中和は、以下の1つ又は複数によって観察され得る:結紮された回腸ループにおける液体蓄積の予防及び胃組織壊死の予防、下痢、動物の死の偽膜形成。

0023

従って、1つの実施形態において、CDR、例えば以下から選択される1、2、3、4、5又は6つのCDRを含む抗体(例えば、抗毒素A抗体)が提供される:

0024

1つの実施形態において、配列1〜3が抗体の軽鎖にある。

0025

1つの実施形態において、配列4〜6が抗体の重鎖にある。

0026

1つの実施形態において、配列番号1はCDRL1であり、配列番号2はCDR L2であり、配列番号3はCDR L3である。

0027

1つの実施形態において、配列番号4はCDRH1であり、配列番号5はCDR H2であり、配列番号6はCDR H3である。

0028

1つの実施形態において、配列番号1はCDRL1であり、配列番号2はCDR L2であり、配列番号3はCDR L3であり、配列番号4はCDR H1であり、配列番号5はCDR H2であり、配列番号6はCDR H3である。

0029

1つの実施形態において、可変領域、例えば、以下の配列(抗体922抗毒素A抗体;軽鎖可変領域配列)配列番号7を有する軽鎖可変領域が提供される:




ここで、CDRは下線を引かれており、構築物は、ここで922.g1 VK(gL1)と呼ばれる。

0030

配列番号7をコードするポリヌクレオチド配列は、図1及びその中の配列番号8において示される。

0031

1つの実施形態において、可変領域、例えば、以下の配列(抗体922抗毒素A抗体重鎖可変領域配列)配列番号9を有する重鎖可変領域が提供される:




ここで、CDRは下線を引かれており、構築物は、ここで922.g1 VH(gH1)と呼ばれる。

0032

配列番号9をコードするポリヌクレオチド配列は、図1及びその中の配列番号10において示される。

0033

1つの実施形態において、抗体は、配列番号7及び9に示される可変領域を含む。

0034

従って、1つの実施形態において、CDR、例えば以下から選択される1、2、3、4、5又は6つのCDRを含む抗体(例えば、抗毒素A抗体)が提供される:

0035

1つの実施形態において、配列11〜13が抗体の軽鎖にある。

0036

1つの実施形態において、配列14〜16が抗体の重鎖にある。

0037

1つの実施形態において、配列番号11はCDRL1であり、配列番号12はCDR L2であり、配列番号13はCDR L3である。

0038

1つの実施形態において、配列番号14はCDRH1であり、配列番号15はCDR H2であり、配列番号16はCDR H3である。

0039

1つの実施形態において、配列番号11はCDRL1であり、配列番号12はCDR L2であり、配列番号13はCDR L3であり、配列番号14はCDR H1であり、配列番号15はCDR H2であり、配列番号16はCDR H3である。

0040

1つの実施形態において、可変領域、例えば、以下の配列(抗体923抗毒素A抗体;軽鎖可変領域配列)配列番号17を有する軽鎖可変領域が提供される:




ここで、CDRは下線を引かれており、構築物は、ここでCA923.g1 gL1と呼ばれる。

0041

配列番号17をコードするポリヌクレオチド配列は、図1及びその中の配列番号18において示される。

0042

1つの実施形態において、可変領域、例えば、以下の配列(抗体923抗毒素A抗体重鎖可変領域配列)配列番号19を有する重鎖可変領域が提供される:




ここで、CDRは下線を引かれており、構築物は、ここでCA923.g1 gH1と呼ばれる。

0043

配列番号19をコードするポリヌクレオチド配列は、図2及びその中の配列番号20において示される。

0044

1つの実施形態において、本発明に従う抗体は、配列番号17及び配列番号19に示される可変領域を含む。

0045

1つの実施形態において、CDR、例えば以下から選択される1、2、3、4、5又は6つのCDRを含む抗体(例えば、抗毒素A抗体)が提供される:

0046

1つの実施形態において、配列21〜23が抗体の軽鎖にある。

0047

1つの実施形態において、配列24〜26が抗体の重鎖にある。

0048

1つの実施形態において、配列番号21はCDRL1であり、配列番号22はCDR L2であり、配列番号23はCDR L3である。

0049

1つの実施形態において、配列番号24はCDRH1であり、配列番号25はCDR H2であり、配列番号26はCDR H3である。

0050

1つの実施形態において、配列番号21はCDRL1であり、配列番号22はCDR L2であり、配列番号23はCDR L3であり、配列番号24はCDR H1であり、配列番号25はCDR H2であり、配列番号26はCDR H3である。

0051

1つの実施形態において、可変領域、例えば、以下の配列(抗体993抗毒素A抗体;軽鎖可変領域配列)配列番号27を有する軽鎖可変領域が提供される:




ここで、CDRは下線を引かれており、構築物は、ここでCA993.g1 gL1と呼ばれる。

0052

配列番号27をコードするポリヌクレオチド配列は、図2及びその中の配列番号28において示される。

0053

1つの実施形態において、可変領域、例えば、以下の配列(抗体993抗毒素A抗体重鎖可変領域配列)配列番号29を有する重鎖可変領域が提供される:




ここで、CDRは下線を引かれており、構築物は、ここでCA993.g1 gH1と呼ばれる。

0054

配列番号29をコードするポリヌクレオチド配列は、図2及びその中の配列番号30において示される。

0055

1つの実施形態において、本発明に従う抗体は、配列番号27及び配列番号29に示される可変領域を含む。

0056

1つの実施形態において、CDR、例えば以下から選択される1、2、3、4、5又は6つのCDRを含む抗体(例えば、抗毒素A抗体)が提供される:

0057

1つの実施形態において、配列31〜33が抗体の軽鎖にある。

0058

1つの実施形態において、配列34〜36が抗体の重鎖にある。

0059

1つの実施形態において、配列番号31はCDRL1であり、配列番号32はCDR L2であり、配列番号33はCDR L3である。

0060

1つの実施形態において、配列番号34はCDRH1であり、配列番号35はCDR H2であり、配列番号36はCDR H3である。

0061

1つの実施形態において、配列番号31はCDRL1であり、配列番号32はCDR L2であり、配列番号33はCDR L3であり、配列番号34はCDR H1であり、配列番号35はCDR H2であり、配列番号36はCDR H3である。

0062

1つの実施形態において、可変領域、例えば、以下の配列(抗体995抗毒素A抗体;軽鎖可変領域配列)配列番号37を有する軽鎖可変領域が提供される:




ここで、CDRは下線を引かれている。

0063

配列番号37をコードするポリヌクレオチド配列は、図3及びその中の配列番号38において示される。

0064

1つの実施形態において、可変領域、例えば、以下の配列(抗体995抗毒素A抗体重鎖可変領域配列)配列番号39を有する重鎖可変領域が提供される:




ここで、CDRは下線を引かれている。

0065

配列番号39をコードするポリヌクレオチド配列は、図3及びその中の配列番号40において示される。

0066

1つの実施形態において、本発明に従う抗体は、配列番号37及び配列番号39に示される可変領域を含む。

0067

1つの実施形態において、CDR、例えば以下から選択される1、2、3、4、5又は6つのCDRを含む抗体(例えば、抗毒素A抗体)が提供される:

0068

1つの実施形態において、配列41〜43が抗体の軽鎖にある。

0069

1つの実施形態において、配列44〜46が抗体の重鎖にある。

0070

1つの実施形態において、配列番号41はCDRL1であり、配列番号42はCDR L2であり、配列番号43はCDR L3である。

0071

1つの実施形態において、配列番号44はCDRH1であり、配列番号45はCDR H2であり、配列番号46はCDR H3である。

0072

1つの実施形態において、配列番号41はCDRL1であり、配列番号42はCDR L2であり、配列番号43はCDR L3であり、配列番号44はCDR H1であり、配列番号45はCDR H2であり、配列番号46はCDR H3である。

0073

1つの実施形態において、可変領域、例えば、以下の配列(抗体997抗毒素A抗体;軽鎖可変領域配列)配列番号47を有する軽鎖可変領域が提供される:




ここで、CDRは下線を引かれている。

0074

配列番号47をコードするポリヌクレオチド配列は、図3及びその中の配列番号48において示される。

0075

1つの実施形態において、可変領域、例えば、以下の配列(抗体997抗毒素A抗体重鎖可変領域配列)配列番号49を有する重鎖可変領域が提供される:




ここで、CDRは下線を引かれている。

0076

配列番号49をコードするポリヌクレオチド配列は、図4及びその中の配列番号50において示される。

0077

1つの実施形態において、本発明に従う抗体は、配列番号47及び配列番号49に示される可変領域を含む。

0078

1つの実施形態において、CDR、例えば以下から選択される1、2、3、4、5又は6つのCDRを含む抗体(例えば、抗毒素A抗体)が提供される:

0079

1つの実施形態において、配列51〜53が抗体の軽鎖にある。

0080

1つの実施形態において、配列54〜56が抗体の重鎖にある。

0081

1つの実施形態において、配列番号51はCDRL1であり、配列番号52はCDR L2であり、配列番号53はCDR L3である。

0082

1つの実施形態において、配列番号54はCDRH1であり、配列番号55はCDR H2であり、配列番号56はCDR H3である。

0083

1つの実施形態において、配列番号51はCDRL1であり、配列番号52はCDR L2であり、配列番号53はCDR L3であり、配列番号54はCDR H1であり、配列番号55はCDR H2であり、配列番号56はCDR H3である。

0084

1つの実施形態において、可変領域、例えば、以下の配列(抗体1000抗毒素A抗体;軽鎖可変領域配列)配列番号57を有する軽鎖可変領域が提供される:




ここで、CDRは下線を引かれている。

0085

配列番号57をコードするポリヌクレオチド配列は、図4及びその中の配列番号58において示される。

0086

1つの実施形態において、可変領域、例えば、以下の配列(抗体1000抗毒素A抗体重鎖可変領域配列)配列番号59を有する重鎖可変領域が提供される:




ここで、CDRは下線を引かれている。

0087

配列番号59をコードするポリヌクレオチド配列は、図4及びその中の配列番号60において示される。

0088

1つの実施形態において、本発明に従う抗体は、配列番号57及び配列番号59に示される可変領域を含む。

0089

1つの実施形態において、CDR、例えば以下から選択される1、2、3、4、5又は6つのCDRを含む抗体(例えば、抗毒素B抗体)が提供される:

0090

1つの実施形態において、配列61〜63が抗体の軽鎖にある。

0091

1つの実施形態において、配列64〜66が抗体の重鎖にある。

0092

1つの実施形態において、配列番号61はCDRL1であり、配列番号62はCDR L2であり、配列番号63はCDR L3である。

0093

1つの実施形態において、配列番号64はCDRH1であり、配列番号65はCDR H2であり、配列番号66はCDR H3である。

0094

1つの実施形態において、配列番号61はCDRL1であり、配列番号62はCDR L2であり、配列番号63はCDR L3であり、配列番号64はCDR H1であり、配列番号65はCDR H2であり、配列番号66はCDR H3である。

0095

1つの実施形態において、可変領域、例えば、以下の配列(抗体926抗毒素B抗体;軽鎖可変領域配列)配列番号67を有する軽鎖可変領域が提供される:




ここで、CDRは下線を引かれている。

0096

配列番号67をコードするポリヌクレオチド配列は、図5及びその中の配列番号68において示される。

0097

1つの実施形態において、可変領域、例えば、以下の配列(抗体926抗毒素B抗体重鎖可変領域配列)配列番号69を有する重鎖可変領域が提供される:




ここで、CDRは下線を引かれている。

0098

配列番号69をコードするポリヌクレオチド配列は、図5及びその中の配列番号70において示される。

0099

1つの実施形態において、CDR、例えば以下から選択される1、2、3、4、5又は6つのCDRを含む抗体(例えば、抗毒素B抗体)が提供される:

0100

1つの実施形態において、配列71〜73が抗体の軽鎖にある。

0101

1つの実施形態において、配列74〜76が抗体の重鎖にある。

0102

1つの実施形態において、配列番号71はCDRL1であり、配列番号72はCDR L2であり、配列番号73はCDR L3である。

0103

1つの実施形態において、配列番号74はCDRH1であり、配列番号75はCDR H2であり、配列番号76はCDR H3である。

0104

1つの実施形態において、配列番号71はCDRL1であり、配列番号72はCDR L2であり、配列番号73はCDR L3であり、配列番号74はCDR H1であり、配列番号75はCDR H2であり、配列番号76はCDR H3である。

0105

1つの実施形態において、可変領域、例えば、以下の配列(抗体927抗毒素B抗体;軽鎖可変領域配列)配列番号77を有する軽鎖可変領域が提供される:




ここで、CDRは下線を引かれている。

0106

配列番号77をコードするポリヌクレオチド配列は、図5及びその中の配列番号78において示される。

0107

1つの実施形態において、可変領域、例えば、以下の配列(抗体927抗毒素B抗体重鎖可変領域配列)配列番号79を有する重鎖可変領域が提供される:




ここで、CDRは下線を引かれている。

0108

配列番号79をコードするポリヌクレオチド配列は、図5及びその中の配列番号80において示される。

0109

1つの実施形態において、本発明に従う抗体は、配列番号77及び配列番号79に示される可変領域を含む。

0110

1つの実施形態において、CDR、例えば以下から選択される1、2、3、4、5又は6つのCDRを含む抗体(例えば、抗毒素B抗体)が提供される:

0111

1つの実施形態において、配列81〜83が抗体の軽鎖にある。

0112

1つの実施形態において、配列84〜86が抗体の重鎖にある。

0113

1つの実施形態において、配列番号81はCDRL1であり、配列番号82はCDR L2であり、配列番号83はCDR L3である。

0114

1つの実施形態において、配列番号84はCDRH1であり、配列番号85はCDR H2であり、配列番号86はCDR H3である。

0115

1つの実施形態において、配列番号81はCDRL1であり、配列番号82はCDR L2であり、配列番号83はCDR L3であり、配列番号84はCDR H1であり、配列番号85はCDR H2であり、配列番号86はCDR H3である。

0116

1つの実施形態において、可変領域、例えば、以下の配列(抗体1099抗毒素B抗体;軽鎖可変領域配列)配列番号87を有する軽鎖可変領域が提供される:




ここで、CDRは下線を引かれている。

0117

1つの実施形態において、配列番号87の最後の2つのアミノ酸RT)が、省かれる。

0118

配列番号87をコードするポリヌクレオチド配列は、図6及びその中の配列番号88において示される。1つの実施形態において、最後の2つのアミノ酸(RT)をコードするコドンが、省かれる。

0119

1つの実施形態において、可変領域、例えば、以下の配列(抗体1099抗毒素B抗体重鎖可変領域配列)配列番号89を有する重鎖可変領域が提供される:




ここで、CDRは下線を引かれている。

0120

配列番号89をコードするポリヌクレオチド配列は、図6及びその中の配列番号90において示される。

0121

1つの実施形態において、本発明に従う抗体は、配列番号87及び配列番号89に示される可変領域を含む。

0122

1つの実施形態において、CDR、例えば以下から選択される1、2、3、4、5又は6つのCDRを含む抗体(例えば、抗毒素B抗体)が提供される:

0123

1つの実施形態において、配列91〜93が抗体の軽鎖にある。

0124

1つの実施形態において、配列94〜96が抗体の重鎖にある。

0125

1つの実施形態において、配列番号91はCDRL1であり、配列番号92はCDR L2であり、配列番号93はCDR L3である。

0126

1つの実施形態において、配列番号94はCDRH1であり、配列番号95はCDR H2であり、配列番号96はCDR H3である。

0127

1つの実施形態において、配列番号91はCDRL1であり、配列番号92はCDR L2であり、配列番号93はCDR L3であり、配列番号94はCDR H1であり、配列番号95はCDR H2であり、配列番号96はCDR H3である。

0128

1つの実施形態において、可変領域、例えば、以下の配列(抗体1102抗毒素B抗体;軽鎖可変領域配列)配列番号97を有する軽鎖可変領域が提供される:




ここで、CDRは下線を引かれている。

0129

配列番号97をコードするポリヌクレオチド配列は、図6及びその中の配列番号98において示される。

0130

1つの実施形態において、可変領域、例えば、以下の配列(抗体1102抗毒素B抗体重鎖可変領域配列)配列番号99を有する重鎖可変領域が提供される:




ここで、CDRは下線を引かれている。

0131

配列番号99をコードするポリヌクレオチド配列は、図7及びその中の配列番号100において示される。

0132

1つの実施形態において、本発明に従う抗体は、配列番号97及び配列番号99に示される可変領域を含む。

0133

1つの実施形態において、CDR、例えば以下から選択される1、2、3、4、5又は6つのCDRを含む抗体(例えば、抗毒素B抗体)が提供される:

0134

1つの実施形態において、配列101〜103が抗体の軽鎖にある。

0135

1つの実施形態において、配列104〜106が抗体の重鎖にある。

0136

1つの実施形態において、配列番号101はCDRL1であり、配列番号102はCDR L2であり、配列番号103はCDR L3である。

0137

1つの実施形態において、配列番号104はCDRH1であり、配列番号105はCDR H2であり、配列番号106はCDR H3である。

0138

1つの実施形態において、配列番号101はCDRL1であり、配列番号102はCDR L2であり、配列番号103はCDR L3であり、配列番号104はCDR H1であり、配列番号105はCDR H2であり、配列番号106はCDR H3である。

0139

1つの実施形態において、可変領域、例えば、以下の配列(抗体1114抗毒素B抗体;軽鎖可変領域配列)配列番号107を有する軽鎖可変領域が提供される:




ここで、CDRは下線を引かれている。

0140

配列番号107をコードするポリヌクレオチド配列は、図7及びその中の配列番号108において示される。

0141

1つの実施形態において、可変領域、例えば、以下の配列(抗体1114抗毒素B抗体重鎖可変領域配列)配列番号109を有する重鎖可変領域が提供される:




ここで、CDRは下線を引かれている。

0142

配列番号109をコードするポリヌクレオチド配列は、図7及びその中の配列番号110において示される。

0143

1つの実施形態において、本発明に従う抗体は、配列番号107及び配列番号109に示される可変領域を含む。

0144

1つの実施形態において、CDR、例えば以下から選択される1、2、3、4、5又は6つのCDRを含む抗体(例えば、抗毒素B抗体)が提供される:

0145

1つの実施形態において、配列111〜113が抗体の軽鎖にある。

0146

1つの実施形態において、配列114〜116が抗体の重鎖にある。

0147

1つの実施形態において、配列番号111はCDRL1であり、配列番号112はCDR L2であり、配列番号113はCDR L3である。

0148

1つの実施形態において、配列番号114はCDRH1であり、配列番号115はCDR H2であり、配列番号116はCDR H3である。

0149

1つの実施形態において、配列番号111はCDRL1であり、配列番号112はCDR L2であり、配列番号113はCDR L3であり、配列番号114はCDR H1であり、配列番号115はCDR H2であり、配列番号116はCDR H3である。

0150

1つの実施形態において、可変領域、例えば、以下の配列(抗体1114グラフト8抗毒素B抗体;軽鎖可変領域配列)配列番号117を有する軽鎖可変領域が提供される:




ここで、CDRは、下線を引かれている。

0151

配列番号117をコードするポリヌクレオチド配列は、図8及びその中の配列番号118において示される。

0152

1つの実施形態において、可変領域、例えば、以下の配列(抗体1114グラフト8抗毒素B抗体重鎖可変領域配列)配列番号119を有する重鎖可変領域が提供される:




ここで、CDRは下線を引かれている。

0153

配列番号119をコードするポリヌクレオチド配列は、図8及びその中の配列番号120において示される。

0154

1つの実施形態において、本発明に従う抗体は、配列番号117及び配列番号119に示される可変領域を含む。

0155

1つの実施形態において、CDR、例えば以下から選択される1、2、3、4、5又は6つのCDRを含む抗体(例えば、抗毒素B抗体)が提供される:

0156

1つの実施形態において、配列121〜123が抗体の軽鎖にある。

0157

1つの実施形態において、配列124〜126が抗体の重鎖にある。

0158

1つの実施形態において、配列番号121はCDRL1であり、配列番号122はCDR L2であり、配列番号123はCDR L3である。

0159

1つの実施形態において、配列番号124はCDRH1であり、配列番号125はCDR H2であり、配列番号126はCDR H3である。

0160

1つの実施形態において、配列番号121はCDRL1であり、配列番号122はCDR L2であり、配列番号123はCDR L3であり、配列番号124はCDR H1であり、配列番号125はCDR H2であり、配列番号126はCDR H3である。

0161

1つの実施形態において、可変領域、例えば、以下の配列(抗体1125抗毒素B抗体;軽鎖可変領域配列)配列番号127を有する軽鎖可変領域が提供される:




ここで、CDRは下線を引かれている。

0162

配列番号127をコードするポリヌクレオチド配列は、図8及びその中の配列番号128において示される。

0163

1つの実施形態において、可変領域、例えば、以下の配列(抗体1125抗毒素B抗体重鎖可変領域配列)配列番号129を有する重鎖可変領域が提供される:




ここで、CDRは下線を引かれている。

0164

1つの実施形態において、配列番号129の最後のアミノ酸(S)は、省かれる。

0165

配列番号129をコードするポリヌクレオチド配列は、図9及びその中の配列番号130において示される。
1つの実施形態において、最後のアミノ酸SをコードするコドンAGCは、省かれる。

0166

1つの実施形態において、本発明に従う抗体は、配列番号127及び配列番号129に示される可変領域を含む。

0167

1つの実施形態において、CDR、例えば以下から選択される1、2、3、4、5又は6つのCDRを含む抗体(例えば、抗毒素B抗体)が提供される:

0168

1つの実施形態において、配列131〜133は、抗体の軽鎖にある。

0169

1つの実施形態において、配列134〜136は、抗体の重鎖にある。

0170

1つの実施形態において、配列番号131はCDRL1であり、配列番号132はCDR L2であり、配列番号133はCDR L3である。

0171

1つの実施形態において、配列番号134はCDRH1であり、配列番号135はCDR H2であり、配列番号136はCDR H3である。

0172

1つの実施形態において、配列番号131はCDRL1であり、配列番号132はCDR L2であり、配列番号133はCDR L3であり、配列番号134はCDR H1であり、配列番号135はCDR H2であり、配列番号136はCDR H3である。

0173

1つの実施形態において、可変領域、例えば、以下の配列(抗体1129抗毒素B抗体;軽鎖可変領域配列)配列番号137を有する軽鎖可変領域が提供される:




ここで、CDRは下線を引かれている。

0174

配列番号137をコードするポリヌクレオチド配列は、図8及びその中の配列番号138において示される。

0175

1つの実施形態において、可変領域、例えば、以下の配列(抗体1129抗毒素B抗体重鎖可変領域配列)配列番号139を有する重鎖可変領域が提供される:




ここで、CDRは下線を引かれている。

0176

1つの実施形態において、配列番号139の最後のアミノ酸(S)は、省かれる。

0177

配列番号139をコードするポリヌクレオチド配列は、図8及びその中の配列番号140において示される。1つの実施形態において、最後のアミノ酸SをコードするコドンAGCは、省かれる。

0178

1つの実施形態において、本発明に従う抗体は、配列番号137及び配列番号139に示される可変領域を含む。

0179

1つの実施形態において、CDR、例えば以下から選択される1、2、3、4、5又は6つのCDRを含む抗体(例えば、抗毒素B抗体)が提供される:

0180

1つの実施形態において、配列141〜143が抗体の軽鎖にある。

0181

1つの実施形態において、配列144〜146が抗体の重鎖にある。

0182

1つの実施形態において、配列番号141はCDRL1であり、配列番号142はCDR L2であり、配列番号143はCDR L3である。

0183

1つの実施形態において、配列番号144はCDRH1であり、配列番号145はCDR H2であり、配列番号146はCDR H3である。

0184

1つの実施形態において、配列番号141はCDRL1であり、配列番号142はCDR L2であり、配列番号143はCDR L3であり、配列番号144はCDR H1であり、配列番号145はCDR H2であり、配列番号146はCDR H3である。

0185

1つの実施形態において、可変領域、例えば、以下の配列(抗体1134抗毒素B抗体;軽鎖可変領域配列)配列番号147を有する軽鎖可変領域が提供される:




ここで、CDRは下線を引かれている。

0186

配列番号147をコードするポリヌクレオチド配列は、図9及びその中の配列番号148において示される。

0187

1つの実施形態において、可変領域、例えば、以下の配列(抗体1134抗毒素B抗体重鎖可変領域配列)配列番号149を有する重鎖可変領域が提供される:




ここで、CDRは下線を引かれている。

0188

配列番号149をコードするポリヌクレオチド配列は、図9及びその中の配列番号150において示される。

0189

1つの実施形態において、本発明に従う抗体は、配列番号147及び配列番号149に示される可変領域を含む。

0190

1つの実施形態において、CDR、例えば、以下から選択される1、2、3、4、5又は6つのCDRを含む抗体(例えば、抗毒素B抗体)が提供される:

0191

1つの実施形態において、配列151〜153が抗体の軽鎖にある。

0192

1つの実施形態において、配列154〜156が抗体の重鎖にある。

0193

1つの実施形態において、配列番号151はCDRL1であり、配列番号152はCDR L2であり、配列番号153はCDR L3である。

0194

1つの実施形態において、配列番号154はCDRH1であり、配列番号155はCDR H2であり、配列番号156はCDR H3である。

0195

1つの実施形態において、配列番号151はCDRL1であり、配列番号152はCDR L2であり、配列番号153はCDR L3であり、配列番号154はCDR H1であり、配列番号155はCDR H2であり、配列番号156はCDR H3である。

0196

1つの実施形態において、可変領域、例えば、以下の配列(抗体1151抗毒素B抗体;軽鎖可変領域配列)配列番号157を有する軽鎖可変領域が提供される:




ここで、CDRは下線を引かれている。

0197

配列番号157をコードするポリヌクレオチド配列は、図9及びその中の配列番号158において示される。

0198

1つの実施形態において、可変領域、例えば、以下の配列(抗体1151抗毒素B抗体重鎖可変領域配列)配列番号159を有する重鎖可変領域が提供される:




ここで、CDRは下線を引かれている。

0199

配列番号159をコードするポリヌクレオチド配列は、図9及びその中の配列番号160において示される。

0200

1つの実施形態において、本発明に従う抗体は、配列番号157及び配列番号159に示される可変領域を含む。

0201

1つの実施形態において、CDR、例えば、以下から選択される1、2、3、4、5又は6つのCDRを含む抗体(例えば、抗毒素B抗体)が提供される:

0202

1つの実施形態において、配列161〜163が抗体の軽鎖にある。

0203

1つの実施形態において、配列164〜166が抗体の重鎖にある。

0204

1つの実施形態において、配列番号161はCDRL1であり、配列番号162はCDR L2であり、配列番号163はCDR L3である。

0205

1つの実施形態において、配列番号164はCDRH1であり、配列番号165はCDR H2であり、配列番号166はCDR H3である。

0206

1つの実施形態において、配列番号161はCDRL1であり、配列番号162はCDR L2であり、配列番号163はCDR L3であり、配列番号164はCDR H1であり、配列番号165はCDR H2であり、配列番号166はCDR H3である。

0207

1つの実施形態において、可変領域、例えば、以下の配列(抗体1153抗毒素B抗体;軽鎖可変領域配列)配列番号167を有する軽鎖可変領域が提供される:




ここで、CDRは下線を引かれている。

0208

配列番号167をコードするポリヌクレオチド配列は、図10及びその中の配列番号168において示される。

0209

1つの実施形態において、可変領域、例えば、以下の配列(抗体1153抗毒素B抗体重鎖可変領域配列)配列番号169を有する重鎖可変領域が提供される:




ここで、CDRは下線を引かれている。

0210

配列番号169をコードするポリヌクレオチド配列は、図10及びその中の配列番号170において示される。

0211

1つの実施形態において、本発明に従う抗体は、配列番号167及び配列番号169に示される可変領域を含む。

0212

1つの実施形態において、配列番号1、2、3、4、5、6、11、12、13、14、15、16、21、22、23、24、25、26、31、32、33、34、35、36、41、42、43、44、45、46、51、52、53、54、55、56、61、62、63、64、65、66、71、72、73、74、75、76、81、82、83、84、85、86、91、92、93、94、95、96、101、102、103、104、105、106、111、112、113、114、115、116、121,122、123、124、125、126、131、132、133、134、135、136、141、142、143、144、145、146、151、152、153、154、155、156、161、162、163、164、165及び166から独立して選択される6つのCDRを含む抗体が、提供される。

0213

1つの実施形態において、配列番号1、2、3、4、5、6、11、12、13、14、15、16、21、22、23、24、25、26、31、32、33、34、35、36、41、42、43、44、45、46、51、52、53、54、55及び56から独立して選択される6つのCDRを含む抗TcdA抗体が、提供される。

0214

1つの実施形態において、配列番号61、62、63、64、65、66、71、72、73、74、75、76、81、82、83、84、85、86、91、92、93、94、95、96、101、102、103、104、105、106、111、112、113、114、115、116、121、122、123、124、125、126、131、132、133、134、135、136、141、142、143、144、145、146、151、152、153、154、155、156、161、162、163、164、165及び166から独立して選択される6つのCDRを含む抗TcdB抗体が、提供される。

0215

1つの実施形態において、配列番号7、9、17、19、27、29、37、39、47、49、57、59、67、69、77、79、87、89、97、99、107、109、117、119、127、129、137、139、147、149、157及び159から独立して選択される2つの可変領域を含む抗体が、提供される。

0216

1つの実施形態において、配列番号7、9、17、19、27、29、37、39、47、49、57及び59から独立して選択される2つの可変領域を含む抗体が、提供される。

0217

1つの実施形態において、配列番号67、69、77、79、87、89、97、99、107、109、117、119、127、129、137、139、147、149、157及び159から独立して選択される2つの可変領域を含む抗体が、提供される。

0218

1つの実施形態において、本発明に従う抗体は、ヒト化されている。

0219

1つの実施形態において、この抗体(単数又は複数)は、TcdA及び/又はTcdB毒素のC末端「細胞結合」部分に対する。

0220

1つの実施形態において、本発明に従う抗体は、毒素A又は毒素Bを中和するために好適である。

0221

ここで使用される場合、中和するは、標的毒素の害のある/有害な効果の消滅又は低減、例えば関連の有害効果における少なくとも50%の低減を意味するものとする。

0222

本発明者らは、本願において発見された抗体間の内部比較を用いることによって、及び当該分野で十分に記載されている(Babcock et al. 2006; Lowy et al., 2010)抗体に対する比較を用いることによって、いくつかの抗体は、高い毒素濃度にあっても、有効な中和(例えば、低EC50及び高い%防御)を維持する望ましい特徴を有することを確立した。当該分野で記載されているものを含む他の抗体は、高い毒素濃度において有効な毒素中和を維持しない。

0223

有効な毒素濃度は、中和抗体非存在下で、滴定研究において「致死用量」(LD)として規定され得る。中和アッセイは、代表的に、完全細胞殺傷の50%のLD(すなわち、LD50)において行われるが、より厳密に、LD80において行われてもよい。

0224

アッセイは、かなり負荷の高い(challenging)条件、例えば、LD90、LD95及び/又はLDmax(LDmaxは、アッセイ容量及び最大毒素濃度/溶解度によって制約される、アッセイに含まれ得る最大毒素量である)においても、実施され得る。このようなアッセイは、腸におけるC.ディフィシレ増殖が激しく、下痢及び他の症状から毒素濃度がその最大にあるとの仮定に導かれる場合、ヒトの感染の初期段階模倣することを目的とする。高い毒素濃度条件下で毒素の損傷活性を有効に中和する抗体は、本発明者らによって、ヒト感染における症状を制御するために、特別な臨床的価値を有すると考えられる。1つの実施形態において、本開示の抗体(単数又は複数)は、1つ又は複数のLD80、LD90、LD95及び/又はLDmaxについて、有用な、例えば低EC50値及び/又は細胞死からの高い%防御を有する。1つの実施形態において、後者の条件の1つ又は複数におけるEC50は、15ng/ml以下、例えば10ng/ml以下、例えば5ng/ml以下、詳細には1ng/ml以下である。1つの実施形態において、細胞死からの%防御は、90%を超えるか、又は75%を超えるか、又は50%を超える。

0225

従って、1つの実施形態において、本開示は、例えばここで提供されるアッセイで測定されるように、高レベルの毒素の存在下であっても、毒素中和を維持する抗体又は抗体の組み合わせを提供する。

0226

毒素の有害効果は、例えば、好適なインビトロアッセイにおいて測定され得る。1つの実施形態において、中和は、以下の例1に示されるアッセイにおいて測定される。中和アッセイにおいて同定される抗体(単数又は複数)、例えば、抗体の力価が高レベルの毒素の存在下において維持される抗体もまた、提供される。

0227

毒素Aは、TcdAと相互交換可能に使用される。

0228

毒素Bは、TcdBと相互交換可能に使用される。

0229

1つの実施形態において、本発明に従う抗体は、モノクローナル抗体又はその結合断片である。

0230

1つの実施形態において、本発明に従うモノクローナル抗体は、非常に高い力価及び親和性で、TcdAを中和できる。

0231

1つの実施形態において、本発明に従うモノクローナル抗体は、非常に高い力価及び親和性並びに高い結合活性で、TcdAを中和できる。

0232

ここで使用される場合、結合活性は、複数の結合親和性の複合強度を意味する。

0233

1つの実施形態において、本発明に従うモノクローナル抗体は、非常に高い力価及び親和性並びに高い結合活性及び高い結合価で、TcdAを中和できる。

0234

ここで使用される場合、結合価は、モノクローナル抗体が抗原に複数回結合する能力を意味する。従って、高い結合価は、抗原の抗体による高レベルの修飾及び/又は毒素分子の高レベルの架橋をもたらし、これは、有利であると考えられる。

0235

本開示に従う抗TcdA Mabは、TcdAの早期効果、例えばタイトジャンクションの喪失などの細胞に対する早期効果を中和するために好適であり得る。

0236

ここで使用されるタイトジャンクションは、単層又は解剖学的組織構造内の細胞間の結合の不透過性領域を意味するものとする。タイトジャンクションがその構造的及び機能的な完全性を保持している場合、体液喪失は起こらない。タイトジャンクションの喪失は、細胞が毒素によって損なわれていることの指標であり、TcdA及びTcdBの毒性効果における早期段階であることが十分に記載されていて(25)、血清、免疫グロブリン及びイオンを含む体液の喪失をもたらす(26、3)。タイトジャンクションの喪失は、ヒトにおける下痢の発症第一段階と考えられている。

0237

TEERアッセイ系は、インビトロでタイトジャンクションの喪失を測定するために使用され得る。TEERは、経上皮電気抵抗アッセイの頭字語であり、一般に、胃内皮壁に代表される分化した細胞層透過性を測定するために使用される。しかし、抗体についてのスクリーニング文脈において、TEER喪失は、タイトジャンクションに対する損傷を減速するか又は予防する抗体を同定するために使用され得、従って、下痢をもたらす組織損傷に対する防御のための代理物である。

0238

しばしば、Caco−2が使用される。何故なら、これらは、ヒト結腸細胞に由来し、タイトジャンクションによって結合する細胞による分化した単層を形成することが公知であるからである。キットは、Becton−Dickinsonより、Caco−2 BioCoatHTプレートシステム(BD Biosciences/354802)の名称で市販されている。キット中の指示は、この状況において試験するために好適である。膜の抵抗は、膜が損なわれている場合に変化する。

0239

一般に、抗体は、TEER系に添加される前に毒素と共にプレインキュベートされ、抗体が毒素によって引き起こされる膜に対する損傷を予防又は減速し得るかどうかを確立される。アッセイは、好適な期間、例えば24時間にわたって実施され得、特定の時点で測定を行う。本発明者らは、4時間の時点で、治療的に有用な抗体が特に識別されることを確立している。TEERアッセイにおいて使用される毒素の濃度は、一般に、100〜200ng/mlの範囲内であり、最も好ましくは、125ng/mlである。

0240

TEERアッセイにおいて使用される抗体(例えば、IgG1)の濃度は、一般に、4〜2000ng/ml、例えば50〜1000ng/ml、例えば100〜500ng/mlの範囲内である。

0241

1つの実施形態において、前記条件において使用されるTEERアッセイにおける抗体のEC50は、少なくとも200ng/ml、例えば100ng/ml未満、例えば約60〜80ng/mlである。

0242

1つの実施形態において、C.ディフィシレ感染の処置又は予防における治療剤としての使用のために好適な抗TcdA抗体又は抗TcdB抗体が提供され、ここで、前記抗体は、TEERアッセイを使用してスクリーニングされ、そして選択される。

0243

1つの局面において、TEERアッセイにおいて、タイトジャンクションの喪失を減速するか又は予防する能力について抗体をスクリーニングする方法が、提供される。1つの実施形態において、スクリーニングされる抗体(単数又は複数)は、抗TcdA抗体である。1つの実施形態において、スクリーニングされる抗体(単数又は複数)は、抗TcdB抗体である。1つの実施形態において、スクリーニングされる抗体(単数又は複数)は、抗TcdA抗体と抗TcdB抗体との組み合わせである。1つの実施形態において、この方法は、適切な抗体(単数又は複数)を同定し、その好適な量を発現する工程を含む。1つの実施形態において、この方法は、前記抗体(単数又は複数)を医薬製剤に製剤化するさらなる工程を含む。1つの実施形態において、この方法は、前記抗体(単数又は複数)又は前記製剤を、それを必要とする患者に投与するさらなる工程を含む。

0244

1つの実施形態において、本開示の複数の抗体は、標的毒素(TcdA又はTcdB)に対して結合可能であってもよく、これは、この毒素の免疫クリアランスを補助し得る。

0245

ここで使用される複数の抗体は、同じ配列を有する抗体の複数のコピー、又は同じアミノ酸配列を有する抗体、又は異なるアミノ酸配列を有するが同じ標的抗原に対して特異的な抗体を意味するものとする。

0246

1つの実施形態において、本発明に従う抗体は、標的抗原に対して特異的であり例えば、標的抗原におけるエピトープに対して特異的である。

0247

1つの実施形態において、本発明の抗体は、2つ以上の位置、例えば2つ若しくは3つの位置、例えば、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10以上の位置で標的抗原に結合することができる。例えば、毒素は、反復ドメインを含み得、従って、抗体は、エピトープに対して特異的であり得、実際に、エピトープは、抗原において数回、すなわち、1つ以上の位置で、存在し得る。従って、所定の抗体は、同じエピトープに複数回、抗原における異なる位置で結合し得る。

0248

1つの実施形態において、抗体は、所定の抗原に、複数回、例えば、2〜20回、例えば、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15又は16回結合する。1つの実施形態において、抗体は、所定の抗原に、少なくとも3回結合する。この複数回結合は、毒素の中和及び/又はクリアランスに重要であると考えられる。理論に縛られることを望まないが、複数回、例えば3回以上の、すなわち、3以上のFc断片による修飾による結合は、主に肝臓及び脾臓を介した(27、28)毒素の迅速なクリアランスの引き金を引くために重要である(24)。

0249

1つの実施形態において、抗TcdA抗体は、3回以上、例えば3〜16回結合する。

0250

1つの実施形態において、抗TcdA抗体は、12回結合する。

0251

1つの実施形態において、抗TcdA抗体は、2回結合する。

0252

1つの実施形態において、抗TcdA抗体は、TcdAの触媒末端細胞結合ドメインにおいて結合する。

0253

1つの実施形態において、抗TcdB抗体は、2回以上、例えば2回結合する。

0254

1つの実施形態において、抗TcdB抗体は、TcdBの触媒末端細胞結合ドメインにおいて結合する。

0255

1つの実施形態において、本開示に従う抗体(単数又は複数)は、毒素分子を架橋することができ、例えば、抗体分子の1つの腕が、1つの毒素分子に結合し、そして抗体の別の腕が、異なる毒素分子におけるエピトープに結合し、それによって、1種の免疫複合体を形成する。後者の形成はまた、免疫系の活性化を促進して関連の毒素を除去させ、それによってこの毒素の有害なインビボ効果を最小化することもできる。

0256

1つの実施形態において、生来免疫応答、例えば補体が、活性化される。

0257

1つの実施形態において、本開示の抗体(単数又は複数)は、異なるリボタイプの株、例えば003、027、078に由来する毒素に対する高い力価を有する。

0258

1つの実施形態において、TcdAに対する抗体は、例えば、リボタイプ003、027及び078の株由来の毒素に対し、LD80〜95の毒素濃度において、0.1〜100ng/ml、例えば1〜10ng/mlの範囲内のEC50、及び50〜100%の範囲内の最大阻害を有し得る。

0259

1つの実施形態において、TcdAに対する抗体は、例えば、リボタイプ003、027及び078の株由来の毒素に対し、LD80〜95の毒素濃度において、0.1〜100ng/ml、例えば1〜10ng/mlの範囲内のEC50、及び60〜100%、70〜100%、80〜100%又は90〜100%の範囲内の最大阻害を有し得る。

0260

1つの実施形態において、TcdBに対する抗体は、例えば、リボタイプ003の株由来の毒素に対し、LD80〜95の毒素濃度において、0.1〜100ng/ml、例えば1〜10ng/mlの範囲内のEC50、及び50〜100%の範囲内の最大阻害を有し得る。

0261

1つの実施形態において、TcdBに対する抗体は、例えば、リボタイプ003の株由来の毒素に対し、LD80〜95の毒素濃度において、0.1〜100ng/ml、例えば1〜10ng/mlの範囲内のEC50、及び60〜100%、70〜100%、80〜100%又は90〜100%の範囲内の最大阻害を有し得る。

0262

1つの実施形態において、本発明に従う抗体の組み合わせ、例えばTcdAに特異的な抗体の組み合わせ、TcdBに特異的な抗体の組み合わせ、又はTcdAに特異的な抗体とTcdBに特異的な抗体との組み合わせが提供される。

0263

TcdAに特異的な抗体の組み合わせは、一般に、標的抗原TcdA上の異なるエピトープに対する抗体の組み合わせ、又は少なくとも異なる結合特性を有する抗体の組み合わせを意味する。

0264

TcdBに特異的な抗体の組み合わせは、一般に、標的抗原TcdB上の異なるエピトープに対する抗体の組み合わせ、又は少なくとも異なる結合特性を有する抗体の組み合わせを意味する。

0265

組み合わせは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14又は15の別個の抗体、例えば2、3、4又は5の抗体を含み得る。

0266

1つの実施形態において、1つの抗TcdA抗体と2つの抗TcdB抗体の組み合わせ、例えば、抗TcdA抗体が997であり、抗TcdB抗体が1125及び1151である組み合わせが提供される。

0267

詳細には、配列番号49に示される配列を有する重鎖可変領域及び配列番号47に示される配列を有する軽鎖可変領域を含む1つの抗TcdA抗体と、配列番号129に示される重鎖可変領域及び配列番号127に示される軽鎖可変領域を有する第1の抗体並びに配列番号159に示される重鎖可変領域及び配列番号157に示される軽鎖可変領域を有する第2の抗体の2つの抗TcdB抗体との組み合わせが、提供される。

0268

ここで使用される場合、別個の抗体は、標的抗原上の同じエピトープ又は異なるエピトープに結合し得る異なるアミノ酸配列を有する抗体を意味するものとする。

0269

また、本発明によって提供される抗体、詳細には配列番号49に示される重鎖配列及び配列番号47に示される軽鎖配列を含む抗体によって結合される、TcdAの特異的領域又はエピトープが、本発明によって提供される。

0270

また、本発明によって提供される抗体、詳細には配列番号129に示される重鎖配列及び配列番号127に示される軽鎖配列を含む抗体、又は配列番号159に示される重鎖配列及び配列番号157に示される軽鎖配列を含む抗体によって結合される、TcdBの特異的領域又はエピトープが、本発明によって提供される。

0271

TcdA若しくはTcdB毒素のこの特異的領域又はエピトープは、本発明によって提供される抗体の任意の1つと組み合わせた当該分野で公知の任意の好適なエピトープマッピング方法によって同定され得る。このような方法の例としては、毒素に由来する種々の長さのペプチドを、本発明の抗体への結合について、この抗体によって認識されるエピトープの配列を含む抗体に特異的に結合し得る最小の断片によってスクリーニングすることが挙げられる。ペプチドは、合成的に生成されても、毒素ポリペプチドタンパク質分解消化によって生成されてもよい。抗体に結合するペプチドは、例えば、質量分析によって同定され得る。別の例において、NMR分光学又はX線結晶学が、本発明の抗体によって結合されるエピトープを同定するために使用され得る。一旦同定されると、本発明の抗体に結合するこのエピトープ断片は、必要である場合、同じエピトープに結合するさらなる拮抗性の抗体を得るための免疫原として使用され得る。

0272

本発明に従う抗体の結合を交差遮断する抗体は、同様に、毒素活性を中和する際に有用であり得る。従って、本発明はまた、TcdA又はTcdBに対する特異性を有する、TcdA若しくはTcdBに対する上記の抗体のいずれか1つの結合を交差遮断するか、及び/又はこれらの抗体のいずれか1つによってこれらの毒素の結合から交差遮断される中和抗体を提供する。1つの実施形態において、このような抗体は、ここで上記された抗体と同じエピトープに結合する。別の実施形態において、交差遮断する中和抗体は、ここで上記される抗体によって結合されるエピトープと境を接するか及び/又は重複するエピトープに結合する。別の実施形態において、本発明のこの局面の交差遮断する中和抗体は、本発明の抗体と同じエピトープ、又は前記エピトープと境を接するか及び/若しくは重複するエピトープに結合しない。

0273

交差遮断する抗体は、当該分野で好適な任意の方法、例えば、競合ELISA又はBIAcoreアッセイ(ここでは、交差遮断する抗体のTcdA又はTcdBに対する結合が、本発明の抗体の結合によって防止されるか、又はその逆である)を用いて同定され得る。

0274

1つの実施形態において、抗TcdA又は抗TcdB抗体、詳細には、中和抗体及び/又はここで記載される抗体の結合を交差遮断する抗体を作製する方法が提供され、前記方法は、好適な抗原、例えば配列番号173〜194のいずれか1つに示される抗原又はこれらの組み合わせによって、宿主を免疫化する工程を含む。前記方法はまた、1つ又は複数の以下の工程を含む:例えば、目的の抗体を同定する工程(詳細には、機能的アッセイ、例えばTEERアッセイを用いる)、目的の抗体を発現する工程、及び必要に応じて、この抗体を薬学的に許容可能な組成物として製剤化する工程。

0275

従って、1つの局面において、本開示は、配列番号173〜194に示されるアミノ酸配列又はこれらの組み合わせによって宿主を免疫化する方法を提供する。

0276

1つの実施形態において、本発明に従う抗体は、標的抗原に対し、10nM以下、例えば1nM以下、例えば900pM、詳細には800pM、700pM、600pM又は500pM、例えば60pMの親和性を有する。

0277

1つの実施形態において、親和性は、TcdA若しくはTcdB又はこれらの断片についてである。1つの例において、この断片は、TcdAの残基S1827〜D2249に対応するTcdA123である。1つの例において、この断片は、残基G2205〜R2608に対応するTcdA456である。1つの実施形態において、この断片は、TcdBの残基S1833〜E2366に対応するTcdB1234である。

0278

1つの実施形態において、本発明に従う抗体又はその組み合わせは、200ng/ml以下、例えば150ng/ml以下、例えば100ng/ml以下、例えば0.1〜10ng/mlの範囲内のEC50を有する。

0279

混合物の個々の構成要素抗体は、これらが、1つ又は複数の抗体と組み合わせて使用される場合に、この組み合わせが前記範囲内のEC50を有する限り、前記範囲内のEC50を有することが必須ではない。

0280

有利にも、本発明の抗体は、安定的であり、例えば、50℃を超える温度、例えば60℃又は70℃において熱安定性である。

0281

本発明に従う抗体及び組み合わせはまた、1つ又は複数の以下の有利な特性を有する:遅いオフレート、高い親和性、高い力価、標的抗原に複数回結合する能力、測定可能なTEER活性の喪失を低下するメカニズムにより毒素を中和すること、宿主天然免疫応答を刺激するか若しくは補助すること、病原(又は毒素)の免疫クリアランスを触媒するか若しくは補助すること、及び/又は病原(又は毒素)に対して適切に応答するよう免疫系を教育すること。

0282

抗体可変ドメインにおける残基は、従来、Kabatらによって考案されたシステムに従って番号付けられる。このシステムは、Kabat et al., 1987, in Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA(以後「Kabatら(前出)」)に記載される。この番号付けシステムは、そうでないと示されない限り、本明細書中で使用される。

0283

Kabat残基名称は、アミノ酸残基直鎖番号付けと必ずしも直接対応しない。実際の直鎖アミノ酸配列は、基本的可変ドメイン構造のフレームワーク又は相補性決定領域(CDR)のいずれにせよ、構造的構成要素の短縮又はそれへの挿入に対応する厳密なKabat番号付けにおけるよりも、より少ないか又は追加のアミノ酸を含み得る。残基の正確なKabat番号付けは、「標準的」Kabat番号付けをされた配列を有する抗体の配列における残基の相同性アラインメントにより、所定の抗体について決定され得る。

0284

重鎖可変ドメインのCDRは、Kabat番号付けシステムに従って、残基31〜35(CDR−H1)、残基50〜65(CDR−H2)及び残基95〜102(CDR−H3)に位置する。しかし、Chothiaに従うと、(Chothia, C. and Lesk, A.M. J. Mol. Biol., 196, 901-917 (1987))、CDR−H1と同等のループは、残基26から残基32まで延びる。従って、そうでないと示されない限り、「CDR−H1」は、ここで使用される場合、Kabat番号付けシステム及びChothiaトポロジカルループ定義の組み合わせによって記載されるように、残基26〜35を意味するものとする。

0285

軽鎖可変ドメインのCDRは、Kabat番号付けシステムに従って、残基24〜34(CDR−L1)、残基50〜56(CDR−L2)及び残基89〜97(CDR−L3)に位置する。

0286

本発明における使用のための抗体は、当該分野で公知の任意の好適な方法を用いて得ることができる。融合タンパク質、例えば毒素−Fc融合タンパク質を含む毒素A及び/又は毒素Bポリペプチド/タンパク質又はポリペプチド(例えば、活性化T細胞)を(組換え的に又は天然で)発現する細胞は、標的毒素を特異的に認識する抗体を生成するために使用され得る。毒素ポリペプチドは、完全長ポリペプチド又はその生物学的に活性な断片若しくは誘導体であり得る。

0287

ポリペプチドは、当該分野で周知のプロセスによって、発現系を含む遺伝子操作された宿主細胞から調製され得るか、又はこれらは、天然の生物学的供給源から回収され得る。本願において、用語「ポリペプチド」は、ペプチド、ポリペプチド及びタンパク質を含む。これらは、そうでないと特定されない限り、相互交換可能に使用される。リボタイプ027由来のTcdAについての配列は、配列番号171(Uniprot受託番号C9YJ37)において示され、そしてリボタイプ027由来のTcdBについての配列は、配列番号172(Uniprot受託番号C9YJ35)において示される。

0288

抗原ポリペプチドは、いくつかの場合、例えばアフィニティタグに融合した融合タンパク質などのより大きなタンパク質の一部であってもよい。

0289

抗原ポリペプチドに対して作製された抗体は、動物の免疫化が必要な場合に、ポリペプチドを動物、好ましくは非ヒト動物に、周知且つ慣用的プロトコール(例えば、Handbook of Experimental Immunology, D. M. Weir (ed.), Vol 4, Blackwell Scientific Publishers, Oxford, England, 1986を参照されたい)を用いて投与することによって得ることができる。多くの温血動物、例えばウサギマウスラットヒツジ雌ウシラクダ又はブタが、免疫化される。しかし、マウス、ウサギ、ブタ及びラットが、一般に最も好適である。

0290

モノクローナル抗体は、当該分野で公知の任意の方法、例えばハイブリドーマ技術(Kohler & Milstein, 1975, Nature, 256:495-497)、トリオーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術(Kozbor et al., 1983, Immunology Today, 4:72)及びEBV−ハイブリドーマ技術(Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp77-96, Alan R Liss, Inc., 1985)によって調製され得る。

0291

本発明における使用のための抗体はまた、特異的抗体の生成のために選択された一リンパ球から作製された免疫グロブリン可変領域cDNAクローニング及び発現によって、例えば、Babcook, J. et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(15):7843-7848l;WO92/02551;WO2004/051268及び国際特許出願番号WO2004/106377によって記載された方法により、一リンパ球抗体方法を用いて作製され得る。

0292

ヒト化抗体(CDRグラフト抗体を含む)は、非ヒト種由来の1つ又は複数の相補性決定領域(CDR)及びヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する抗体分子である(例えば、US5,585,089号;WO91/09967を参照されたい)。完全なCDRよりもむしろCDRの特異性決定残基を移す必要があるのみであり得ることが、理解される(例えば、Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25-34を参照されたい)。ヒト化抗体は、必要に応じて、CDRが由来するところの非ヒト種由来の1つ又は複数のフレームワーク残基をさらに含み得る。

0293

ここで使用される場合、用語「ヒト化抗体分子」は、重鎖及び/又は軽鎖が、アクセプター抗体(例えば、ヒト抗体)の重鎖及び/又は軽鎖可変領域フレームワーク内にグラフトされたドナー抗体(例えば、マウスモノクローナル抗体)由来の1つ又は複数のCDR(所望される場合、1つ又は複数の改変CDRを含む)を含む、抗体分子を意味する。概説のために、Vaughan et al, Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998を参照されたい。1つの実施形態において、完全なCDRが移されるよりもむしろ、ここで上述されたCDRの任意の1つ由来の1つ又は複数の特異性決定残基のみが、ヒト抗体フレームワークに移される(例えば、Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25-34を参照されたい)。1つの実施形態において、ここで上述されたCDRの1つ又は複数に由来する特異性決定残基のみが、ヒト抗体フレームワークに移される。別の実施形態において、ここで上述されたCDRのそれぞれに由来する特異性決定残基のみが、ヒト抗体フレームワークに移される。

0294

CDR又は特異性決定残基がグラフトされた場合、任意の適切なアクセプター可変領域フレームワーク配列が、CDRが由来するところのドナー抗体のクラス/タイプに関連して使用され得る(マウス、霊長類及びヒトフレームワーク領域を含む)。好適には、本発明に従うヒト化抗体は、ヒトアクセプターフレームワーク領域及びここで提供された1つ又は複数のCDRを含む可変ドメインを有する。

0295

従って、1つの実施形態において、毒素A又は毒素Bに結合するヒト化抗体が提供され、ここで、可変ドメインは、ヒトアクセプターフレームワーク領域及び非ヒトドナーCDRを含む。

0296

本発明において使用され得るヒトフレームワークの例は、KOL、NEWM、REI、EU、TUR、TEI、LAY及びPOMである(Kabatら、前出)。例えば、KOL及びNEWMは、重鎖のために使用され得、REIは、軽鎖のために使用され得、そしてEU、LAY及びPOMは、重鎖及び軽鎖の両方のために使用され得る。或いは、ヒト生殖細胞配列が、使用されてもよい;これらは、http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/において利用可能である。

0297

本発明のヒト化抗体において、アクセプター重鎖及びアクセプター軽鎖は、同じ抗体由来である必要は必ずしもなく、そして、所望される場合、異なる鎖由来のフレームワーク領域を有する混成鎖を含んでもよい。

0298

また、本発明のヒト化抗体において、フレームワーク領域は、アクセプター抗体の配列と正確に同じ配列を有さなくてもよい。例えば、稀な残基は、アクセプター鎖クラス又はタイプにより頻繁に出現する残基に変更されてもよい。或いは、アクセプターフレームワーク領域において選択された残基は、ドナー抗体の同じ位置で見出される残基に対応するように変更されてもよい(Reichmann et al., 1998, Nature, 332, 323-324を参照されたい)。このような変更は、ドナー抗体の親和性を回復するために必要な最小限に留められるべきである。アクセプターフレームワーク領域において変更する必要のある残基を選択するためのプロトコールは、WO91/09967に記載される。

0299

一般に、本明細書中に開示される抗体配列は、ヒト化される。

0300

本発明はまた、ここで開示される配列又は抗体に80%、90%、91%、92%、93% 94%、95% 96%、97%、98%又は99%類似する配列も提供する。

0301

ここで使用される場合、「同一性」は、並べられた配列における、任意の特定の位置で、アミノ酸残基が配列間で同一であることを示す。「類似性」は、ここで使用される場合、並べられた配列における、任意の特定の位置で、アミノ酸残基が配列間で類似の型であることを示す。例えば、ロイシンは、イソロイシン又はバリン置換され得る。しばしば互いに置換され得る他のアミノ酸としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:
フェニルアラニンチロシン及びトリプトファン芳香族側鎖を有するアミノ酸);
リシンアルギニン及びヒスチジン塩基性側鎖を有するアミノ酸);
アスパラギン酸及びグルタミン酸酸性側鎖を有するアミノ酸);
アスパラギン及びグルタミンアミド側鎖を有するアミノ酸);及び
システイン及びメチオニン硫黄含有側鎖を有するアミノ酸)。
同一性及び類似性の程度は、容易に計算され得る(Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988;Biocomputing. Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993;Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994;Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987, Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991、NCBIから入手可能なBLAST商標ソフトウェア(Altschul, S.F. et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410;Gish, W. & States, D.J. 1993, Nature Genet. 3:266-272. Madden, T.L. et al., 1996, Meth. Enzymol. 266:131-141;Altschul, S.F. et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402;Zhang, J. & Madden, T.L. 1997, Genome Res. 7:649-656)。

0302

本発明の抗体分子としては、完全長の重鎖及び軽鎖を有する完全抗体分子又はその断片が挙げられ、限定されないが、Fab、改変Fab、Fab’、改変Fab’、F(ab’)2、Fv、Fab−Fv、Fab−dsFv、一ドメイン抗体(例えば、VH又はVL又はVHH)、scFv、二価抗体三価抗体若しくは四価抗体、ビス−scFv、ディアボディ、トリアボディ、テトラボディ及び上記の任意のエピトープ結合断片であってもよい(例えば、Holliger and Hudson, 2005、Nature Biotech. 23(9):1126-1136;Adair and Lawson, 2005, Drug Design Reviews - Online 2(3), 209〜217を参照されたい)。これらの抗体断片を作り、製造するための方法は、当該分野で周知である(例えば、Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181を参照されたい)。本発明における使用のための他の抗体断片としては、国際特許出願WO2005/003169、WO2005/003170及びWO2005/003171に記載されるFab断片及びFab’断片が挙げられる。多価抗体は、複数の特異性を、例えば二重特異性を含んでいてもよく、又は一重特異性であってもよい(例えば、WO92/22853及びWO05/113605を参照されたい)。二重特異性及び多特異性抗体改変体は、この例において、2つの独立した標的タンパク質:TcdA及びTcdBを中和することが目的であるので、特に考慮される。ここで開示される抗体由来の可変領域は、TcdA及びTcdBに結合し中和可能である1つの抗体改変体を生成する様式で構成され得る。

0303

1つの実施形態において、本開示に従う抗体は、例えば、WO2009/040562に記載されるように、免疫グロブリング部分、例えばFab又はFab’断片及びこれらに直接的に又は間接的に連結する1つ又は2つの一ドメイン抗体(dAb)を含む、TcdA又はTcdB結合抗体融合タンパク質として提供される。

0304

1つの実施形態において、融合タンパク質は、例えば、WO2010/035012に記載されるように、例えば、ジスルフィド結合で必要に応じて連結した可変重鎖(VH)及び可変軽鎖(VL)対などの二ドメイン抗体を含む。

0305

1つの実施形態において、融合タンパク質のFab又はFab’エレメントは、一ドメイン抗体(単数又は複数)に対して同一又は類似の特異性を有する。1つの実施形態において、Fab又はFab’は、一ドメイン抗体(単数又は複数)に対して異なる特異性を有し、すなわち、この融合タンパク質は、多価である。1つの実施形態において、本発明に従う多価融合タンパク質は、アルブミン結合部位を有し、例えば、その中のVH/VL対が、アルブミン結合部位を提供する。

0306

1つの実施形態において、本発明に従う多価融合タンパク質はTcdA及びTcdBに結合する。

0307

1つの実施形態において、本発明に従う多価融合タンパク質は、複数の位置でTcdBに結合し、例えば、2つの異なるエピトープに特異的な別個の結合領域を有する。

0308

本発明の抗体分子の定常領域ドメインは、存在する場合、抗体分子の提唱された機能、詳細には、必要とされ得るエフェクター機能に関して選択され得る。例えば、定常領域ドメインは、ヒトIgAIgDIgE、IgG又はIgMドメインであり得る。詳細には、特にIgG1及びIgG3イソ型のヒトIgG定常領域ドメインは、抗体分子が治療的使用のために企図され、そして抗体エフェクター機能が必要とされる場合に、使用され得る。或いは、IgG2及びIgG4イソ型は、抗体分子が治療目的を企図され、そして抗体エフェクター機能が必要とされない場合、例えば、単に抗原を中和するか又はアゴナイズすることを企図される場合に、使用され得る。これらの定常領域ドメインの配列改変体も使用され得ることが、理解される。例えば、Angal et al., Molecular Immunology, 1993, 30 (1), 105-108に記載されるように241位のセリンプロリンに変更されているIgG4分子が、使用され得る。抗体は、種々の翻訳後修飾を受け得ることもまた、当業者によって理解される。これらの修飾の型及び程度は、多くの場合、抗体を発現するために使用される宿主細胞系並びに培養条件に依存する。このような修飾は、グリコシル化、メチオニン酸化ジケトピペラジン形成、アスパラギン酸異性化及びアスパラギン脱アミド化における変種を含み得る。頻繁な修飾は、カルボキシペプチダーゼの作用によるカルボキシ末端塩基性残基(例えば、リシン又はアルギニン)の欠失である(Harris, RJ. Journal of Chromatography 705:129-134, 1995に記載される通りである)。

0309

1つの実施形態において、抗体重鎖は、CH1ドメインを含み、抗体軽鎖は、κ又はλのいずれかのCLドメインを含む。

0310

生物学的分子、例えば抗体又は断片は、酸性及び/又は塩基性官能基を含み、それによって、総合的に正又は負に荷電する分子を生じる。全体の「観察された」電荷の量は、実体の絶対アミノ酸配列、3D構造における荷電した基の局所的環境及びこの分子の環境条件に依存する。等電点(pI)は、特定の分子又はその溶媒接近可能表面が総合的な電荷を保有しないpHである。1つの例において、本発明の抗体及び断片は、適切な等電点を有するように操作され得る。このことは、より強固な特性、詳細には、好適な溶解度及び/又は安定性プロフィール及び/又は改善された精製特徴を有する抗体及び/又は断片をもたらし得る。

0311

従って、1つの局面において、本発明は、由来する元々同定された抗体とは異なる等電点を有するように操作されたヒト化抗体を提供する。抗体は、例えば、アミノ酸残基を置き換える、例えば酸性アミノ酸残基を1つ又は複数の塩基性アミノ酸残基と置き換えることによって操作され得る。或いは、塩基性アミノ酸残基が導入され得るか、又は酸性アミノ酸残基が除去され得る。或いは、分子が受容できない高いpI値を有する場合、必要とされる場合に酸性残基が導入されて、pIを下げる。pIを操作する場合に、抗体又は断片の望ましい活性を保持することに留意するべきであることが、重要である。従って、1つの実施形態において、操作された抗体又は断片は、「未修飾の」抗体又は断片と同じ又は実質的に同じ活性を有する。

0312

例えば、** ExPASY http://www.expasy.ch/tools/pi_tool.html、及びhttp://www.iut-arles.up.univ-mrs.fr/w3bb/d_abim/compo-p.htmlなどのプログラムが、抗体又は断片の等電点を予測するために使用され得る。

0313

本発明によって提供される抗体の親和性は、当該分野で公知の任意の好適な方法を用いて変えることができることが理解される。抗体又はその改変体の親和性は、適切な単離された天然のタンパク質又は組換えタンパク質又は好適な融合タンパク質/ポリペプチドを用いるBIAcoreを含む、当該分野で公知の任意の好適な方法を用いて測定され得る。

0314

従って、本発明はまた、適切な場合にTcdA又はTcdBについての改善された親和性を有する本発明の抗体分子の改変体に関する。このような改変体は、CDRの(Yang et al., J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995)、鎖シャッフリング(Marks et al., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992)、大腸菌(E.coli)の突然変異誘発株の使用(Low et al., J. Mol. Biol., 250, 359-368, 1996)、DNAシャッフリング(Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997)、ファージディスプレイ(Thompson et al., J. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996)及び性PCR(Crameri et al., Nature, 391, 288-291, 1998)を含む多くの親和性成熟プロトコールによって得ることができる。Vaughanら(前出)は、これらの親和性成熟の方法を議論する。

0315

この文脈においてここで使用される場合、改善された親和性は、開始分子をしのぐ改善を意味する改善を意味する。

0316

所望される場合、本発明における使用のための抗体は、1つ又は複数のエフェクター分子コンジュゲートされ得る。エフェクター分子は、1つのエフェクター分子、又は、連結して本発明の抗体に結合し得る1つの部分を形成する2以上のこのような分子を含み得ることが、理解される。エフェクター分子に連結した抗体断片を得ることが所望される場合、これは、抗体断片がエフェクター分子に直接的に連結するか又はカップリング剤を介して連結する、標準的化学的手順又は組換えDNA手順によって調製され得る。このようなエフェクター分子を抗体にコンジュゲートするための技術は、当該分野で周知である(Hellstrom et al., Controlled Drug Delivery, 2nd Ed., Robinson et al., eds., 1987, pp. 623-53;Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev., 62:119-58及びDubowchik et al., 1999, Pharmacology and Therapeutics, 83, 67-123を参照されたい)。詳細な化学的手順としては、例えば、WO93/06231、WO92/22583、WO89/00195、WO89/01476及びWO03031581に記載されるものが挙げられる。或いは、エフェクター分子がタンパク質又はポリペプチドである場合、連結は、例えばWO86/01533及びEP0392745に記載されるように、組換えDNA手順を用いて達成され得る。

0317

用語エフェクター分子は、ここで使用される場合、例えば、生物学的に活性なタンパク質、例えば酵素、他の抗体又は抗体断片、合成又は天然に存在するポリマー核酸及びその断片、例えばDNA、RNA及びその断片、放射性核種、特に放射性ヨウ化物放射性同位体キレート化金属、ナノ粒子及びNMR若しくはESR分光学によって検出され得る蛍光化合物のようなレポーター基が挙げられる。

0318

他のエフェクター分子は、111In及び90Y、Lu177、ビスマス213、カリフォルニウム252、イリジウム192及びタングステン188/レニウム188などのキレート化放射性核種;又はアルキルホスホコリントポイソメラーゼインヒビタータキソイド及びスラミンなどであるがこれらに限定されない薬物を含み得る。

0319

他のエフェクター分子としては、タンパク質、ペプチド及び酵素が挙げられる。目的の酵素としては、タンパク質分解酵素ヒドロラーゼリアーゼイソメラーゼトランスフェラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。目的のタンパク質、ポリペプチド及びペプチドとしては、免疫グロブリン、アブリン、リシンA、シュードモナス外毒素、又はジフテリア毒素などの毒素、インスリン腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経増殖因子血小板由来増殖因子又は組織プラスミノゲンアクチベーター血栓剤又は抗血管形成剤、例えばアンギオスタチン若しくはエンドスタチン、又はリンホカインインターロイキン−1(IL−1)、インターロイキン−2(IL−2)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子GMCSF)、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)、神経増殖因子(NGF)又は他の増殖因子などの生物学的応答改変因子並びに免疫グロブリンなどのタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。

0320

他のエフェクター分子は、例えば診断のために有用な、検出可能な物質を含み得る。検出可能な物質の例としては、種々の酵素、補欠分子族蛍光物質発光物質生物発光物質、放射性核種、陽電子出金属(陽電子放出トモグラフィーにおける使用のため)、及び非放射活性常磁性金属イオンが挙げられる。一般的に、診断としての使用のための抗体にコンジュゲート可能な金属イオンについては、米国特許第4,741,900号を参照されたい。好適な酵素としては、西ワサビペルオキシダーゼアルカリホスファターゼβ−ガラクトシダーゼ又はアセチルコリンエステラーゼが挙げられる;好適な補欠分子族としては、ストレプトアビジンアビジン及びビオチンが挙げられる;好適な蛍光物質としては、ウンベリフェロンフルオレセインフルオレセインイソチオシアネートローダミンジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド及びフィコエリトリンが挙げられる;好適な蛍光物質としては、ルミノールが挙げられる;好適な生物発光物質としては、ルシフェラーゼルシフェリン及びエクオリンが挙げられる;並びに好適な放射性核種としては、125I、131I、111In及び99Tcが挙げられる。

0321

別の例において、エフェクター分子は、抗体の半減期をインビボで延長させ得るか、及び/又は抗体の免疫原性を低減し得るか、及び/又は上皮性関門を通った免疫系への抗体の送達を増強し得る。この型の好適なエフェクター分子の例としては、WO05/117984に記載される、ポリマー、アルブミン、アルブミン結合タンパク質又はアルブミン結合化合物が挙げられる。

0322

エフェクター分子がポリマーである場合、これは、一般に、合成又は天然に存在するポリマー、例えば、必要に応じて置換される直鎖若しくは分枝鎖ポリアルキレンポリマー、ポリアルケニレンポリマー又はポリオキシアルキレンポリマー又は分枝鎖若しくは非分枝鎖多糖類、例えばホモ多糖類又はヘテロ多糖類であり得る。

0323

上述の合成ポリマー上に存在し得る特異的な必要に応じた置換基としては、1つ又は複数のヒドロキシ基メチル基又はメトキシ基が挙げられる。

0324

合成ポリマーの具体的な例としては、必要に応じて置換された直鎖若しくは分枝鎖のポリエチレングリコール)、ポリ(プロピレングリコール)、ポリ(ビニルアルコール)又はその誘導体が挙げられ、特に、必要に応じて置換されたポリ(エチレングリコール)、例えばメトキシポリ(エチレングリコール)又はその誘導体が挙げられる。

0325

具体的な天然に存在するポリマーとしては、ラクトースアミロースデキストラングリコーゲン又はその誘導体が挙げられる。

0326

「誘導体」は、ここで使用される場合、反応性の誘導体、例えばチオール−選択的反応基、例えばマレイミドなどを含むことが企図される。反応性の基は、直接的に、又はリンカーセグメントを通して、ポリマーに連結され得る。このような基の残基は、いくつかの場合、抗体断片とポリマーとの間の連結基としての産物の一部を形成することが、理解される。

0327

ポリマーの大きさは、所望されるように変動し得るが、一般に、500Da〜50000Da、例えば5000〜40000Da、例えば20000〜40000Daの範囲の平均分子量である。ポリマーの大きさは、詳細には、産物の企図される使用に基づいて、例えば、腫瘍などの特定の組織に局在する能力又は循環中の半減期を延長する能力に基づいて、選択され得る(概説については、Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews, 54, 531-545を参照されたい)。従って、例えば、例えば、腫瘍の処置における使用のために、この産物が循環から離れて組織に浸透することが企図される場合、低分子量のポリマー、例えば約5000Daの分子量のポリマーを用いることが有利であり得る。産物が循環中に留まる適用のために、より高分子量のポリマー、例えば20000Da〜40000Daの範囲内の分子量を有するポリマーを用いることが有利であり得る。

0328

好適なポリマーとしては、ポリアルキレンポリマー、例えばポリ(エチレングリコール)又は、特に、メトキシポリ(エチレングリコール)又はその誘導体、及び特に、約15000Da〜約40000Daの範囲内の分子量を有するポリマーが、挙げられる。

0329

1つの例において、本発明における使用のための抗体は、ポリ(エチレングリコール)(PEG)部分に結合する。1つの詳細な例において、抗体は、抗体断片であり、PEG分子は、この抗体断片内に位置する任意の利用可能なアミノ酸側鎖若しくは末端アミノ酸官能基、例えば、任意の遊離アミノ基、イミノ基チオール基ヒドロキシル基又はカルボキシル基を介して結合し得る。このようなアミノ酸は、抗体断片内に天然に存在し得るか、又は断片内に、組換えDNA法を用いて操作され得る(例えば、US5,219,996;US5,667,425;WO98/25971、WO2008/038024を参照されたい)。1つの例において、本発明の抗体分子は、修飾されたFab断片であり、ここで、この修飾は、その重鎖のC末端に、1つ又は複数のアミノ酸を付加し、エフェクター分子の結合を可能にする。好適には、さらなるアミノ酸は、エフェクター分子が結合し得る1つ又は複数のシステイン残基を含む修飾されたヒンジ領域を形成する。複数の部位が、2つ以上のPEG分子を結合するために、使用され得る。

0330

好適には、PEG分子は、抗体断片内に位置する少なくとも1つのシステイン残基のチオール基を介して共有結合している。修飾抗体断片に結合した各ポリマー分子は、この断片内に位置するシステイン残基の硫黄原子に共有結合し得る。共有結合は、一般に、ジスルフィド結合又は、詳細には、硫黄炭素結合である。結合の地点としてチオール基が使用される場合、適切に活性化したエフェクター分子、例えば、マレイミド及びシステイン誘導体などのチオール選択的誘導体が、使用され得る。活性化ポリマーは、上述のようなポリマー修飾抗体断片の調製における開始物質として使用され得る。活性化ポリマーは、チオール反応基を含む任意のポリマー、例えばα−ハロカルボン酸又はエステル、例えば、ヨードアセトアミドイミド、例えばマレイミド、ビニルスルホン又はジスルフィドであり得る。このような開始物質は(例えば、Nektar、以前のShearwater Polymers Inc.、Huntsville、AL、USAから)市販されているか、又は市販の開始物質から従来的化学手順を用いて調製され得る。詳細なPEG分子としては、20Kメトキシ−PEG−アミン(Nektar、以前のShearwater;Rapp Polymere;及びSunBioから得られる)及びM−PEG−SPA(Nektar、以前のShearwaterから得られる)が挙げられる。

0331

1つの実施形態において、抗体は、例えば、EP0948544又はEP1090037に開示される方法["Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications", 1992, J. Milton Harris (ed), Plenum Press, New York、"Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications", 1997, J. Milton Harris and S. Zalipsky (eds), American Chemical Society, Washington DC及び"Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences", 1998, M. Aslam and A. Dent, Grove Publishers, New York;Chapman, A. 2002, Advanced Drug Delivery Reviews 2002, 54:531-545もまた、参照されたい]に従ってPEG化された、すなわちそれに共有結合したPEG(ポリ(エチレングリコール))を有する、修飾Fab断片又はdiFabである。1つの例において、PEGは、ヒンジ領域においてシステインに結合している。1つの例において、PEG修飾Fab断片は、修飾ヒンジ領域において1つのチオール基に共有結合したマレイミド基を有する。リシン残基は、マレイミド基に共有結合され得、リシン残基上のアミン基のそれぞれに対し、約20,000Daの分子量を有するメトキシポリ(エチレングリコール)ポリマーが結合し得る。Fab断片に結合するPEGの全分子量は、従って、約40,000Daである。

0332

特定のPEG分子としては、PEG2MAL40Kとしても知られるN,N’−ビス(メトキシポリ(エチレングリコール)MW 20,000)修飾リシンの2−[3−(N−マレイミド)プロピオンアミドエチルアミドが挙げられる(Nektar、以前のShearwaterから得られる)。

0333

PEGリンカーの代替の供給源としては、GL2−400MA2(ここで、以下の構造中のmは、5である)及びGL2−400MA(ここで、mは、2である)(nは、約450である)を供給するNOFが挙げられる:




すなわち、各PEGは、約20,000Daである。
以下の型のさらなる代替のPEGエフェクター分子:




は、Dr Reddy、NOF及びJenkemから入手可能である。

0334

1つの実施形態において、鎖内のアミノ酸226又はその近傍、例えば重鎖のアミノ酸226(配列番号付けによる)においてシステインアミノ酸残基を通して結合した、(例えば、ここで記載されたPEGによって)PEG化された抗体が、提供される。

0335

1つの実施形態において、本開示に従う1つの特定の抗体は、以下の特性を有する:

0336

本発明はまた、ここで規定される抗体又は抗体の組み合わせの医薬組成物などの組成物を提供する。

0337

本発明はまた、本発明に従う少なくとも2つの抗体を含む組成物を提供し、例えば、そのうちの少なくとも1つの抗体はTcdAに対して特異的であり、そのうちの少なくとも1つの抗体はTcdBに対して特異的であるか、又は代替的には、少なくとも2つの抗体が、TcdAに対して特異的であるか、又は少なくとも2つの抗体が、TcdBに対して特異的である。

0338

1つの実施形態において、TcdAに対して特異的な複数の抗体及び必要に応じて1つ又は複数のTcdBに対して特異的な抗体を含む組成物が、提供される。

0339

1つの実施形態において、TcdBに対して特異的な複数の抗体及び必要に応じて1つ又は複数のTcdAに対して特異的な抗体を含む組成物が、提供される。

0340

従って、1つの実施形態において、本発明に従う2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14又は15の抗体、すなわち別個の抗体を含む組成物が、提供される。

0341

本発明は、3つのMabを含む1つの特定の混合物を記載し、その1つのMabは、TcdAに対して特異的であり、そしてその2つのMabは、TcdBに対して特異的である。この混合物は、ハムスターにおいて、感染経口用量のクロストリジウム・ディフィシレによる、死及び胃炎症からの非常に高いレベルの防御を実証した。

0342

詳細には、配列番号49に示される配列を有する重鎖可変領域及び配列番号47に示される配列を有する軽鎖可変領域を含む1つの抗TcdA抗体と、第1に配列番号129に示される重鎖可変領域及び配列番号127に示される軽鎖可変領域、並びに第2に配列番号159に示される重鎖可変領域及び配列番号157に示される軽鎖可変領域の2つの抗TcdBとの組み合わせを含む組成物を提供する。

0343

1つの実施形態において、この組成物は、1つの抗TcdA及び2つの抗TcdB抗体などの3つの抗体を含み、これらの抗体は、その全抗体含量のそれぞれ50%、25%及び25%である。

0344

1つの実施形態において、TcdAに対して特異的な2、3、4又は5の抗体、及び必要に応じて、TcdBに対して特異的な1、2、3、4又は5の抗体を含む組成物が、提供される。

0345

1つの実施形態において、本発明に従って提供される組成物は、十分に規定されており、例えば、免疫化されたか免疫応答性の宿主に由来する単純なポリクローナル組成物よりもむしろ、モノクローナル抗体の混合物である。

0346

1つの実施形態において、抗体の組成物は、200ng/ml以下、例えば150ng/ml以下、例えば100ng/ml以下、例えば0.1〜10ng/mlのEC50を有する。

0347

有利には、ここで記載される抗体は、非常に高いレベルの生物物理学的安定性を有し、従って、抗体の混合物に含めるために好適である。

0348

1つの局面において、本発明に従う薬学的製剤又は組成物は、さらに、薬学的に許容可能な賦形剤を含む。

0349

治療組成物中の薬学的に許容可能なキャリアは、さらに、水、生理食塩水グリセロール及びエタノールなどの液体を含み得る。さらに、補助物質、例えば湿潤剤若しくは乳化剤又はpH緩衝化物質が、このような組成物中に存在し得る。このようなキャリアは、医薬組成物を、患者による摂取のための、錠剤丸剤ドラジェカプセル液剤ゲルシロップスラリー及び懸濁剤として製剤化可能である。

0350

投与のために好適な形態としては、例えば、注射若しくは注入による、例えば、ボーラス注射又は連続的注入による非経口投与のために好適な形態が、挙げられる。製品が注射又は注入のためである場合、これは、油性若しくは水性ビヒクル中の懸濁液、溶液又はエマルジョンの形態を取り得、懸濁化剤保存剤安定化剤及び/又は分散剤などの、製剤化剤を含み得る。或いは、抗体分子は、適切な滅菌液による使用前の再構築のための、乾燥形態であってもよい。

0351

一旦製剤化されると、本発明の組成物は、対象に直接投与される。処置される対象は、動物であり得る。しかし、1つ又は複数の実施形態において、組成物は、ヒト対象に対する投与に適合している。

0352

本開示に従う製剤において、好適には、最終製剤のpHは、抗体又は断片の等電点の値に類似せず、例えば、製剤のpHが7である場合、8〜9以上のpIが、適切であり得る。理論に縛られることを望まないが、最終的には、改善された安定性を有する最終製剤、例えば溶液中に抗体又は断片が留まっている製剤が、提供され得ると考えられる。

0353

1つの実施形態において、本開示の組成物又は製剤は、1〜200mg/mLの抗体、すなわち、合わせた抗体含量を、例えば、150mg/mL以下、例えば100mg/mL以下、詳細には90、80、70、60、50、40、30、20、10mg/mL以下含む。

0354

1つの実施形態において、本開示に従う組成物又は製剤は、各20mg/mLの抗体をその中に含む。

0355

1つの実施形態において、以下を含む製剤が、提供される:
配列番号49に示される配列を有する重鎖可変領域及び配列番号47に示される配列を有する軽鎖可変領域を含む、33mg/mL以下の1つの抗TcdA抗体、及び
配列番号129に示される重鎖可変領域及び配列番号127に示される軽鎖可変領域を含む、28mg/mL以下の第1の抗TcdB、並びに
配列番号159に示される重鎖可変領域及び配列番号157に示される軽鎖可変領域を含む、25mg/mLの第2の抗TcdB。

0356

1つの実施形態において、4.0〜7.0の範囲内のpHの薬学的製剤は、以下:1〜200mg/mLの本開示に従う抗体、1〜100mMの緩衝液、0.001〜1%の界面活性剤
(a)10〜500mMの安定化剤、
(b)5〜500mMの等張剤、又は
(c)10〜500mMの安定化剤及び5〜500mMの等張剤
を含む。

0357

1つの実施形態において、本開示に従う組成物又は製剤は、リン酸緩衝化生食塩水の緩衝液を含む。

0358

例えば、約pH6であるこの製剤は、1〜50mg/mLの抗体、20mMのL−ヒスチジンHCl、240mMトレハロース及び0.02%ポリソルベート20を含み得る。或いは、約pH5.5の製剤は、1〜50mg/mLの抗体、20mMクエン酸緩衝液、240mMショ糖、20mMアルギニン、及び0.02%ポリソルベート20を含み得る。

0359

本発明の医薬組成物は、任意の数の経路によって投与され得、これらとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:経口経路静脈内経路、筋肉内経路、動脈内経路、脊髄内経路、髄腔内経路、心室内経路、経皮経路(transdermal)、経皮経路(transcutaneous)(例えば、WO98/20734を参照されたい)、皮下経路、腹腔内経路、鼻腔内経路、経腸経路、局所経路下経路、内経路又は直腸経路。皮下噴射器もまた、本発明の医薬組成物を投与するために使用され得る。代表的には、治療組成物は、液体溶液又は懸濁液のいずれかとして、注射剤として調製され得る。液体ビヒクル中の溶液又は懸濁液のために好適な固体形態が、注射の前に調製されてもよい。

0360

組成物の直接送達は、一般に、皮下的、腹腔内、静脈内又は筋肉内の注射によって達成されるか、又は組織の間質腔に送達される。

0361

この組成物はまた、例えば、飲み込むためのカプセル化経口投薬物によって、胃若しくは回腸への経鼻胃管を通して、直腸管を通して、又は浣腸液若しくは直腸カプセルによって、病変内に又は直接胃腸管内に投与され得る。投薬処置は、単回投薬スケジュールであっても、多回投薬スケジュールであってもよい。

0362

組成物中の活性成分は、抗体分子であることが、理解される。それ自体が、胃腸管において分解を受けやすい。従って、胃腸管を用いる経路によって組成物が投与される場合、組成物は、抗体を分解から防御するが、一旦胃腸管から吸収されたら抗体を放出する薬剤を含むことを必要とする。

0363

薬学的に許容可能なキャリアについての完全な議論は、Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Company, N.J. 1991)において利用可能である。

0364

本発明はまた、ここで記載されるように、処置のため、例えばC.ディフィシレ感染又はこれに関連する合併症、例えば下痢、大腸炎、詳細には偽膜性大腸炎、腹部膨満腹痛及び中毒性巨大結腸の処置又は予防のための、抗体若しくは抗体組み合わせ又はこれを含む組成物を提供する。

0365

予防はまた、ワクチンを作るための不活化毒素抗原トキソイド)及び抗体の事前に形成された複合体を投与することによって達成され得る。

0366

1つの実施形態において、本発明に従う抗体、その組み合わせ及びそれを含む組成物は、いわゆるC.ディフィシレのスーパー株、すなわち、リボタイプ027などの高毒性株による感染を処置するために好適である。

0367

本発明に従う抗体及び組成物は、一次感染の間の、対応するC.ディフィシレ毒素の急性及び/又は慢性の効果の処置又は予防における使用のために好適である。

0368

本発明に従う抗体及び組成物は、二次感染の間又は再感染の間の、対応するC.ディフィシレ毒素の効果の処置又は予防における使用のために、好適である。国際ガイドラインは、一次感染後の時間間隔を重要視し、その後、存在する症状の持続とは異なる、時々ぶり返しと記載される二次(すなわち再発性の)感染を規定する(29)。研究は、二次感染は、一次感染と同じ株又はリボタイプの結果であり得ることを示した。このような場合、ぶり返しよりもむしろ再発は、承認された時間的制約に依拠する。しかし、研究はまた、二次感染はまた、一次感染とは別個の株又はリボタイプの感染の結果であり得ることをも明らかに示す。1つの研究において、疾患再発の48%は、第1の感染を起こしたものとは別個の第2の株の結果であった(30)。別の研究において、56%を超える疾患再発が、第1の感染を起こしたものとは別個の第2の株の結果であった(31)。

0369

1つの実施形態において、本発明に従う抗体、その組み合わせ及びそれを含む組成物は、損傷、例えば結腸上皮の長期の構造的損傷の予防における使用のために好適である。

0370

1つの実施形態において、抗体、組み合わせ及び組成物は、感染の再発を含めたC.ディフィシレ感染、詳細には院内感染の予防のために好適である。

0371

1つの実施形態において、本発明に従う抗体、その組み合わせ及びそれを含む組成物は、C.ディフィシレ感染の再発のリスクを低減するために好適である。

0372

有利にも、本開示の抗体は、感染又は再感染を予防するために、予防的に投与され得る。何故なら、この抗体が特異的である毒素の非存在下で、この抗体は、対象の身体組織に対し有害な相互作用を引き起こすことなく、身体から単純に除去されるからである。

0373

有利にも、本開示の抗体は、投与後に、迅速な応答を誘発するとみられ、例えば、投与の1日若しくは2日間以内に、標的毒素の迅速なクリアランスが発動され、これは、致命的な器官、例えば心臓及び腎臓が損傷されることを予防し得る。共に利用可能であるように作られた薬剤が、急性のC.ディフィシレ感染段階において、患者に対する毒素A及び/又はBによる損傷又は傷害を予防するために使用され得ることは、初めてである。

0374

従って、1つの実施形態において、本発明に従う抗体、その組み合わせ及びそれを含む組成物は、致命的な器官に対する損傷を予防するために好適である。

0375

1つの実施形態において、ここで記載される抗体、組み合わせ又は製剤は、毒素によって回復不能な損傷を負わされる前に適切な時間枠内で投与された場合、感染患者の死を予防するために好適である。

0376

本開示の抗体は、速いオンレートを有し、このことは、インビボでの迅速な効果を促進する。

0377

1つの実施形態において、患者集団は、60を超える、例えば65歳を超える年齢である。

0378

1つの実施形態において、患者集団は、5歳以下である。

0379

本発明に従う抗体は、抗生物質、例えばメトロニダゾール、バンコマイシン又はフィダキソマイシンの処置と組み合わせて使用され得る。様々なインビトロデータは、Mab及びMab混合物の特性を例示する。我々は、3つのMabの1つの混合物(50%モル量の抗TcdA構成要素及び50%モル量の抗TcdB構成要素)が、ハムスターを致死性のCDIから防御可能であったことを示す。

0380

1つの実施形態において、治療有効量のここで記載される抗体若しくは抗体組み合わせ又はそれを含む組成物を、例えばC.ディフィシレ感染又はそれに関連する合併症、例えば下痢、大腸炎、詳細には偽膜性大腸炎、腹部膨満、腹痛及び中毒性巨大結腸の処置又は予防において投与することにより、それを必要とする患者を処置する方法が提供される。

0381

1つの実施形態において、抗体、組み合わせ又は製剤は、非経口経路、例えば皮下経路、腹腔内経路、静脈内経路又は筋肉内経路によって投与される。ハムスターにおいて出された実施例におけるデータは、この経路によって投与された用量は、胃に達し、従って、治療効果をもたらすことができることを示す。

0382

1つの実施形態において、抗体、組み合わせ又は製剤は、経口的に投与され、例えば腸溶コーティングした製剤である。

0383

1つの実施形態において、C.ディフィシレ感染の処置又は予防のための医薬の製造のための、ここで記載される抗体、組み合わせ又は製剤の使用が提供される。

0384

1つの実施形態において、投与される用量は、1〜1000mg/Kg、例えば10〜75mg/Kg、例えば20〜50mg/Kgの範囲内である。

0385

1つの実施形態において、マウス及びハムスターにおけるインビボの抗体(単数又は複数)の半減期は、健康な(未感染の)動物において6〜8日間の範囲内であり、従って、ヒトにおいては14〜28日間の範囲内の半減期を有すると予測される。

0386

1つの実施形態において、抗体(単数又は複数)は、1用量のみ与えられる。

0387

1つの実施形態において、抗体(単数又は複数)は、週に1回又は二週に1回の用量で与えられる。

0388

1つの実施形態において、抗体(単数又は複数)は、1日に1回用量で与えられる。

0389

1つの実施形態において、ここで規定される1種又は複数の抗TcdA抗体と複合体化したTcdA又はその免疫原性断片を含む複合体を、提供する。この複合体は、例えば、ヒトへの投与の後にインビボで毒素Aに対する防御抗体を作製するために好適なワクチン製剤における抗原として使用され得る。

0390

1つの実施形態において、ここで規定される1種又は複数の抗TcdB抗体と複合体化したTcdB又はその免疫原性断片を含む複合体を、提供する。この複合体は、例えば、ヒトへの投与の後にインビボで毒素Bに対する防御抗体を作製するために好適なワクチン製剤における抗原として使用され得る。

0391

製剤化されて本発明における使用のために好適なアジュバントを生成し得るTh1型免疫刺激剤としては、以下が挙げられるが、これらに制限されない。

0392

1つの実施形態において、TcdA又はその免疫原性断片及びTcdB又はその免疫原性断片を含む複合体が提供され、ここで、それぞれの毒素又は断片は、それに特異的な1つ又は複数の抗体と複合体化し、ここで、その複合体は、ワクチン製剤としての投与のために好適である。

0393

抗体:抗原複合体は、Fcレセプター媒介型プロセスにおいて免疫系によって取り込まれることが公知であり(27、28)、そして抗体の事前形成された複合体:抗原複合体は、ヒト臨床試験におけるワクチンとしての成功した使用である(22)。

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