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課題

アミロイド線維形成タンパク質を含む溶液に超音波照射してアミロイド線維を形成させる際に、アミロイド線維形成を効率良くまた比較的短時間で行うことができる、アミロイド線維形成容器ならびにアミロイド線維形成方法を提供する。

解決手段

アミロイド線維形成タンパク質を含む溶液を収容し、超音波を照射することによってアミロイド線維を形成させるための容器であって、液晶ポリマーまたは液晶ポリマー組成物から構成されることを特徴とするアミロイド線維形成容器、ならびに当該容器に収容したアミロイド線維形成タンパク質を含む溶液に超音波を照射する工程を含む、アミロイド線維の形成方法

概要

背景

アミロイドーシスは、タンパク質凝集して形成されるアミロイド線維沈着を伴う疾患の総称である。アルツハイマー病プリオン病として知られる脳アミロイド—シスをはじめ、透析アミロイドーシス、免疫グロブリン性アミロイドーシスなど、深刻な疾患が含まれる。

アミロイドの沈着を未然に予測することは困難であることが知られている。アミロイド線維を形成するアミロイド線維形成タンパク質は確認されているものだけでも多数あり、その多くは生命機能支える重要なタンパク質である。また、アミロイド線維形成タンパク質として疾患に関わるものだけでなく、ある特定の条件でアミロイド線維を形成するタンパク質も数多く報告されている。これらの知見より、多くは体内で何十年もかけて少しずつ形成されるアミロイド線維は、タンパク質の物理化学的性質に基づいて生じることが解明された。すなわちアミロイド線維の形成は、物質結晶形成結晶成長過程に似た現象である。アミロイド線維形成タンパク質の濃度が危険レベルを超えていても、アミロイド線維形成のエネルギー障壁が高いため、過飽和状態に保たれている場合が多い。このような状況では、アミロイド核、アミロイド線維やそのオリゴマーは形成されず、潜伏状態にあると言える。

アミロイドーシスに関する研究の大きな問題点は、アミロイド線維や、アミロイド線維形成タンパク質が数十個凝集して形成されるオリゴマーなど、異常凝集体の形成を事前に予測することが困難なことである。

アミロイドーシス研究のため、試験管内でアミロイド線維形成タンパク質をアミロイド線維へと誘導する試みがなされている。アミロイド線維形成タンパク質の過飽和溶液を長期間、例えば数日から数ヶ月静置すると、低い確率でアミロイド線維が発生することが知られている。かかる手法は、時間がかかるだけでなく、再現性が乏しく、また得られるアミロイド線維が不均質なものが多いのが現状である。

過飽和状態のアミロイド線維形成タンパク質溶液におけるアミロイド線維の発生確率が低いのは、核形成のためのエネルギー障壁が大きいためであると考えられている。アミロイド線維形成タンパク質の溶液へ超音波照射することにより、アミロイド線維形成時のエネルギー障壁を下げて、アミロイド線維の形成を促進する試みが報告されている(非特許文献1)。またかかる手法を用いたアッセイ用装置を特許文献1は開示する。

特許文献1や非特許文献1のアミロイド線維形成タンパク質溶液へ超音波を照射する際に用いられる容器としては主にポリププレン(PP)製のマイクロチューブや96ウェルプレートが用いられている。

概要

アミロイド線維形成タンパク質を含む溶液に超音波を照射してアミロイド線維を形成させる際に、アミロイド線維形成を効率良くまた比較的短時間で行うことができる、アミロイド線維形成容器ならびにアミロイド線維形成方法を提供する。 アミロイド線維形成タンパク質を含む溶液を収容し、超音波を照射することによってアミロイド線維を形成させるための容器であって、液晶ポリマーまたは液晶ポリマー組成物から構成されることを特徴とするアミロイド線維形成容器、ならびに当該容器に収容したアミロイド線維形成タンパク質を含む溶液に超音波を照射する工程を含む、アミロイド線維の形成方法。なし

目的

本発明は、アミロイド線維形成タンパク質を含む溶液に超音波を照射してアミロイド線維を形成させる際に、アミロイド線維形成を効率良くまた比較的短時間で行うことができる、アミロイド線維形成容器を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

アミロイド線維形成タンパク質を含む溶液を収容し、超音波照射することによってアミロイド線維を形成させるための容器であって、液晶ポリマーまたは液晶ポリマー組成物から構成されることを特徴とするアミロイド線維形成容器。

請求項2

容器がマイクロチューブである請求項1に記載のアミロイド線維形成容器。

請求項3

液晶ポリマーが、芳香族ヒドロキシカルボン酸芳香族ジカルボン酸芳香族ジオール芳香族アミノカルボン酸芳香族ヒドロキシアミン芳香族ジアミン脂肪族ジオールおよび脂肪族ジカルボン酸からなる群から選択される2種以上の化合物から構成される共重合体である、請求項1または2に記載のアミロイド線維形成容器。

請求項4

液晶ポリマーが、芳香族ヒドロキシカルボン酸、芳香族ジカルボン酸および芳香族ジオールからなる群から選択される2種以上の化合物から構成される共重合体である、請求項1または2に記載のアミロイド線維形成容器。

請求項5

芳香族ヒドロキシカルボン酸が、4‐ヒドロキシ安息香酸および6−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸からなる群から選択される1種以上の化合物である、請求項3または4に記載のアミロイド線維形成容器。

請求項6

芳香族ジカルボン酸が、テレフタル酸イソフタル酸および2,6−ナフタレンジカルボン酸からなる群から選択される1種以上の化合物である、請求項3または4に記載のアミロイド線維形成容器。

請求項7

芳香族ジオールが、ハイドロキノンレゾルシン、4,4`−ジヒドロキシビフェニルおよび2,6−ジヒドロキシナフタレンからなる群から選択される1種以上の化合物である、請求項3または4に記載のアミロイド線維形成容器。

請求項8

アミロイド線維形成タンパク質を含む溶液を収容した、液晶ポリマーまたは液晶ポリマー組成物から構成される容器に超音波を照射する工程を含む、アミロイド線維の形成方法

請求項9

液晶ポリマーまたは液晶ポリマー組成物から構成される容器へ収容されたタンパク質溶液に超音波を照射する工程、およびタンパク質溶液中のアミロイド線維を検出する工程を含む、超音波アミロイドアッセイ方法

技術分野

0001

本発明は、タンパク質を含む溶液を収容し、超音波照射してアミロイド線維を形成させるために用いられるアミロイド線維形成容器に関する。

背景技術

0002

アミロイドーシスは、タンパク質が凝集して形成されるアミロイド線維の沈着を伴う疾患の総称である。アルツハイマー病プリオン病として知られる脳アミロイド—シスをはじめ、透析アミロイドーシス、免疫グロブリン性アミロイドーシスなど、深刻な疾患が含まれる。

0003

アミロイドの沈着を未然に予測することは困難であることが知られている。アミロイド線維を形成するアミロイド線維形成タンパク質は確認されているものだけでも多数あり、その多くは生命機能支える重要なタンパク質である。また、アミロイド線維形成タンパク質として疾患に関わるものだけでなく、ある特定の条件でアミロイド線維を形成するタンパク質も数多く報告されている。これらの知見より、多くは体内で何十年もかけて少しずつ形成されるアミロイド線維は、タンパク質の物理化学的性質に基づいて生じることが解明された。すなわちアミロイド線維の形成は、物質結晶形成結晶成長過程に似た現象である。アミロイド線維形成タンパク質の濃度が危険レベルを超えていても、アミロイド線維形成のエネルギー障壁が高いため、過飽和状態に保たれている場合が多い。このような状況では、アミロイド核、アミロイド線維やそのオリゴマーは形成されず、潜伏状態にあると言える。

0004

アミロイドーシスに関する研究の大きな問題点は、アミロイド線維や、アミロイド線維形成タンパク質が数十個凝集して形成されるオリゴマーなど、異常凝集体の形成を事前に予測することが困難なことである。

0005

アミロイドーシス研究のため、試験管内でアミロイド線維形成タンパク質をアミロイド線維へと誘導する試みがなされている。アミロイド線維形成タンパク質の過飽和溶液を長期間、例えば数日から数ヶ月静置すると、低い確率でアミロイド線維が発生することが知られている。かかる手法は、時間がかかるだけでなく、再現性が乏しく、また得られるアミロイド線維が不均質なものが多いのが現状である。

0006

過飽和状態のアミロイド線維形成タンパク質溶液におけるアミロイド線維の発生確率が低いのは、核形成のためのエネルギー障壁が大きいためであると考えられている。アミロイド線維形成タンパク質の溶液へ超音波を照射することにより、アミロイド線維形成時のエネルギー障壁を下げて、アミロイド線維の形成を促進する試みが報告されている(非特許文献1)。またかかる手法を用いたアッセイ用装置を特許文献1は開示する。

0007

特許文献1や非特許文献1のアミロイド線維形成タンパク質溶液へ超音波を照射する際に用いられる容器としては主にポリププレン(PP)製のマイクロチューブや96ウェルプレートが用いられている。

0008

国際公開公報WO2012/017739

先行技術

0009

Ultrasonication-induced amyloid fibril formation ofβ2-microglobulin. Ohhashi,Y., Kihara,M., Naiki,H. & Goto,Y. (2005) J. Biol. Chem. 280, 32843-32848.

発明が解決しようとする課題

0010

本発明は、アミロイド線維形成タンパク質を含む溶液に超音波を照射してアミロイド線維を形成させる際に、アミロイド線維形成を効率良くまた比較的短時間で行うことができる、アミロイド線維形成容器を提供することを目的とする。

課題を解決するための手段

0011

本発明はアミロイド線維形成タンパク質を含む溶液を収容し、超音波を照射することによってアミロイド線維を形成させるための容器であって、液晶ポリマーまたは液晶ポリマー組成物から構成されることを特徴とするアミロイド線維形成容器を提供する。

0012

本発明はまた、アミロイド線維形成タンパク質を含む溶液を収容した、液晶ポリマーまたは液晶ポリマー組成物から構成される容器に超音波を照射する工程を含む、アミロイド線維の形成方法を提供する。

0013

本発明はまた、液晶ポリマーまたは液晶ポリマー組成物製の容器へ収容されたタンパク質溶液に超音波を照射する工程、およびタンパク質溶液中のアミロイド線維を検出する工程を含む、超音波アミロイドアッセイ方法を提供する。

発明の効果

0014

アミロイド線維形成タンパク質を含む溶液に超音波を照射してアミロイド線維を形成させる際に、アミロイド線維形成タンパク質を収容する容器を液晶ポリマーまたは液晶ポリマー組成物で構成することにより、超音波照射により生じるアミロイド線維形成タンパク質の凝集が促進され、ポリプロピレン製容器を使用する場合に比べアミロイド線維形成までの時間が短縮される。

図面の簡単な説明

0015

本発明のアミロイド線維形成方法に用いられる超音波照射装置の一例の模式図である。
図1の超音波照射装置に設置されるアミロイド線維形成容器の支持体の一例の模式図である。
実施例および比較例の結果を示すグラフである。

0016

本願明細書並びに請求の範囲において「液晶ポリマー」は、異方性溶融相を形成するポリエステルまたはポリエステルアミドであり、当該技術分野においてサーモトロピック液晶ポリエステルまたはサーモトロピック液晶ポリエステルアミドと呼ばれるものであれば特に限定されない。

0017

異方性溶融相の性質は、直交偏光子を利用した慣用偏光検査法により確認することができる。より具体的には、異方性溶融相の確認は、Leitz偏光顕微鏡を使用し、Leitzホットステージに載せた試料窒素雰囲気下で40倍の倍率で観察することにより実施できる。本発明における液晶ポリマーは光学的に異方性を示すもの、即ち、直交偏光子の間で検査したときに光を透過させるものである。試料が光学的に異方性であると、たとえ静止状態であっても偏光は透過する。

0018

本発明において液晶ポリマーを構成する重合性単量体としては、例えば芳香族ヒドロキシカルボン酸芳香族ジカルボン酸芳香族ジオール芳香族アミノカルボン酸芳香族ヒドロキシアミン芳香族ジアミン脂肪族ジオールおよび脂肪族ジカルボン酸が挙げられる。液晶ポリマーを構成する重合性単量体は、これら化合物の1種のみであってもよく、2種以上の化合物を組み合わせてもよいが、少なくとも1種のヒドロキシ基またはアミノ基を有する重合性単量体を含むことが望ましい。液晶ポリマーを構成する重合性単量体は、前記化合物の1種以上が結合してなるオリゴマー、つまり1種以上の前記化合物から構成されるオリゴマーであってもよい。

0019

芳香族ヒドロキシカルボン酸の具体例としては、4−ヒドロキシ安息香酸、3−ヒドロキシ安息香酸、2−ヒドロキシ安息香酸、6−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸、5−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸、7−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸、3−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸、4'−ヒドロキシフェニル−4−安息香酸、3'−ヒドロキシフェニル−4−安息香酸、4'−ヒドロキシフェニル−3−安息香酸およびそれらのアルキルアルコキシまたはハロゲン置換体ならびにこれらのアシル化物エステル誘導体酸ハロゲン化物などのエステル形成性誘導体が挙げられる。これらの中でも、得られる液晶ポリマーの耐熱性および機械強度ならびに融点を調節し易いという観点から、4−ヒドロキシ安息香酸および6−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸からなる群から選択される1種以上の化合物が好ましい。

0020

芳香族ジカルボン酸の具体例としては、テレフタル酸イソフタル酸、2,6−ナフタレンジカルボン酸、1,6−ナフタレンジカルボン酸、2,7−ナフタレンジカルボン酸、4,4'−ジカルボキシビフェニル、3,4'−ジカルボキシビフェニルおよび4,4'−ジカルボキシターフェニル、これらのアルキル、アルコキシまたはハロゲン置換体ならびにそれらのエステル誘導体、酸ハロゲン化物などのエステル形成性誘導体が挙げられる。これらの中でも、得られる液晶ポリマーの耐熱性を効果的に高められる観点から、テレフタル酸、イソフタル酸および2,6−ナフタレンジカルボン酸からなる群から選択される1種以上の化合物が好ましく、テレフタル酸がより好ましい。

0021

芳香族ジオールの具体例としては、ハイドロキノンレゾルシン、2,6−ジヒドロキシナフタレン、2,7−ジヒドロキシナフタレン、1,6−ジヒドロキシナフタレン、3,3'−ジヒドロキシビフェニル、3,4'−ジヒドロキシビフェニル、4,4'−ジヒドロキシビフェニル、4,4'−ジヒドロキシビフェノールエーテルおよび2,2'−ジヒドロキシビナフチル、これらのアルキル、アルコキシまたはハロゲン置換体ならびにそれらのアシル化物などのエステル形成性誘導体が挙げられる。これらの中でも、重合時の反応性に優れる観点から、ハイドロキノン、レゾルシン、4,4'−ジヒドロキシビフェニルおよび2,6−ジヒドロキシナフタレンからなる群から選択される1種以上の化合物が好ましく、ハイドロキノン、4,4'−ジヒドロキシビフェニルおよび2,6−ジヒドロキシナフタレンからなる群から選択される1種以上の化合物がより好ましい。

0022

芳香族アミノカルボン酸の具体例としては、4−アミノ安息香酸、3−アミノ安息香酸、6−アミノ−2−ナフトエ酸、これらのアルキル、アルコキシまたはハロゲン置換体、ならびにそれらのアシル化物、エステル誘導体、酸ハロゲン化物などのエステル形成性誘導体が挙げられる。

0023

芳香族ヒドロキシアミンの具体例としては、4−アミノフェノール、N−メチル−4−アミノフェノール、3−アミノフェノール、3−メチル−4−アミノフェノール、4−アミノ−1−ナフトール、4−アミノ−4'−ヒドロキシビフェニル、4−アミノ−4'−ヒドロキシビフェニルエーテル、4−アミノ−4'−ヒドロキシビフェニルメタン、4−アミノ−4'−ヒドロキシビフェニルスルフィドおよび2,2'−ジアミノビナフチル、これらのアルキル、アルコキシまたはハロゲン置換体、ならびにそれらのアシル化物などのエステル形成性誘導体が挙げられる。これらの中でも、得られる液晶ポリマーの耐熱性および機械強度のバランスをとりやすい観点から、4−アミノフェノールが好ましい。

0024

芳香族ジアミンの具体例としては、1,4−フェニレンジアミン、1,3−フェニレンジアミン、1,5−ジアミノナフタレン、1,8−ジアミノナフタレン、これらのアルキル、アルコキシまたはハロゲン置換体、ならびにそれらのアシル化物などのアミド形成性誘導体が挙げられる。

0025

脂肪族ジオールの具体例としては、エチレングリコール、1,4−ブタンジオール、1,6−ヘキサンジオール、ならびにそれらのアシル化物が挙げられる。また、ポリエチレンテレフタレートポリブチレンテレフタレートなどの脂肪族ジオールを含有するポリマーを、前記の芳香族オキシカルボン酸、芳香族ジカルボン酸、芳香族ジオールおよびそれらのアシル化物、エステル誘導体、酸ハロゲン化物などと反応させてもよい。

0026

脂肪族ジカルボン酸の具体例としては、シュウ酸マロン酸コハク酸グルタル酸アジピン酸ピメリン酸スベリン酸アゼライン酸セバシン酸ドデカン二酸テトラデカン二酸フマル酸マレイン酸およびヘキサヒドロテレフタル酸が挙げられる。これらの中でも、重合時の反応性に優れる観点から、シュウ酸、コハク酸、アジピン酸、スベリン酸、セバシン酸およびドデカン二酸が好ましい。

0027

本発明において液晶ポリマーは、本発明の目的を損なわない範囲で、ジヒドロキシテレフタル酸、4−ヒドロキシイソフタル酸、5−ヒドロキシイソフタル酸、トリメリット酸、1,3,5−ベンゼントリカルボン酸ピロメリット酸またはこれらのアルキル、アルコキシもしくはハロゲン置換体、ならびにそれらのアシル化物、エステル誘導体、酸ハロゲン化物などのエステル形成性誘導体を重合性単量体として含むものであってもよい。これらの重合性単量体の含有量は、他の重合性単量体の合計量に対して10モル%以下であるのが好ましい。

0028

本発明において液晶ポリマーは、本発明の目的を損なわない範囲で、チオエステル結合を含むものであってもよい。このような結合を与える重合性単量体としては、メルカプト芳香族カルボン酸、および芳香族ジチオールおよびヒドロキシ芳香族チオールなどが挙げられる。これらの重合性単量体の含有量は、他の重合性単量体の合計量に対して10モル%以下であるのが好ましい。

0029

本発明において液晶ポリマーは、芳香族ヒドロキシカルボン酸、芳香族ジカルボン酸、芳香族ジオール、芳香族アミノカルボン酸、芳香族ヒドロキシアミン、芳香族ジアミン、脂肪族ジオールおよび脂肪族ジカルボン酸からなる群から選択される2種以上の化合物から構成される共重合体であることが好ましく、芳香族ヒドロキシカルボン酸、芳香族アミノカルボン酸、芳香族ジオール、芳香族ヒドロキシアミン、芳香族ジアミン、脂肪族ジオール、芳香族ジカルボン酸および脂肪族カルボン酸からなる群から選択される2種以上の化合物から構成される共重合体であることがより好ましい。

0030

また、本発明において液晶ポリマーを構成する重合性単量体が芳香族ヒドロキシカルボン酸を含むことが特に好ましく、液相ポリマーが芳香族ヒドロキシカルボン酸、芳香族ジカルボン酸および芳香族ジオールからなる群から選択される2種以上の化合物から構成される共重合体であることが非常に好ましい。
なお、重合性単量体が芳香族ヒドロキシカルボン酸として4−ヒドロキシ安息香酸を含む場合、4−ヒドロキシ安息香酸の含有量は、全重合性単量体100モル部に対して、好ましくは30〜100モル部、より好ましくは33〜80モル部である。

0031

本発明のアミロイド線維形成容器を構成する液晶ポリマーを構成する重合性単量体の具体例としては、例えば下記の組み合わせからなるものが挙げられる。
1)4−ヒドロキシ安息香酸/6−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸、
2)4−ヒドロキシ安息香酸/テレフタル酸/4,4'−ジヒドロキシビフェニル、
3)4−ヒドロキシ安息香酸/テレフタル酸/イソフタル酸/4,4'−ジヒドロキシビフェニル、
4)4−ヒドロキシ安息香酸/テレフタル酸/イソフタル酸/4,4'−ジヒドロキシビフェニル/ハイドロキノン、
5)4−ヒドロキシ安息香酸/テレフタル酸/ハイドロキノン、
6)6−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸/テレフタル酸/ハイドロキノン、
7)4−ヒドロキシ安息香酸/6−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸/テレフタル酸/4,4'−ジヒドロキシビフェニル、
8)6−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸/テレフタル酸/4,4'−ジヒドロキシビフェニル、
9)4−ヒドロキシ安息香酸/6−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸/テレフタル酸/ハイドロキノン、
10)4−ヒドロキシ安息香酸/6−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸/テレフタル酸/ハイドロキノン/4,4'−ジヒドロキシビフェニル、
11)4−ヒドロキシ安息香酸/2,6−ナフタレンジカルボン酸/4,4'−ジヒドロキシビフェニル、
12)4−ヒドロキシ安息香酸/テレフタル酸/2,6−ナフタレンジカルボン酸/ハイドロキノン、
13)4−ヒドロキシ安息香酸/2,6−ナフタレンジカルボン酸/ハイドロキノン、
14)4−ヒドロキシ安息香酸/6−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸/2,6−ナフタレンジカルボン酸/ハイドロキノン、
15)4−ヒドロキシ安息香酸/テレフタル酸/2,6−ナフタレンジカルボン酸/ハイドロキノン/4,4'−ジヒドロキシビフェニル、
16)4−ヒドロキシ安息香酸/テレフタル酸/4−アミノフェノール、
17)6−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸/テレフタル酸/4−アミノフェノール、
18)4−ヒドロキシ安息香酸/6−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸/テレフタル酸/4−アミノフェノール、
19)4−ヒドロキシ安息香酸/テレフタル酸/4,4'−ジヒドロキシビフェニル/4−アミノフェノール、
20)4−ヒドロキシ安息香酸/テレフタル酸/エチレングリコール、
21)4−ヒドロキシ安息香酸/テレフタル酸/4,4'−ジヒドロキシビフェニル/エチレングリコール、
22)4−ヒドロキシ安息香酸/6−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸/テレフタル酸/エチレングリコール、
23)4−ヒドロキシ安息香酸/6−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸/テレフタル酸/4,4'−ジヒドロキシビフェニル/エチレングリコール、
24)4−ヒドロキシ安息香酸/テレフタル酸/2,6−ナフタレンジカルボン酸/4,4'−ジヒドロキシビフェニル。

0032

これらの中でも、1)、9)、10)および14)のモノマー構成単位からなる液晶ポリマーが好ましい。

0033

以下、本発明のアミロイド線維形成容器を構成する液晶ポリマーの製造方法について説明する。

0034

本発明のアミロイド線維形成容器を構成する液晶ポリマーを製造する方法に特に制限はなく、重合性単量体を、エステル結合またはアミド結合を形成させる公知の重縮合方法、例えば溶融アシドリシス法、スラリー重合法などに供することにより液晶ポリマーを得ることができる。

0035

溶融アシドリシス法は、本発明のアミロイド線維形成容器を構成する液晶ポリマーを製造するのに好ましい方法である。この方法は、最初に重合性単量体を加熱して反応物質溶融溶液を形成し、次いで重縮合反応を続けて溶融ポリマーを得るものである。なお、縮合最終段階で副生する揮発物(例えば酢酸、水など)の除去を容易にするために真空を適用してもよい。

0036

スラリー重合法とは、熱交換流体の存在下で重合性単量体を反応させる方法であって、固体生成物熱交換媒質中に懸濁した状態で得られる。

0037

溶融アシドリシス法およびスラリー重合法のいずれの場合においても、液晶ポリマーを製造する際に使用される重合性単量体を、常温において、ヒドロキシ基および/またはアミノ基をアシル化した変性形態、すなわち低級アシル化物として反応に供することもできる。

0038

低級アシル基炭素原子数2〜5のものが好ましく、炭素原子数2または3のものがより好ましい。本発明の好ましい実施態様において、前記重合性単量体のアセチル化物を反応に供する。

0039

重合性単量体の低級アシル化物は、別途アシル化して予め合成したものを用いてもよいし、液晶ポリマーの製造時に重合性単量体に無水酢酸等のアシル化剤を加えて反応系内で生成せしめることもできる。

0040

溶融アシドリシス法またはスラリー重合法のいずれの場合においても、重縮合反応は、温度150〜400℃、好ましくは250〜370℃で、常圧および/または減圧下で行うのがよく、必要に応じて触媒を用いてもよい。

0041

触媒の具体例としては、ジアルキルスズオキシド(例えばジブチルスズオキシド)、ジアリールスズオキシドなどの有機スズ化合物二酸化チタン三酸化アンチモンアルコキシチタンシリケートチタンアルコキシドなどの有機チタン化合物カルボン酸アルカリおよびアルカリ土類金属塩(例えば酢酸カリウム);ルイス酸(例えば三フッ化硼素)、ハロゲン化水素(例えば塩化水素)などの気体酸触媒などが挙げられる。
触媒を使用する場合、該触媒の量は重合性単量体全量に対し、好ましくは1〜1000ppm、より好ましくは2〜100ppmである。

0042

このようにして重縮合反応させて得られた液晶ポリマーは、通常、溶融状態重合反応槽より抜き出された後に、ペレット状、フレーク状、または粉末状に加工される。

0043

ペレット状、フレーク状、または粉末状の液晶ポリマーは、分子量を高め耐熱性を向上させる目的などで、減圧下、真空下、または窒素ヘリウムなどの不活性ガス雰囲気下において、実質的に固相状態で熱処理を行ってもよい。

0044

固相状態において行う熱処理の温度は、液晶ポリマーが溶融しない限り特に限定されないが、260〜350℃、好ましくは280〜320℃で行うのがよい。

0045

上記のようにして得られた液晶ポリマーには、無機または有機充填材、以下に説明する他の添加剤、および他の樹脂成分から選択される一種以上を含有させてもよい。なお、液晶ポリマーの他に、無機または有機充填材および他の添加剤等を含有する組成物を液晶ポリマー組成物ともいう。

0046

液晶ポリマー組成物が含有し得る無機充填材または有機充填材は、繊維状、板状または粒状のものであってよく、例えばガラス繊維ミルガラスシリカアルミナ繊維、アルミナ繊維炭素繊維アラミド繊維チタン酸カリウムウイスカホウ酸アルミニウムウイスカウォラストナイトタルクマイカグラファイト炭酸カルシウムドロマイトクレイガラスフレークガラスビーズ硫酸バリウム、および酸化チタンが挙げられる。これらの中では、ガラス繊維が物性とコストのバランスが優れている点で好ましい。これら充填材は、2種以上を併用してもよい。

0047

液晶ポリマー組成物における無機充填材または有機充填材の合計量は、液晶ポリマー100重量部に対して、好ましくは1〜200重量部、より好ましくは5〜100重量部である。前記の無機充填材または有機充填材の合計量が液晶ポリマー100重量部に対して200重量部を超える場合には、液晶ポリマー組成物の成形加工性が低下する傾向や、成形機シリンダー金型の磨耗が大きくなる傾向がある。前記の無機充填材または有機充填材の合計量が上記下限値以上であると、充填材の含有量に応じた機械強度の向上効果発現させることができる。

0048

本発明において液晶ポリマー組成物は、本発明の効果を損なわない範囲で、他の添加剤、例えば高級脂肪酸、高級脂肪酸エステル、高級脂肪酸アミド、高級脂肪酸金属塩(ここで高級脂肪酸とは、炭素原子数10〜25のものをいう)、ポリシロキサンフッ素樹脂などの離型改良剤染料顔料などの着色剤酸化防止剤熱安定剤紫外線吸収剤帯電防止剤界面活性剤などを含有してもよい。これらの添加剤は1種のみを含有してもよく、または2種以上を組み合わせて含有してもよい。

0049

液晶ポリマー組成物における他の添加剤の合計量は、液晶ポリマー100重量部に対して、好ましくは0.1〜10重量部、より好ましくは0.5〜5重量部である。他の添加剤の合計量が液晶ポリマー100重量部に対して10重量部を超える場合には、液晶ポリマー組成物の成形加工性が低下する傾向や、熱安定性が悪くなる傾向がある。他の添加剤の合計量が上記下限値以上であると、添加剤の含有量に応じた添加剤の機能を発現させることができる。

0050

また、液晶ポリマー組成物を本願のアミロイド線維形成容器へと成形するに際し、上記他の添加剤のうち高級脂肪酸、高級脂肪酸エステル、高級脂肪酸金属塩、フルオロカーボン系界面活性剤等の外部滑剤効果を有する添加剤を、予め、液晶ポリマーのペレット表面に付着せしめてもよい。

0051

本発明のアミロイド線維形成容器を構成する液晶ポリマー組成物は、他の樹脂成分を含有してもよい。他の樹脂成分としては、例えばポリアミド、ポリエステル、ポリアセタールポリフェニレンエーテル、およびその変性物、ならびにポリスルホンポリエーテルスルホンポリエーテルイミドポリアミドイミドなどの熱可塑性樹脂や、フェノール樹脂エポキシ樹脂ポリイミド樹脂などの熱硬化性樹脂が挙げられる。他の樹脂成分は、単独で、または2種以上を組み合わせて含有することができる。他の樹脂成分の含有量は特に限定的ではないが、一つの典型的な例において、他の樹脂成分の合計量は、液晶ポリマー100重量部に対して、通常0.1〜100重量部、特に0.1〜80重量部である。

0052

本発明のアミロイド線維形成容器を構成する液晶ポリマー組成物は、無機充填材または有機充填材、他の添加剤および他の樹脂成分等を液晶ポリマー中に添加し、これをバンバリーミキサーニーダー、一軸もしくは二軸押出機などを用いて、液晶ポリマーの結晶融解温度近傍から結晶融解温度プラス100℃までの温度範囲溶融混練して得ることができる。

0053

このようにして得られた液晶ポリマーまたは液晶ポリマー組成物は、射出成形など公知の方法によって、アミロイド線維形成容器へと成形される。

0054

本発明のアミロイド線維形成容器の形状としては特に限定的ではなく、カップ状、ボトル状チューブ状等、タンパク質溶液を収容することが可能な形状であればよい。具体的には生化学分野の試験で用いられる形状が例示され、例えば試験管、マイクロチューブ、フラスコ、6ウェル、12ウェル、24ウェル、96ウェル、384ウェルプレートなどが例示される。プレートやチューブは蓋を有していても良い。

0055

アミロイド線維形成容器の厚み、サイズは特に限定的ではなく、アミロイド線維形成タンパク質またはアミロイド線維形成タンパク質を含む溶液の種類やアミロイド線維形成の目的により適宜設定すればよい。

0056

本願はまた、本願のアミロイド線維形成容器を用いて、アミロイド線維形成タンパク質からアミロイド線維を形成させる方法を提供する。

0057

本願明細書並びに請求の範囲において、「アミロイド線維形成タンパク質」とは生体内あるいは当業者に公知の試験法、例えば過飽和状態としたタンパク質を数日から数カ月の長時間静置する方法、非特許文献1や本願の超音波を照射してアミロイド線維の形成を促進させる方法等によってアミロイド線維を形成しうるタンパク質をいう。アミロイド線維形成タンパク質は、アミロイド線維を形成し得るタンパク質であれば特に限定されず、疾患に関係することが知られているものであっても、疾患と関連しないもの、および疾患との関連が未知のものいずれであってもよい。

0058

アミロイド線維形成タンパク質として公知のものとしては、アミロイドββ2ミクログロブリンアミリン、α−シヌクレインプリオンカルシトニン心房性ナトリウム利尿ペプチドアポリポタンパク質A−1、血清アミロイドAトランスサイレチンリゾチーム、免疫グロブリン、シスタチン等が挙げられる。

0059

一部のアミロイド線維形成タンパク質については、アミロイド線維を形成しやすくする溶液の構成やpHが知られている。本発明のアミロイド線維形成方法においては、タンパク質溶液としてかかる構成を採用してもよい。アミロイド線維形成タンパク質を含む溶液は当該タンパク質の過飽和溶液とすることが好ましい。

0060

本発明のアミロイド線維形成方法は、上記本発明の液晶ポリマーまたは液晶ポリマー組成物により構成される容器を用いる。該容器に収容されたアミロイド線維形成タンパク質を含む溶液へ超音波を照射する。

0061

本発明のアミロイド線維形成方法において、超音波照射装置としては特に限定されず、タンパク質の溶液を収容した液晶ポリマーまたは液晶ポリマー組成物により構成される容器へ超音波を照射することが出来る装置であればよい。超音波照射装置の一態様として、超音波槽、超音波槽内にアミロイド線維形成容器を支持することのできる支持体、超音波槽の壁面に備えられた圧電素子からなる超音波振動子、および超音波振動子を駆動する超音波発振器を有する装置が例示される。超音波発振器により超音波振動子の固有周波数に相当する周波数変調電圧印加すると、超音波振動子が固有振動数振動し、超音波槽内に収容された媒体超音波振動伝搬し、容器を介して容器内に収容したタンパク質溶液に伝搬する。

0062

本発明のアミロイド線維形成方法において、超音波振動子の振動数並びに強度、超音波照射スケジュールは対象とするアミロイド線維形成タンパク質溶液の種類やアミロイド線維を形成する目的によって、適宜設定すればよい。例えば超音波振動子の振動数を20kHz〜200kHzの間に設定することが例示される。

0063

超音波照射のスケジュールはアミロイド線維形成タンパク質溶液の種類やアミロイド線維を形成する目的によって適宜設定すればよい。例えば、本願実施例の10μmol/L濃度のアミロイドβタンパク質溶液を用いてアミロイド線維の形成を行う場合には、1分間の超音波照射、9分間のインキュベーションを1時間以上、例えば1〜7時間の間繰り返すことが例示される。

0064

アミロイド線維の生成は公知のアミロイド線維の検出方法により検出することができる。例えばアミロイド線維またはオリゴマーとアミロイド特異的蛍光色素との結合によって発せられる蛍光強度を測定することによって検出することが可能である。アミロイド特異的蛍光色素としては、チオフラビンTが例示される。

0065

蛍光色素を用いる場合、本願のアミロイド線維形成容器中のアミロイド線維形成タンパク質を含む溶液に予め蛍光色素を添加して、超音波を照射してそのまま蛍光強度を測定しても、別容器に取り出して蛍光強度を測定してもよい。あるいはアミロイド線維形成容器に収容したアミロイド線維形成タンパク質を含む溶液には蛍光色素を添加せず、当該容器へ超音波を照射した後に溶液の一部を別容器に取り出し、蛍光色素を添加した上で蛍光強度を測定してもよい。

0066

本願のアミロイド線維形成容器およびアミロイド線維形成方法は、アミロイド線維形成能が知られているタンパク質のアミロイド線維形成のためのみならず、アミロイド線維形成能が未知のタンパク質のアミロイド線維形成能を調べるために用いても良い。アミロイド線維形成能が未知のタンパク質溶液を容器へ収容して、アミロイド線維形成を期待して当該容器へ超音波を照射する際に使用する場合も、本発明の範囲内である。

0067

本願はまた、本願のアミロイド線維形成容器へ収容されたタンパク質溶液に超音波を照射する工程、およびタンパク質溶液中のアミロイド線維を検出する工程を含む、超音波アミロイドアッセイ方法を提供する。

0068

本発明の超音波アミロイドアッセイに用いられるタンパク質溶液としては、アミロイド線維形成タンパク質を含む溶液並びにアミロイド線維形成能が未知のタンパク質を含む溶液が例示される。また、本発明の超音波アミロイドアッセイに用いられるタンパク質溶液としては、被験者由来体液、例えば血液が例示される。

0069

本願の超音波アミロイドアッセイとしては例えば、被験者血清をアミロイドアッセイに供し、当該被験者のアミロイドーシス発症リスクを判断するために用いることができる。また、任意のタンパク質過飽和溶液を本願の容器に投入し、超音波を照射してアミロイド線維形成の有無を確認することにより、当該タンパク質のアミロイド線維形成能を調べるために用いることができる。また、アミロイド線維形成を阻害、あるいは促進し得る物質のスクリーニングに用いることができる。

0070

以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
参考例1(液晶ポリマー1の合成)
下記化合物を撹拌翼留出管を備えた2L反応容器仕込み窒素ガス雰囲気下に40−170℃の間を1時間かけて昇温し、170℃で30分保った後、330℃まで7時間かけて昇温し、さらに330℃で10分反応させた後、330℃で減圧を行った。次いで1.5時間かけて10torrまで減圧し、所定の撹拌トルクに達成した時点で重縮合を完結させた。反応容器からは内容物を取り出し、粉砕機により液晶ポリマーのペレットを得た。重縮合時の流出酢酸量はほぼ理論量どおりであった。

0071

4−ヒドロキシ安息香酸:655.3g(73モル部)
6−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸:330.3g(27モル部)
無水酢酸:676.9g(102モル部)

0072

参考例2(液晶ポリマー2の合成)
下記化合物を撹拌翼、留出管を備えた2L反応容器に仕込み、窒素ガス雰囲気下に40−170℃の間を1時間かけて昇温し、170℃で30分保った後、350℃まで7時間かけて昇温し、さらに350℃で10分反応させた後、350℃で減圧を行った。次いで1.5時間かけて5torrまで減圧し、所定の撹拌トルクに達成した時点で重縮合を完結させた。反応容器からは内容物を取り出し、粉砕機により液晶ポリマーのペレットを得た。重縮合時の流出酢酸量はほぼ理論量どおりであった。

0073

4−ヒドロキシ安息香酸:314.2g(35モル部)
6−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸:61.2g(5モル部)
テレフタル酸:323.9g(30モル部)
4,4'−ジヒドロキシビフェニル:157.3g(13モル部)
ハイドロキノン:121.7g(17モル部)
無水酢酸:696.8g(105モル部)

0074

<アミロイド線維形成評価>
参考例1および2で合成した液晶ポリマー1および2を用いて、射出成形により厚さ1mm、長さ8mmの2.5mLマイクロチューブを作成した(それぞれ実施例1および2)。ポリプロピレン(日本ポリプロ社製)を用いて射出成形により同じ厚さ、長さおよび容量のマイクロチューブを作成した(比較例1)。
リン酸緩衝液および塩化ナトリウムを含むDMSO溶液アミロイドβタンパク質(アミロイドβタンパク質フラグメント1−40、ペプチド研究所)を加え、10μmol/Lのアミロイドβタンパク質を調製した。各マイクロチューブへアミロイドβタンパク質溶液500μLを投入し、図2に示す支持体を有する図1に示す超音波照射装置の超音波槽へ設置した。

0075

超音波槽の温度を18℃に設定した。マイクロチューブの下方から26kHzの超音波を1分間付与し、9分間インキュベーションするサイクルを繰り返した。照射開始前、照射1時間、2.5時間、4.0時間、5.5時間および7時間時点で各チューブより5μLサンプリングした。サンプリングした各溶液に5μmol/L濃度のチオフラビンT(ThT)(和光純薬工業(株))溶液を50μL混合し、混合液の485nmでの蛍光強度を測定した。試験は各チューブにつき4回行った。結果を図3に示す。

0076

図3に示す通り、液晶ポリマーにより構成されるマイクロチューブを用いた実施例1および実施例2は、2.5時間の短時間の照射でThTアッセイによる強い蛍光強度が観測され、マイクロチューブ内でアミロイド線維が形成されていることがわかる。PP製のチューブでは7時間超音波照射してもアミロイド線維の形成は認められなかった。

実施例

0077

また、実施例1及び2並びに比較例1のマイクロチューブに上記と同じアミロイドβタンパク質溶液を投入して超音波照射を行わず室温にて静置した場合、24時間静置後もアミロイド線維の形成は全く認められなかった。

0078

1超音波照射装置
2超音波槽
3超音波振動子
ポンプ
5媒体
6アミロイド線維形成容器
7 支持体

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