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課題

洗浄及び他の用途に用いられる、保存安定性を改良した少なくとも一つの中性金属プロテアーゼ酵素を含む方法及び組成物の提供。

解決手段

野生型バチルスアミロリケファシエンス中性金属プロテアーゼ酵素由来配列の、特定の配列群から選択される少なくとも一つの突然変異を含むアミノ酸配列を持つ中性金属プロテアーゼ変異体であって、野生型と比較して、低い又は高いpH条件下で改良された機能を持ち、又は改良された自己分解安定性を持つ、単離された中性金属プロテアーゼ変異体。

概要

背景

洗剤及び他の洗浄のための組成物は、通常活性成分複合した組み合わせを含む。例えば、殆んどの洗浄用製品は、界面活性剤系、洗浄のための酵素漂白剤原材料ビルダー)、泡抑制剤汚れ懸濁化剤、汚れ剥離剤蛍光増白剤分散剤染料移動抑制化合物研磨剤殺菌剤及び香料を含む。

現在の洗剤は複合的であるが、完全に取り除くのが難しい汚れは多い。更に、しばしば残留物蓄積され、これは変色を起し(例えば、黄色化)洗浄が完全でないことにより美観衰える。これらの問題は、低温での洗浄(例えば、冷水)が増え及び洗浄サイクルが短くなることにより更に深刻化する。更に、汚れの多くは炭水化物及び炭水化物誘導体を含む繊維性材料、繊維及び細胞壁成分(例えば、植物材料、木材、/粘土ベースの汚れ、及び果物)を主に含む繊維性材料の複雑な混合物から成っている。これらの汚れは洗剤組成物調剤及び使用において解決すべき困難な問題を提起する。

更に、有色衣料品摩耗し、及び見栄えが衰える傾向がある。この色が衰える原因の一部は洗濯過程での摩耗、特に自動洗濯機及び乾燥機での摩耗によるものである。更に、織物引張り強度の低下は使用、着用、及び/又は洗濯、乾燥による避けられない機械的及び化学的作用によるものと思われる。したがって、これらの外観衰えを最小にするための、有色の衣料能率的及び効果的に洗濯する手段が求められる。

つまり、洗浄用組成物の効果は向上しているが、汚れを落とし、繊維の色及び外観を維持し、染料移動を防ぐ洗剤の需要がある。更に、しわ防止、毛玉防止、及び/又は繊維に収縮防止特性を提供し、しわや型崩れを防止し、繊維に軟らかさを与え、所望の外観色彩、及び繊維の対摩耗特性及び利益を維持するのみならず、引張り強度を提供し及び/又は回復する洗剤及び/又は繊維ケアー組成物の需要がある。特に、洗濯される繊維にしばしば付着している変色した汚れの成分を取除くことのできる組成物を含むことに対する需要がある。更に、織物の漂白に適した改善された方法及び/又は組成物に対する需要がある。

概要

洗浄及び他の用途に用いられる、保存安定性を改良した少なくとも一つの中性金属プロテアーゼ酵素を含む方法及び組成物の提供。野生型バチルスアミロリケファシエンス中性金属プロテアーゼ酵素由来配列の、特定の配列群から選択される少なくとも一つの突然変異を含むアミノ酸配列を持つ中性金属プロテアーゼ変異体であって、野生型と比較して、低い又は高いpH条件下で改良された機能を持ち、又は改良された自己分解安定性を持つ、単離された中性金属プロテアーゼ変異体。

目的

本発明は保存安定性を向上させた少なくとも一つの中性金属プロテアーゼ酵素を含む方法及び組成物を提供する

効果

実績

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請求項1

列番号3又は配列番号18を含む中性金属プロテアーゼと少なくとも95%のアミノ酸同一性を持つ単離された中性金属プロテアーゼ変異体であって、前記中性金属プロテアーゼ変異体は、配列番号18に規定するアミノ酸配列中の、下記のものに対応する少なくとも一つの突然変異を含むアミノ酸配列を持ち: 前記中性金属プロテアーゼ変異体は、野生型バチルスアミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)中性金属プロテアーゼと比較して,低いまたは高いpH条件下で改良された機能を持ち、又は野生型バチルスアミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)中性金属プロテアーゼと比較して、改良された自己分解定性を持つ、前記単離された中性金属プロテアーゼ変異体。

請求項2

請求項1の単離された中性金属プロテアーゼ変異体であって、下記のものから選択される多重突然変異を含む、前記中性金属プロテアーゼ変異体:

請求項3

請求項1の単離された中性金属プロテアーゼ変異体であって、前記プロテアーゼは下記のものから選択される多重突然変異を含む、前記中性金属プロテアーゼ変異体:

請求項4

請求項1の単離された中性金属プロテアーゼ変異体であって、前記プロテアーゼは以下のものから選択される多重突然変異を含む、前記中性金属プロテアーゼ変異体:

請求項5

請求項1乃至4の何れか1項の中性金属プロテアーゼをコードするヌクレオチド配列

請求項6

請求項5のヌクレオチドを含む発現ベクター

請求項7

請求項6の発現ベクターを含む宿主細胞

請求項8

中性金属プロテアーゼ活性を持つ酵素を生成する方法であって、前記中性金属プロテアーゼ変異体の生成に適した条件下で請求項7の宿主細胞を培養することを含む、前記方法。

請求項9

更に、前記生成された中性金属プロテアーゼ変異体を収集するステップを含む請求項8の方法。

請求項10

前記宿主細胞がバチルス(Bacillus)種である請求項7又は8の方法。

請求項11

請求項1乃至4の何れか1項の中性金属プロテアーゼ変異体を含む組成物であって、前記組成物は更に少なくとも一つのカルシウムイオン及び/又は亜鉛イオンを含む、組成物。

請求項12

請求項1乃至4の何れか1項の中性金属プロテアーゼ変異体を含む組成物であって、前記組成物は更に少なくとも一つの安定剤を含む、組成物。

請求項13

前記安定剤は、ホウ砂グリセロール、亜鉛イオン、カルシウムイオン及びギ酸カルシウムよりなる群れから選択される、請求項12の組成物。

請求項14

前記安定剤は、陰イオン界面活性剤の存在下で少なくとも一つの中性金属プロテアーゼを安定させる、少なくとも一つの拮抗阻害剤である、請求項12の組成物。

請求項15

請求項1乃至4の何れか1項の中性金属プロテアーゼ変異体を含む洗浄組成物

請求項16

前記洗浄組成物が洗剤である請求項15の洗浄組成物。

請求項17

更に、プロテアーゼ、アミラーゼリパーゼマンナーゼペクチナーゼクチナーゼオキシドレダクターゼヘミセルラーゼ、及びセルラーゼから選択される少なくとも一つの追加酵素又は酵素誘導体を含む、請求項15の洗浄組成物。

請求項18

前記組成物が少なくとも約0.0001重量パーセントの前記中性金属プロテアーゼ、例えば、約0.001から約0.5重量パーセントの前記中性金属プロテアーゼを含む、請求項16の洗浄組成物。

請求項19

前記組成物が更に少なくとも一つの補助成分を含む、請求項18の洗浄組成物。

請求項20

更に、pHが約3から約5の組成物を提供するための十分な量のpH調節剤を含み、約3から約5のpHで加水分解する材料を実質的に含まない、請求項15の洗浄組成物。

請求項21

約3から約5のpHで加水分解する前記材料は少なくとも一つの界面活性剤を含み、例えば、前記界面活性剤が、エチレン酸化物部分を含むアルキル硫酸ナトリウム界面活性剤である請求項20の洗浄組成物。

請求項22

前記組成物が液体である、請求項15の洗浄組成物。

請求項23

更に少なくとも一つの酸安定性を持つ酵素を含む、請求項15の洗浄組成物。

請求項24

表面及び/又は織物を含む商品を請求項15の洗浄組成物に接触させるステップを含む、洗浄方法

請求項25

前記表面及び/又は材料を前記洗浄組成物に接触させた後、さらに前記表面及び/又は材料をすすぐステップを含む、請求項24の洗浄方法。

請求項26

前記表面及び/又は織物を含む商品は草の染みを含み、及び前記接触させるステップには前記草の染みを前記洗浄組成物と接触させることを含む、請求項24の洗浄方法。

請求項27

請求項1乃至4の何れか1項の単離された中性金属プロテアーゼ変異体を含む動物飼料用組成物繊維加工用組成物又は皮革加工用組成物。

技術分野

0001

本発明は保存安定性を向上させた少なくとも一つの中性金属プロテアーゼ酵素を含む方法及び組成物を提供する。ある実施の態様においては、中性金属プロテアーゼは洗浄及び他の用途に用いられる。特に好ましい実施の態様においては、本発明はバチルス(Bacillus)種から得られる中性金属プロテアーゼを含む方法及び組成物を提供する。ある更に好ましい実施の態様においては、中性金属プロテアーゼはバチルスアミロリケファシエンス(Bacillus amylloliquefaciens)から得られる。より更に好ましい実施の態様においては、中性金属プロテアーゼはバチルス アミロリケファシエンス(Bacillus amylloliquefaciens)中性金属プロテアーゼの変異体である。更なる実施の態様においては、中性金属プロテアーゼはバチルス アミロリケファシエンス(Bacillus amylloliquefaciens)中性金属プロテアーゼの同族体ホモログ)である。本発明は、特に洗浄、漂白及び殺菌を含む用途に応用されるがこれに限定されるものではない。

0002

本出願は2005年10月12日に出願された米国特許仮出願第60/726,448号の優先権の利益を享受するものである。

背景技術

0003

洗剤及び他の洗浄のための組成物は、通常活性成分複合した組み合わせを含む。例えば、殆んどの洗浄用製品は、界面活性剤系、洗浄のための酵素、漂白剤原材料ビルダー)、泡抑制剤汚れ懸濁化剤、汚れ剥離剤蛍光増白剤分散剤染料移動抑制化合物研磨剤殺菌剤及び香料を含む。

0004

現在の洗剤は複合的であるが、完全に取り除くのが難しい汚れは多い。更に、しばしば残留物蓄積され、これは変色を起し(例えば、黄色化)洗浄が完全でないことにより美観衰える。これらの問題は、低温での洗浄(例えば、冷水)が増え及び洗浄サイクルが短くなることにより更に深刻化する。更に、汚れの多くは炭水化物及び炭水化物誘導体を含む繊維性材料、繊維及び細胞壁成分(例えば、植物材料、木材、/粘土ベースの汚れ、及び果物)を主に含む繊維性材料の複雑な混合物から成っている。これらの汚れは洗剤組成物調剤及び使用において解決すべき困難な問題を提起する。

0005

更に、有色衣料品摩耗し、及び見栄えが衰える傾向がある。この色が衰える原因の一部は洗濯過程での摩耗、特に自動洗濯機及び乾燥機での摩耗によるものである。更に、織物引張り強度の低下は使用、着用、及び/又は洗濯、乾燥による避けられない機械的及び化学的作用によるものと思われる。したがって、これらの外観衰えを最小にするための、有色の衣料能率的及び効果的に洗濯する手段が求められる。

0006

つまり、洗浄用組成物の効果は向上しているが、汚れを落とし、繊維の色及び外観を維持し、染料移動を防ぐ洗剤の需要がある。更に、しわ防止、毛玉防止、及び/又は繊維に収縮防止特性を提供し、しわや型崩れを防止し、繊維に軟らかさを与え、所望の外観色彩、及び繊維の対摩耗特性及び利益を維持するのみならず、引張り強度を提供し及び/又は回復する洗剤及び/又は繊維ケアー組成物の需要がある。特に、洗濯される繊維にしばしば付着している変色した汚れの成分を取除くことのできる組成物を含むことに対する需要がある。更に、織物の漂白に適した改善された方法及び/又は組成物に対する需要がある。

0007

本発明は保存安定性を向上させた少なくとも一つの中性金属プロテアーゼ酵素を含む方法及び組成物を提供する。ある実施の態様においては、中性金属プロテアーゼは洗浄及び他の用途に使用される。ある特に好ましい実施の態様においては、本発明はバチルス(Bacillus)種より得られる中性金属プロテアーゼを含む方法及び組成物を提供する。ある特に好ましい実施の態様においては、中性金属プロテアーゼはバチルスアミロリケファシエンスより得られる。更に好ましい実施の態様においては、中性金属プロテアーゼはバチルス アミロリケファシエンス中性金属プロテアーゼのホモログである。本発明は特に洗浄、漂白及び殺菌を含む用途に用いられるがこれに限定されるものではない。

0008

本発明は、新しい中性金属プロテアーゼ、中性金属プロテアーゼ酵素をコ−ドする新しい総称的材料、及びバチルス種、特にバチルスアミロリケファシエンスから得られる中性金属プロテアーゼ及びそれから発展したタンパク質変異体を提供する。特に、本発明はバチルス種、特にバチルス アミロリケファシエンスから得られる中性金属プロテアーゼ組成物、プロテアーゼをコードするDNA、中性金属プロテアーゼをコードするDNAを含むベクター、ベクターDNAによって形質転換された宿主細胞、及び宿主細胞により生成された酵素を提供する。本発明はまた洗浄のための組成物(例えば、洗剤組成物)、動物用飼料組成物、及びバチルス種、特にバチルス アミロリケファシエンスから得られる中性金属プロテアーゼを含む、織物及び皮革加工のための組成物を提供する。代替的な実施の態様においては、本発明は、本明細書に記載の野生型中性金属プロテアーゼ由来変種(すなわち、変異体)中性金属プロテアーゼを提供する。これらの変種中性金属プロテアーゼはまた多くの用途が見出される。

0009

本発明はバチルス種、特にバチルスアミロリケファシエンスから得られる単離した中性金属プロテアーゼを提供する。更なる実施の態様においては、中性金属プロテアーゼは配列番号3,4、又は18に定めるアミノ酸配列を含む。更なる実施の態様においては、本発明は配列番号3,4、又は18を含む中性金属プロテアーゼと少なくとも45%相同性を持つアミノ酸を含む単離した中性金属プロテアーゼを提供する。ある実施の態様においては、単離された中性金属プロテアーゼは配列番号3,4、又は18を含む中性金属プロテアーゼと少なくとも50%相同性を持ち、好ましくは少なくとも55%、より好ましくは少なくとも60%、より好ましくは少なくとも65%、さらに好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、さらにより好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、さらにより好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも99%相同性を持つ。

0010

本発明はまた、バチルスアミロリケファシエンスから得られる金属プロテアーゼと免疫交叉反応性がある単離された中性金属プロテアーゼ及びこれらの中性金属プロテアーゼを含む組成物を提供する。代替的な実施の態様においては、中性金属プロテアーゼは配列番号3,4、又は18に規定するアミノ酸配列を含む中性金属プロテアーゼと免疫交叉反応性がある。更なる実施の態様においては、中性金属プロテアーゼはバチルス アミロリケファシエンスの中性金属プロテアーゼ、及び/又は配列番号3,4、又は18に規定のアミノ酸配列を含む中性金属プロテアーゼの断片(すなわち、部分)と交叉反応性がある。事実、本発明は動物(ヒトを含むがこれに限定されるものではない)での免疫反応刺激し、及び/又は何れの種類の抗体によって認識されるバチルス アミロリケファシエンス金属プロテアーゼの断片(すなわち、エピトープ)を含むことを意図している。本発明は更にバチルス アミロリケファシエンス金属プロテアーゼ エピトープと交叉反応性のある金属プロテアーゼ上のエピトープを含む。ある実施の態様においては、金属プロテアーゼエピトープは抗体により認識されるが、動物(ヒトを含むがこれに限定されるものではない)の免疫反応を刺激せず、一方他の実施の態様においては、金属プロテアーゼ エピトープは少なくとも一つの動物種(ヒトを含むがこれに限定されるものではない)の免疫反応を刺激し、及びどの種類の抗体によっても認識される。本発明はまた交叉反応性エピトープを同定し及び評価する方法及び組成物を提供する。

0011

ある実施の態様においては、本発明は配列番号3,4、又は18に規定のアミノ酸配列を提供する。他の実施の態様においては、配列は配列番号3,4、又は18の少なくとも一つのアミノ酸位置に置換を含む。ある特に好ましい代替的実施の態様においては、配列は配列番号18の少なくとも一つのアミノ酸位置に置換を含む。ある好ましい実施の態様においては、本発明は配列番号3,4、又は18に規定のアミノ酸配列を含むバチルスアミロリケファシエンス中性金属プロテアーゼ中のある位置と同等位置に作られた少なくとも一つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を持つ中性金属プロテアーゼ変異体を提供する。ある更に好ましい実施の態様においては、本発明は配列番号18に規定するアミノ酸配列を含むバチルス アミロリケファシエンス中性金属プロテアーゼ中のある位置に同等な位置に作られたアミノ酸の少なくとも一つの置換を含むアミノ酸配列を持つ中性金属プロテアーゼ変異体を提供する。他の実施の形態においては、本発明は配列番号3,4、又は18の少なくとも一部を含むバチルス アミロリケファシエンス中性金属プロテアーゼ中のある位置に同等な位置に作られたアミノ酸の少なくとも一つの置換を含むアミノ酸配列を持つ変異体中性金属プロテアーゼを提供する。ある好ましい他の実施の態様においては、中性金属プロテアーゼは配列番号3,4、又は18の少なくとも一部に多重突然変異を含む。

0012

ある他の好ましい実施の態様においては、中性金属プロテアーゼは配列番号18の少なくとも一部に多重突然変異を含む。

0013

更なる実施の態様においては、本発明は配列番号18に規定のアミノ酸配列を提供する。他の実施の態様においては、配列は配列番号18の少なくとも一つのアミノ酸位置に置換を含む。ある好ましい実施の態様においては、本発明は配列番号18に規定するアミノ酸配列を含むバチルスアミロリケファシエンス中性金属プロテアーゼのある位置に同等な位置に作られるアミノ酸の少なくとも一つの置換を含むアミノ酸配列を持つ中性金属プロテアーゼ変異体を提供する。他の実施の態様においては、本発明は配列番号18の少なくともある部分を含むバチルス アミロリケファシエンス中性金属プロテアーゼのある位置と同等な位置に作られる少なくとも一つのアミノ酸の置換を含むアミノ酸配列を持つ中性金属プロテアーゼ変異体を提供する。ある他の好ましい実施の態様においては、中性金属プロテアーゼは配列番号18の少なくともある部分に多重突然変異を含む。

0014

ある特に好ましい実施の態様においては、これらの変異体は野生型バチルスアミロリケファシエンス中性金属プロテアーゼと比べて改良された機能を持つ。本発明はまた、野生型中性金属プロテアーゼと比べて少なくとも一つの改良された特性を持つ中性金属プロテアーゼ変異体を提供する。ある更に好ましい実施の態様においては、これらの変異体は野生型バチルス アミロリケファシエンス中性金属プロテアーゼと比べて改良された安定性を持つ。ある更に好ましい実施の態様においては、これらの変異体は野生型バチルス アミロリケファシエンス中性金属プロテアーゼに比べて改良された熱安定性を持つ。更に他の好ましい実施の態様においては、これらの変異体は、野生型バチルス アミロリケファシエンス中性金属プロテアーゼに比べてより低い、又はより高いpHの下で改良された機能を持つ。

0015

本発明はまた、配列番号3,4、又は18に規定するアミノ酸配列の少なくとも一部を含む中性金属プロテアーゼを提供する。ある実施の態様においては、これらの中性金属プロテアーゼをコードするヌクレオチド配列は配列番号1,2,12及び/又は13から選択されるヌクレオチド配列を含む。ある実施の態様においては、中性金属プロテアーゼは配列番号3,4、又は18に規定するアミノ酸配列に類似のアミノ酸配列を持つ変異体である。更に他の実施の態様においては、中性金属プロテアーゼは変異体及び/又はホモログである。更に他の実施の態様においては、中性金属プロテアーゼは図3乃至5のいずれかに規定の中性金属プロテアーゼである。他の実施の態様においては、中性金属プロテアーゼは図3、4及び/又は5に規定の変異体である。

0016

本発明はまた、配列番号3,4、又は18に規定する中性金属プロテアーゼの少なくとも一つの位置をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを提供する。本発明は更に、配列番号3,4、又は18に規定するアミノ酸配列を含むバチルス中性金属プロテアーゼのある位置に同等な位置に作られるアミノ酸の少なくとも一つの置換を含むアミノ酸配列を持つ少なくとも一つの中性金属プロテアーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを提供する。更なる実施の態様においては、本発明はこれらの配列ベクターを含む宿主細胞を提供する。ある特に好ましい実施の態様においては、宿主細胞はバチルス種からなる群れから選択される。本発明はまた、宿主細胞により生成される中性金属プロテアーゼを提供する。

0017

本発明はまた、中性金属プロテアーゼの少なくとも一部が配列番号1,2、12、及び/又は13から選択されるポリヌクレオチド配列によりコードされる、バチルス種、特にバチルスアミロリケファシエンスから得られ単離された中性金属プロテアーゼの少なくとも一部を含む組成物を提供する。更なる実施の態様においては、本発明はこれらの発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。ある特に好ましい実施の態様においては、宿主細胞はバチルス種である。本発明はまた、宿主細胞により生成される中性金属プロテアーゼを提供する。

0018

本発明はまた、中性金属プロテアーゼが配列番号3及び/又は18のアミノ酸位置に対応する、少なくとも一つの置換を持つ中性金属プロテアーゼである変異体中性金属プロテアーゼを提供し、変異体金属プロテアーゼは、野生型バチルスアミロリケファシエンス金属プロテアーゼと比べて、少なくとも一つのより優れた特性を持つ。ある特に好ましい実施の態様においては、本発明はまた、中性金属プロテアーゼが配列番号18のアミノ酸位置に対応する少なくとも一つの置換を含み、変異体金属プロテアーゼは、野生型バチルス アミロリケファシエンス金属プロテアーゼと比べて、少なくとも一つのより優れた特性を持つ変異体中性金属プロテアーゼを提供する。

0019

本発明はまた、変異体が配列番号18に規定のアミノ酸を含む中性金属プロテアーゼのある位置と同等の位置に作られるアミノ酸の少なくとも一つの置換を含み、その位置(単数、又は複数)は以下の位置から選択される、変異体アミノ酸を提供する:

0020

本発明はまた配列番号18に規定のアミノ酸配列を含む中性金属プロテアーゼのある位置と同等の位置に作られる少なくとも一つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を持つ単離された中性金属プロテアーゼを提供する。ある実施の態様においては、単離された中性金属プロテアーゼ変異体は、配列番号8に規定のアミノ酸配列を含む中性金属プロテアーゼの以下の位置と同等な位置に作られる置換を持つ:

0021

更なる実施の態様においては、単離された中性金属プロテアーゼ変異体は以下のものから選択される少なくとも一つの突然変異変異種を含む:

0022

0023

更なる実施の態様においては、本発明は、金属プロテアーゼが以下から選択される多重突然変異種を含む、単離された変異体中性金属プロテアーゼを提供する:

0024

0025

また更なる実施の態様においては、本発明は、金属プロテアーゼが以下から選択される多重突然変異種を含む、単離された変異体中性金属プロテアーゼを提供する:

0026

0027

また更なる実施の態様においては、本発明は、以下から選択される多重突然変異種を含む、単離された変異体中性金属プロテアーゼを提供する:

0028

0029

本発明はまた以下のヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する、すなわち、
(i) 配列番号1,2,12及び/又は13と少なくとも70%同一性を持ち、又は
(ii) 中程度から高度の厳格さの条件下で、実施例に示されるプライマ配列を含み、本明細書に規定される任意のヌクレオチド配列に由来するプローブハイブリッドすることができ、又は
(iii)配列番号1,2,12及び/又は13に規定するヌクレオチド配列と相補的である。

0030

ある実施の態様においては、本発明は少なくとも一つのその様なポリヌクレオチドをコードする発現ベクターを提供する。更なる実施の態様においては、本発明はこれらの発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。ある特に好ましい実施の態様においては、宿主細胞はバチルス種である。本発明はまた宿主細胞により生成される中性金属プロテアーゼを提供する。更なる実施の態様においては、本発明は配列番号1,2,12及び/又は13に規定する配列の少なくともある一部と相補的であるポリヌクレオチドを提供する。

0031

本発明はまた、中性金属プロテアーゼ活性を持つ酵素を生成する方法を提供し、その方法は、配列番号1,2,12及び/又は13と少なくとも70%同一の配列を持つポリヌクレオチドを含む配列ベクターにより宿主細胞を形質転換すること、宿主細胞に適した条件で形質転換された宿主細胞を培養することを含む。

0032

ある好ましい実施の態様においては、宿主細胞はバチルス種である。

0033

本発明はまた、配列番号1,2,12及び/又は13の対応する断片と実質的に同一の4から150のヌクレオチド配列を含むプローブを提供し、前記プローブは金属プロテアーゼ活性を持つ酵素をコードする核酸配列を検出するのに用いられる。ある実施の態様においては、核酸はバチルス種から得られる。

0034

本発明はまた、バチルス種から得られる少なくとも一つの中性金属プロテアーゼを含む洗浄組成物を提供する。ある実施の態様においては、少なくとも一つの中性金属プロテアーゼはバチルスアミロリケファシエンスから得られる。ある特に好ましい実施の態様においては、少なくとも一つの中性金属プロテアーゼは配列番号3,4、及び/又は18に規定するアミノ酸配列を含む。ある更なる実施の態様においては、本発明は配列番号3,4、及び/又は18を含む中性金属プロテアーゼと少なくとも45%同一のアミノ酸を含む単離された中性金属プロテアーゼを提供する。ある実施の態様においては、単離された中性金属プロテアーゼは配列番号3,4、及び/又は18と、少なくとも50%同一、好ましくは少なくとも55%同一、より好ましくは少なくとも60%同一、さらにより好ましくは少なくとも65%同一、さらにより好ましくは少なくとも70%同一、さらにより好ましくは少なくとも75%同一、さらにより好ましくは少なくとも80%同一、さらにより好ましくは85%同一、さらにより好ましくは90%同一、さらにより好ましくは少なくとも95%同一、最も好ましくは99%同一であるのが良い。

0035

本発明は更に少なくとも一つの中性金属プロテアーゼを含む洗浄用組成物を提供し、中性金属プロテアーゼの少なくとも一つはバチルス種から得られる中性金属プロテアーゼと免疫交叉反応性を持つ。ある実施の態様においては、中性金属プロテアーゼはバチルスアミロリケファシエンスから得られる中性金属プロテアーゼと免疫交叉反応性を持つ。他の実施の態様においては、中性金属プロテアーゼは配列番号3,4、及び/又は18に規定されるアミノ酸配列を含む中性金属プロテアーゼと免疫交叉反応性を持つ。更なる実施の態様においては、中性金属プロテアーゼはバチルス種中性金属プロテアーゼの断片(すなわち、部分)及び/又は配列番号3,4、及び/又は18に規定されるアミノ酸配列を含む中性金属プロテアーゼと交叉反応性を持つ。本発明は更に、少なくとも一つの中性金属プロテアーゼを含む洗浄組成物を提供し、前記中性金属プロテアーゼは、配列番号3,4、及び/又は18に規定するアミノ酸配列を持つバチルス種中性金属プロテアーゼ、特にバチルス アミロリケファシエンス中性金属プロテアーゼ中のある位置と同等な位置に作られた少なくとも一つのアミノ酸の置換を含むアミノ酸配列を持つ変異体中性金属プロテアーゼである。ある特に好ましい実施の態様においては、本発明はまた少なくとも一つの中性金属プロテアーゼを含む洗浄組成物を提供し、前記中性金属プロテアーゼは配列番号18に規定するアミノ酸配列を持つバチルス種中性金属プロテアーゼ、特にバチルス アミロリケファシエンス中性金属プロテアーゼ中のある位置と同等な位置に作られた少なくとも一つのアミノ酸の置換を含むアミノ酸配列を持つ変異体中性金属プロテアーゼである。

0036

更に他の実施の態様においては、洗浄組成物は配列番号3,4、及び/又は18に一組の変異種を含む少なくとも一つの中性金属プロテアーゼを含む。ある特に好ましい実施の態様においては、変異体中性金属プロテアーゼは配列番号3,4、及び/又は18のアミノ酸位置に対応する少なくとも一つの置換を含み、変異体中性金属プロテアーゼは、野生型バチルスアミロリケファシエンス中性金属プロテアーゼと比較して、少なくとも一つの優れた特性を持つ。

0037

本発明はまた、少なくとも一つの金属プロテアーゼ酵素の、洗浄に効果的な量を含む洗浄組成物を提供し、前記酵素は配列番号3,4、及び/又は18と70%同一の配列を持つアミノ酸配列及び好適な洗浄のための製剤を含む。ある好ましい実施の態様においては、洗浄組成物は更に一以上の追加の酵素又はプロテアーゼ、アミラーゼリパーゼマンナーゼペクチナーゼクチナーゼオキシドレダクターゼヘミセルラーゼ及びセルラーゼよりなる群から選択される酵素誘導体を含む。

0038

本発明はまた、バチルス種、特にバチルスアミロリケファシエンスから得られる少なくとも一つの中性金属プロテアーゼを含む組成物を提供し、前記組成物は更に少なくとも一つの安定剤を含む。ある実施の態様においては、安定剤は、ホウ砂グリセロール亜鉛イオンカルシウムイオン、及びギ酸カルシウム塩から選択される。ある実施の態様においては、本発明は本発明の酵素を陰イオン界面活性剤に対して安定させるために好適な拮抗阻害剤を提供する。ある実施の態様においては、少なくとも一つの中性金属プロテアーゼはバチルス種から得られる。ある特に好ましい実施の態様においては、少なくとも一つの中性金属プロテアーゼはバチルス アミロリケファシエンスから得られる。ある特に好ましい実施の態様においては、少なくとも一つの中性金属プロテアーゼは配列番号3,4、及び/又は18に規定するアミノ酸配列を含む。

0039

本発明は更に、バチルス種から得られる少なくとも一つの中性金属プロテアーゼを含む組成物を提供し、前記中性金属プロテアーゼは自己分解に安定な変異体である。ある実施の態様においては、少なくとも一つの変異体中性金属プロテアーゼはバチルスアミロリケファシエンスから得られる。ある特に好ましい実施の態様においては、少なくとも一つの変異体中性金属プロテアーゼは配列番号3,4、及び/又は18に規定するアミノ酸配列を含む。

0040

本発明はまた、本発明の中性金属プロテアーゼを少なくとも0.0001重量%及び任意選択的に、一つの補助成分を含む洗浄組成物を提供する。ある実施の態様においては、前記組成物は一つの補助成分を含む。ある好ましい実施の態様においては、前記組成物は、組成物に約3から約5の純度のpHを持つ組成物を提供する、十分な量のpH調整剤を含み。前記組成物は約3から約5のpHで加水分解する材料を実質的に含まない。ある特に好ましい実施の態様においては、加水分解する材料は界面活性剤材料を含む。更なる実施の態様においては、洗浄組成物は液状組成物であり、他の実施の態様においては、洗浄組成物は固形組成物であり、更に他の実施の態様においては、洗浄組成物はゲル状である。事実、本発明においては種々の製剤、及び/又は組成物で用いられるため、本発明は特定の製剤及び/又は組成物に限定することを意図するものではない。更なる実施の態様においては、界面活性剤材料は、エチレンオキシド部分を含むアルキル硫酸塩ナトリウム界面活性剤を含む。

0041

本発明は更に、本発明の少なくとも一つの中性金属プロテアーゼに加えて更に少なくとも一つの酸に安定的な酵素を含む洗浄組成物を提供し、前記洗浄組成物は、約3から約5の純度のpHを持つ組成物を提供するに十分な量のpH調整剤を含み、組成物は約3から約5のpHで加水分解する材料を実質的に含まない。更なる実施の態様においては、加水分解する材料は界面活性剤材料を含む。ある好ましい実施の態様においては、洗浄組成物は液状組成物である。更なる実施の態様においては、界面活性剤材料はエチレンオキシド部分を含むアルキル硫酸塩ナトリウム界面活性剤を含む。ある実施の態様においては、洗浄組成物は好適な補助成分を含む。ある実施の態様においては、組成物は好適な補助成分を含む。ある実施の態様においては、組成物は約0.001から約0.5wt%の中性金属プロテアーゼを含む。

0042

ある代替的な好ましい実施の態様においては、組成物は約0.01から約0.1重量%の中性金属プロテアーゼを含む。

0043

本発明はまた、洗浄方法を提供し、該方法は:
a) 表面及び/又は織物を含む商品を、本発明の中性金属プロテアーゼを適当な濃度で含む洗浄組成物に接触させ、及び
b)任意選択的に表面又は材料を洗浄及び/又はすすぐこと
を含むステップを含む。

0044

代替的な実施の態様においては、本明細書に記載の好適な組成物は
どの様なものでも用いることができる。ある実施の態様においては、織物は少なくとも一つの草の染みを含む。ある特に好ましい実施の態様においては、本発明の洗浄組成物は織物から草及び他の染みを除去するのに使用することができる。

0045

本発明はまた、バチルス種から得られる少なくとも一つの中性金属プロテアーゼを含む動物の飼料を提供する。ある実施の態様においては、少なくとも一つの中性金属プロテアーゼはバチルスアミロリケファシエンスから得られる。ある特に好ましい実施の態様においては、少なくとも一つの中性金属プロテアーゼは配列番号3,4、又は18に規定するアミノ酸配列を含む。ある代替的な特に好ましい実施の態様においては、少なくとも一つの中性金属プロテアーゼは配列番号18に規定するアミノ酸配列を含む。

0046

本発明は配列番号18に規定するアミノ酸配列を持つ金属プロテアーゼ活性(例えば、中性金属プロテアーゼ)を持つ単離されたポリペプチドを提供する。ある実施の態様においては、本発明は配列番号18に規定する配列と約40%から98%同一の配列を持つ単離されたポリペプチドを提供する。

0047

ある好ましい実施の態様においては、ポリペプチドは配列番号18に規定する配列と約50%から95%同一の配列を持つ。更にある好ましい実施の態様においては、ポリペプチドは配列番号18に規定する配列と約60%から90%同一の配列を持つ。更なる実施の態様においては、ポリペプチドは配列番号3,4、又は18に規定する配列と約65%から85%同一の配列を持つ。ある特に好ましい実施の態様においては、ポリペプチドは配列番号3,4、又は18に規定する配列と約90%から95%同一の配列を持つ。

0048

本発明は更に、配列番号3,4、又は18と少なくとも40%配列が同一であるアミノ酸配列を含む中性金属プロテアーゼをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。ある実施の態様においては、中性金属プロテアーゼは配列番号3,4、及び/又は18と少なくとも50%配列が同一のアミノ酸配列を含む。

0049

ある実施の態様においては、中性金属プロテアーゼは配列番号3,4、又は18と少なくとも60%配列が同一のアミノ酸配列を含む。

0050

ある実施の態様においては、中性金属プロテアーゼは配列番号3,4、又は18と少なくとも70%配列が同一のアミノ酸配列を含む。

0051

ある実施の態様においては、中性金属プロテアーゼは配列番号3,4、又は18と少なくとも80%配列が同一のアミノ酸配列を含む。

0052

ある実施の態様においては、中性金属プロテアーゼは配列番号3,4、又は18と少なくとも90%配列が同一のアミノ酸配列を含む。

0053

ある実施の態様においては、中性金属プロテアーゼは配列番号3,4、又は18と少なくとも95%配列が同一のアミノ酸配列を含む。

0054

本発明はまた、上に記載のポリヌクレオチドの何れかを含む発現ベクターを提供する。

0055

本発明は更に、本発明の発現ベクターにより形質転換される宿主細胞を提供するため、少なくとも一つの中性金属プロテアーゼはその宿主細胞により発現される。ある実施の態様においては、宿主細胞はバクテリアであり、他の実施の態様においては、宿主細胞は真菌である。

0056

本発明はまたヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供し、ヌクレオチド配列は
(i) 配列番号1,2,12及び/又は13と少なくとも70%配列が同一であり、又は
(ii) 中程度から高度に厳格な条件において、配列番号1,2,12及び/又は13のヌクレオチド配列由来のプローブとハイブリッドすることが可能であり、又は
(iii)配列番号1,2,12及び/又は13のヌクレオチド配列に相補的である。

0057

ある実施の態様においては、本発明はその様なポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。更なる実施の態様においては、本発明はその様なベクターにより形質転換される宿主細胞を提供する。

0058

本発明は更に、中性金属プロテアーゼ活性を持つ少なくとも一つの酵素を生成する方法を提供し、該方法は:配列番号1,2,12及び/又は13と少なくとも70%同一配列を持つポリヌクレオチドを含む発現ベクターにより宿主細胞を形質転換させるステップ、宿主細胞が中性金属プロテアーゼを生成するに適した条件下で形質転換された宿主細胞を培養するステップ、及び中性金属プロテアーゼを回収するステップを含む。ある好ましい実施の態様においては、宿主細胞はバチルス種であり、他方ある実施の態様においては、宿主細胞はバチルスアミロリケファシエンスである。

0059

本発明はまた、本明細書に記載の中性金属プロテアーゼをコードするDNAの断片(すなわち、部分)を提供する。これらの断片はバチルスアミロリケファシエンスから得られる本明細書に記載の成熟中性金属プロテアーゼ酵素又はプロテアーゼ活性を持つその一部分をコードするポリヌクレオチドを分離し、又は同定するために用いることができる部分的な長さのDNA断片を得るのに用いられる。ある実施の態様においては、配列番号2に記載のDNAの部分は、中性金属プロテアーゼ又は金属プロテアーゼ活性を持つその部分をコードする他の種に由来するDNAの同種の断片を得るために用いられる。

0060

本発明は更に、配列番号:1, 2, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15の断片及び/又は本明細書に記載のプライマのいずれとも実質的に同一のポリヌクレオチドを含む少なくとも一つのプローブを提供し、該プローブは金属プロテアーゼ活性を持つ酵素をコードする核酸配列を検出するために用いられ、該核酸配列はバクテリアソースから得られる。ある実施の態様においては、バクテリアソースはバチルス種である。ある好ましい実施の態様においては、バクテリアソースはバチルスアミロリケファシエンスである。

0061

本発明は更に、本明細書に記載の中性金属プロテアーゼの少なくとも一つを含む組成物を提供する。ある好ましい実施の態様においては、組成物は洗浄用組成物である。ある実施の態様においては、本発明は、配列番号18と少なくとも40%同一の配列、少なくとも90%同一、及び/又は配列番号18の配列を持つアミノ酸配列を含む少なくとも一つの中性金属プロテアーゼを洗浄に効果的な量含む洗浄組成物を提供する。ある実施の態様においては、洗浄組成物は更に少なくとも一つの補助洗浄剤を含む。ある実施の態様においては、中性金属プロテアーゼはバチルス種に由来する。ある好ましい実施の態様においては、バチルス種はバチルスアミロリケファシエンスである。

0062

更なる実施の態様においては、洗浄組成物は更に少なくとも一つの酵素又は、プロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、マンナーゼ、及びセルラーゼよりなる群から選択される酵素の誘導体を更に含む。

0063

本発明はまた、配列番号18と少なくとも45%同一の配列、配列番号18と少なくとも60%同一の配列、配列番号18と少なくとも75%同一の配列、配列番号18と少なくとも90%同一の配列、配列番号18と少なくとも95%同一の配列、配列番号18と同一の配列を持つアミノ酸配列を含む単離された天然の中性金属プロテアーゼを提供し、前記中性金属プロテアーゼはバチルス種から単離される。ある実施の態様においては、中性金属プロテアーゼはバチルスアミロリケファシエンスから単離される。

0064

更なる実施の態様においては、本発明は、本発明の中性金属プロテアーゼの改変された変異体を提供する。ある実施の態様においては、改変された変異体はDNA組み換え技術を用いて遺伝子的に組み換えられ、他の実施の形態においては、変異体は自然発生したものである。本発明は更に、単離された酵素ホモログのみならず、ホモログ酵素の改変された変異体を含む。ある実施の態様においては、改変された変異体ホモログ中性金属プロテアーゼはDNA組み換え技術を用いて遺伝子的に組み換えられ、一方他の実施の態様においては、変異体ホモログ中性金属プロテアーゼは天然に発生する。

0065

本発明はまた、中性金属プロテアーゼを生成する方法を提供し、該方法は:
(a) 配列番号2と少なくとも70%同一の配列、配列番号2と少なくとも95%同一の配列、配列番号2のポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドを含む配列ベクターにより宿主細胞を形質転換し、
(b) 宿主細胞が中性金属プロテアーゼを生成するのに適した条件下で形質転換された宿主細胞を培養し、
(c) 中性金属プロテアーゼを回収する
ことを含む。

0066

ある実施の態様においては、宿主細胞はバチルス種である(例えば、バチルススブチリス、バチルスクラウシ(Bacillus clausii)又はバチルス リチェフォルミス(Bacillus licheniformis))。他の実施の態様においては、宿主細胞はバチルスアミロリケファシエンス(Bacillus amylloliquefaciens)である。

0067

更なる実施の態様においては、本発明は本発明の中性金属プロテアーゼを比較的多量に生成することができる宿主細胞を生成する方法を提供する。特に好ましい実施の態様においては、本発明は食料及び/又は飼料成分のみならず、洗浄組成物、織物加工、皮の仕上げ穀物加工、食肉加工、洗浄、タンパク質加水分解物の生成、消化補助剤殺菌性成分静菌性成分、静真菌性成分、個人ケアー製品(例えば、口内ケアー、ヘアケアー、及び/又はスキンケアー)を含み、ポリペプチドの分解又は合成が望まれる場合の種々の商業的応用において中性金属プロテアーゼを生成する方法を提供する。

0068

本発明はまた、野生型バチルスアミロリケファシエンス中性金属プロテアーゼと比べて改良された機能を持つ変異体中性金属プロテアーゼを提供する。他の好ましい実施の態様においては、改良された機能には、野生型バチルス アミロリケファシエンス中性金属プロテアーゼと比べ改良された熱安定性を持つ。

0069

他の好ましい実施の態様においては、改良された機能には、野生型バチルスアミロリケファシエンス中性金属プロテアーゼと比べより低い又はより高いpHにおいて改良された機能を持つ。更なる、好ましい実施の態様においては、改良された機能には、野生型バチルス アミロリケファシエンス中性金属プロテアーゼと比べ、改良された自己分解安定性を含む。ある特に好ましい実施の態様においては、本発明の酵素組成物は、現在用いられている中性金属プロテアーゼに比肩する又はそれより改良された洗濯機能を持つ。本発明の他の目的及び優位性は本明細書の記載より明らかである。

発明の詳細な説明

0070

本発明は改良された保存安定性を持つ少なくとも一つの中性金属プロテアーゼ酵素を含む方法及び組成物を提供する。ある実施の態様においては、中性金属プロテアーゼは洗浄及び他の用途に使用することができる。ある特に好ましい実施の態様においては、本発明はバチルス種から得られる中性金属プロテアーゼを含む方法及び組成物を提供する。ある更に特に好ましい実施の態様においては、中性金属プロテアーゼはバチルスアミロリケファシエンスから得られる。更に好ましい実施の態様においては、中性金属プロテアーゼはバチルス アミロリケファシエンス中性金属プロテアーゼの変異体である。更なる実施の態様においては、中性金属プロテアーゼはバチルス アミロリケファシエンス中性金属プロテアーゼのホモログである。本発明は特に漂白及び殺菌を含む分野で応用されるが、これに限定されるものではない。

0071

特に断らない限り、本発明の実施においては当業者技術範囲にある分子生物学微生物学タンパク質精製、タンパク質工学、タンパク質及びDNA配列決定、及びDNA組み換え分野で通常使用される従来の技術を用いる。その様な技術は当業者に知られており、数多くの論文及び参考文献に記載されている(Sambrook他, 「分子クローン実験室マニュアル」(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)、第二版 (Cold Spring Harbor), [1989]);及びAusubel 他、 「分子生物学における現在の手順」(Current Protocols in Molecular Biology)[1987]))。本明細書に記載の全ての特許、特許出願、論文及び出版物は既に挙げたもの、以下に挙げるものの何れも参照により本明細書に組み入れられる。

0072

更に、本明細書に記載の各見出しは、本発明の種々の特徴又は実施の態様を限定するものではなく、本発明は明細書を全体として考察することにより把握することができる。したがって、これに直ぐ続く定義は明細書を全体として考察することにより更に十分に理解される。しかし、本発明の理解の促進を図るために、多くの用語を以下に定義する。

0073

定義
本明細書において、他の意味として規定しない限り、本明細書の全ての技術及び科学用語はこの発明が関係する技術分野の当業者により通常理解されると同じ意味を持つ。例えば、
Singleton and Sainsbury, 「微生物及び分子生物学辞典」(Dictionary of Microbiology and Molecular Biology)第二版., John Wiley and Sons, NY (1994); 及び Hale 及びMarham, 「Harper Collins生物学辞典」(The Harper Collins Dictionary of Biology)、Harper Perennial, NY (1991)はこれらの当業者に本明細書で使用される多くの用語の一般的辞典を提供する。本明細書に記載のこれらの方法と同様又は同等な方法及び材料は、本発明の実施に使用できるが、本明細書では好ましい方法及び材料が記載されている。したがって、以下に、続いて定義される用語は明細書を全体として考察することにより、より完全に把握することができる。また、本明細書で使用する単数を表わす「a」「an」及び「the」は、文意より明確に異なる意味に解せられない限りその複数系をも含む。
他に断らない限り、核酸は左から右へ、5’ から3’の方向へ記載され;アミノ酸配列は左から右へ、アミノ基からカルボキシ基の方向に記載される。本発明は記載された特定の方法論、手順、及び試薬に限定されるものではないことを理解するべきである。これらは当業者により使用される状況により変わりうるからである。

0074

本明細書を通じ記載されている各最大限界数値は、その下限数値が本明細書に記載されているかの様に、各下限値を含んでいることを意図している。本明細書を通じ記載されている各最小限界数値は、その上限限界値が本明細書に記載されているかの様に、各上限値を含んでいることを意図している。本明細書を通じ記載されている各数値範囲は、そのより狭い数値範囲が、全て本明細書に記載されている様に、その様なより広い数値範囲内にある各狭い数値範囲を含む。

0075

本明細書に引用される全ての書類は、その関係する部分において、参照により本明細書に組み入れられる。各書類を引用することにより、それらの書類は、本発明との関係において先行技術文献であると認めたものと解してはならない。

0076

本明細書で用いる「漂白」(bleaching)は材料(織物、洗濯物パルプ等)に光沢を与え(すなわち、白くする)及び/又は材料を洗浄するため、材料又は表面を十分な時間及び適切なpH及び温度条件で処理することを言う。漂白のための好適な化学品の例には、ClO2, H2O2, 過酸、NO2等を含むがこれに限定されるものではない。

0077

本明細書で用いる「殺菌」(disinfecting)は品物の表面の微生物を抑制し又は殺すのみならず、表面から汚染物質を除去することを言う。本発明は特定の表面、品物又は汚染物質、又は微生物の除去に限定されるものではない。

0078

本明細書で用いる、「多量体」(multimer)は共有結合的に、又は非共有結合的に結合され、及び溶液中で複合物として存在する2以上のタンパク質又はペプチドを言う。

0079

二量体」(dimer)は2つのタンパク質又はペプチドを含む多量体である。「三量体」(trimer)は3つのタンパク質又はペプチドを含む。本明細書で用いる「八量体」(octamer)は8つのタンパク質又はペプチドの多量体である。

0080

本明細書で用いる、「パーソナルケア製品」(personal care product)は、これらに限定されるものではないが、シャンプーボディーローションシャワーゲル局所用の肌の保湿剤歯磨き粉及び/又は他の局所用洗浄剤を含む、髪、皮膚、頭皮及び歯の洗浄、漂白及び/又は殺菌に使用する製品を指す。ある特に好ましい実施の態様においては、これらの製品は人に用いられるが、他の実施の態様においては、これらの製品は人以外の動物に用いる(例えば、獣医による使用)ことができる。

0081

本明細書で用いる「洗浄(用)組成物」(cleaning composition)及び「洗浄(用)製剤」(cleaning formulation)は、特に断らない限り、織物、皿、コンタクトレンズ、他の汚染された基質ヘア(シャンプー)、皮膚(石鹸及びクリーム)、歯(うがい薬、歯磨き粉)等の様な洗浄される物品から望まれない化合物を除去するのに使用される組成物を指す。この用語は、組成物が中性金属プロテアーゼ及び組成物に用いられる他の酵素と両立しうる限り、特定の種類の所望の洗浄組成物及び製品の形式(例えば、液体、ゲル、顆粒又はスプレー組成物)用に選定される任意の材料/化合物を含む。洗浄組成物材料の特定のものの選択は、洗浄される表面、品物又は織物及び、使用時の洗浄条件に合う組成物の所望の形を考慮することにより容易に行うことができる。

0082

この用語は更に、任意の物品及び/又は表面の洗浄、漂白、殺菌及び/又は殺菌消毒するのに適した任意の組成物を指す。この用語は、洗剤組成物(例えば、液体及び/又は固体洗濯用洗剤及びきめの細かい織物用洗剤;ガラス、木、セラミック及び金属カウンター甲板及び窓の様な固い表面洗浄用製剤;カーペットクリーナ炉用クリーナ;織物用消臭脱臭剤;織物軟化剤;繊維及び洗濯用事前染み抜き;皿用洗剤は当然のことである)を含むが、これに限定されるものではない。

0083

事実、本明細書で用いる「洗浄用組成物」(cleaning composition)は、特に断らない限り、顆粒状又は粉末汎用又は強力洗濯剤、特に洗浄洗剤;液体、ゲル、又はペースト状汎用洗濯用剤、特にいわゆる強力液(HDL)タイプ;液状のきめ細かい織物用洗剤;手洗い用皿洗い用洗剤又は軽質皿洗い用洗剤、特に高泡立ちタイプの皿洗い用洗剤;家庭用及び業務用の種々の錠剤、顆粒、液体及びすすぎ補助タイプを含む機械洗い皿洗い用洗剤;抗菌性手洗いタイプ、洗浄用石鹸、うがい薬、入れ歯洗浄剤、車又はカーペット用シャンプー、フロ洗浄剤を含む液体洗浄剤及び殺菌剤;ヘアシャンプー、及びヘアリンス;シャワーゲル及び泡バス及び金属洗浄を含み、並びに漂白用添加剤及び「汚れ棒」(stain stick)又は事前処理タイプの様な洗浄補助剤を含むのはもちろんである。

0084

本明細書で用いる「洗剤(用)組成物」(detergent composition)及び「洗剤(用)製剤」(detergent formulation)は、汚れた物を洗浄するための洗剤媒体で使用されることが意図されている混合物を指すのに用いられる。ある好ましい実施の態様においては、この用語は織物及び/又は衣料を洗濯する(例えば、洗濯洗剤)こととの関連で用いられる。他の実施の態様においては、この用語は、皿、刃物等の洗浄に用いられる他の洗剤を指す(例えば、皿洗い用洗剤)。本発明においては特定の洗剤調剤又は組成物に限定することを意図するものではない。事実、中性金属プロテアーゼに加えて、この用語は、界面活性剤、トランスフェラーゼ加水分解酵素酸化還元酵素、原材料(ビルダー)、漂白剤、漂白活性剤青味剤蛍光染料固化抑制剤マスキング剤酵素活性剤抗酸化剤及び可溶剤を含む洗剤を含む。

0085

本明細書で用いる、「出願人酵素」(Applicant enzyme)は本発明の中性金属プロテアーゼを言う。

0086

本明細書で言う、洗剤の「改善された機能」(enhanced performance)は、標準洗濯サイクル後に、通常の評価によって決定される、漂白に敏感な汚れ(例えば、草、おワイン、血、くすみ等)を洗浄する力が増すことと定義される。ある特異な実施の態様においては、本発明の中性金属プロテアーゼは、有色の染み及び汚れを除去することにおいて改良された機能を提供する。更なる実施の態様においては、本発明の酵素はしみの除去及び/又は脱色において改善された機能を提供する。

0087

本明細書で用いる、「硬表面洗浄組成物」(hard surface cleaning compositon)は、床、壁、タイル風呂場、及び台所備品などの様な硬い表面を洗浄するための洗剤組成物を指すが、その組成物は固体状、液体状、エマルジョンなどを含むがこれに限定されず任意の形で提供される。

0088

本明細書で用いる「皿用洗浄組成物」(dishwashing composition)は顆粒状、液状を含むあらゆる形の皿用洗浄剤を指すが、これらに限定されるものではなく、任意の形の組成物を指す。

0089

本明細書で用いる、「織物洗浄組成物」(fabric cleaning composition)は、織物を洗浄する全ての形の洗剤組成物を指し、顆粒状、液状及び棒状のものを含むが、これらに限定されるものではない。

0090

本明細書で用いる、「布地」(textile)は、糸、織物、ニット及び不織布へ転換し又はこれらとして使用するに適した短繊維、及び繊維のみならず、織物を指す。この用語は、合成(例えば、製造された)繊維から得られるもののみならず、天然に得られる糸を含む。

0091

本明細書で用いる、「布地材料」(textile material)は、繊維、糸の中間材、糸、織物、及び織物から得られる製品(例えば、衣料及び他の商品)の一般的総称である。

0092

本明細書で用いる、「織物」(fabric)は任意の布地材料を含む。したがって、この用語は織物、糸、繊維、不織布材料天然材料合成材料、及び他の任意の布地材料にみならず衣料品をも含む。

0093

本明細書で用いる、「適合可性のある」(compatible)は、洗剤組成物材料が、中性金属プロテアーゼが通常の使用条件において所望の効果を発揮することができない程度に、中性金属プロテアーゼの酵素活性を低減させないことを言う。

0094

特定の洗剤組成物材料については以下に詳細に説明する。

0095

本明細書で用いる、「酵素の効果的な量」(effective amount of enzyme)は、特定の応用(パーソナルケア製品、洗剤組成物等)において必要とされる酵素活性を得る為に必要な酵素の量を言う。その様な効果的な量は当業者により容易に確認することができ、使用される特定の酵素の変異体、洗剤使用分野、洗浄組成物の特定の組成物、及び液状又は乾燥した(例えば、顆粒状、棒状)組成物が必要であるか等多くの要素に基づく。

0096

本明細書で用いる、「非繊維洗浄組成物」(non-fabric cleaning composition)は、硬表面洗浄組成物、皿洗浄用組成物、パーソナルケア洗浄組成物(例えば、口内洗浄組成物、入れ歯洗浄組成物、パーソナル洗浄組成物等)及びパルプ及び製紙工業の使用に適した組成物を含む。

0097

本明細書で用いる、「口内洗浄組成物」(oral cleaning composition)は、歯磨き剤練り歯磨き歯磨き用ゲル、歯磨き粉、うがい薬、口腔用スプレー、口腔用ゲル、チュウインガムトローチ剤、におい袋、錠剤、バイオゲル病気予防ペースト、歯治療用液体等を言う。

0098

本明細書で用いる、「トランスフェラーゼ」(transferase)は官能基を含む化合物を基質の範囲への移転触媒する酵素を言う。

0099

本明細書で用いる、「離脱基」(leaving group)は、アシル供与体が他の求核試薬により置換されることで開裂される求核試薬を言う。

0100

本明細書で用いる、「酵素的変換」(enzymatic conversion)は、基質又は中間体を酵素に接触させることにより、ある基質を中間体に、又は中間体を最終製品に修飾することを言う。ある実施の態様においては、接触は基質又は中間体を直接適当な酵素に暴露することにより行われる。他の実施の態様においては、接触は基質又は中間体を、各々酵素を発現させ及び/又は分泌する有機体に暴露することを含み、及び/又は所望の基質及び/又は中間体を所望の中間体及び/又は最終製品に代謝する。

0101

本明細書で用いる、「洗浄安定性」(detergent stability)は、洗剤組成物の安定性を言う。ある実施の態様においては、安定性は洗剤の使用中に評価され、他の実施の態様においては、この用語は保存中の洗剤組成物の安定性を言う。

0102

本明細書で用いる、「タンパク質分解に対する安定性」(stability to proteolysis)はタンパク質分解に抵抗するタンパク質(例えば、酵素)の能力を言う。この用語はタンパク質の安定性を評価するためのある特定のプロテアーゼの使用に限定することを意図しているものではない。

0103

本明細書で用いる、「酸化安定性」(oxidative stability)は酸化される条件下でタンパク質が機能する能力を言う。特に、この用語は種々の濃度のH2O2及び/又は過酸の存在下で機能するタンパク質の能力を言う。種々の酸化性条件下での安定性は、当該技術分野で知られている標準的手順及び/又は本明細書に記載の方法により測定することができる。酸化に対する安定性の本質的変化は、酸化性化合物が存在しない場合の酵素活性に比べて、酵素活性の半減期において少なくとも約5%以上増大するか又は減少するか(殆んどの実施の態様において、好ましくは増大するのが良い)により示される。

0104

本明細書で用いる、「pH安定性」(pH stability)は特定のpHでタンパク質の機能する能力を言う。一般的に殆んどの酵素は機能するpHの範囲が限定されている。さらに中間範囲のpH(例えば、約pH7)で機能する酵素に加えて、非常に高い、又は非常に低いpH条件下で機能することの可能な酵素がある。種々のpHでの安定性は、該技術分野で知られている標準的手順及び/又は本明細書に記載の方法により測定することができる。pHの安定性の本質的変化は、酵素の最適pHでの酵素活性に比べて、酵素活性の半減期において少なくとも約5%以上増大するか又は減少するか(殆んどの実施の態様において、好ましくは増大するのが良い)により示される。しかし、本発明は特定のpHでの安定性又はpH範囲に限定されるものではない。

0105

本明細書で用いる、「熱安定性」(thermal stability)はある特定の温度で機能するタンパク質の能力を言う。一般に、殆んどの酵素は機能する温度範囲が限られている。中間範囲の温度(例えば、室温)で機能する酵素に加えて、非常に高い、又は非常に低い温度で機能することのできる酵素がある。熱安定性は既知の手順、又は本明細書に記載の方法により測定することができる。熱安定性における本質的変化は、酵素の最適温度と異なる温度に曝されたときの変異体の触媒活性の半減期において、少なくとも約5%以上増大するか又は減少するか(殆んどの実施の態様において、好ましくは増大するのが良い)により示される。しかし、本発明は特定の温度レベルでの安定性又は温度範囲に限定されるものではない。

0106

本明細書で用いる、「化学的安定性」(chemical stability)はその活性に悪影響を与える化合物質に対するタンパク質(例えば、酵素)の安定性を言う。ある実施の態様においては、その様な化合物質は、過酸化水素、過酸、陰イオン洗剤、陽イオン洗剤非イオン洗剤キーラント(chelant)等を含むがこれに限定されるものではない。しかし、本発明は特定の化学物質に対する安定性のレベル又は化学物質の範囲に限定されるものではない。

0107

本明細書で用いる、「中性金属プロテアーゼ活性の改良」(neutral metalloprotease activity improvement)は、標準的酵素と比べた中性金属プロテアーゼ活性の相対的改良度を言う。他の実施の態様においては、この用語は加水分解製品の生成がより少ない組成物を含む。ある実施の態様においては、この用語は製品の製剤での改良度合いを言い、他の実施の態様においては、この用語は改変された基質特異性を持つ中性金属プロテアーゼを言う。

0108

本明細書で用いる、「基質特異性の変化」(alteration in substrate specificity)は酵素の基質特異性における変化を言う。ある実施の態様においては、基質特異性の変化は、酵素の、酵素変異体又は他の酵素組成物と対比したKcat/Km比の間の差異と定義される。酵素基質特異性試験される基質により変わる。酵素基質の特異性は、酵素が異なる基質に対して示す触媒効率を比較することにより決定される。これらを決定することは、一般に、特に関心のある基質において、より大きな比率を示す変異体酵素を生成することが望まれるため、特に変異酵素の効率を評価するのに用いるのが有用である。

0109

しかし、本発明は、特定の基質組成物や特定の基質の特異性を持つものに限定されるものではない。

0110

本明細書で用いる、「表面特性」(surface property)は、タンパク質の表面に現れる疎水性及び/又は親水性のような性質のみならず、帯電に関しても用いられる。

0111

本明細書で用いる、「よりなる群から独立に選択され」(is independently selected from the group consisting of . . .)の語句は、以下の例に示される様に、参照されるマーカッシュ群から選択される部分又は要素が同じ、異なる又はこれらの要素の混合であり得ることを言う。その例としては、3R基を持つ分子であり、各R基はA,B及びCよりなる群から独立に選択される。ここで3つのR基は、AAA, BBB, CCC, AAB, AAC, BBA, BBC, CCA, CCB, 又はABCである。

0112

化学組成物については、本明細書で用いる「置換され」(substituted)の用語は、この用語が適用される有機組成物又はラジカルが:
(a) 少なくとも一つの元素又はラジカルを除くことにより不飽和となる、
(b)化合物又はラジカル中の少なくとも一つの水素が、一以上の(i)炭素、(ii)酸素、(iii)硫黄、(iv)窒素、又は (v)ハロゲン原子を含む部分により置換され、又は
(c) 上の(a) 及び(b)の両方である、
ことを言う。

0113

炭素及び水素原子のみを含む、前記(b)に記載の様に、水素を置換する部分は、アルキルアルケニルアルキニル、アルキルジエニルシクロアルキル、フフェニルアルキルフェニルナフチルアントリル、フェナアントリル、フルオリル、ステロイド基、及びこれらの基と各他の基との組み合わせ、及びアルキレンアルキリデン、及びアルキリデン(alkylidyne))基のような多価炭化水素基との組み合わせを含む炭化水素部分であるが、これに限定されるものではない。前記(b)に記載の様に、水素を置換する酸素原子を含む部分は、ヒドロキシアシル、ケトエーテルエポキシカルボキシ、及びエステルを含む基を含むが、これに限定されるものではない。前記(b)に記載の様に、水素を置換する硫黄原子を含む部分は、硫黄含有酸及び酸エステル基チオエーテル基メルカプト基及びチオケト基を含むが、これに限定されるものではない。前記(b)に記載の様に、水素を置換する窒素原子を含む部分は、アミノ基、ニトロ基アゾ基アンモニア基、アミド基アジド基イソシアネート基シアノ基及びニトリル基を含むが、これに限定されるものではない。前記(b)に記載の様に、水素を置換するハロゲン原子を含む部分は、塩素臭素フッ素ヨウ素基及び上に記載の任意の部分を含み、ここで水素又は側基アルキル基ハロ基で置換されて安定した置換部分を形成する。

0114

上の(b)(i) から(b)(v)の任意の部分は、一価置換により又は多価置換により水素を失うことにより、夫々他の中に置換されて、有機化合物又はラジカル中の水素を置換することのできる他の一価部分を形成すると理解される。

0115

本明細書で用いる、「精製され」(purified)及び「単離され」(isolated)はサンプルから汚染物質を除去することを言う。例えば、中性金属プロテアーゼは溶液中の汚染するタンパク質及び他の化合物、又は中性金属プロテアーゼでない調剤を除去することにより精製される。ある実施の態様においては、組み換え中性金属プロテアーゼは細菌性又は真菌性宿主細胞で発現し、これらの組み換え中性金属プロテアーゼは他の宿主細胞成分を除去することにより精製され、それによってサンプル中の組み換え中性金属プロテアーゼポリペプチドのパーセントが増大する。特に好ましい実施の態様においては、本発明の金属プロテアーゼはSDS-PAGE 又は技術分野で知られている他の標準的な方法により決定される様に、タンパク質の成分が本質的に少なくとも約99%のレベルにまで精製される。他の好ましい実施の態様においては、本発明の金属プロテアーゼは組成物中に少なくとも99%のプロテアーゼ成分を含む。更に他の実施の態様においては、金属プロテアーゼは全タンパク質及び/又はプロテアーゼの少なくとも約90−95%の範囲で存在する。

0116

本明細書で用いる、「関心の対象のタンパク質」(protein of interest)は分析され、同定され及び/又は修飾されるタンパク質(例えば、酵素又は「関心の対象の酵素」(enzyme of interest))を言う。組み換えタンパク質のみならず天然のタンパク質も本発明で用いることができる。

0117

本明細書で用いる、「タンパク質」(protein)はアミノ酸よりなる任意の組成物及び当業者によりタンパク質として認められている任意の組成物を言う。「タンパク質」及び「ペプチド」の用語は相互交換的に用いられる。ペプチドはタンパク質の一部分であり、当業者はこの用語の意味を文意中で理解するであろう。

0118

本明細書で用いる、機能的及び/又は構造的に類似のタンパク質は「関連タンパク質」(related proteins)と考えられる。ある実施の態様においては、これらのタンパク質は、有機体の種の間の差異(例えば、細菌タンパク質及び糸状菌タンパク質)を含み、異なる属及び/又は種に由来する。ある実施の態様においては、有機体の種の間の差異(例えば、細菌酵素及び真菌酵素を含み)これらのタンパク質は異なる属及び/又は種に由来する。他の実施の態様においては、関連タンパク質は同じ種から提供される。事実、本発明はある特定のソースに由来の関連タンパク質に限定されることを意図するものではない。さらに、「関連タンパク質」の用語は三次構造ホモログ及び一次配列ホモログ(例えば、本発明の中性金属プロテアーゼ)を含む。例えば、本発明は図3−5に示す様なホモログを含む。更に他のホモログも、オーレオリシン(aureolysin)、細胞外エラスターゼ(extracellular elastase)及び中性プロテアーゼBのみならず、バチルスセレウス(B. cereus)、バチルス セレウスE33L(B. cereus E33L)、バチルスカルドリクス(B. caldolyticus)、バチルス プムリス(B.pumulis)、バチルスメガテリウム(B. megaterium)、バチルススブチリスアミロサッカリチクス(B subtilis amylosacchariticus)、ブレビバチルスブレビス(Brevibacillus brevis))、パエニバチルスポリミクサ(Paenibacillus polymyxa) バチルスポリミクサ(Bacillus polymyxa)、バチルスステアテルモフィルス(Bacillus stearothermophilus)、バチルスツリンゲンシス(B. thuringiensis)、バチルス スブチリス (Bacillus subtilis)及び Sアウレウス(S. aureus)、から得られる金属プロテアーゼを含むが、これに限定されるものではない。

0119

更なる実施の態様においては、この用語は免疫的に交叉反応性を持つタンパク質を含む。

0120

本明細書で用いる、「誘導体」(derivative)は、一以上のアミノ酸を、C及びN末端に付加することにより、一以上のアミノ酸をアミノ酸配列の一又は多くの異なる部位で置換し、及び/又はタンパク質の一方の端又は両端で、又はアミノ酸配列の一以上の部位で、一以上のアミノ酸を欠失し、及び/又はアミノ酸配列の一以上の部位で一以上のアミノ酸を挿入することにより、タンパク質から誘導されたタンパク質を言う。タンパク質の誘導体の生成は、好ましくは天然のタンパク質をコードするDNA配列を修飾し、そのDNA配列を好適な宿主細胞に形質転換し、及び修飾されたDNA配列を発現させて誘導体タンパク質を形成することにより実施されるのが良い。

0121

関連(及び誘導体)タンパク質は、「変異体タンパク質」(variant protein)を含む。
ある好ましい実施の態様においては、変異体タンパク質は親タンパク質と異なり、また互いにその小数アミノ酸残基が異なる。異なるアミノ酸残基の数は一以上、好ましくは1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 又はそれ以上であることもある。ある好ましい実施の態様においては、変異体間の異なるアミノ酸の数は1乃至10の間である。ある好ましい実施の態様においては、関連タンパク質及び変異体タンパク質は、少なくとも35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%,90%, 95%, 97%, 98% 又は99%アミノ酸配列が同一である。更に、本明細書で用いる関連タンパク質又は変異体タンパク質は、顕著な領域の数において他の関連タンパク質又は親タンパク質と異なるタンパク質を言う。例えば、ある実施の態様においては、変異体タンパク質は、親タンパク質と異なる1, 2, 3, 4, 5, 又は10の対応する顕著な領域を持つ。

0122

本発明の酵素の変異体を産み出すのに好適な方法は、部位飽和突然変異法、走査突然変異法、挿入突然変異法、ランダム突然変異法、部位特異突然変異法、及び指向進化法、及び種々の他の組み換えによるアプローチを含みいくつかの方法が知られているが、これに限定されるものではない。

0123

野生型及び変異タンパク質特徴付けは任意の適当な方法で実施することができ、好ましくは関心のある特性の評価に基づくのが良い。例えば、本発明のある実施の態様においては、pH及び/又は温度並びに洗剤及び/又は酸化安定性が決定される。事実、これらの一以上の特徴(pH,温度、タンパク質分解安定性、洗剤安定性、及び/又は酸化安定性)において種々の異なる安定性を持つ酵素を用いることが意図されている。

0124

本明細書で用いる、「発現ベクター」(expression vector)は、好適な宿主中でDNAを発現させることのできる好適な制御配列に動作可能にリンクされているDNA配列を含むDNA構築体を言う。その様な制御配列は、転写を行うプロモータ、その様な転写を制御する任意のオペレーター配列、好適なmRNAリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写及び翻訳の終了を制御する配列を含む。ベクターはプラスミドファージ粒子、又は単にゲノム挿入可能物であっても良い。好適な宿主に形質転換されると、ベクターは複製され、そして宿主ゲノムとは独立に機能する、又はある場合には、ゲノム自身と一体となる。プラスミドは現在最も良く用いられるベクターの形であるため、本明細書では、「プラスミド」(plasmid)、「発現プラスミド」(expression plasmid)及び「ベクター」(vector)はしばしば相互交換的に用いられる。しかし、本発明では、同等機能を持つその様な他の形の発現ベクターで、当業者に知られており、又は知られるであろうものを含むことを意図している。

0125

ある好ましい実施の態様においては、中性金属プロテアーゼ遺伝子は適当な発現プラスミドに結紮している。クローンされた中性金属プロテアーゼ遺伝子が、その後中性金属プロテアーゼ遺伝子を発現させるために宿主細胞を形質転換し、又はトランスフェクするために使用される。このプラスミドは、プラスミドを複製するために必要な周知の要素を含む、又はプラスミドが宿主染色体統合されるようにデザインされるという意味で宿主中で複製される。効果的な遺伝子発現のために必要な要素が提供される(例えば、関心の対象となる遺伝子に動作可能にリンクされたプロモータ)。ある実施の態様においては、これらの必要な要素はもし認識される場合(すなわち、宿主により転写される)は遺伝子自身の同族プロモータとして供給され、転写ターミネータ真核性宿主細胞のためのポリアデニル化領域)は外生的であるか、又は中性金属プロテアーゼ遺伝子の内生ターミネータ領域により供給される。ある実施の態様においては、抗菌を含む培養体中で成長することにより、プラスミドに感染した宿主細胞を連続的に培養維持することのできる耐抗生物質遺伝子の様な選択遺伝子もまた含まれる。

0126

他の方法を使用することもできるが、以下のカセット式変異誘発法は、本発明の中性金属プロテアーゼ変異体の構築を促進するために用いても良い。まず、本明細書に記載の様に、中性金属プロテアーゼをコードする天然の遺伝子を得て、その全部又は一部を配列決定する。その後、配列は、コードされた中性金属プロテアーゼ中の一以上のアミノ酸の変異(欠失、挿入又は置換)を起させたい所を探してスキャンする。この箇所に隣接する配列については、オリゴヌクレオチドが発現される場合に種々の変種をコードするそのオリゴヌクレオチドプールにより遺伝子の小部分を置換する制限部位が存在するか評価される。
その様な制限部位は、好ましくは遺伝子小部分の置換を促進するために、タンパク質内の特異部位であるのが良い。しかし、制限的消化により生成される遺伝子断片が適正な配列に再構築されるならば、中性金属プロテアーゼ遺伝子中の過度に余分でない従来の任意の制限部位を用いることができる。もし制限部位が選択された箇所から好都合な距離の位置にない場合(10−15ヌクレオチド)は、その様な部位は遺伝子中のヌクレオチドを置換することにより、最終的構築体においてリーディングフレーム及びコードされたアミノ酸の何れもが変えられない様な方法により生成される。

0127

遺伝子の配列を所望の配列に変えるために、遺伝子の変形は通常知られているM13プライマ伸長法により実施されうる。適当な隣接領域を確認し、及び2つの都合の良い制限部位配列に到達するための必要な変化を評価する仕事は、遺伝子コード重複、遺伝子の制限酵素マップ及び数多くの異なる制限酵素により日常的に行われる。もし都合の良い隣接制限部位が使用できる場合は、上記の方法は、部位を持たない隣接領域との関連においてのみ必要となることに留意すべきである。

0128

天然のDNA及び/又は合成DNAがクローンされると、変異される位置に隣接する制限部位は同族の制限酵素により消化され、そして複数の末端相補的オリゴヌクレオチドカセットが遺伝子に結紮される。突然変異はこの方法では簡素化される。その理由は、全てのオリゴヌクレオチドは同じ制限部位を持つように合成され、制限部位を生成するために合成リンカーは必要ないからである。

0129

本明細書で用いる、「対応する」(corresponding to)タンパク質又はペプチド中の列挙された位置の残基、又はタンパク質又はペプチド中の列挙された位置の残基に類似の、同族の、又は同等の残基を言う。

0130

本明細書で用いる、「対応領域」(corresponding region)は関連タンパク質又は親タンパク質に沿った類似の位置を言う。

0131

核酸分子をコードする」(nucleic acid molecule encoding)、「核酸配列をコードする」(nucleic acid sequence encoding)、「DNA配列をコードする」((DNA sequence encoding))、「DNAをコードする」(DNA encoding)はデオキシリボ核酸らせん構造に沿ったデオキシリボヌクレオチド順序又は配列を指すこれらのデオキシリボヌクレオチドの順序は、ポリペプチド(タンパク質)鎖に沿ったアミノ酸の順序を決定する。この様にDNA配列はアミノ酸配列をコードする。

0132

本明細書で用いる、「類似配列」(analogous sequence)は同様な機能、三次構造及び/又は関心の対象であるタンパク質としての保存残基(すなわち、典型的には関心のあるタンパク質の元の形)を提供するタンパク質内の配列を言う。

0133

例えば、アルファらせん又はベータシート構造を持つエピトープ領域では、類似配列中の置換アミノ酸は同じ特異構造を維持するのが好ましい。この用語はまたアミノ酸配列のみならず、ヌクレオチド配列を言う。ある実施の態様においては、置換アミノ酸が同様な又は改良された機能を示す変異体酵素となる様に、類似配列が開発される。ある好ましい実施の態様においては、関心の対象となるタンパク質中の三次構造及び/又はアミノ酸の保存残基は、関心のある区分又は断片において又はその近くに位置する。この様に、関心のある部分又は断片は、例えば、アルファらせん又はベータシート構造を含む場合は、好ましくは置換アミノ酸はその特異構造を維持するのが良い。

0134

本明細書で用いる、「相同タンパク質」(homologous protein)は、関心の対象となるタンパク質(例えば、他のソースからの中性金属プロテアーゼ)として同様な作用及び/又は構造をもつタンパク質(例えば、中性金属プロテアーゼ)を言う。ホモログ(また、「相同物」(homologue)とも呼ばれる)は必ずしも進化的に関連することを意味しているものではない。したがって、この用語は異なる種から得られる同じ又は類似の酵素(すなわち、その構造及び機能において)を含むことを意図している。ある好ましい実施の態様においては、関心の対象であるタンパク質中の部分又は断片を、ホモログからの類似部分により置換することによって変化の混乱を低減させることとなるため、関心の対象となるタンパク質に類似の第四次、第三次及び/又は第一次構造を持つホモログを同定することが望ましい。

0135

本明細書で用いる、「ホモログ遺伝子」(homologous genes)は、異なる種からの少なくとも一対の遺伝子を言い、これらの遺伝子は互いに対応し、及びお互いに同一又は非常に類似している。この用語は遺伝子複製によって分離された遺伝子(例えば、パラロガス遺伝子)のみならずスペシエーション(すなわち、新しい種の開発)(例えば、オルソロガス遺伝子)によって分離された遺伝子を含む。これらの遺伝子は「相同タンパク質」をコードする。

0136

本明細書で用いる、「オルソログ」(ortholog)及び/又は「オルソロガス遺伝子」(orthologous gene)はスペシエーションによって共通の先祖遺伝子(すなわち、相同遺伝子)より進化した異なる種の遺伝子を言う。典型的には、オルソログは進化の過程で同じ機能を保持する。オルソログの同定は新しく配列決定されたゲノムにおいて遺伝子機能予測する信頼される方法として用いられる。

0137

本明細書で用いる、「パラログ」(paralog)及び「パラロガス遺伝子」(paralogous gene)はゲノム内で複製されることにより関連する遺伝子を言う。オルソログが進化の過程で同じ機能を保持するのに対し、パラログは、その幾つかの機能は元の機能としばしば関連するものであるが、新しい機能を発展させる。

0138

パラロガス遺伝子の例には、全てセリンプロテナーゼであり、同じ種内で共に生じるトリプシンキモトリプシン、エラスターゼ及びトロンビンをコードする遺伝子を含むがこれに限定されるものではない。

0139

本明細書で用いる、「野生型」(wild-type)及び「天然」(native)のタンパク質は自然に見出されるタンパク質を言う。「野生型配列」(wild-type sequence)及び「野生型遺伝子」(wild-type gene)は、本明細書では相互交換的に使用され、天然に存在し又は宿主細胞中で自然発生的に生じる配列を指す。

0140

ある実施の態様においては、野生型配列はタンパク質組み換え計画開始点である関心の対象である配列を言う。自然に生じるタンパク質をコードする遺伝子は、技術分野で知られている一般的方法に従って得ても良い。これらの方法は通常、関心の対象となるタンパク質の推定配列コード領域を持つ標識プローブを合成し、タンパク質を発現させる有機体からのゲノムライブラリーを生成し、及びプローブにハイブリッドすることにより関心の対象である遺伝子のライブラリースクリーニングすることを含む。確実にハイブリッドするクローンの遺伝子地図が作られそして配列が決定される。

0141

本明細書で用いる「組み換えDNA分子」(recombinant DNA molecule)は、分子生物学の技術により結合されたDNA部分よりなるDNA分子を言う。

0142

「組み換えオリゴヌクレオチド」(recombinant oligonucleotide)の用語は、分子生物学操作により生成されるオリゴヌクレオチドを言い、ポリヌクレオチド配列の制限酵素による消化により生成される2以上のオリゴヌクレオチド配列の結紮、オリゴヌクレオチドの合成(例えば、プライマ又はオリゴヌクレオチドの合成)等を含むがこれに限定されるものではない。

0143

配列間の相同性の程度は技術分野で知られている任意の好適な方法を用いて決定することができる(例えば、Smith and Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482 [1981]; Needleman and Wunsch, J. MoI. Biol., 48:443 [1970]; Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 [1988]; Wisconsin Geneticsソフトウエア一式(Genetics Computer Group, Madison, WI)中のGAP, BESTFIT,FASTA, 及びTFASTA の様なプログラム; 及びDevereux 他、Nucl. Acid Res., 12:387-395 [1984]を参照)。

0144

例えば、PILEUPは、相同性のレベルを決定する有用なプログラムである。

0145

PILEUPは漸進的な、対合アラインメントを用いて関連配列グループから複数配列アラインメントを作り出す。それはまた、アラインメントを作るために用いられる一団の関係を示すツリー(tree)をプロットすることができる。PILEUPはFeng and Doolittle, (Feng and Doolittle, J. MoI. Evol., 35:351-360 [1987])の漸進アラインメントを単純化してものを用いる。この方法はHiggins 及びSharp (Higgins and Sharp, CABIOS 5: 151-153 [1989])により記載されたものと類似する。有用なPILEUPパラメータは、デフォールトギャップウエイト3.00, デフォールトギャップ長さウエイト0.10, 及び加重エンドギャップを含む。

0146

有用なアルゴリズムの他の例には、Altschul 他、(Altschul 他、J. MoI. Biol., 215:403-410, [1990]; 及び Karlin 他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 [1993])により記述されたBLASTアルゴリズムである。

0147

特に有用なBLASTプログラムはWU-BLAST-2である(Altschul他、Meth. Enzymol、266:460-480 [1996]を参照願いたい)。パラメータ"W," "T," 及び"X"はアラインメントの感度及び速度を決定する。BLASTプログラムは11の語長(w)、マトリクスBLOSUM62得点マトリクス(Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 [1989])、50のアラインメント(B)、10の期待値(E)、M'5, N'-4, 及び両鎖構造の比較をデフォールトとして用いる。

0148

本明細書で用いる、「パーセント(%)核酸配列の同一性」(percent (%) nucleic acid sequence identity)は、配列のヌクレオチド残基と同一である候補配列中のヌクレオチド残基のパーセントとして定義される。

0149

本明細書で用いる、「ハイブリッドする」(hybridization)は、技術分野で知られている様に、核酸のらせんが塩基ペアーを通して相補鎖と結合するプロセスを言う。

0150

本明細書で用いる、「ハイブリッドする条件」(hybridization conditions)は、ハイブリッド反応が実施される条件を言う。これらの条件は、典型的にはハイブリッド化が測定される条件の「厳格さ」(stringency)の程度により分類されている。厳格さの程度は、例えば、核酸結合複合体又はプローブの溶融温度に基づくことが可能である。例えば、「最も厳格」(maximum stringency)は典型的にはTm−約5°C (プローブのTmより5℃低い);「高度に厳格」(high stringency)は通常、Tmより5-10℃低い;「中程度に厳格」(intermidiate stringency)はプローブのTmより約10-20℃低い;「低度に厳格」(low stringency)はTmより約20-25℃低い。代替的に、又は追加的に、ハイブリッド条件はハイブリッド条件の塩又はイオン強度及び/又は一以上の洗濯の厳格さに基づいても良い。
例えば、6xSSC = 非常に低い厳格さ、3xSSC =低から中程度の厳格さ;1xSSC = 中程度の厳格さ; 及び0.5xSSC = 高度の厳格さである。機能的には、「最も厳格」条件は、ハイブリッドプローブを用いて厳格な同一性又は厳格な同一性に近い同一性を持つ核酸配列を同定するのに用いても良く、プローブと約80%以上の同一性を持つ核酸配列を同定するのに用いられる。

0151

高選択性を必要とする応用分野では、通常、ハイブリッドを形成するために比較的厳しい条件を使用するのが望ましい(例えば、相対的に低塩及び/又は高温度条件が使用される)。

0152

少なくとも2つの核酸又はポリペプチドの文意においては、「実質的に類似」(substantially similar)「実質的に同一」(substantially identical)は、ポリヌクレオチド又はポリペプチドが、参考配列(すなわち、野生型)と比べて、少なくとも約40%の同一の配列、より好ましくは少なくとも約50%同一、更に好ましくは少なくとも約60%同一、好ましくは少なくとも約75%同一、より好ましくは少なくとも約80%の同一、更により好ましくは少なくとも約90%同一、更に好ましくは少なくとも約95%の同一、最も好ましくは少なくとも約97%の同一、時には約98%及び約99%同一の配列を持つ配列を含むことを言う。配列の同一性は、例えば、BLAST, ALIGN, 及びCLUSTALの標準パラメータを用いた既知のプログラムを用いて決定しても良い (例えば、Altschul他、 J. MoI. Biol. 215:403-410 [1990]; Henikoff他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 [1989]; Karin他、Proc. Natl. Acad. Sci USA 90:5873 [1993]; 及びHiggins 他、Gene 73:237 - 244 [1988]をご参照)。

0153

BLAST解析を実施するソフトはNational Center for Biotechnology Informationを通して誰でも入手が可能である。またデータベースはFASTAを用いて検索が可能である(Pearson他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-2448 [1988])。2つのポリペプチドが実質的に同一であるとする一つの指標は、第一のポリペプチドが第二のポリペプチドと免疫的に交叉反応することである。典型的には、保存アミノ酸置換が異なるポリペプチドは免疫的に交叉反応する。この様に、例えば、2つのペプチの一つの保存置換のみが異なる場合、ポリペプチドは実質的に第二のポリペプチドと同一である。2つの核酸配列が実質的に同一である他の指標は、2つの分子が厳格な条件(例えば、中程度から高度の厳格さの範囲内で)下でお互いにハイブリッドすることである。

0154

本明細書で用いる、「同等の残基」(equivalent residue)は、互いに特定のアミノ酸残基を持つタンパク質を言う。例えば、同等の残基はその三次構造はX線結晶学により決定されたタンパク質(例えば、中性金属プロテアーゼ)の三次構造レベルで相同性を決定することにより同定されてもよい。同等の残基は、推定同等残基を持つタンパク質、及び関心の対象のタンパク質の、特定のアミノ酸残基の2以上の主鎖の原子原子座標(N上のN、CA上のCA、C上のC、及びO上のO)がアラインメント後、0.13nm及び好ましくは0.1nm内にある残基と定義される。アラインメントは、ベストモデルが解析されるタンパク質の非水素タンパク質原子の原子座標が最大重なるように配向させ、及び位置が決まった後に実現される。好ましいモデルは、結晶学及びタンパク質の特性化/解析の技術分野で知られている方法を用いて、決定された、最高解像度による実験回折データでRを最小とする結晶モデルである。

0155

本明細書で用いる、「ハイブリッド中性金属プロテアーゼ」(hybrid neutral metalloprotease)及び「融合中性金属プロテアーゼ」(fusion neutral metalloprotease)は少なくとも2つの異なる又は「親」(parental)タンパク質から操作されるタンパク質を言う。好ましい実施の態様においては、これらの親タンパク質はお互いにホモログである。例えば、ある実施の態様においては、好ましいハイブリッド中性金属プロテアーゼ又は融合タンパク質はタンパク質のN末端及びタンパク質のホモログのC末端を含む。ある好ましい実施の態様においては、2つの末端は全長サイズ活性タンパク質に対応する様に結合される。

0156

本明細書で用いる、「調節要素」(regulatory element)は核酸配列の発現のある部面を制御する遺伝子因子を言う。例えば、プロモータは動作可能にリンクされたコード領域の転写の開始を促進する調節要素である。更なる調節要素には、スプライシングシグナルポリアデニル化シグナル及び終結シグナルを含む。

0157

本明細書で用いる、「宿主細胞」(host cell)は一般的に、技術分野で知られている組み換えDNA技術を用いて構築されたベクターにより形質転換され又はトランスフェクションされた原核生物又は真核性宿主である。形質転換された宿主細胞はタンパク質変異体をコードするベクターを複製し、又は所望のタンパク質変異体を発現させることができる。
タンパク質変異体のプリフォーム又はプリプロフォームをコードするベクターの場合、その様は変異体は、発現される場合には、通常宿主細胞から宿主細胞媒体中に分泌される。

0158

核酸配列を細胞に挿入する場合の「導入される」(introduced)の用語は、形質転換、形質導入又はトランスフェクションを言う。形質転換の方法には、技術分野で知られているプロトプラスト形質転換、塩化カルシウム沈殿電気穿孔法(electroporation)、のDNA等を含む。(Chang 及びCohen, MoI. Gen. Genet., 168:111 - 115 [1979]; Smith 他、Appl. Env. Microbiol., 51:634 [1986];及びFerrari他の論文、Harwood, Bacillus中の論文, Plenum Publishing Corporation, 57-72ページ[1989])を参照)。

0159

「プロモータ/エンハンサー」(promoter/enhancer)は、プロモータ及びエンハンサー機能を共に与えることのできる配列を含むDNAの一部分を示す(例えば、レトロウイルスの長い末端の繰り返しが共にプロモータ/エンハンサーを含む)。

0160

エンハンサー/プロモータは「内因性」又は「外因性」又は「非相同性」であることもある。内因性エンハンサー/プロモータはゲノム中のある遺伝子と自然にリンクしているものである。外因性(非相同性)エンハンサー/プロモータは遺伝子操作(すなわち、分子生物学技術)により遺伝子と並んだ位置に置かれたものである。

0161

発現ベクター上の「スプライシングシグナル」(splicing signal)は、しばしば組み換え転写物のより高度の発現をもたらす。スプライシング シグナルは一次RNA転写物からのイントロンの除去を媒介し、スプライスドナー部位及び受容部位よりなる(Sambrook他、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第二版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York [1989], 16.7-16.8ページ)。通常使用されるスプライスドナー部位及び受容部位はSV40の16S RNAのスプライス部位である。

0162

「安定的なトランスフェクション」(stable transfection)、又は「安定的にトランスフェクトされた」(stably transfected)は外来DNAをトランスフェクトされた細胞のゲノムに導入し、統合することを言う。「安定的トランスフェクタント」(stable transfectant)は、外来又は外因性DNAをトランスフェクトされた細胞の遺伝子DNAに安定的に統合した細胞を言う。

0163

本明細書で用いる、「選択可能なマーカー」(selectable marker)又は「選択可能な遺伝子製品」(selectable gene product)は、選択可能なマーカーが発現される細胞上に抗生物質又は薬物に耐性を与える酵素活性をコードする遺伝子の使用を言う。

0164

本明細書で用いる、「増幅」(amplification)及び「遺伝子増幅」(gene amplification)は、特異DNA配列が不釣合いに複製され、増幅された遺伝子がゲノムに当初存在したよりも多いコピー数で存在することを言う。ある実施の態様においては、薬剤(例えば、抑制可能な酵素の抑制剤)の存在下で成長によって細胞を選択することは、薬剤の存在下で成長に必要な遺伝子製品をコードする内生性遺伝子を増幅するか、又はこの遺伝子製品をコードする外因性(すなわち、投入された)配列を増幅することのいずれか、又はその双方となる。

0165

「増幅」(amplification)は鋳型特異性(template specificity)を含む核酸の複製の特異な場合である。これは非特異的鋳型複製と対比されるべきである(すなわち、複製は鋳型に依存するが、特定の鋳型に依存するものではない)。ここでの鋳型特異性は、複製が忠実であるかどうか(すなわち、適正なポリヌクレオチド配列の合成)及びヌクレオチド(リボ−又はデオキシリボ−)特異性とは区別される。鋳型特異性は、しばしば「標的」(target)特異性と呼ばれる。標的配列は、これらが他の核酸から選定されるという意味で「標的」である。増幅技術は、主にこの選定をするために設計されたものである。

0166

本明細書で用いる、「共増幅」(co-amplification)は、単一細胞に他の遺伝子配列(すなわち、発現ベクターに含まれる一以上の非選択性遺伝子)と共に増幅マーカーを導入し、細胞が増幅可能なマーカー及び他の非選択的遺伝子配列を増幅する様に、適当な選択的圧力を与えることを言う。増幅可能なマーカーは物理的に他の遺伝子配列にリンクされても良く、又は代替的に、その一つは増幅可能なマーカーを含み、他は非選択的マーカーを含む2つの別々のDNA が同じ細胞に導入されても良い。

0167

本明細書で用いる、「増幅可能なマーカー」(amplifiable marker)、「増幅可能な遺伝子」(amplifiable gene)及び「増幅ベクター」(amplification vector)は、適当な成長条件でその遺伝子を増幅させるマーカー、遺伝子又は遺伝子をコードするベクターを言う。

0168

本明細書で用いる、「増幅可能な核酸」(amplifiable nucleic acid)は、任意の増幅方法により増幅される核酸を言う。「増幅可能な核酸」は通常「サンプル鋳型」(sample template)を含むと考えられる。

0169

本明細書で用いる、「サンプル鋳型」(sample template)は、「標的」(target)(以下に定義される)の存在が分析されるサンプルに基づく核酸を言う。対照的に、「バックグラウンド鋳型」(background template)は、サンプル中に存在し、又は存在しないサンプル鋳型と異なる核酸について用いられる。バックグラウンド鋳型は殆んどの場合偶然による。それはキャリーオーバーの結果であるか、又はサンプルから精製されて除去される核酸汚染物質によるものである。例えば、検知されるべき有機体以外の有機体からの核酸は、テストサンプル中にバックグラウンドとして存在することもある。

0170

「鋳型特異性」(template specificity)は酵素を選択することにより殆んどの増幅技術によって実現される。増幅酵素は、それらが使用される条件下で、異種の核酸の混合物中の核酸の特異の配列のみを処理する酵素である。例えば、Qβレプリカーゼの場合, MDV-I RNAがレプリカーゼの特異鋳型である(例えば、 Kacian 他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:3038 [1972]を参照)。他の核酸はこの増幅酵素によっては複製されない。同様に、T7RNAポリメラーゼの場合、この増幅酵素はそれ自身のプロモータに厳格な特異性を持つ(Chamberlin他、Nature 228:227 [1970]を参照)。T4DNAリガーゼの場合、この酵素は、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド基質及び結紮接合点の鋳型間にミスマッチのある2つのオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを結紮しない(Wu 及びWallace, Genomics 4:560 [1989]を参照)。最後に、Taq 及びPfuポリメラーゼは、高温で機能するという能力のため、プライマにより画され(bounded)、それにより規定される配列に高い特異性を示すことが判明しており、高温はプライマが標的配列とハイブリッドするのに都合が良いが、非標的配列とハイブリッドするにはそうはならない熱力学条件を産み出す。

0171

本明細書で用いる、「プライマ」(primer)は、精製された制限消化の様に自然に生成されるか、合成により生成されるかを問わず、オリゴヌクレオチドを言う。オリゴヌクレオチドは、プライマ伸長法による、核酸鎖に相補的な合成品が誘発される条件下に置かれる場合、合成の開始点として作動することができる(すなわち、ヌクレオチド及びDNAポリメラーゼの様な誘発剤の存在下及び好適な温度及びpHで)。プライマは、増幅で最大の効果を得るためには好ましくは単一鎖であるのが良いが、代替的に、二重鎖であっても良い。もし、二重鎖の場合は、プライマはまず、伸長製品を得るために使用するには、その鎖を分離する処理がなされる。好ましくは、プライマはオリゴデキシリボヌクレオチドであるのが良い。プライマは誘発剤の存在下で伸長製品の合成を準備するために十分長くなければならない。プライマの正確な長さは、温度、プライマソース及び使用法を含み数多くの要因に依る。

0172

本明細書で用いる、「プローブ」(probe)は、精製された制限消化の様に自然に生成されるか、合成により、組み換えにより又はPCR増幅により生成されるかを問わず、オリゴヌクレオチド(すなわち、ヌクレオチド配列)を言い、オリゴヌクレオチドは関心の対象である他のオリゴヌクレオチドにハイブリッドすることができる。プローブは単一鎖であるか又は二重鎖であっても良い。プローブは特定の遺伝子配列の検出、同定及び単離に有用である。本発明で用いられるどのプローブも任意の「レポーター分子」(reporter molecule)によりラベルを付され、酵素(例えば、酵素ベースの組織化学アッセイのみならずELISA)、蛍光放射線、及び発光システムを含む検出システムで検出することができるが、これに限定されるものではない。本発明は特定の検出システム又はラベルに限定されるものではない。

0173

本明細書で用いる、「標的」(target)は、増幅方法(例えば、ポリメラーゼ連鎖反応)との関係で用いる場合は、ポリメラーゼ連鎖反応に使用されるプライマにより画された(bounded)核酸の領域を言う。したがって、「標的」は他の核酸配列から選定される。「部分」(segment)は標的配列中の核酸の領域として定義される。

0174

本明細書で用いる、「ポリメラーゼ連鎖反応」(polymerase chain reaction (PCR))は米国特許第4,683,195号, 第4,683,202号及び第4,965,188号に記載の方法を言う。これらの文献は参照により本明細書に組み入れられる。この方法は、クローン又は精製をすることなくゲノムDNAの混合物中で標的配列のある部分の濃度を増大させる方法を含む。この標的配列を増幅するプロセスは、2つのオリゴヌクレオチドプライマの十分過度の量を所望の標的配列を含むDNA混合物に導入し、続いてDNAポリメラーゼの存在下で正確な熱サイクルを連続して行うことからなる。二つのプライマは二重鎖標的配列の各鎖に相補的である。増幅を実行するために、混合物は変性させ、その後プライマは標的分子中相補配列アニーリングされる。アニーリングに続いて、プライマは新しい1対の相補鎖を形成するためにポリメラーゼにより伸長される。変性のためのステップ、プライマアニーリング、及びポリメラーゼ伸長は、所望の標的配列の増幅部分について高濃度のものを得るため何度も繰り返すことができる(変性、アニーリング及び伸長は一つの「サイクル」を構成し、多数の「サイクル」があり得る)。

0175

所望の標的配列の増幅された部分の長さは、プライマの互いの相対的位置により決まり、そのためこの長さは制御可能なパラメータである。プロセスが繰り返されるため、この方法は「ポリメラーゼ連鎖反応」(polymerase chain reaction)(以下PCRという)と呼ばれる。標的配列の所望の増幅部分が混合物中の主要な配列(濃度において)であるため、これらは「PCR増幅された」と言われる。

0176

本明細書で用いる、「増幅試薬」(amplification reagent)は、プライマ、核酸鋳型、及び増幅酵素を除く増幅に必要な試薬(デオキリリボヌクレオチド三リン酸緩衝剤等)を言う。典型的には、増幅試薬は他の反応成分と共に反応容器テスト管ミクロウエル等)に置かれ、そして収容される。

0177

PCRでは、ゲノムDNAにおいて特定の標的配列の単一コピーをいくつかの異なる方法により検出可能なレベルまで増幅することが可能である(例えば、標識を付したプローブとハイブリッドさせ;ビオチニル化したプライマを組み込み、続いてアビジン酵素と結合させることにより検出する;dCTP又はdATPの様な 32P標識を付したデオキシヌクレオチド三リン酸を増幅された部分に組み込む)。ゲノムDNAの他に、任意のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドも適切なプライマ分子のセットによって増幅することができる。

0178

特に、PCRプロセス自身により作られた増幅部分は、それ自身続くPCR増幅のための効果的な鋳型である。

0179

本明細書で用いる、「PCR製品」(PCR product)、「PCRフラグメント」(PCR fragment)及び「増幅製品」(amplification product)は2以上のPCRの変性、アニーリング及び伸長が終了した後の結果の化合物の混合物を言う。これらの用語は一以上の標的配列の一以上の部分の増幅がある場合を含む。

0180

本明細書で用いる、「制限エンドヌクレアーゼ」(restriction endonuclease)及び「制限酵素」(restriction enzyme)は、細菌酵素を言い、そのそれぞれが特異ヌクレオチド配列において、又はその近辺で二重鎖DNAを切断する。

0181

本発明は、保存安定性を向上させた少なくとも一つの中性金属プロテアーゼを含む方法及び組成物を提供する。ある実施の態様においては、中性金属プロテアーゼは洗浄及び他の用途に応用される。ある特に好ましい実施の態様においては、本発明はバチルス種から得られる中性金属プロテアーゼを含む方法及び組成物を提供する。ある特に好ましい実施の態様においては、中性金属プロテアーゼはバチルスアミロリケファシエンスから得られる。更に好ましい実施の態様においては、中性金属プロテアーゼはバチルス アミロリケファシエンス中性金属プロテアーゼの変異体である。更に他の実施の態様においては、中性金属プロテアーゼはバチルス アミロリケファシエンス中性金属プロテアーゼのホモログである。本発明は特に洗浄、漂白及び殺菌を含む応用分野で用いられるがこれに限定されるものではない。

0182

また以下の実施例において更に詳細に説明する様に、本発明は衣類、織物、医療機器等を含む広い範囲の物の洗浄において多くの利点を有するが、これに限定されるものではない。さらに、本発明は洗浄、漂白、及び殺菌において、ある範囲の洗浄温度及びpHに渡り効果的である組成物を提供する。

0183

通常、プロテアーゼはタンパク質のアミド結合を、ペプチド結合水分子を添加することにより加水分解する。開裂はペプチド結合のカルボニル基で起こる。

0184

バチルス種の様な細菌種では2種の主要な細胞外プロテアーゼが存在する、すなわち、アルカリ性又はセリンプロテアーゼ及び中性金属プロテアーゼである。

0185

中性金属エンドペプチダーゼ(すなわち、中性金属プロテアーゼ)(EC 3.4.24.4)は、触媒活性のために亜鉛イオンを絶対的に必要とするプロテアーゼ種に属する。これらの酵素は中性pHで最適に活動し、30 から40 kDa のサイズの範囲にある。中性金属プロテアーゼはタンパク質の構造的安定性に寄与する2乃至4のカルシウムの間を結合する。金属プロテアーゼの活性部位の結合イオンは水分子を活性にする必須の特性である。水分子は求核試薬として機能し、ペプチド結合のカルボニル基を開裂する。

0186

中性亜鉛結合金属プロテアーゼファミリーには、カルボシキペプチダーゼA(消化酵素)及び組織再成形及び分解において反応を触媒するマトリクス金属プロテアーゼのみならず、細菌酵素サーモリシン及びサーモリシン類似のプロテアーゼ(TLP)を含む。安定性及び機能について、これらのプロテアーゼの内唯一十分特徴が分かっているものはサーモリシン及びその変異体(TLP)のみである。

0187

事実、酵素の熱安定性を増大させるためにバチルス種中性プロテアーゼを操作することに多大の研究がなされて来た(例えば、Vriend 他、In, Tweel 他 (編集),「酵素の安定性及び安定化」(Stability and Stabilization of enzymes) Elsevier, 93-99 [1993]ページを参照)。

0188

努力の多くは、タンパク質の自己分解を起こし、中性プロテアーゼを高温で変質させる局所的変性プロセスを防止することとなると見られる分子モデルを使用することにより同定される構造決定因子を変えることによってプロテアーゼの安定性を増すことに向けられた(例えば、van den Burg他、in Hopsu-Havu 他、(編纂), 「細胞機能におけるタンパク質分解、バチルスプロテアーゼの自己分解路の操作」(Proteolysis in Cell Functions Manipulating the Autolytic Pathway of a Bacillus Protease)Biomedical and Health Research Vol. 13, IOS Press [1997] 、576ページを参照)。

0189

本明細書では、改良された特徴を持つ中性金属プロテアーゼを操作するための組成物及び方法が提供する。本明細書に記載の様に、自己分解を防ぐためにサーモリシンの様な他のプロテアーゼに対しカルシウムイオンの使用が報ぜられている。バチルスステアロテルモフィルス(Bacillus stearothermophilus)中性プロテアーゼは、カルシウムを加えることにより自己分解及びタンパク質分解から安定的であった(Durrschmidt他、FEBSJ., 272:1523-1534 [2005]参照)。

0190

事実、本発明はその構造的安定性を維持するために、カルシウムを使用しない中性金属プロテアーゼの操作に好適な組成物及び方法を提供する。ある実施の態様においては、操作はタンパク質分解を防ぐある特定の二次構造要素中での局部的変性を防ぐ。

0191

天然の及び操作されたプロテアーゼ、例えば、スブチリシンはしばしばバチルス種で発現され、いくつかはタンパク質性の汚れを除去する洗剤製剤に使用されている。その他のものは例えば、製パン業で用いられる(例えば、バチルスサーモプロテオリチクス(Bacillus thermoproteolyticus)からのサーモリシン;例えば、Galante及びFormantici, Curr. Organic Chem., 7, 1399-1422 [2003]を参照)。一般的に、セリンプロテアーゼは洗剤に広く利用されており、これらのプロテアーゼは比較的容易に安定化させることができるため、少なくともその部分的容易性より広く用いられている。

0192

事実、金属プロテアーゼは産業、特に洗剤工業では多くの理由によりその使用頻度は比較的小さい。これらの酵素は、安定性及び機能を発揮するためには各々カルシウム及び亜鉛イオンを絶対的に必要とするためより複雑なタンパク質系と関係している。更に洗濯プロセスでは使用される水のみならず洗剤溶液中に、しばしば酵素によりそのイオンの結合が干渉を受け又はこれらのイオンをキレートする成分を含むため、タンパク質分解機能が低下し又は失われ及びプロテアーゼが分解される。

0193

現在用いられている中性金属プロテアーゼ酵素システムに比べ、本発明は液状洗濯用洗剤組成物の、での長期の保存を容易にするために十分な安定性を持つ中性金属プロテアーゼを提供する。特に好ましい実施の態様においては、金属プロテアーゼの安定性及び活性は酵素をその不可欠な活性部位亜鉛分子により錯体化することにより保たれる。重要なことにはカルシウム及び亜鉛イオンの組合せは酵素の機能に有害な影響を与えないことである。ある実施の態様においては、安定化した中性金属プロテアーゼはバチルスアミロリケファシエンス(例えば、精製されたMULTIFECT(登録商標)Neutral; 「PMN」)から得られる野生型中性金属プロテアーゼである。他の好ましい実施の態様においては、組み換え中性金属プロテアーゼ(例えば、バチルススブチリス(nprE)にクローンされたバチルス アミロリケファシエンス中性金属プロテアーゼ)がある。更なる実施の態様においては、改良された安定性を持つ金属プロテアーゼは、酵素の一以上のカルシウム結合部位に対する親和性を増した酵素を含む。好ましい実施の態様においては、本発明の中性金属プロテアーゼは、通常、冷水温度、草の染み、及び/又は低いpH条件での使用を含み洗剤において応用することができるが、これに限定されるものではない。

0194

本発明は洗剤の基剤及び/又は組成物において保存安定性を増すために、亜鉛結合中性金属プロテアーゼを安定化させる条件を提供する。好ましい実施の態様においては、洗剤組成物は、洗浄製剤に必須の亜鉛及び/又はカルシウムイオンを含むことにより、自己分解及び変性に対して安定的な少なくとも一つの金属プロテアーゼ(例えば、任意のバチルス中性金属プロテアーゼ)を含む。

0195

ある特に好ましい実施の態様においては、バチルスアミロリケファシエンス由来の中性金属プロテアーゼ(PMN)、及び亜鉛イオンをカルシウムイオンより10倍の親和性で結合するバチルススブチリス(Bacillus subtilis)(nprE)で発現される組み換え形式は本発明で用いることができる。必須の亜鉛イオンの存在下で安定化されたプロテアーゼは、イオンが存在しない場合の同じプロテアーゼに比べてタンパク質分解に対して改良された安定性を持つ。

0196

幾つかの実験の結果では、nprEは洗剤の基剤を加えた1時間後にタンパク質分解活性をある程度(〜20%)失うことを示したが、亜鉛イオンの存在下で32℃で培養されたnprEは塩又はカルシウムイオンを追加しないテスト条件において極めて安定していた。カルシウム及び亜鉛イオンがともに存在していても、新たな効果を生じなかった。15 mM未満の亜鉛イオン濃度での中性金属プロテアーゼはほぼ4週間に亙り十分安定的であった。したがって、本発明は洗剤成分の存在する中で中性金属プロテアーゼの保存寿命を長期化するために亜鉛の添加を含む組成物を提供する。

0197

更に、代替的な実施の態様においては、亜鉛カチオンはCo2+, Mn2+ 又はFe2+
によって代替される。これらのイオンは全て結合し、中性金属プロテアーゼのプロテアーゼ活性を回復させることが示されたからである。しかし、Mn2+ 及びFe2+は自然の活性の全てを回復するものではないことが判明した。Co2+は最も高い活性回復パーセントを示すが、Zn2+より結合力は弱いと思われる。

0198

亜鉛カチオンは、基質結合及び酵素触媒反応における役割を果たすことが知られており、全ての中性金属プロテアーゼの活性部位において必須の要素である(例えば、Holmquist及びVallee, J. Biol. Chem., 249:4601-4607 [1974]を参照)。中性金属プロテアーゼの亜鉛カチオンによる比較的高い親和性及びカルシウムに比べてこのイオンの親和性が約10倍大きいことより亜鉛は安定剤として機能し、そしてその結果自己分解、タンパク質分解及び変性を防ぐと思われる。しかし、本発明は何れかの特定の機構に限定されるものではない。

0199

本発明は工業用洗剤生産及び開発における応用面で極めて有利な機会を提供する。多くの洗剤がタンパク質、でん粉及び油汚れの除去に対して高い特異性を持つため用いられる。特に、PMN又はEquest Grass (Warwick)上のバチルスアミロリケファシエンス由来の中性金属プロテアーゼの良好な洗濯効果は、亜鉛も含む洗剤の基剤中で本発明の中性金属プロテアーゼは改良された洗剤組成物として用いることができることを示す。

0200

本発明の洗浄及び洗剤製剤の詳細な説明
特に断らない限り、本明細書に記載の成分又は組成物のレベルはすべて、その活性レベルに関して言うものであり、不純物、例えば、市販の商品に存在する残留溶媒又は副生物を除いたものである。

0201

酵素成分の重量は全活性タンパク質に基づく。

0202

全てのパーセント及び比率は、特に示さない限り重量に基づき計算される。全てのパーセント及び比率は、特に示さない限り全組成物に基づき計算される。

0203

代表的な洗剤組成物においては、酵素レベルは全組成物の重量に基づく純粋な酵素により表わされるものであり、特に断らない限り、洗剤成分は全組成物の重量により表わされる。

0204

中性金属プロテアーゼを含む洗剤組成物
本発明の安定化された中性金属プロテアーゼは種々の洗剤組成物を処方するのに有用である。本発明の洗浄組成物は、例えば、義歯、歯、髪及び皮膚のような美容整形用のみならず、洗濯用、硬い表面の洗浄、自動皿洗い機用に有利に用いることができる。しかし、低温溶液中において効果が増大するという稀有な優位点を持ち、またその優れた色彩安全性プロフィールのために、本発明の酵素は、織物の漂白のような洗濯への応用に非常に適している。更に本発明の酵素は顆粒及び液状組成物の両方で使用することができる。本発明の酵素はまた、洗浄添加剤製品として使用することができる。本発明の少なくとも一つの酵素を含む洗浄添加剤製品は、更に追加の漂白効果を得たい場合に洗浄プロセスに含むのが特に好適である。その様な例には、低温溶液洗浄での応用を含むが、これに限定されるものではない。添加剤製品は、その単純な形としては、本発明により提供される一以上の中性金属プロテアーゼ酵素であっても良い。ある実施の態様においては、過酸化物のソースが用いられ、更に大きい漂白効果が求められる場合、添加剤は洗浄プロセスに添加するために投薬形式に梱包される。

0205

ある実施の態様においては、単一の投薬量は、丸薬、錠剤、ゲルキャップ又は事前に計量された粉末及び液体を含む他の単一の投薬単位を含む。ある実施の態様においては、充填剤及び/又はキャリア材料は、その組成物の容量を増すために含まれる。好適な充填剤又はキャリア材料は、タルク、粘土等のみならず種々の硫酸塩、炭酸塩及びケイ酸塩を含むがこれに限定されるものではない。ある実施の態様においては、液状組成物のための充填剤及び/又はキャリア材料には、水及び/又はポリオール及びジオールを含む低分子量第一級及び/又は第二級アルコールを含む。その様なアルコールの例には、メタノールエタノールプロパノール及びイソプロパノールを含むがこれに限定されるものではない。ある実施の態様においては、組成物はその様な材料を約5%から約90%含む。更なる実施の態様においては、組成物のpHを減少させるために酸性充填剤が使用される。他の代替的な実施の態様においては、洗浄用添加剤には、以下に述べる少なくとも一つの活性過酸化物ソース及び/又は更に詳細を以下に述べる補助成分を含む。

0206

本発明の洗浄組成物及び洗浄添加剤は、本発明で提供される効果的な量の中性金属プロテアーゼ酵素を必要とする。ある実施の態様においては、酵素の必要レベルは、本発明により提供される一以上の中性金属プロテアーゼ種の添加により達成される。典型的には、本発明の洗浄組成物は、本発明により提供される少なくとも一つの中性金属プロテアーゼを、少なくとも0.0001 重量%, 約0.0001 から約1, 約0.001 から約0.5, 又は更には約0.01から約0.1重量%含む。

0207

ある好ましい実施の態様においては、本発明が提供する洗浄組成物は典型的には、水を使用する洗浄作業において、洗浄水は約5.0から約11.5のpH、又は他の実施の態様においては、更には約6.0 から約0.5のpHである様に製剤される。ある好ましい実施の態様においては、液状製品製剤は、典型的には純度約 3.0から約9.0のpHを持ち、他の実施の態様においては、純度約3から約5のpHを持つ。ある好ましい実施の態様においては、顆粒状の洗濯用製品は、典型的には約8から約11のpHを持つ様製剤される。推奨される使用レベルにpHを制御する技術には、緩衝液アルカリ、酸等を用いることを含み、これらは当業者に周知である。

0208

ある特に好ましい実施の態様においては、少なくとも一つの中性金属プロテアーゼが顆粒状組成物又は液状で使用される場合、中性金属プロテアーゼは、保存中に顆粒組成物の他の成分から酵素を保護するためにカプセルに収めた粒子の形をとる。更に、カプセルに収めることは、洗浄プロセスの間に中性金属プロテアーゼの使用を制御する方法を提供し、中性金属プロテアーゼの効果を高める。本発明のカプセルに収められた中性金属プロテアーゼは種々の場面設定下で用いることができることを想定している。また、中性金属プロテアーゼは既知の任意の好適なカプセル化材料及びそのための方法によりカプセル化することが意図されている。

0209

ある好ましい実施の態様においては、カプセル化材料は典型的には、中性金属プロテアーゼ触媒の少なくとも一部をカプセル化する。ある実施の態様においては、カプセル化材料は水溶性であり及び/又は水分散性を持つ。ある更なる実施の態様においては、カプセル化材料は0℃以上のガラス転移温度(Tg)を持つ(例えば、ガラス転移温度についてのより詳細な情報については、WO 97/11151, 特に6ページ, 25 行から7ページ、2行を参照,)。

0210

ある実施の態様においては、カプセル化材料は炭水化物、天然又は合成ゴムキチンキトサンセルロース及びセルロース誘導体、ケイ酸塩、リン酸塩ホウ酸塩ポリビニルアルコールポリエチレングリコールパラフィンワックス及びこれらの組み合わせよりなる群から選択される。カプセル化材料が炭水化物である、ある実施の態様においては、それは単糖類オリゴ糖多糖類及びこれらの組み合わせよりなる群から選択される。
ある好ましい実施の態様においては、カプセル化材料はでん粉である(例えば、幾つかの代表的な好適なでん粉についてはEP 0 922 499; 米国特許第4,977,252号、米国特許第5,354,559号, 及び米国特許第5,935,826号を参照)。

0211

更なる実施の態様においては、カプセル化材料はプラスチックからなるミクロスフェアを含む(例えば、熱可塑性物質アクリロニトリルメタクリロニトリルポリアクリロニトリル、ポリメタクリロニトリル、及びこれらの混合物;市販されているもので利用可能なミクロスフェアには、EXPANCEL(登録商標)[Casco Products, Stockholm, Sweden], PM 6545, PM 6550, PM 7220, PM 7228, EXTENDOSPHERES(登録商標), 及びQ-CEL(登録商標) [PQ Corp., Valley Forge, PA], LUXSIL(登録商標)及び SPHERICELl(登録商標) [Potters Industries, Inc., Carlstadt, NJ 及びValley Forge, PA])を含むがこれに限定されるものではない)。

0212

出願人の洗浄用組成物を生成及び使用するプロセス
ある好ましい実施の態様においては、本発明の洗浄用組成物は製剤者によって選択される任意のプロセスによって任意の好適な形に製剤されまた調整される(例えば、米国特許第 5,879,584号、米国特許第5,691,297号、米国特許第 5,574,005号、米国特許第 5,569,645号、米国特許第5,565,422号、米国特許第. 5,516,448号、米国特許第5,489,392号、米国特許第 5,486,303号を参照願いたいが、これらに限定されるものではない)。低pH洗浄用組成物が望まれるある実施の態様においては、その様な組成物のpHはHCLのような酸性材料を添加することにより調整される。

0213

補助材料
本発明の目的との関係では必須ではないが、ある実施の態様においては、本明細書に記載の補助材料の例の一部を挙げることが本発明の洗浄用組成物を使用するために適当である。事実、ある実施の態様においては、補助材料は本発明の洗浄用組成物に組み入れられる。ある実施の態様においては、補助材料は洗浄を助けその機能を向上させ、洗浄される基質を処理し及び/又は洗浄用組成物の美観を整える(例えば、香水顔料染料等)。その様な補助剤は本発明の中性金属プロテアーゼに添加されると了解される。これらの添加成分の厳密な性質及び組み入れられるレベルは、組成物の物理的形式及び/又はそれが用いられる洗浄作業の性質による。好適な補助材料には、界面活性剤、ビルダー、キレート材、染料移動抑制剤、堆積助剤、分散剤、追加酵素、及び酵素安定剤、触媒物質、漂白活性剤、漂白推進剤、過酸化水素、過酸化水素のソース、事前生成過酸、ポリマー系分散剤粘土質土壌/再堆積防止剤光沢剤、泡抑制剤、染料、香水、構造弾力付与剤織物柔軟剤キャリアー、可水溶剤(hydrotrope)、プロセス補助剤及び/又は色素を含むが、これに限定されるものではない。本明細書に明記されているものの他、更なる例は当業者に知られている(例えば、米国特許第5,576,282号, 米国特許第6,306,812号Bl 及び米国特許第6,326,348号Blを参照)。

0214

ある実施の態様においては、前記の補助剤の成分は本発明の洗浄組成物のバランス部分を構成する。

0215

界面活性剤
ある実施の態様においては、本発明の洗浄組成物は少なくとも一つの界面活性剤又は界面活性剤システムを含み、前記界面活性剤はノンイオン性界面活性剤アニオン性界面活性剤カチオン性界面活性剤両性界面活性剤両性イオン界面活性剤、半極性ノンイオン性活性剤、及びこれらの混合物から選択される。

0216

ある低pH洗浄組成物の実施の態様(例えば、約3から約5の純度のpHの組成物)においては、界面活性剤はその様なその組成物中の酸含有物により加水分解されると信じられているため、その組成物は典型的にはアルキルエトキシ硫酸塩を含まない。

0217

ある実施の態様においては、界面活性剤は、洗浄組成物の重量に基づき約0.1%から約60%のレベルで存在し、他の実施の態様においては約1%から約50%のレベルで存在し、更に他の実施の態様においては約5%から約40%のレベルで存在する。

0218

原材料(ビルダー(builder))
ある実施の態様においては、本発明の洗浄組成物は一以上の洗剤原材料(builder)又は原材料システムを含む。少なくとも一つの原材料を組み入れるある実施の態様においては、洗剤組成物は、洗浄組成物の重量に基づき、少なくとも約1%、約3から約60%の又は更に約5から約40%の原材料を含む。

0219

原材料(ビルダー)は、アルカリ金属、アンモニア及びポリリン酸塩アルカノールアンモニウム塩アルカリ金属ケイ酸塩アルカリ土類及びアルカリ金属炭酸塩アルミノケイ酸塩原材料ポリカルボン酸塩化合物、ヒドロキシカルボン酸塩エーテル、無水マレイン酸とエチレン又はビニルメチルエーテルコポリマー、1, 3, 5-トリヒドロキシベンゼン−2, 4, 6-トリスルホン酸及びカルボキシメチルオキシスルホン酸及び種々のアルカリ金属、エチレンジアミンテトラ酢酸及びニトリロトリ酢酸の様なポリ酢酸のアンモニア又は置換アンモニア塩、並びにメリト酸コハク酸クエン酸オキシジコハク酸、ポリマレイン酸、1,3,5-カルボン酸ベンゼン、カルボキシメチルオキシコハク酸及びそれらの可溶塩を含むがこれに限定されるものではない。事実、本発明の種々の実施の態様においては、任意の好適な原材料(ビルダー)が使用されることが想定される。

0220

キレート剤
ある実施の態様においては、本発明の洗浄組成物は少なくとも一つのキレート剤を含む。
好適なキレート剤は、銅、鉄及び/又はマンガンキレート剤及びこれらの混合物を含むがこれに限定されるものではない。少なくとも一つのキレート剤が使用される実施の態様においては、本発明のキレート組成物は、主題となっているキレート組成物の重量に基づき、約0.1%から約15%の、又は更に約3.0%から約10%のキレート剤を含む。

0221

沈殿助剤
ある実施の態様においては、本発明の洗浄組成物は少なくとも一つの沈殿助剤を含む。好適な沈殿助剤には、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリカルボン酸塩、ポリテレフタル酸の様な汚れ遊離ポリマーカオリナイト、モントモリオイト、アタプルガイト、イライトベントナイトハロイサイトのような粘土及びこれらの混合物を含むがこれに限定されるものではない。

0222

染料移動抑制剤
ある実施の態様においては、本発明の洗浄組成物は、一以上の染料移動抑制剤を含む。好適な重合体染料移動抑制剤には、ポリビニルピロリドンポリマーポリアミンN−酸化物ポリマー、N−ビニルピロリドン及びN−ビニルイミダゾールポリビニルオキサゾリドン及びポリビニルイミダゾールのコポリマー又はこれらの混合物を含むがこれに限定されるものではない。

0223

少なくとも一つの染料移動抑制剤が使用される実施の態様においては、本発明の洗浄組成物は、洗浄組成物の重量に基づき、約0.0001%から約10%、約0.01%から約5%、又は更に約0.1から約3%含む。

0224

分散剤
ある実施の態様においては、本発明の洗浄組成物は少なくとも一つの分散剤を含む。好適な水溶性有機材料は、ホモ又は共重合酸又はその塩を含むがこれに限定されるものではなく、その場合ポリカルボン酸は、2を超えない原子で互いに分離されている少なくとも2つのカルボキシルラジカルを含む。

0225

酵素
ある実施の態様においては、本発明の洗浄組成物は洗浄機能及び/又は織物へのケアーを提供する一以上の洗剤酵素を含む。好適な酵素の例には、ヘミセルラーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼエステラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、リダクターゼ、オキシダーゼフェノールオキシダーゼリポキシゲナーゼリグニナーゼプルラナーゼタンナーゼペントサナーゼ、マラナーゼ、β—グルカナーゼアラビノシダーゼ、ヒアルロニダーゼコンドロイチナーゼラッカーゼ、及びアミラーゼ又はこれらの混合物を含むがこれに限定されるものではない。ある実施の態様においては、酵素の組み合わせ(すなわち、カクテル)が使用され、プロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、及び/又はセルラーゼの様な従来使用される酵素を含む組み合わせがアミラーゼと共に使用される。

0226

酵素安定剤
本発明のある実施の態様においては、本発明の洗剤の製剤に用いられる酵素は安定化される。酵素の安定化のための種々の技術が本発明で用いられることが予定される。例えば、ある実施の態様においては、本発明で用いられる酵素は、その様なイオンを酵素に提供する最終組成物中に水溶性亜鉛(II),カルシウム(II)及び/又はマグネシウム(II)イオン、及び/他の金属イオン(例えば、バリウム(II),スカンジウム(II),鉄(II),マグネシウム(II),アルミニウム(III),スズ(II),コバルト(II),銅(II)、ニッケル(II),及びオキソバナジウム(IV)のソースの存在により安定化する。

0227

触媒金属複合体
ある実施の態様においては、本発明の洗浄組成物は一以上の触媒金属複合体を含む。ある実施の態様においては、金属含有漂白触媒を用いることができる。ある好ましい実施の態様においては、金属含有漂白触媒は規定の漂白触媒活性の遷移金属カチオン(例えば、銅、鉄、チタンルテニウムタングステンモリブデン又はマンガンカチオン)、漂白触媒活性をほとんど又は全く持たない補助的金属カチオン(例えば、亜鉛、アルミニウムカチオン)及び触媒及び補助的金属カチオンの規定された安定係数を持つセクエストレート(sequestrate)を含む触媒システムを含む。特にエチレンジアミンテトラ酢酸、エチレンジアミンテトラメチレンホスホン酸)及びそれらの可水溶塩が用いられる(例えば、米国特許第4,430,243号を参照)。

0228

ある実施の態様においては、本発明の洗浄組成物はマンガン化合物により触媒される。その様な化合物及び使用のレベルは周知である(例えば、米国特許第5,576,282号を参照)。

0229

更なる実施の態様においては、コバルト漂白触媒を本発明の洗浄組成物に用いることができる。種々のコバルト漂白触媒が知られている(例えば、米国特許第5,597,936号及び第5,595,967号を参照)。その様なコバルト触媒は既知の手順で容易に生成される(例えば、米国特許第5,597,936号及び第5,595,967号を参照)。

0230

更なる実施の態様においては、本発明の洗浄組成物はマクロ多還式硬リガンドMRL)の遷移金属複合体を含む。限定する意味ではなく、実際の問題としある実施の態様においては、本発明により提供される組成物及び洗浄プロセスは、水性洗濯媒体中で、活性を持つMRL種を100ミルあたり少なくとも1のオーダーで提供する様に調整され、ある好ましい実施の態様においては、洗濯液中で約0.005 ppmから約25ppm、より好ましくは約0.05 ppmから約10ppm、最も好ましくは約0.1ppmから約5ppmのMRLを提供する。

0231

容易に手に入る遷移金属漂白触媒の好ましい遷移金属はマンガン、鉄、及びクロムを含むが、これに限定されるものではない。好ましいMRLはまた、交差結合している特別な超硬度リガンド(例えば、5,12-ジエチル-l,5,8,12-テトラアザビシクロ[6.6.2]ヘキサデカン)を含むがこれに限定されるものではない。好適な遷移金属MRLは既知の手順により容易に生成される(例えば、WO 00/32601, 及び米国特許第6,225,464号)を参照。

0232

洗浄組成物の生成及び使用プロセス
本発明の洗浄組成物は製剤者により選択される任意のプロセスにより、任意の好適な形に製剤され、生成される(例えば、米国特許第5,879,584号、米国特許第5,691,297号、米国特許第5,574,005号、米国特許第5,569,645号、米国特許第5,565,422号、米国特許第5,516,448号、米国特許第5,489,392号、米国特許第5,486,303号、米国特許第4,515,705号、米国特許第4,537,706号、米国特許第4,515,707号、米国特許第4,550,862号、米国特許第4,561,998号、米国特許第4,597,898号、米国特許第4,968,451号、米国特許第5,565,145号、米国特許第5,929,022号、米国特許第6,294,514号、及び米国特許第6,376,445,を参照。これらの引用文献は参照により本明細書に組み入れられる)。

0233

使用方法
好ましい実施の態様においては、本発明の洗浄組成物は表面及び/又は織物の洗浄に使用できる。ある実施の態様においては、表面及び/又は織物の少なくとも一部は、本発明の洗浄組成物の少なくとも一つの実施の態様で示すものと純粋な形又は水で希釈された形で接触させ、そして表面及び/又は織物は任意選択的に洗濯され及び/又は濯がれる。本発明の目的との関係においては、「洗濯」(washing)には、手洗い、及び機械的攪拌を含むがこれに限定されるものではない。

0234

ある実施の態様においては、織物には、通常の消費者の使用条件で洗濯することのできる織物を含む。ある好ましい実施の態様においては、本発明の洗浄組成物は溶液中で約500ppmから約1500ppmの濃度で使用される。洗濯液が水である場合のある実施の態様においては、水の温度は通常約5℃から約90℃である。織物洗浄でのある好ましい実施の態様においては、水と織物の質量比は通常約1:1から約30:1である。

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