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図面 (20)

課題

試験試料中に存在しうる1以上のターゲット分子検出のための方法、デバイス試薬、およびキットの提供。

解決手段

ターゲット分子に対する特異的アフィニティーを有するアプタマーと、試験試料を接触させ、ここで、アプタマーとそのターゲット分子の非共有相互作用によって形成されるアプタマー・アフィニティー複合体平衡化後、動力学的に負荷を与え、試験試料からアプタマー・アフィニティー複合体を分離した後、アプタマーまたはアプタマー・アフィニティー複合体のタンパク質又はアプタマー・アフィニティー複合体を検出又は定量化する、試験試料中に存在しうるターゲット分子を検出するための方法。アプタマーが一本鎖核酸二本鎖核酸、DNA又はRNAである、方法。好ましくは競合分子オリゴヌクレオチドである、方法。

概要

背景

概要

試験試料中に存在しうる1以上のターゲット分子検出のための方法、デバイス試薬、およびキットの提供。ターゲット分子に対する特異的アフィニティーを有するアプタマーと、試験試料を接触させ、ここで、アプタマーとそのターゲット分子の非共有相互作用によって形成されるアプタマー・アフィニティー複合体平衡化後、動力学的に負荷を与え、試験試料からアプタマー・アフィニティー複合体を分離した後、アプタマーまたはアプタマー・アフィニティー複合体のタンパク質又はアプタマー・アフィニティー複合体を検出又は定量化する、試験試料中に存在しうるターゲット分子を検出するための方法。アプタマーが一本鎖核酸二本鎖核酸、DNA又はRNAである、方法。好ましくは競合分子オリゴヌクレオチドである、方法。なし

目的

本発明に関連する情報の要約を提供し、そして本明細書に提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

この技術が所属する分野

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請求項1

試験試料中に存在しうるターゲット分子を検出するための方法であって:(a)ターゲット分子に対する特異的アフィニティーを有するアプタマーと、試験試料を接触させ、ここで、前記試験試料中に前記ターゲット分子が存在するならば、アプタマーとそのターゲット分子の非共有相互作用によってアプタマー・アフィニティー複合体が形成され;(b)アプタマー・アフィニティー複合体形成の平衡化の後、前記試験試料の成分に、動力学的に負荷を与える(challenge)条件に、前記試験試料を曝露し;(c)前記試験試料からアプタマー・アフィニティー複合体を分離した後、前記アプタマーおよび/または前記アプタマー・アフィニティー複合体のタンパク質および/または前記アプタマー・アフィニティー複合体を検出および/または定量化し、ここで、動力学的負荷が、(i)非ターゲット分子と非特異的複合体を形成することのできる競合剤分子を試験試料に導入する、又は(ii)固体支持体上でアプタマー・アフィニティー複合体を捕捉し、その後非ターゲット分子と非特異的複合体を形成することのできる競合剤分子を含む洗浄液洗浄する、を含むものである、工程を含み、さらに前記競合剤分子がオリゴヌクレオチドである、前記方法。

請求項2

前記アプタマーが一本鎖核酸二本鎖核酸、DNAまたはRNAである、請求項1に記載の方法。

請求項3

前記ターゲット分子が、タンパク質、炭水化物多糖糖タンパク質ホルモン受容体抗原、抗体、ウイルス基質代謝物補因子阻害剤薬剤色素栄養物増殖因子および組織からなる群より選択される、請求項1または2に記載の方法。

請求項4

前記試験試料が全血白血球末梢血単核細胞血漿血清、息、尿、精液唾液髄膜液、羊水液、リンパ液乳頭吸引液気管支吸引液滑液、関節吸引液、細胞細胞抽出物糞便、組織、組織抽出物、組織生検、および脳脊髄液から選択される、生物学的試料である、請求項1−3のいずれかに記載の方法。

請求項5

アプタマーが前記ターゲット分子に対する結合アフィニティーをもつように予め選択されている、請求項1−4のいずれかに記載の方法。

請求項6

オリゴヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチドリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドの類似体、リボヌクレオチドの類似体、化学的に修飾されたデオキシリボヌクレオチドおよび化学的に修飾されたリボヌクレオチドからなる群より選択される、請求項1−5のいずれかに記載の方法。

発明の分野

0001

[0001]本発明は、一般的に、試料中のターゲット分子の検出のための方法、デバイス試薬、およびキットに、そしてより具体的には、試験試料中に含有されうる1以上のターゲット分子の検出および/または定量化に関する。

0002

背景
[0002]以下の説明は、本発明に関連する情報の要約を提供し、そして本明細書に提供する情報または引用する刊行物のいずれかが、ここに請求する発明に対する先行技術であることの容認ではない。

0003

[0003]生物学的試料および他の試料中の生理学的に重要な分子の検出および定量化に向けられるアッセイは、科学的研究において、そして健康管理分野において重要なツールである。こうしたアッセイの1つのクラスは、固体支持体上に固定された1以上のアプタマーを含むマイクロアレイの使用を伴う。アプタマーは、各々、非常に特異的な方式でそして非常に高いアフィニティーで、ターゲット分子に結合可能である。例えば、米国特許第5,475,096号、表題「Nucleic Acid Ligands」を参照されたい;また、例えば、米国特許第6,242,246号、米国特許第6,458,543号、および米国特許第6,503,715号、各々、表題「Nucleic Acid Ligand Diagnostic Biochip」を参照されたい。マイクロアレイを試料と接触させると、アプタマーが、試料中に存在するそれぞれのターゲット分子に結合し、そしてそれによって、試料中のターゲット分子の非存在、存在、量、および/または濃度の決定が可能になる。

0004

[0004]このアッセイの変形は、アプタマーが、ターゲット分子と共有結合する、または「光架橋する」のを可能にする光反応性官能基を含むアプタマーを使用する。例えば、米国特許第6,544,776号、表題「Nucleic Acid Ligand
Diagnostic Biochip」を参照されたい。これらの光反応性アプタマーはまた、光アプタマー(photoaptamer)とも称される。例えば、米国特許第5,763,177号、米国特許第6,001,577号、および米国特許第6,291,184号、各々、表題「Systematic Evolution of Nucleic Acid Ligandsby Exponential Enrichment: Photoselection of Nucleic Acid Ligands and Solution SELEX」を参照されたい;また、例えば、米国特許第6,458,539号、表題「Photoselection of Nucleic Acid Ligands」も参照されたい。マイクロアレイを試料と接触させ、そして光アプタマーがそのターゲット分子と結合する機会を得た後、光アプタマーを光活性化し、そして固体支持体を洗浄して、いかなる非特異的結合分子も除去する。光アプタマーに結合したターゲット分子は、光アプタマー上の光活性化された官能基単数または複数)によって達成される共有結合のため、一般的に、除去されないため、激しい洗浄条件を用いてもよい。この方式で、該アッセイは、試験試料中のターゲット分子の非存在、存在、量、および/または濃度の決定を可能にする。

0005

[0005]これらのアッセイ形式のどちらでも、試料と接触させる前に、アプタマーを固体支持体上に固定する。しかし、特定の状況下では、試料と接触させる前のアプタマーの固定は、最適なアッセイを提供しない可能性もある。例えば、アプタマーをあらかじめ固定した結果、固体支持体表面上で、ターゲット分子とアプタマーが不十分にしか混合されず、これがおそらく長時間の反応時間につながり、そしてしたがって、ターゲット
子に対するアプタマーの十分な結合を可能にするためには、長時間のインキュベーション期間を要することになる可能性もある。さらに、光アプタマーをアッセイ中に使用すると、そして固体支持体として利用する物質に応じて、固体支持体は、光アプタマーおよびそのターゲット分子間の共有結合の形成を達成するのに用いられる光を散乱させるかまたは吸収する傾向がありうる。さらに、固体支持体表面もまた、用いるいかなる標識剤にも曝露され、そしてこれらに影響を受ける可能性もあるため、使用する方法に応じて、アプタマーに結合したターゲット分子の検出は、不正確になりやすい可能性もある。最後に、固体支持体上のアプタマーの固定は、一般的に、試料へのアプタマーの曝露前に、アプタマー調製工程(すなわち固定)を伴い、そしてこの調製工程は、アプタマーの活性または官能性に影響を及ぼしうる。

0006

[0006]したがって、(1)アプタマーの活性、(2)アプタマー−ターゲット分子複合体に関する結合平衡を達成する効率、(3)アプタマーおよびそのターゲット分子間の共有結合(単数または複数)の形成、ならびに(4)アプタマー−ターゲット分子複合体の検出に影響を及ぼす条件を最適化することによって、試験試料中のターゲット分子の検出および/または定量化のための高感度アッセイを提供する方法、デバイス、試薬、およびキットに関する必要性が存在する。

0007

要約
[0007]本開示には、試験試料中に存在しうる1以上のターゲット分子の検出および/または定量化のための方法、デバイス、試薬、およびキットが含まれる。1つの態様において、タグを含み、そしてターゲット分子に対する特異的アフィニティーを有するアプタマーと、試験試料を接触させる。ターゲット分子に結合したアプタマーを含むアプタマー・アフィニティー複合体の形成を可能にする。試験試料がターゲット分子を含有する場合、一般的に、試験試料中で、アプタマー・アフィニティー複合体が形成されるであろう。場合によって、アプタマー・アフィニティー複合体を、ターゲット分子に共有結合したアプタマーを含むアプタマー共有複合体に変換する。次いで、限定されるわけではないが、固体支持体を用い、質量分析を用い、そして定量的ポリメラーゼ連鎖反応(Q−PCR)を用いることを含めて、当業者に知られる多様な方法のいずれを用いて、アプタマー・アフィニティー複合体(または場合によってアプタマー共有複合体)を検出し、そして/または定量化してもよい。

0008

[0008]1つの態様において、固体支持体の使用を通じて、アプタマー・アフィニティー複合体(または場合によってアプタマー共有複合体)を検出し、そして/または定量化する。この態様において、アプタマー・アフィニティー複合体(または場合によってアプタマー共有複合体)を固体支持体に付着させる。固体支持体をアプタマー・アフィニティー複合体(または場合によってアプタマー共有複合体)に接触させ、そしてアプタマー上に含まれるタグが、固体支持体に付着したプローブと、直接または間接的にのいずれかで会合するのを可能にすることによって、付着を達成する。次いで、固体支持体上のプローブと会合しているアプタマー・アフィニティー複合体(または場合によってアプタマー共有複合体)を検出し、そして場合によって定量化する。検出および場合による定量化に先立つ任意の時点で、すなわち、固体支持体へのアプタマー・アフィニティー複合体(または場合によってアプタマー共有複合体)の付着前または付着後のいずれかいつでも、複合体を標識剤と接触させて、結合したターゲット分子の検出を可能にする。

0009

[0009]別の態様において、質量分析を用いて、アプタマー・アフィニティー複合体(または場合によってアプタマー共有複合体)を検出し、そして/または定量化する。この態様において、固体支持体を、アプタマー・アフィニティー複合体(または場合によってアプタマー共有複合体)と接触させ、そしてアプタマー上に含まれるタグが、固体支持体に付着したプローブと、直接または間接的にのいずれかで会合するのを可能にするこ
とによって、アプタマー・アフィニティー複合体(または場合によってアプタマー共有複合体)を固体支持体に付着させる。これは、試験試料の残りから、アプタマー・アフィニティー複合体(または場合によってアプタマー共有複合体)を分配し、それによって、質量分析前に、ターゲット分子を濃縮し、そしてこの分析ツールを用いた、複合体混合物からの分析物の検出および定量化を改善することを容易にする。次いで、固体支持体上のプローブと会合しているアプタマー・アフィニティー複合体(または場合によってアプタマー共有複合体)を溶出し、そして質量分析を用いて分析し、質量分析は、ターゲット分子を同定し、そしてしたがって検出するのに使用可能なピークスペクトルを生じる。ターゲット分子が検出されたならば、場合によって、当業者に知られる標準的技術によって、定量化もまたしてもよい。1つの態様において、ターゲット分子がタンパク質であるならば、質量分析を用いて、アプタマー・アフィニティー複合体(または場合によってアプタマー共有複合体)を分析する前に、アプタマー・アフィニティー複合体(または場合によってアプタマー共有複合体)を、例えばプロテイナーゼKまたはトリプシンなどのプロテアーゼ酵素消化して、結合したターゲット分子の断片を生じてもよく、次いで、この断片を用いてターゲット分子を同定し、そしてそれによってターゲット分子の検出および場合によっては定量化を可能にしてもよい。

0010

[0010]さらなる態様において、Q−PCRを用いて、アプタマー・アフィニティー複合体(または場合によってアプタマー共有複合体)を検出し、そして/または定量化する。この態様において、試験試料中の未結合(free)アプタマーを、検出および/または定量化前に、アプタマー・アフィニティー複合体(または場合によってアプタマー共有複合体)から分配する。PCRを実行し、そして試験試料中のターゲット分子に結合しているアプタマーの量または濃度を、直接または間接的にのいずれかで決定することによって、アプタマー・アフィニティー複合体(または場合によってアプタマー共有複合体)を定量化する。試験試料中のターゲット分子の量または濃度は、一般的に、Q−PCRを用いることによって定量化されたアプタマーの量または濃度と正比例する。この方式で、アプタマー・アフィニティー複合体(または場合によってアプタマー共有複合体)を定量化するのに使用可能な、典型的な方法は、TaqMan(登録商標)アッセイ(PE Biosystems、カリフォルニアフォスターティ;米国特許第5,210,015号もまた参照されたい)である。

図面の簡単な説明

0011

[0011]図1Aおよび1Bは、試験試料中に存在しうる1以上のターゲット分子の検出および/または定量化のための典型的な方法を例示する。
[0011]図1Aおよび1Bは、試験試料中に存在しうる1以上のターゲット分子の検出および/または定量化のための典型的な方法を例示する。
[0012]図2A、2Bおよび2Cは、試験試料中に存在しうる1以上のターゲット分子の検出および/または定量化のための典型的な方法を例示する。
[0012]図2A、2Bおよび2Cは、試験試料中に存在しうる1以上のターゲット分子の検出および/または定量化のための典型的な方法を例示する。
[0012]図2A、2Bおよび2Cは、試験試料中に存在しうる1以上のターゲット分子の検出および/または定量化のための典型的な方法を例示する。
図3は、試験試料中に存在しうる1以上のターゲット分子の検出および/または定量化のための典型的な方法を例示する。
図4は、図2A、2B、および2Cに示すアッセイを用いた、緩衝液図4A)および血漿図4B)中のVEGFの連続希釈に関する用量反応曲線を示す。タンパク質不含緩衝液反応を、両方のセット中の各データ点から減じてある。対数変換データ適合させた最小二乗直線を示す。
[0015]図5A〜5Jは、図2A、2B、および2Cに示すアッセイを用いた緩衝液中の41の光アプタマーで多重化された10のターゲットタンパク質の連続希釈に関する用量反応曲線を示す。タンパク質不含緩衝液反応を、このセット内の各データ点から減じてある。対数変換データに適合させた最小二乗直線もまた示す。直線適合に用いたデータ点のみを示す。
[0015]図5A〜5Jは、図2A、2B、および2Cに示すアッセイを用いた緩衝液中の41の光アプタマーで多重化された10のターゲットタンパク質の連続希釈に関する用量反応曲線を示す。タンパク質不含緩衝液反応を、このセット内の各データ点から減じてある。対数変換データに適合させた最小二乗直線もまた示す。直線適合に用いたデータ点のみを示す。
[0015]図5A〜5Jは、図2A、2B、および2Cに示すアッセイを用いた緩衝液中の41の光アプタマーで多重化された10のターゲットタンパク質の連続希釈に関する用量反応曲線を示す。タンパク質不含緩衝液反応を、このセット内の各データ点から減じてある。対数変換データに適合させた最小二乗直線もまた示す。直線適合に用いたデータ点のみを示す。
[0015]図5A〜5Jは、図2A、2B、および2Cに示すアッセイを用いた緩衝液中の41の光アプタマーで多重化された10のターゲットタンパク質の連続希釈に関する用量反応曲線を示す。タンパク質不含緩衝液反応を、このセット内の各データ点から減じてある。対数変換データに適合させた最小二乗直線もまた示す。直線適合に用いたデータ点のみを示す。
[0015]図5A〜5Jは、図2A、2B、および2Cに示すアッセイを用いた緩衝液中の41の光アプタマーで多重化された10のターゲットタンパク質の連続希釈に関する用量反応曲線を示す。タンパク質不含緩衝液反応を、このセット内の各データ点から減じてある。対数変換データに適合させた最小二乗直線もまた示す。直線適合に用いたデータ点のみを示す。
[0015]図5A〜5Jは、図2A、2B、および2Cに示すアッセイを用いた緩衝液中の41の光アプタマーで多重化された10のターゲットタンパク質の連続希釈に関する用量反応曲線を示す。タンパク質不含緩衝液反応を、このセット内の各データ点から減じてある。対数変換データに適合させた最小二乗直線もまた示す。直線適合に用いたデータ点のみを示す。
[0015]図5A〜5Jは、図2A、2B、および2Cに示すアッセイを用いた緩衝液中の41の光アプタマーで多重化された10のターゲットタンパク質の連続希釈に関する用量反応曲線を示す。タンパク質不含緩衝液反応を、このセット内の各データ点から減じてある。対数変換データに適合させた最小二乗直線もまた示す。直線適合に用いたデータ点のみを示す。
[0015]図5A〜5Jは、図2A、2B、および2Cに示すアッセイを用いた緩衝液中の41の光アプタマーで多重化された10のターゲットタンパク質の連続希釈に関する用量反応曲線を示す。タンパク質不含緩衝液反応を、このセット内の各データ点から減じてある。対数変換データに適合させた最小二乗直線もまた示す。直線適合に用いたデータ点のみを示す。
[0015]図5A〜5Jは、図2A、2B、および2Cに示すアッセイを用いた緩衝液中の41の光アプタマーで多重化された10のターゲットタンパク質の連続希釈に関する用量反応曲線を示す。タンパク質不含緩衝液反応を、このセット内の各データ点から減じてある。対数変換データに適合させた最小二乗直線もまた示す。直線適合に用いたデータ点のみを示す。
[0015]図5A〜5Jは、図2A、2B、および2Cに示すアッセイを用いた緩衝液中の41の光アプタマーで多重化された10のターゲットタンパク質の連続希釈に関する用量反応曲線を示す。タンパク質不含緩衝液反応を、このセット内の各データ点から減じてある。対数変換データに適合させた最小二乗直線もまた示す。直線適合に用いたデータ点のみを示す。
[0016]図6Aおよび6Bは、図2A、2B、および2Cに概略するアッセイから得られる、2つの個体の血清試料中の57の光アプタマーの反応に関する、RFUでの反復測定を示す。どちらの反復測定も、測定した57のターゲットに関して、非常に優れた再現性を示し、0.99より高いピアソン相関を生じた。
[0017]図7は、場合によって動力学的負荷を伴う、UPSハイブリダイゼーション捕捉アッセイを用いた、緩衝液(●)および血漿(▲)中のtPAに関する用量反応曲線を示す。タンパク質不含緩衝液反応を平均し、そしてどちらの曲線からも減じた。ターゲットタンパク質が添加されない血漿試料に関しては、0.1pM tPAで、動力学的負荷を伴わない希釈した血漿反応を(□)によって示し、そして動力学的負荷を伴うものを(△)によって示す。測定される反応は、血漿において動力学的負荷のため、ほぼ1対数減少し、一方、10nMのtPAを添加すると、(○)(緩衝液)および(△)(血漿)によって明らかであるように、ターゲット−アプタマー反応は不変である。
[0018]図8は、競合剤を含み(■)、そして含まず(●)、場合によって動力学的負荷を伴うアッセイを用いた、血漿中のtPAに関する用量反応曲線を示す。タンパク質不含血漿値を1pM[tPA]でプロットし、そしてこれは、競合剤負荷によって、70%減少したが、30nM tPAでの反応によって立証されるように、ターゲット−アプタマー反応は不変であり、競合剤の存在下または非存在下で本質的に同じである。
[0019]図9は、緩衝液(●)および血漿(▲)中の、3つのターゲットタンパク質(tPA(図9A)、PAI−1(図9B)、およびIL−6(図9C))の用量反応曲線を示す。各アプタマーに関して、タンパク質不含緩衝液RFU値を減じることによって、RFU値を補正してある。対数変換データに適合させた最小二乗直線もまた、緩衝液データに関してプロットする。これらのアプタマーに関する補正したタンパク質不含血漿RFU値(△、1pM)は、それぞれ、66、26、および49RFUである。
[0020]図10A〜10Dは、K+/SDS沈殿を用いた、未結合アプタマーの場合による除去に先立って、緩衝液中で架橋し、そして血漿に添加した4つのターゲットタンパク質に関する用量反応曲線(●)を、未結合アプタマーを除去せずに生成した曲線(■)に比較して示す。シグナルは、未結合アプタマーの除去に際して増加し、そして測定のダイナミックレンジは一般的に増加する。
[0021]図11は、ハイブリダイゼーション中に界面活性剤および高塩濃度を用いた際の、光アプタマーに対するターゲットタンパク質(bFGF)の光誘導性化学的架橋の影響を示す。光の非存在下で、そしてしたがって光アプタマーに対するターゲットの共有結合の非存在下で、緩衝液中、アッセイシグナルは2桁以上減少する。bFGFの内因性濃度は非常に低く、これは、光なしの対照および全体のバックグラウンド反応を超えるシグナルが小さいことに反映される。
[0022]図12は、dTの代わりに5−ベンジル−dTの修飾ライブラリー発展させた光アプタマーを用いた、ターゲットタンパク質(C4b)の緩衝液中の用量反応を示す。ターゲット濃度の3対数を超えて反応が線形であることによって、アッセイにおける修飾ヌクレオチドアプタマーの活性が立証される。
[0023]図13は、Schott Nexterion表面(図13A)またはメタクリレートコポリマー表面(図13B)上のターゲットタンパク質の直接標識(▲)またはビオチン化後の蛍光標識されたストレプトアビジン(■)で生じた用量反応曲線を示す。どちらの表面もよく働き、そして2つの標識戦略は同等である。
[0024]図14は、緩衝液(図14A)または10%血清図14B)のいずれか由来であり、そしてAffymetrix GeneChip(登録商標)Test3アレイ上でNHS−PEO4−ビオチンで標識されたアプタマー−ターゲット複合体のハイブリダイゼーションを例示する。Affymetrix GeneChip(登録商標)流体工学ステーション上で、フィコエリトリン−Rでの染色を行う。緩衝液中(図14A)、VEGFアプタマーは、3500RFUの強度で、プローブ201(1)にハイブリダイズし、そしてbFGFアプタマーは、23000RFUの強度でプローブ1121(2)にハイブリダイズする。血清中図14B)、VEGFおよびbFGFアプタマーに関して、相対強度はそれぞれ、5000(1)および18000(2)である。
[0025]図15は、血漿試料由来のアプタマー−ターゲット複合体のハイブリダイゼーションに先立ち、Affymetrix GeneChip(登録商標)Test3アレイをブロッキングする影響を例示する。ビオチン化プローブを、緩衝液中で(図15A)、そして血漿試料中で、脱脂乳でブロッキングした表面に(図15B)、「スターターブロック」でブロッキングした表面に(図15C)、そして非標識血漿でブロッキングした表面に(図15D)、ハイブリダイズさせた。これらの4つの表面のバックグラウンド値は、49、300、400および500RFUであり、一方、3つのプローブのハイブリダイゼーションシグナルは、図15Aおよび図15Bでは16,000、33000および18000であり、図15Cでは17000、35000、および18000であり、そして図15Dでは20000、36000および18000である。
[0026]図16は、血漿に添加され、光アプタマーに架橋され、そしてAffymetrix GeneChip(登録商標)Test3アレイ上にハイブリダイズさせたターゲットタンパク質の定量的検出を例示する。血漿中で形成される、ターゲットタンパク質、IL1−R4(▲)およびbFGF(■)のアプタマー複合体のハイブリダイゼーション反応からは、タンパク質不含反応RFU値を減じてある。アレイ表面をブロッキングして、試料マトリックス中の分子の吸着を減少させた後、血漿試料からは、2対数定量化範囲が見られる。
[0027]図17は、緩衝液中の光アプタマーと多重化した3つのターゲットタンパク質の連続希釈に関するターゲットタンパク質用量反応を示す。特異的オリゴヌクレオチドプローブコンジュゲート化したLuminex SeroMapTM微小球体へのハイブリダイゼーションを通じて、光アプタマー架橋ターゲットタンパク質を捕捉した。シグナル定量化には、Luminex 100IS装置ステムを用いた。各アプタマーに関して、タンパク質不含対照MFI(中央値蛍光強度)値を減じることによって、MFI値を補正してある。

0012

詳細な説明
[0028]本明細書に開示する本発明の実施は、別に示さない限り、当該技術分野の技術レベル内の化学微生物学分子生物学、および組換えDNA技術慣用法を使用する。こうした技術は文献に完全に説明される。例えば、Sambrookら Molecular Cloning: A Laboratory Manual(現行版); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. IおよびII(D. Glover監修); Oligonucleotide Synthesis(N. Gait監修、現行版); Nucleic Acid Hybridization(B. HamesおよびS. Higgins監修、現行版); Transcription and Translation(B. HamesおよびS. Higgins監修、現行版)を参照されたい。

0013

[0029]本明細書に引用するすべての刊行物、公開特許文書、および特許出願は、本発明が属する当該技術分野(単数または複数)の技術のレベルを示す。本明細書に引用するすべての刊行物、公開特許文書、および特許出願は、各々の個々の刊行物、公開特許文書、または特許出願が、具体的に、そして個々に、本明細書に援用されると示されるのと同じ度合いまで、本明細書に援用される。

0014

[0030]付随する請求項を含めて、本明細書で用いる際、単数形「a」、「an」、および「the」には、内容が明らかに別に指示しない限り、複数の言及も含まれ、そして「少なくとも1つ」および「1以上」と交換可能に用いられる。したがって、「単数のアプタマー(an aptamer)」への言及には、アプタマーの混合物が含まれ、「単数のプローブ(a probe)」への言及には、プローブの混合物が含まれるなど
である。

0015

[0031]本明細書において、用語「含む(comprises)」、「含むこと(comprising)」、「含まれる(includes)」、「含まれること(including)」、「含有する(contains)」、「含有すること(containing)」、およびそれらの任意の変形は、非包括包含を含むと意図され、したがって、要素または要素のリストを含むか、該要素が含まれるか、または該要素を含有する、問題のプロセス、方法、プロセスによる産物、または組成物には、これらの要素のみが含まれるのでなく、問題のこうしたプロセス、方法、プロセスによる産物、または組成物に明確に列挙されていないかまたは本質的でない、他の要素もまた、含まれてもよい。

0016

[0032]本開示には、試験試料中に存在しうる1以上のターゲット分子の検出および/または定量化のための方法、デバイス、試薬、およびキットが含まれる。開示する方法、デバイス、試薬、およびキットは、(1)アプタマーの活性、(2)アプタマー−ターゲット分子複合体に関する結合平衡を達成する効率、(3)アプタマーおよびそのターゲット分子間の共有結合(単数または複数)の形成、ならびに(4)アプタマー−ターゲット分子複合体の検出に影響を及ぼす条件を最適化することによって、試験試料中のターゲット分子の検出および/または定量化のための高感度アッセイを提供する。

0017

[0033]図1Aおよび1Bと関連して、ターゲット分子に対する特異的アフィニティーを有するアプタマーと試験試料をまず接触させることによって、試験試料中のターゲット分子の存在を検出し、そしてまたは定量化する。ターゲット分子に結合したアプタマーを含むアプタマー・アフィニティー複合体の形成を可能にする。試験試料がターゲット分子を含有する場合、一般的に、試験試料中で、アプタマー・アフィニティー複合体が形成されるであろう。使用しているアプタマーに適した方法を用いて、場合によって、アプタマー・アフィニティー複合体を、ターゲット分子に共有結合したアプタマーを含むアプタマー共有複合体に変換する。次いで、アプタマー・アフィニティー複合体(または場合によってアプタマー共有複合体)を検出し、そして/または定量化する。

0018

[0034]1つの態様において、アプタマー・アフィニティー複合体(または場合によってアプタマー共有複合体)を固体支持体に付着させることによって、アプタマー・アフィニティー複合体(または場合によってアプタマー共有複合体)を検出し、そして/または定量化する。図2A、2B、および2Cと関連して、試験試料中に存在しうるターゲット分子の検出および/または定量化のための典型的な方法において、タグを含み、そしてターゲット分子に対する特異的アフィニティーを有するアプタマーと試験試料を接触させる。ターゲット分子に結合したアプタマーを含むアプタマー・アフィニティー複合体の形成を可能にする。試験試料がターゲット分子を含有する場合、一般的に、試験試料中で、アプタマー・アフィニティー複合体が形成されるであろう。使用しているアプタマーに適した方法を用いて、場合によって、アプタマー・アフィニティー複合体を、ターゲット分子に共有結合したアプタマーを含むアプタマー共有複合体に変換する。アプタマー・アフィニティー複合体(または場合によってアプタマー共有複合体)を固体支持体に付着させる。アプタマー・アフィニティー複合体(または場合によってアプタマー共有複合体)と固体支持体を接触させ、そしてアプタマー上に含まれるタグが、固体支持体に付着したプローブと、直接または間接的にのいずれかで会合するのを可能にすることによって、付着を達成する。次いで、固体支持体上のプローブと会合しているアプタマー・アフィニティー複合体(または場合によってアプタマー共有複合体)を検出し、そして場合によって定量化する。検出および場合による定量化に先立つ任意の時点で、すなわち、固体支持体へのアプタマー・アフィニティー複合体(または場合によってアプタマー共有複合体)の付着前または付着後のいずれかいつでも、複合体を標識剤と接触させて、結合したターゲット分子の検出を可能にする。

0019

[0035]本明細書において、「核酸」、「オリゴヌクレオチド」、および「ポリヌクレオチド」は、交換可能に用いられ、任意の長さのヌクレオチドポリマーを指し、そしてこうしたヌクレオチドには、デオキシリボヌクレオチドリボヌクレオチド、および/または類似体、あるいは化学的に修飾されたデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドが含まれてもよい。用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、および「核酸」には、二本鎖または一本鎖分子、ならびに三重らせん分子が含まれる。

0020

[0036]存在する場合、ヌクレオチドの化学的修飾には、単独でまたは任意の組み合わせで、2’位糖修飾、5位ピリミジン修飾(例えば、5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン、5−(N−イソブチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン、5−(N−[2−(1H−インドール−3イルエチル]カルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン、5−(N−[1−(3−トリメチルアンモニウムプロピル]カルボキシアミド)−2’−デオキシウリジンクロリド、5−(N−ナフチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン、および5−(N−[1−(2,3−ジヒドロキシプロピル)]カルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン)、8位プリン修飾、環外アミンでの修飾、4−チオウリジン置換、5−ブロモまたは5−ヨードウラシルの置換、主鎖修飾、メチル化イソ塩基、イソシチジンおよびイソグアニジンなどの異常な塩基対形成の組み合わせ等が含まれてもよい。修飾にはまた、キャッピングなどの3’および5’修飾もまた含まれてもよい。他の修飾には、類似体での1以上の天然存在ヌクレオチドの置換、ヌクレオチド間修飾、例えば非荷電連結での修飾(例えばメチルホスホネートホスホトリエステル、ホスホアミデートカルバメートなど)、および荷電連結での修飾(例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど)、挿入剤(例えばアクリジンソラレンなど)での修飾、キレート剤(例えば金属、放射性金属ホウ素、酸化金属等)を含有する修飾、アルキル化剤を含有する修飾、および修飾連結での修飾(例えばアルファアノマー核酸など)が含まれてもよい。さらに、糖に通常存在する任意のヒドロキシル基を、ホスホン酸基またはリン酸基によって置換するか;標準的保護基によって保護するか;あるいはさらなるヌクレオチドまたは固体支持体へのさらなる連結に備えて活性化してもよい。5’および3’末端OH基リン酸化するか、あるいは、アミン、約1〜約20炭素原子有機キャッピング基部分、または約1〜約20のポリエチレングリコール(PEG)ポリマーまたは他の親水性もしくは疎水性生物学的もしくは合成ポリマーの有機キャッピング基部分で置換してもよい。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾を、ポリマーの組み立て前または後に行ってもよい。非ヌクレオチド構成要素によって、ヌクレオチド配列中断してもよい。標識構成要素とのコンジュゲート化によるなどで、重合後にポリヌクレオチドをさらに修飾してもよい。

0021

[0037]ポリヌクレオチドはまた、当該技術分野に一般的に知られるリボースまたはデオキシリボース糖の類似体型も含有してもよく、これらには、2’−O−メチル−、2’−O−アリル、2’−フルオロ−または2’−アジド−リボース、炭素環糖類似体、α−アノマー糖、エピマー糖、例えばアラビノースキシロースまたはリキソースピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、無環類似体および無塩基性ヌクレオシド類似体、例えばメチルリボシドが含まれる。上に記載するように、1以上のホスホジエステル連結を、別の連結基によって置換してもよい。これらの別の連結基には、ホスフェートがP(O)S(「チオエート」)、P(S)S(「ジチオエート」)、(O)NR2(「アミデート」)、P(O)R、P(O)OR’、COまたはCH2(「ホルムアセタール」)によって置換されている態様が含まれ、式中、各RまたはR’は、独立に、H、あるいはエーテル(−O−)連結、アリールアルケニルシクロアルキルシクロアルケニルまたはアラルジル(araldyl)を場合によって含有する、置換または非置換アルキル(1〜20C)である。ポリヌクレオチド中のすべての連結が同一である必要はない。糖、プリン、およびピリミジンの類似型の置換は、最終産物の設計に好都合である可能
性もあり、例えばポリアミン主鎖のような別の主鎖構造も好都合でありうる。

0022

[0038]本明細書において、「アプタマー」および「核酸リガンド」は、交換可能に用いられ、ターゲット分子に対する特異的結合アフィニティーを有する核酸を指す。アフィニティー相互作用は、程度の問題であることが認識される;が、この文脈では、ターゲットに対するアプタマーの「特異的結合アフィニティー」は、試験試料中の他の構成要素に結合するよりも、一般的に、はるかにより高い度合いのアフィニティーで、アプタマーがターゲットに結合することを意味する。(単数の)「アプタマー」は、特定のヌクレオチド配列を有する核酸分子の1つのタイプまたは種類のコピーのセットである。アプタマーには、いかなる適切な数のヌクレオチドが含まれてもよい。「(複数の)アプタマー」はこうした分子セットの1より多くを指す。異なるアプタマーは、同数かまたは異なる数か、いずれのヌクレオチドを有してもよい。本明細書に開示するいかなる方法にも、1以上のアプタマーの使用が含まれてもよい。本明細書に開示するいかなる方法にも、また、同じターゲット分子に特異的に結合する2以上のアプタマーの使用も含まれてもよい。以下にさらに記載するように、アプタマーにはタグが含まれてもよい。アプタマーにタグが含まれる場合、アプタマーのすべてのコピーが同じタグを有する必要はない。さらに、異なるアプタマーに、各々、タグが含まれる場合、これらの異なるアプタマーは、同じタグまたは異なるタグのいずれを有してもよい。

0023

[0039]SELEX法を含む、いかなる既知の方法を用いて、アプタマーを同定してもよい。例えば、米国特許第5,475,096号、表題「Nucleic Acid
Ligands」を参照されたい。同定されたならば、化学的合成法および酵素的合成法を含めて、いかなる既知の方法にしたがって、アプタマーを調製するかまたは合成してもよい。

0024

[0040]用語「SELEX」および「SELEX法」は、本明細書において交換可能に用いられ、一般的に、(1)望ましい方式でターゲット分子と相互作用する、例えばタンパク質に高いアフィニティーで結合する、核酸の選択と、(2)これらの選択された核酸の増幅の組み合わせを指す。例えば、米国特許第5,475,096号、表題「Nucleic Acid Ligands」を参照されたい。SELEX法を用いて、ターゲットと共有結合するアプタマー、ならびにターゲットに非共有的に結合するアプタマーを生成してもよい。例えば、米国特許第5,705,337号、表題「Systematic Evolution of Nucleic Acid Ligands by Exponential Enrichment: Chemi−SELEX」を参照されたい。

0025

[0041]本明細書に開示するように、アプタマーは、「タグ」をさらに含んでもよく、タグは、固体支持体にアプタマーを(およびそれに結合したいかなるターゲット分子も)付着させるかまたは固定する手段を提供する構成要素を指す。(単数の)「タグ」は、プローブと会合可能な構成要素の1つのタイプまたは種類のコピーのセットである。「(複数の)タグ」は、構成要素のこうしたセットの1より多くを指す。当該技術分野に知られるいかなる方法によって、タグをアプタマーに付着させてもよいし、またはタグがアプタマーに含まれてもよい。一般的に、タグは、アプタマーが、固体支持体に付着したプローブと、直接または間接的にのいずれかで会合することを可能にする。タグは、固体支持体上の空間的に定義されたアドレスに、アプタマー共有複合体を局在させることを可能にしうる。したがって、異なるタグは、固体支持体上の空間的に定義された異なるアドレスに、異なるアプタマー共有複合体を局在させることを可能にしうる。タグは、ポリヌクレオチド、ポリペプチドペプチド核酸ロック核酸、オリゴ糖多糖、抗体、アフィボディー抗体模倣体細胞受容体リガンド、脂質、これらの構造の任意の断片または誘導体、前述のものの任意の組み合わせ、あるいはプローブ(または以下に記載するような
リンカー分子)が、特異性を持って結合するかまたは別の方式で会合するように設計されるかまたは設定されうる任意の他の構造であってもよい。一般的に、タグは、分子内で、それ自体と、あるいはそのタグが付着しているかまたはそのタグが一部となっているアプタマーと相互作用しないように設定される。SELEXを用いてアプタマーを同定する場合、SELEX前またはSELEX後のいずれかで、タグをアプタマーに付加してもよい。1つの態様において、SELEX後、アプタマーの5’端上にタグが含まれる。別の態様において、SELEX後、アプタマーの3’端上にタグが含まれる。

0026

[0042]1つの態様において、タグには、プローブ配列と直接ハイブリダイズすることによって、相補的ポリヌクレオチド配列を含むプローブと直接会合するように設計されたポリヌクレオチドが含まれる。この態様において、タグは、一般的に設定され、そしてタグが完全な相補体を含むプローブ以外のプローブとタグがハイブリダイズしないような条件下で、ハイブリダイゼーション反応が行われる。

0027

[0043]いくつかの態様において、タグは、アプタマー自体の部分であるヌクレオチドを含む。例えば、SELEXを用いてアプタマーを同定する場合、アプタマーには、一般的に、アプタマーに応じて多様であるヌクレオチド配列、すなわち可変領域によって3’固定端から分離された5’固定端が含まれる。1つの態様において、タグは、アプタマーの固定端に含まれる任意の適切な数のヌクレオチド、例えば、固定端全体または固定端の任意の一部を含んでもよく、固定端より内部のヌクレオチドを含んでもよい。別の態様において、タグは、アプタマーの可変領域内に含まれる任意の適切な数のヌクレオチドを含んでもよいし、例えば、可変領域全体または可変領域の任意の一部を含んでもよい。さらなる態様において、タグは、可変領域および固定端の1つの両方に重なり合うヌクレオチドの任意の適切な数を含んでもよく、すなわち、タグは、可変領域の任意の一部(すべてを含む)および固定端の任意の一部(すべてを含む)を含んでもよい。

0028

[0044]別の態様において、タグは直接プローブに会合し、そしてプローブに共有結合して、それによって、固体支持体表面にアプタマーを共有結合させてもよい。この態様において、タグおよびプローブには、プローブとタグとの会合に際して、共有結合を生じる化学反応を経るために、互いに十分に近接している、適切な反応基が含まれてもよい。反応は、自発的に起きてもよいし、あるいは活性化、例えば光活性化または化学的活性化を必要としてもよい。典型的な態様において、タグには、ジエン部分が含まれ、そしてプローブには求ジエン(dienophile)が含まれて、そして共有結合形成は、ジエンおよび求ジエンの自発的なディールスアルダー・コンジュゲート化反応から生じる。例えば、N−マンニッヒ反応ジスルフィド形成、カーティス反応、アルドール縮重シッフ塩基形成、およびマイケル付加などの任意の適切な補完的化学反応を用いてもよい。

0029

[0045]別の態様において、以下にさらに記載するように、タグは、例えばリンカー分子を通じて、プローブと間接的に会合する。この態様において、タグには、リンカー分子の特定の領域または構成要素に相補的ポリヌクレオチド配列が含まれてもよい。タグは、一般的に設定され、そしてリンカー分子中に含まれるポリヌクレオチド配列以外のポリヌクレオチド配列とタグがハイブリダイズしないように、ハイブリダイゼーション反応が行われる。

0030

[0046]タグにポリヌクレオチドが含まれる場合、ポリヌクレオチドには、任意の適切な数のヌクレオチドが含まれてもよい。1つの態様において、タグには、少なくとも約10ヌクレオチドが含まれる。別の態様において、タグには、約10〜約45ヌクレオチドが含まれる。さらに別の態様において、タグには、少なくとも約30ヌクレオチドが含まれる。ポリヌクレオチドが含まれる、異なるタグには、同じ数のヌクレオチドまたは
異なる数のヌクレオチドのいずれかが含まれてもよい。

0031

[0047]本明細書において、用語「約」は、数値が関連する項目の基本的な機能が不変であるような、数値の重要でない修飾または変動を示す。

0032

[0048]本明細書において、「会合する(associate、associates)」およびそのいかなる変形も、所定の複合体形成または反応条件下で、タグ−プローブ複合体から、試験試料の「非会合」または非結合物質、例えば非結合構成要素を分離することを可能にするように、十分に安定な複合体を生じる、タグおよびプローブ間の相互作用または複合体形成を指す。特異性を持って互いに相互作用して、そして結合することによって、タグおよびプローブは、互いに直接会合しうる。タグおよびプローブはまた、その複合体形成がリンカー分子によって仲介される際などに、互いに間接的に会合しうる。

0033

[0049]本明細書において、「プローブ」は、タグと直接または間接的にのいずれかで会合するように設定された分子を指す。(単数の)「プローブ」は、タグと直接または間接的にのいずれかで会合することによって、固体支持体にアプタマーを固定することが可能な、分子の1つのタイプまたは多分子構造の1つのタイプのコピーのセットである。「(複数の)プローブ」は、分子のこうしたセットの1より多くを指す。プローブは、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ペプチド核酸、ロック核酸、オリゴ糖、多糖、抗体、アフィボディ、抗体模倣体、細胞受容体、リガンド、脂質、これらの構造の任意の断片または誘導体、前述のものの任意の組み合わせ、あるいはタグ(またはリンカー分子)が、特異性を持って結合するかまたは別の方式で会合するように設計されるかまたは設定されうる任意の他の構造であってもよい。当該技術分野に知られるいかなる方法によって、プローブを共有的または非共有的のいずれかで、固体支持体に付着させてもよい。

0034

[0050]1つの態様において、プローブには、ポリヌクレオチド・タグ配列に相補的な配列を有するポリヌクレオチドが含まれる。この態様において、プローブ配列は、一般的に設定され、そしてプローブが相補配列を含むタグ以外のヌクレオチド配列にはプローブがハイブリダイズしないような条件下で、ハイブリダイゼーション反応が行われる(すなわち、プローブは、一般的に設定され、そしてプローブが、異なるタグまたはアプタマーとハイブリダイズしないような条件下で、ハイブリダイゼーション反応が行われる)。

0035

[0051]別の態様において、プローブは、タグと間接的に、例えばリンカー分子を通じて会合する。この態様において、プローブには、リンカー分子の特定の領域または構成要素に相補的なポリヌクレオチド配列が含まれてもよい。プローブは、一般的に設定され、そしてプローブが、リンカー分子中に含まれるポリヌクレオチド配列以外のポリヌクレオチド配列とはハイブリダイズしないように、ハイブリダイゼーション反応が行われる。

0036

[0052]プローブにポリヌクレオチドが含まれる場合、ポリヌクレオチドには、任意の適切な数のヌクレオチドが含まれてもよい。1つの態様において、プローブには、少なくとも約10ヌクレオチドが含まれる。別の態様において、プローブには、約10〜約45ヌクレオチドが含まれる。さらに別の態様において、プローブには、少なくとも約30ヌクレオチドが含まれる。ポリヌクレオチドが含まれる、異なるプローブには、同じ数のヌクレオチドまたは異なる数のヌクレオチドのいずれかが含まれてもよい。

0037

[0053]本明細書において、「リンカー分子」は、タグとプローブの会合を仲介するよう設定される1以上の分子を指す。一般的に、リンカー分子は、タグに連結するため
の官能性およびプローブに連結するための官能性を含む点で、二官能性である。(単数の)「リンカー分子」は、タグとプローブを会合させることが可能な、分子(単数または複数)または多分子構造(単数または複数)の1つのタイプまたは種類のコピーのセットである。「(複数の)リンカー分子」は、分子または多分子構造のこうしたセットの1より多くを指す。リンカー分子は、任意の適切な設定を有してもよく、そしてポリヌクレオチド、ポリペプチド、ペプチド核酸、ロック核酸、オリゴ糖、多糖、抗体、アフィボディ、抗体模倣体、ポリエチレングリコール(PEG)分子、細胞受容体、リガンド、脂質、これらの構造の任意の断片または誘導体、前述のものの任意の組み合わせ、あるいは特異性を持ってタグおよびプローブ間の会合を仲介するように設計されるかまたは設定されうる任意の他の構造または化学的構成要素を含む、任意の適切な構成要素を含んでもよい。リンカー分子は、脂肪族または芳香族であってもよい。

0038

[0054]リンカー分子の組成は、本明細書に開示する方法のいずれにも重要ではない。リンカー分子が親水性であることがしばしば好ましい。一般的な規則として、特定のリンカー分子の長さを選択して、合成の好適性およびプローブとタグの会合を仲介する際の容易さを提供してもよい。リンカー分子は、官能性を含有してはならず、または開示する方法にしたがって望ましい反応に、干渉するであろう長さのものであってはならない。

0039

[0055]図2A、2B、および2Cに関連して、本明細書開示の任意の方法でリンカー分子を使用する際に、アッセイ実行中の任意の適切な時点で、リンカー分子を導入してもよいし、そしてリンカー分子をまず、タグまたはプローブのいずれかと接触させてもよい。例えば、アプタマー共有複合体が固体支持体上のプローブに接触する前の任意の時点で、アプタマー上に含まれるタグを、リンカー分子と接触させてもよい。別の態様において、プローブを、アプタマー共有複合体上のタグに曝露する前の任意の時点で、固体支持体に付着したプローブを、リンカー分子と接触させてもよい。さらなる態様において、実行する特定のアッセイの複雑さおよび反応条件に応じて、例えば、プローブをリンカー分子、およびアプタマー共有複合体上のタグに同時に接触させてもよい。

0040

[0056]リンカー分子は、一般的に、タグ会合構成要素およびプローブ会合構成要素を含む。タグ会合構成要素およびプローブ会合構成要素は、特定のアッセイで利用される特定のタグおよびプローブに基づいて、独立に選択される。1つの態様において、タグ会合構成要素は、タグ中に含まれるポリヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチドである。別の態様において、プローブ会合構成要素は、プローブ中に含まれるポリヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチドである。さらなる態様において、タグ会合構成要素はポリヌクレオチドであり、そしてプローブ会合構成要素もまたポリヌクレオチドである。

0041

[0057]さらなる態様において、リンカー分子には、第三の構成要素によってプローブ会合構成要素から分離されたタグ会合構成要素が含まれる。この態様において、第三の構成要素には、1以上の分子または下位構成要素(sub−component)が含まれてもよく、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ペプチド核酸、ロック核酸、オリゴ糖、多糖、抗体、アフィボディ、抗体模倣体、脂肪族炭素分子、ポリエチレングリコール(PEG)分子、細胞受容体、リガンド、脂質、これらの構造の任意の断片または誘導体、前述のものの任意の組み合わせ、あるいは例えば、タグ会合構成要素およびプローブ会合構成要素間の柔軟性を増加させることによるなどで、プローブとタグの会合を補助しうる任意の他の化学的構造または構成要素が含まれてもよい。

0042

[0058]リンカー分子のポリヌクレオチド構成要素には、任意の適切な数のヌクレオチドが含まれてもよい。1つの態様において、リンカー分子のポリヌクレオチド構成要素には、少なくとも約10ヌクレオチドが含まれる。別の態様において、リンカー分子の
ポリヌクレオチド構成要素には、約10〜約45ヌクレオチドが含まれる。さらに別の態様において、リンカー分子のポリヌクレオチド構成要素には、少なくとも約30ヌクレオチドが含まれる。本明細書に開示する任意の方法で用いられるリンカー分子には、同じ数のヌクレオチドまたは異なる数のヌクレオチドのいずれかを有するポリヌクレオチド構成要素が含まれてもよい。

0043

[0059]本明細書において、「光アプタマー」、「光反応性核酸リガンド」、および「光反応性アプタマー」は交換可能に用いられ、ターゲット分子に共有結合するかまたは該分子と「架橋する」ことも可能な、1以上の光反応性官能基を含有するアプタマーを指す。例えば、天然存在核酸残基を修飾して、適切な波長照射供給源に対する曝露に際して核酸残基に光反応性を与える、化学的官能基を含ませてもよい。いかなる既知の方法を用いて、光アプタマーを同定し、そして/または調製してもよい。いくつかの態様において、光SELEX法を用いて、光反応性アプタマーを同定する。例えば、米国特許第5,763,177号、米国特許第6,001,577号、および米国特許第6,291,184号、各々、表題「Systematic Evolution of Nucleic Acid Ligandsby Exponential Enrichment: Photoselection of Nucleic Acid Ligands and Solution SELEX」を参照されたい;また、例えば、米国特許第6,458,539号、表題「Photoselection of Nucleic
Acid Ligands」も参照されたい。他の態様において、アプタマーを調製し、そして続いて、1以上の光反応性官能基を取り込むように修飾して、それによって光アプタマーを生成する。これらの態様において、アプタマーにおいて、例えば、1以上のチミジンおよび/またはシジチン・ヌクレオチドなどの1以上の他のヌクレオチドの代わりに、光反応性核酸残基を置換することによるか、あるいは光反応性官能基を含むように1以上の核酸残基を修飾することによるかのいずれかで、1以上の光反応性核酸残基をアプタマーに取り込んでもよい。

0044

[0060]光アプタマー内に取り込んでもよい典型的な光反応性官能基には、5−ブロモウラシル、5−ヨードウラシル、5−ブロモビニルウラシル、5−ヨードビニルウラシル、5−アジドウラシル、4−チオウラシル、5−チオウラシル、4−チオシトシン、5−ブロモシトシン、5−ヨードシトシン、5−ブロモビニルシトシン、5−ヨードビニルシトシン、5−アジドシトシン、8−アジドアデニン、8−ブロモアデニン、8−ヨードアデニン、8−アジドグアニン、8−ブロモグアニン、8−ヨードグアニン、8−アジドヒポキサンチン、8−ブロモヒポキサンチン、8−ヨードヒポキサンチン、8−アジドキサンチン、8−ブロモキサンチン、8−ヨードキサンチン、5−[(4−アジドフェナシル)チオ]シトシン、5−[(4−アジドフェナシル)チオ]ウラシル、7−デアザ−7−ヨードアデニン、7−デアザ−7−ヨードグアニン、7−デアザ−7−ブロモアデニン、および7−デアザ−7−ブロモグアニンが含まれる。

0045

[0061]これらのヌクレオシドに基づく典型的な光反応性官能基に加えて、適切なリンカー分子を用いてアプタマーの末端に付加可能な他の光反応性官能基もまた用いてもよい。こうした光反応性官能基には、ベンゾフェノンアントラキノン、4−アジド−2−ニトロ−アニリン、ソラレン、これらのいずれかの誘導体等が含まれる。

0046

[0062]いかなる適切な方法によって、光アプタマー内に取り込まれる光反応性官能基を活性化してもよい。1つの態様において、光アプタマー・アフィニティー複合体を、電磁放射線供給源に曝露することによって、光反応性官能基を含有する光アプタマーを架橋する。適切なタイプの電磁放射線には、紫外光可視光X線、およびガンマ線が含まれる。適切な放射線供給源には、単色光またはフィルター処理した多色光のいずれかを利用する供給源が含まれる。

0047

[0063]1つの態様において、例えば4−アジド−2−ニトロ−アニリンなどの光反応性ヌクレオチドを光アプタマー内に取り込んで、そして約325nm〜約470nmの範囲の波長を有する光を用いて、この光アプタマーを含む光アプタマー・アフィニティー複合体に照射してもよい。例えば、単一の発光ダイオード(LED)または一連のLEDのいずれかを用いて、安価なLEDで、これらの波長での励起を達成してもよく、これは所要電力が適度であるためである。465〜475nmの範囲の波長、100度の視角を有し、そして38ルーメンの光を提供する、ほぼ単色の光を、1以上の高出力LEDによって供給する。望ましい光反応性官能基が、LEDによって生じる波長では励起不能である場合、しばしば、電子求引基または電子供与基の適切な置換を用いて、光反応性官能基の励起波長を適度にシフトさせて、LEDによって生じる波長での光反応性官能基の励起を可能にしてもよい。

0048

[0064]1つの態様において、光反応性ヌクレオチドを光アプタマー内に取り込んで、そして約300nm〜約350nmの範囲の波長を有する光を用いて、この光アプタマーを含む光アプタマー・アフィニティー複合体に照射して、光アプタマー・アフィニティー複合体を光アプタマー共有複合体に変換してもよい。

0049

[0065]1つの態様において、例えば5−ヨードウラシルまたは5−ヨードシトシンなどの光反応性ヌクレオチドを光アプタマー内に取り込んで、そして約320nm〜約325nmの範囲の波長を有する光を用いて、この光アプタマーを含む光アプタマー・アフィニティー複合体に照射してもよい。この組み合わせは、他の非特異的光反応誘導せずに、ターゲット分子への、発色体含有光アプタマーの選択的光架橋を促進する。例えば、ターゲットタンパク質の場合、ターゲットタンパク質中に含まれうるいかなるトリプトファン残基、ならびに光アプタマー中に含まれうるいかなるチミンおよびウラシル塩基もまた、光反応性であってもよい。5−ヨードウラシルまたは5−ヨードシトシンは、約325nmの波長を有する光を吸収するが、トリプトファンおよび天然存在核酸塩基は吸収しないため、この波長の光を用いると、光アプタマー・アフィニティー複合体内の5−ヨードウラシル(単数または複数)または5−ヨードシトシン(単数または複数)での選択的光反応が可能になる。例えば、約320nmの波長の周波数重複調節可能(frequency doubled tunable)色素レーザー放出光によって、または約325nmの波長のヘリウムカドミウムレーザー放出光によって、約320nm〜約325nmの範囲の波長を有する単色光を供給してもよい。

0050

[0066]さらなる態様において、光アプタマー・アフィニティー複合体を、塩化キセノン(XeCl)エキシマーレーザーセットに曝露して、約308nmの波長の光を放出させてもよい。この態様において、光アプタマーには、光反応性官能基(例えば5−ブロモウラシルまたは5−ブロモシトシン)が含まれてもよく、そして光アプタマー・アフィニティー複合体を光源で処理すると、光反応性官能基が光活性化されるように働いて、光アプタマーがターゲット分子と架橋され、そして光アプタマー共有複合体が形成される。

0051

[0067]さらに別の態様において、約313nmの波長の光を放出するようにセットされた高圧水銀ランプに、光アプタマー・アフィニティー複合体を曝露することによって、光アプタマーをターゲットに架橋してもよい。さらなる態様において、波長フィルターを使用して、放出光が約300nmより大きくなるように制限して、光アプタマー・アフィニティー複合体中に含まれるもの以外の発色体の活性化を最小限にしてもよい。

0052

[0068]さらなる態様において、約254nmの波長の光を放出するようにセットされた低圧水銀ランプに、光アプタマー・アフィニティー複合体を曝露して、この波長が
次いで、リンによって吸収され、そして約300nm〜約325nmの範囲の波長で再放出されることによって、光アプタマーをターゲットに架橋してもよい。この態様において、再放出された光をフィルター処理して、ターゲットタンパク質を損傷しうる、リンに吸収されない約254nmのいかなる光も、ならびに約290nm〜約305nmの範囲の波長のいかなる光も除去する。

0053

[0069]さらに別の態様において、例えばヨードウラシルまたはブロモシトシンなどのハロゲン光反応性官能基を光アプタマー内に取り込んでもよく、そしてこの光アプタマーを含む光アプタマー・アフィニティー複合体を、約350nm〜約400nmの範囲の波長を有する光で処理してもよい。例えば、約355nmにセットされたNeodymiumYAGレーザーの第三高調波由来の単色光または約351nmのフッ化キセノン(XeF)エキシマーレーザーの第一高調波由来の単色光を用いてもよい。

0054

[0070]本明細書において、「ターゲット分子」および「ターゲット」は交換可能に用いられ、アプタマーが高いアフィニティーおよび特異性で結合可能であり、そして試験試料中に存在しうる、関心対象のいかなる分子も指す。「関心対象の分子」には、特定の分子のいかなる重要でない変動も含まれ、例えば、タンパク質の場合、例えばアミノ酸配列の重要でない変動、ジスルフィド結合形成グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、あるいは他の操作または修飾のいずれか、例えば分子の同一性を実質的に改変しない標識構成要素とのコンジュゲート化が含まれる。「ターゲット分子」または「ターゲット」は、アプタマーに結合可能な分子または多分子構造の1つのタイプまたは種類のコピーのセットである。「ターゲット分子」または「ターゲット」は、分子のこうしたセットの1より多くを指す。典型的なターゲット分子には、タンパク質、ポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質、多糖、糖タンパク質ホルモン受容体抗原、抗体、アフィボディ、抗体模倣体、ウイルス病原体毒性物質基質代謝物遷移状態類似体、補因子阻害剤薬剤色素栄養物増殖因子細胞組織、および前述の任意のものの任意の断片または部分が含まれる。任意のサイズの実質的に任意の化学的または生物学的分子に関してアプタマーを同定してもよく、そしてしたがって、任意のサイズの実質的に任意の化学的または生物学的分子も適切なターゲットでありうる。また、ターゲットを修飾して、ターゲットおよびアプタマー間の相互作用の可能性または強度を増進してもよい。典型的な態様において、ターゲット分子はタンパク質である。SELEXターゲットがペプチドである方法に関しては、米国特許第6,376,190号、表題「Modified SELEX Processes Without Purified Protein」を参照されたい。

0055

[0071]「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、本明細書において交換可能に用いられ、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。ポリマーは直鎖でもまたは分枝鎖でもよく、修飾アミノ酸を含んでもよく、そして非アミノ酸によって中断されてもよい。該用語はまた、天然にまたは介入によって;例えばジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、あるいは他の操作または修飾のいずれか、例えば標識構成要素とのコンジュゲート化によって修飾されているアミノ酸ポリマーも含む。定義内にやはり含まれるのは、例えば、アミノ酸の1以上の類似体(例えば非天然アミノ酸等を含む)、ならびに当該技術分野に知られる他の修飾を含有するポリペプチドである。ポリペプチドは一本鎖または会合鎖であってもよい。

0056

[0072]本明細書において、「非ターゲット分子」および「非ターゲット」は、交換可能に用いられ、アプタマーと非特異的複合体を形成しうる、試験試料中に含有される分子を指す。(単数の)「非ターゲット分子」または「非ターゲット」は、アプタマーに結合可能な分子または多分子構造の1つのタイプまたは種類のコピーのセットである。「(複数の)非ターゲット分子」または「(複数の)非ターゲット」は、分子のこうしたセ
ットの1より多くを指す。第一のアプタマーに関して非ターゲットである分子が、第二のアプタマーに関してターゲットであってもよいことが認識されるであろう。同様に、第一のアプタマーに関してターゲットである分子は、第二のアプタマーに関して非ターゲットであってもよい。

0057

[0073]本明細書において、用語「アプタマー・アフィニティー複合体」は、ターゲット分子とアプタマーの相互作用によって形成される非共有複合体を指す。(単数の)「アプタマー・アフィニティー複合体」は、対応するターゲット分子に結合したアプタマーによって形成される複合体の1つのタイプまたは種類のコピーのセットである。「(複数の)アプタマー・アフィニティー複合体」は、複合体のこうしたセットの1より多くを指す。アプタマー・アフィニティー複合体は、一般的に、環境条件における変化、例えば温度の増加、塩濃度の増加、または変性剤の添加によって、逆転するかまたは解離することも可能である。

0058

[0074]本明細書において、用語「アプタマー共有複合体」は、アプタマーが、ターゲット分子と共有結合を形成するよう誘導されているか、または別の方式でターゲット分子と共有結合を形成する、アプタマー・アフィニティー複合体を指す。(単数の)「アプタマー共有複合体」は、対応するターゲット分子に共有結合したアプタマーによって形成される複合体の1つのタイプまたは種類のコピーのセットである。「(複数の)アプタマー共有複合体」は、複合体のこうしたセットの1より多くを指す。光アプタマーに関して上述した部分を含めて、アプタマー上の化学部分の光活性化によって、アプタマーおよびそのターゲット分子間の共有結合または連結を誘導してもよい。アプタマーおよびそのターゲット分子間の共有結合または連結はまた、化学的に誘導されてもよい。アプタマー中に含まれて、そしてターゲットとの共有連結を誘導するのに用いることも可能な化学基には、限定されるわけではないが、アルデヒドマレイミドアクリル誘導体、ジアゾニウム誘導体、チオール等が含まれる。いくつかの態様において、例えばマレイミドまたはジアゾニウム塩などの化学的架橋基は、単に、特異的でそして十分に増進された化学的反応性が起こるために必要な、適切な環境および反応基の並置を提供することによって、アプタマー・アフィニティー複合体をアプタマー共有複合体に変換可能である。他の態様において、化学的架橋剤、例えばアルデヒド基は、アプタマー・アフィニティー複合体を、安定な不可逆的アプタマー共有複合体に変換するために、別の構成要素、例えばシアノ水素化ホウ素ナトリウムの付加を必要としうる。さらに他の態様において、こうした化学的架橋剤はアプタマー中にまったく含まれず;第三の試薬を用いて、アプタマーおよびターゲット間の共有結合を促進することによって、アプタマー・アフィニティー複合体をアプタマー共有複合体に変換する。例えば、アミン反応性部分(例えばN−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、アルデヒド、またはイミデート)およびヌクレオシド反応基(例えばヨードアセトアミドまたは活性化アルデヒド)の両方を含有するホモおよびヘテロ二重官能性試薬は、アプタマー・アフィニティー複合体、例えばアプタマーおよびターゲットタンパク質によって形成されるアフィニティー複合体の共有複合体形成を誘導可能である。

0059

[0075]用語「試験試料」は、本明細書において、複数の分子を含有し、そして少なくとも1つのターゲット分子を含みうる、いかなる物質、溶液、または混合物も指す。用語、試験試料には、以下に定義するような生物学的試料、ならびに例えば汚染されたかまたは潜在的に汚染された水および産業廃水などの、環境または毒性試験に使用可能な試料が含まれる。試験試料はまた、準備プロセス、例えば製造プロセスの最終産物、中間産物、または副産物であってもよい。試験試料には、生物から、またはいくつかの他の供給源(例えば環境または産業供給源)から得られた、物質、溶液、または混合物に添加されている、任意の適切なアッセイ培地、緩衝液、または希釈剤が含まれてもよい。

0060

[0076]用語「生物学的試料」は、生物から得られた任意の物質、溶液、または混合物を指す。これには、血液(全血白血球末梢血単核細胞、血漿、および血清を含む)、、息、尿、精液唾液髄膜液、羊水液、リンパ液乳頭吸引液気管支吸引液滑液、関節吸引液、細胞、細胞抽出物、および脳脊髄液が含まれる。これにはまた、前述のすべての実験的に分離された分画も含まれる。用語「生物学的試料」にはまた、例えば糞便試料組織試料、または組織生検由来のものなどの、ホモジナイズした固形物質を含有する、物質、溶液、または混合物も含まれる。用語「生物学的試料」にはまた、組織培養細胞培養細菌培養、またはウイルス培養由来の物質、溶液、または混合物も含まれる。

0061

[0077]「固体支持体」は、共有または非共有結合いずれかを通じて、直接または間接的に分子が付着可能な表面を有する、任意の支持体を指す。固体支持体には、表面に付着するプローブのために物理的支持を提供可能ないかなる支持物質も含まれてもよい。物質は、一般的に、表面へのプローブの付着、およびアッセイの実行中に出会う、いかなる続く処理、取り扱い、またはプロセシングに関連する条件にも耐えることが可能である。物質は、天然存在、合成、または天然存在物質の修飾であってもよい。適切な固体支持体物質には、それのみで、または他の物質と組み合わせて用いられるかいずれかの、シリコングラファイト、鏡面、ラミネートセラミックスプラスチック(例えばポリ塩化ビニル)、シクロオレフィン・コポリマー、ポリアクリルアミドポリアクリレートポリエチレンポリプロピレン、ポリ(4−メチルブテン)、ポリスチレンポリメタクリレート、ポリ(テレフタル酸エチレン)、ポリテトラフルオロエチレンPTFEまたはテフロン(登録商標))、ナイロン、ポリ(酪酸ビニル))、ゲルマニウムガリウムヒ素、金、銀等が含まれてもよい。シリカを含み、そしてさらに例えばBioglassとして入手可能なガラスを含む、ガラスなどの、さらなる堅い物質を考慮してもよい。使用してもよい他の物質には、例えば、調節孔ガラスビーズなどの多孔物質が含まれる。表面上に取り込まれた、1以上の官能基、例えば任意のアミノカルボキシル、チオール、またはヒドロキシル官能基などを有することが可能な、当該技術分野に知られる任意の他の物質もまた、意図される。

0062

[0078]固体支持体に用いる物質は、単純から複雑の範囲に渡る、多様な設定のいずれをとってもよい。固体支持体は、ストリッププレートディスクロッドビーズを含む粒子試験管ウェル等を含む、いくつかの形状のいずれか1つであってもよい。物質は、通常、例えばスライドのように、比較的平面であるが、例えばビーズのように球状でも、または筒状(例えばカラム)であってもよい。多くの態様において、物質は、一般的に、長方形固体として成形される。例えばプローブのアレイなどの、多数のあらかじめ決定された配置をシート上で合成し、次いでさいの目切り、すなわちスコアの線に沿って、単一アレイ支持体になるまで割ることによって切断してもよい。使用可能な典型的な固体支持体には、マイクロタイターウェル、顕微鏡スライド、膜、常磁性ビーズ帯電紙、ラングミュアブロジェット膜シリコンウェハーチップフロースルーチップ、およびマイクロビーズが含まれる。

0063

[0079]固体支持体表面は、通常、固体支持体を形成する支持体物質外部部分である。プローブが結合している固体支持体表面は、平滑であってもまたは実質的に平面であっても、あるいは、くぼみ、溝、上昇、または他の外見などの、不規則性を有してもよい。所望の方式で、表面の特性を修飾するように働く化合物の1以上の異なる層で、表面を修飾してもよい。多様な態様において、一般的に、こうした表面修飾層は、存在するならば、単一分子の厚さから約1mm、または単一分子の厚さから約0.1mm、または単一分子の厚さから約0.001mmの厚さの範囲であってもよい。

0064

[0080]関心対象の表面修飾層には、無機および有機層、例えば金属、酸化金属、
ポリマー、小有機分子等が含まれる。関心対象のポリマー層には、メタクリレート・コポリマー、ポリアクリルアミド、多糖、リン脂質ポリウレタンポリエステルポリカーボネートポリ尿素ポリアミドポリエチレンアミンポリアリーレンスルフィドポリシロキサンポリイミド、ポリアセテート等が含まれ、ここで、ポリマーは、ヘテロまたはホモポリマー性であってもよく、そして付着した別個官能部分(例えばコンジュゲート化された部分)を持ってもまたは持たなくてもよい。関心対象の他の表面修飾には、例えばヒドロゲルなどの三次元ネットワークが含まれる。当該技術分野に知られる任意の適切なヒドロゲルを用いてもよい。例えば、米国特許出願公報第2003/0218130号、表題「Biochips with Surfaces Coated with
Polysaccharide−Based Hydrogels」、米国特許出願公報第20050147994号、表題「Method for Immobilizing a Biologic in a Polyurethane−Hydrogel Composition, a Composition Prepared from
the Method, and Biomedical Applications」、米国特許出願公報第2005005908号、表題「Photocrosslinked Hydrogel Blend Surface Coatings」、およびこれらの刊行物に引用される参考文献いずれかを参照されたい。

0065

[0081]1つの態様において、固体支持体の表面には、ヒドロゲルが含まれる。ヒドロゲルは、例えば、ポリマーマトリックスを含んでもよい。ヒドロゲルを固体支持体表面に化学的に付着させてもよく、そしてヒドロゲルには、直接または間接的にのいずれかで、ヒドロゲルにプローブを付着させることが可能な結合官能性が含まれてもよい。典型的な結合官能性には、疎水性基親水性基、反応基、例えばアルデヒド基、エポキシ基炭酸基等、カルボキシル基チオール基スルホン酸基硫酸基、アミノ基、置換アミノ基、リン酸基、金属キレート基チオエーテル基、ビオチン基、ボロン酸基等が含まれる。

0066

[0082]遺伝子発現またはSNP分析に適した任意の表面を用いてもよく、これには、支持体および表面として、または他の構成要素をさらに含む製品の構成要素としてのいずれかで、例えばAffymetrix、General Electric(例えばCodeLink)、Agilent、およびSchott Nexterionによって提供される支持体および表面が含まれる。

0067

[0083]開示する方法にしたがった、続くインキュベーションおよびプロセシング工程、例えば、表面を洗浄して非特異的複合体を除去する工程などの間に、プローブが未結合にならない限り、いかなる適切な方式で、固体支持体表面にプローブを結合させてもよい。固体支持体表面に非共有連結させる、例えば接着させるか、吸収させるか、吸着させることによって、または共有連結させることによって、プローブを結合させてもよい。固体支持体へのプローブの共有連結の場合、固体支持体表面は、プローブに連結される官能基を含有するであろう。用いる官能基(単数または複数)の性質は、プローブの性質に応じる。表面に分子を共有結合させるための多様な方法が報告されている。典型的には、分子上の活性官能基と表面上の活性化官能基との反応によって、これらの反応を行う。例えばN−ヒドロキシスクシンイミド誘導体などのカルボン酸活性化エステルを形成することによって、アミン含有化合物をカルボン酸含有表面に付着させてもよい。アミンは、この活性化されたエステルと容易に反応して、安定なアミド結合を形成する。この反応は、所望のアミンとの反応が、系の中の他の求核試薬との反応より有意により速い条件下で、有用である。

0068

[0084]当該技術分野に先に記載されている方法の例には、臭化シアン、N−ヒドロキシスクシンイミドエステルカルボニルジイミダゾールカルボジイミド、アズラ
トン(azlactones)、塩化シアヌル有機塩化スルホニルスルホン酸ジビニルニトロフェニルエステル、ヨードアセチル、マレイミド、エポキシヒドラジド還元的アミノ化、ジアゾニウム塩、およびマンニッヒ縮合での表面の活性化が含まれる。活性化表面と反応する分子には、アミン、アルコール、カルボン酸、チオール、カルボニル、および活性水素を含有する化合物が含まれる。

0069

[0085]1つの態様において、プローブをあらかじめ決定された空間配置またはパターンで、固体支持体表面に結合させ、これは特定の位置のプローブの同一性が知られる表面上の任意の配置を意味する。1つの態様において、あらかじめ決定された配置は、アレイである。アレイには、一般的に、その領域と会合する特定のプローブを所持するアドレス可能な領域の一次元、二次元、または三次元いずれの配置も含まれる。アレイ上の特定のあらかじめ決定された位置またはアドレスのアレイの領域または特徴またはスポットが、特定のアプタマー共有複合体上のタグと特異的に会合するため、こうしたアプタマー共有複合体、そしてしたがって特定のターゲット分子を検出するように、異なるプローブの多数の領域を有する点で、アレイはアドレス可能である。

0070

[0086]固体支持体表面上のアレイの組み立ては、個々の固体支持体表面に沿って配置され、そしてアレイ間領域によって分離される1以上のアレイを指す。通常、アレイを含む表面の反対側の固体支持体表面(反対表面)は、いかなるアレイも所持しない。任意のタイプの試験試料に対して試験するために、アレイを設計することも可能である。固体支持体表面は、少なくとも1つ、2つ、4つ、20、100、または少なくとも500のアレイを所持してもよい。意図する使用に応じて、アレイのいずれかまたはすべてが、互いに同じであってもまたは異なってもよく、そして各々、プローブが配置された多数のスポットまたは特徴を含有してもよい。典型的なアレイは、約20cm2未満またはさらに約10cm2未満の領域中に、10より多く、100より多く、1000より多く、または1万より多く、またはさらに10万より多い特徴を含有してもよい。例えば、特徴は、約10μm〜約1.0cmの範囲の幅(すなわち、丸い点に関しては直径)を有してもよい。他の態様において、各特徴は、約1.0μm〜約1.0mm、または約5.0μm〜約500μm、または約10μm〜約200μmの幅を有してもよい。丸くない特徴は、前述の幅(直径)範囲の円形の特徴のものと同等の面積範囲を有しうる。

0071

[0087]固体支持体上のアレイの多様な配置のいずれを用いてもよい。上述のように、個々の固体支持体は、単一のアレイまたは多数のアレイを含有してもよい。アレイの特徴を直線の行および列に配置してもよい。これは、固体支持体上の単一アレイには特に魅力的である。多数のアレイが存在する場合、こうしたアレイを、例えば、固体支持体表面に渡る、一連の曲線の列(例えば、スポットの一連の同心円または半円)等に、配置してもよい。同様に、特徴のパターンが、例えば、固体支持体表面に渡る、一連の曲線の列(例えば、スポットの一連の同心円または半円)等を含むように、直線の行および列から変形させてもよい。製造、取り扱い、および使用考慮にしたがって、アレイおよびその特徴の配置を選択してもよい。

0072

[0088]アレイ内の各特徴、または要素は、固体支持体表面の小さく規則的に成形された領域に明示される。特徴をあらかじめ決定された方式で配置する。アレイの各特徴は、通常、あらかじめ決定されたプローブまたはプローブ混合物を所持する。分子アレイ内の各特徴は、異なるプローブを含有してもよく、そして所定の特徴内のプローブは、アレイの残りの特徴内のプローブと異なってもよい。特徴のいくつかまたはすべては、異なる組成であってもよい。各アレイは、多数のスポットまたは特徴を含有してもよく、そして各アレイは、空間または領域によって、別のアレイから分離されていてもよい。アレイを互いに分離するいかなる空間も必要ではないこともまた認識されるであろう。アレイ間領域および特徴間領域は、通常存在するが、必須ではない。いかなる境界領域とも同様に
、これらのアレイ間および特徴間領域は、いかなるプローブも所持しない。アレイ間領域および特徴間領域は、存在する場合、多様なサイズおよび設定であってもよいことが認識されるであろう。

0073

[0089]いくつかの態様において、例えばビーズなどの第一の固体支持体にプローブを付着させ、そして次いで、第一の固体支持体を、例えばマイクロタイタープレートなどの第二の固体支持体上でアレイ形式に配置することによって、アレイを形成してもよい。他の態様において、アドレス可能なビーズにプローブを付着させることによって、アレイを形成してもよい。「アドレス可能ビーズ」には、色素、バーコード、およびトランスポンダーが含まれる。

0074

[0090]いくつかの態様において、固体支持体の選択した表面に応じて、固体支持体表面への分子の非特異的結合を減少させるかまたは阻害するため、表面を「ブロッキング」するかまたは「不動態化」してもよい。ブロッキング試薬または不動態化試薬には、粉乳カゼインプールした血清、プールした血漿、BSA、PEG−PLL、PEG−シラン、SuperBlockまたはStarterBlock(Pierce Biotechnology、イリノイロックフォード)、および前述の任意のものの任意の組み合わせが含まれる。

0075

[0091]本明細書において、用語「標識剤」は、アプタマー共有複合体中の、アプタマーに結合したターゲット分子を検出するのに使用可能な、1以上の試薬を指す。

0076

[0092]ターゲット分子を検出するための1つの態様において、アプタマーに結合したターゲット分子に特異的な結合パートナーを含む標識剤と、アプタマー共有複合体を接触させる。特異的結合パートナーは、抗体、抗体断片合成抗体模倣体生物模倣体、アプタマー、分子インプリンティング・リガンド等を含む、任意の適切な部分であってもよい。特異的結合パートナーを、別の標識剤構成要素、通常、検出可能部分または標識にコンジュゲート化するかまたは連結する。プローブを固体支持体表面に連結させるための任意の前述の方法によって、標識への特異的結合パートナーの連結を行ってもよい。多数のターゲット分子を検出する場合、多数のアプタマー共有複合体を、存在すると推測されるターゲット分子に各々特異的な特異的結合パートナーの混合物と接触させてもよいことが認識されるであろう。使用する標識は、多数のターゲット分子の多重化検出のため、当該技術分野に知られるものであってもよい。

0077

[0093]検出可能部分または標識は、直接または間接的に検出可能である。一般的に、検出可能な任意のレポーター分子が標識であってもよい。標識には、例えば、(i)シグナルを生じることによって直接検出可能なレポーター分子、(ii)レポーター分子を含有する同族体(cognate)に、続いて結合することによって、間接的に検出可能な特異的結合対メンバー、(iii)質量分析によって検出可能な質量タグ、(iv)増幅または連結のテンプレートを提供可能なオリゴヌクレオチド・プライマー、および(v)例えばリプレッサータンパク質などのリガンドとして作用可能な特異的ポリヌクレオチド配列または認識配列が含まれ、ここで、後者の2つの例では、オリゴヌクレオチド・プライマーまたはリプレッサータンパク質は、レポーター分子などを有するか、または有しうるであろう。レポーター分子は、触媒、例えば酵素、触媒をコードするポリヌクレオチド、プロモーター、色素、蛍光分子量子ドット化学発光分子補酵素酵素基質放射性基、小有機分子、増幅可能ポリヌクレオチド配列、ラテックスまたは炭素粒子などの粒子、金属ゾル晶子リポソーム、細胞等であってもよく、これらは色素、触媒または他の検出可能基、質量分析目的のために分子にコンジュゲート化される、分子の重量を改変する質量タグ等でさらに標識されていてもまたはいなくてもよい。標識は、電磁または電気化学物質から選択可能である。1つの態様において、検出可能標識は蛍光色素であ
る。本明細書の開示に基づいて、他の標識および標識スキームが、当業者には明らかであろう。

0078

[0094]ターゲット分子を検出するための別の態様において、ターゲット分子はタンパク質であり、そして普遍的タンパク質染色剤を含む標識剤と、アプタマー共有複合体を接触させる。本明細書において、「普遍的タンパク質染色剤」および「UPS」は、交換可能に用いられ、試験試料中に存在するタンパク質の全部でないとしてもほとんどを、検出可能部分で標識するが、核酸、または固体支持体などのアッセイの他の構成要素を標識しないかまたは最小限にしか標識しない傾向がある、いかなる標識剤も指す。タンパク質上に見られるが、核酸または支持体表面上に見られない、いかなる反応性化学基も、共有付着部位として働きうる。典型的な反応性化学基には、一次アミン(例えばリジン残基上)、チオール(例えばシステイン上、ジスルフィド連結還元によって生じうる)、アルコール(例えばセリンスレオニンチロシン、および糖タンパク質上の糖部分上(こうした糖の上のシス−ジオール酸化産物を含む))、およびカルボキシレート(例えばグルタミン酸およびアスパラギン酸上)が含まれる。

0079

[0095]検出可能部分には、上に列挙するいかなるレポーター分子も、そして任意の方式で、検出可能シグナルを生じるのにも使用可能な他のいかなる化学薬品または構成要素も含まれうる。蛍光シグナル化学発光シグナル、または部分の同一性に応じた、任意の他の検出可能シグナルを介して、検出可能部分を検出してもよい。検出可能部分が酵素(例えばアルカリホスファターゼ)である場合、酵素基質および酵素活性に必要な任意のさらなる因子の存在下で、シグナルを生じさせてもよい。検出可能部分が酵素基質である場合、酵素および酵素活性に必要な任意のさらなる因子の存在下で、シグナルを生じさせてもよい。ターゲットタンパク質に検出可能部分を付着させるのに適した試薬設定には、ターゲットタンパク質への検出可能部分の共有結合、ターゲットタンパク質に共有結合した別の標識剤構成要素と検出可能部分の非共有結合、およびターゲットタンパク質と非共有結合した標識剤構成要素への検出可能部分の共有結合が含まれる。普遍的タンパク質染色剤は、米国特許出願第10/504,696号、2004年8月12日出願、表題「Methodsand Reagents for Detecting Target Binding by Nucleic Acid Ligands」に詳細に記載される。

0080

[0096]いくつかの態様において、UPSは、検出可能部分を含み、そしてタンパク質に特徴的であるが、アプタマーにはない官能基と共有的に反応し、そしてこうして反応する際、検出可能部分をターゲットタンパク質に共有結合させる、単一の化学的試薬である。この態様にしたがったUPSには、タンパク質にユニークな官能基と共有的に反応可能な基を持つ色素が含まれる。誘導体化によって、こうした基を色素に付加させてもよいし、またはこうした基が非修飾色素上に存在してもよい。1つの態様において、UPSは、NHS−Alexa蛍光体(例えばNHS−Alexa647など)を含む、N−ヒドロキシスクシンイミド活性化蛍光体などの、アミン基と反応するN−ヒドロキシスクシンイミド活性化色素を含む。使用可能な別のUPSは、CBQCA(3−(4−カルボキシベンゾイル)キノリン−2−カルボクスアルデヒド)であり、これもまた、シアン化物またはチオールの存在下でアミンと反応して、非常に蛍光が高いイソインドールを形成する。UPS試薬で使用するのに適した他のアミン反応基には、イソシアネートイソチオシアネートアシルアジド、塩化スルホニル、アルデヒド、4−スルホ−2,3,5,6−テトラフルオロフェノール(STP)エステル、TFP−Alexa647、ならびにNBD(7−ニトロベンズ−2−オキサ−1,3−ジアゾール)クロリド、NBDフルオリド、およびジクロロトリアジンなどのアリール化剤が含まれる。

0081

[0097]他の態様において、UPSは、複数の試薬を含む。例えば、UPSは、タ
ゲットタンパク質と共有的に反応する第一の試薬、および第一の試薬によって導入された化学基または他の官能性を介して、ターゲットタンパク質に、直接または間接的にのいずれかで、そして共有的にまたは非共有的にのいずれかで、検出可能部分を付着させる、1以上のさらなる試薬を含んでもよい。UPSが多数の試薬を含むならば、いくつかの場合、試薬が連続して添加され、そして他の場合、同時に添加されてもよいことが認識されるであろう。

0082

[0098]1つの態様において、適切なUPSは、(a)ターゲットタンパク質と反応するビオチン誘導体;および(b)例えば、蛍光ストレプトアビジン誘導体またはストレプトアビジン−酵素コンジュゲートなどの、ストレプトアビジン−検出可能部分コンジュゲートを含む。ビオチン誘導体は、アミン基と反応し、それによって、ターゲットタンパク質にビオチンを共有結合させ;ストレプトアビジン−検出可能部分コンジュゲートが、固定されたビオチン基に結合し、それによって、ターゲットタンパク質が結合している固体支持体上の部位(単数または複数)の検出可能部分を位置決定する。この態様において、適切な試薬には、PFP−ビオチン、NHS−PEO4−ビオチン(スペーサーアーム29Å)、スルホ−NHS−LC−ビオチン(スペーサーアーム22.4Å)、およびTFP−PEO3−ビオチン(スペーサーアーム32.6Å)が含まれる。

0083

[0099]別の態様において、適切なUPSは:(a)結合したターゲットタンパク質にビオチンまたはビオチン誘導体を共有結合させることが可能な反応基にコンジュゲート化された、ビオチンまたはビオチン誘導体;(b)アビジンおよび/またはストレプトアビジン;ならびに(c)ビオチン−検出可能部分コンジュゲート、例えば蛍光ビオチン誘導体を含む。上記(a)のビオチン誘導体は、例えば、NHS−ビオチンなどのアミン反応性ビオチン誘導体であってもよく、ビオチンは、場合によってスペーサーアーム(Calbiochem, Inc.)によって、NHSから分離されていてもよい。結合したターゲットタンパク質上の一次アミンとNHS基の反応は、対応するアプタマーに結合したターゲットタンパク質へのビオチンの共有結合を導く。次いで、対応するアプタマーと複合体形成したターゲットタンパク質をストレプトアビジンまたはアビジンで処理してもよい。ストレプトアビジンおよびアビジンは、各々、4つのビオチンに結合可能であるため、これらのタンパク質の付加は、NHS−ビオチンによって、結合したターゲットタンパク質に元来カップリングしていた各ビオチンに関して、3つのビオチン結合部位を提供する。次いで、上記(c)のビオチン検出部分誘導体を付加してもよく、この際、この部分が、ストレプトアビジンまたはアビジン上の占有されていないビオチン結合部位に緊密に結合する。この態様において、適切な試薬には、PFP−ビオチン、NHS−PEO4−ビオチン(スペーサーアーム29Å)、スルホ−NHS−LC−ビオチン(スペーサーアーム22.4Å)、およびTFP−PEO3−ビオチン(スペーサーアーム32.6Å)が含まれる。

0084

[00100]標識剤の性質、ターゲット分子の性質およびそのあらかじめ決定されたカットオフレベル、特定のターゲットレベルの生物学的重要性等などの考慮が、使用可能な特定の試薬の個々の濃度を含めた、標識剤の濃度を、通常、決定する。各試薬の最終濃度は、通常、方法の感度を最適にするように、経験的に決定されるであろう。1つの態様において、標識剤の濃度は、通常、ターゲット分子の少なくとも約1%を検出するのに十分である。別の態様において、標識剤の濃度は、通常、ターゲット分子の少なくとも約10%を検出するのに十分である。さらなる態様において、標識剤の濃度は、通常、ターゲット分子の少なくとも約90%を検出するのに十分である。

0085

[00101]標識剤の活性化は、用いる試薬の性質に応じる。例えば、光で活性化される試薬に関しては、試薬を適切な波長の光で照射する。本明細書の開示を考慮すると、当業者には、他の活性化法が示唆されるであろう。放射性標識、酵素等を伴う標識剤など
の、いくつかの標識剤に関しては、活性化剤はまったく必要ではない。酵素系に関しては、基質および/または補因子の添加が必要でありうる。

0086

[00102]標識剤によって生じるシグナルの存在および/または量に関する固体支持体の検査には、一般的には単にシグナルを読み取る工程である、シグナルの検出が含まれる。シグナルは通常、装置を用いて読み取られ、装置の性質は、シグナルの性質に応じる。装置は、分光光度計蛍光計吸収分光計発光計、化学発光計、感光計写真装置等であってもよい。検出するシグナルの存在および/または量を、あらかじめ決定されたカットオフレベルを超える、試験試料中に存在する任意のターゲット分子の存在および量に関連させる。測定中の温度は、一般的に、約10℃〜約70℃、または約20℃〜約45℃、または約20℃〜約25℃の範囲であってもよい。1つのアプローチにおいて、試験するターゲット分子の既知の濃度を用いて、標準曲線を形成する。標準物質および他の対照もまた用いてもよい。

0087

[00103]1つの態様において、例えばアレイを含む固体支持体を、検査デバイスに移動させ、ここでいかなる結合したターゲット分子の存在に関しても、固体支持体表面を調べる。検査デバイスは、光学系を伴うスキャニングデバイスであってもよい。例えば、アレイに照射し、そしてアレイの各特徴での生じたシグナル(例えば蛍光)の位置および強度を読み取ることによって、アレイを調べるかまたは読み取ってもよい。スキャナは、例えばTecan Systems、カリフォルニア州サンノゼから入手可能なTECAN LS 300スキャナに類似であってもよい。しかし、他の光学技術(例えば化学発光または電子発光標識の検出)および電気技術を含む、アレイの他の検査法を用い、前述のもの以外の方法または装置を用いることによって、アレイを調べるかまたは読み取ってもよい。

0088

[00104]アレイの検査から生じる結果は、生の結果(1以上の色チャネルにおける各特徴に関する蛍光強度読取り値など)であってもよいし、または特徴に関しての、あらかじめ決定された閾値より低い読取り値を拒絶し、そして/またはアレイから読み取ったパターンに基づいて結論を形成する(特定のターゲット分子が試験試料中に存在していたかどうかなど)ことによって得た結果などのプロセシングした結果であってもよい。所望の場合、検査結果(プロセシングしたかまたはしていない)を(コミュニケーションによるなどで)離れた場所に送り、そしてさらなる使用(例えばさらなるプロセシング)のためにそこで受け取ってもよい。

0089

[00105]別の態様において、コンピュータの制御下で、すなわちコンピュータの補助で方法を行う。例えば、IBM(登録商標)互換パーソナルコンピュータを利用してもよい。コンピュータを、本明細書記載の方法に特異的なソフトウェアによって駆動する。本明細書に開示する方法の実行を補助することが可能なコンピュータハードウェアには、以下の仕様を有するシステムが含まれてもよい:例えば、Microsoft Windows(登録商標)95またはMicrosoft WindowsNT(登録商標)4.0オペレーティングシステム(またはその後継)のいずれかの元で作動する、少なくとも100MHzのクロック速度、少なくとも32メガバイトランダムアクセスメモリ(RAM)、および少なくとも80メガバイトの仮想メモリを持つ、Pentium(登録商標)プロセッサまたはそれより優れているもの。

0090

[00106]方法を実行するのに使用可能なソフトウェアは、例えば、使用者が書いた関数およびテンプレートを介して適切に拡張され、そして必要な場合、望ましい可能性もある独立型プログラムリンクされた、Microsoft ExcelまたはMicrosoft Access(登録商標)であってもよい。本方法を行うのを補助する際に用いるソフトウェアまたはコンピュータプログラムの例は、VisualBASIC
(登録商標)、FORTRAN、C、C++、Java(登録商標)、Python、あるいは現在または未来利用可能な他の任意の適切なプログラミング言語で書かれていてもよい。上記コンピュータ情報および本明細書で用いるソフトウェアは、例示のみであり、そして限定的であることを意図しないことを理解しなければならない。本明細書に開示する方法のいずれも、他のコンピュータ、コンピュータシステム、およびソフトウェアに適応可能である。使用可能な他の言語には、例えば、PASCAL、PERLまたはアセンブリ言語が含まれる。

0091

[00107]別の態様において、質量分析を用いて、アプタマー・アフィニティー複合体(または場合によってアプタマー共有複合体)を検出し、そして/または定量化する。図1Bを参照すると、試験試料中に存在しうるターゲット分子の検出および/または定量化のための典型的な例において、タグを含み、そしてターゲット分子に対する特異的アフィニティーを有するアプタマーと、試験試料を接触させる。ターゲット分子に結合したアプタマーを含むアプタマー・アフィニティー複合体形成を可能にする。試験試料がターゲット分子を含有する場合、一般的に、試験試料中で、アプタマー・アフィニティー複合体が形成されるであろう。使用しているアプタマーに適した方法を用いて、場合によって、アプタマー・アフィニティー複合体を、ターゲット分子に共有結合したアプタマーを含むアプタマー共有複合体に変換する。アプタマー・アフィニティー複合体(または場合によってアプタマー共有複合体)を固体支持体に付着させる。アプタマー・アフィニティー複合体(または場合によってアプタマー共有複合体)と固体支持体を接触させ、そしてアプタマー上に含まれるタグが、固体支持体に付着したプローブと、直接または間接的にのいずれかで会合するのを可能にすることによって、付着を達成する。次いで、固体支持体上のプローブと会合したアプタマー・アフィニティー複合体(または場合によってアプタマー共有複合体)を、質量分析を用いた検出(および場合によって定量化)のために調製する。

0092

[00108]多様な方法のいずれを用いて、質量分析による検出および場合による定量化のため、アプタマー・アフィニティー複合体(または場合によってアプタマー共有複合体)を調製してもよい。例えば、1つの態様において、ターゲット分子がタンパク質である場合、固体支持体から複合体を除去する前または後のいずれかに、プロテアーゼ消化することによって、アプタマー・アフィニティー複合体(または場合によってアプタマー共有複合体)を調製する。別の態様において、アプタマー・アフィニティー複合体(または場合によってアプタマー共有複合体)を固体支持体から放出させ、そして次いで、マトリックス支援レーザー脱離イオン化(MALDI)、表面増強レーザー脱離イオン化(SELDI)、エレクトロスプレー・イオン化、または電子衝撃イオン化を含む、当該技術分野に知られるいくつかの方法の任意のものを用いた、質量分析用に調製する。1つの態様において、アプタマー・アフィニティー複合体(または場合によってアプタマー共有複合体)を、エレクトロスプレー・イオン化質量分析計内に直接溶出させてもよい。他の態様において、溶出させた試験試料を、質量分析前に、例えば酵素消化または化学的修飾などのさらなるプロセシングに供してもよい。例えばエレクトロスプレー・イオン化、マトリックス支援レーザー脱離イオン化、または電子衝撃イオン化によって、マススペクトルを得てもよい。

0093

[00109]典型的には、質量分析によるターゲット分子の定量化は、内部標準、すなわち分析しようとする試験試料内に導入される既知の濃度の化合物を必要とする。理想的な内部標準は、ターゲット分子のものと類似の溶出およびイオン化特性を有するであろうが、異なる質量対電荷比イオンを生じるであろう。一般的な内部標準は、ターゲット分子の安定な同位体標識型である。1つの態様において、ターゲット分子の安定な同位体標識型を、内部標準として、試験試料に添加する。次いで、試験試料中の多様な構成要素に対応するスペクトルピークを、内部標準のピークの高さまたは面積と比較して、そして
それによって、ターゲット分子の定量化を可能にする。

0094

[00110]別の態様において、ターゲット分子の既知の濃度を含む試料セットから生じたスペクトルピークと、ターゲット分子に対応するスペクトルピークのピークの高さまたは面積を比較することによって、ターゲット分子の定量化を達成する。ターゲット分子の既知の濃度を有する試料から得た、スペクトルピークのピークの高さまたは面積は、標準曲線を構成し、ここから、試験試料中のターゲット分子の未知の濃度を計算可能である。

0095

[00111]別の態様において、Q−PCRを用いて、アプタマー・アフィニティー複合体(または場合によってアプタマー共有複合体)を検出し、そして/または定量化する。本明細書において、「Q−PCR」は、アッセイの結果が定量的である、すなわち、アッセイが、試験試料中に存在するアプタマーの量または濃度を定量化可能であるような方式で、そしてそのように調節された条件下で行う、PCR反応を指す。図1Bを参照すると、試験試料中に存在しうるターゲット分子の検出および/または定量化のための典型的な方法において、タグを含んでもよく、そしてターゲット分子に対する特異的アフィニティーを有するアプタマーと、試験試料を接触させる。ターゲット分子に結合したアプタマーを含むアプタマー・アフィニティー複合体形成を可能にする。試験試料がターゲット分子を含有する場合、一般的に、試験試料中で、アプタマー・アフィニティー複合体が形成されるであろう。使用しているアプタマーに適した方法を用いて、場合によって、アプタマー・アフィニティー複合体を、ターゲット分子に共有結合したアプタマーを含むアプタマー共有複合体に変換する。次いで、本明細書にさらに記載するように、次いで、アプタマー・アフィニティー複合体の形成およびアプタマー共有複合体への場合による変換に続いて、試験試料中に存在しうるいかなる未結合アプタマーも、アプタマー・アフィニティー複合体(または場合によってアプタマー共有複合体)から分配する。次いで、ポリヌクレオチドの定量的複製のために知られる技術を用いて、アプタマー・アフィニティー複合体(または場合によってアプタマー共有複合体)を定量化する。

0096

[00112]1つの態様において、TaqMan(登録商標)PCRを用いて、試験試料中のアプタマー・アフィニティー複合体(または場合によってアプタマー共有複合体)の量または濃度を決定する。この技術は、一般的に、オリゴヌクレオチド複製酵素の5’−3’エキソヌクレアーゼ活性に頼って、ターゲット配列からのシグナルを生じる。定量化しようとするアプタマーの配列に基づいて、TaqManプローブを選択し、そしてこれには、一般的には、例えば6−カルボキシフルオレセインなどの5’端蛍光、および例えば6−カルボキシテトラメチルフルオレセインなどの3’端消光剤が含まれ、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いてアプタマー配列が増幅されるにつれて、シグナルが生じる。ポリメラーゼがアプタマー配列をコピーするにつれ、PCRプライマーより下流にアニーリングするプローブから、エキソヌクレアーゼ活性が蛍光を遊離させ、それによってシグナルを生じる。複製産物が産生されるにつれて、シグナルが増加する。PCR産物の量は、行った複製周期の数ならびにアプタマーの出発濃度の両方に応じる。

0097

[00113]別の態様において、複製プロセス中に挿入蛍光色素を用いて、アプタマー・アフィニティー複合体(または場合によってアプタマー共有複合体)の量または濃度を決定する。例えばSYBR(登録商標)グリーンなどの挿入色素は、一本鎖DNAの存在下で生じる蛍光シグナルに比較した際、二本鎖DNAの存在下で、大きな蛍光シグナルを生じる。PCR中に二本鎖DNA産物が形成されるにつれて、色素によって生じるシグナルは増加する。生じるシグナルの度合いは、PCR周期の数およびアプタマーの出発濃度の両方に依存する。

0098

[00114]別の態様において、複製プロセス中、「分子ビーコン」を用いて、アプ
タマー・アフィニティー複合体(または場合によってアプタマー共有複合体)の量または濃度を決定する(例えば、Tyagiら, Nat. Biotech. 16:49 53, 1998;米国特許第5,925,517号を参照されたい)。分子ビーコンは、フォールディングしてヘアピンループを形成し、そしてヘアピンが形成された際には、蛍光によってほとんどまたはまったくシグナルが生じないように、ヘアピン構造の一端に蛍光を、そしてもう一端に消光剤を含有する、特異的核酸プローブである。ループ配列は、ターゲットポリヌクレオチド配列に特異的であり、そしてアプタマー配列にハイブリダイズした際、ヘアピンがアンフォールディングし、そしてそれによって蛍光シグナルが生じる。

0099

[00115]コンピュータプログラムを利用して、本明細書に開示する方法のいずれかの1以上の工程を行ってもよい。本発明の別の側面は、コンピュータプログラムが記憶された、コンピュータ読取り能記媒体を含むコンピュータプログラム製品であり、これをコンピュータに読み込むと、このプログラムが、本明細書開示の任意の方法の実行を行うかまたは補助する。

0100

[00116]本発明の1つの側面は、本明細書に開示する方法のいずれかの産物、すなわちアッセイ結果であり、これを試験場所で評価してもよいし、または望ましい場合、評価およびコミュニケーションのために、離れた場所の興味を持つ団体に送ってもよい。本明細書において、「離れた場所」は、結果を得た場所と物理的に異なる場所を指す。したがって、結果を、異なる部屋、異なる建物の異なる場所、異なる町等に送ってもよい。例えばファクシミリ郵便、翌日配達便、e−メール、ftp、ボイスメール等などの標準的手段によって、データを送ってもよい。

0101

[00117]情報の「コミュニケーション」は、適切なコミュニケーションチャネル(例えば民間または公的ネットワーク)を通した、電子シグナルとしての、その情報を表すデータの伝達を指す。項目を「送る」は、その項目の物理的輸送であれ、または別の方式であれ(可能な場合)、その項目を1つの場所から次の場所に移動させる任意の手段を指し、そしてこれには、少なくともデータの場合、データを所持するかまたはデータを通信する媒体を物理的に輸送することが含まれる。

0102

[00118]図3を参照すると、試験試料に存在しうる1以上のターゲット分子の検出および/または定量化のための別の典型的な方法において、ターゲット分子および少なくとも1つの非ターゲット分子を含みうる試験試料を、場合によって競合剤分子(図3オプションAと示す)と接触させてもよい。1以上の非特異的複合体が形成されうる。次いで、タグを含み、そしてターゲット分子に対する特異的アフィニティーを有するアプタマーと、試験試料を接触させる。ターゲット分子に結合したアプタマーを含むアプタマー・アフィニティー複合体形成を可能にする。試験試料がターゲット分子を含有する場合、一般的に、試験試料中で、アプタマー・アフィニティー複合体が形成されるであろう。試験試料の性質に応じて、アプタマーおよび1以上の非ターゲット分子間で、1以上の非特異的複合体もまた形成されうる。試験試料を競合剤分子と接触させた場合、競合剤を含む多様な非特異的複合体もまた形成され、そして試験試料中に存在しうる。

0103

[00119]次いで、場合によって、試験試料の構成要素に動力学的に負荷を与える(challenge)条件に試験試料を曝露してもよい(図3にオプションBとして示す)。以下にさらに記載するように、動力学的負荷は、試験試料の希釈、試験試料への競合剤分子の導入、あるいは固体支持体上のアプタマー・アフィニティー複合体の捕捉、その後の、洗浄溶液中に競合剤分子が存在するかまたは存在しないかいずれかの洗浄を含んでもよい。動力学的負荷を導入した場合、アプタマーおよびいかなる非ターゲット分子の間の非特異的複合体も、解離後、再形成される可能性は低い。非特異的複合体は、一般的
に、アプタマー・アフィニティー複合体よりも迅速に解離するため、動力学的負荷は、アプタマーが、非ターゲットとの非特異的複合体中に含まれる可能性を減少させる。有効な動力学的負荷は、最初のアプタマー結合事象およびそれに続く共有相互作用のものを超えて、さらなる特異性を持つアッセイを提供しうる。

0104

[00120]動力学的負荷を使用するかどうかに関わらず、次いで、使用中のアプタマーに適した方法を用いて、形成されたアプタマー・アフィニティー複合体を、ターゲット分子に共有結合したアプタマーを含むアプタマー共有複合体に変換する。アプタマー共有複合体形成後、場合によって、試験試料中に存在しうるいかなる未結合のまたは複合体形成していないアプタマーも試験試料から分配してもよい(図3にオプションCとして示す)。場合によって、試験試料中に存在しうるいかなる未結合のまたは複合体形成していない非ターゲットおよびターゲット分子も試験試料から分配してもよい(図3にオプションDとして示す)。場合によって、未結合アプタマー、ならびに未結合非ターゲットおよびターゲット分子を、アプタマー共有複合体形成後、どちらかの順序で、除去してもよい。

0105

[00121]動力学的負荷を導入するために希釈を用いる場合、アプタマー共有複合体を含有する、続く試験試料を、好ましくは濃縮する。適用可能である場合、場合によって試験試料からいかなる未結合のアプタマーも分配し、そして/または場合によって標識剤と反応しうる試験試料の他の構成要素を除去する工程に関して以下に記載する方法を用いて、この濃縮を達成してもよい。

0106

[00122]次いで、本明細書記載の任意の方法または一般の当業者に知られる他の適切な任意の方法を用いて、試験試料中のアプタマー共有複合体を検出し、そして/または定量化する。例えば、試験試料と固体支持体を接触させ、そしてアプタマー上のタグが、固体支持体表面上に固定されたプローブと、直接または間接的にのいずれかで会合するのを可能にすることによって、アプタマー共有複合体を固体支持体表面に付着させてもよい。次いで、固体支持体上のプローブと会合したアプタマー共有複合体を検出し、そして場合によって定量化する。検出および場合による定量化に先立つ任意の時点で、すなわち、固体支持体へのアプタマー共有複合体の付着前または付着後のいずれかいつでも、アプタマー共有複合体を標識剤と接触させて、結合したターゲット分子の検出を可能にする。当業者が認識するであろうように、質量分析、Q−PCR、または当該技術分野に知られる他の任意の適切な方法を用いて、アプタマー共有複合体を検出し、そして/または定量化してもよい。

0107

[00123]本明細書において、「競合剤分子」および「競合剤」は、交換可能に用いられ、非特異的複合体と非ターゲット分子を形成可能ないかなる分子も指す。(単数の)「競合剤分子」または「競合剤」は、分子の1つのタイプまたは種類のコピーのセットである。「(複数の)競合剤分子」または「(複数の)競合剤」は、分子のこうしたセットの1より多くを指す。競合剤分子には、オリゴヌクレオチド、ポリアニオン(例えば、ヘパリン、一本鎖サケ精子DNA、およびポリデキストラン(例えば硫酸デキストラン))、無塩基性ホスホジエステルポリマー、dNTP、およびピロリン酸が含まれる。競合剤を用いる動力学的負荷の場合、競合剤はまた、アプタマーと非特異的複合体を形成しうる任意の分子であってもよい。こうした競合剤分子には、ポリカチオン(例えば、スペルミンスペルミジンポリリジン、およびポリアルギニン)およびアミノ酸(例えばアルギニンおよびリジン)が含まれる。

0108

[00124]本明細書において、「非特異的複合体」は、アプタマーおよびそのターゲット分子以外の2以上の分子間の非共有会合を指す。非特異的複合体は、その構成要素分子間のアフィニティー相互作用に基づいては選択されないが、分子のクラス間の相互作
用に相当するため、非特異的複合体に関与する分子は、平均して、互いに対して、はるかにより低いアフィニティーを示し、そしてしたがって、アプタマーおよびそのターゲット分子よりも、対応して高い解離速度を有するであろう。非特異的複合体には、アプタマーおよび非ターゲット分子間、競合剤および非ターゲット分子間、競合剤およびターゲット分子間、ならびにターゲット分子および非ターゲット分子間に形成される複合体が含まれる。

0109

[00125]本明細書において、用語「動力学的に負荷を与える」および「動力学的負荷」は、動力学的圧を適用し、そして解離速度を含む、複合体のこうしたクラスの構成要素の異なるアフィニティー特性を利用することによって、アプタマー・アフィニティー複合体および非特異的複合体を含む複合体セットから、アプタマー・アフィニティー複合体を濃縮するプロセスを指す。アプタマー−非ターゲット複合体は、典型的には、アプタマー−ターゲット複合体に比較して減少するため、動力学的負荷は、一般的に、特異性の増加を生じる。本明細書において、用語「動力学的圧」は、複合体が自然に解離する機会を提供し、そして/または複合体から天然に解離する分子の再結合を阻害するための手段を指す。競合剤分子の添加によって、または試料の希釈によって、または複合体が固体支持体に結合している場合は徹底的な洗浄によって、または当業者に知られる他の任意の手段によって、動力学的圧を適用してもよい。一般の当業者が認識するであろうように、動力学的負荷は、一般的に、アプタマー・アフィニティー複合体およびアプタマー−非ターゲット複合体の異なる解離速度に応じるため、実質的にアプタマー−非ターゲット複合体の数を減少させつつ、アプタマー・アフィニティー複合体の高い比率を維持するように、動力学的負荷の期間を選択する。動力学的負荷が有効になるために、アプタマー・アフィニティー複合体の解離速度は、好ましくは、アプタマー−非ターゲット複合体のものよりも有意に低い。アプタマーが特定の特性を含むように選択可能であるため、比較的低い解離速度を有するように、アプタマー・アフィニティー複合体の構成要素を設計してもよい。

0110

[00126]本明細書において、用語「分配」は、試験試料からの1以上の分子種の分離または除去を指す。分配を用いて、感度を増加させ、そして/またはバックグラウンドを減少させてもよい。分配は、アプタマー・アフィニティー複合体が、共有結合のために不可逆的になる際、アプタマー共有複合体形成後に最も有効である。

0111

[00127]例えば、未結合アプタマーは、固体支持体表面上のプローブへのアプタマー共有複合体の付着中に、アプタマー共有複合体と競合しうるため、試験試料から未結合アプタマーを除去すると、アッセイ感度が増加しうる。検出および場合による定量化にQPCRを用いた際、未結合アプタマーの除去は、ターゲット分子の検出および定量化を促進する。1つの態様において、ターゲット分子はタンパク質であり、そして試験試料において、アプタマー共有複合体などのタンパク質を含む複合体を沈殿させ、そして遊離核酸を沈殿させない試薬を用いることによって、未結合アプタマーをアプタマー共有複合体(および試験試料の残り)から分配する。こうした試薬には、K+/SDS、アセトン、(NH4)2SO4、ProCipitate、および当該技術分野に知られる他の荷電ポリマーが含まれてもよい。

0112

[00128]1つの態様において、ターゲット分子、この場合はターゲットタンパク質に対する特異的アフィニティーを持つ、例えばタグ化光アプタマーなどのアプタマーを、試験試料に導入する。本明細書にさらに記載するように、アプタマー・アフィニティー複合体の形成およびアプタマー共有複合体への変換後、上に列挙する任意の試薬または他の任意の適切な試薬などの適切な試薬を用いて、試験試料からアプタマー−タンパク質共有複合体および複合体形成していないタンパク質を沈殿させる。試験試料の沈殿した構成要素を、遠心分離によってペレットにして、そして未結合アプタマーを含有する上清を廃
棄する。次いで、未結合タンパク質およびアプタマー−タンパク質共有複合体を含有するペレットを、例えばアッセイ結合希釈剤などの適切な溶液中に懸濁し、そして次いで、アプタマー共有複合体を、固体支持体へのアプタマー共有複合体の付着前または後のいずれかで、標識剤と接触させてもよい。次いで、ターゲット分子が試験試料中に存在する場合、アプタマー共有複合体上の標識剤を検出することによって、ターゲット分子を検出し、そして/または定量化する。

0113

[00129]アッセイ・バックグラウンドを減少させるため、標識剤と反応可能であり、そしてアプタマーに共有結合していない分子を、試験試料から除去してもよい。1つの態様において、未結合アプタマーおよび複合体形成したアプタマーの両方を、試験試料から沈殿させ、標識剤と反応しうる他の分子を、廃棄される上清中に残すことによって、これを達成する。セチルトリメチルアンモニウムブロミド(CTAB)、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド(DTAB)、および例えばエタノールなどの有機溶媒を含む試薬で、こうした核酸沈殿を達成してもよい。別の態様において、固体支持体にアプタマーをハイブリダイズさせることによって、試料から未結合アプタマーおよび複合体形成したアプタマーの両方のアプタマーを分配する。この場合の固体支持体には、マイクロビーズ(例えば常磁性ビーズ)、本明細書記載の他の適切な固体支持体のいずれか等が含まれてもよい。アプタマーが適切な固体支持体表面にハイブリダイズするのを可能にした後、標識剤と反応しうる分子を含有する溶液を容易に除去し、アプタマー共有複合体の濃縮を生じる。一般の当業者が認識するであろうように、この方式でのアプタマーの分配は、アプタマー上に含まれるタグ、またはアプタマー上の何らかの他の核酸配列のいずれかを用いて、固体支持体に付着した適切な相補性ヌクレオチド配列にアプタマーをハイブリダイズさせてもよい。

0114

[00130]1つの態様において、ターゲットタンパク質に対する特異的アフィニティーを持つ、タグ化光アプタマーなどのタグ化アプタマーを試験試料に導入する。本明細書にさらに記載するように、アプタマー・アフィニティー複合体の形成およびアプタマー共有複合体への変換後、上に列挙する任意の試薬または他の任意の適切な試薬などの適切な試薬を用いて、試験試料からアプタマー−タンパク質共有複合体および未結合アプタマーを沈殿させる。試験試料の沈殿した構成要素を、遠心分離によってペレットにして、そして複合体形成していないターゲットおよび試験試料の残りを含有する上清を廃棄する。次いで、未結合アプタマーおよびアプタマー共有複合体を含有するペレットを、例えばアッセイ結合希釈剤などの適切な溶液中に懸濁し、そして次いで、アプタマー共有複合体および未結合アプタマーを、固体支持体へのアプタマー共有複合体の付着前または後のいずれかで、標識剤と接触させてもよい。次いで、ターゲット分子が試験試料中に存在する場合、アプタマー共有複合体上の標識剤を検出することによって、ターゲット分子を検出し、そして/または定量化する。

0115

[00131]別の態様において、ターゲットタンパク質に対する特異的アフィニティーを持つ、タグ化光アプタマーなどのタグ化アプタマーを、試験試料に導入する。本明細書にさらに記載するように、アプタマー・アフィニティー複合体の形成およびアプタマー共有複合体への変換後、例えばアプタマータグに相補的なプローブを含有するビーズを用いて、固体支持体上にアプタマー−タンパク質共有複合体および未結合アプタマーを捕捉する。常磁性ビーズの場合、磁力によるか、または非常磁性ビーズでは遠心分離によるかのいずれかで、ビーズをペレットにし、そして複合体形成していないターゲットおよび試験試料を含有する上清を廃棄する。次いで、ペレットを、例えばアッセイ結合希釈剤などの適切な溶液中に懸濁し、そして例えば、熱、高pH、蒸留水、これらの何らかの組み合わせ、または他の任意の既知の方法を含めて、ハイブリダイゼーション相互作用を破壊するための任意の適切な手段を用いて、未結合アプタマーを溶出させる。ビーズを再びペレットにし、そして未結合アプタマーおよびアプタマー共有複合体を含有する上清を、固体
支持体へのアプタマー共有複合体の付着前または後のいずれかで、標識剤と接触させてもよい。次いで、ターゲット分子が試験試料中に存在する場合、アプタマー共有複合体上の標識剤を検出することによって、ターゲット分子を検出し、そして/または定量化する。

0116

[00132]別の態様において、複合体形成していないターゲットおよび試験試料を含有する上清を廃棄した後にビーズを懸濁する工程まで、そしてこの工程を含めて、上に概略するように、アッセイを行う。次いで、未結合アプタマーおよびアプタマー共有複合体をビーズから溶出させる前に、アプタマー共有複合体を標識剤と接触させて、その後、ペレットにする工程および洗浄する工程を反復して、ターゲット分子の検出および/または定量化のためにアプタマー共有複合体と固体支持体を接触させる前に、未反応標識剤を除去してもよい。

0117

[00133]本明細書に開示する任意の方法において、試験試料の2以上の希釈として、試験試料を調製してもよく、これは、ターゲット分子が試験試料中に存在可能であり、そして本明細書に開示する方法による検出に供されうる濃度のダイナミックレンジを増加させうる。個々の希釈試験試料を、アプタマー共有複合体形成工程まで、そしてこの工程を含めて、別個にアッセイし、その後、残りのアッセイのため、希釈試験試料をプールし、そして単一固体支持体上で同時に検出してもよい。1つの態様において、各希釈試験試料には、ユニークなアプタマーが含まれ、それによって、対応するターゲットの単一の測定が可能になる。別の態様において、2以上の希釈にアプタマーを添加して、各々の希釈を、特定のターゲットに対する別個にタグ化されたアプタマーと接触させ、単一の固体支持体上の異なる希釈試料各々に関する特異的アプタマーシグナルの検出を可能にしてもよい。この方式で、希釈試料を一緒つなぎ合わせて、単一のターゲット分子に関するダイナミックレンジを何桁にも渡って拡張することも可能であるし、そして定量化の領域が重複していて、単一のターゲット濃度の多数回の決定につながる場合は、正確さを加えることも可能である。

0118

[00134]1つの態様において、連続希釈として、試験試料セットを調製し、これに、ターゲット分子に対する特異的アフィニティーを持つ、タグ化光アプタマーなどのタグ化アプタマーを導入する。異なるタグを持つ同じアプタマーを、各試験試料希釈に添加してもよい。本明細書にさらに記載するように、アプタマー・アフィニティー複合体の形成およびアプタマー共有複合体への変換後、個々の試験試料をプールし、そして固体支持体へのアプタマー共有複合体の付着前または後のいずれかで、標識剤と接触させてもよい。次いで、ターゲット分子が試験試料中に存在する場合、アプタマー共有複合体上の標識剤を検出することによって、ターゲット分子を検出し、そして/または定量化する。異なるタグを有する各アプタマーに関して検出される生じたシグナルを組み合わせて、元来の試験試料における、ターゲット分子の量または濃度を正確に定量化してもよい。例えば、第一の希釈は、ターゲットに関する最大シグナルを生じ、半定量的情報しか生じない可能性もあるが、第二の希釈は、飽和未満のシグナルを生じ、元来の試験試料におけるターゲットの正確な定量を可能にすることも可能である。

0119

[00135]別の態様において、ターゲット分子に対する特異的アフィニティーを持つ、タグ化光アプタマーなどのタグ化アプタマーを導入する連続希釈として、試験試料セットを調製する。ユニークなタグを有する、異なるアプタマーを、各試料希釈に添加してもよい。本明細書にさらに記載するように、アプタマー・アフィニティー複合体の形成およびアプタマー共有複合体への変換後、個々の試験試料をプールし、そして固体支持体へのアプタマー共有複合体の付着前または後のいずれかで、標識剤と接触させてもよい。次いで、アプタマー共有複合体上の標識剤を検出することによって、試験試料中に存在するターゲット分子を検出し、そして/または定量化する。元来の試料の異なる連続希釈に応じて、何桁にも渡るターゲット範囲に関して、生じたシグナルを定量化することも可能で
ある。

0120

[00136]本明細書に開示する任意の方法において、試験試料を参照試料に比較してもよい。「参照試料」は、本明細書において、複数の分子を含有し、そして少なくとも1つのターゲット分子を含むことが知られる、任意の物質、溶液、または混合物を指す。参照試料に存在する任意のターゲット分子の正確な量または濃度もまた知ることも可能である。用語、参照試料には、本明細書に定義するような、生物学的試料、ならびに、例えば汚染されたかまたは潜在的に汚染されている水および産業廃水などの、環境または毒性試験に使用可能な試料が含まれる。参照試料はまた、準備プロセス、例えば製造プロセスの最終産物、中間産物、または副産物であってもよい。参照試料には、生物から、またはいくつかの他の供給源(例えば環境または産業供給源)から得られた、物質、溶液、または混合物に添加されている、任意の適切なアッセイ培地、緩衝液、または希釈剤が含まれてもよい。

0121

[00137]1つの態様において、標識剤への曝露工程までであるが、この工程を含まずに、同一の方式で、参照試料を試験試料と別個に処理し、ここで、標識剤への曝露工程は、この態様においてのみ、固体支持体にアプタマー共有複合体を付着させる前に起こる必要がある。2つの異なる標識剤を用いて、参照試料中のターゲットレベルを試験試料中のターゲットレベルと区別する。試料を標識剤と接触させた後、これらを等しく混合し、そして固体支持体と同時に接触させてもよい。次いで、各標識剤からのシグナルを別個に測定することによって、参照試料および試験試料間の任意の異なる発現(すなわち試料中のターゲットの異なる量または濃度)の直接比較が可能である。2つの標識剤には、Cy3およびCy5対、ならびにAlexa555およびAlexa647対が含まれてもよい。1つの態様において、参照試料は、対照群に相当するプールした生物学的試料であってもよい。別の態様において、参照試料は、個体から得た、最初に収集した生物学的試料であってもよく、そして試験試料を同じ個体から、しかし二回目に収集して得てもよく、それによって、長期に渡り、個体によって提供される多数の生物学的試料における1以上のターゲット分子の量または濃度のいかなる変化も測定し、そして評価することによって、個体の長期的な研究を容易にしてもよい。

0122

[00138]1つの態様において、ターゲット分子に対する特異的アフィニティーを持つ、タグ化光アプタマーなどのタグ化アプタマーを、参照試料および試験試料の両方に導入する。本明細書にさらに記載するように、アプタマー・アフィニティー複合体の形成およびアプタマー共有複合体への変換後、2つの異なる検出分子を含有する2つの別個の標識剤と、2つの試料を接触させてもよい。次いで、アプタマー共有複合体を含有する2つの別個に標識された試料を、固体支持体に付着させてもよい。次いで、ターゲット分子がいずれかまたは両方の試料中に存在する場合、アプタマー共有複合体上の2つの標識剤を検出することによって、例えば検出標識が蛍光分子である場合、典型的には、異なる励起および発光波長で多数回のスキャンを行うことによって、ターゲット分子を検出し、そして/または定量化する。こうした定量化は、参照試料中の異なるターゲット量または濃度のより正確な評価につながる可能性もあり、そして使用する参照試料が同じである場合、異なる試験試料間での比較を容易にしうる。

0123

[00139]本明細書に開示する任意の方法において、多数の標識剤を用いて、単一の試験試料を分析してもよい。1つの態様において、各々、異なるターゲット分子部分を標識するための別個の化学反応および場合によって異なる検出基を持つ、2以上の標識剤を、単一の試験試料とともに用いてもよい。異なる化学反応は、ターゲット分子上の異なる官能基を標識し、そこから、さらなる情報が得られうるであろう。例えば、ターゲットタンパク質の場合、一次アミン(例えばリジン)と反応する化学反応を用いて、1つの標識をターゲットに付着させてもよく、一方、例えば、典型的にはグリコシル化したタンパ
ク質と会合する炭水化物基と反応する化学反応を通じて、第二の標識をターゲットに付着させる。共通のアプタマーによって認識される、同じターゲット分子上のこれらの2つの部分の相対的定量化は、試験試料内のそのターゲットのグリコシル化の度合いに関する有用な情報を提供しうる。

0124

[00140]1つの態様において、ターゲット分子に対する特異的アフィニティーを持つ、タグ化光アプタマーなどのタグ化アプタマーを試験試料に導入する。本明細書にさらに記載するように、アプタマー・アフィニティー複合体の形成およびアプタマー共有複合体への変換後、アプタマー複合体を固体支持体と接触させる前または後のいずれかで、2つの異なる検出分子を含有する2つの別個の標識剤と、試験試料を接触させてもよい。1つの態様において、検出標識および化学反応はユニークであり、アプタマー共有複合体を含有する同じ試験試料の連続標識が可能である。別の態様において、1つの反応中で同時に化学反応を行ってもよい。次いで、アプタマー共有複合体上の2つの標識剤を検出することによって、例えば検出標識が蛍光分子である場合、典型的には、異なる励起および発光波長で多数回のスキャンを行うことによって、多重標識されたアプタマー共有複合体を検出し、そして/または定量化してもよい。

0125

[00141]別の態様において、2以上の別個の標識剤が同じ検出標識を使用する。アッセイは、アプタマー共有複合体への変換工程まで、そして該工程を含めて、上述のように進行し、その後、試験試料を別個の標識剤が存在するのと同じ数のアリコットに分け、そして試験試料の各アリコットを、固体支持体へのアプタマー共有複合体の付着前または付着後のいずれかに、標識剤と別個に接触させる。アプタマー共有複合体を含有する試験試料の別個に標識されたアリコットを、別個に検出し、そして/または定量化してもよい。

0126

[00142]本明細書記載の任意の方法を用いて、試験試料の多重化分析を行ってもよい。こうした任意の多重化分析には、例えば生物学的試料などの試験試料中の同数のターゲット分子を同時にアッセイするための、少なくとも2つ、少なくとも数十、少なくとも数百または少なくとも数千のアプタマーの使用も含まれてもよい。これらの態様において、各々、ターゲット分子に対する特異的アフィニティーを有する、タグ化光アプタマーなどの複数のタグ化アプタマーを、試験試料に導入する。本明細書にさらに記載するように、アプタマー・アフィニティー複合体の形成およびアプタマー共有複合体への変換後、固体支持体上に固定された複数の対応するプローブを通じて、アプタマー共有複合体を固体支持体に付着させる。固体支持体へのアプタマー共有複合体の付着前または付着後のいずれかに、アプタマー共有複合体と標識剤を接触させてもよい。次いで、アプタマー共有複合体上の標識剤を検出することによって、試験試料中に存在するターゲット分子を検出し、そして/または定量化する。

0127

[00143]本発明の別の側面は、試験試料を分析するために、本明細書に開示する任意の方法を好適に実行するのに有用なキットに関する。本発明の多用途性を増進するため、試薬の比が、方法およびアッセイの実質的な最適化を提供するように、同じまたは別個の容器中、パッケージングされた組み合わせで、試薬を提供してもよい。試薬の交差反応性および安定性に応じて、試薬は各々、別個の容器中にあってもよいし、または多様な試薬が1以上の容器中で組み合わされてもよい。

0128

[00144]キットは、パッケージングされた組み合わせ中、少なくとも1つのタグ化アプタマー、少なくとも1つのプローブを含む固体支持体、および適切な標識剤を含む。キットはまた、試料希釈のための緩衝水性媒体などの洗浄溶液、ならびにアレイ洗浄、試料調製試薬等も含んでもよい。キット中の多様な試薬の相対量を広く変化させて、アッセイ中に起こる必要がある反応を実質的に最適化し、そしてさらにアッセイ感度を実質的
に最適化する、試薬濃度を提供してもよい。適切な状況下で、キット中の1以上の試薬を、賦形剤を含む、通常は凍結乾燥された乾燥粉末として提供してもよく、この粉末は溶解に際して、本発明にしたがった方法またはアッセイを実行するのに適した濃度を有する試薬溶液を提供するであろう。キットにはさらに、本明細書に記載するような、本発明にしたがった方法の書面の説明が含まれてもよい。

0129

[00145]典型的な態様において、試験試料中に存在しうる1以上のターゲット分子の検出および/または定量化のためのキットには、ターゲット分子に対する特異的アフィニティーを有し、そしてタグを含む、少なくとも1つのアプタマー;標識剤;および固体支持体が含まれ、固体支持体には配置された少なくとも1つのプローブが含まれ、そしてプローブは、アプタマー上のタグと会合可能である。

0130

実施例
[00146]以下の実施例は、例示目的のみのために提供され、そして付随する請求項中に定義するような本発明の範囲を限定することを意図しない。

0131

実施例1. 検出および定量化のため、表面上に固定されたプローブによるハイブリダイゼーション捕捉を用いた、緩衝液および血漿内に連続希釈したVEGFを測定する光アプタマーアッセイ
[00147]本実施例は、単一の光アプタマーおよびそのターゲットタンパク質に関する、図2A、2B、および2Cに例示するようなアッセイの工程を例示する。2つの異なる試験試料、緩衝液および血漿を用いて、アッセイを行った。

0132

[0148]A.オリゴヌクレオチドの調製。ここでは、光アプタマーの3’端上に含まれるDNAオリゴヌクレオチドタグを用いた。この場合、タグは、SELEXプロトコル中に用いる、3’固定領域であった。慣用的合成装置を用い、固相上で、ホスホロアミダイトDNA合成のため、標準的プロトコルを用いて、VEGF光アプタマー509−80を合成した。1:1:2の比のt−ブチルアミンメタノール:水を70℃で5時間用いて、DNA合成において標準的である条件よりは穏やかな条件下で、5−BrdUを含有する光アプタマーを切断し、そして脱保護し、ろ過し、そして蒸発乾固した。エタノール沈殿後、逆相HPLCを用いて、アプタマーを精製した。光アプタマー上のタグに相補的であり、そしてアミン反応基を含むDNAプローブを上述のように合成し、そしてDNAに関する標準的プロトコルを用いて、切断し、そして脱保護した。エタノール沈殿のみを用いて、プローブを精製した。

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