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技術 セロトニン関連の医学的状態、アドレナリン関連の医学的状態、ノルアドレナリン関連の医学的状態、グルタミン酸関連の医学的状態および副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン関連の医学的状態の処置および診断のためのミクロRNAおよび該ミクロRNAを含む組成物

出願人 イェダリサーチアンドデベロップメントカンパニーリミテッド
発明者 チェン,アロンホルンステイン,エランイスラー,オルナハラマチ,シャロンヴォルク,ナアマ
出願日 2016年12月28日 (3年1ヶ月経過) 出願番号 2016-254743
公開日 2017年6月1日 (2年8ヶ月経過) 公開番号 2017-095482
状態 未査定
技術分野 突然変異または遺伝子工学 蛋白脂質酵素含有:その他の医薬 他の有機化合物及び無機化合物含有医薬 化合物または医薬の治療活性
主要キーワード 付きチャンバ 打ち抜き物 代替形式 平坦シート インジェクターシステム トランスリン 開放アーム スライス片
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2017年6月1日)のものです。
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図面 (20)

課題

セロトニンレベルの上昇が治療上有益である医学的状態処置するための医薬組成物の提供。

解決手段

miR−135(ミクロRNA−135)、miR−135の前駆体、又は前記miR−135もしくは前記miR−135の前駆体をコードする外因性ポリヌクレオチドを有効成分として含む、うつ病、不安、疲労、損なわれた認知機能パニック発作脅迫行動嗜癖社会恐怖睡眠障害成長障害及び生殖障害等の治療に有効な医薬組成物。

概要

背景

概要

セロトニンレベルの上昇が治療上有益である医学的状態処置するための医薬組成物の提供。miR−135(ミクロRNA−135)、miR−135の前駆体、又は前記miR−135もしくは前記miR−135の前駆体をコードする外因性ポリヌクレオチドを有効成分として含む、うつ病、不安、疲労、損なわれた認知機能パニック発作脅迫行動嗜癖社会恐怖睡眠障害成長障害及び生殖障害等の治療に有効な医薬組成物。なし

目的

投薬量および投薬間隔を、生物学的効果誘導または抑制するために活性な成分の十分な血漿レベル(これは最小有効濃度(MEC)と呼ばれる)を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

セロトニンレベルの上昇が治療上有益である医学的状態処置するための医薬組成物であって、miR−135、miR−135の前駆体、または前記miR−135もしくは前記miR−135の前駆体をコードする外因性ポリヌクレオチドを有効成分として含む医薬組成物。

請求項2

前記miR−135または前記miR−135の前駆体をコードする前記外因性ポリヌクレオチドが核酸構築物中に含まれており、前記外因性ポリヌクレオチドが、シス作用調節要素転写制御下にある、請求項1に記載の医薬組成物。

請求項3

前記シス作用調節要素は神経膠細胞中で特異的に活性である、請求項2に記載の医薬組成物。

請求項4

前記miR−135は、配列番号58〜62に示される通りである、請求項1〜3のいずれかに記載の医薬組成物。

請求項5

前記miR−135は、修飾された骨格、修飾されたヌクレオシド間連結、および修飾された塩基からなる群から選択される修飾を含む、請求項1〜4のいずれかに記載の医薬組成物。

請求項6

前記修飾された骨格は、ホスホチオアートキラルなホスホロチオアート;ホスホロジチオアート;ホスホトリエステルアミノアルキルホスホトリエステル;メチルホスホナートアルキルホスホナート;キラルなホスホナート;ホスフィナートホスホルアミダート;アミノアルキルホスホルアミダート;チオノホスホルアミダート;チオノアキルホスホナート;チオノアルキルホスホトリエステル;ボラノホスフェートホスホジエステルペプチド核酸(PNA)、および2’−O−メトキシエチルからなる群から選択される修飾を含む、請求項5に記載の医薬組成物。

請求項7

前記miR−135は、糖およびヌクレオシド間連結の両方に修飾を含む、請求項1〜4のいずれかに記載の医薬組成物。

請求項8

前記医学的状態は、うつ病、不安、ストレス、疲労、損なわれた認知機能パニック発作脅迫行動嗜癖社会恐怖睡眠障害食品関連障害成長障害および生殖障害からなる群から選択される、請求項1〜7のいずれかに記載の医薬組成物。

請求項9

前記医学的状態は気分障害である、請求項1〜7のいずれかに記載の医薬組成物。

請求項10

前記miR−135またはmiR−135の前駆体は、核酸構築物からコードされており、前記医薬組成物は、医薬的に許容される担体または希釈剤をさらに含み、前記医薬組成物は、セロトニンレベルの上昇が治療上有益である医学的状態を処置するためのものである、請求項1〜4,8および9のいずれかに記載の医薬組成物。

請求項11

前記核酸構築物は、前記miR−135またはmiR−135の前駆体の発現を標的化するために、神経膠細胞中で特異的に活性であるシス作用調節要素を含む、請求項10に記載の医薬組成物。

技術分野

0001

本発明はそのいくつかの実施形態において、ミクロRNAに関連し、より具体的には、しかし、限定ではなく、疾患を診断し、処置し、また、処置をモニターするための該ミクロRNAの使用に関連する。

0002

気分障害(例えば、大うつ病など)は、人口の約10%が世界中で襲われる最も一般的かつ急増している健康問題の一部を占める。何十年の研究にもかかわらず、うつ病発症の背後に潜む機構罹病性および利用可能な治療法は一部が理解されているにすぎない。現在、約1/3の患者だけが、利用可能な処置に応答しており、したがって、その病理学をより良く理解することが非常に求められている。うつ病の病因に関する現在の定説は、環境的要因遺伝学素因との間における複雑な相互作用からなり、これにより、エピジェネティックプロセスについての機構的役割示唆されている。

0003

セロトニン(5HT)は、様々な認知機能情動機能および生理学的機能を調整するために脳全体に広範囲に突き出る縫線核(RN)によって脳内で産生されるモノアミン神経伝達物質である。調節不全セロトニン作動性活性と、うつ病とのつながりが十分に立証されている[Michelsen KA他、Brain Res Rev、(2007)55(2):329〜42]。5HTのレベル、同様にまた、その産生、分泌再取り込みおよび不活性化に関わる遺伝的回路網がうつ病では調節不全となっている。さらに、ほとんどの現在利用可能な抗うつ剤は、5HT系に関連づけられるタンパク質の機能を標的としており、これにより、増大した5THレベルをシナプスにおいてもたらしている[Krishnan VおよびNestler EJ、Nature、(2008)455:894〜902]。利用可能な治療剤は、症状の緩和が認められるまでに長期間の投与を必要とする。

0004

ミクロRNA(miR)は、遺伝子発現転写後に抑制する内因性の小さい(およそ22ヌクレオチドの)RNA分子サブセットである。miRは、ステムループ構造を有する前駆体miRに細胞の核においてプロセッシングされる一次miR分子として転写され、その後、この前駆体miRが、活性な成熟型miRにさらにプロセッシングされる細胞質に排出される。成熟型miRは続いて、RNA誘導サイレンシング複合体に取り込まれ、主に、特定のmRNA分子の3’未翻訳領域(3’UTR)に結合することによって機能する。結合が、標的mRNAの3’UTRにおける相補的シード一致配列に対して対形成するシード配列(miRの5’末端における6〜8ヌクレオチド配列)を介して生じる。miRの結合は、直接的なmRNA脱安定化または翻訳抑制を引き起こし、最終的には、標的遺伝子の低下したタンパク質レベルをもたらす。

0005

miRは神経系に多量に存在しており、初期の研究は主に、発達、癌および神経変性障害、ならびに、正常なプロセス(例えば、可塑性など)との関連においてニューロンに集中している[Kosik KS、Nat Rev Neurosci、(2006)7:911〜20]。加えて、miRは、ヒトおよびマウスモデルの両方で、精神医学的障害、例えば、統合失調症自閉症、また同様に、うつ病および不安においてある一定の役割を果たすことが示唆されている[Miller BHおよびWahlestedt C、Brain Res、(2010)1338:89〜99]。いくつかの研究では近年、5HT系の調節におけるmiRの新たに明らかになりつつある役割、ならびに、うつ病関連障害とのそれらの潜在的連関を明らかにする、5HT関連遺伝子を調節することにおけるmiRの関与が明らかにされている[Millan MJ、Curr Opin Pharmacol、(2011)11(1):11〜22]。

0006

米国特許出願公開第20100222413号(Stoffel M.他)は、ミクロRNAの発現を調整するための化学修飾されたオリゴヌクレオチドを開示する。米国特許出願公開第20100222413号はさらに、ミクロRNA(例えば、miR−122、miR−16、miR−192およびmiR−194)のサイレンシングを、中枢神経系の疾患を処置するために行うための方法を開示する。

0007

本発明のいくつかの実施形態の1つの局面によれば、セロトニンレベルの上昇が治療上有益である医学的状態を処置の必要性のある対象において処置する方法であって、miR−135、miR−335、miR−26およびmiR−182からなる群から選択される少なくとも1つのミクロRNAまたはその前駆体をコードする外因性ポリヌクレオチドを上記対象の細胞に投与し、または、上記対象の細胞において発現させ、それにより、上記医学的状態を処置することを含む方法が提供される。

0008

本発明のいくつかの実施形態の1つの局面によれば、miR−135、miR−335、miR−26およびmiR−182からなる群から選択される少なくとも1つのミクロRNAまたはその前駆体をコードする外因性ポリヌクレオチドの使用であって、セロトニンレベルの上昇が治療上有益である医学的状態を処置するために特定される医薬を製造するための使用が提供される。

0009

本発明のいくつかの実施形態の1つの局面によれば、セロトニンレベルをその必要性のある対象のシナプス間隙において増大させる方法であって、miR−135、miR−335、miR−26およびmiR−182からなる群から選択される少なくとも1つのミクロRNAまたはその前駆体をコードする外因性ポリヌクレオチドを上記対象のセロトニン作動性ニューロンに投与し、または、上記対象のセロトニン作動性ニューロンにおいて発現させ、それにより、セロトニンレベルを上記シナプス間隙において増大させることを含む方法が提供される。

0010

本発明のいくつかの実施形態の1つの局面によれば、miR−135、miR−335、miR−26およびmiR−182からなる群から選択される少なくとも1つのミクロRNAまたはその前駆体をシス作用調節要素転写制御下において発現する核酸構築物を含む単離された神経膠細胞が提供される。

0011

本発明のいくつかの実施形態の1つの局面によれば、セロトニンレベルの上昇が治療上有益である医学的状態を処置するための、miR−135、miR−335、miR−26およびmiR−182からなる群から選択される少なくとも1つのミクロRNAまたはその前駆体をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。

0012

本発明のいくつかの実施形態の1つの局面によれば、アドレナリンまたはノルアドレナリンの低いレベルが治療上有益である医学的状態を処置の必要性のある対象において処置する方法であって、miR−19またはその前駆体をコードする外因性ポリヌクレオチドを上記対象の細胞に投与し、または、上記対象の細胞において発現させ、それにより、上記医学的状態を処置することを含む方法が提供される。

0013

本発明のいくつかの実施形態の1つの局面によれば、miR−19またはその前駆体をコードする外因性ポリヌクレオチドの使用であって、アドレナリンまたはノルアドレナリンの低いレベルが治療上有益である医学的状態を処置するために特定される医薬を製造するための使用が提供される。

0014

本発明のいくつかの実施形態の1つの局面によれば、miR−19またはその前駆体をシス作用調節要素の転写制御下において発現する核酸構築物を含む単離された細胞が提供される。

0015

本発明のいくつかの実施形態の1つの局面によれば、アドレナリンまたはノルアドレナリンの低いレベルが治療上有益である医学的状態を処置するための、miR−19またはその前駆体をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。

0016

本発明のいくつかの実施形態の1つの局面によれば、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン(CRH)の低いレベルが治療上有益である医学的状態を処置の必要性のある対象において処置する方法であって、miR−15またはその前駆体をコードする外因性ポリヌクレオチドを上記対象の細胞に投与し、または、上記対象の細胞において発現させ、それにより、上記医学的状態を処置することを含む方法が提供される。

0017

本発明のいくつかの実施形態の1つの局面によれば、miR−15またはその前駆体をコードする外因性ポリヌクレオチドの使用であって、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン(CRH)の低いレベルが治療上有益である医学的状態を処置するために特定される医薬を製造するための使用が提供される。

0018

本発明のいくつかの実施形態の1つの局面によれば、miR−15またはその前駆体をシス作用調節要素の転写制御下において発現する核酸構築物を含む単離された細胞が提供される。

0019

本発明のいくつかの実施形態の1つの局面によれば、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン(CRH)の低いレベルが治療上有益である医学的状態を処置するための、miR−15またはその前駆体をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。

0020

本発明のいくつかの実施形態の1つの局面によれば、グルタミン酸受容体の低いレベルが治療上有益である医学的状態を処置の必要性のある対象において処置する方法であって、miR−181またはその前駆体をコードする外因性ポリヌクレオチドを上記対象の細胞に投与し、または、上記対象の細胞において発現させ、それにより、上記医学的状態を処置することを含む方法が提供される。

0021

本発明のいくつかの実施形態の1つの局面によれば、miR−181またはその前駆体をコードする外因性ポリヌクレオチドの使用であって、グルタミン酸受容体の低いレベルが治療上有益である医学的状態を処置するために特定される医薬を製造するための使用が提供される。

0022

本発明のいくつかの実施形態の1つの局面によれば、miR−181またはその前駆体をシス作用調節要素の転写制御下において発現する核酸構築物を含む単離された細胞が提供される。

0023

本発明のいくつかの実施形態の1つの局面によれば、グルタミン酸受容体の低いレベルが治療上有益である医学的状態を処置するための、miR−181またはその前駆体をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。

0024

本発明のいくつかの実施形態の1つの局面によれば、miR−135、miR−335、miR−26、miR−27、miR−181、miR−182、miR−19およびmiR−15からなる群から選択されるミクロRNAまたはその前駆体をコードする核酸配列を含み、上記核酸配列がシス作用調節要素の転写制御下にある核酸構築物が提供される。

0025

本発明のいくつかの実施形態の1つの局面によれば、本発明の核酸構築物と、医薬的に許容される担体または希釈剤とを含む医薬組成物が提供される。

0026

本発明のいくつかの実施形態の1つの局面によれば、トリプトファンヒドロキシラーゼ2(Tph2)遺伝子の発現を神経膠細胞において調節する方法であって、miR−181およびmiR−27からなる群から選択されるミクロRNAまたはその前駆体の活性または発現を上記神経膠細胞において調整し、それにより、上記Tph2遺伝子の発現を調節することを含む方法が提供される。

0027

本発明のいくつかの実施形態の1つの局面によれば、グルタミン酸受容体遺伝子の発現を神経膠細胞において調節する方法であって、miR−181またはその前駆体の活性または発現を上記神経膠細胞において調整し、それにより、上記グルタミン酸受容体遺伝子の発現を調節することを含む方法が提供される。

0028

本発明のいくつかの実施形態の1つの局面によれば、miR−181、miR−27またはその前駆体の発現をダウンレギュレーションするための核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドが提供される。

0029

本発明のいくつかの実施形態の1つの局面によれば、miR−181およびmiR−27からなる群から選択されるミクロRNAまたはその前駆体の発現をダウンレギュレーションするための核酸配列を含み、上記核酸配列がシス作用調節要素の転写制御下にある核酸構築物が提供される。

0030

本発明のいくつかの実施形態の1つの局面によれば、セロトニン輸送体(Slc6a4)遺伝子の発現を神経膠細胞において調節する方法であって、miR−135およびmiR−335からなる群から選択されるミクロRNAまたはその前駆体の活性または発現を上記神経膠細胞において調整し、それにより、上記Slc6a4遺伝子の上記発現を調節することを含む方法が提供される。

0031

本発明のいくつかの実施形態の1つの局面によれば、セロトニン阻害受容体1a(Htr1a)遺伝子の発現を神経膠細胞において調節する方法であって、miR−135、miR−335、miR−181、miR−182およびmiR−26からなる群から選択されるミクロRNAまたはその前駆体の活性または発現を上記神経膠細胞において調整し、それにより、上記Htr1a遺伝子の上記発現を調節することを含む方法が提供される。

0032

本発明のいくつかの実施形態の1つの局面によれば、ダウン症候群細胞接着分子(Dscam)遺伝子の発現を神経膠細胞において調節する方法であって、miR−182またはその前駆体の活性または発現を上記神経膠細胞において調整し、それにより、上記Dscam遺伝子の上記発現を調節することを含む方法が提供される。

0033

本発明のいくつかの実施形態の1つの局面によれば、細胞接着分子L1(L1cam)遺伝子の発現を神経膠細胞において調節する方法であって、miR−182またはその前駆体の活性または発現を上記神経膠細胞において調整し、それにより、上記L1cam遺伝子の上記発現を調節することを含む方法が提供される。

0034

本発明のいくつかの実施形態の1つの局面によれば、トランスリン会合タンパク質X(Tsnax)遺伝子の発現を神経膠細胞において調節する方法であって、miR−182またはその前駆体の活性または発現を上記神経膠細胞において調整し、それにより、上記Tsnax遺伝子の上記発現を調節することを含む方法が提供される。

0035

本発明のいくつかの実施形態の1つの局面によれば、モノアミンヒドロキシラーゼ(MaoA)遺伝子の発現を神経膠細胞において調節する方法であって、miR−27の活性または発現を調整し、それにより、上記MaoA遺伝子の上記発現を調節することを含む方法が提供される。

0036

本発明のいくつかの実施形態の1つの局面によれば、ベータアドレナリン作動性受容体1(Adrb1)遺伝子の発現を神経膠細胞または心臓細胞において調節する方法であって、miR−19の活性または発現を調整し、それにより、上記Adrb1遺伝子の上記発現を調節することを含む方法が提供される。

0037

本発明のいくつかの実施形態の1つの局面によれば、カナノイド受容体1(CB1)遺伝子の発現を神経膠細胞において調節する方法であって、miR−19またはその前駆体の活性または発現を上記神経膠細胞において調整し、それにより、上記CB1遺伝子の上記発現を調節することを含む方法が提供される。

0038

本発明のいくつかの実施形態の1つの局面によれば、CRH1型受容体遺伝子の発現を神経膠細胞において調節する方法であって、miR−15の活性または発現を調整し、それにより、上記CRH1型受容体遺伝子の上記発現を調節することを含む方法が提供される。

0039

本発明のいくつかの実施形態の1つの局面によれば、FK506結合タンパク質5(FKBP5)遺伝子の発現を神経膠細胞において調節する方法であって、miR−15またはその前駆体の活性または発現を上記神経膠細胞において調整し、それにより、上記FKBP5遺伝子の上記発現を調節することを含む方法が提供される。

0040

本発明のいくつかの実施形態の1つの局面によれば、シンタキシン1a(Stx1a)遺伝子の発現を神経膠細胞において調節する方法であって、miR−15またはその前駆体の活性または発現を上記神経膠細胞において調整し、それにより、上記Stx1a遺伝子の上記発現を調節することを含む方法が提供される。

0041

本発明のいくつかの実施形態の1つの局面によれば、血清グルココルチコイド調節キナーゼ(Sgk1)遺伝子の発現を神経膠細胞において調節する方法であって、miR−15またはその前駆体の活性または発現を上記神経膠細胞において調整し、それにより、上記Sgk1遺伝子の上記発現を調節することを含む方法が提供される。

0042

本発明のいくつかの実施形態の1つの局面によれば、ベータ2型アドレナリン作動性受容体(Adrb2)遺伝子の発現を神経膠細胞において調節する方法であって、miR−15またはその前駆体の活性または発現を上記神経膠細胞において調整し、それにより、上記Adrb2遺伝子の上記発現を調節することを含む方法が提供される。

0043

本発明のいくつかの実施形態の1つの局面によれば、抗うつ剤の処置をモニターする方法であって、(a)処置の必要性のある対象を抗うつ剤により処置すること、および、(b)上記対象の血液におけるmiR−135の発現レベルを上記処置の前後で測定することを含み、上記抗うつ剤による上記処置の前における上記miR−135の発現レベルと比較して、上記抗うつ剤による上記処置の後における上記miR−135のより低い発現レベルにより、上記処置が効率的であることが示される、方法が提供される。

0044

本発明のいくつかの実施形態の1つの局面によれば、セロトニン関連の医学的状態を診断の必要性のある対象において診断する方法であって、miR−135の発現レベルを上記対象の血液において測定することを含み、健康な対象の血液試料の場合上記と比較して上記miR−135の高い発現レベルが、上記セロトニン関連の医学的状態を示すものである、方法が提供される。

0045

本発明のいくつかの実施形態によれば、上記細胞は神経膠細胞である。

0046

本発明のいくつかの実施形態によれば、上記神経膠細胞はセロトニン作動性ニューロンである。

0047

本発明のいくつかの実施形態によれば、上記miR−135は、配列番号58〜62に示される通りである。

0048

本発明のいくつかの実施形態によれば、上記miR−335は、配列番号63〜64に示される通りである。

0049

本発明のいくつかの実施形態によれば、上記miR−26は、配列番号65〜69に示される通りである。

0050

本発明のいくつかの実施形態によれば、上記miR−182は、配列番号70〜71に示される通りである。

0051

本発明のいくつかの実施形態によれば、上記医学的状態は、うつ病、不安、ストレス、疲労、損なわれた認知機能、パニック発作脅迫行動嗜癖社会恐怖睡眠障害食品関連障害成長障害および生殖障害からなる群から選択される。

0052

本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ミクロRNAがmiR−135であるとき、上記医学的状態はうつ病または不安である。

0053

本発明のいくつかの実施形態によれば、上記細胞は神経膠細胞または心臓細胞である。

0054

本発明のいくつかの実施形態によれば、上記miR−19は、配列番号72〜76に示される通りである。

0055

本発明のいくつかの実施形態によれば、上記医学的状態は、ストレス、不安、記憶障害および心臓病気からなる群から選択される。

0056

本発明のいくつかの実施形態によれば、上記miR−15は、配列番号77〜80に示される通りである。

0057

本発明のいくつかの実施形態によれば、上記医学的状態は、うつ病、不安、ストレス、疲労、損なわれた認知機能、パニック発作、脅迫行動、嗜癖、社会恐怖、睡眠障害、食品関連障害、成長障害および生殖障害からなる群から選択される。

0058

本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ポリヌクレオチドは、神経膠細胞において活性であるシス作用調節要素の転写制御下にある。

0059

本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ポリヌクレオチドは、心臓細胞において活性であるシス作用調節要素の転写制御下にある。

0060

本発明のいくつかの実施形態によれば、上記miR−181は、配列番号85〜94に示される通りである。

0061

本発明のいくつかの実施形態によれば、上記医学的状態は、てんかん発作ハンチントン病、統合失調症、脆弱X症候群、全般性不安障害および癌からなる群から選択される。

0062

本発明のいくつかの実施形態によれば、上記シス作用調節要素は神経膠細胞または心臓細胞において活性である。

0063

本発明のいくつかの実施形態によれば、上記対象はヒト対象である。

0064

本発明のいくつかの実施形態によれば、上記調節することが、上記Tph2遺伝子の発現をアップレギュレーションすることを含むとき、上記調整することは、上記miR−181および/または上記miR−27を上記神経膠細胞においてダウンレギュレーションすることを含む。

0065

本発明のいくつかの実施形態によれば、上記方法はさらに、上記Tph2遺伝子の発現を上記miR−181および/または上記miR−27の上記神経膠細胞における上記ダウンレギュレーションの後で測定することを含む。

0066

本発明のいくつかの実施形態によれば、上記グルタミン酸受容体遺伝子は、グルタミン酸受容体代謝型1(Grm1)、グルタミン酸受容体イオンチャネル型カイニン酸3(Grik3)、グルタミン酸受容体代謝型5(Grm5)、グルタミン酸受容体イオンチャネル型カイニン酸2(Grik2)およびグルタミン酸受容体代謝型7(Grm7)からなる群から選択される。

0067

本発明のいくつかの実施形態によれば、上記調節することが、上記Slc6a4遺伝子の発現をダウンレギュレーションすることを含むとき、上記調整することは、上記miR−135および/またはmiR−335を上記神経膠細胞においてアップレギュレーションすることを含む。

0068

本発明のいくつかの実施形態によれば、上記方法はさらに、上記Slc6a4遺伝子の発現を上記miR−135および/またはmiR−335の上記神経膠細胞における上記アップレギュレーションの後で測定することを含む。

0069

本発明のいくつかの実施形態によれば、上記調節することが、上記Htr1a遺伝子の発現をダウンレギュレーションすることを含むとき、上記調整することは、上記miR−135、miR−335、miR−181、miR−182および/またはmiR−26を上記神経膠細胞においてアップレギュレーションすることを含む。

0070

本発明のいくつかの実施形態によれば、上記方法はさらに、上記Htr1a遺伝子の発現を、上記miR−135、miR−335、miR−181、miR−182および/またはmiR−26の上記神経膠細胞における上記アップレギュレーションの後で測定することを含む。

0071

本発明のいくつかの実施形態によれば、上記調節することが、上記MaoA遺伝子の発現をダウンレギュレーションすることを含むとき、上記調整することは、上記miR−27を上記神経膠細胞においてアップレギュレーションすることを含む。

0072

本発明のいくつかの実施形態によれば、上記方法はさらに、上記MaoA遺伝子の発現を上記miR−27の上記神経膠細胞における上記アップレギュレーションの上記アップレギュレーションの後で測定することを含む。

0073

本発明のいくつかの実施形態によれば、上記調節することが、上記Adrb1遺伝子の発現をダウンレギュレーションすることを含むとき、上記調整することは、上記miR−19を上記神経膠細胞または上記心臓細胞においてアップレギュレーションすることを含む。

0074

本発明のいくつかの実施形態によれば、上記方法はさらに、上記Adrb1遺伝子の発現を上記miR−19の上記神経膠細胞または上記心臓細胞における上記アップレギュレーションの後で測定することを含む。

0075

本発明のいくつかの実施形態によれば、上記調節することが、上記CB1遺伝子の発現をダウンレギュレーションすることを含むとき、上記調整することは、上記miR−19を上記神経膠細胞においてアップレギュレーションすることを含む。

0076

本発明のいくつかの実施形態によれば、上記方法はさらに、上記CB1遺伝子の発現を上記CB1の上記神経膠細胞における上記アップレギュレーションの後で測定することを含む。

0077

本発明のいくつかの実施形態によれば、上記調節することが、上記CRH1型受容体遺伝子の発現をダウンレギュレーションすることを含むとき、上記調整することは、上記miR−15を上記神経膠細胞においてアップレギュレーションすることを含む。

0078

本発明のいくつかの実施形態によれば、上記方法はさらに、上記CRH1型受容体遺伝子の発現を上記miR−15の上記神経膠細胞における上記アップレギュレーションの後で測定することを含む。

0079

本発明のいくつかの実施形態によれば、上記調節することが、上記FKBP5遺伝子の発現をダウンレギュレーションすることを含むとき、上記調整することは、上記miR−15を上記神経膠細胞においてアップレギュレーションすることを含む。

0080

本発明のいくつかの実施形態によれば、上記方法はさらに、上記FKBP5遺伝子の発現を上記miR−15の上記神経膠細胞における上記アップレギュレーションの後で測定することを含む。

0081

本発明のいくつかの実施形態によれば、上記方法はさらに、血液試料を上記処置に先立って上記対象から得ることを含む。

0082

本発明のいくつかの実施形態によれば、上記抗うつ剤は、選択的セロトニン再取り込み阻害剤SSRI)、三環系抗うつ剤およびノルアドレナリン再取り込み阻害剤(NRI)からなる群から選択される。

0083

本発明のいくつかの実施形態によれば、上記セロトニン関連の医学的状態は精神医学的状態である。

0084

本発明のいくつかの実施形態によれば、上記精神医学的状態は、うつ病、不安、ストレス、疲労、損なわれた認知機能、パニック発作、脅迫行動、嗜癖、社会恐怖、睡眠障害および食品関連障害からなる群から選択される。

0085

本発明のいくつかの実施形態によれば、上記miR−135はmiR−135aまたはmiR−135bを含む。

0086

別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的用語および/または科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載される方法および材料と類似または同等である方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、例示的な方法および/または材料が下記に記載される。矛盾する場合には、定義を含めて、本特許明細書が優先する。加えて、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。

図面の簡単な説明

0087

本明細書では本発明のいくつかの実施形態を単に例示し添付の図面を参照して説明する。特に詳細に図面を参照して、示されている詳細が例示として本発明の実施形態を例示考察することだけを目的としていることを強調するものである。この点について、図面について行う説明によって、本発明の実施形態を実施する方法は当業者には明らかになるであろう。

0088

図1A−1Eは、セロトニン(5HT)ニューロンにおけるミクロRNAの発現を示す。図1Aは、5HTニューロンにおける示差的に発現したmiRNAのグラフ例示である。Lowess正規化値が、平均対数強度に対してプロットされるスポット強度のln2倍率変化として示される(MAプロット);図1Bは、対照と比較して、5HTニューロンにおけるmiR−375の増大したレベルを示す、miRのリアルタイムPCRにおけるアレイ結果の検証である。n=5個の5HT細胞、n=4個の非5HT。バーは平均±s.e.m.を表す。**P=0.0071;図1Cは、対照と比較して、5HTニューロンにおけるmiR−135aの低下したレベルを示す、miRのリアルタイムPCRにおけるアレイ結果の検証である。N=5個の5HT細胞、n=4個の非5HT。**P=0.0075;図1Dは、Slc6a4についての生物情報学予測を5HTマイクロアレイ結果と組み合わせることを表し、かつ、インビトロ試験のために選ばれるmiRを列挙するバンダイアグラムである;図1Eは、Htr1aについての生物情報学予測を5HTマイクロアレイ結果と組み合わせることを表し、かつ、インビトロ試験のために選ばれるmiRを列挙するバンダイアグラムである。
図1F−1Iは、セロトニン(5HT)ニューロンにおけるミクロRNAの発現を示す。図1Fは、Tph2についての生物情報学予測を5HTマイクロアレイ結果と組み合わせることを表し、かつ、インビトロ試験のために選ばれるmiRを列挙するバンダイアグラムである;図1Gは、MaoAについての生物情報学予測を5HTマイクロアレイ結果と組み合わせることを表し、かつ、インビトロ試験のために選ばれるmiRを列挙するバンダイアグラムである;図1Hは、miR−181cおよびmiR−27bがTph2の3’UTRを標的とし得ることを示すルシフェラーゼレポーターアッセイ結果を例示するグラフである;図1Iは、miR−27bがHtr1a MaoAを標的とし得ることを示すルシフェラーゼレポーターアッセイ結果を例示するグラフである。

0089

図2A−2Dは、ミクロRNAがSlc6a4の3’UTR(配列番号25)およびHtr1aの3’UTR(配列番号27)を標的とすることを示す。図2Aは、miR−135aおよびmiR−135b(それぞれ、配列番号24および26)がSlc6a4の3’UTRを標的とすることの例示である;図2Bは、miR−135aおよびmiR−135b(それぞれ、配列番号24および26)がHtr1aの3’UTRを標的とすることの例示である;図2Cは、miR−135aおよびmiR−135bがSlc6a4の3’UTRを標的とし得ることを示すルシフェラーゼレポーターアッセイ結果を例示するグラフである。ルシフェラーゼアッセイのデータは、記載された遺伝子の3’UTRおよび空ベクター、または、特定のmiRを過剰発現するベクターによりトランスフェクションされたHEK293細胞における共トランスフェクションされたホタルルシフェラーゼレポーターの活性に対して正規化されるウミシイタケルシフェラーゼ活性を示す。バーは平均±s.e.m.を表す。*P=0.014、***P=0.0002、miR−16については#p<0.0535、miR−27については#P=0.0967;図2Dは、miR−135a、miR−135b、miR−335、miR−181CおよびmiR−26aがHtr1aの3’UTRを標的とし得ることを示すルシフェラーゼレポーターアッセイ結果を例示するグラフである。***P<0.0001、**P=0.0029
図2E−2Hは、ミクロRNAがSlc6a4の3’UTR(配列番号25)およびHtr1aの3’UTR(配列番号27)を標的とすることを示す。図2Eは、miR−135についてのシード一致部(配列番号27〜41)の、slc6a4の3’UTRでの保存を例示するものである;図2Fは、miR−135についてのHtr1aの3’UTRシード一致部(配列番号42〜54)を例示するものであり、シード1がマウスの3’UTRにおいてのみ現れ、シード2が高度に保存されていることを示している。図2Gは、slc6a4の3’UTRにおけるmiR−135のシード一致部での変異がmiR−135aおよびmiR−135bの抑制因子効果を阻止したことを例示するグラフである。***P<0.0001、**P=0.0032;図2Hは、Htr1aの3’UTRにおけるmiR−135のシード一致部での変異を個々に行った場合および両方を一緒に行った場合を例示するグラフであり、miR−135bが両方のシード一致部を介してHtr1aを標的とし、miR−135aはシード2によってのみ標的とすることを示している。***P<0.0001。

0090

図3A−3Dは、miR−135aおよびmiR−135bのレベルを種々の条件のもとで示す。図3Aは、急性ストレスの後でのRNにおけるmiR−135aレベルのダウンレギュレーションを例示するグラフである。バーは平均±s.e.m.を表す。(n=8、群0において;n=10、群90において;n=9、群24において)。***P<0.0001、*P=0.0357;図3Bは、急性ストレスの後でのRNにおけるmiR−135bレベルのダウンレギュレーションを例示するグラフである。***P<0.0001、**P=0.0055;図3Cは、マウスが社会的にさらされたかどうかに関係なく、イミプラミン急性投与および長期投与の後でのRNにおけるmiR−135aレベルのアップレギュレーションを例示するグラフである。(n=8、対照の長期生理的食塩水および対照の長期イミプラミン;n=7、急性イミプラミン;n=11、社会的敗北での長期生理的食塩水;n=9、社会的敗北での長期イミプラミン)。**P=0.003;図3Dは、マウスが社会的敗北にさらされたかどうかに関係なく、イミプラミンの急性投与および長期投与の後でのRNにおけるmiR−135bレベルのアップレギュレーションを例示するグラフである。**P=0.0093。
図3E−3Jは、miR−135aおよびmiR−135bのレベルを種々の条件のもとで示す。図3Eは、NRIまたは生理的食塩水ではなく、SSRIの急性投与または長期投与の後のRNでのmiR−135aレベルにおける増大を例示するグラフである;(n=8、急性生理的食塩水(n=7)を除く各群)。***P<0.0001;図3Fは、SSRIまたはNRIの急性投与または長期投与の後でのRNにおける変化しないmiR−135bレベルを例示するグラフである;図3Gは、対照と比較して、長期SSRIまたは急性SSRIを受けるマウスの血漿中でのmiR−135aレベルにおける低下を例示するグラフである。(n=8、長期SSRIおよび長期NRI(n=7)を除く各群)。急性生理的食塩水と比較して急性SSRIについては**P=0.0004、長期生理的食塩水と比較して長期SSRIについては**P=0.0006;図3Hは、対照と比較して、長期SSRIまたは急性SSRIを受けるマウスの血漿における変化しないmiR−135bレベルを例示するグラフである;図3Iは、血漿と比較して、RNにおける個々のマウスのmiR−135aレベルを明らかにする散乱プロットグラフであり、SSRIまたは生理的食塩水の処置を受けるマウスでは逆の相関を示している。図3Jは、対照と比較して、SSRI処置を受けるマウスでは、血漿に対するRNにおけるmiR−135bレベルの間には相関がないことを明らかにする散乱プロットグラフである。

0091

図4A−4Bは、miR−135bのインビボ過剰発現を示す。図4Aは、miR−135bの過剰発現のためのレンチウイルスの概略的例示である;図4Bは、成体マウスの背側縫線核(DRN)におけるインビボでのmiR−135bの過剰発現を示すリアルタイムPCR結果を例示するグラフである。バーは平均±s.e.m.を表す。(n=5、GFP注入;n=3、miR−135 OE)。P=0.0032。
図4C−4Dは、miR−135bのインビボ過剰発現を示す。図4C〜図4Dは、注入部位におけるGFP染色を明らかにすることによるDRN注入部位の例示である。(Paxinosから借用される区分マップ)。
図4E−4Hは、miR−135bのインビボ過剰発現を示す。図4Eは、対照マウスと比較して、RNにおいてmiR−135bを過剰発現するマウスにおけるフォレスト水泳試験での低下した不動時間を例示するグラフである。(n=9、対照;n=9、miR−135)。P=0.0088(3分の時点で)およびP=0.00330(4分の時点について);図4Fは、対照マウスと比較して、RNにおいてmiR−135bを過剰発現するマウスにおける尾懸垂試験での低下した不動時間を例示するグラフである。P<0.07351;図4G〜図4Hは、対照と比較して、RNにおいてmiR−135bを過剰発現するマウスのホームケージでの自発運動における差がないことを例示するグラフである。

0092

図5は、ルシフェラーゼ遺伝子の後にクローン化されるADRb1の3’UTRを示す。Psicheck2プラスミドにおいてルシフェラーゼ遺伝子の下流側にクローン化される、4つのmiR−19結合部位を有する無傷上段)のADRb1 3’UTR、および、4つすべてのmiR−19結合部位を欠いている変異型下段)形態のADRb1 3’UTRの例示。

0093

図6A−6Eは、miR−19bが、ADRb1の3’UTRを、その3’UTRにおけるシード一致部を介して標的とすることを示す;図6A〜図6Bは、低い内因性miR−19レベルを発現するHT22細胞において測定される正規化されたルシフェラーゼレベルを、(図6A)GFPプラスミドまたは(図6B)プレ−miR−19b過剰発現(OE)プラスミドによるトランスフェクションの後において例示するグラフである;図6C〜図6Eは、高い内因性miR−19レベルを発現するHEK293T細胞において測定される正規化されたルシフェラーゼレベルを例示するグラフである。(図6C)対照プラスミドによるトランスフェクション、(図6D)対照としてmiR−19bノックダウン(KD)プローブまたはスクランブル化プローブによるトランスフェクション、および、(図6E)miR−19bのmiArrestプラスミドまたは対照のmiArrestプラスミドによるトランスフェクション。***P<0.005。ウミシイタケルシフェラーゼ活性をホタルルシフェラーゼの発現レベルによって正規化し、対照処置の存在時における変異型形態のAdrb1−3’UTR(Adrb1−mut)によって達成される活性の比率として示した。

0094

図7A−7Bは、扁桃体におけるmiRNAの示差的発現を示す。図7A〜図7Bは、急性ストレス後90分での扁桃体におけるmiRNAの示差的発現を例示するグラフである。図7Aはagilentアレイの結果を例示する。図7Bはaffymetrixアレイの結果を例示する。正規化された値が、条件の全体にわたる平均強度に対してプロットされるスポット強度のlog2比率(ストレス対対照)として示される(N=2,2)。それぞれのmiRNAの強度を生物学的反復の全体にわたる平均正規化強度として計算した。miR−15aおよびmiR−15bが赤色で示される。miR−124、すなわち、ストレスプロトコルによって影響されない十分に確立されたニューロンマーカーが、白色で示される。
図7C−7Dは、扁桃体におけるmiRNAの示差的発現を示す。図7Cは、miR−15aおよびmiR−15bが半保存的なシード一致部を副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン1型受容体の3’UTRに有することを例示する[CRHR1、targetscan(dot)orgからの改編];図7Dは、miR−15b−EGFP過剰発現プラスミドまたはGFP発現プラスミドと、CRFR1−3’UTRによって制御されるルシフェラーゼレポータープラスミドとにより共トランスフェクションされたHEK293T細胞において測定されるルシフェラーゼ活性を例示するグラフである。ウミシイタケルシフェラーゼ活性をホタルルシフェラーゼの発現レベルによって正規化した。

0095

図8は、miR−182がおそらくはHtr1aの3’UTRを標的とすることを示すルシフェラーゼレポーターアッセイ結果を例示するグラフである。ルシフェラーゼアッセイのデータは、記載された遺伝子の3’UTRおよび空ベクター、または、特定のmiRを過剰発現するベクターによりトランスフェクションされたHEK293細胞における共トランスフェクションされたホタルルシフェラーゼレポーターの活性に対して正規化されるウミシイタケルシフェラーゼ活性を示す。

0096

図9は、長期の社会的敗北の後における低下した発現についての傾向を示す、成体マウスのDRNにおけるmiR−182発現レベルのリアルタイムPCR結果を例示するグラフである。データは平均±SEMを表す。n=7(対照)および18(社会的敗北群におけるマウス)、#=p=0.1。

0097

図10は、2つのアルゴリズムにおけるmiR−182の標的についてのインシリコ生物情報学予測を表すバンダイアグラム、ならびに、この予測において現れる正常なニューロン機能および病理学的ニューロン機能について大きな関連性がある潜在的な標的遺伝子のリストである。

0098

図11A−11Cは、miR−182の過剰発現またはノックダウンを示す。図11Aは、miR−182の過剰発現のためのレンチウイルスの概略的例示である;図11Bは、N2A細胞株におけるインビトロでのmiR−182の過剰発現を示すリアルタイムPCR結果を例示するグラフである;図11Cは、miR−182のノックダウンのためのレンチウイルスの概略的例示である。

0099

図12A−12Dは、NRI投与後のPFCにおけるmiR−19レベルを示す。NRIのレボキセチンを急性(1回)または長期(18日間)のどちらかで投与した。注目すべきことに、miR−19aおよびmiR−19bのレベルがNRIの急性投与の後ではPFCにおいて低下し(それぞれ、図12Aおよび図12B)、しかし、NRIの長期投与の後では増大した(それぞれ、図12Cおよび図12D)。

0100

図13A−13Dは、社会的敗北に供されたマウスのPFCおよび扁桃体におけるmiR−19レベルを示す。miR−19aおよびmiR−19bのレベルを、社会的敗北パラダイムに供されたマウスから採取される扁桃体からの試料において測定した。注目すべきことに、PFCにおけるmiR−19aおよびmiR−19bのレベルが、対照マウスに対して、社会的敗北に対する「感受性あり」として分類されるマウスにおいて上昇した(それぞれ、図13Aおよび図13B)。miR−19のレベルはまた、対照マウスに対して、社会的敗北に対する「感受性あり」として分類されるマウスの扁桃体において上昇した(それぞれ、図13Cおよび図13D)。

0101

図14は、miRNA−19bがCB1の3’UTRを標的とすることを示す。CB1の3’UTR、および、miR−19bまたはGFP対照のどちらかを過剰発現するプラスミドによるHT−22細胞のトランスフェクションは、正規化されたルシフェラーゼレベルにおける50%の低下を引き起こした。

0102

図15Aは、マウス脳の冠状切片の概略的例示である。図15Aは、BLAを含む脳におけるいくつかの核を示す(PaxinosおよびFranklinによるマウス脳からの改編)。
図15Bは、マウス脳の冠状切片の概略的例示である。図15Bは脳におけるCB1分布を示す(Allen Brain Atlasからの改編、www.mouse.brain−map.org/)。注目すべきことに、CB1がBLAに多く存在することがこの分布によって明らかである。

0103

図16は、扁桃体の基底外側核(BLA)における記憶固定についての提案された機構の概略的例示である。コルチコステロン(CORT)が、内在性カンナビノイド(eCB)の合成を誘導するためにGs−cAMPPK経路を活性化する未だ特徴確認されていない膜結合型グルココルチコイド受容体(mbGR)に結合する。内在性カンナビノイドが、GABA作動性終末部におけるCB1受容体に結合し、これにより、GABA放出を阻害するシナプスの中に放出される。GABA放出のこの阻害がノルエピネフリン(NE)放出を脱抑制し、シナプス後のβ−アドレナリン受容体のNE活性化を増大させ、これにより、情動的嫌悪記憶の固定を増大させる。

0104

図17A−17Bは、RISC複合体におけるAgo2を例示する。図17Aは、miRNAとmRNAとの相互作用を伝達するRISC複合体におけるAgo2の概略例示である;図17Bは、抗Ago2抗体を用いて行われたウエスタンブロット分析を例示する。このIPは、Ago2抗体により1回、IgG1対照により1回沈殿させられた全脳試料を比較したときに認められ得るように、Ago2タンパク質に対して特異的であった。注目すべきことに、Ago2タンパク質は、IgG1対照により沈殿させられた試料においては検出されなかった。

0105

図18A−18Dは、社会的回避試験を示す。マウスを、慣らすために単独で3分間迷路に置き(図18Aおよび図18B)、マウスの動きを記録し、プロットした。3分後、ノーバル(noval)ICRマウスを、被験マウスの隣のチャンバーに置き(図18Cおよび図18D)、被験マウスの動きを再び記録し、プロットした。

0106

図19Aは、アレイでアップレギュレーションされる選択されたmiRNAのヒートマップ例示を示す。

0107

図19Bは、アレイでダウンレギュレーションされる選択されたmiRNAのヒートマップ例示を示す。

0108

図20Aは、マイクロアレイ結果からのmiR−15aのlog2発現を示す。それぞれの赤色ドットがアレイの1回の反復を示す。対照群(CNT)は4回の反復を有し、「感受性あり」群(SUSC)は3回の反復を有し、「立ち直りが速い」群(RESIL)は3回の反復を有した。黒色線により、それぞれの群における反復の平均を示した。
図20Bは、マイクロアレイ結果からのFKBP5のlog2発現を示す。それぞれの赤色ドットがアレイの1回の反復を示す。対照群(CNT)は4回の反復を有し、「感受性あり」群(SUSC)は3回の反復を有し、「立ち直りが速い」群(RESIL)は3回の反復を有した。黒色線により、それぞれの群における反復の平均を示した。

0109

図20CはマウスFKBP5の3’UTR配列を示す(targetscan.orgから採用)。

0110

図21A−21Bは、社会的敗北後の対照に対して、「感受性あり」マウスにおける扁桃体のmiR−15aのレベル(図21A)およびFKBP5のレベル(図21B)を示す。注目すべきことに、miR−15aのレベルが、社会的敗北に供され、かつ、「感受性あり」として特徴づけられるマウスの扁桃体において上昇した(図21A)。FKBP5のレベルが、社会的敗北に供され、かつ、「感受性あり」として特徴づけられるマウスの扁桃体において低下した(図21B)。

0111

図22は、Stx1a、Sgk1およびAdrb2の3’UTRの概略的例示である(これらはそれぞれが単一のmiRNA−15結合部位を有する)。

0112

図23は、対照マウスに対して、社会的敗北に供されたマウスにおける扁桃体のmiR−181のレベルを示す。注目すべきことに、miR−181のレベルが、社会的敗北に供されたマウスの扁桃体において上昇した。

0113

図24は、miR−181およびグルタミン酸受容体についての生物情報学予測を組み合わせることを表すバンダイアグラムを示す。

0114

図25は、miR−181の6個の潜在的標的の完全な3’UTRの概略的例示である。

0115

図26は、ストレス後の縫線核におけるmiR182の発現レベルを示す。注目すべきことに、急性30分不動ストレスは、リアルタイムPCRによって測定されるように、ストレス後24時間で試験されたとき、RNにおけるmiR182の低下した発現レベルを引き起こした。**=P<0.01;n=8(各群)。

0116

図27A−27Cは、miR182が、DSCAM、L1CAMおよびTSNAXの3’UTRを標的とすることを示す、ルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を示す。図27Aは、記載された遺伝子の3’UTRおよび空ベクター、または、特定のmiRを過剰発現するベクターによりトランスフェクションされたN2a細胞における共トランスフェクションされたホタルルシフェラーゼレポーターの活性に対して正規化されるウミシイタケルシフェラーゼ活性を示す、ルシフェラーゼアッセイのデータを例示する。L1cam(図27B)およびTsnax(図27C)の3’UTRにおけるmiR182シード一致部での変異はmiR182の抑制効果を阻止した。バーは平均±s.e.m.を表す。*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001。

0117

図28A−28Dは、扁桃体(AMY)および前頭前皮質(PFC)におけるmiR135の発現を示す。図28Aは、急性SSRIおよびNRIがmiR135aレベルをAMYにおいて増大させたことを例示する;図28Bは、AMYにおけるmiR135bレベルが、生理的食塩水と比較して、SSRIまたはNRIの急性投与によってアップレギュレーションされたことを例示する;図28Cは、長期SSRIがmiR135aレベルをPFCにおいて低下させたことを例示する;図28Dは、PFCにおけるmiR135bレベルが急性SSRIまたはNRIによってアップレギュレーションされ、長期SSRI処置によって低下したことを例示する。n=7〜8(各群)。*=P<0.05、**=P<0.01;***=P<0.0001。

0118

図29A−29Bは、社会的敗北後のマウスの循環系における増大したmiR135レベルを示す。社会的敗北後2週間でのマウスの血漿におけるmiR135aレベル(図29A)およびmiR135bレベル(図29B)が、対照マウスと比較して著しく増大した(**=P<0.01、n=7〜16(各群))。

0119

図30A−30Bは、インビトロおよびインビボにおけるmiR135KDの検証を示す。図30A〜図30Bは、miR135がHtr1a(図30A)またはslc6a4(図30B)を標的とすることがmiR135bのKD構築物によって阻止されたことを示す、ルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を例示する。
図30C−30Eは、インビトロおよびインビボにおけるmiR135KDの検証を示す。図30Cは、miR135bKDウイルスベクターおよび対照ウイルスベクターの概略的例示である;図30D〜図30EはDRN注入部位の例示である(図30DはPaxsinosからの採用である);図30Eは、miR135KDレンチウイルスを感染させたDRNのGFP染色である。

0120

図31A−31Bは、miR135KDマウスにおける増大した不安様行動およびSSRIに対する弱化した応答を示す。図31Aは、miR135KDマウスの行動がオープンフィールド試験において対照マウスと類似していたことを例示する;図31Bは、高架式十字迷路において、対照マウスと比較して、miR135KDマウスにおける増大した不安様行動を例示する。不動時間が両方の群においてSSRIによって減少し、しかしながら、その減少が、試験の最後の2分において、対照と比較して、miR135KDマウスでは弱まった。〜=p<0.1 *=p<0.05;**=p<0.01;***=p<0.001。n=10〜11(各群)。
図31C−31Eは、miR135KDマウスにおける増大した不安様行動およびSSRIに対する弱化した応答を示す。図31Cは、明暗所移動試験において、miR135KDマウスが、急性ストレスの後ではなく、基礎ストレス条件のもとでは、対照マウスと比較して、明るいチャンバーにおいてより多くの時間を過ごしたことを例示する;図31Dは、miR135KDマウスが、急性ストレスの後ではなく、基礎的ストレス条件のもとでは、対照マウスと比較して、明るいチャンバーをより多く訪れたことを例示する;図31Eは、miR135KDマウスが、急性ストレスの後ではなく、基礎的ストレス条件のもとでは、対照マウスと比較して、明るいチャンバーにおいてそれほど多くの距離を移動しなかったことを例示する。不動時間が両方の群においてSSRIによって減少し、しかしながら、その減少が、試験の最後の2分において、対照と比較して、miR135KDマウスでは弱まった。〜=p<0.1 *=p<0.05;**=p<0.01;***=p<0.001。n=10〜11(各群)。
図31F−31Gは、miR135KDマウスにおける増大した不安様行動およびSSRIに対する弱化した応答を示す。図31Fは、基礎的条件およびSSRI投与後の両方で尾懸垂試験において、miR135KDマウスと対照マウスとの間に差がないことを例示しており、それにもかかわらず、不動時間の減少が、両方の群において、基礎的条件と比較して、SSRI処置の後で認められた。(図31F〜図31G)。不動時間が両方の群においてSSRIによって減少し、しかしながら、その減少が、試験の最後の2分において、対照と比較して、miR135KDマウスでは弱まった。〜=p<0.1 *=p<0.05;**=p<0.01;***=p<0.001。n=10〜11(各群)。

0121

図32は、miR135マウスの誘導可能な過剰発現系の概略的例示である。miR135a配列の前のloxP化トランザクショナル停止およびGFPレポーターを発現するトランスジェニックマウス。変異トランスジェニックマウスはmiR135aを5−HTのePet陽性細胞においてのみ発現する。

0122

図33A−33Cは、miR135を5−HTニューロンにおいて過剰発現するマウス系統の検証を示す。図33Aは、miR135が、対照マウスと比較して、miR135OEマウスのRNにおいて過剰発現されたことを例示する。図33B〜図33Cは、miR135標的遺伝子のmRNAが、Slc6a4(図33B)およびHtr1a(図33C)の両方について、miR135OEマウスのRNにおいてダウンレギュレーションされたことを例示する。#=p<0.1 *=p<0.05;n=4(各群)。

0123

図34A−34Cは、miR135OEマウスにおける社会的敗北後での低下した不安およびうつ病様行動を示す。図34Aは、miR135OEマウスが、低下した不安様行動をオープンフィールド試験において有することを示す;図34Bは、明暗所移動試験におけるmiR135OEマウスの、対照と比較してより少ない不安様行動を示す;図34Cは、miR135OEマウスの高架式十字迷路における、対照と比較して低下した不安様行動を示す。#=p<0.1 *=p<0.05;**=p<0.01。n=7〜11(各群)。
図34D−34Eは、miR135OEマウスにおける社会的敗北後での低下した不安およびうつ病様行動を示す。図34Dは、尾懸垂試験において、対照と比較して、miR135OEマウスの不動時間の減少に向かう傾向を示す;図34Eは、強制水泳試験において、対照と比較して、miR135OEマウスにおける減少した不動時間を示す。#=p<0.1 *=p<0.05;**=p<0.01。n=7〜11(各群)。

0124

本発明はそのいくつかの実施形態において、ミクロRNAに関連し、より具体的には、しかし、限定ではなく、疾患を診断し、モニターし、また、処置するための該ミクロRNAの使用に関連する。

0125

本発明の原理および操作は、図面および付随する説明を参照してより良く理解されることができる。

0126

本発明の少なくとも1つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明に示される細部、または、実施例によって例示される細部に必ずしも限定されないことを理解しなければならない。本発明は他の実施形態が可能であり、あるいは、様々な方法で実施、または、実行される。また、本明細書中において用いられる表現法および用語法は説明のためであって、限定として見なされるべきでないことを理解しなければならない。

0127

調節不全のセロトニン作動性活性と、精神医学的障害(例えば、不安およびうつ病など)とのつながりがこれまでに立証されており、それにもかかわらず、これらの病理の根底にある分子的機構は完全には理解されていない。ミクロRNA(miR)は、遺伝子発現を転写後に調節し、脳に多く存在する小さいRNA分子のサブセットである。

0128

本発明を実施に移しているとき、本発明者らは、特定のミクロRNA(miR)が、セロトニン(5HT)神経膠関連遺伝子の調節に関与していること、したがって、異常なセロトニンレベルに伴う医学的状態(例えば、精神医学的障害など)を調整することに関与していることを発見した。

0129

本明細書中下記および下記の実施例の節において例示されるように、本発明者らは、5HTレポーターマウス(ePET−YFP)の縫線核(RN)から得られる5HTニューロンにおけるmiR発現パターンを、miRマイクロアレイを使用して明らかにした(下記の実施例の節における表2A〜表2B参照)。アレイから得られるセロトニン作動性ニューロンの特異なmiR発現プロフィルを生物情報学的に分析して、重要なセロトニン作動性関連遺伝子(例えば、セロトニン輸送体(Slc6a4、図1D)、セロトニン自己受容体(Htr1a、図1E)、トリプトファンヒドロキシラーゼ2(Tph2、図1F)およびモノアミンヒドロキシラーゼ(MaoA、図1G)など)を標的とすることが推定されるmiRを特定した。これらの遺伝子についての3’UTRのmiRNA標的化をさらに、5HTニューロン遺伝子を特異的に標的とし、これらを調節する特定のmiR(例えば、miR−135)を例示してインビトロで試験した(図1H〜図1Iおよび図2C〜図2D参照)。本発明者らはさらに、miR135の発現レベルが、急性ストレスの後で(図3A〜図3D)、また、抗うつ剤による処置の後で(図3E〜図3J)、RNおよび血漿において改変されることを例示している。成体マウスのRNにおけるインビボでのmiR−135の過剰発現は社会的敗北の後におけるうつ病様行動を低下させた(図4A〜図4H)。そのうえ、本発明者らは、(Htr1aの直接的な抑制を介した)ニューロン活性調節因子としてのmiR−182の活性(図8)、および、精神病理学的行動の調節因子としてのmiR−182の活性(図9)、ならびに、[CRH1R(図7A〜図7B)、FK506結合タンパク質5(FKBP5)(図21A〜図21B)、ならびに、Stx1a、Sgk1およびAdrb2(図22)の直接的な抑制を介した]ストレス応答の調節因子としてのmiR−15の活性を例示している。本発明者らはまた、miR−19によるベータアドレナリン作動性受容体(Adrb1)およびカナビノイド受容体1(CB1)の特異的な標的化を例示している。miR−19の過剰発現はAdrb1を抑制し(図6A〜図6C)、一方、miR−19のノックダウンはAdrb1の発現を高めた(図6D〜図6E)。miR−19の過剰発現はまた、CB1を抑制した(図14)。本発明者らはまた、miR−181についての標的を発見している。具体的には、本発明者らは、miR−181がグルタミン酸受容体を特異的に調節することを例示している(図24および図25)。まとめると、これらの結果は、miR−135、miR−335、miR−181、miR−182、miR−26、miR−27、miR−15およびmiR−19などのmiRNAまたは当該miRNAを調節する配列の、治療様式としての使用を実証するものである。

0130

従って、本発明の1つの局面によれば、セロトニンレベルの上昇が治療上有益である医学的状態を処置の必要性のある対象において処置する方法であって、少なくとも1つのミクロRNAまたはその前駆体をコードする外因性ポリヌクレオチドを上記対象の細胞に投与し、または、上記対象の細胞において発現させることを含む方法が提供される。

0131

特定の実施形態によれば、セロトニンレベルの上昇が治療上有益である医学的状態を処置するために、ミクロRNAはmiR−135、miR−335、miR−26およびmiR−182を含む。

0132

本発明の別の局面によれば、アドレナリンまたはノルアドレナリンの低いレベルが治療上有益である医学的状態を処置の必要性のある対象において処置する方法であって、ミクロRNAまたはその前駆体をコードする外因性ポリヌクレオチドを上記対象の細胞に投与し、または、上記対象の細胞において発現させることを含む方法が提供される。

0133

特定の実施形態によれば、アドレナリンまたはノルアドレナリンの低いレベルが治療上有益である医学的状態を処置するために、ミクロRNAはmiR−19を含む。

0134

本発明の別の局面によれば、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン(CRH)の低いレベルが治療上有益である医学的状態を処置の必要性のある対象において処置する方法であって、ミクロRNAまたはその前駆体をコードする外因性ポリヌクレオチドを上記対象の細胞に投与し、または、上記対象の細胞において発現させることを含む方法が提供される。

0135

特定の実施形態によれば、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン(CRH)の低いレベルが治療上有益である医学的状態を処置するために、ミクロRNAはmiR−15を含む。

0136

本発明の別の局面によれば、グルタミン酸受容体の低いレベルが治療上有益である医学的状態を処置の必要性のある対象において処置する方法であって、ミクロRNAまたはその前駆体をコードする外因性ポリヌクレオチドを上記対象の細胞に投与し、または、上記対象の細胞において発現させることを含む方法が提供される。

0137

1つの具体的な実施形態によれば、グルタミン酸受容体の低いレベルが治療上有益である医学的状態を処置するために、ミクロRNAはmiR−181を含む。

0138

用語「処置(治療)する」は、疾患、障害もしくは状態の発症を阻害すること、もしくは停止させること、および/または、疾患、障害もしくは状態の軽減、寛解もしくは退行を生じさせること、あるいは、疾患、障害もしくは医学的状態を、当該疾患、障害もしくは状態について危険性があるかもしれないが、当該疾患、障害もしくは状態を有すると未だ診断されていない対象において生じさせないことを示す。当業者は、様々な方法論およびアッセイが、疾患、障害もしくは状態の発症を評価するために使用され得ること、また、同様に、様々な方法論およびアッセイが、疾患、障害もしくは状態の軽減、寛解もしくは退行を評価するために使用され得ることを理解するであろう。

0139

本明細書中で使用される場合、用語「対象」には、哺乳動物、好ましくは、どのような年齢であれ、上記病理に苦しむヒトが含まれる。好ましくは、この用語は、上記病理を発現する危険性がある個体を包含する。

0140

本明細書中で使用される場合、表現「セロトニンレベルの上昇が治療上有益である医学的状態」は、セロトニンのレベルを増大させることにより、(本明細書中下記でさらに詳述されるように)、それに伴う疾患または医学的症状の発生が妨げられ得るか、あるいは、それに伴う疾患進行または医学的症状が停止され得る疾患または障害を示す。

0141

本明細書中で使用される場合、用語「セロトニン」は、[5−ヒドロキシトリプタミン(5−HT)としても示される]モノアミン神経伝達物質を示す。セロトニンは、例えば、CAS番号50−67−9で示される。

0142

1つの実施形態によれば、セロトニンレベルをシナプス間隙において増大させる方法であって、少なくとも1つのミクロRNAまたはその前駆体をコードする外因性ポリヌクレオチドを対象の神経膠細胞(例えば、セロトニン作動性ニューロン)に投与するか、または、対象の神経膠細胞(例えば、セロトニン作動性ニューロン)において発現させることを含む方法が提供される。

0143

本明細書中で使用される場合、用語「シナプス間隙」は、電気的または化学的シグナルが通過する2つのニューロンの間の領域を示す。

0144

「神経膠細胞」は、ニューロンまたはグリア細胞(例えば、乏突起膠細胞または星状膠細胞)を示す。

0145

本明細書中で使用される場合、用語「セロトニン作動性ニューロン」は、セロトニンを分泌するか、または、セロトニンの再取り込み(すなわち、その細胞表面に発現されるセロトニン輸送体による)が可能であるニューロンを示す。

0146

セロトニンレベルの上昇が治療上有益である医学的状態は、例えば、うつ病、不安、ストレス、疲労、損なわれた認知機能、パニック発作、脅迫行動、嗜癖、社会恐怖を含むあらゆる気分障害、睡眠障害、食品関連障害、成長障害および生殖障害を含み得る。

0147

1つの具体的な実施形態によれば、セロトニンレベルの上昇が治療上有益である医学的状態はうつ病を含む。

0148

1つの実施形態によれば、医学的状態がうつ病または不安であるとき、ミクロRNAはmiR−135である。

0149

うつ病または不安は必ずしもセロトニンに関連づけられない可能性があるものとする。

0150

本明細書中で使用される場合、表現「アドレナリンまたはノルアドレナリンの低いレベルが治療上有益である医学的状態」は、アドレナリンまたはノルアドレナリンの発現または活性を低下させることにより、(本明細書中下記でさらに詳述されるように)、それに伴う疾患または医学的症状の発生が妨げられ得るか、あるいは、それに伴う疾患進行または医学的症状が停止され得る疾患または障害を示す。

0151

本明細書中で使用される場合、用語「アドレナリン」は、(エピネフリンとしても知られている)ホルモンおよび神経伝達物質を示す。アドレナリンは、例えば、CAS番号51−43−4で示される。

0152

本明細書中で使用される場合、用語「ノルアドレナリン」は、(ノルエピネフリンとしても知られている)ホルモンおよび神経伝達物質として作用するカテコールアミンを示す。ノルアドレナリンは、例えば、CAS番号(l)51−41−2(l)および同138−65−8(dl)で示される。

0153

アドレナリンまたはノルアドレナリンの低いレベルが治療上有益である医学的状態は、例えば、ストレス関連障害、不安、記憶障害、心臓の病気(例えば、動悸頻脈不整脈)、頭痛振戦高血圧および急性肺水腫を含み得る。

0154

本明細書中で使用される場合、表現「副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン(CRH)の低いレベルが治療上有益である医学的状態」は、CRHの発現または活性を低下させることにより、(本明細書中下記でさらに詳述されるように)、それに伴う疾患または医学的症状の発生が妨げられ得るか、あるいは、それに伴う疾患進行または医学的症状が停止され得る疾患または障害を示す。

0155

本明細書中で使用される場合、用語「副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン(CRH)」は、(副腎皮質刺激ホルモン放出因子(CRF)またはコルチコリベリンとしても知られている)ポリペプチドホルモンおよび神経伝達物質を示す。CRHは、例えば、NP_000747.1で示される。

0156

CRHの低いレベルが治療上有益である医学的状態は、例えば、ストレス、うつ病、不安、疲労、損なわれた認知機能、パニック発作、脅迫行動、嗜癖、社会恐怖、睡眠障害、食品関連障害、成長障害、生殖障害および肥満を含み得る。

0157

本明細書中で使用される場合、表現「グルタミン酸受容体の低いレベルが治療上有益である医学的状態」は、グルタミン酸受容体の発現または活性を低下させることにより、(本明細書中下記でさらに詳述されるように)、それに伴う疾患または医学的症状の発生が妨げられ得るか、あるいは、それに伴う疾患進行または医学的症状が停止され得る疾患または障害を示す。

0158

本明細書中で使用される場合、用語「グルタミン酸受容体」は、典型的にはニューロン細胞の膜に位置するシナプス受容体を示す(例えば、Grm1、Grik3、Grm5、Gria2、Grik2およびGrm7)。グルタミン酸受容体は、例えば、NP_000822.2[グルタミン酸受容体イオンチャネル型カイニン酸3(Grik3)];NP_000817.2、NP_001077088.1、NP_001077089.1[グルタミン酸受容体イオンチャネル型AMPA2(Gria2)];NP_001159719.1、NP_068775.1、NP_786944.1[グルタミン酸受容体イオンチャネル型カイニン酸2(Grik2)];NP_000833.1、NP_001137303.1[グルタミン酸受容体代謝型5(Grm5)];NP_000835.1、NP_870989.1[グルタミン酸受容体代謝型7(Grm7)];NP_000829.2、NP_001107801.1[グルタミン酸受容体代謝型1(Grm1)]で示される。

0159

グルタミン酸受容体の低いレベルが治療上有益である医学的状態は、例えば、てんかん発作(例えば、てんかん)、ハンチントン病、統合失調症、脆弱X症候群、全般性不安障害および癌(例えば、メラノーマ)を含み得る。

0160

本明細書中で使用される場合、用語「ミクロRNAまたはその前駆体」は、転写後の調節因子として作用するミクロRNA(miRNA)分子を示す。ミクロRNAは典型的には、プレ−miR(プレ−ミクロRNA前駆体)からプロセッシングされる。プレ−miRは、例えば、培養細胞にトランスフェクションされたとき、機能的なmiRNAに効率よくプロセッシングされる、RNAポリメラーゼIIIによって転写される一組の前駆体miRNA分子である。プレ−miRを使用して、特異的なmiRNA活性を、このmiRNAを通常は発現しない細胞型において誘発することができ、したがって、その標的の機能を、その発現を「(miRNA)機能獲得」実験においてダウンレギュレーションすることによって検討することができる。様々なプレ−miR設計が、miRNA Registryにおいて列挙されている公知miRNAのすべてに対して存在しており、また、どのような研究のためにでも容易に設計され得る。ミクロRNAは、本明細書中下記でさらに記載するように、細胞自体に投与されるか、または、核酸構築物中に連結される前駆体分子からコードされる場合がある。

0161

本教示のミクロRNAは、どのようなミクロRNA標的であれ、標的との結合、標的への結合、標的の調節、標的のプロセッシング、標的の妨害、標的の増強、標的の安定化および/または標的の脱安定化をもたらし得るものとする。そのような標的は、DNA分子、RNA分子およびポリペプチド(これらに限定されない)を含む、いかなる分子でもあり得、例えば、セロトニン関連遺伝子、例えば、セロトニン輸送体(すなわち、SERTまたはSlc6a4)、セロトニン阻害受容体1a(Htr1a)、トリプトファンヒドロキシラーゼ2(Tph2)およびモノアミンヒドロキシラーゼ(MaoA)など;アドレナリンまたはノルアドレナリン受容体(アドレナリン作動性受容体、例えば、Adr1など);アデニル酸シクラーゼ1型(ADCY1);CRH受容体、例えば、Crh1Rなど;または、任意の他の分子、例えば、FK506結合タンパク質5(FKBP5)、カナビノイド受容体1(CB1)、ダウン症候群細胞接着分子(Dscam)、トランスリン会合タンパク質X(Tsnax)および細胞接着分子L1(L1cam)など(これらに限定されない)が可能である(すべてが本明細書中下記でさらに詳しく記載される)。

0162

本発明のミクロRNAが、例えば、ミクロRNA登録(http://wwwdotssangerdotacdotuk/Software/Rfam/mirna/indexdotshtml)を含めて、様々なデータベースを介して同定され得るものとする。

0163

本発明の方法は、ミクロRNAをコードする外因性ポリヌクレオチドを対象に投与することによって、または、対象の細胞において発現させることによって達成され得る。

0164

用語「ポリヌクレオチド」は、リボ核酸(RNA)、デオキシリボ核酸(DNA)またはそれらの模倣体一本鎖または二本鎖オリゴマーまたはポリマーを示す。この用語には、自然界に存在する核酸分子(例えば、RNAまたはDNA)に由来するポリヌクレオチドおよび/またはオリゴヌクレオチド、自然界に存在する塩基、糖および共有結合性ヌクレオシド間連結(例えば、骨格)から構成される合成ポリヌクレオチド分子および/またはオリゴヌクレオチド分子、同様にまた、自然界に存在するそれぞれの部分と同様に機能する自然界に存在しない部分を有する合成ポリヌクレオチドおよび/またはオリゴヌクレオチドが含まれる。

0165

本発明のポリヌクレオチドの長さは、必要に応じて100ヌクレオチド以下、必要に応じて90ヌクレオチド以下、必要に応じて80ヌクレオチド以下、必要に応じて70ヌクレオチド以下、必要に応じて60ヌクレオチド以下、必要に応じて50ヌクレオチド以下、必要に応じて40ヌクレオチド以下、必要に応じて30ヌクレオチド以下(例えば、29ヌクレオチド、28ヌクレオチド、27ヌクレオチド、26ヌクレオチド、25ヌクレオチド、24ヌクレオチド、23ヌクレオチド、22ヌクレオチド、21ヌクレオチド、20ヌクレオチド、19ヌクレオチド、18ヌクレオチド、17ヌクレオチド、16ヌクレオチド、15ヌクレオチド)、必要に応じて12ヌクレオチド〜24ヌクレオチドの間、必要に応じて5ヌクレオチド〜15ヌクレオチドの間、必要に応じて5ヌクレオチド〜25ヌクレオチドの間、最も好ましくは約20〜25ヌクレオチドである。

0166

本発明の教示に従って設計されるポリヌクレオチド(オリゴヌクレオチドを含む)は、酵素的合成または固相合成の両方を含めて、当技術分野で知られている任意のオリゴヌクレオチド合成法に従って作製することができる。固相合成を実行するための様々な設備および試薬が、例えば、Applied Biosystemsから市販されている。そのような合成のための他の手段があれば、それらもまた用いることができる;オリゴヌクレオチドの実際の合成は十分に当業者の能力の範囲内であり、固相化学(例えば、シアノエチルホスホルアミダイト)、その後、脱保護、脱塩および精製(例えば、自動化されたトリチルオン法またはHPLCによる)を利用して、例えば、下記において詳しく記載されるような確立された方法論により達成することができる:Sambrook、J.およびRussell,D.W.(2001)、“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”;Ausubel,R.M.他編(1994、1989)、“Current Protocols in Molecular Biology”、第I巻〜第III巻、John Wiley &Sons、ボルチモア、メリーランド;Perbal,B.(1988)、“A Practical Guide to Molecular Cloning”、John Wiley & Sons,ニューヨーク;およびGait,M.J.編(1984)、“Oligonucleotide Synthesis”。

0167

RNA分子を含むポリヌクレオチドは、本明細書中下記でさらに記載されるような発現ベクターを使用して作製され得るものとする。

0168

好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは修飾ポリヌクレオチドである。ポリヌクレオチドは、当技術分野で知られている様々な方法を使用して修飾することができる。

0169

例えば、本発明のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、3’から5’へのホスホジエステル連結で結合する、プリン塩基およびピリミジン塩基からなる複素環式ヌクレオシドを含み得る。

0170

好ましく使用されるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、本明細書中下記で幅広く記載されるように、骨格、ヌクレオシド間連結または塩基のいずれかにおいて改変されるものである。

0171

本発明のこの局面に従って有用である好ましいオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの具体的な例には、修飾された骨格または非天然型ヌクレオシド間連結を含有するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが含まれる。修飾された骨格を有するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドには、下記において開示されるように、リン原子を骨格に保持するものが含まれる:米国特許第4469863号、同第4476301号、同第5023243号、同第5177196号、同第5188897号、同第5264423号、同第5276019号、同第5278302号、同第5286717号、同第5321131号、同第5399676号、同第5405939号、同第5453496号、同第5455233号、同第5466677号、同第5476925号、同第5519126号、同第5536821号、同第5541306号、同第5550111号、同第5563253号、同第5571799号、同第5587361号および同第5625050号。

0172

好ましい修飾オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド骨格には、例えば、ホスホチオアートキラルなホスホロチオアート;ホスホロジチオアート;ホスホトリエステルアミノアルキルホスホトリエステル;メチルホスホナートおよび他のアルキルホスホナート(3’−アルキレンホスホナートおよびキラルなホスホナートを含む);ホスフィナートホスホルアミダート(3’−アミノホスホルアミダートおよびアミノアルキルホスホルアミダートを含む);チオノホスホルアミダート;チオノアキルホスホナート;チオノアルキルホスホトリエステル;ならびに、通常の3’−5’連結を有するボラノホスホナート、これらの2’−5’連結類似体、および、逆の極性を有するもの(この場合、ヌクレオシド単位の隣接対が、3’−5’から5’−3’に、または、2’−5’から5’−2’に連結される)が含まれる。上記修飾体の様々な塩、混合塩および遊離酸形態もまた使用することができる。

0173

別法として、リン原子を骨格に含まない修飾オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド骨格は、短鎖アルキルまたはシクロアルキルのヌクレオシド間連結、ヘテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキルの混合型ヌクレオシド間連結、あるいは、1つまたは複数の短鎖ヘテロ原子ヌクレオシド間連結または複素環ヌクレオシド間連結によって形成される骨格を有する。これらには、下記の米国特許において開示されるように、(部分的にはヌクレオシドの糖部分から形成される)モルホリノ連結;シロキサン骨格スルフィド骨格、スルホキシド骨格およびスルホン骨格;ホルムアセチル骨格およびチオホルムアセチル骨格;メチレンホルムアセチル骨格およびメチレンチオホルムアセチル骨格;アルケン含有骨格;スルファマート骨格;メチレンイミノ骨格およびメチレンヒドラジノ骨格;スルホナート骨格およびスルホンアミド骨格;アミド骨格を有するもの;ならびに、N、O、SおよびCH2の混合成分部分を有する他のものが含まれる:米国特許第5034506号、同第5166315号、同第5185444号、同第5214134号、同第5216141号、同第5235033号、同第5264562号、同第5264564号、同第5405938号、同第5434257号、同第5466677号、同第5470967号、同第5489677号、同第5541307号、同第5561225号、同第5596086号、同第5602240号、同第5610289号、同第5602240号、同第5608046号、同第5610289号、同第5618704号、同第5623070号、同第5663312号、同第5633360号、同第5677437号および同第5677439号。

0174

本発明に従って使用される場合がある他のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、糖およびヌクレオシド間連結の両方において修飾されるものであり、すなわち、ヌクレオチド単位の骨格が新規な基により置き換えられる。塩基単位は、適切なポリヌクレオチド標的との相補のために維持される。そのようなオリゴヌクレオチド模倣体の一例には、ペプチド核酸(PNA)が含まれる。PNAオリゴヌクレオチドは、糖−骨格がアミド含有骨格(特に、アミノエチルグリシン骨格)により置き換えられるオリゴヌクレオチドを示す。塩基は保持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合される。PNA化合物の調製を教示する米国特許には、米国特許第5539082号、同第5714331号および同第5719262号が含まれるが、これらに限定されない(これらのそれぞれが参照によって本明細書中に組み込まれる)。本発明において使用される場合がある他の骨格修飾が米国特許第6303374号に開示されている。

0175

本発明のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドはまた、塩基修飾または塩基置換を含む場合がある。本明細書中で使用される場合、「非修飾」塩基または「天然型」塩基には、プリン塩基のアデニン(A)およびグアニン(G)、ならびに、ピリミジン塩基のチミン(T)、シトシン(C)およびウラシル(U)が含まれる。「修飾(された)」塩基には、他の合成塩基および天然型塩基(これらに限定されない)が含まれ、例えば、5−メチルシトシン(5−me−C);5−ヒドロキシメチルシトシンキサンチンヒポキサンチン;2−アミノアデニン;アデニンおよびグアニンの6−メチル誘導体および他のアルキル誘導体;アデニンおよびグアニンの2−プロピル誘導体および他のアルキル誘導体;2−チオウラシル、2−チオチミンおよび2−チオシトシン;5−ハロウラシルおよびシトシン;5−プロピニルウラシルおよび5−プロピニルシトシン;6−アゾウシル、6−アゾシトシンおよび6−アゾチミン;5−ウラシル(プセウドウラシル);4−チオウラシル;8−ハロ、8−アミノ、8−チオール、8−チオアルキル、8−ヒドロキシおよび他の8−置換されたアデニンおよびグアニン;5−ハロ、特に5−ブロモ、5−トリフルオロメチルおよび他の5−置換されたウラシルおよびシトシン;7−メチルグアニンおよび7−メチルアデニン8−アザグアニンおよび8−アザアデニン;7−デアザグアニンおよび7−デアザアデニン;ならびに、3−デアザグアニンおよび3−デアザアデニンなどが含まれる。さらなる修飾塩基には、米国特許第3687808号;Kroschwitz,J.I.編(1990)、“The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering”、858頁〜859頁、John Wiley & Sons;Englisch他(1991)、“Angewandte Chemie”、International Edition、30、613;および、Sanghvi,Y.S.、“Antisense Research and Applications”、第15章、289頁〜302頁、S.T.CrookeおよびB.Lebleu編、CRCPress、1993に開示されているものが含まれる。そのような修飾塩基は、本発明のオリゴマー化合物結合親和性を増大させるために特に有用である。これらには、5−置換ピリミジン、6−アザピリミジン、ならびに、N−2−置換プリン、N−6−置換プリンおよびO−6−置換プリン(2−アミノプロピルアデニン、5−プロピニルウラシルおよび5−プロピニルシトシンを含む)が含まれる。5−メチルシトシン置換は、核酸二重鎖の安定性を0.6〜1.2℃増大させることが示されており(Sanghvi,Y.S.他(1993)、“Antisense Research and Applications”、276頁〜278頁、CRC Press、ボカラトン)、現時点では好ましい塩基置換であり、より一層具体的には、2’−O−メトキシエチル糖修飾と組み合わされた場合である。

0176

1つの具体的な実施形態によれば、本発明のmiRNAポリヌクレオチドは、配列番号58〜94で示される核酸配列を有する(表1A参照)。

0177

本明細書中上記で述べられるように、また、下記の実施例の節において示されるように、ミクロRNAは、特定の前駆体(すなわち、プレ−miRNA)に由来するプロセッシングされた分子であり、特異的なmiRNA機能のアップレギュレーションを、特定のmiRNA前駆体分子を使用して達成することができる。

0178

同様に意図されるものが、miRNAおよびその前駆体に対して相同的な配列である。相同性のレベルは、成熟型miRNAについては比較的高いものとするべきであるが、より大きな自由度が、配列変化が、成熟型miRに対応する核酸セグメントではなくヘアピン配列においてである限り、前駆体レベルでは許容される(例えば、少なくとも60%、70%、80%、85%、90%、95%またはそれ以上)。

0179

そのような前駆体ポリヌクレオチド作用物質は典型的には、発現構築物の一部として標的細胞(例えば、神経膠細胞または心臓細胞)に投与される。この場合、ポリヌクレオチド作用物質は、標的細胞(例えば、神経膠細胞または心臓細胞)におけるミクロRNAの発現を構成的または誘導可能な様式で行わせることができるシス作用調節要素(例えば、プロモーター)の制御下で核酸構築物において連結される。

0180

本発明のミクロRNAポリヌクレオチド作用物質の例には、miR−15(例えば、GenBank受入番号NR_029485RNA)、miR−19(例えば、GenBank受入番号NR_029489.1)、miR−26(例えば、GenBank受入番号NR_029500および同NR_029499)、miR−27(例えば、GenBank受入番号NR_029501RNA)、miR−135(例えば、GenBank受入番号NR_029677.1)、miR−335(例えば、GenBank受入番号NR_029899.1)、miR−181(例えば、GenBank受入番号NR_029611.1)およびmiR−182(例えば、GenBank受入番号NR_029614)が含まれるが、これらに限定されない。

0181

ニューロン細胞特異的プロモーターの例には、ニューロン特異的エノラーゼ遺伝子プロモーターシナプシンプロモーター、強化シナプシンプロモーター、カルシウムカルモジュリンプロモーターおよびThy1プロモーターが含まれるが、これらに限定されない。

0182

心臓細胞特異的プロモーターの例には、心臓NCX1プロモーターおよびα−ミオシン重鎖(αMHC)プロモーターが含まれるが、これらに限定されない。

0183

本発明の発現構築物はまた、当該ベクターを真核生物における複製および組み込みについて好適にするさらなる配列を含む場合がある(例えば、シャトルベクター)。典型的なクローニング用ベクターは、転写開始配列および翻訳開始配列(例えば、プロモーター、エンハンサー)、ならびに、転写ターミネーターおよび翻訳ターミネーター(例えば、ポリアデニル化シグナル)を含有する。本発明の発現構築物はさらに、エンハンサーを含むことができ、これは、プロモーター配列に対して近位または遠位に位置することができ、プロモーター配列からの転写をアップレギュレーションすることにおいて機能することができる。

0184

エンハンサー要素は、転写を連結されている同種プロモーターまたは異種プロモーターから1000倍にまで刺激することができる。エンハンサーは、転写開始部位の下流側または上流側に置かれたときに活性である。ウイルスに由来する多くのエンハンサー要素は広範な宿主範囲を有しており、また、様々な組織において活性である。例えば、SV40初期遺伝子エンハンサーが多くの細胞型について好適である。本発明のために好適である他のエンハンサー/プロモーターの組合せには、ポリオーマウイルスまたはヒトもしくはマウスのサイトメガロウイルス(CMV)、および、様々なレトロウイルス(例えば、マウス白血病ウイルスマウス肉腫ウイルスまたはラウス肉腫ウイルス、および、HIVなど)から得られる長い縦列反復(LTR)に由来する組合せが含まれる。Gluzman,Y.およびShenk,T.編(1983)、Enhancers and Eukaryotic Gene Expression(Cold Spring Harbor Press、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク)参照(これは参照によって本明細書中に組み込まれる)。

0185

ポリアデニル化配列もまた、検出可能な部分の発現効率を増大させるために本発明の発現構築物に加えることができる。2つの異なった配列要素が、正確かつ効率的なポリアデニル化のために要求される:ポリアデニル化部位の下流側に位置するGUリッチ配列またはUリッチ配列、および、この部位の11〜30ヌクレオチド上流側に位置する6ヌクレオチドの高度保存配列、すなわち、AAUAAA。本発明のために好適である終結シグナルおよびポリアデニル化シグナルには、SV40に由来するシグナルが含まれる。

0186

既に記載された実施形態に加えて、本発明の発現構築物は典型的には、クローン化された核酸の発現レベルを増大させるために、または、組換えDNAを有する細胞の特定を容易にするために意図される他の特化された要素を含有し得る。例えば、いくつかの動物ウイルスは、許容細胞型におけるウイルスゲノム染色体外複製を促進するDNA配列を含有する。これらのウイルスレプリコンを有するプラスミドは、適切な因子が、プラスミドで運ばれる遺伝子、または、宿主細胞ゲノムとともに運ばれる遺伝子のどちらかによって提供される限り、エピソームとして複製される。

0187

本発明の発現構築物は真核生物レプリコンを含む場合も、または含まない場合もがあり得る。真核生物レプリコンが存在するならば、ベクターは、真核生物細胞における増幅を、適切な選択マーカーを使用して行うことができる。構築物が真核生物レプリコンを含まないならば、エピソーム増殖を行うことができない。代わりに、組換えDNAが、操作された細胞のゲノムに一体化し、この場合、その細胞において、プロモーターにより、所望される核酸の発現が導かれる。

0188

核酸構築物は、適切な遺伝子送達ビヒクル/方法(トランスフェクション、形質導入など)および適切な発現系を使用して本発明の標的細胞(例えば、神経膠細胞または心臓細胞)に導入され得る。

0189

哺乳動物発現ベクターの例には、pcDNA3、pcDNA3.1(+/−)、pGL3、pZeoSV2(+/−)、pSecTag2、pDisplay、pEF/myc/cyto、pCMV/myc/cyto、pCR3.1、pSinRep5、DH26S、DHBB、pNMT1、pNMT41およびpNMT81(これらはInvitrogenから入手可能である)、pCI(これはPromegaから入手可能である)、pMbac、pPbac、pBK−RSVおよびpBK−CMV(これらはStrategeneから入手可能である)、pTRES(これはClontechから入手可能である)、ならびに、それらの誘導体が含まれるが、これらに限定されない。

0190

真核生物ウイルス(例えば、レトロウイルスなど)から得られる調節要素を含有する発現ベクターもまた使用することができる。SV40系ベクターには、例えば、pSVT7およびpMT2が含まれる。ウシパピローマウイルスに由来するベクターには、pBV−1MTHAが含まれ、エプスタインバールウイルスに由来するベクターには、pHEBOおよびp2O5が含まれる。他の例示的なベクターには、pMSG、pAV009/A+、pMTO10/A+、pMAMneo−5およびバキュロウイルスpDSVEが含まれる。

0191

脂質に基づく系が、これらの構築物を本発明の標的細胞(例えば、神経膠細胞または心臓細胞)に送達するために使用される場合がある。

0192

リポソームには、一定量を包む脂質二重層から構成されるあらゆる合成(すなわち、自然界に存在しない)構造が含まれる。リポソームは、エマルションフォームミセル不溶性単層物、液晶リン脂質分散物およびラメラ層などを含む。リポソームは、当技術分野における公知方法のいずれかによって調製され得る[Monkkonen,J.他、1994、J.Drug Target、2:299〜308;Monkkonen,J.他、1993、Calcif.Tissue Int.、53:139〜145;LasicDD.、Liposomes Technology Inc.、Elsevier、1993、63〜105(第3章);Winterhalter M、Lasic DD、Chem Phys Lipids、1993(9月)、64(1−3):35〜43]。リポソームは、正荷電、中性または負荷電であり得る。単核食細胞系(MPS)取り込みのために、リポソームは疎水性とすることができ、これは、リポソーム膜の(例えば、ポリエチレングリコール結合脂質および親水性粒子の使用による)親水性での遮蔽がMPS取り込みを受けにくくする場合があるからである。リポソームが、立体的に遮蔽された脂質(例えば、ガングリオシドGM1およびホスファチジルイノシトールなど)を含まないことまたも好ましく、これは、これらの脂質がMPS取り込みを妨げるからである。

0193

リポソームは単一脂質層であり得、または、多層状であり得る。治療剤が親水性であるならば、その送達が、大きい単層小胞を使用してさらに改善される場合があり、これは、それらの内部体積がより大きいからである。逆に、治療剤が疎水性であるならば、その送達が、多層小胞を使用してさらに改善される場合がある。別法として、治療剤(例えば、オリゴヌクレオチド)は脂質二重層を透過することができないことがあり得、結果として、リポソーム表面吸着されたままとなる。この場合には、リポソームの表面積を増大することにより、治療剤の送達がさらに改善される場合がある。本発明による好適なリポソームは非毒性のリポソームであり、例えば、ホスファチジルコリンホスホグリセロールおよびコレステロールから調製されるリポソームなどである。使用されるリポソームの直径は0.1〜1.0ミクロンの範囲であり得る。しかしながら、食作用細胞による食作用に好適である他のサイズ範囲もまた使用される場合がある。リポソームのサイズ調整を行うために、均質化が使用される場合があり、これは、大きいリポソームをより小さいリポソームに細分化するための剪断エネルギーに依拠する。都合よく使用され得るホモジナイザーには、Microfluidics(ボストン、マサチューセッツ)によって製造されるミクロフルイダイザーが含まれる。典型的な均質化手順において、リポソームは、選択されたリポソームサイズ観測されるまで、標準的な乳化ホモジナイザーに通して再循環される。粒子サイズ分布慣用的レーザービーム粒子サイズ識別によってモニターすることができる。小細孔のポリカルボナート膜または非対称セラミック膜に通したリポソームの押出しが、リポソームサイズを比較的十分に規定されたサイズ分布にまで小さくするための効果的な方法である。典型的には、懸濁物が、所望されるリポソームサイズ分布が達成されるまで1回または複数回、そのような膜に通して循環される。リポソームが、リポソームサイズを徐々に減少させるために、細孔が順次小さくなる膜に通して押し出される場合がある。

0194

当技術分野で知られている方法はどれも、ミクロRNAポリヌクレオチド作用物質をリポソームに取り込ませるために使用することができる。例えば、ミクロRNAポリヌクレオチド作用物質がリポソーム内カプセル化される場合がある。別法として、ミクロRNAポリヌクレオチド作用物質がリポソームの表面に吸着される場合がある。薬剤を本発明のリポソームに取り込ませるために使用される場合がある他の方法には、Alfonso他[The science and practice of pharmacy、Mack Publishing、イーストン、ペンシルベニア、第19版(1995)]によって記載された方法、および、Kulkarni他[J.Microencapsul.1995、12(3):229〜46]によって記載された方法がある。

0195

本発明の方法において使用されるリポソームは好ましくは、血液関門を越える。したがって、本発明のリポソームは好ましくは、血液関門を標的とする多糖(例えば、マンノース)をその膜部分に含まない。好ましくは、本発明のリポソームは、リポソームを血液関門上の受容体に対して標的化するペプチドをその膜部分に含まない。そのようなペプチドの例には、トランスフェリンインスリン、IGF−1、IGF−2、抗トランスフェリン受容体抗体、抗インスリン受容体抗体、抗IGF−1受容体抗体および抗IGF−2受容体抗体が含まれるが、これらに限定されない。

0196

本発明に従ってとりわけ好適であるリポソームを決定するために、例えば、米国特許出願公開第20040266734号および米国特許出願公開第20040266734号、ならびに、Danenberg他、Journal of cardiovascular pharmacology、2003、42:671〜9;Circulation、2002、106:599〜605;Circulation、2003、108:2798〜804に記載されたアッセイなどのスクリーニングアッセイを行うことができる。

0197

本発明のこの局面に従って使用することができる他の非脂質型ベクターには、ポリリシンおよびデンドリマーが含まれるが、これらに限定されない。

0198

発現構築物はまた、ウイルスであり得る。ウイルス構築物の例には、アデノウイルスベクターレトロウイルスベクターワクシニアウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ポリオーマウイルスベクターアルファウイルスベクター、ラブドウイルスベクター、レンチウイルスベクターおよびヘルペスウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されない。

0199

レトロウイルスベクターは、本発明との使用のために特に好適である一群のベクターを表す。欠陥レトロウイルスベクターが、遺伝子を哺乳動物細胞移入することにおいて常用されている(総説については、Miller,A.D.(1990)、Blood、76、271参照)。本発明のポリヌクレオチドを含む組換えレトロウイルスを、よく知られている分子技術を使用して構築することができる。レトロウイルスのゲノムの一部を、レトロウイルス複製装置を欠陥にするために除くことができ、その後、この複製欠陥レトロウイルスをビリオンパッケージングすることができ、このビリオンを、標準的な技術を用いながら、ヘルパーウイルスの使用により標的細胞に感染させるために使用することができる。組換えレトロウイルスを作製するため、および、細胞にウイルスをインビトロまたはインビボで感染させるためのプロトコルを、例えば、Ausubel他(1994)、Current Protocols in Molecular Biology(Greene Publishing Associates,Inc.およびJohn Wiley & Sons,Inc.)において見出すことができる。レトロウイルスは、様々な遺伝子を多くの異なる細胞型(ニューロン細胞、上皮細胞内皮細胞リンパ球筋芽細胞肝細胞および骨髄細胞を含む)に導入するために使用されている。

0200

1実施形態によれば、レンチウイルスベクター(レトロウイルスベクターの1つのタイプ)が本教示に従って使用される。レンチウイルスベクターは、分裂中の細胞と同様に、非分裂細胞のゲノムに組み込むそれらの能力のためにベクターとして広範囲に使用されている。ウイルスのゲノム(これはRNAの形態である)が、ウイルスが細胞に進入したときに逆転写されて、DNAを産生し、このDNAがその後、ウイルスインテグラーゼ酵素によってランダムな位置においてゲノムに挿入される。ベクター(プロウイルス)はゲノムに留まり、細胞が分裂するとき、細胞の子孫に伝えられる。安全性の理由から、レンチウイルスベクターは、その複製に要求される遺伝子を決して有しない。レンチウイルスを作製するために、いくつかのプラスミドが、いわゆるパッケージング細胞株(一般にはHEK293)にトランスフェクションされる。1つまたは複数のプラスミド(これらは一般にパッケージングプラスミドとして示される)により、ビリオンタンパク質(例えば、カプシドおよび逆転写酵素など)がコードされる。別のプラスミドが、ベクターによって送達されるための遺伝物質を含有する。遺伝物質は、一本鎖のRNAウイルスゲノムを産生するために転写され、また、Ψ(プサイ)配列の存在によって印が付けられる。この配列が、ゲノムをビリオンにパッケージングするために使用される。

0201

本発明のポリヌクレオチド配列を神経膠細胞または心臓細胞に導入し、当該細胞において発現させるための好適なレンチウイルスベクターの具体的な一例が、レンチウイルスpLKO.1ベクターである。

0202

本発明のこの局面に従って使用される場合がある別の好適な発現ベクターがアデノウイルスベクターである。アデノウイルスは、広範囲に研究され、かつ、常用されている遺伝子移入ベクターである。アデノウイルスベクターの重要な利点には、分裂細胞および休止細胞の比較的大きい形質導入効率、広範囲の上皮組織に対する天然指向性、ならびに、高力価物の容易な製造が含まれる(Russel,W.C.(2000)、J Gen Virol、81、57〜63)。アデノウイルスDNAは核に輸送されるが、そこに組み込まれることはない。したがって、アデノウイルスベクターによる変異誘発の危険性が最小限に抑えられ、一方で、短期間の発現が、癌細胞を処置するために特に適している。実験的な癌処置において使用されるアデノウイルスベクターが、Seth他(1999)、“Adenoviral vectors for cancer gene therapy”(103〜120頁);P.Seth編、Adenoviruses:Basic Biology to Gene Therapy(ランデス、オースチン、テキサス)によって記載されている。

0203

好適なウイルス発現ベクターはまた、レトロウイルス成分およびアデノウイルス成分を組み合わせるキメラアデノウイルス/レトロウイルスベクターであり得る。そのようなベクターは、腫瘍細胞を形質導入するための従来型の発現ベクターよりも効率的であり得る(Pan他(2002)、Cancer Letts、184、179〜188)。

0204

本発明の発現構築物をウイルス感染によって標的細胞(例えば、神経膠細胞または心臓細胞)に導入するとき、感染のためのウイルス用量は、少なくとも103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015またはそれ以上のpfuまたはウイルス粒子である。

0205

用いられる方法または構築物にかかわらず、上記で詳述されたように、ミクロRNAをコードする核酸構築物を含む単離された細胞が提供される。

0206

本明細書中で使用される場合、用語「単離(された)」は、天然の環境から、例えば、人体から少なくとも部分的に分離されたことを示す。

0207

1つの実施形態によれば、miR−135、miR−335、miR−15、miR−19、miR−26、miR−27、miR−181およびmiR−182からなる群から選択される少なくとも1つのミクロRNAまたはその前駆体を発現する核酸構築物を含み、上記核酸構築物がシス作用調節要素の転写制御下にある単離された細胞が提供される。

0208

特定の実施形態によれば、miR−135、miR−335、miR−26およびmiR−182からなる群から選択される少なくとも1つのミクロRNAまたはその前駆体を発現する核酸構築物を含み、上記核酸構築物がシス作用調節要素の転写制御下にある単離された神経膠細胞が提供される。

0209

特定の実施形態によれば、miR−19またはその前駆体を発現する核酸構築物を含み、上記核酸構築物がシス作用調節要素の転写制御下にある単離された細胞が提供される。

0210

特定の実施形態によれば、miR−15またはその前駆体を発現する核酸構築物を含み、上記核酸構築物がシス作用調節要素の転写制御下にある単離された細胞が提供される。

0211

特定の実施形態によれば、上記細胞は神経膠細胞または心臓細胞である。

0212

特定の実施形態によれば、上記神経膠細胞はセロトニン作動性ニューロンなどのニューロンである。

0213

ミクロRNAまたはその前駆体は、細胞、すなわち、本発明の標的細胞(例えば、神経膠細胞または心臓細胞にインビボで(すなわち、生物または対象の体内に)、または、エクスビボで(例えば、組織培養において)与えられるためのものである。細胞がエクスビボで処理される場合、方法は好ましくは、そのような細胞を個体に投与して戻す段階を含む(エクスビボ細胞治療)。

0214

エクスビボ治療のために、細胞が好ましくは、本発明の作用物質(例えば、ミクロRNAをコードするポリヌクレオチド)により処理され、その後、その細胞が、その必要性のある対象に投与される。

0215

本発明のエクスビボ処理細胞の投与を、任意の好適な導入経路(例えば、静脈内、腹腔内、腎臓内胃腸管内、皮下、経皮筋肉内、皮内、クモ膜下腔内、硬膜外および直腸など)を使用して達成することができる。現在好ましい実施形態によれば、本発明のエクスビボ処理細胞は、静脈内、腎臓内、胃腸管内および/または腹腔内投与を使用して個体に導入される場合がある。

0216

本発明の細胞(例えば、神経膠細胞または心臓細胞)は、自己供給源または同種供給源(例えば、ヒト死体またはヒトドナー)のどちらからでも得ることができる。非自己細胞は、身体に投与されたときには免疫反応を誘導する可能性があるので、いくつかの取り組みが、非自己細胞を拒絶する可能性を軽減するために開発されている。これらには、レシピエントの免疫系を抑制すること、または、非自己細胞を移植前に、免疫隔離する半透過性膜でカプセル化することのどちらかが含まれる。

0217

カプセル化技術は一般には、小さい球状ビヒクルを伴うマイクロカプセル化として、また、より大きい平坦シートおよび中空繊維膜を伴うマクロカプセル化として分類される(Uludag,H.他(2000)、Technology of mammalian cell encapsulation、Adv Drug Deliv Rev、42、29〜64)。

0218

マイクロカプセル調製方法は、当技術分野では知られており、例えば、下記の文献において開示されている方法が含まれる:Lu,M.Z.他(2000)、Cell encapsulation with alginate and alpha−phenoxycinnamylidene−acetylated poly(allylamine)、Biotechnol Bioeng、70、479〜483;Chang,T.M.およびPrakash,S.(2001)Procedures for microencapsulation of enzymes,cells and genetically engineered microorganisms、Mol Biotechnol、17、249〜260;およびLu,M.Z.他(2000)、A novel cell encapsulation method using photosensitive poly(allylamine alpha−cyanocinnamylideneacetate)、J Microencapsul、17、245〜521。

0219

例えば、マイクロカプセルは、修飾コラーゲンを、メチルアクリル酸2−ヒドロキシエチル(HEMA)、メタクリル酸(MAA)およびメタクリル酸メチル(MMA)のターポリマー殻との複合体(これは2〜5μmのカプセル厚さをもたらす)で使用して調製される。そのようなマイクロカプセルはさらに、負荷電の滑らかな表面を与えるために、かつ、血漿タンパク質の吸収を最小限に抑えるために、さらに2〜5μmのターポリマー殻によりカプセル化することができる(Chia,S.M.他(2002)、Multi−layered microcapsules for cell encapsulation、Biomaterials、23、849〜856)。

0220

他のマイクロカプセルは、海洋多糖であるアルギン酸塩(Sambanis,A.(2003)、Encapsulated islets in diabetes treatment、Diabetes Thechnol Ther、5、665〜668)またはその誘導体に基づく。例えば、マイクロカプセルを、ポリアニオンアルギン酸ナトリウムおよびセルロース硫酸ナトリウムと、ポリカチオンポリ(メチレン−コ−グアニジン塩酸塩との間における塩化カルシウム存在下での高分子電解質複合体化によって調製することができる。

0221

細胞のカプセル化は、より小さいカプセルが使用されるときには改善されるものとする。したがって、例えば、カプセル化された細胞の品質管理機械的安定性、拡散特性およびインビトロ活性が、カプセルサイズが1mmから400μmに縮小されたときに改善した(Canaple,L.他(2002)、Improving cell encapsulation through size control、J Biomater Sci Polym Ed13、783〜96)。そのうえ、7nmもの小さい十分制御された細孔サイズ、調整された表面化学、および、精密な微細構造様式を有するナノ多孔性バイオカプセルは、細胞のための微小環境を首尾良く免疫隔離することが見出された(Williams,D.(1999)、Small is beautiful:microparticle and nanoparticle technology in medical devices、Med Device Technol、10、6〜9;およびDesai,T.A.(2002)、Microfabrication technology for pancreatic cell encapsulation、Expert Opin Biol Ther、2、633〜646参照)。

0223

インビボ治療のために、作用物質(例えば、ミクロRNAをコードするポリヌクレオチド)が、それ自体で、または、医薬組成物の一部として対象に投与される。好ましくは、そのような組成物は、血液脳関門(BBB)の通過を可能にするように配合される。

0224

中枢神経系(CNS)への薬物送達のための従来の取り組みには、下記のことが含まれる:神経外科的戦略(例えば、脳内注射または脳室内注入);BBBの内在性輸送経路の1つを利用するための試みでの、作用物質の分子的操作(例えば、内皮細胞表面分子に対する親和性を有する輸送ペプチドを、自身でBBBを越えることができない作用物質との組合せで含むキメラ融合タンパク質の製造);作用物質の脂質溶解性を増大させるために設計される薬理学的戦略(例えば、水溶性作用物質脂質担体またはコレステロール担体にコンジュゲート化すること);および、BBBの一体性の、(頸動脈内へのマンニトール溶液の注入または生物学的活性剤(例えば、アンギオテンシンペプチドなど)の使用から生じる)高浸透圧破壊による一時的な破壊。

0225

BBBの背後への薬物送達のための方法には、脳内埋め込み(例えば、針によるものなど)および対流強化分布が含まれる。マンニトールを、BBBを迂回することにおいて使用することができる。同様に、粘膜投与(例えば、鼻腔投与)を、BBBを迂回するために使用することができる。

0226

本発明のミクロRNAポリヌクレオチド作用物質はまた、当該作用物質が好適な担体または賦形剤と混合される医薬組成物において生物に投与することができる。

0227

本明細書中で使用される「医薬組成物」は、本明細書中に記載される有効成分の1つまたは複数と、他の化学的成分(例えば、生理学的に好適な担体および賦形剤など)との調製物を示す。医薬組成物の目的は、生物に対する化合物の投与を容易にすることである。

0228

本明細書中において、用語「有効成分」は、生物学的効果を説明することができるペプチドを示す。

0229

本明細書中以降、表現「生理学的に許容される担体」および表現「医薬的に許容される担体」は、交換可能に使用され得るが、生物に対する著しい刺激を生じさせず、かつ、投与された化合物の生物学的な活性および性質を妨げない担体または希釈剤を示す。アジュバントはこれらの表現に包含される。

0230

本明細書中において、用語「賦形剤」は、有効成分の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性な物質を示す。賦形剤の非限定的な例としては、炭酸カルシウムリン酸カルシウム、様々な糖およびデンプンセルロース誘導体ゼラチン植物油およびポリエチレングリコールが挙げられる。

0231

薬物の配合および投与のための技術が「Remington’s Pharmaceutical Sciences」(Mack Publishing Co.、Easton、PA、最新版)に見出されることができ、これは参考として本明細書中に組み込まれる。

0232

好適な投与経路には、例えば、経口送達、直腸送達、経粘膜送達、特に経鼻送達、腸管送達、または非経口送達(これには、筋肉内注射皮下注射および内注射、ならびに、クモ膜下注射、直接的な脳室内注射静脈内注射腹腔内注射内注射または眼内注射が含まれる)が含まれることができる。

0233

あるいは、例えば、患者の組織領域に直接的に医薬組成物の注射をすることによって、全身的な方法よりも局所的に医薬組成物を投与することができる。

0234

本発明の医薬組成物は、この分野で十分に知られているプロセスによって、例えば、従来の混合、溶解、造粒糖衣錠作製、研和、乳化、カプセル化、包括化または凍結乾燥のプロセスによって製造されることができる。

0235

従って、本発明に従って使用される医薬組成物は、医薬品として使用されることができる調製物への有効成分の加工を容易にする賦形剤および補助剤を含む1つまたは複数の生理学的に許容され得る担体を使用して従来の様式で配合されることできる。適正な配合は、選ばれた投与経路に依存する。

0236

注射の場合、医薬組成物の有効成分は、水溶液において、好ましくは生理学的に適合しうる緩衝液(例えば、ハンクス溶液リンゲル溶液、または生理学的な食塩緩衝液など)において配合されることができる。経粘膜投与の場合、浸透されるバリヤーに対して適切な浸透剤が配合において使用される。そのような浸透剤はこの分野では一般に知られている。

0237

経口投与の場合、医薬組成物は、活性化合物をこの分野でよく知られている医薬的に許容され得る担体と組み合わせることによって容易に配合されることができる。そのような担体は、医薬組成物が、患者によって経口摂取される錠剤ピル、糖衣錠、カプセル、液剤ゲルシロップスラリー剤および懸濁物などとして配合されることを可能にする。経口使用される薬理学的調製物は、固体の賦形剤を使用し、得られた混合物を場合により粉砕し、錠剤または糖衣錠コアを得るために、望ましい好適な補助剤を添加した後、顆粒の混合物を加工して作製されることができる。好適な賦形剤は、特に、ラクトーススクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む糖などの充填剤;セルロース調製物、例えば、トウモロコシデンプンコムギデンプン、コメデンプンジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴムメチルセルロースヒドロキシプロピルメチルセルロースナトリウムカルボメチルセルロースなど;および/またはポリビニルピロリドンPVP)などの生理学的に許容され得るポリマーである。もし望むなら、架橋されたポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩(例えば、アルギン酸ナトリウムなど)などの崩壊剤が加えられることができる。

0238

糖衣錠コアには、好適なコーティングが施される。この目的のために、高濃度糖溶液を使用することができ、この場合、糖溶液は、場合により、アラビアゴムタルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタンラッカー溶液、および好適な有機溶媒または溶媒混合物を含有しうる。色素または顔料は、活性化合物の量を明らかにするために、または活性化合物の量の種々の組合せを特徴づけるために、錠剤または糖衣錠コーティングに加えられることができる。

0239

経口使用されうる医薬組成物としては、ゼラチンから作製されたプッシュフィット型カプセル、ならびに、ゼラチンおよび可塑剤(例えば、グリセロールまたはソルビトールなど)から作製された軟いシールされたカプセルが挙げられる。プッシュ・フィット型カプセルは、充填剤(例えば、ラクトースなど)、結合剤(例えば、デンプンなど)、滑剤(例えば、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなど)、および場合により安定化剤との混合で有効成分を含有することができる。軟カプセルでは、有効成分は、好適な液体(例えば、脂肪油流動パラフィンまたは液状のポリエチレングリコールなど)に溶解または懸濁されることができる。さらに、安定化剤が加えられることができる。経口投与される配合物はすべて、選ばれた投与経路について好適な投薬形態でなければならない。

0240

口内投与の場合、組成物は、従来の方法で配合された錠剤またはトローチの形態を取ることができる。

0241

吸入による投与の場合、本発明による使用のための有効成分は、好適な噴射剤(例えば、ジクロロジフルオロメタントリクロロフルオロメタンジクロロテトラフルオロエタンまたは二酸化炭素)の使用により加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレー提示物の形態で都合よく送達される。加圧されたエアロゾルの場合、投与量は、計量された量を送達するためのバルブを備えることによって決定されることができる。ディスペンサーにおいて使用される、例えば、ゼラチン製のカプセルおよびカートリッジは、化合物および好適な粉末基剤(例えば、ラクトースまたはデンプンなど)の粉末混合物を含有して配合されることができる。

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