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課題

血液または血液成分、とりわけ血清または血漿中の25(OH)ビタミンDイムノアッセイを提供する。

解決手段

(a)試料に、4〜12個の炭素原子炭素鎖長を有するペルフルオロアルキル酸、またはその塩を加える工程、(b)任意選択で試料を希釈液希釈する工程、(c)混合物抗ビタミンD抗体と共にインキュベーションにかける工程、(d)試料を、ビタミンDのコンジュゲートおよび競合的に抗ビタミンD抗体と結合する機能性標識と接触させる工程、(e)結合タンパク質に結合した標識化ビタミンD化合物の濃度を測定する工程を含む。

概要

背景

ビタミンD」と呼ばれる物質は、一群脂溶性プロホルモン、ならびにその代謝産物および類似体包含する。体内で生じるビタミンDの主要形態は、ビタミンD2(エルゴカルシフェロール)およびビタミンD3(コレカルシフェロール)である。後者は、ヒトが日光の影響を受けて皮膚内に形成し得るビタミンDの内因性形態である。前者は、食物一緒に吸収されるビタミンDの外因性形態である。米国では、ビタミンD2は、ビタミンDサプリメント製剤として使用されている。

ビタミンD2およびD3は、それらの側鎖の分子構造の点で異なるが、それらはプロホルモンであるという同じ生物活性共有し、2つのステップで代謝されて、最終的に、1,25ジヒドロキシビタミンD(カルシトリオール、または1,25ジヒドロキシコレカルシフェロール)になる。上述の代謝産物、25-ヒドロキシビタミンDまたはカルシジオールは、肝臓での変換によって生じ、体内におけるビタミンDの貯蔵形態であると考えられる。

循環血中ビタミンDは、主に25(OH)ビタミンD3および25(OH)ビタミンD2からなる。生物学的には、25(OH)ビタミンD2は、25(OH)ビタミンD3と同じくらい有効である。循環血中の25(OH)ビタミンD2の半減期のほうが短い。臨床診療では、25(OH)ビタミンD3と25(OH)ビタミンD2の両方を測定する25(OH)ビタミンDアッセイの使用が推奨されている(1)。

ビタミンDは、長年にわたり、その活性型が骨の形成および維持、ならびにヒトまたは動物の体内の他のプロセスにおいて役割を果たす重要な物質として認識されている。したがって、ビタミンDは、腸における食物からのカルシウムおよびリンの吸収と、腎臓におけるカルシウムの再吸収を促進することによって、血流中のカルシウムの濃度を増大させる働きをし;骨の正常な石灰化を可能にし、低カルシウム血症テタニーを予防する。ビタミンDはまた、骨芽細胞および破骨細胞による骨成長および骨リモデリングに必要である。

ビタミンD欠乏症は、骨の石灰化を損ない、骨軟化疾患、小児はくる病および成人では骨軟化症をもたらし、骨粗鬆症の一因となる可能性がある。

近年、ビタミンDがヒトの健康においていくつかの他の役割を果たすことが確認されている。ビタミンDは、免疫機能を調節し、炎症を低減することができる。ビタミンDが大腸癌乳癌および卵巣癌を予防し得ることも提案されている。

したがって、十分なレベルのビタミンDを有することは、ヒトまたは動物の健康に極めて重要である。

けれども、過剰なビタミンD(過量の結果として起こり得る)は、有毒である。ビタミンD毒性のいくつかの症状は、カルシウムの腸管吸収の増大が原因である高カルシウム血症(血中のカルシウムレベルの上昇)である。ビタミンD毒性は、高血圧の原因であることが知られている。ビタミンD毒性の胃腸症状には、食欲不振悪心、および嘔吐を含めることができる。これらの症状に続いて、多尿症(尿の過剰生成)、多渇症(のどの渇きの増大)、虚弱神経質そう痒症(かゆみ)、最終的に腎不全が生じることが多い。

明らかに、ビタミンD欠乏症の可能性について対象を診断できることは重要である。潜在的に過剰なビタミンDについて対象を試験できることも、特にビタミンDを補充している対象にとって重要である。臨床診療では、25-ヒドロキシ-ビタミンDの血清レベルは、ビタミンDの状態の一次指標であると考えられている(2)。

血清中のほとんど全ての循環血中25(OH)ビタミンDは、ビタミンD結合タンパク質(88%)およびアルブミン(12%)と結合している。ビタミンD結合タンパク質(DBP)は、豊富タンパク質であり、血清の濃度が250〜400mg/Lである。ビタミンDは、抗体のものに近い(5*108M-1)比較的高い親和性でDBPと結合している。

血清中のビタミンDの濃度の正確な測定には、DBPからの結合ビタミンDの放出を必要とする。

ビタミンDの測定するための初期の方法には、アセトニトリルなどの有機溶媒を使用した抽出ステップが含まれていた。他の手法は、高または低pHを使用したビタミンD-DBP複合体の分離を利用している(WO2004/063704)。他の方法は、ANSを使用した内因性結合タンパク質からのビタミンDの競争的置換を利用している(US 7,482,162)。近年、DBPのタンパク質分解消化を含む方法が公開されている(WO 2008/092917 A1)。Armbrusterは、ヒドロキシル化された芳香族カルボン酸による置換を使用したビタミンDを直接測定するための方法を公開している(WO 2003/023391)。Kyriatsoulisによって記載された方法は、pHが3.8〜4.8であり、5〜30%DMSO、液体有機アミドおよび任意選択で0.5〜5%の短鎖アルコールを含む試薬を使用することによる、ビタミンD結合タンパク質からのビタミンDの放出を利用している。Koboldは、第四級窒素系イオンを有する陽イオンを含む塩に基づいて放出するための方法を示した。EP2007/140962。US 2008/0182341は、検体濃度を測定するアッセイで使用する安定剤および捕捉リガンドについて述べている。これらの安定剤は、いくつかのアルキルアミノフルオロ界面活性剤背景に対して開示されている。発明者らは、この界面活性剤が、平衡を安定化させることによって結合検体に対する遊離型非結合検体の測定を容易にすることを示唆している。フルオロカーボンオクタン酸は、潜在的な有害物質として言及されている。

ビタミンDのアッセイに関する背景の参考文献としては、Hollis BW. Measuring 25-hydroxyvitamin D in a clinical environment: challenges and needs. Am J Clin Nutr. 2008年8月;88(2):507S〜510S; HolickMF. Vitamin D: extraskeletal health. Endocrinol Metab Clin North Am. 2010年6月;39(2):381〜400などが挙げられる。

概要

血液または血液成分、とりわけ血清または血漿中の25(OH)ビタミンDのイムノアッセイを提供する。(a)試料に、4〜12個の炭素原子炭素鎖長を有するペルフルオロアルキル酸、またはその塩を加える工程、(b)任意選択で試料を希釈液希釈する工程、(c)混合物抗ビタミンD抗体と共にインキュベーションにかける工程、(d)試料を、ビタミンDのコンジュゲートおよび競合的に抗ビタミンD抗体と結合する機能性標識と接触させる工程、(e)結合タンパク質に結合した標識化ビタミンD化合物の濃度を測定する工程を含む。なし

目的

効果

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請求項1

25-ヒドロキシビタミンDの存在について血液または血液成分を定性的にin vitroアッセイする方法であって、(a)試料に、4〜12個の炭素原子炭素鎖長を有するペルフルオロアルキル酸、またはその塩を加える工程(b)任意選択で試料を希釈液希釈する工程(c)混合物抗ビタミンD抗体と共にインキュベーションにかける工程(d)試料を、ビタミンDコンジュゲートおよび競合的に抗ビタミンD抗体と結合する機能性標識と接触させる工程(e)結合タンパク質に結合した標識化ビタミンD化合物の濃度を測定する工程を含む、方法。

請求項2

ペルフルオロアルキル酸が、ペルフルオロヘキサン酸ペルフルオロオクタン酸、およびその混合物からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。

請求項3

ペルフルオロアルキル酸が希釈液中に含まれる、請求項1または2に記載の方法。

請求項4

インキュベーションの前に試料を希釈する、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。

請求項5

試料がヒト血清または血漿である、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。

請求項6

結合タンパク質が、磁性粒子上にコーティングした形態で提供される、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。

請求項7

機能性標識が、放射標識蛍光標識発光標識ビオチン標識金標識酵素標識からなる群から選択される、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。

請求項8

濃度を、総25-OHビタミンDに対する標準物質濃度を参照して測定する、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。

請求項9

ペルフルオロオクタン酸、またはその誘導体が、ペルフルオロオクタン酸、ペルフルオロオクタン酸アンモニウム塩、およびペルフルオロオクタンスルホン酸塩からなる群から選択される、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。

請求項10

請求項1から9のいずれか一項に記載の方法を利用する、血液または血液成分中の25-OHビタミンDを測定するためのイムノアッセイ

請求項11

固相上に固定化された25-OHビタミンDに対して特異的な抗体と、ビタミンDおよび機能性標識のコンジュゲートとを含む、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法を使用してイムノアッセイを実施するためのキット

技術分野

0001

本発明は、内因性結合タンパク質からビタミンDを放出するための薬剤を用いて総ビタミンDまたはビタミンD代謝産物、特に25-ヒドロキシビタミンDについて血液または血液成分の試料アッセイするための、ポイントオブケア検査を含むイムノアッセイ法に関する。

背景技術

0002

「ビタミンD」と呼ばれる物質は、一群脂溶性プロホルモン、ならびにその代謝産物および類似体包含する。体内で生じるビタミンDの主要形態は、ビタミンD2(エルゴカルシフェロール)およびビタミンD3(コレカルシフェロール)である。後者は、ヒトが日光の影響を受けて皮膚内に形成し得るビタミンDの内因性形態である。前者は、食物一緒に吸収されるビタミンDの外因性形態である。米国では、ビタミンD2は、ビタミンDサプリメント製剤として使用されている。

0003

ビタミンD2およびD3は、それらの側鎖の分子構造の点で異なるが、それらはプロホルモンであるという同じ生物活性共有し、2つのステップで代謝されて、最終的に、1,25ジヒドロキシビタミンD(カルシトリオール、または1,25ジヒドロキシコレカルシフェロール)になる。上述の代謝産物、25-ヒドロキシビタミンDまたはカルシジオールは、肝臓での変換によって生じ、体内におけるビタミンDの貯蔵形態であると考えられる。

0004

循環血中ビタミンDは、主に25(OH)ビタミンD3および25(OH)ビタミンD2からなる。生物学的には、25(OH)ビタミンD2は、25(OH)ビタミンD3と同じくらい有効である。循環血中の25(OH)ビタミンD2の半減期のほうが短い。臨床診療では、25(OH)ビタミンD3と25(OH)ビタミンD2の両方を測定する25(OH)ビタミンDアッセイの使用が推奨されている(1)。

0005

ビタミンDは、長年にわたり、その活性型が骨の形成および維持、ならびにヒトまたは動物の体内の他のプロセスにおいて役割を果たす重要な物質として認識されている。したがって、ビタミンDは、腸における食物からのカルシウムおよびリンの吸収と、腎臓におけるカルシウムの再吸収を促進することによって、血流中のカルシウムの濃度を増大させる働きをし;骨の正常な石灰化を可能にし、低カルシウム血症テタニーを予防する。ビタミンDはまた、骨芽細胞および破骨細胞による骨成長および骨リモデリングに必要である。

0006

ビタミンD欠乏症は、骨の石灰化を損ない、骨軟化疾患、小児はくる病および成人では骨軟化症をもたらし、骨粗鬆症の一因となる可能性がある。

0007

近年、ビタミンDがヒトの健康においていくつかの他の役割を果たすことが確認されている。ビタミンDは、免疫機能を調節し、炎症を低減することができる。ビタミンDが大腸癌乳癌および卵巣癌を予防し得ることも提案されている。

0008

したがって、十分なレベルのビタミンDを有することは、ヒトまたは動物の健康に極めて重要である。

0009

けれども、過剰なビタミンD(過量の結果として起こり得る)は、有毒である。ビタミンD毒性のいくつかの症状は、カルシウムの腸管吸収の増大が原因である高カルシウム血症(血中のカルシウムレベルの上昇)である。ビタミンD毒性は、高血圧の原因であることが知られている。ビタミンD毒性の胃腸症状には、食欲不振悪心、および嘔吐を含めることができる。これらの症状に続いて、多尿症(尿の過剰生成)、多渇症(のどの渇きの増大)、虚弱神経質そう痒症(かゆみ)、最終的に腎不全が生じることが多い。

0010

明らかに、ビタミンD欠乏症の可能性について対象を診断できることは重要である。潜在的に過剰なビタミンDについて対象を試験できることも、特にビタミンDを補充している対象にとって重要である。臨床診療では、25-ヒドロキシ-ビタミンDの血清レベルは、ビタミンDの状態の一次指標であると考えられている(2)。

0011

血清中のほとんど全ての循環血中25(OH)ビタミンDは、ビタミンD結合タンパク質(88%)およびアルブミン(12%)と結合している。ビタミンD結合タンパク質(DBP)は、豊富タンパク質であり、血清の濃度が250〜400mg/Lである。ビタミンDは、抗体のものに近い(5*108M-1)比較的高い親和性でDBPと結合している。

0012

血清中のビタミンDの濃度の正確な測定には、DBPからの結合ビタミンDの放出を必要とする。

0013

ビタミンDの測定するための初期の方法には、アセトニトリルなどの有機溶媒を使用した抽出ステップが含まれていた。他の手法は、高または低pHを使用したビタミンD-DBP複合体の分離を利用している(WO2004/063704)。他の方法は、ANSを使用した内因性結合タンパク質からのビタミンDの競争的置換を利用している(US 7,482,162)。近年、DBPのタンパク質分解消化を含む方法が公開されている(WO 2008/092917 A1)。Armbrusterは、ヒドロキシル化された芳香族カルボン酸による置換を使用したビタミンDを直接測定するための方法を公開している(WO 2003/023391)。Kyriatsoulisによって記載された方法は、pHが3.8〜4.8であり、5〜30%DMSO、液体有機アミドおよび任意選択で0.5〜5%の短鎖アルコールを含む試薬を使用することによる、ビタミンD結合タンパク質からのビタミンDの放出を利用している。Koboldは、第四級窒素系イオンを有する陽イオンを含む塩に基づいて放出するための方法を示した。EP2007/140962。US 2008/0182341は、検体濃度を測定するアッセイで使用する安定剤および捕捉リガンドについて述べている。これらの安定剤は、いくつかのアルキルアミノフルオロ界面活性剤背景に対して開示されている。発明者らは、この界面活性剤が、平衡を安定化させることによって結合検体に対する遊離型非結合検体の測定を容易にすることを示唆している。フルオロカーボンオクタン酸は、潜在的な有害物質として言及されている。

0014

ビタミンDのアッセイに関する背景の参考文献としては、Hollis BW. Measuring 25-hydroxyvitamin D in a clinical environment: challenges and needs. Am J Clin Nutr. 2008年8月;88(2):507S〜510S; HolickMF. Vitamin D: extraskeletal health. Endocrinol Metab Clin North Am. 2010年6月;39(2):381〜400などが挙げられる。

0015

WO2004/063704
US 7,482,162
WO 2008/092917 A1
WO 2003/023391
EP2007/140962
US 2008/0182341

先行技術

0016

Hollis BW. Measuring 25-hydroxyvitamin D in a clinical environment: challenges and needs. Am J Clin Nutr. 2008年8月;88(2):507S〜510S
HolickMF. Vitamin D: extraskeletal health. Endocrinol Metab Clin North Am. 2010年6月;39(2):381〜400
Hollis, Clin. Chem 31/11, 1815〜1819(1985)
Hollis, Clin. Chem 39/3, 529〜533(1993)

課題を解決するための手段

0017

本発明は、1つの態様において、25-ヒドロキシビタミンDの存在について血液または血液成分を定性アッセイするin vitroの方法であって、
(a)ビタミンD結合タンパク質からのビタミンDの放出を可能にするために、試料に、4〜12個の炭素原子炭素鎖長を有するペルフルオロアルキル酸、またはその塩を加える工程
(b)任意選択で試料を希釈液希釈する工程
(c)混合物固定化結合タンパク質、とりわけ抗ビタミンD抗体と共にインキュベーションにかける工程
(d)試料を、ビタミンDのコンジュゲートおよび競合的に抗ビタミンD抗体と結合する機能性標識と接触させる工程
(e)結合タンパク質に結合した標識化ビタミンD化合物の濃度を測定する工程
を含む方法を提示する。

0018

別の態様では、本発明は、前述の方法を実施するためのキットに属する。

0019

さらに別の態様では、本方法は、「ポイント・オブ・ケア」検査に使用することができる。後者は、患者治療場所またはその近くで検査することを意味し、すなわち血液試料採取し、それらを診断研究所に送るのではなく、試料は、可能な限り数を制限したステップで、可能な限り回数を制限した手動操作を用いてアッセイを行うことが可能な、携帯型、好ましくは手持形のデバイスに直ちに導入することができる。

図面の簡単な説明

0020

25(OH)ビタミンD検量線を示す図である。
ペルフルオロヘキサン酸(PFHxA)およびペルフルオロオクタン酸(PFOA)放出から得られた結果を比較したグラフである。

実施例

0021

広い意味で、本発明は、内因性結合タンパク質からビタミンDを放出するために4〜12の炭素鎖長を有するペルフルオロアルキル酸またはその塩を使用したイムノアッセイによる、血液または血液成分、とりわけ血清または血漿中のビタミンDの測定に関する。

0022

考えられる限りでは、本発明では、ペルフルオロアルキルカルボン酸またはペルフルオロスルホン酸またはその塩を使用することができる。特にペルフルオロヘキサン酸(PFHxA)またはペルフルオロオクタン酸(PFOA)を使用することができる。

0023

アッセイは、一般に
(a)希釈液/アッセイバッファーを試料に加える工程
(b)抗ビタミンD抗体でコーティングした磁性粒子を加える工程
(c)試料をある一定量の時間インキュベートする工程
(d)ビタミンDのコンジュゲートおよび機能性標識を加える工程
(e)ビタミンDのコンジュゲートおよび抗体に結合した機能性標識の量を測定する工程
を含む。

0024

このような試料は、血中の25-OHビタミンDの存在をアッセイすることが望まれる対象、特にヒトから、当技術分野既知の任意の方法で採取することができる。

0025

試料は、水性希釈液で希釈することが好ましい。希釈液は、アッセイバッファーであることが好ましい。希釈は、抗体の添加前、添加の間、または添加後に行うことができる。試料の希釈液またはアッセイバッファーは、水性系であってよく、好ましくはバッファー溶液であろう。緩衝pHは、6.0〜8.0の範囲であることが好ましい。適当な希釈液には、例えばリン酸塩クエン酸塩バッファーが含まれる。バッファー中のペルフルオロアルキル酸の濃度は、0.1%〜3%、好ましくは0.5%のはずである。適当なバッファー溶液は、当技術分野で習慣的であり、ここでは説明は必要ではない。

0026

ペルフルオロアルキル酸は、別々の形で加えることができるが、好ましくは試料の希釈液、好ましくはアッセイバッファー中に含まれている。

0027

試料は、抗25(OH)ビタミンD抗体と接触している。後者は、試料に加えることができ、あるいは試料は、結合タンパク質を含有する反応バイアルに移すことができる。

0028

ビタミンDの抗体は、当技術分野で既知であり、ビタミンDのための既存のイムノアッセイで広く使用されている。これらの同じ抗体、ならびに他の結合タンパク質は、同様に本発明で使用することができる。例えば、ビタミンDの抗体の代わりに、ファージディスプレイ技術を用いて生成したような抗体フラグメントを使用してもよい。適当な抗体は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体であってよい。それらは、既知の方法、例えばポリクローナルヤギ抗ビタミンD、ポリクローナルウサギ抗ビタミンD、またはビタミンDのためのイムノアッセイへの適用から当技術分野で知られているようなビタミンDの任意の他の適当な抗体で得ることができる。適当な抗体は、例えば以下の参考文献: Hollis, Clin. Chem 31/11, 1815〜1819(1985); Hollis, Clin. Chem 39/3, 529〜533(1993)で知られている。

0029

使用したような抗体は、固定化することが好ましい。それらは、固体担体を含む微粒子形態で使用することが好ましい。通常、抗体は、固相、例えば微量定量プレート上にコーティングされる。好ましい実施形態では、抗体は、磁性粒子上にコーティングされ、磁場におけるそれらの分離を促進する。

0030

抗体の添加後、試料をインキュベートすることができる。必要な時間は、試薬の濃度、結合タンパク質の種類、ならびにインキュベーション中の条件、例えば振盪および温度などの状況に応じて決まる。一般に、インキュベーション時間は、10秒間から数時間の範囲であり、好ましくは1分間から1時間である。自動化プラットフォームでは、短いインキュベーション時間(10秒間から10分間、好ましくは30秒間から30分間)が好ましい。

0031

最初のインキュベーション期間後、機能性標識を含むビタミンDのコンジュゲートを加える。ビタミンDの測定のためのイムノアッセイにおける競合的結合抗原として働くことができる多くの標識化化合物が知られている。典型的な標識は、放射標識蛍光標識発光標識ビオチン標識金標識酵素標識である。競合的結合アッセイは当業者に知られており、とりわけ、本発明の方法のこの部分は、ビタミンDの測定に適していることが知られている任意の標識を使用して実施できるので、説明は必要ではない。使用できる標識は、特に、既存のビタミンDイムノアッセイに関する前述の参考文献に開示されるものである。

0032

濃度の測定を可能にする標識を用いて、結果として、試料中のビタミンDの濃度を測定する。測定した値の解釈は、較正測定、すなわち同じアッセイにおける標準物質応答によって決定されることが理解されよう。

0033

本発明のアッセイの較正は、所定濃度の25-OHビタミンDを含む標準物質を用意することによって行うことができる。標準物質中のビタミンDの濃度は、LC-MS-MS法を使用して測定することが好ましい。

0034

本発明は、別の態様では、血液または血液成分中の25-OHビタミンDを測定するためのイムノアッセイの形態をした製品を示し、ここで、このアッセイは、上述の実施形態のいずれか1つに基づいた方法を使用する。より具体的には、このような製品は、イムノアッセイを実施するためのキットの形態で提供されよう。このようなキットは、関係する個々の試薬、すなわち抗体、標識化ビタミンD化合物および希釈液/アッセイバッファーを含むことができる。これらの試薬は、別々に提供でき、そのため本発明のイムノアッセイでそれらを使用する際にのみキットを形成することができる。試薬は、部品からなる1つのキットとして、好ましくは一緒に提供され、好ましくは一緒に包装される。キットには、任意選択で、血液または血液成分の試料用の容器が含まれるが、習慣的に、別々に提供してもよい。通常、キットは、固相上に固定化した結合剤、および別個のコンジュゲート型ビタミンDを含む。異なる標識には異なる試薬が必要となり得るので、他のキット構成要素は、当技術分野の慣例通り、選択した標識に応じて決まる。

0035

本発明は、本明細書で先に記載された実施形態および式に限定されないことが理解されるべきである。特許請求の範囲において、「含む(comprising)」という用語は、他の構成要素またはステップを除外しないことも理解されるべきである。単数名詞を参照して、例えば「a」または「an」、「the」などの不定詞または定冠詞を使用する場合、これは、他のことが具体的に示されない限り、その名詞の複数形を含む。

0036

本発明は、以下の非限定的な実施例および添付の非限定的な図に関して例示される。

0037

(実施例)
ビタミンDの測定
アッセイは、自動化プラットフォームを使用して行った。試料15μlに、試料希釈液/アッセイバッファー255μlを加えた。希釈した試料100μlのアリコートを第2のインキュベーションウェルに移した。モノクローナル抗体でコーティングした体積が50μlの磁性粒子を、希釈した試料に加え、37℃で45分間インキュベートした。続いてビオチン化ビタミンDの溶液50μlを加え、37℃で7分間インキュベートした。次いでストレプトアビジン-アクリジニウムエステル溶液50μlを加え、再度37℃で7分間インキュベートした。結合および遊離型ビオチン化ビタミンDの磁気分離後、結合アクリジニウムエステルを定量した。

0038

材料
常磁性粒子磁性粒子(Invitrogen、M280トシル活性化、2.8μm)を、マウスIgG(5μg/mgの磁性粒子)に対するポリクローナル抗体でコーティングした。粒子を、pH 7.4の0.01MPBS、0.138M NaCl中0.5mg/mlの濃度で16時間の間、ローラー上でコーティングした。最後に、粒子を、0.05Mトリス/0.05%BSA含有0.1%プロクリン-950でブロックした。粒子を、16時間の間37℃で0.4μg/mg粒子の濃度の抗ビタミンDモノクローナル抗体の第2層でコーティングした。

0039

試料希釈液は、0.05%BSAおよび0.5%PFOAを含有するpH8.0の0.1Mトリスバッファーからなる。

0040

コンジュゲート(すなわち、標識化ビタミンD化合物)は、ビオチン化ビタミンDである。コンジュゲートは、0.05%ウシ血清アルブミンを含有するpH8.0の0.1Mトリスバッファー中に0.5ng/mlの濃度で存在していた。

0041

プロトコル
試料15μlに、試料希釈液/アッセイバッファー255μlを加えた。希釈した試料100μlのアリコートを第2のインキュベーションウェルに移した。モノクローナル抗体でコーティングした体積が50μlの磁性粒子を、希釈した試料に加え、37℃で45分間インキュベートした。続いてビオチン化ビタミンDの溶液50μlを加え、37℃で7分間インキュベートした。次いでストレプトアビジン-アクリジニウムエステル溶液50μlを加え、再度37℃で7分間インキュベートした。結合および遊離型ビオチン化ビタミンDの磁気分離後、結合アクリジニウムエステルを定量した。トリガー試薬の添加によって化学発光シグナルが発生した。キュベット中で発生したシグナルは、試料または標準物質中の25(OH)ビタミンDの濃度に反比例する。元の試料中の25(OH)ビタミンDの濃度は、未知試料のシグナルを標準物質の応答と比較することによって計算することができる。

0042

結果
以下の表および図1では、検量線を示している。25(OH)ビタミンD3標準物質は、ビタミンDを含まない血清で調製し、0〜136 ng/mlの範囲であった。

0043

ビオチン化25(OH)ビタミンDは、136ng/mlで7%のレベルまで置換した。

0044

ペルフルオロオクタン酸放出およびペルフルオロヘキサン酸放出を用いて1セットの試料を測定した。結果は、非常に良好な相関があり(r=0.990)、どちらの化合物も使用できることを示している(図2)。

0045

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