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技術 タンパク質又はポリペプチドの製造方法

出願人 花王株式会社
発明者 四方健一
出願日 2015年10月28日 (4年8ヶ月経過) 出願番号 2015-211921
公開日 2017年5月18日 (3年1ヶ月経過) 公開番号 2017-079646
状態 未査定
技術分野 突然変異または遺伝子工学 酵素・酵素の調製 微生物による化合物の製造
主要キーワード クラウジ カウント法 担体ゲル アルカリプロテアーゼ活性 包括固定化法 湿度範囲 医療検査 世代数
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2017年5月18日)のものです。
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課題

宿主内でのプラスミドの保持安定性を高め、目的の有用物質を効率よく高生産する新たな方法の提供。

解決手段

目的の蛋白質又はポリペプチドをコードする遺伝子を含む組換えプラスミドが導入された微生物固体培地の表面で繰り返し培養することを含む、蛋白質又はポリペプチドの製造方法。目的の蛋白質又はポリペプチドが加水分解酵素であることが好ましく、特にアルカリセルラーゼ又はアルカリプロテアーゼであることが好ましい蛋白質又はポリペプチドの製造方法。宿主微生物枯草菌であることが好ましい蛋白質又はポリペプチドの製造方法。

概要

背景

近年、遺伝子工学の研究が盛んに行われ、遺伝子組換え体微生物を用いてタンパク質等の有用物質を大量に生産させる技術が多数報告されている。
遺伝子組換え体微生物の作製には主に目的遺伝子を組み込んだプラスミドベクターが利用され、宿主内でのプラスミドの保持安定性は目的の有用物質を高生産する上で極めて重要であるが、宿主の複製システム等の問題から、プラスミドは培養の過程で一定の確率で脱落することが知られている。特に、長期培養の過程でプラスミドは脱落し易い。

そこで、プラスミドの安定化に関する技術が検討され、例えば、遺伝子組換え体微生物を、カラギーナンアルギン酸塩等のゲル包括固定化する方法が提案されている。なかでも、アルギン酸塩による包括固定化法は、プラスミドを安定化し、宿主からの脱落を抑制することが報告されている(特許文献1、非特許文献1)。

概要

宿主内でのプラスミドの保持安定性を高め、目的の有用物質を効率よく高生産する新たな方法の提供。目的の蛋白質又はポリペプチドをコードする遺伝子を含む組換えプラスミドが導入された微生物を固体培地の表面で繰り返し培養することを含む、蛋白質又はポリペプチドの製造方法。目的の蛋白質又はポリペプチドが加水分解酵素であることが好ましく、特にアルカリセルラーゼ又はアルカリプロテアーゼであることが好ましい蛋白質又はポリペプチドの製造方法。宿主微生物枯草菌であることが好ましい蛋白質又はポリペプチドの製造方法。なし

目的

本発明は、目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を含む組換えプラスミドが導入された微生物を固体培地の表面で繰り返し培養することを含む、タンパク質又はポリペプチドの製造方法を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を含む組換えプラスミドが導入された微生物固体培地の表面で繰り返し培養することを含む、タンパク質又はポリペプチドの製造方法。

請求項2

微生物を45世代以上にわたって培養する、請求項1記載のタンパク質又はポリペプチドの製造方法。

請求項3

目的のタンパク質又はポリペプチドが加水分解酵素である請求項1又は2記載のタンパク質又はポリペプチドの製造方法。

請求項4

加水分解酵素がアルカリセルラーゼ又はアルカリプロテアーゼである請求項3記載のタンパク質又はポリペプチドの製造方法。

請求項5

微生物が枯草菌(Bacillussubtilis)である請求項1〜4のいずれか1項記載のタンパク質又はポリペプチドの製造方法。

請求項6

目的遺伝子を含む組換えプラスミドが導入された微生物を固体培地の表面で培養し、さらに固体培地の表面で継代培養を繰り返す、該プラスミドの安定化方法。

技術分野

0001

本発明は、タンパク質又はポリペプチドの製造方法、並びにプラスミドの安定化方法に関する。

背景技術

0002

近年、遺伝子工学の研究が盛んに行われ、遺伝子組換え体微生物を用いてタンパク質等の有用物質を大量に生産させる技術が多数報告されている。
遺伝子組換え体微生物の作製には主に目的遺伝子を組み込んだプラスミドベクターが利用され、宿主内でのプラスミドの保持安定性は目的の有用物質を高生産する上で極めて重要であるが、宿主の複製システム等の問題から、プラスミドは培養の過程で一定の確率で脱落することが知られている。特に、長期培養の過程でプラスミドは脱落し易い。

0003

そこで、プラスミドの安定化に関する技術が検討され、例えば、遺伝子組換え体微生物を、カラギーナンアルギン酸塩等のゲル包括固定化する方法が提案されている。なかでも、アルギン酸塩による包括固定化法は、プラスミドを安定化し、宿主からの脱落を抑制することが報告されている(特許文献1、非特許文献1)。

0004

特開平1−120288号公報

先行技術

0005

Enzyme and Microbial Technology、2002年、第30巻、p.862−866

発明が解決しようとする課題

0006

しかし、アルギン酸はそのゲル形成カチオンが必要で、特にアルギン酸と親和性の高いカルシウムイオンは微生物の生育に阻害を示すため、これを避けると遺伝子組換え体微生物を包括固定化する担体ゲル機械的に非常に弱いものとなり易い。その上、非特許文献1によれば、遺伝子組換え体微生物が固定化状態から漏出してくるとプラスミドは脱落してしまい、且つプラスミドの脱落した菌体の増殖が優位になってしまう。そのため、アルギン酸塩による包括固定化法は、特に長期培養に不向きと考えられる。
したがって、本発明は、宿主内でのプラスミドの保持安定性を高め、目的の有用物質を効率よく高生産する新たな方法を提供しようとするものである。

課題を解決するための手段

0007

本発明者は、プラスミドの安定性を向上させる技術について種々検討したところ、固体培地を用いて、目的遺伝子を含む組換えプラスミドが導入された微生物を培地固体表面で培養することにより、プラスミドが安定化し、繰り返し長時間培養してもプラスミドの脱落を抑えることができ、目的の有用物質を効率よく生産できることを見出した。

0008

すなわち、本発明は、目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を含む組換えプラスミドが導入された微生物を固体培地の表面で繰り返し培養することを含む、タンパク質又はポリペプチドの製造方法を提供するものである。
また、本発明は、目的遺伝子を含む組換えプラスミドが導入された微生物を固体培地の表面で培養し、さらに固体培地の表面で継代培養を繰り返す、該プラスミドの安定化方法を提供するものである。

発明の効果

0009

本発明の方法によれば、微生物に導入された組換えプラスミドを長期間安定して保持でき、目的のタンパク質又はポリペプチドを効率よく生産することができる。

0010

本発明のタンパク質又はポリペプチドの製造方法は、目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を含む組換えプラスミドが導入された微生物を固体培地の表面で繰り返し培養することを含む、ものである。
また、本発明のプラスミドの安定化方法は、目的遺伝子を含む組換えプラスミドが導入された微生物を固体培地の表面で培養し、さらに固体培地の表面で継代培養を繰り返す、ものである。

0011

本発明において、組換えプラスミドは制限酵素法等の通常の方法で作製することができる。
例えば、適当なプラスミドベクターを制限酵素で切断し、そこに制限酵素切断配列を端部に有するように構築した目的遺伝子のDNAを添加することによって、該遺伝子DNAをベクターに挿入することができる。
目的遺伝子は、目的遺伝子産物をコードする遺伝子であり、微生物が生来有する遺伝子であってもよいが、好ましくは微生物が生来的に有さない異種遺伝子であり、なかでもタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子が好ましい。
利用可能なプラスミドベクターとしては、特に制限されず、例えば、pHY300PLK(タカラバイオ(株))等が挙げられる。

0012

本発明において、目的のタンパク質又はポリペプチドは、食品医薬品、化粧品洗浄剤、繊維、医療検査等の分野で用いられる産業上有用な酵素生理活性因子等のタンパク質又はポリペプチドが含まれる。
酵素としては、酸化還元酵素オキシドレダクターゼ)、転移酵素トランスフェラーゼ)、加水分解酵素ヒドロラーゼ)、脱離酵素リアーゼ)、異性化酵素イソメラーゼ)、合成酵素リガーゼシンセターゼ)等が含まれる。
なかでも、加水分解酵素が好ましく、更にセルラーゼα−アミラーゼプロテアーゼが好ましく、更にセルラーゼ、プロテアーゼが好ましい。セルラーゼ、プロテアーゼは、アルカリセルラーゼアルカリプロテアーゼが好ましい。アルカリセルラーゼ、アルカリプロテアーゼは、アルカリ性領域至適pHを有するセルラーゼ、プロテアーゼである。

0013

セルラーゼは、多糖加水分解酵素の分類(Biochem.J.,280,309(1991))中でファミリー5に属するセルラーゼが好ましく、微生物由来のセルラーゼがより好ましく、バチルス(Bacillus)属細菌由来のセルラーゼが更に好ましい。バチルス属細菌由来のセルラーゼとしては、バチルスエスピー(Bacillus sp.)KSM−S237株(FERM BP−7875)、バチルス エスピー(Bacillus sp.)KSM−64株(FERM BP−2886)由来のアルカリセルラーゼが挙げられる。

0014

プロテアーゼは、微生物由来のプロテアーゼが好ましく、バチルス属細菌由来のプロテアーゼがより好ましく、活性中心セリン残基であるセリンプロテアーゼ金属プロテアーゼが更に好ましい。バチルス属細菌由来のプロテアーゼとしては、バチルスエスピー(Bacillus sp.)KSM−64株(FERM P−10482)、バチルスクラウジ(Bacillus clausii)KSM K−16株(FERM BP−3376)、バチルス エスピー(Bacillus sp.)KSM−KP43株(FERM BP−6532)、バチルス エスピー(Bacillus sp.)KSM—KP9860株(FERM BP−6534)、バチルス No.D−6(FERM P−1592)(プロテアーゼE−1)、バチルス エスピーY(FERM BP−1029)、バチルス SD521(FERM P−11162)、バチルス エスピー(Bacillus sp.)KSM−9865株(FERM P−18566)、NCIB12289、NCIB12513由来のアルカリプロテアーゼが挙げられる。

0015

作製した組換えプラスミドは、コンピテントセル法、プロトプラスト法等の通常の方法で微生物に導入することができる。
本発明において、微生物としては、ブドウ球菌(Staphylococcus)属、エンテロコッカス(Enterococcus)属、リステリア(Listeria)属、バチルス(Bacillus)属、コリネバクテリウム属(Corynebacterium)に属する微生物等が挙げられる。なかでも、バチルス(Bacillus)属細菌が好ましく、枯草菌(Bacillus subtilis)がより好ましい。
微生物は、各種遺伝子操作によって、塩基配列の挿入、置換欠失等の変異が生じた変異微生物であってもよい。

0016

本発明では、上記組換えプラスミドが導入された微生物を固体培地の表面で繰り返し培養する。
ここで、「繰り返し培養する」とは、微生物を所定の稠密状態になるまで培養し、その後培養物を新たな培養培地移し換えて培養する操作を繰り返し行うことをいう。初代培養から1回目の継代培養、1回目から2回目以降の継代培養はそれぞれ同一の培養条件としてもよく、異なる培養条件としてもよい。
培養は、生産性の点から、世代数にして45代以上、更に70代以上、こと更80代以上にわたって行うことが好ましい。
また、継代培養の間隔は、24時間以内、更には12時間以内が好ましい。

0017

固体培地は、特に限定されず、微生物の種類に応じたもの、微生物による目的遺伝子産物の生産のために用いられるものでよい。通常、固体培地は、微生物が資化し得る炭素源窒素源無機塩類、その他必要な栄養源等を含む固体培地が好ましい。作業性の観点から、寒天培地を用いても良い。
寒天培地の場合、培地中の寒天は、0.5〜5質量%添加することが好ましい。
他の炭素源としては、例えば、糖類(グルコースアラビノースキシロースマンノースフラクトースガラクトースシュークロースマルトースラクトースソルビトールマンニトールイノシットグリセリン可溶性澱粉廃糖蜜転化糖等)、酢酸等の資化しうる有機酸エタノール等の低級アルコール類等が挙げられる。なかでも、増殖の点から、糖類を含有するのが好ましい。
窒素源としては、例えば、アンモニア無機有機アンモニウム塩尿素コーングルテンミール大豆粉酵母エキス肉エキス魚肉エキスポリペプトントリプトンペプトン、各種アミノ酸、ソイビーンミール等が挙げられる。
無機塩類としては、例えば、硫酸塩、マグネシウム塩亜鉛塩等が挙げられる。
培地中の寒天以外の炭素源は、増殖の点から、0〜20質量%添加することが好ましい。また、窒素源は、上記を適宜混合した後に添加することが好ましい。これら培地成分は、必要に応じて培地中に追添することもできる。
また、LB寒天培地等の市販の固体培地を用いてもよい。
固体培地の形状は、特に制限されず、平板、斜面、高層培地等として用いることができる。これら培地中には、抗生物質や微量成分を適宜必要に応じて添加しても良い。

0018

固体培地の表面で培養する条件は、微生物により目的遺伝子産物が生産される条件であればよい。
培養温度は、微生物の増殖に悪影響を与えない範囲であれば特に制限されないが、通常、20〜48℃が好ましく、25〜45℃がより好ましく、更に28〜39℃が好ましい。

0019

固体培地に塗沫する微生物の量は、1〜1000CFU/mLが好ましい。

0020

培養時のpHは、通常、6.5〜8.5が好ましく、pH7.0〜8.0がより好ましい。

0021

培養期間は、微生物の増殖に応じて1〜7日、更に1〜3日、更には1〜2日が好ましい。

0022

例えば、枯草菌(Bacillus subtilis)によるアルカリセルラーゼ又はアルカリプロテアーゼの生産では、好気的条件下、一定の温度で行うのが好ましい。固体培地を用いる場合には一定の湿度範囲内で乾燥を抑制することが好ましい。

0023

このような培養を行うことにより、プラスミドが安定化し、宿主内のプラスミドの脱落を抑えることができ、効率よく目的のタンパク質又はポリペプチドが得られる。
本発明において、プラスミドの保持率は、1培養あたり0.9以上、好ましくは0.95以上である。
培養終了後、適当な分離・精製手段により培地から目的遺伝子産物、例えば目的のタンパク質又はポリペプチドを採取することができる。
また、プラスミドが安定に保持された微生物を目的遺伝子産物生産用の培地に供して目的遺伝子産物を高生産させてもよい。

0024

製造例1アルカリプロテアーゼ遺伝子導入用ベクターによる枯草菌の形質転換
特開2014−161284に示すように、アルカリプロテアーゼ遺伝子を含む組換えプラスミドpHY−SP64−E−1を得た。
次いで、組換えプラスミドpHY−SP64−E−1を、特開2014−158430に示すように構築した枯草菌変異株であるrecA遺伝子欠失株(kao119株)にプロトプラスト形質転換法(Mol.Gen.Genet.,1979,vol.168,p.111)によって導入し、形質転換体を得た。

0025

製造例2アルカリセルラーゼ遺伝子導入用ベクターによる枯草菌の形質転換
特開2014−158430に示すように、アルカリセルラーゼ遺伝子を含む組換えプラスミドpHY−S237を作製した。
次いで、組換えプラスミドpHY−S237を、上記と同様の特開2014−158430に示すように構築したrecA遺伝子欠失株(kao119株)にプロトプラスト形質転換法(Mol.Gen.Genet.,1979,vol.168,p.111)によって導入し、形質転換体を得た。

0026

実施例1及び実施例2
製造例1で得た形質転換体を適宜希釈・懸濁した後、15mLのLB−Tc−Sm寒天培地(1質量%トリプトン、0.5質量%酵母エキス、1質量%NaCl、10ppmテトラサイクリン、1質量%スキムミルク、1.5質量%寒天)の表面に100μLを塗布し、培養温度32℃で2日又は3日で植え継いで繰り返し固体培養を行った。

0027

実施例3
製造例2で得た形質転換体を適宜希釈・懸濁した後、15mLのLB−Tc−Tb寒天培地(1質量%トリプトン、0.5質量%酵母エキス、1質量%NaCl、10ppmテトラサイクリン、1質量%CMC、0.04質量%トリパンブルー、1.5質量%寒天)の表面に100μL塗布し、培養温度32℃で2日で植え継いで繰り返し固体培養を行った。

0028

比較例1
製造例1で得た形質転換体を、20mLのLB−Tc培地(1質量%トリプトン、0.5質量%酵母エキス、1質量%NaCl、10ppmテトラサイクリン)に1%(v/v)接種し、培養温度32℃、200r/minで2日で植え継いで繰り返し振盪培養を行った。

0029

比較例2
培養温度を25℃とし、3日で植え継いだ以外は比較例1と同様に繰り返し振盪培養を行った。

0030

比較例3
製造例2で得た形質転換体を、20mLのLB−Tc−Tb培地(1質量%トリプトン、0.5質量%酵母エキス、1質量%NaCl、10ppmテトラサイクリン、1質量%CMC、0.04質量%トリパンブルー)に1%(v/v)接種し、培養温度32℃、200r/minで2日で植え継いで繰り返し振盪培養を行った。

0031

〔プラスミド安定性評価及び保持率の算出〕
上記実施例1〜3、比較例1〜3で得た培養物に対して、コロニーカウント法により、下記式に従ってプラスミド保持率の算出を行った。プラスミドを保持しているかどうかは目視により判別を行った。
〔プラスミド保持率の算出〕
プラスミド保持率=(プラスミドを保持したコロニー数)/(全コロニー数)
培養条件及びプラスミド保持率の結果を表1に示す。

0032

0033

表1より明らかなように、固体培地で継代培養を行った実施例1〜3ではプラスミドの脱落は認められず、プラスミドを安定に保持していることが確認された。これに対して、液体培養ではプラスミドは脱落し、培養温度25℃で増殖速度が遅くてもプラスミドは安定に保持されなかった。

0034

〔アルカリプロテアーゼ生産性評価〕
実施例1、比較例1で得られた各世代の形質転換体を、タンパク生産性評価用培地(1.0質量%酵母エキス、1.0質量%魚肉エキス、0.24質量%金属塩、16質量%マルトース、3.6質量%アミノ酸混合物、0.4質量%アンモニウム塩、0.2質量%リン酸二カリウム、10ppmテトラサイクリン)に接種し、それぞれ36℃で3日間培養した。
培養後、菌体を除いた培養上清アルカリプロテアーゼ活性を下記の手順にて測定し、菌体外分泌生産されたアルカリプロテアーゼの量を求めた。
1/15Mリン酸緩衝液(pH7.4)0.9mL、40mM Glt−Ala−Ala−Pro−Leu−p−ニトロアニリド/ジメチルスルホキシド溶液0.05mLを試験管に採り、30℃で5分間保温した。これに酵素液(培養上清)0.05mLを加えて30℃で10分間反応を行った後、5%(w/v)クエン酸水溶液2.0mLを加えて反応を停止し、分光光度計を用いて420nmにおける吸光度を測定した。吸光度の変化に基づいてサンプル中のアルカリプロテアーゼ量を定量した。1分間に1μmolのp−ニトロアニリンを生成する酵素活性を1Uとし、比活性よりアルカリプロテアーゼ生産量を算出した。
結果を表2に示す。

0035

0036

〔アルカリセルラーゼ生産性評価〕
実施例3、比較例3で得られた各世代の形質転換体を、上記と同じタンパク生産性評価用培地に接種し、それぞれ36℃で3日間培養した。
培養後、菌体を除いた培養上清のアルカリセルラーゼ活性を下記の手順にて測定し、菌体外に分泌生産されたアルカリセルラーゼの量を求めた。
1/7.5Mリン酸緩衝液(pH7.4、和光純薬)で適宜希釈したサンプル溶液50μLに0.4mM p−nitrophenyl−β−D−cellotrioside(生化学工業)を50μL加えて混和し、30℃にて反応を行った際に遊離するp−ニトロフェノール量を420nmにおける吸光度(OD420nm)変化により定量した。1分間に1μmolのp−ニトロフェノールを遊離させる酵素量を1Uとし、比活性よりセルラーゼ生産量は比活性よりアルカリセルラーゼ生産量を算出した。
結果を表3に示す。

0037

実施例

0038

表2及び表3より明らかなように、固体培地で継代培養を行うと、液体培養の場合と比較して、アルカリプロテアーゼ及びアルカリセルラーゼの生産性が高いことが確認された。

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