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課題

野生株に対してゲノムの大領域が欠失し、目的遺伝子産物を高生産することができる枯草菌変異株、及び当該枯草菌変異株を用いた目的遺伝子産物の製造方法の提供。

解決手段

枯草菌変異株であって、 prophage6領域、prophage1領域、prophage4領域、PBSX領域、prophage5領域、prophage3領域、spb領域、pks領域、skin領域、pps領域、prophage2領域、ydcL−ydeK−ydhU領域、yisB−yitD領域、yunA−yurT領域、cgeE−ypmQ領域、yeeK−yesX領域、pdp−rocR領域、ycxB−sipU領域、prophage7領域(yrkM−yraK、又はyrkS-yraK)、sbo−ywhH領域、yybP−yyaJ領域及びyncM−fosB領域からなる群より選択される1以上の領域が欠失したゲノムを有し、 abrB遺伝子又はそれに相当する遺伝子が恒常的に発現するように遺伝子構築され、且つkinA遺伝子が欠失又は不活性化されている、枯草菌変異株。

概要

背景

微生物による有用物質工業的生産は、アルコール飲料味噌醤油等の食品類をはじめとし、アミノ酸有機酸核酸関連物質抗生物質糖質、脂質、タンパク質等、その種類は多岐に渡っており、またその用途についても食品医薬品、洗浄剤化粧品等日用品、或いは各種化成品原料に至るまで幅広い分野に広がっている。

こうした微生物による有用物質の工業生産においては、その生産性の向上が重要な課題の一つであり、その手法として、突然変異等の遺伝学的手法による生産菌の育種が行われてきた。特に最近では、微生物遺伝学バイオテクノロジー発展により、遺伝子組換え技術等を用いたより効率的な生産菌の育種が行われるようになっている。さらに、近年のゲノム解析技術の急速な発展を受けて、対象とする微生物のゲノム情報解読し、これらを積極的に産業に応用しようとする試みもなされている。

近年、枯草菌については、枯草菌ゲノムに存在する約4100種類の遺伝子の破壊株網羅的に研究され、271個の遺伝子が生育に必須であることが指摘されている(非特許文献1)。また、枯草菌等の胞子形成初期に関わる遺伝子やプロテアーゼ遺伝子、又は細胞壁或いは細胞膜中のテイコ酸へのD−アラニン付加に関わる遺伝子、更にはサーファクチン生合成或いは分泌に関わる遺伝子を単独に欠失又は不活性化した菌株構築されている(特許文献1〜8参照)。

枯草菌についてはまた、ゲノムの大領域あるいは遺伝子を欠失させた変異株網羅的解析により、各種酵素の生産性に優れた変異株が見出されている。この研究で得られた枯草菌変異株の1つであるMGB874株は、枯草菌Bacillus subtilis Marburg No.168(枯草菌168株)に由来し、そのゲノムの合計874kbが削除された変異株であるが、野生株である168株に比較して、タンパク質の分泌生産性が有意に向上することが報告されている(特許文献9)。また、最近では、当該ゲノムの大領域を欠失させて得られた枯草菌株を用いて、バイオポリマーとして注目されているポリ−γ−グルタミン酸PGA)や、生分解性の高い天然キレート剤として知られているジピコリン酸(2,6−ピリジンジカルボン酸DPA)を効率よく製造する方法が報告されている(特許文献10、特許文献11)。
斯様に枯草菌は、有用物質の生産に極めて重要な微生物であり、目的遺伝子産物又は当該遺伝子産物から合成される目的生産物の工業的生産のために、生産性がより向上した枯草菌変異株が求められている。

一方、枯草菌AbrBは、対数増殖期から定常期へと移行する間の遷移期、および定常期において、胞子形成やコンピテンス、或いは栄養源獲得などに関与する様々な遺伝子発現の制御に重要な役割を果たす転写因子であり(非特許文献2及び3)、例えば、AbrB制御下の遺伝子として死滅因子(killing factor)をコードするskf遺伝子を含むskfオペロン(skfA−H)などが負に制御されることが報告されている(非特許文献4)。また、abrB遺伝子を欠失させた枯草菌株では、アミラーゼプロテアーゼの生産性が向上することが報告されている(特許文献12)。
しかしながら、AbrBを恒常的に発現させた枯草菌変異株については全く報告されていない。
他方、枯草菌KinAは細胞質内に存在し、胞子形成初期に関与する多成分制御系ヒスチジンキナーゼで、自身のリン酸化を経て、リン酸基をSpo0Fに転移し、Spo0F〜Pを生じるとされている。KinA変異株では胞子形成能野生型に比較して1〜30%に減少するとされている(非特許文献5)。また、KinA変異株ではアルカリセルラーゼ分泌生産性が向上することが認められている(特許文献13)。

概要

野生株に対してゲノムの大領域が欠失し、目的遺伝子産物を高生産することができる枯草菌変異株、及び当該枯草菌変異株を用いた目的遺伝子産物の製造方法の提供。 枯草菌変異株であって、 prophage6領域、prophage1領域、prophage4領域、PBSX領域、prophage5領域、prophage3領域、spb領域、pks領域、skin領域、pps領域、prophage2領域、ydcL−ydeK−ydhU領域、yisB−yitD領域、yunA−yurT領域、cgeE−ypmQ領域、yeeK−yesX領域、pdp−rocR領域、ycxB−sipU領域、prophage7領域(yrkM−yraK、又はyrkS-yraK)、sbo−ywhH領域、yybP−yyaJ領域及びyncM−fosB領域からなる群より選択される1以上の領域が欠失したゲノムを有し、 abrB遺伝子又はそれに相当する遺伝子が恒常的に発現するように遺伝子構築され、且つkinA遺伝子が欠失又は不活性化されている、枯草菌変異株。なし

目的

本発明は、野生株に対してゲノムの大領域が欠失し、目的遺伝子産物又は当該遺伝子産物を用いて合成される目的生産物を高生産することができる枯草菌変異株、及び当該枯草菌変異株を用いた有用物質の製造方法を提供することに関する。

効果

実績

技術文献被引用数
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請求項1

枯草菌変異株であって、prophage6領域、prophage1領域、prophage4領域、PBSX領域、prophage5領域、prophage3領域、spb領域、pks領域、skin領域、pps領域、prophage2領域、ydcL−ydeK−ydhU領域、yisB−yitD領域、yunA−yurT領域、cgeE−ypmQ領域、yeeK−yesX領域、pdp−rocR領域、ycxB−sipU領域、prophage7領域(yrkM−yraK、又はyrkS-yraK)、sbo−ywhH領域、yybP−yyaJ領域及びyncM−fosB領域からなる群より選択される1以上の領域が欠失したゲノムを有し、abrB遺伝子又はそれに相当する遺伝子が恒常的に発現するように遺伝子構築され、且つkinA遺伝子が欠失又は不活性化されている、枯草菌変異株。

請求項2

prophage6領域、prophage1領域、prophage4領域、PBSX領域、prophage5領域、prophage3領域、spb領域、pks領域、skin領域、pps領域、prophage2領域及びprophage7領域(yrkM-yraK)を欠失したゲノムを有する、請求項1記載の枯草菌変異株。

請求項3

prophage6領域、prophage1領域、prophage4領域、PBSX領域、prophage5領域、prophage3領域、spb領域、pks領域、skin領域、pps領域、prophage2領域、ydcL−ydeK−ydhU領域、yisB−yitD領域、yunA−yurT領域、cgeE−ypmQ領域、yeeK−yesX領域、pdp−rocR領域、ycxB−sipU領域、prophage7領域(yrkS−yraK)、sbo−ywhH領域、yybP−yyaJ領域及びyncM−fosB領域を欠失したゲノムを有する、請求項1記載の枯草菌変異株。

請求項4

abrB遺伝子又はそれに相当する遺伝子が恒常的に発現するような遺伝子構築が、abrB遺伝子又はそれに相当する遺伝子の転写開始制御領域、又は転写開始制御領域及びリボソーム結合部位、或いは転写開始制御領域から翻訳開始制御領域に至るまでの領域における抑制性制御因子結合部位を不活性化することである、請求項1〜3のいずれか1項記載の枯草菌変異株。

請求項5

abrB遺伝子又はそれに相当する遺伝子の転写開始制御領域、又は転写開始制御領域及びリボソーム結合部位、或いは転写開始制御領域から翻訳開始制御領域に至るまでの領域における抑制性制御因子の結合部位が、配列番号5に示される塩基配列において、20〜49番目塩基からなる領域又はこれに相当する領域、又は/及び73〜89番目の塩基からなる領域又はこれに相当する領域である、請求項1〜3のいずれか1項記載の枯草菌変異株。

請求項6

abrB遺伝子又はそれに相当する遺伝子が恒常的に発現するような遺伝子構築が、配列番号5に示される塩基配列において73〜89番目の塩基からなる領域又はこれに相当する領域を削除するものである、請求項5項記載の枯草菌変異株。

請求項7

abrB遺伝子又はそれに相当する遺伝子が、下記の(a)〜(f)からなる群より選択される、請求項1〜6のいずれか1項記載の枯草菌変異株。(a)配列番号1に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;(b)配列番号1に示すヌクレオチド配列と90%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつAbrBと同様の遷移期および定常期誘導される遺伝子の転写因子としての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;(c)配列番号1に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつAbrBと同様の遷移期および定常期に誘導される遺伝子の転写因子としての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;(d)配列番号2に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;(e)配列番号2に示すアミノ酸配列において1又は数個アミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなりかつAbrBと同様の遷移期および定常期に誘導される遺伝子の転写因子としての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;(f)配列番号2に示すアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつAbrBと同様の遷移期および定常期に誘導される遺伝子の転写因子としての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。

請求項8

kinA遺伝子が、下記の(g)〜(l)からなる群より選択される、請求項1〜7のいずれか1項記載の枯草菌変異株。(g)配列番号3に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;(h)配列番号3に示すヌクレオチド配列と90%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ胞子形成初期に関わる多成分制御系ヒスチジンキナーゼとしての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;(i)配列番号3に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ胞子形成初期に関わる多成分制御系のヒスチジンキナーゼとしての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;(j)配列番号4に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;(k)配列番号4に示すアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ胞子形成初期に関わる多成分制御系のヒスチジンキナーゼとしての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;(l)配列番号4に示すアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ胞子形成初期に関わる多成分制御系のヒスチジンキナーゼとしての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。

請求項9

請求項1〜8のいずれか1項記載の枯草菌変異株において、目的遺伝子が発現可能に強化又は導入された組換え枯草菌

請求項10

目的遺伝子が、セルラーゼ遺伝子である請求項9記載の組換え枯草菌。

請求項11

目的遺伝子が、ポリ−γ−グルタミン酸合成酵素遺伝子、又はポリ−γ−グルタミン酸合成酵素遺伝子及びポリ−γ−グルタミン酸分解酵素遺伝子である請求項9記載の組換え枯草菌。

請求項12

ポリ−γ−グルタミン酸合成酵素をコードする遺伝子が、枯草菌遺伝子pgsB、pgsC、pgsA及びpgsE、ならびにそれらに相当する遺伝子からなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子であり、ポリ−γ−グルタミン酸分解酵素遺伝子が枯草菌pgdS遺伝子又はそれに相当する遺伝子である請求項11記載の組換え枯草菌。

請求項13

目的遺伝子が、ジピコリン酸シンターゼ遺伝子である請求項9記載の組換え枯草菌。

請求項14

ジピコリン酸シンターゼをコードする遺伝子が、枯草菌spoVFA又はそれに相当する遺伝子及び枯草菌spoVFB又はそれに相当する遺伝子である請求項13記載の組換え枯草菌。

請求項15

枯草菌変異株の製造方法であって、prophage6領域、prophage1領域、prophage4領域、PBSX領域、prophage5領域、prophage3領域、spb領域、pks領域、skin領域、pps領域、prophage2領域、ydcL−ydeK−ydhU領域、yisB−yitD領域、yunA−yurT領域、cgeE−ypmQ領域、yeeK−yesX領域、pdp−rocR領域、ycxB−sipU領域、prophage7領域(yrkM−yraK、又はyrkS-yraK)、sbo−ywhH領域、yybP−yyaJ領域及びyncM−fosB領域からなる群より選択される1以上の領域が欠失したゲノムを有する枯草菌変異株において、abrB遺伝子又はそれに相当する遺伝子が恒常的に発現するように遺伝子構築する工程、及びkinA遺伝子を欠失又は不活性化させる工程を含む、方法。

請求項16

組換え枯草菌の製造方法であって、prophage6領域、prophage1領域、prophage4領域、PBSX領域、prophage5領域、prophage3領域、spb領域、pks領域、skin領域、pps領域、prophage2領域、ydcL−ydeK−ydhU領域、yisB−yitD領域、yunA−yurT領域、cgeE−ypmQ領域、yeeK−yesX領域、pdp−rocR領域、ycxB−sipU領域、prophage7領域(yrkM−yraK、又はyrkS-yraK)、sbo−ywhH領域、yybP−yyaJ領域及びyncM−fosB領域からなる群より選択される1以上の領域が欠失したゲノムを有する枯草菌変異株において、abrB遺伝子又はそれに相当する遺伝子が恒常的に発現するように遺伝子構築する工程、kinA遺伝子を欠失又は不活性化させる工程、及び目的遺伝子を発現可能に強化又は導入する工程を含む、方法。

請求項17

請求項9記載の組換え枯草菌を培養し、培養物又は菌体から目的遺伝子産物回収する工程を含む、目的遺伝子産物の製造方法。

請求項18

請求項10記載の組換え枯草菌を培養し、培養物又は菌体からセルラーゼを回収する工程を含む、セルラーゼの製造方法。

請求項19

請求項11又は12記載の組換え枯草菌を培養し、培養物からポリ−γ−グルタミン酸を回収する工程を含む、ポリ−γ−グルタミン酸の製造方法。

請求項20

請求項13又は14記載の組換え枯草菌を培養し、培養物からジピコリン酸を回収する工程を含む、ジピコリン酸の製造方法。

技術分野

0001

本発明は、新規枯草菌変異株及び利用に関する。

背景技術

0002

微生物による有用物質工業的生産は、アルコール飲料味噌醤油等の食品類をはじめとし、アミノ酸有機酸核酸関連物質抗生物質糖質、脂質、タンパク質等、その種類は多岐に渡っており、またその用途についても食品医薬品、洗浄剤化粧品等日用品、或いは各種化成品原料に至るまで幅広い分野に広がっている。

0003

こうした微生物による有用物質の工業生産においては、その生産性の向上が重要な課題の一つであり、その手法として、突然変異等の遺伝学的手法による生産菌の育種が行われてきた。特に最近では、微生物遺伝学バイオテクノロジー発展により、遺伝子組換え技術等を用いたより効率的な生産菌の育種が行われるようになっている。さらに、近年のゲノム解析技術の急速な発展を受けて、対象とする微生物のゲノム情報解読し、これらを積極的に産業に応用しようとする試みもなされている。

0004

近年、枯草菌については、枯草菌ゲノムに存在する約4100種類の遺伝子の破壊株網羅的に研究され、271個の遺伝子が生育に必須であることが指摘されている(非特許文献1)。また、枯草菌等の胞子形成初期に関わる遺伝子やプロテアーゼ遺伝子、又は細胞壁或いは細胞膜中のテイコ酸へのD−アラニン付加に関わる遺伝子、更にはサーファクチン生合成或いは分泌に関わる遺伝子を単独に欠失又は不活性化した菌株構築されている(特許文献1〜8参照)。

0005

枯草菌についてはまた、ゲノムの大領域あるいは遺伝子を欠失させた変異株網羅的解析により、各種酵素の生産性に優れた変異株が見出されている。この研究で得られた枯草菌変異株の1つであるMGB874株は、枯草菌Bacillus subtilis Marburg No.168(枯草菌168株)に由来し、そのゲノムの合計874kbが削除された変異株であるが、野生株である168株に比較して、タンパク質の分泌生産性が有意に向上することが報告されている(特許文献9)。また、最近では、当該ゲノムの大領域を欠失させて得られた枯草菌株を用いて、バイオポリマーとして注目されているポリ−γ−グルタミン酸PGA)や、生分解性の高い天然キレート剤として知られているジピコリン酸(2,6−ピリジンジカルボン酸DPA)を効率よく製造する方法が報告されている(特許文献10、特許文献11)。
斯様に枯草菌は、有用物質の生産に極めて重要な微生物であり、目的遺伝子産物又は当該遺伝子産物から合成される目的生産物の工業的生産のために、生産性がより向上した枯草菌変異株が求められている。

0006

一方、枯草菌AbrBは、対数増殖期から定常期へと移行する間の遷移期、および定常期において、胞子形成やコンピテンス、或いは栄養源獲得などに関与する様々な遺伝子発現の制御に重要な役割を果たす転写因子であり(非特許文献2及び3)、例えば、AbrB制御下の遺伝子として死滅因子(killing factor)をコードするskf遺伝子を含むskfオペロン(skfA−H)などが負に制御されることが報告されている(非特許文献4)。また、abrB遺伝子を欠失させた枯草菌株では、アミラーゼプロテアーゼの生産性が向上することが報告されている(特許文献12)。
しかしながら、AbrBを恒常的に発現させた枯草菌変異株については全く報告されていない。
他方、枯草菌KinAは細胞質内に存在し、胞子形成初期に関与する多成分制御系ヒスチジンキナーゼで、自身のリン酸化を経て、リン酸基をSpo0Fに転移し、Spo0F〜Pを生じるとされている。KinA変異株では胞子形成能野生型に比較して1〜30%に減少するとされている(非特許文献5)。また、KinA変異株ではアルカリセルラーゼ分泌生産性が向上することが認められている(特許文献13)。

0007

特開昭58−190390号公報
特開昭61−1381号公報
国際公開第89/04866号
特表平11−509096号公報
特許第3210315号公報
特表2001−527401号公報
特表2002−520017号公報
特表2001−503641号公報
特開2007−130013号公報
特開2013−252115号公報
特開2014−045692号公報
特開2007−74934号公報
特開2006−296268号公報

先行技術

0008

K. Kobayashi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 100, 4678-4683, 2003
M. A. Strauch, et al., Mol. Microbiol., 1993, 7:337-342
Z. E. V. Phillips, et al., Cell Mol. Life Sci., 2002, 59:392-402
M. Fujita, et al., J. Bacteriol., 2005, 187:1357-1368
日本細菌学雑誌、1996,51:789-801

発明が解決しようとする課題

0009

本発明は、野生株に対してゲノムの大領域が欠失し、目的遺伝子産物又は当該遺伝子産物を用いて合成される目的生産物を高生産することができる枯草菌変異株、及び当該枯草菌変異株を用いた有用物質の製造方法を提供することに関する。

課題を解決するための手段

0010

本発明者らは、枯草菌Bacillus subtilis Marburg No.168(枯草菌168株)に由来し、168株のゲノムの大領域が欠失した枯草菌変異株において、目的遺伝子産物又は当該遺伝子産物を用いて合成される目的生産物の生産性を更に向上させるべく検討した結果、遷移期および定常期に特異的に発現する遺伝子群を抑制する枯草菌転写因子であるAbrBを恒常的に発現させると共に、kinA遺伝子を欠失又は不活化することにより、目的遺伝子産物又は当該遺伝子産物を用いて合成される目的生産物の生産性が向上した枯草菌変異株を取得できることを見出した。

0011

すなわち本発明は、以下の(1)〜(7)に係るものである。
(1)枯草菌変異株であって、
prophage6領域、prophage1領域、prophage4領域、PBSX領域、prophage5領域、prophage3領域、spb領域、pks領域、skin領域、pps領域、prophage2領域、ydcL−ydeK−ydhU領域、yisB−yitD領域、yunA−yurT領域、cgeE−ypmQ領域、yeeK−yesX領域、pdp−rocR領域、ycxB−sipU領域、prophage7領域(yrkM−yraK、又はyrkS-yraK)、sbo−ywhH領域、yybP−yyaJ領域及びyncM−fosB領域からなる群より選択される1以上の領域が欠失したゲノムを有し、
abrB遺伝子又はそれに相当する遺伝子が恒常的に発現するように遺伝子構築され、且つkinA遺伝子が欠失又は不活性化されている、枯草菌変異株。
(2)上記(1)の枯草菌変異株において、目的遺伝子が発現可能に強化又は導入された組換え枯草菌
(3)枯草菌変異株の製造方法であって、
prophage6領域、prophage1領域、prophage4領域、PBSX領域、prophage5領域、prophage3領域、spb領域、pks領域、skin領域、pps領域、prophage2領域、ydcL−ydeK−ydhU領域、yisB−yitD領域、yunA−yurT領域、cgeE−ypmQ領域、yeeK−yesX領域、pdp−rocR領域、ycxB−sipU領域、prophage7領域(yrkM−yraK、又はyrkS-yraK)、sbo−ywhH領域、yybP−yyaJ領域及びyncM−fosB領域からなる群より選択される1以上の領域が欠失したゲノムを有する枯草菌変異株において、abrB遺伝子又はそれに相当する遺伝子が恒常的に発現するように遺伝子構築する工程、及びkinA遺伝子を欠失又は不活性化させる工程を含む、方法。
(4)組換え枯草菌の製造方法であって、
prophage6領域、prophage1領域、prophage4領域、PBSX領域、prophage5領域、prophage3領域、spb領域、pks領域、skin領域、pps領域、prophage2領域、ydcL−ydeK−ydhU領域、yisB−yitD領域、yunA−yurT領域、cgeE−ypmQ領域、yeeK−yesX領域、pdp−rocR領域、ycxB−sipU領域、prophage7領域(yrkM−yraK、又はyrkS-yraK)、sbo−ywhH領域、yybP−yyaJ領域及びyncM−fosB領域からなる群より選択される1以上の領域が欠失したゲノムを有する枯草菌変異株において、abrB遺伝子又はそれに相当する遺伝子が恒常的に発現するように遺伝子構築する工程、kinA遺伝子を欠失又は不活性化させる工程、及び目的遺伝子を発現可能に強化又は導入する工程を含む、方法。
(5)上記(2)の組換え枯草菌を培養し、培養物又は菌体から目的遺伝子産物を回収する工程を含む、目的遺伝子産物の製造方法。
(6)上記(2)の組換え枯草菌を培養し、培養物又は菌体からポリ−γ−グルタミン酸を回収する工程を含む、ポリ−γ−グルタミン酸の製造方法。
(7)上記(2)の組換え枯草菌を培養し、培養物又は菌体からジピコリン酸を回収する工程を含む、ジピコリン酸の製造方法。

発明の効果

0012

本発明によれば、目的遺伝子産物又は当該遺伝子産物を用いて合成される目的生産物の生産性に優れた枯草菌変異株が提供される。当該枯草菌変異株を用いることによって、目的遺伝子産物である目的タンパク質又はポリペプチド、又は遺伝子産物を用いて合成されるPGA、DPAといった有用な目的生産物の効率的生産が実現できる。

図面の簡単な説明

0013

枯草菌のゲノム上から所定の領域を欠失させる方法の一例を示す模式図。
枯草菌ゲノムから外来薬剤耐性遺伝子を除去する手順を示す模式図。
mazF遺伝子融合カセットを使用したマーカーフリー欠失法の手順を示す模式図。
βガラクトシダーゼ活性測定の図。

0014

本明細書に記載の枯草菌の各遺伝子及びゲノム領域名称は、JAFAN:Japan Functional Analysis Network for Bacillus subtilis(BSORF DB)でインターネット公開([bacillus.genome.ad.jp/]、2006年1月18日更新)された枯草菌ゲノムデータに基づいて記載されている。

0015

本明細書において、アミノ酸配列及びヌクレオチド配列同一性はLipman−Pearson法(Lipman,DJ.,Pearson.WR.:Science,1985,227:1435−1441)によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx−Win Ver.11(ソフトウェア開発)のホモロジー解析(Search homology)プログラムを用いて、Unit size to compare(ktup)を2として解析を行うことにより算出される。

0016

本明細書において、別途定義されない限り、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列におけるアミノ酸又はヌクレオチドの欠失、置換、付加又は挿入に関して使用される「1又は数個」の「数個」とは、例えば、対象となるアミノ酸配列又はヌクレオチド配列の総アミノ酸基数又は総ヌクレオチド数の20%以下の最大整数、好ましくは同じく10%に当たる最大整数、より好ましくは同じく5%に当たる最大整数、さらに好ましくは同じく4%以下の最大整数、さらに好ましくは同じく3%以下の最大整数、さらに好ましくは同じく2%以下の最大整数、さらにより好ましくは同じく1%以下の最大整数を意味する。また本明細書において、アミノ酸又はヌクレオチドの「付加」には、配列の一末端及び両末端への1又は数個のアミノ酸又はヌクレオチドの付加が含まれる。

0017

本明細書において、別途定義されない限り、ハイブリダイゼーションに関する「ストリンジェントな条件」とは、配列同一性が約80%以上、好ましくは約90%以上のヌクレオチド配列を有する遺伝子の確認を可能にする条件である。「ストリンジェントな条件」としては、Molecular Cloning−A LABORATORYMANUAL THIRDEDITION(Joseph Sambrook,David W.Russell,Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001)記載の条件が挙げられる。ハイブリダイゼーションの当業者は、プローブのヌクレオチド配列や濃度、長さ等に応じて、ハイブリダイゼーション溶液塩濃度、温度等を調節することにより、ストリンジェントな条件を適切に作り出すことができる。一例を示せば、上記「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーション条件としては、5×SSC、70℃以上が好ましく、5×SSC、85℃以上がより好ましく、又は、6×SSC、60℃以上が好ましく、6×SSC、65℃以上がより好ましく、洗浄条件としては、1×SSC、60℃以上が好ましく、1×SSC、73℃以上がより好ましい。上記SSC及び温度条件の組み合わせは例示であり、当業者であれば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記若しくは他の要素を適宜組み合わせることにより、適切なストリンジェンシーを実現することが可能である。

0018

本明細書において、遺伝子の上流及び下流とは、それぞれ、対象として捉えている遺伝子又は領域を基点とした、5’側及び3’側に続く領域を示す。

0019

本明細書において、遺伝子の制御領域とは、該領域の下流の遺伝子の細胞内における発現を制御する機能を有し、好ましくは、下流遺伝子を構成的に発現又は高発現させる機能を有する領域である。具体的には、当該遺伝子におけるコーディング領域の上流に存在し、RNAポリメラーゼ相互作用して当該遺伝子の転写を制御する機能を有する領域と定義され得る。好ましくは、本明細書における遺伝子の制御領域とは、当該遺伝子におけるコーディング領域の上流200〜600ヌクレオチド程度の領域をいう。制御領域は、遺伝子の転写開始制御領域及び/又は翻訳開始制御領域、或いは転写開始制御領域から翻訳開始制御領域に至るまでの領域を含む。転写開始制御領域はプロモーター及び転写開始点を含む領域であり、翻訳開始制御領域は開始コドンと共にリボソーム結合部位を形成するShine−Dalgarno(SD)配列に相当する部位である(Shine,J.,Dalgarno,L.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,1974,71:1342−1346)。

0020

本明細書において、目的遺伝子と制御領域とを「作動可能に連結する」とは、制御領域による遺伝子発現を制御する機能が目的遺伝子に作用するように、DNA上で制御領域と目的遺伝子とを配置することをいう。目的遺伝子と制御領域を作動可能に連結する方法としては、当該制御領域の下流に当該目的遺伝子を連結する方法が挙げられる。

0021

本明細書において、「転写因子」(「転写制御因子」)とは、DNA上の転写開始制御領域などに結合し、DNAからRNAへの転写過程を促進或いは抑制するタンパク質を意味する。
また、本明細書において、「遷移期」とは細菌の増殖において、対数増殖期又は指数増殖期から定常期又は静止期へと移行する間を意味する。

0022

本明細書において、「目的遺伝子産物」とは、本発明の枯草菌変異株を用いて生産される目的の遺伝子生産物(タンパク質又はポリペプチド)を意味し、「目的生産物」とは、当該遺伝子産物を用いて生産される目的の生産物(PGA、DPA等)を意味し、「目的遺伝子」とは、上記目的遺伝子産物又は目的生産物を生産するための遺伝子を意味する。

0023

[1.枯草菌変異株の構築]
本発明の枯草菌変異株は、枯草菌野生株のゲノム上の大領域が欠失したゲノムを有し、枯草菌abrB遺伝子又はそれに相当する遺伝子が恒常的に発現するように遺伝子構築されており、且つkinA遺伝子が欠失又は不活性化されている、枯草菌変異株である。
本発明の枯草菌変異株は、該ゲノムの大領域が欠失した枯草菌変異株に対して、枯草菌abrB遺伝子又はそれに相当する遺伝子を恒常的に発現させる遺伝子改変と、kinA遺伝子を欠失又は不活性化させる改変とを加えることによって作製することができる。

0024

[1−1.ゲノム領域欠失枯草菌変異株]
本発明の枯草菌変異株の親株となる、ゲノムの大領域が欠失した枯草菌変異株は、枯草菌野生株(例えば、Bacillus subtilis Marburg No.168;本明細書において以下、枯草菌168株又は単に168株、あるいは野生株と称する)のゲノムと比べて、そのゲノム中の大領域が欠失したゲノムを有する。すなわち、当該枯草菌変異株のゲノムにおいては、枯草菌野生株のゲノム中の、prophage6(yoaV−yobO)領域、prophage1(ybbU−ybdE)領域、prophage4(yjcM−yjdJ)領域、PBSX(ykdA−xlyA)領域、prophage5(ynxB−dut)領域、prophage3(ydiM−ydjC)領域、spb(yodU−ypqP)領域、pks(pksA−ymaC)領域、skin(spoIVCB−spoIIIC)領域、pps(ppsE−ppsA)領域、prophage2(ydcL−ydeJ)領域、ydcL−ydeK−ydhU領域、yisB−yitD領域、yunA−yurT領域、cgeE−ypmQ領域、yeeK−yesX領域、pdp−rocR領域、ycxB−sipU領域、prophage7(yrkM−yraK、又はyrkS-yraK)領域、sbo−ywhH領域、yybP−yyaJ領域及びyncM−fosB領域からなる群より選択される領域の1以上が欠失している。
ここで、例えばprophage6(yoaV−yobO)領域の欠失とは、yoaV遺伝子及びyobO遺伝子の両遺伝子を含む、両遺伝子に挟まれる領域をゲノムから削除することを意味している。

0025

好ましくは、当該枯草菌変異株は、枯草菌野生株のゲノム中の、prophage6(yoaV−yobO)領域、prophage1(ybbU−ybdE)領域、prophage4(yjcM−yjdJ)領域、PBSX(ykdA−xlyA)領域、prophage5(ynxB−dut)領域、prophage3(ydiM−ydjC)領域、spb(yodU−ypqP)領域、pks(pksA−ymaC)領域、skin(spoIVCB−spoIIIC)領域、pps(ppsE−ppsA)領域、prophage2(ydcL−ydeJ)領域、ydcL−ydeK−ydhU領域、yisB−yitD領域、yunA−yurT領域、cgeE−ypmQ領域、yeeK−yesX領域、pdp−rocR領域、ycxB−sipU領域、prophage7(yrkS−yraK)領域、sbo−ywhH領域、yybP−yyaJ領域及びyncM−fosB領域からなる群より選択される領域の全てを欠失している枯草菌MGB874株(特開2007−130013号公報)や、枯草菌野生株のゲノム中の、prophage6(yoaV−yobO)領域、prophage1(ybbU−ybdE)領域、prophage4(yjcM−yjdJ)領域、PBSX(ykdA−xlyA)領域、prophage5(ynxB−dut)領域、prophage3(ydiM−ydjC)領域、spb(yodU−ypqP)領域、pks(pksA−ymaC)領域、skin(spoIVCB−spoIIIC)領域、pps(ppsE−ppsA)領域、prophage2(ydcL−ydeJ)領域、prophage7(yrkM−yraK)領域からなる群より選択される領域の全てを欠失しているOA105株が挙げられる。

0026

OA105株は、特開2007−130013号公報に記載されているprophage6(yoaV−yobO)領域、prophage1(ybbU−ybdE)領域、prophage4(yjcM−yjdJ)領域、PBSX(ykdA−xlyA)領域、prophage5(ynxB−dut)領域、prophage3(ydiM−ydjC)領域、spb(yodU−ypqP)領域、pks(pksA−ymaC)領域、skin(spoIVCB−spoIIIC)領域、pps(ppsE−ppsA)領域、prophage2(ydcL−ydeJ)領域を欠失した株(MGB469株)に対して、後記実施例5に記載のprophage7(yrkM−yraK)領域をさらに欠失することにより、調製される。
なお、本明細書記載のMGB874株の欠失領域であるskin(spoIVCB−spoIIIC)領域及びprophage7(yrkS−yraK)領域は、隣接した領域であり、特開2007−130013号公報に記載されているSKIN−Pro7(spoIVCB−yraK)領域と同じ領域である。
MGB469株及びMGB874株は国立遺伝学研究所NBRP(ナシナルバイオリソースプロジェクト)より分譲可能となっている(http://www.shigen.nig.ac.jp/bsub/kaoListAction.do)。

0027

上記ゲノムの大領域が欠失した枯草菌変異株は、例えば、168株等の任意の枯草菌株から上述のゲノム領域を欠失させることによって作製することができる。欠失させるべき目的のゲノム領域は、例えば、当該任意の枯草菌株のゲノムを、公開されている枯草菌168株のゲノムと対比することにより決定することができる。枯草菌168株の全ヌクレオチド配列及びゲノムの情報は、上述のBSORF DB、又はGenBank:AL009126.2([www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/38680335])から入手することができる。当業者は、これらの情報源から得た枯草菌168株のゲノム情報に基づいて、欠失させるべき目的のゲノム領域を決定することができる。ここで、欠失させるべきゲノム領域は、公開されている枯草菌168株における上述のゲノム領域のヌクレオチド配列に対して、1又は数個(例えば、1〜100個、好ましくは1〜50個、より好ましくは1〜30個、さらに好ましくは1〜10個、さらにより好ましくは1〜5個)のヌクレオチドにおける天然又は人工的に引き起こされた欠失、置換、挿入、付加等の変異を含むヌクレオチド配列を有するゲノム領域であり得る。あるいは、欠失させるべきゲノム領域は、公開されている枯草菌168株における上述のゲノム領域に対して、ヌクレオチド配列において好ましくは80%以上同一、さらにより好ましくは90%以上同一、なお好ましくは95%以上同一なゲノム領域であり得る。

0028

あるいは、上記欠失させるべきゲノム領域は、表1に示す一対のオリゴヌクレオチドセットにより挟み込まれる領域として表すことができる。表1に記載の領域を枯草菌ゲノム上から欠失させる方法としては、特に限定されないが、例えばSOE−PCR法(splicing by overlap extensionPCR:Gene,1989,77:61−68)等により調製された欠失用DNA断片を用いた2重交差法が挙げられる。当該方法により枯草菌野生株から所定のゲノム領域が欠失した変異株を作製する手順は、特開2007−130013号公報に詳述されているが、以下に概要を説明する。

0029

0030

SOE−PCR法による欠失用DNA断片の調製と当該欠失用DNA断片を用いた2重交差法による目的領域の欠失の手順の概要を図1に示す。初めに、SOE−PCR法により、欠失させるべき目的領域の上流に隣接する約0.1〜3kb領域に対応する断片(上流断片と称する)と、同じく下流に隣接する約0.1〜3kb領域に対応する断片(下流断片と称する)とを連結したDNA断片を調製する。好ましくは、目的領域の欠失を確認するために、当該上流断片と下流断片の間に薬剤耐性遺伝子などのマーカー遺伝子断片をさらに連結したDNA断片を調製する。

0031

まず、1回目のPCRによって、欠失させるべき領域の上流断片A及び下流断片B、並びに必要に応じてマーカー遺伝子断片(図1中では、クロラムフェニコール耐性遺伝子断片Cm)の3断片を調製する。上流断片及び下流断片のPCR増幅の際には、後に連結される断片の末端10〜30ヌクレオチドの配列を付加したプライマーを使用する。例えば、上流断片A、薬剤耐性マーカー遺伝子断片Cm、及び下流断片Bをこの順で連結させる場合、上流断片Aの下流末端に結合するプライマーの5'末端に、薬剤耐性マーカー遺伝子断片Cmの上流側10〜30ヌクレオチドに相当する配列を付加し(図1、プライマーDR1)、また下流断片Bの上流末端に結合するプライマーの5'末端に、薬剤耐性マーカー遺伝子断片Cmの下流側10〜30ヌクレオチドに相当する配列を付加する(図1、プライマーDF2)。このように設計したプライマーセットを用いて上流断片A及び下流断片BをPCRで増幅した場合、増幅された上流断片A'の下流側には薬剤耐性マーカー遺伝子断片Cmの上流側に相当する領域が付加されることとなり、増幅された下流断片B'の上流側には薬剤耐性マーカー遺伝子断片Cmの下流側に相当する領域が付加されることとなる。

0032

次に、1回目のPCRで調製した上流断片A'、薬剤耐性マーカー遺伝子断片Cm、及び下流断片B'を混合して鋳型とし、上流断片の上流側に結合するプライマー(図1、プライマーDF1)及び下流断片の下流側に結合するプライマー(図1、プライマーDR2)からなる1対のプライマーを用いて2回目のPCRを行う。この2回目のPCRにより、上流断片A、薬剤耐性マーカー遺伝子断片Cm、及び下流断片Bをこの順で結合した欠失用DNA断片Dを増幅することができる。

0033

上述の方法などによって得られる欠失用DNA断片を、通常の制限酵素DNAリガーゼを用いてプラスミドに挿入し、欠失導入用プラスミドを構築する。あるいは、上流断片及び下流断片を直接連結した欠失用DNA断片を調製した後、当該欠失用DNA断片を薬剤耐性マーカー遺伝子を含むプラスミドに挿入することで、上流断片及び下流断片に加えて薬剤耐性マーカー遺伝子断片を有する欠失導入用プラスミドを構築することができる。

0034

上記手順で構築された欠失導入用プラスミドを、コンピテントセル形質転換法等の通常の手法により、ゲノム領域を欠失させたい枯草菌に導入する。プラスミドの導入により、当該プラスミド上の上流断片及び下流断片と、枯草菌ゲノムのそれらに相同な領域との間で2重交差の相同組換えが生じ、欠失させるべき領域が薬剤耐性マーカー遺伝子に置き換えられた形質転換体が得られる(図1)。形質転換体の選択は、欠失用DNA断片中に存在する薬剤耐性遺伝子などのマーカー遺伝子の発現を指標に行えばよい。例えば、クロラムフェニコール耐性遺伝子断片で形質転換処理をした菌を、抗生物質(クロラムフェニコール等)を含む培地で培養し、生育したコロニーを回収することで、目的の領域が欠失しクロラムフェニコール耐性遺伝子に置き換えられた形質転換体を取得することができる。さらに、形質転換体のゲノムDNAを抽出し、これを鋳型としてPCRを行うことで、目的の領域が欠失されていることを確認することができる。

0035

次に、得られた形質転換体から、ゲノムDNAに挿入された上記マーカー遺伝子を除去する。除去の手順としては、特に限定されないが、図2に示すような2段階相同組換え法を用いることができる(特開平2009−254350号公報)。当該方法では、初めに第1相同組換えのためのDNA断片(供与体DNA)を調製する。調製の方法としては、特に限定されないが、上述したSOE−PCR法等が挙げられる。供与体DNAとしては、例えば、除去すべきマーカー遺伝子領域(すなわち、欠失された領域)の上流に隣接する領域に対応する約0.1〜3kb断片(上流断片)及び同じく下流に隣接する領域に対応する約0.1〜3kb断片(下流断片)が結合した断片と、当該除去すべきマーカー遺伝子下流領域の断片とが連結したDNA断片を用いることができる。好適には、当該下流断片と除去すべき第1のマーカー遺伝子下流領域断片との間に、相同組換えの指標となる第2のマーカー遺伝子等が挿入されたDNA断片が用いられる(図2を参照)。

0036

次いで、調製された供与体DNAをコンピテントセル形質転換法等の通常の手法によって上記形質転換体に導入し、当該形質転換体ゲノム上の当該上流断片及び第1のマーカー遺伝子下流領域に相当する領域との間に相同組換えを起こさせる(第1相同組換え)。所望の相同組換えが生じた形質転換体は、供与体DNA中に挿入した第2のマーカー遺伝子の発現を指標に選択することができる。第1相同組換えが適切に生じた形質転換体のゲノムDNAでは、上流断片、下流断片、必要に応じて第2のマーカー遺伝子、第1のマーカー遺伝子下流領域、及び下流断片が順番に配置している(図2参照)。このような配置を有するゲノムDNAにおいては、上記2つの下流断片同士の間で自然誘発的に相同組換えが起こり得る(ゲノム内相同組換え)。このゲノム内相同組換えによって、当該2つの下流断片の間に位置していた領域が欠失することにより、第1のマーカー遺伝子が形質転換体ゲノムから除去される。

0037

ゲノム内相同組換えを起こした形質転換体を選択する手段としては、第1のマーカー遺伝子が薬剤耐性遺伝子の場合は、薬剤耐性を持たない菌を選択する方法が挙げられる。ペニシリン系抗生物質は、増殖細胞に対して殺菌的に作用するが非増殖細胞には作用しない。したがって、薬剤とペニシリン系抗生物質の存在下で菌を培養すれば、薬剤存在下で増殖しない薬剤非耐性菌を選択的に濃縮することができる(Methodsin Molecular Genetics,Cold Spring Harbor Labs,1970)。別の手段としては、致死遺伝子を導入する方法が挙げられる。例えば、上記第2のマーカーとしてchpA(mazF)遺伝子等の致死遺伝子を菌に導入すれば、ゲノム内相同組換えが起こらなかった菌は当該致死遺伝子の作用で死滅するので、ゲノム内相同組換えを起こした形質転換体を選択することができる。選択された菌株からゲノムDNAを抽出し、これを鋳型としてPCRを行うことで、目的の領域が欠失されていることを確認することができる(特開2009-254350号公報を参照)。

0038

以上のようにして、ゲノム上の所定の領域を欠失した枯草菌変異株を作製することができる。さらに、当該手順を繰り返すことにより、上述のゲノム領域が一部又は全て欠失した枯草菌変異株を作製することができる。

0039

[1−2.abrB遺伝子の恒常的発現]
本発明の枯草菌変異株においては、abrB遺伝子又はそれに相当する遺伝子が恒常的に発現するように遺伝子構築されている。
枯草菌において、abrB遺伝子は転写因子AbrBをコードする遺伝子であり、対数増殖期に発現するが、定常期へと移行する間の遷移期およびその後の定常期において発現が抑制される。本転写因子AbrBは対数増殖期において、胞子形成やコンピテンス、或いは栄養源獲得等に関する多数の遺伝子を直接的あるいは間接的に発現抑制する。遷移期および定常期においては、AbrBによる発現抑制が解除され、上述の多数の遺伝子が発現誘導される。
枯草菌abrB遺伝子は、遺伝子番号:BG10204として特定され、配列番号1に示すヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号2に示すアミノ酸配列からなるタンパク質AbrBをコードする。

0040

abrB遺伝子に相当する遺伝子としては、枯草菌以外のバチルス属に属する微生物のabrB遺伝子が挙げられる。枯草菌以外の微生物としては、例えば、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus licheniformis、Bacillus megaterium、Bacillus anthracis、Bacillus cereus等のバチルス属微生物などが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、枯草菌abrBに相当する遺伝子は、上記の微生物からゲノムDNAを抽出し、配列番号1で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドやそのフラグメントをプローブとし、ストリンジェントな条件下にてサザンハイブリダイゼーションを行うことによって同定することができる。また例えば、公知のゲノム配列情報に基づいて上記微生物のゲノムのヌクレオチド配列と、配列番号1で示されるヌクレオチド配列とを比較することによって、上記微生物におけるabrBに相当する遺伝子を同定することができる。

0041

例えば、Bacillus amyloliquefaciens DSM7株のabrB遺伝子(配列番号12、13)、Bacillus licheniformisATCC14580株のabrB遺伝子(配列番号14、15)、Bacillus megateriumDMS319株のabrB遺伝子(配列番号16,17)は、枯草菌168株のabrB遺伝子との配列同一性が、ヌクレオチド配列において、それぞれ91%、88%、80%であり、またそれらのコードするアミノ酸配列において、それぞれ98%、94%、85%である。これらは、abrB遺伝子に相当する遺伝子として例示される。

0042

したがって、abrB遺伝子又はそれに相当する遺伝子としては、以下が挙げられる:
(a)配列番号1に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
(b)配列番号1に示すヌクレオチド配列と80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつAbrBと同様に遷移期および定常期に誘導される遺伝子の転写因子としての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号1に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつAbrBと同様に遷移期および定常期に誘導される遺伝子の転写因子としての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号2に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(e)配列番号2に示すアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなりかつAbrBと同様に遷移期および定常期に誘導される遺伝子の転写因子としての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(f)配列番号2に示すアミノ酸配列と80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつAbrBと同様に遷移期および定常期に誘導される遺伝子の転写因子としての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。

0043

本発明において、abrB遺伝子又はそれに相当する遺伝子を恒常的に発現するように遺伝子構築するとは、微生物が生存している間、abrB遺伝子又はそれに相当する遺伝子が常に発現するように遺伝子構築すること、すなわち当該遺伝子が通常では発現しない対数増殖期以降の定常期においても発現するように遺伝子構築することを意味する。abrB遺伝子又はそれに相当する遺伝子が恒常的に発現するような遺伝子構築としては、例えば、abrB遺伝子又はそれに相当する遺伝子の上流に位置する転写開始制御領域、又は転写開始制御領域及びリボソーム結合部位、或いは転写開始制御領域から翻訳開始制御領域に至るまでの領域における抑制性制御因子結合部位を不活性化することが挙げられる。ここで、「抑制性制御因子」とは、遺伝子上の転写の制御に関わる特定の塩基配列に結合し、転写を抑制的に制御するタンパク質を意味する。abrB遺伝子の転写開始制御領域、又は転写開始制御領域及びリボソーム結合部位、或いは転写開始制御領域から翻訳開始制御領域に至るまでの領域の一例としては、配列番号5に示される塩基配列からなるDNA、又は当該配列と相同な塩基配列からなり転写開始制御領域又は転写開始制御領域及びリボソーム結合部位、或いは転写開始制御領域から翻訳開始制御領域に至るまでの領域としての機能を有するDNAが挙げられる。配列番号5に示される塩基配列と相同な塩基配列としては、例えば、配列番号5に示される塩基配列と90%以上、好ましくは95%以上、より好ましくは99%以上の同一性を有する塩基配列、又は配列番号5に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAからなる塩基配列が挙げられる。

0044

上記制御領域において、抑制性制御因子の結合部位としては、例えば、配列番号5に示される塩基配列において、20〜49番目塩基からなる領域又はこれに相当する領域、73〜89番目の塩基からなる領域又はこれに相当する領域が挙げられる。
ここで、配列番号5に示される塩基配列において20〜49番目の塩基からなる領域又は73〜89番目の塩基からなる領域に相当する領域としては、上述した配列番号5に示される塩基配列からなるDNAと相同な塩基配列からなり転写開始制御領域又は転写開始制御領域及びリボソーム結合部位、或いは転写開始制御領域から翻訳開始制御領域に至るまでの領域としての機能を有するDNAにおいて、配列番号5に示される塩基配列と比較した場合に当該領域に相当する領域であって、抑制性制御因子の結合部位として機能するものが挙げられる。
上記部位を不活性化する手段としては、該部位のヌクレオチド配列上の1つ以上のヌクレオチドに対する突然変異導入、又は該ヌクレオチド配列に対する別のヌクレオチド配列の置換若しくは挿入、あるいは該部位の配列の一部若しくは全部の削除などが挙げられる。ここで、一部とは、1〜40個、好ましくは5〜30個、又は10〜17個の塩基からなる部分配列が挙げられる。このうち、好ましくは、配列番号5に示される塩基配列において、20〜49番目の塩基からなる領域又はこれに相当する領域、又は/及び73〜89番目の塩基からなる領域又はこれに相当する領域を全て削除することが挙げられ、より好ましくは73〜89番目の塩基からなる領域又はこれに相当する領域を全て削除することである。上記突然変異導入や、ヌクレオチド配列の置換若しくは挿入のための具体的な手法としては、紫外線照射部位特異的変異導入、及び上記[1−1.ゲノム領域欠失枯草菌変異株]にて説明したSOE−PCR法や相同組換え法、などを挙げることができる。

0045

また、abrB遺伝子又はそれに相当する遺伝子が恒常的に発現するような遺伝子構築の他の手段としては、ゲノム上の枯草菌abrB遺伝子又はそれに相当する遺伝子に、定常期において該遺伝子の発現を強化できる制御領域(強発現制御領域)を作動可能に連結すること、強発現制御領域と作動可能に連結された枯草菌abrB遺伝子又それに相当する遺伝子を細胞内のゲノム中若しくはプラスミド中に導入することが挙げられる。斯かる強発現制御領域としては、例えば、枯草菌rplK遺伝子、fus遺伝子若しくはatpI遺伝子又はこれらの遺伝子に相当する遺伝子の上流に位置する転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位が挙げられる。

0046

[1−3.kinA遺伝子の欠失又は不活性化]
本発明の枯草菌変異株においては、kinA遺伝子が欠失又は不活性化されている。abrB遺伝子又はそれに相当する遺伝子が恒常的に発現するような遺伝子構築がなされた枯草菌変異株において、kinA遺伝子の欠失又は不活性化により、培地中での溶菌現象を抑制することが見出された。
kinA遺伝子は、遺伝子番号:BG10204(配列番号3)として特定され、斯かる遺伝子がコードするタンパク質は、胞子形成初期に関わる多成分制御系のセンサーヒスチジンキナーゼ(two−component sensor histidine kinase involved in the initiation of sporulation)であるとされている。

0047

枯草菌のkinA遺伝子としては、以下が挙げられる。
(g)配列番号3に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
(h)配列番号3に示すヌクレオチド配列と80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ胞子形成初期に関わる多成分制御系のセンサーヒスチジンキナーゼとしての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(i)配列番号3に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ胞子形成初期に関わる多成分制御系のヒスチジンキナーゼとしての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(j)配列番号3に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(k)配列番号4に示すアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ胞子形成初期に関わる多成分制御系のヒスチジンキナーゼとしての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(l)配列番号4に示すアミノ酸配列と80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ胞子形成初期に関わる多成分制御系のヒスチジンキナーゼとしての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。

0048

上記遺伝子を欠失又は不活性化させる手段としては、該遺伝子のヌクレオチド配列上の1つ以上のヌクレオチドに対する突然変異導入、又は該ヌクレオチド配列に対する別のヌクレオチド配列の置換若しくは挿入、あるいは該遺伝子の配列の一部若しくは全部の削除などが挙げられる。上記遺伝子の転写を阻害する変異を導入する手段としては、該遺伝子のプロモーター領域に対する突然変異導入や、別のヌクレオチド配列での置換若しくは挿入による、当該プロモーターの不活性化が挙げられる。上記突然変異導や、ヌクレオチド配列の置換若しくは挿入のための具体的な手法としては、紫外線照射、部位特異的変異導入、及び上記[1−1.ゲノム領域欠失枯草菌変異株]にて説明したSOE−PCR法や相同組換え法、などを挙げることができる。欠失又は不活性化させる遺伝子の枯草菌ゲノム上での位置やヌクレオチド配列は、上述したBSORF DBにて確認することができる。

0049

[2.組換え枯草菌の構築]
本発明の組換え枯草菌は、上述したabrB遺伝子又はそれに相当する遺伝子が恒常的に発現され、且つkinA遺伝子が欠失又は不活性化され、さらに目的遺伝子が発現可能なように強化又は導入されたものが好ましい。
当該組換え枯草菌は、最終的に得られた微生物において、上述したゲノムの大領域の欠失、abrB遺伝子又はそれに相当する遺伝子が恒常的に発現、kinA遺伝子が欠失又は不活性化、目的遺伝子が発現可能なように強化又は導入が達成されていればよく、それぞれの遺伝子改変・導入工程の順序は特に限定されないが、好ましくは、ゲノムの大領域が欠失したゲノム欠失株に対して、abrB遺伝子又はそれに相当する遺伝子が恒常的に発現され、且つkinA遺伝子が欠失又は不活性化された枯草菌変異株を親株とし、これに目的遺伝子を発現可能なように強化又は導入することにより製造できる。

0050

[2−1.目的遺伝子の発現可能な強化又は導入]
目的遺伝子を発現可能なように強化又は導入するとは、本発明の枯草菌変異株において、目的遺伝子が少なくとも発現可能な状態に置かれることを意味している。
目的遺伝子を発現可能なように強化又は導入する手段としては、例えば、親株のゲノム上で、野生型に比較し発現を強化できる制御領域(強制御領域)と目的遺伝子とを作動可能に連結して配置すること;及び、制御領域、好ましくは強制御領域と作動可能に連結された目的遺伝子を、親株細胞のゲノム中若しくはプラスミド中に導入すること、などが挙げられる。例えば、親株のゲノム上の目的遺伝子の制御領域配列を強制御領域に置換すること、あるいは、適切な位置に目的遺伝子が組み込まれた発現ベクターや、制御領域、好ましくは強制御領域と作動可能に連結された目的遺伝子を含むベクターを、一般的な形質転換法を用いて親株に取り込ませることが挙げられる。
また、制御領域には、発現させる遺伝子産物に応じて、転写及び翻訳に関わる制御領域の他、分泌に関わる制御領域(例えば、分泌シグナルペプチド領域)を包含させることができる。
なお、上記に例示したような、細胞へ遺伝子を発現可能に導入するための種々の手法は、当業者に周知である。すなわち、ベクターによって導入する場合、その上流に「当該遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる制御領域、即ち、プロモーター及び転写開始点を含む転写開始制御領域、リボソーム結合部位及び開始コドンを含む翻訳開始制御領域及び分泌シグナルペプチド領域から選ばれる1以上の領域」が適正な形で結合されている目的遺伝子を含むベクターを、コンピテントセル形質転換方法プロトプラスト形質転換法、或いはエレクトロポレーション法等の適当な形質転換法により導入すればよい。ここで、ベクターとしては、目的遺伝子を宿主に導入し、増殖、発現させるための適当な運搬体核酸分子であれば特に限定されず、プラスミドのみならず、例えば、YAC,BACなどの人工染色体トランスポゾンを用いたベクター、コスミドが挙げられ、プラスミドとしては例えば、pUB110、pHY300PLKが挙げられる。

0051

また、ゲノムへの挿入は、例えば相同組換えによる方法を用いればよい。すなわち、目的遺伝子に導入を起こさせる染色体領域の一部を結合したDNA断片を、微生物細胞内に取り込ませ、当該染色体領域の一部領域における相同組換えを起こさせることによって、ゲノムに組み込ませることができる。ここで、導入を起こさせる染色体領域としては、特に制限されないが、必須でない遺伝子領域、若しくは必須でない遺伝子領域上流の非遺伝子領域が好ましい。

0052

一態様において、本発明の枯草菌変異株に導入される目的遺伝子は、その上流に当該遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる制御領域、即ち、プロモーター及び転写開始点を含む転写開始制御領域、リボソーム結合部位及び開始コドンを含む翻訳開始領域並びに分泌シグナルペプチド領域から選ばれる1以上の領域と作動可能に連結されていることが挙げられる。好ましくは、転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる3領域が、更に好ましくは、分泌シグナルペプチド領域がバチルス(Bacillus)属細菌セルラーゼ遺伝子由来のものであり、転写開始制御領域及び翻訳開始制御領域が当該セルラーゼ遺伝子の開始コドンから始まる長さ0.6〜1kbの上流領域であるものが、目的遺伝子の上流に作動可能に連結されているものが挙げられる。

0053

例えば、本発明の枯草菌変異株に導入される目的遺伝子の一例として挙げられるセルラーゼ遺伝子は、その構造遺伝子が、特開2000−210081号公報や特開平4−190793号公報等に記載されているバチルス(Bacillus)属細菌、すなわちKSM−S237株(FERM BP−7875)、又はKSM−64株(FERM BP−2886)由来のセルラーゼ遺伝子の転写開始制御領域、翻訳開始領域及び分泌シグナルペプチド領域が作動可能に連結されていることが望ましい。より具体的には、配列番号6で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号1〜659の塩基配列、配列番号8で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号1〜696の塩基配列からなるDNA断片、当該塩基配列に対して70%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上、さらにより好ましくは98%以上の同一性を有する塩基配列からなり、且つ遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる機能を有するDNA断片、又は上記いずれかの塩基配列からなるDNAとストリンジェントの条件でハイブリダイズし且つ遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる機能を有するDNA、或いは上記いずれかの塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなり且つ遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる機能を有するDNA断片が、目的遺伝子の構造遺伝子と作動可能に連結されていることが望ましい。尚、ここで、上記塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなるDNA断片とは、上記塩基配列の一部、好ましくは数個(例えば、1〜50個、好ましくは1〜30個、より好ましくは1〜20個、さらに好ましくは1〜10個)の塩基を欠失しているが、遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる機能を有するDNA断片を意味する。

0054

またここで言うストリンジェントな条件とは、例えば[Molecular cloning−a Laboratory Manual 2nd edition(Sambrookら、1989)]に記載の条件等が挙げられる。例えば、5×SSC、70℃以上が好ましく、5×SSC、85℃以上がより好ましく、又は、6×SSC、60℃以上が好ましく、6×SSC、65℃以上がより好ましく、洗浄条件としては、1×SSC、60℃以上が好ましく、1×SSC、73℃以上がより好ましい。

0055

本発明において、目的遺伝子としては特に限定されず、内在性の遺伝子であっても、外来遺伝子異種遺伝子)であってもよい。目的遺伝子としては、洗剤、食品、繊維、飼料化学品医療診断、研究などの各種分野において有用なあらゆるタンパク質又はポリペプチド、例えば、酵素、生理活性ペプチド、マーカー、シグナル伝達物質構造タンパク質、各種調節因子などをコードする遺伝子が挙げられる。また、上記酵素としては、機能別に列挙すると、酸化還元酵素(Oxidoreductase)、転移酵素(Transferase)、加水分解酵素(Hydrolase)、脱離酵素(Lyase)、異性化酵素(Isomerase)、合成酵素(Ligase/Synthetase)等が挙げられるが、好適にはセルラーゼα−アミラーゼ、プロテアーゼ等の加水分解酵素、PGA合成酵素やDPAシンターゼ等の合成酵素が挙げられる。

0056

ここで、セルラーゼとしては、例えば、多糖加水分解酵素の分類(Biochem. J., 280, 309, 1991)中でファミリー5に属するセルラーゼが挙げられ、中でも微生物由来、好ましくはBacillus属細菌由来のセルラーゼが好適に挙げられる。より具体的な例として、配列番号7で示されるアミノ酸配列からなるBacillus属細菌KSM−S237株(FERM BP−7875)由来のアルカリセルラーゼ、又は、配列番号9で示されるアミノ酸配列からなるBacillus属細菌KSM−64株(FERM BP−2886)由来のアルカリセルラーゼ、或いは、当該アミノ酸配列と70%、好ましくは80%、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上、さらにより好ましくは98%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるアルカリセルラーゼ、又は配列番号7又は配列番号9で示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるアルカリセルラーゼが挙げられる。

0057

α−アミラーゼとしては、微生物由来のα−アミラーゼが挙げられ、好ましくはBacillus属細菌由来の液化型アミラーゼが好適に挙げられる。より具体的な例として、配列番号10で示されるアミノ酸配列からなるBacillus属細菌KSM−K38株(FERM BP−6946)由来のアルカリアミラーゼ、或いは当該アミノ酸配列と70%、好ましくは80%、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上、さらにより好ましくは98%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるアルカリアミラーゼ、又は配列番号10で示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるアルカリアミラーゼが挙げられる。

0058

プロテアーゼとしては、微生物由来、好ましくはBacillus属細菌由来のセリンプロテアーゼ金属プロテアーゼ等が好適に挙げられる。より具体的な例として、配列番号11で示されるアミノ酸配列からなるバチルスクラウジ(Bacillus clausii)KSMK−16株(FERM BP−3376)由来のアルカリセリンプロテアーゼ、或いは当該アミノ酸配列と70%、好ましくは80%、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上、さらにより好ましくは98%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるプロテアーゼ、又は配列番号11で示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるアルカリセリンプロテアーゼが挙げられる。

0059

本発明の枯草菌変異株は、PGAやDPAの効率的な生産に好適に用いられる。この場合の目的遺伝子は、内在性の遺伝子である、ポリ−γ−グルタミン酸(PGA)の生産に関わる遺伝子(例えば、PGA合成酵素遺伝子、PGA分解酵素をコードする遺伝子)や、ジピコリン酸(2,6−ピリジンジカルボン酸、DPA)の生産に関わる遺伝子(例えば、ジピコリン酸シンターゼ遺伝子)であり、本発明の枯草菌変異株に対して、当該PGAの生産に関わる遺伝子又はDPAの生産に関わる遺伝子を発現可能に強化又は導入することにより、PGAやDPAの効率的な生産が可能となる。
以下に、PGA及びDPAの生産に関わる遺伝子の発現可能な強化又は導入について述べる。

0060

[2−2.PGAの生産に関わる遺伝子の発現可能な強化又は導入]
[2−2−1.PGA合成酵素遺伝子]
PGA合成酵素遺伝子としては、例えば枯草菌遺伝子pgsB(配列番号18)、pgsC(配列番号20)、pgsA(配列番号22)及びpgsE(配列番号24)、ならびにそれらに相当する遺伝子からなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子が挙げられ、好ましくは、少なくとも枯草菌pgsB遺伝子又はその相当遺伝子と、枯草菌pgsC遺伝子又はその相当遺伝子とを含む組み合わせであり、より好ましくは、枯草菌pgsB遺伝子又はその相当遺伝子と、枯草菌pgsC遺伝子又はその相当遺伝子との組み合わせ、あるいは枯草菌pgsB遺伝子又はその相当遺伝子と、枯草菌pgsC遺伝子又はその相当遺伝子と、枯草菌pgsA遺伝子又はその相当遺伝子と、枯草菌pgsE遺伝子又はその相当遺伝子との組み合わせである。

0061

枯草菌pgsB遺伝子又はそれに相当する遺伝子としては、以下が挙げられる:
(a)配列番号18に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
(b)配列番号18に示すヌクレオチド配列と少なくとも62%、例えば、62%以上、好ましくは65%以上、より好ましくは70%以上、より好ましくは75%以上、より好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつアミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号18に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号19に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(e)配列番号19に示すアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなりかつアミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(f)配列番号19に示すアミノ酸配列と少なくとも55%、例えば、55%以上、好ましくは60%以上、より好ましくは65%以上、より好ましくは70%以上、より好ましくは75%以上、より好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなりかつアミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。

0062

枯草菌pgsC遺伝子又はそれに相当する遺伝子としては、以下が挙げられる:
(a')配列番号20に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
(b')配列番号20に示すヌクレオチド配列と少なくとも59%、例えば、59%以上、好ましくは60%以上、より好ましくは65%以上、より好ましくは70%以上、より好ましくは75%以上、より好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ上記枯草菌pgsB遺伝子又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でPGAを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c')配列番号20に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ上記枯草菌pgsB遺伝子又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でPGAを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d')配列番号21に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(e')配列番号21に示すアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなりかつ上記枯草菌pgsB遺伝子又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でPGAを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(f')配列番号21に示すアミノ酸配列と少なくとも51%、例えば、51%以上、好ましくは55%以上、より好ましくは60%以上、より好ましくは65%以上、より好ましくは70%以上、より好ましくは75%以上、より好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなりかつ上記枯草菌pgsB遺伝子又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でPGAを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。

0063

枯草菌pgsA遺伝子又はそれに相当する遺伝子としては、以下が挙げられる:
(a'')配列番号22に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
(b'')配列番号22に示すヌクレオチド配列と少なくとも48%、例えば、48%以上、好ましくは50%以上、より好ましくは60%以上、より好ましくは65%以上、より好ましくは70%以上、より好ましくは75%以上、より好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ上記枯草菌pgsB遺伝子又はその相当遺伝子と上記枯草菌pgsC遺伝子又はその相当遺伝子の存在下で、PGAを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c'')配列番号22に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ上記枯草菌pgsB遺伝子又はその相当遺伝子と上記枯草菌pgsC遺伝子又はその相当遺伝子の存在下で、PGAを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d'')配列番号23に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(e'')配列番号23に示すアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなりかつ上記枯草菌pgsB遺伝子又はその相当遺伝子と上記枯草菌pgsC遺伝子又はその相当遺伝子の存在下で、PGAを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(f'')配列番号23に示すアミノ酸配列と少なくとも30%、例えば、30%以上、好ましくは50%以上、より好ましくは60%以上、より好ましくは65%以上、より好ましくは70%以上、より好ましくは75%以上、より好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなりかつ上記枯草菌pgsB遺伝子又はその相当遺伝子と上記枯草菌pgsC遺伝子又はその相当遺伝子の存在下で、PGAを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。

0064

枯草菌pgsE遺伝子又はそれに相当する遺伝子としては、以下が挙げられる:
(a''')配列番号24に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
(b''')配列番号24に示すヌクレオチド配列と少なくとも51%、例えば、51%以上、好ましくは55%以上、より好ましくは60%以上、より好ましくは65%以上、より好ましくは70%以上、より好ましくは75%以上、より好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ上記枯草菌pgsB遺伝子又はその相当遺伝子と、上記枯草菌pgsC遺伝子又はその相当遺伝子と、上記枯草菌pgsA遺伝子又はその相当遺伝子の存在下で、PGAを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c''')配列番号24に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ上記枯草菌pgsB遺伝子又はその相当遺伝子と、上記枯草菌pgsC遺伝子又はその相当遺伝子と、上記枯草菌pgsA遺伝子又はその相当遺伝子の存在下で、PGAを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d''')配列番号25に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(e''')配列番号25に示すアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなりかつ上記枯草菌pgsB遺伝子又はその相当遺伝子と、上記枯草菌pgsC遺伝子又はその相当遺伝子と、上記枯草菌pgsA遺伝子又はその相当遺伝子の存在下で、PGAを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(f''')配列番号25に示すアミノ酸配列と少なくとも35%、例えば、35%以上、好ましくは50%以上、より好ましくは60%以上、より好ましくは65%以上、より好ましくは70%以上、より好ましくは75%以上、より好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなりかつ上記枯草菌pgsB遺伝子又はその相当遺伝子と、上記枯草菌pgsC遺伝子又はその相当遺伝子と、上記枯草菌pgsA遺伝子又はその相当遺伝子の存在下で、PGAを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。

0065

上記において、タンパク質の「アミドリガーゼ活性」は、グルタミン酸、及びATP又はGTP基質とし、これに塩化マンガンを加えた反応溶液中におけるPGAの生成を検出することにより測定することができる(J.Bacteriol.,2002,184:337−343)。また、上述の枯草菌pgsB遺伝子又はその相当遺伝子がコードするタンパク質の「アミドリガーゼ活性」とは、当該pgsB遺伝子又はその相当遺伝子を、上記pgsC遺伝子又はその相当遺伝子とともに枯草菌又はその変異株に導入した際に、当該株におけるPGAの生産と菌体外への分泌をもたらす能力であり得る。
所定の微生物におけるPGA生産能の評価は、例えば、グルタミン酸又はその塩を含有するPGA生産寒天培地に培養したときにコロニー周辺に形成される半透明粘性物質目視によって観察する方法;SDS−PAGEによってPGAを検出する方法(Biosci.Biotechnol.Biochem.,1996,60:255−258);酸加水分解後にアミノ酸分析装置を用いて定量する方法(Biosci.Biotechnol.Biochem.,1997,61:1684−1687);培養液から精製し乾燥重量を求める定量法(Biochem.Biophys.Res.Commun.,1999,263:6−12);ゲルろ過カラムを用いたHPLC高速液体クロマトグラフィー)による定量/定性法(Biosci.Biotechnol.Biochem.,1993,57:1212−1213)等によって行うことができる。

0066

また、枯草菌pgsB、pgsC、pgsA、及びpgsEの各遺伝子に相当する遺伝子としては、枯草菌以外のバチルス属又は他の属に属する微生物のPGA合成に関与する遺伝子が挙げられる。枯草菌以外の微生物としては、PGA生産性微生物であってもPGA非生産性微生物であってもよく、例えば、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus pumilus、Bacillus licheniformis、Bacillus megaterium、Bacillus anthracis等のバチルス属微生物、及びNatrialba aegyptiaca、Hydra、Oceanobacillus iheyensisなどが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、枯草菌pgsB、pgsC、pgsA又はpgsEに相当する遺伝子は、上記の微生物からゲノムDNAを抽出し、配列番号18、20、22又は24で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドやそのフラグメントをプローブとしたサザンハイブリダイゼーションを行うことによって同定することができる。また例えば、公知のゲノム配列情報に基づいて上記微生物のゲノムのヌクレオチド配列と、配列番号18、20、22又は24で示されるヌクレオチド配列とを比較することによって、上記微生物における枯草菌pgsB、pgsC、pgsA又はpgsEに相当する遺伝子を同定することができる。

0067

例えば、Bacillus sp.KSM−366株(FERM BP−6262)のpgsB遺伝子、Bacillus licheniformisATCC14580株のpgsB遺伝子、Bacillus amyloliquefaciens FZB42株のywsC遺伝子、及びOceanobacillus iheyensisHTE831株のOB0201遺伝子は、枯草菌168株のpgsB遺伝子との同一性が、ヌクレオチド配列において、それぞれ99.9%、78%、81%及び62%であり、またそれらのコードするアミノ酸配列において、それぞれ99.7%、89%、93%及び55%である。これらは、枯草菌pgsB遺伝子に相当する遺伝子として例示され、具体的に枯草菌によるPGA生産において利用できることが示されている(特開2010−213664号公報)。

0068

また例えば、Bacillus sp.KSM−366株(FERM BP−6262)のpgsC遺伝子、Bacillus licheniformisATCC14580株のpgsC遺伝子、Bacillus amyloliquefaciens FZB42株のywtA遺伝子、及びOceanobacillus iheyensisHTE831株のOB0202遺伝子は、枯草菌168株のpgsC遺伝子との同一性が、ヌクレオチド配列において、それぞれ100%、78%、83%及び59%であり、またそれらのコードするアミノ酸配列において、それぞれ100%、89%、93%及び51%である。これらは、枯草菌pgsC遺伝子に相当する遺伝子として例示され、具体的に枯草菌によるPGA生産において利用できることが示されている(特開2010−213664号公報)。

0069

また例えば、Bacillus sp.KSM−366株(FERM BP−6262)のpgsA遺伝子、Bacillus licheniformisATCC14580株のpgsA遺伝子、Bacillus amyloliquefaciens FZB42株のywtB遺伝子、及びOceanobacillus iheyensisHTE831株のOB2917遺伝子は、枯草菌168株のpgsA遺伝子との同一性が、ヌクレオチド配列においてそれぞれ100%、68%、75%及び48%であり、またそれらのコードするアミノ酸配列においてそれぞれ100%、67%、78%及び30%である。これらは、枯草菌pgsA遺伝子に相当する遺伝子として例示される(特開2010−213664号公報)。

0070

また例えば、Bacillus licheniformisATCC14580株のpgsE遺伝子、Bacillus amyloliquefaciens FZB42株のpgsE遺伝子、及びBacillsu anthracis H9401株のcapE遺伝子は、枯草菌168株のpgsE遺伝子との同一性が、ヌクレオチド配列においてそれぞれ63%、76%及び51%であり、またそれらのコードするアミノ酸配列においてそれぞれ47%、72%及び35%である。これらは、枯草菌pgsE遺伝子に相当する遺伝子として例示される。

0071

枯草菌遺伝子pgsBCAEに相当するバチルス属又は他の属に属する微生物の遺伝子の具体的な例としては、下記表2に示す遺伝子が挙げられる。

0072

0073

好ましい実施形態において、本発明の枯草菌変異株において発現可能に強化又は導入されるPGA合成酵素遺伝子は、上記(a)〜(f)、(a')〜(f')、(a'')〜(f'')及び(a''')〜(f''')で表した遺伝子からなる群より選択される少なくとも1つであり、好ましくは、少なくとも上記(a)〜(f)で表した遺伝子からなる群より選択される少なくとも1つと、上記(a')〜(f')で表した遺伝子からなる群より選択される少なくとも1つとの組み合わせを含む。また好ましくは、発現可能に強化又は導入される遺伝子は、上記(a)、(a')、(a'')及び(a''')で表した遺伝子からなる群より選択される少なくとも1つであり、より好ましくは、少なくとも上記(a)で表した遺伝子と、(a')で表した遺伝子との組み合わせを含む。さらに好ましくは、発現可能に強化又は導入される遺伝子は、上記(a)及び(a')で表した遺伝子の組み合わせであるか、又は上記(a)、(a')、(a'')及び(a''')で表した遺伝子の組み合わせである。

0074

別の好ましい実施形態において、本発明の枯草菌変異株において発現可能に強化又は導入されるPGA合成酵素遺伝子としては、例えば配列番号18、20、22、24並びに28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60及び62のいずれかに示す配列からなる遺伝子のうちの少なくとも1つが挙げられ、好ましくは、少なくとも配列番号18、28、34、42、50及び56のいずれかに示す配列からなる遺伝子のうちの少なくとも1つと、配列番号20、30、36、44、52及び58のいずれかに示す配列からなる遺伝子のうちの少なくとも1つとの組み合わせを含む。より好ましくは、発現可能に強化又は導入される遺伝子は、配列番号18、28、34、42、50及び56のいずれかに示す配列からなる遺伝子のうちの少なくとも1つと、配列番号20、30、36、44、52及び58のいずれかに示す配列からなる遺伝子のうちの少なくとも1つと、配列番号22、32、38、46、54及び60のいずれかに示す配列からなる遺伝子のうちの少なくとも1つと、配列番号24、40、48及び62のいずれかに示す配列からなる遺伝子のうちの少なくとも1つとの組み合わせである。

0075

[2−2−2.PGA分解酵素をコードする遺伝子]
PGA合成酵素遺伝子が発現可能に強化又は導入された組換え枯草菌においては、さらにPGA分解酵素をコードする遺伝子が発現可能に強化又は導入されるのが好ましい。微生物がPGAを高生産すると培地の粘度が高まり、その結果、微生物の生存やPGAの生産性に悪影響が及ぶ場合がある。枯草菌pgdS遺伝子又はそれに相当する遺伝子が発現可能に強化又は導入されることで、低分子化されたPGAが生産され、培養液の粘度を抑制することにより、PGAの高生産に伴う上記課題を解決することができる。
したがって、PGA分解酵素をコードする遺伝子としては、枯草菌pgdS遺伝子(配列番号26)又はそれに相当する遺伝子が挙げられる。

0076

枯草菌pgdS遺伝子又はそれに相当する遺伝子としては、以下が挙げられる:(g)配列番号26に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
(h)配列番号26に示すヌクレオチド配列と少なくとも62%、例えば、62%以上、好ましくは65%以上、より好ましくは70%以上、より好ましくは75%以上、より好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつPGA分解活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(i)配列番号26に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつPGA分解活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(j)配列番号27に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(k)配列番号27に示すアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなりかつPGA分解活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(l)配列番号27に示すアミノ酸配列と少なくとも57%、例えば、57%以上、好ましくは60%以上、より好ましくは65%以上、より好ましくは70%以上、より好ましくは75%以上、より好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、より好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなりかつPGA分解活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。

0077

枯草菌pgdS遺伝子に相当する遺伝子としては、枯草菌以外のバチルス属又は他の属に属する微生物のPGA分解に関与する遺伝子が挙げられる。枯草菌以外の微生物の枯草菌pgdS遺伝子に相当する遺伝子は、pgsBCAE遺伝子に関して上述したのと同様の手順で、配列番号26で示されるヌクレオチド配列をもとに探索又は同定することができる。枯草菌pgdS遺伝子に相当するバチルス属微生物遺伝子の具体的な例としては、Bacillus licheniformisATCC14580株のpgdS遺伝子(配列番号64)及びBacillus amyloliquefaciens FZB42株のpgdS遺伝子(配列番号66)が挙げられる。

0078

好ましい実施形態において、本発明の組換え枯草菌において発現可能なように強化又は導入される枯草菌PGA分解酵素をコードする遺伝子又はそれに相当する遺伝子は、上記(g)〜(l)で表した遺伝子からなる群より選択される少なくとも1つであり、好ましくは、上記(g)で表した遺伝子である。

0079

別の好ましい実施形態において、枯草菌PGA分解酵素をコードする遺伝子又はそれに相当する遺伝子は、配列番号26、64及び66のいずれかに示す配列からなる遺伝子のうちの少なくとも1つである。

0080

斯かるPGAの生産に関わる遺伝子の発現可能な強化又は導入は、親株のゲノム上の目的遺伝子(例えば、pgsBCAE遺伝子)の制御領域配列を強制御領域に置換すること、あるいは、強制御領域と作動可能に連結された目的遺伝子を含む断片を、親株のゲノム中若しくはプラスミド中に導入することによって成すことができる。またあるいは、親株中に複数の目的遺伝子を発現可能に存在させる改変により成すこともできる。
目的遺伝子を発現可能なように強化又は導入するための手順の一例を以下に記載する。

0081

(1)目的遺伝子が制御領域と作動可能に連結され、さらに親株ゲノムとの相同領域と結合されたDNA断片を構築する。例えば、上流から、制御領域(例えば、rrnOオペロン制御領域)、目的遺伝子(例えば、pgsBCAE遺伝子)の順で配置した断片を作製し、さらにその断片に親株ゲノムの一部との相同領域を結合してDNA断片を調製する。次いで、このDNA断片を親株に導入すれば、親株ゲノム中に当該DNA断片が挿入されて、親株を形質転換することができる。得られた形質転換体は、形質転換前の株と比べて目的遺伝子の発現量が増加する。

0082

(2)制御領域と作動可能に連結された目的遺伝子を含むベクターを構築する。例えば、上流から、制御領域(例えば、KSM−S237のセルラーゼ遺伝子の制御領域)、目的遺伝子(例えば、pgsBC遺伝子)の順で配置したDNAを含むベクターを調製する。次いで、このベクターを親株に導入すれば、親株を形質転換することができる。得られた形質転換体は、形質転換前の株と比べて目的遺伝子の発現量が増加する。

0083

ここで、目的遺伝子の発現に使用され得る制御領域は、好ましくは、宿主内において下流の目的遺伝子の発現を高める機能を有し、より好ましくは、下流の目的遺伝子を構成的に発現又は高発現させる機能を有する制御領域である。また好ましくは、目的遺伝子の野生型の制御領域と比較して、目的遺伝子の発現を強化することができる制御領域(強制御領域)である。

0084

PGA合成酵素遺伝子、PGA分解酵素をコードする遺伝子の発現に使用され得る制御領域の例としては、バチルス属細菌由来のα−アミラーゼ遺伝子の制御領域、プロテアーゼ遺伝子の制御領域、rrnOオペロン制御領域、tufA遺伝子制御領域、aprE遺伝子の制御領域、spoVG遺伝子の制御領域、Bacillus sp.KSM−S237株のセルラーゼ遺伝子の制御領域、Staphylococcus aureus由来のカナマイシン耐性遺伝子の制御領域、クロラムフェニコール耐性遺伝子の制御領域等(いずれも、特開2009−089708号公報を参照)が挙げられる。

0085

好ましくは、Bacillus sp.KSM−S237株のセルラーゼ遺伝子の制御領域であるセルラーゼ遺伝子の翻訳開始点の上流0.4〜1.0kb領域(配列番号68)、及び当該領域とヌクレオチド配列において80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の同一性を有し、かつ当該領域と同等の遺伝子発現制御機能を有する塩基配列が、rrnOオペロンの16SrRNAの上流0.2〜1.0kb領域(配列番号208)、及び当該領域とヌクレオチド配列において80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の同一性を有し、かつ当該領域と同等の遺伝子発現制御機能を有する塩基配列が、tufA遺伝子の翻訳開始点の上流から1kbの領域(配列番号209)、及び当該領域とヌクレオチド配列において80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の同一性を有し、かつ当該領域と同等の遺伝子発現制御機能を有する塩基配列が挙げられる。

0086

好ましくは、PGA合成酵素遺伝子(例えば、pgsBC遺伝子)又はその相当遺伝子に対しては上記KSM−S237セルラーゼ遺伝子の制御領域が、枯草菌ポリ−γ−グルタミン酸合成酵素遺伝子群全て(例えば、pgsBCAE遺伝子)又はその相当遺伝子群全てに対してはrrnOオペロン制御領域が、枯草菌ポリ−γ−グルタミン酸分解酵素をコードする遺伝子又はその相当遺伝子に対してはtufA遺伝子制御領域が使用される。

0087

目的遺伝子又は制御領域の親株への導入に使用されるベクターは、プラスミド等の形質転換に一般的に使用されるベクターであればよい。ベクターの種類は、適宜選択することができるが、親株内で自己複製可能なベクター(例えばプラスミド)であることが好ましく、多コピーのベクターであることがより好ましい。さらに、そのプラスミドのコピー数が親株のゲノム(染色体)に対し、2以上100コピー以下であれば良く、好ましくは2以上50コピー以下、より好ましくは2以上30コピー以下であれば良い。好ましいプラスミドの例としては、例えば、pT181、pC194、pUB110、pE194、pSN2、pHY300PLK等が挙げられる。

0088

目的遺伝子又は制御領域のベクターへの挿入は、当該分野における通常の方法に従って行うことができる。例えば、目的遺伝子及び制御領域の断片をPCR等によって増幅し、これらの断片を制限酵素法等によってプラスミド等のベクターに挿入し、連結すればよい。あるいは、目的遺伝子及び制御領域の断片を予め連結した断片を作製し、これをプラスミド等のベクターに挿入してもよい。その際、ベクター上において、上流から制御領域断片、目的遺伝子の断片の順で連結されているようにする。

0089

PGA合成酵素遺伝子がpgsB遺伝子又はその相当遺伝子とpgsC遺伝子又はその相当遺伝子との組み合わせの場合は、親株に導入するDNA断片やベクター上において、上流から制御領域断片、pgsB遺伝子又はその相当遺伝子の断片、次いでpgsC遺伝子又はその相当遺伝子の断片の順で連結されているようにするとよい。

0090

親株へのDNA断片又はベクターの導入は、例えばプロトプラスト法(Mol.Gen.Genet.,1979,168:111−115)やコンピテントセル法(J.Bacteriol.,1963,86:392−400、J.Bacteriol.,1960,81:741−746)などの通常の手法に従って行うことができる。

0091

[2−3.DPAの生産に関わる遺伝子の発現可能な強化又は導入]
枯草菌におけるDPAシンターゼ遺伝子は、DPAシンターゼ・サブユニットAをコードするspoVFAと、DPAシンターゼ・サブユニットBをコードするspoVFBとから構成されている。枯草菌spoVFA遺伝子のヌクレオチド配列及び当該spoVFA遺伝子によりコードされるDPAシンターゼ・サブユニットAのアミノ酸をそれぞれ配列番号69及び70に示す。また、枯草菌spoVFB遺伝子のヌクレオチド配列及び当該spoVFB遺伝子によりコードされるDPAシンターゼ・サブユニットBのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号71及び72に示す。なお、野生型の枯草菌において、spoVFA及びspoVFBはこの順で配置されてオペロンを形成しており、共にσK因子依存性プロモーターにより転写制御されている。したがって、野生型の枯草菌において、spoVFA遺伝子及びspoVFB遺伝子は枯草菌胞子形成過程におけるスポアコートタンパク沈着期に発現し、内生胞子中にジピコリン酸が蓄積することとなる。

0092

したがって、DPAシンターゼ遺伝子の例としては、以下の(i)及び(ii)の組み合わせが挙げられる。
(i)以下のいずれかである枯草菌spoVFA又はそれに相当する遺伝子:
ia)配列番号69に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
ib)配列番号69に示すヌクレオチド配列と50%以上、好ましくは60%以上、より好ましくは70%以上、より好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つ枯草菌spoVFB又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でDPAシンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
ic)配列番号69に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ枯草菌spoVFB又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でDPAシンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
id)配列番号70に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
ie)配列番号70に示すアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり且つ枯草菌spoVFB又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でDPAシンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;及び、
if)配列番号70に示すアミノ酸配列と50%以上、好ましくは60%以上、より好ましくは70%以上、より好ましくは80%以上、より好ましくは85%、より好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり且つ枯草菌spoVFB又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でDPAシンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(ii)以下のいずれかである枯草菌spoVFB又はそれに相当する遺伝子:
iia)配列番号71に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
iib)配列番号71に示すヌクレオチド配列と60%以上、好ましくは70%以上、より好ましくは75%以上、より好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つ枯草菌spoVFA又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でDPAシンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
iic)配列番号71に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ枯草菌spoVFA又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でDPAシンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
iid)配列番号72に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
iie)配列番号72に示すアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり且つ枯草菌spoVFA又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でDPAシンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;及び、
iif)配列番号72に示すアミノ酸配列と60%以上、好ましくは70%以上、より好ましくは75%以上、より好ましくは80%以上、より好ましくは85%、より好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり且つ枯草菌spoVFA又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でDPAシンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。

0093

さらに、上記枯草菌spoVFA遺伝子及びspoVFB遺伝子に相当する遺伝子の例としては、枯草菌以外の微生物由来のDPAシンターゼ遺伝子が挙げられる。枯草菌以外の微生物に由来するDPAシンターゼ遺伝子の例としては、Bacillus licheniformis由来のspoVFA(配列番号73、74)及びspoVFB(配列番号75、76)、Bacillus clausii由来のspoVFA(配列番号77、78)及びspoVFB(配列番号79、80)、Clostridium thermocellum由来のCtheDRAFT_2170(配列番号81、82)及びCTHEDRAFT_2171(配列番号83、84)、Bacillus atrophaeus由来のspoVFA(配列番号85、86)及びspoVFB(配列番号87、88)、ならびにBacillus amyloliquefaciens由来のspoVFA(配列番号89、90)及びspoVFB(配列番号91、92)等を挙げることができる。本方法においては、上述した如何なる微生物由来のDPAシンターゼ遺伝子をも使用することができる。

0094

上述したDPAシンターゼ遺伝子は、当該遺伝子の発現量を高めるプロモーター、例えば、上記胞子形成期におけるスポアコートタンパク沈着期より前において働くプロモーターと作動可能に連結されることにより、その発現が強化されることから好適である。
具体的には、(1)上記胞子形成期におけるスポアコートタンパク沈着期より前において働くプロモーター及び上記DPAシンターゼ遺伝子が、当該プロモーターの制御下に当該遺伝子が発現されるように配置され、さらに親株ゲノムとの相同領域と結合されたDNA断片として構築され得る。このDNA断片を上述した枯草菌変異株(親株)に導入すれば、親株ゲノム中に当該DNA断片が挿入されて、親株を形質転換することができる。形質転換法としては、親株となる微生物に応じて適切な、且つ一般的な方法を採用することができる。例えば、上流から、上述したプロモーター、spoVFA、spoVFBの順で配置した断片を作製し、さらにその断片に親株ゲノムの一部との相同領域を結合してDNA断片を調製する。得られたDNA断片を用いて親株を形質転換する。

0095

あるいは、(2)上記胞子形成期におけるスポアコートタンパク沈着期より前において働くプロモーター及び上記DPAシンターゼ遺伝子が、当該プロモーターの制御下に当該遺伝子が発現されるように所望のベクターに組み込まれ得る。例えば、上述したプロモーター領域、spoVFA遺伝子、及びspoVFB遺伝子の断片をPCR等によって増幅し、次いで当該断片を制限酵素法等の通常の方法によってベクターに挿入し、連結すればよい。その際、ベクター上で、上流から当該プロモーター断片、spoVFA断片、spoVFB断片の順で連結されているようにする。得られた組換えベクターを用いて通常の方法に従い親株を形質転換することができる。

0096

ここで、使用されるベクターは、PGA合成酵素遺伝子の発現において記載したものと同様のものが使用でき、また、当該ベクターを用いた親株の形質転換方法についても、前記と同様の方法を用いることができる。

0097

ここで、枯草菌の場合、胞子形成期におけるスポアコートタンパク沈着期より前において働くプロモーターとしては、σA因子依存性プロモーター、σH因子依存性プロモーター、σE因子依存性プロモーター及びσF因子依存性プロモーターが挙げられる。構成的に作用するプロモーターを使用することが好ましく、より好ましい例としては、σA依存性プロモーター及びσH依存性プロモーターが挙げられる。また、環境ストレスに応じて発現するσB因子依存性プロモーターや、ECF(extracytoplasmic function)σ因子依存性プロモーター(FEMS Microbiol Lett.,14,220(1),155−60,2003)を使用することもできる。

0098

σA因子依存性プロモーターとしては、特に限定されないが、枯草菌ファージSP01プロモーター(Proc.Natl.Acd.Sci.USA.,81,439−443,1984)、veg遺伝子、amyE(アミラーゼ)遺伝子、aprE(ズブチリシン)遺伝子及びS237(S237セルラーゼ、特開2000−210081号公報)遺伝子のプロモーターを挙げることができる。σH因子依存性プロモーターとしては、特に限定されないが、citG遺伝子、spoVS遺伝子及びspoVG(Proc. Natl. Acd. Sci. USA. (1986) 83:9438−9442.)遺伝子のプロモーターが挙げられる。σE因子依存性プロモーターとしては、特に限定されないが、cotE遺伝子及びspoIVA遺伝子のプロモーターが挙げられる。本方法においては、特に、Bacillus subtilisのyoeB遺伝子のプロモーター、及びS237セルラーゼ遺伝子のプロモーターが望ましい。

0099

[3.目的遺伝子産物の製造、PGA及びDPAの製造]

0100

斯くして得られた本発明の枯草菌変異株は、ゲノムの大領域が欠失した枯草菌変異株と比べて、目的遺伝子産物や目的生産物の生産能が向上している。したがって、本発明の組換え枯草菌を培養することによって、タンパク質又はポリペプチドといった目的遺伝産物を効率よく生産することが可能になり、また、PGA、DPAといった有用な目的生産物を効率よく生産することが可能になる。
本発明の組換え枯草菌を用いた目的遺伝子産物の生産は、当該菌株をグリセロールグルコースフルクトースマルトースキシロースアラビノース、各種有機酸等の炭素源、各種アミノ酸ポリペプトントリプトン硫酸アンモニウム尿素等の窒素源ナトリウム塩等の無機塩類及びその他必要な栄養源、微量金属塩等を含有する培地に接種し、通常の微生物培養法(振とう培養攪拌培養通気培養静置培養など)にて培養し、培養終了後、当該培養物又は菌体から、目的遺伝子産物を、遠心分離限外濾過膜電気透析法等電点沈殿等の手法を用いて回収・採取し、及び必要に応じて精製することにより行うことができる。

0101

PGAの製造においては、PGAの生産性をより向上させるために、本発明の組換え枯草菌が生育に最低限必要とするグルタミン酸量よりも過剰量のグルタミン酸が添加された培地で、当該組換え枯草菌を培養するのが好ましい。グルタミン酸は、培地中へはグルタミン酸ナトリウムとして添加することが好ましいが、その濃度(グルタミン酸換算)は、例えば培地中、好ましくは0.005〜600g/L、より好ましくは0.05〜500g/L、より好ましくは0.1〜400g/L、より好ましくは0.5〜300g/Lであり得る。培地中のグルタミン酸濃度は、PGAの生産性向上の点から、0.005g/L以上であることが好ましく、他方、グルタミン酸ナトリウムの飽和溶解度を超えることによる培地中のグルタミン酸ナトリウムやその他の培地成分析出を回避する点から、グルタミン酸濃度600g/L以下であることが好ましい。
この場合の、培養条件として、至適温度は、好ましくは10〜40℃であり、より好ましくは30〜40℃である。至適pHは、好ましくはpH4〜8であり、より好ましくは5〜8である。また、培養日数は、菌接種後、好ましくは1〜10日間であり、より好ましくは1〜5日間である。
培地中に蓄積されたPGAを回収する際には、PGAを生産させた菌体と分離する必要がある。PGAを分離する手段としては、遠心分離、限外濾過膜、電気透析法、pHをPGAの等電点付近に維持することで沈殿として回収する方法、さらに上記手法の組み合わせ等が挙げられる。

0102

また、DPAの製造においては、培地のpHは6.0〜8.0に調節することが適当であり、pHの調整は、無機又は有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウムアンモニア等を用いて行えばよい。培養条件は、15〜42℃、好ましくは28〜37℃で2〜4日間振盪、又は通気撹拌培養することが挙げられる。なお、上記のように培養した微生物を、アスパラギン酸及び/又はピルビン酸を含む水溶液中に懸濁させることで、該水溶液中にDPAを産生させることも可能である。この時、エネルギー源として上記培地に添加されるような物質を共存させることでさらに効率よくDPAを産生させることが可能である。
上記培養上清又は反応上清液からのDPAの単離は、公知の方法、例えば、イオン交換樹脂による吸脱着、晶析による固液分離膜処理による不純物の除去等、又はそれらを組み合わせることで実施することができる。この方法により、容易にジピコリン酸の結晶又は沈殿を得ることができる。
上記イオン交換樹脂処理などによって得られたDPAを含有する溶液に、目的に応じた量のアルカリを添加することで、DPAの塩を得ることができる。具体的には、NaOHを添加することにより、ジピコリン酸ナトリウム塩を得ることができる。

0103

本発明の例示的実施形態として、さらに以下を本明細書に開示する。但し、本発明はこれらの実施形態に限定されない。
<1>枯草菌変異株であって、
prophage6領域、prophage1領域、prophage4領域、PBSX領域、prophage5領域、prophage3領域、spb領域、pks領域、skin領域、pps領域、prophage2領域、ydcL−ydeK−ydhU領域、yisB−yitD領域、yunA−yurT領域、cgeE−ypmQ領域、yeeK−yesX領域、pdp−rocR領域、ycxB−sipU領域、prophage7領域(yrkM−yraK、又はyrkS-yraK)、sbo−ywhH領域、yybP−yyaJ領域及びyncM−fosB領域からなる群より選択される1以上の領域が欠失したゲノムを有し、
枯草菌のabrB遺伝子又はそれに相当する遺伝子が恒常的に発現するように遺伝子構築され、且つkinA遺伝子が欠失又は不活性化されている、枯草菌変異株。
<2>prophage6領域、prophage1領域、prophage4領域、PBSX領域、prophage5領域、prophage3領域、spb領域、pks領域、skin領域、pps領域、prophage2領域及びprophage7領域(yrkM-yraK)を欠失したゲノムを有する、<1>の枯草菌変異株。
<3>prophage6領域、prophage1領域、prophage4領域、PBSX領域、prophage5領域、prophage3領域、spb領域、pks領域、skin領域、pps領域、prophage2領域、ydcL−ydeK−ydhU領域、yisB−yitD領域、yunA−yurT領域、cgeE−ypmQ領域、yeeK−yesX領域、pdp−rocR領域、ycxB−sipU領域、prophage7領域(yrkS−yraK)、sbo−ywhH領域、yybP−yyaJ領域及びyncM−fosB領域を欠失したゲノムを有する、<1>の枯草菌変異株。
<4>abrB遺伝子又はそれに相当する遺伝子が恒常的に発現するような遺伝子構築が、abrB遺伝子又はそれに相当する遺伝子の転写開始制御領域、又は転写開始制御領域及びリボソーム結合部位、或いは転写開始制御領域から翻訳開始制御領域に至るまでの領域における抑制性制御因子の結合部位を不活性化することである、<1>〜<3>のいずれかの枯草菌変異株。
<5>abrB遺伝子又はそれに相当する遺伝子の転写開始制御領域、又は転写開始制御領域及びリボソーム結合部位、或いは転写開始制御領域から翻訳開始制御領域に至るまでの領域における抑制性制御因子の結合部位が、配列番号5に示される塩基配列において、20〜49番目の塩基からなる領域又はこれに相当する領域、又は73〜89番目の塩基からなる領域又はこれに相当する領域である、<1>〜<3>のいずれかの枯草菌変異株。
<6>abrB遺伝子又はそれに相当する遺伝子が恒常的に発現するような遺伝子構築が、配列番号5に示される塩基配列において73〜89番目の塩基からなる領域又はこれに相当する領域を削除するものである、<5>の枯草菌変異株。
<7>abrB遺伝子又はそれに相当する遺伝子が、下記の(a)〜(f)からなる群より選択される、<1>〜<6>のいずれかの枯草菌変異株。
(a)配列番号1に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
(b)配列番号1に示すヌクレオチド配列と80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつAbrBと同様の遷移期および定常期に誘導される遺伝子の転写因子としての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号1に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつAbrBと同様の遷移期および定常期に誘導される遺伝子の転写因子としての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号2に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(e)配列番号2に示すアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなりかつAbrBと同様の遷移期および定常期に誘導される遺伝子の転写因子としての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(f)配列番号2に示すアミノ酸配列と80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつAbrBと同様の遷移期および定常期に誘導される遺伝子の転写因子としての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
<8>kinA遺伝子が、下記の(g)〜(l)からなる群より選択される、<1>〜<7>のいずれかの枯草菌変異株。
(g)配列番号3に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
(h)配列番号3に示すヌクレオチド配列と80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ胞子形成初期に関わる多成分制御系のセンサーヒスチジンキナーゼとしての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(i)配列番号3に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ胞子形成初期に関わる多成分制御系のヒスチジンキナーゼとしての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(j)配列番号3に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(k)配列番号4に示すアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ胞子形成初期に関わる多成分制御系のヒスチジンキナーゼとしての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(l)配列番号4に示すアミノ酸配列と80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ胞子形成初期に関わる多成分制御系のヒスチジンキナーゼとしての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
<9><1>〜<8>のいずれかの枯草菌変異株において、目的遺伝子が発現可能に強化又は導入された組換え枯草菌。
<10>目的遺伝子が、セルラーゼ遺伝子である<9>の組換え枯草菌。
<11>目的遺伝子が、ポリ−γ−グルタミン酸合成酵素遺伝子、又はポリ−γ−グルタミン酸合成酵素遺伝子及びポリ−γ−グルタミン酸分解酵素遺伝子である<9>の組換え枯草菌。
<12>ポリ−γ−グルタミン酸合成酵素をコードする遺伝子が、枯草菌遺伝子pgsB、pgsC、pgsA及びpgsE、ならびにそれらに相当する遺伝子からなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子であり、ポリ−γ−グルタミン酸分解酵素遺伝子が枯草菌pgdS遺伝子又はそれに相当する遺伝子である<10>の組換え枯草菌。
<13>目的遺伝子が、ジピコリン酸シンターゼ遺伝子である<9>の組換え枯草菌。
<14>ジピコリン酸シンターゼをコードする遺伝子が、枯草菌spoVFA又はそれに相当する遺伝子及び枯草菌spoVFB又はそれに相当する遺伝子である<13>の組換え枯草菌。
<15>枯草菌変異株の製造方法であって、
prophage6領域、prophage1領域、prophage4領域、PBSX領域、prophage5領域、prophage3領域、spb領域、pks領域、skin領域、pps領域、prophage2領域、ydcL−ydeK−ydhU領域、yisB−yitD領域、yunA−yurT領域、cgeE−ypmQ領域、yeeK−yesX領域、pdp−rocR領域、ycxB−sipU領域、prophage7領域(yrkM−yraK、又はyrkS-yraK)、sbo−ywhH領域、yybP−yyaJ領域及びyncM−fosB領域からなる群より選択される1以上の領域が欠失したゲノムを有する枯草菌変異株において、abrB遺伝子又はそれに相当する遺伝子が恒常的に発現するように遺伝子構築する工程、及びkinA遺伝子を欠失又は不活性化させる工程を含む、方法。
<16>組換え枯草菌の製造方法であって、
prophage6領域、prophage1領域、prophage4領域、PBSX領域、prophage5領域、prophage3領域、spb領域、pks領域、skin領域、pps領域、prophage2領域、ydcL−ydeK−ydhU領域、yisB−yitD領域、yunA−yurT領域、cgeE−ypmQ領域、yeeK−yesX領域、pdp−rocR領域、ycxB−sipU領域、prophage7領域(yrkM−yraK、又はyrkS-yraK)、sbo−ywhH領域、yybP−yyaJ領域及びyncM−fosB領域からなる群より選択される1以上の領域が欠失したゲノムを有する枯草菌変異株において、abrB遺伝子又はそれに相当する遺伝子が恒常的に発現するように遺伝子構築する工程、kinA遺伝子を欠失又は不活性化させる工程、及び目的遺伝子を発現可能に強化又は導入する工程を含む、方法。
<17><9>の組換え枯草菌を培養し、培養物又は菌体から目的遺伝子産物を回収する工程を含む、目的遺伝子産物の製造方法。
<18><10>の組換え枯草菌を培養し、培養物又は菌体からセルラーゼを回収する工程を含む、セルラーゼの製造方法。
<19><11>又は<12>の組換え枯草菌を培養し、培養物からポリ−γ−グルタミン酸を回収する工程を含む、ポリ−γ−グルタミン酸の製造方法。
<20>グルタミン酸又はその塩を0.005〜600g/L含有する培地を用いる<19>記載の、ポリ−γ−グルタミン酸の製造方法。
<21><13>又は<14>の組換え枯草菌を培養し、培養物からジピコリン酸を回収する工程を含む、ジピコリン酸の製造方法。

0104

以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。

0105

(実施例1)菌株の構築
(1−1)トリプトファン要求性解除株の作製
枯草菌野生株ゲノムの大領域が欠失した枯草菌変異株(MGB874株;特開2007−130013号公報)におけるトリプトファン要求性を解除した。枯草菌変異株MGB874株の元株である枯草菌168株は、遺伝子型としてtrpC2を所持している。つまり168株はトリプトファン合成に関与するインドール−3−グリセロールリン酸シンターゼをコードするtrpC遺伝子変異のためトリプトファン合成要求性である。また、枯草菌ATCC6051T株はトリプトファン非要求性であることが知られている(Albertini,A.M.&Galizzi,A.Microbiology,1999,145(Pt12):3319−3320)。枯草菌168株とATCC6051T株のtrpC遺伝子を比較したところ、328番目から330番目のヌクレオチドATTが枯草菌168株では存在しないことがわかった。そこで、ATCC6051T株ゲノムを鋳型とし、表3記載のtrpC_F1及びtrpC_R1のプライマーを用いてPCRを行い、PCR産物を構築した。このPCR産物を用いて枯草菌野生株168株及び枯草菌変異株MGB874株をコンピテント法(J.Bacteriol.,1960,81:741−746)でそれぞれ形質転換し、トリプトファン非添加のSMA寒天培地(0.2%硫酸アンモニウム、1.4%リン酸水素カリウム、0.6%リン酸水素カリウム、0.1%クエン酸ナトリウム-2水和物、0.5%グルコース、0.035%硫酸マグネシウム7水和物、1.5%寒天)に生育したコロニーを形質転換体として分離した。こうしてトリプトファン非要求性の枯草菌変異株168T及び枯草菌変異株MGB874T株をそれぞれ得た。

0106

0107

(1−2)abrB遺伝子恒常発現変異が導入された枯草菌変異株(168_abrB*株)の構築
abrB遺伝子恒常発現変異の導入を行った。枯草菌野生株168株のゲノムDNAを鋳型とし、表4記載のプライマーDspo0Abox−FF及びDspo0Abox−FRを用いて、abrB遺伝子上流領域断片(A)をPCRにより増幅した。また、表4記載のプライマーDspo0Abox−PF及びDspo0Abox−PRを用いて、abrB遺伝子上流領域断片(B)をPCRにより増幅した。また、表4記載のプライマーDspo0Abox−BF及びDspo0Abox−BRを用いて、abrB遺伝子上流域中流領域断片(C)をPCRにより増幅した。次いで、クロラムフェニコール耐性遺伝子保有のプラスミドpDLT3(Morimoto T.et al.,Microbiology,2002,148:3539−3552)を鋳型とし、表4記載のプライマーrPCR−CmF2及びrPCR−CmR2を用いて、PCR増幅を行い、クロラムフェニコール耐性遺伝子の断片(D)をPCR増幅した。

0108

次に、得られた断片(A)及び断片(D)を表4記載のプライマーDspo0Abox−FF及びrPCR−CmR2を用いてSOE−PCR法によって結合させ、断片(B)及び断片(C)を表4記載のプライマーDspo0Abox−PF及びDspo0Abox−BRを用いてSOE−PCR法によって結合させた。最後に、断片(A+D)及び断片(B+C)を表4記載のプライマーDspo0Abox−FF及びDspo0Abox−BRを用いてSOE−PCR法によって結合させ、最終PCR産物(A+D+B+C)を得た。得られた最終PCR産物を用いて枯草菌野生株168株で形質転換し、枯草菌変異株168_abrB*_Cm株を得た。

0109

次に、薬剤耐性遺伝子置換用プラスミドpCm::Em(Lei Y.et al.,J.Bacteriol.,2013,195:1697−1705)を用いて枯草菌変異株168_abrB*_Cm株で形質転換し、クロラムフェニコール耐性遺伝子がエリスロマイシン耐性遺伝子に置換された枯草菌変異株168_abrB*を構築した。

0110

得られた枯草菌変異株168_abrB*株のゲノムを用いたPCR及びそれに続くサンガー法によるシークエンシングによって、ゲノム上の所定の位置に目的変異が導入されていることを確認した。

0111

(1−3)kinA遺伝子が欠失した枯草菌変異株(168_ΔkinA株)の構築
kinA遺伝子の欠失変異導入を行った。枯草菌野生株168株のゲノムDNAを鋳型とし、表4記載のプライマーkinA−uF1及びkinA−uR1を用いて、kinA遺伝子上流領域の断片(A)をPCRにより増幅した。また、表4記載のプライマーkinA−dF1及びkinA−dR1を用いて、kinA遺伝子下流領域の断片(B)をPCRにより増幅した。次いで、カナマイシン耐性遺伝子保有のプラスミドpAPNCK(Yoshimura M.et al.,BMCMicrobiology,2007,7:69)を鋳型とし、表4記載のプライマーrPCR−KmF及びrPCR−KmRを用いて、PCR増幅を行い、カナマイシン耐性遺伝子の断片(C)をPCR増幅した。

0112

次に、断片(A)、断片(C)及び断片(B)をこの順になるように表4記載のプライマーkinA−uF1及びkinA−dR1を用いてSOE−PCR法によって結合させ、最終PCR産物(A+C+B)を得た。得られた最終PCR産物を用いて枯草菌野生株168株で形質転換し、枯草菌変異株168_ΔkinA株を得た。

0113

得られた枯草菌変異株168_ΔkinA株のゲノムを用いたPCR及びそれに続くサンガー法によるシークエンシングによって、ゲノム上の所定の位置に目的遺伝子が欠失していることを確認した。

0114

(1−4)abrB遺伝子恒常発現変異の導入及びkinA遺伝子が欠失した枯草菌変異株(168_abrB*ΔkinA株)の構築
枯草菌変異株168_abrB*株のゲノムDNAを用いてコンピテント法(J.Bacteriol.,1960,81:741−746)により枯草菌変異株168_ΔkinA株の形質転換を行い、エリスロマイシンを含むLB寒天培地上に生育したコロニーを枯草菌変異株168_abrB*ΔkinA株として構築した。

0115

得られた枯草菌変のゲノムを用いたPCR法を用いて、ゲノム上の所定の位置に目的変異が導入されていること、及び欠失されていることを確認した。

0116

0117

(1−5)PGA合成酵素遺伝子群及びPGA分解酵素をコードする遺伝子の発現が強化された枯草菌変異株(MGB874T_PGA株)の構築
始めに、枯草菌が本来ゲノム上に有するPGA合成酵素遺伝子群(pgsBCAE)及びPGA分解酵素をコードする遺伝子の欠失変異導入を行った。本変異株の作製は、IPTG制御領域と遊離mRNA切断リボヌクレアーゼであるmazF遺伝子を融合したカセットを使用するマーカーフリーの欠失法にて構築した(Morimoto,T. et al.,In Strain Engineering,pp345−358.Springer)。

0118

実施例(1−1)にて構築した枯草菌変異株MGB874T株から抽出したゲノムDNAを鋳型として、断片(A)増幅には表5記載のプライマーpgs−DF1及びpgs−DR1を、断片(B)増幅には表5記載のプライマーpgs−DF2及びpgs−DR2を、断片(C)増幅には表5記載のプライマーpgs−IF及びpgs−IRを、それぞれ使用した。さらに、枯草菌変異株TOM310(Morimoto,T. et al.,In Strain Engineering,pp345−358.Springer)を鋳型とし、表5記載のプライマーpAPNC−F及びchpA−Rを用いて、スペクチノマイシン耐性遺伝子を含むmazFカセット断片(D)をPCRにより増幅した。次に、得られた断片(A)、断片(B)、断片(D)及び断片(C)をこの順となる様に表5記載のプライマーpgs−DF1及びpgs−IRを用いてSOE−PCR法によって結合させ、最終DNA断片を得た。構築した最終PCR産物を枯草菌変異株MGB874T株で形質転換した。得られた形質転換体(枯草菌MGB874T_ΔpgsBCAEΔpgdS株)のゲノムを用いたPCR及びそれに続くサンガー法によるシークエンシングによって、ゲノム上の変異導入を行った各遺伝子について欠失が生じていることを確認した。本実施例でのmazF遺伝子カセットを使用するマーカーフリーの欠失法にて構築したPGA合成酵素遺伝子群(pgsBCAE)及びPGA分解酵素をコードする遺伝子欠失方法を図3に示した。

0119

次いで、PGA分解酵素をコードする遺伝子の導入を行った。枯草菌変異株MGB874T株のゲノムDNAを鋳型とし、表5記載のプライマーtufA−1f及びtufA−1rを用いて、tufA遺伝子下流領域の断片(A)をPCRにより増幅した。また、表5記載のプライマーtufA−2f及びtufA−2rを用いて、tufA遺伝子下流領域の断片(B)をPCRにより増幅した。次いで、枯草菌変異株MGB874T株のゲノムDNAを鋳型とし、表5記載のプライマーBSpgdS−F及びBSpgdS−Rを用いて、pgdS遺伝子ORFの断片(C)をPCRにより増幅した。次いで、スペクチノマイシン耐性遺伝子保有のプラスミドpAPNC213(Morimoto T.et al.,Microbiology,2002,148:3539−3552)を鋳型とし、表5記載のプライマーspc−F及びspc−Rを用いて、PCR増幅を行い、スペクチノマイシン耐性遺伝子の断片(D)をPCR増幅した。

0120

次に、得られた断片(A)、断片(C)、断片(D)及び断片(B)をこの順となるように表5記載のプライマーtufA−1f及びtufA−2rを用いてSOE−PCR法によって結合させ、最終PCR産物を得た。得られた最終PCR産物を用いて上述した枯草菌MGB874T_ΔpgsBCAEΔpgdS株で形質転換し、枯草菌変異株MGB874T_ΔpgsBCAEΔpgdS_PtufA−pgdS株を得た。

0121

得られた枯草菌変異株MGB874T_ΔpgsBCAEΔpgdS_PtufA−pgdS株のゲノムを用いたPCR及びそれに続くサンガー法によるシークエンシングによって、ゲノム上の所定の位置に目的遺伝子が導入されていることを確認した。

0122

次いで、PGA合成酵素遺伝子群の導入を行った。枯草菌変異株MGB874T株のゲノムDNAを鋳型とし、表5記載のプライマーamyE−UF及び表5記載のプライマーamyE−URを用いて、amyE上流領域の断片(A)をPCRにより増幅した。pDLT3(Morimoto T.et al.,Microbiology,2002,148:3539−3552)で枯草菌野生株168を形質転換した変異株を鋳型とし、表5記載のプライマーcat−F及び表5記載のプライマーamyE−DRを用いて、クロラムフェニコール耐性遺伝子を含むamyE下流領域の断片(B)をPCRにより増幅した。次いで、枯草菌変異株RIK356株(Natori Y.et al.,J.Bacteriol.,2009,191:4555−4561)のゲノムDNAを鋳型とし、表5記載のプライマーamyE/PrrnO−F及びPrrnO/bs−pgsRを用いて、rrnOオペロンの制御領域の断片(C)をPCRにより増幅した。次いで、枯草菌変異株MGB874T株のゲノムDNAを鋳型とし、表5記載のプライマーbs−pgsF及びbs−pgs/catRを用いて、PCR増幅を行い、pgsBCAE遺伝子群の断片(D)をPCR増幅した。

0123

次に、得られた断片(A)、断片(C)、断片(D)及び断片(B)をこの順となる様に表5記載のプライマーamyE−UF及びamyE−DRを用いてSOE−PCR法によって結合させ、最終PCR産物を得た。得られた最終PCR産物を用いてMGB874T_ΔpgsBCAEΔpgdS_PtufA−pgdS株で形質転換し、枯草菌変異株MGB874T_PGA株を得た。

0124

得られた枯草菌変異株MGB874T_PGA株のゲノムを用いたPCR法を用いて、ゲノム上の所定の位置に目的遺伝子群が導入されていることを確認した。

0125

0126

(1−6)abrB遺伝子恒常発現変異が導入され、kinA遺伝子が欠失し、PGA合成酵素遺伝子群及びPGA分解酵素をコードする遺伝子の発現が強化された枯草菌変異株(MGB874T_PGA_abrB*ΔkinA株)の構築
始めに、枯草菌変異株168_abrB*ΔkinA株のゲノムDNAを用いてコンピテント法(J.Bacteriol.,1960,81:741−746)により枯草菌変異株MGB874T_PGA株の形質転換を行い、エリスロマイシンを含むLB寒天培地上に生育したコロニーを枯草菌変異株MGB874T_PGA_abrB*株、及びカナマイシンを含むLB寒天培地上に生育したコロニーを枯草菌変異株MGB874T_PGA_ΔkinA株としてそれぞれ構築した。

0127

次に、枯草菌変異株MGB874T_PGA_abrB*株のゲノムDNAを用いてコンピテント法(J.Bacteriol.,1960,81:741−746)により枯草菌変異株MGB874T_PGA_ΔkinA株の形質転換を行い、エリスロマイシンを含むLB寒天培地上に生育したコロニーを枯草菌変異株MGB874T_PGA_abrB*ΔkinA株として構築した。

0128

得られた枯草菌変のゲノムを用いたPCR法を用いて、ゲノム上の所定の位置に目的遺伝子群が導入されていること、及び欠失されていることを確認した。

0129

(実施例2)PGA生産性評価
実施例1にて得られた枯草菌変異株を5mLの5%グルコースM改変培地(5%グルコース、0.6%塩化アンモニウム、0.15%リン酸水素2カリウム、0.035%硫酸マグネシウム7水和物、0.005%硫酸マンガン5水和物、50mM MOPS(モノホリノプロパンスルホン酸緩衝剤(pH7.0)、その他微量金属)で30℃にて12〜16時間振盪培養を行い、さらに得られた培養液を、30mLの5%グルコースM改変培地(5%グルコース、0.6%塩化アンモニウム、0.15%リン酸水素2カリウム、0.035%硫酸マグネシウム7水和物、0.005%硫酸マンガン5水和物、50mM MOPS(モノホリノプロパンスルホン酸)緩衝剤(pH7.0)、その他微量金属、4.0%炭酸カルシウム)に1mL(約3%(v/v))接種し、37℃、210rpmで1日間、振盪培養を行った。培養終了後、下記測定例に示す分析条件にてPGA生産量を測定した。PGA生産量は、MGB874T_PGA株におけるPGA生産量を100%とした場合の相対値で示した。

0130

結果を表6に示す。abrB遺伝子を恒常発現させた枯草菌変異株MGB874T_PGA_abrB*株は、培養1日目で、枯草菌変異株MGB874T_PGAと比較してPGA生産量が高かった。また、kinA遺伝子が欠失した枯草菌変異株MGB874T_PGA_ΔkinA株は、培養1日目で、枯草菌変異株MGB874T_PGAと比較してPGA生産量が高かった。さらに、abrB遺伝子を恒常発現及びkinA遺伝子が欠失した枯草菌変異株MGB874T_PGA_abrB*ΔkinA株は、培養1日目で、枯草菌変異株MGB874T_PGAと比較してPGA生産量が最も高かった。

0131

0132

<PGAの定量分析及び分子量分析>
培養終了後の培養液試料を、室温にて14,800rpmで30分間の遠心分離(日立工機、himacCF15RX)に供し、得られた遠心分離後の試料上清中に含まれるPGAについて、HPLC法にて定量分析及び分子量分析を行った。使用したHPLC装置は、送液ポンプ島津、LC−9A)、オートサンプラー(日立計測機器、AS−2000)、カラムオーブン(島津、CTO−6A)、UV検出計(島津、SPD−10A)、脱ガス装置(GLサイエンス、DG660B)及びクロマトデータ解析装置(日立計測機器、D−2500)を接続して用いた。分析カラムは、排除限界の異なる2種類の東ソー製の親水性ポリマー用ゲルろ過カラムTSKgel G6000PWXL(7.8mm I.D.×30cm、排除限界>5×107)及びTSKgel G4000PWXL(7.8mm I.D.×30cm、排除限界1×106)を用い、これら分析カラムの直前ガードカラムTSK guardcolumn PWXL(6.0mm I.D.×4.0cm)を接続した。溶離液には0.1M硫酸ナトリウム流速1.0mL/分、カラム温度は50℃、溶出ピーク検出波長は210nmを用いた。試料注入量サンプルループレオダイン)を用い、1分析あたり50μLとした。HPLC分析に供するサンプルは、不溶物を除くための前処理としてMULTISCREEN MNHV45(MILLIPORE製、0.45μmデュポア膜)にてフィルターろ過処理し調製した。濃度検定には分子量80万のPGA(明治フードマテリアル)を用いて検量線を作成した。

0133

(実施例3)菌株の構築
(3−1)abrB遺伝子恒常発現変異の導入及びkinA遺伝子が欠失した枯草菌変異株(MGB874T_abrB*ΔkinA株)の構築
・MGB874T_abrB*ΔkinA株
始めに、枯草菌変異株168_abrB*ΔkinA株のゲノムDNAを用いてコンピテント法(J.Bacteriol.,1960,81:741−746)により枯草菌変異株MGB874T株の形質転換を行い、エリスロマイシンを含むLB寒天培地上に生育したコロニーを枯草菌変異株MGB874T_abrB*株を構築した。
また、上記(1−3)と同様な方法で表7に示したプライマーを用いて枯草菌変異株MGB874Tのゲノム上のkinA遺伝子がクロラムフェニコール耐性遺伝子(pCU194由来(Horinouchi S.and B. Weisblum,J.Bacteriol.,1982,150:815−825))に置換された枯草菌変異株MGB874T_ΔkinA株を構築した。

0134

次に、枯草菌変異株MGB874T_abrB*株のゲノムDNAを用いてコンピテント法(J.Bacteriol.,1960,81:741−746)により枯草菌変異株MGB874T_ΔkinA株の形質転換を行い、エリスロマイシンを含むLB寒天培地上に生育したコロニーを枯草菌変異株MGB874T_abrB*ΔkinA株として構築した。

0135

得られた枯草菌変異株のゲノムを用いたPCR法を用いて、ゲノム上の所定の位置に目的変異が導入されていること、及び欠失されていることを確認した。

0136

(3−2)ジピコリン酸シンターゼ遺伝子が発現強化された枯草菌変異株(MGB874T_PyoeB−spoVFAB株)の構築
・MGB874T_PyoeB−spoVFAB株
上記で構築したMGB874T株を宿主として、ジピコリン酸シンターゼ遺伝子が発現強化された枯草菌変異株(MGB874T_PyoeB−spoVFAB株)の構築を行った。枯草菌野生株168株から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、表7記載のプライマーPsub−spoVFAB−s1及びPsub−spoVFAB−1r(配列番号178)を用いて、断片(A)をPCRにより増幅した。この断片(A)はspoVFA遺伝子のプロモーターの上流に隣接する領域である。また、同ゲノムDNAを鋳型とし、表7記載のプライマーPsub−spoVFAB−2f及びPsub−spoVFAB−s2を用いて、断片(B)をPCRにより増幅した。この断片(B)は、spoVFA遺伝子の開始コドンから下流の領域である。さらに、同ゲノムDNAを鋳型とし、表7記載のプライマーP−yoeB−F及びP−yoeB−Rを用いて、yoeB制御領域配列を含む断片(C)をPCRにより増幅した。さらに、プラスミドpJL62(LeDeaux & Grossman,J.Bacteriol.,1995,177:166−175)を鋳型とし、表7記載のプライマーrPCR−specR及びrPCR−specFを用いて、スペクチノマイシン耐性遺伝子とその制御領域を含む断片(D)をPCRにより増幅した。

0137

次に、得られた断片(A)及び断片(D)を鋳型に、表7記載のプライマーPsub−spoVFAB−s1及びrPCR−specFを用いて、断片(A)と断片(D)を連結した断片(A+D)をPCRにより増幅した。また、得られた断片(C)及び断片(B)を鋳型に、表7記載のプライマーP−yoeB−F及びPsub−spoVFAB−s2を用いて、断片(C)と断片(B)を連結した断片(C+B)をPCRにより増幅した。

0138

最後に、得られた断片(A+D)及び(C+B)を鋳型に、表7記載のプライマーPsub−spoVFAB−1f及びPsub−spoVFAB−2rをもちいて、断片(A+D)及び断片(C+B)を連結したDNA断片を増幅した。
得られたDNA断片を用いて、コンピテント法(J.Bacteriol.,1960,81:741−746)により枯草菌MGB874T株の形質転換を行い、スペクチノマイシンを含むLB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した(以下、分離した形質転換体をMGB874T_PyoeB−spoVFAB株と称する)。MGB874T_PyoeB−spoVFAB株は、spoVFAB遺伝子のプロモーターをyoeB遺伝子のプロモーターに置換され、spoVFAB遺伝子の発現が強化された枯草菌変異株である。

0139

PCR及びそれに続くサンガー法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1982,74:5463−5467)によるシークエンシングによって、構築したMGB874T_PyoeB−spoVFAB株のゲノム上のspoVFA制御領域とspoVFA遺伝子の間に、スペクチノマイシン耐性遺伝子及びyoeB遺伝子制御領域が挿入されていることを確認した。

0140

0141

(3−3)MGB874T_abrB*ΔkinA株にジピコリン酸シンターゼ遺伝子が発現強化された枯草菌変異株(MGB874T_abrB*ΔkinA_PyoeB−spoVFAB株)の構築
上記(3−2)で構築したMGB874T_PyoeB−spoVFAB株を宿主として、kinA遺伝子を削除された枯草菌変異株(MGB874T_PyoeB−spoVFABΔkinA)の構築を行った。上記(3−1)で構築したMGB874T_abrB*ΔkinA株から抽出したゲノムDNA断片を用いて、コンピテント法(J.Bacteriol.,1960,81:741−746)により枯草菌MGB874T_PyoeB−spoVFAB株の形質転換を行い、クロラムフェニコールを含むLB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した(以下、分離した形質転換体をMGB874T_ΔkinA_PyoeB−spoVFAB株と称する)。

0142

次に、得られた形質転換体MGB874T_ΔkinA_PyoeB−spoVFABを宿主として、abrB遺伝子恒常発現変異の導入変異体MGB874T_abrB*ΔkinA_PyoeB−spoVFAB株の構築を行った。上記(3−1)で構築したMGB874T_abrB*ΔkinA株から抽出したゲノムDNA断片を用いて、コンピテント法(J.Bacteriol.,1960,81:741−746)により枯草菌MGB874T_ΔkinA_PyoeB−spoVFAB株の形質転換を行い、エリスロマイシンを含むLB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した(以下、分離した形質転換体をMGB874T_abrB*ΔkinA_PyoeB−spoVFAB株と称する)。

0143

PCR及びそれに続くサンガー法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1982,74:5463−5467)によるシークエンシングによって、構築したMGB874T_abrB*ΔkinA_PyoeB−spoVFAB株のゲノム上の所定の位置に目的遺伝子群が導入されていること及び欠失されていることを確認した。

0144

(実施例4)DPA生産性評価
実施例3で構築したMGB874T_abrB*ΔkinA_PyoeB−spoVFAB株を、5mLの5%グルコースM改変培地(5.0%グルコース、0.6%塩化アンモニウム、0.15%リン酸水素2カリウム、0.035%硫酸マグネシウム7水和物、0.005%硫酸マンガン5水和物、50mM MOPS(モノホリノプロパンスルホン酸)緩衝剤(pH7.0)、その他微量金属、)で37℃において8〜10時間振盪培養を行い、得られた培養液を、5%グルコースM改変培地(5.0%グルコース、0.6%塩化アンモニウム、0.15%リン酸水素2カリウム、0.035%硫酸マグネシウム7水和物、0.005%硫酸マンガン5水和物、50mM MOPS(モノホリノプロパンスルホン酸)緩衝剤(pH7.0)、その他微量金属、4.0%炭酸カルシウム)30mLに接種し、37℃、210rpmで2日間、振盪培養を行った。
培養終了後、下記参考例に示す分析条件にてDPA生産量を測定し、MGB874T_PyoeB−spoVFAB株の生産量を100%とした場合の相対値を求めた。

0145

abrB恒常発現及びkinA欠失変異を導入した枯草菌変異株MGB874T_abrB*ΔkinA_PyoeB−spoVFAB株は、これらの変異を導入していない株であるMGB874T_PyoeB−spoVFAB株と比較して、DPA生産量が顕著に高かった(表8)。

0146

0147

<DPAの定量>
培養終了後の培養液試料を、室温にて14,800rpmで30分間の遠心分離(日立工機、himacCF15RX)に供し、得られた遠心分離後の試料上清中に含まれるDPAについて、HPLC法にて定量分析を行った。HPLC装置は、送液ポンプ(島津、LC−9A)、オートサンプラー(日立計測機器、AS−2000)、カラムオーブン(島津、CTO−6A)、UV検出計(島津、SPD−10A)、脱ガス装置(GLサイエンス、DG660B)及びクロマトデータ解析装置(日立計測機器、D−2500)を接続したものを用いた。分析カラムは、High Performance Carbohydrate Column 60(Å)4μm 4.6×250mm HPLC Column(Aminopropylmethylsilyl bonded amorphous silica)(Waters)を使用した。溶離液としては、10mMEDTAを含む水を濃リン酸でpH3.4に合わせた水溶液とアセトニトリル溶液とを1:1に混合した溶液を用いた。測定条件は、検出波長を270nmとし、流速を1mL/分とした。HPLC分析に供するサンプルは、不溶物を除くため、MULTISCREEN MNHV45(MILLIPORE製、0.45μmデュラポア膜)にてフィルターろ過により前処理した。濃度検定は、2,6−Pyridinedicarboxlic acid:DPA,99%(SIGMA−ALDRICH)を用いて作成した検量線に基づいて行った。

0148

(実施例5)菌株の構築
(5−1)枯草菌変異株OA105T株の作製
枯草菌野生株168株のゲノム上に存在する2つの溶原化ファージ領域(SPβ、PBSX)、1つの潜在性溶原化ファージ残遺物領域(skin)、7つのプロファージ様領域(prophage1−7)、2つの抗菌性物質plipastatin及びbacillaeneの合成遺伝子(pps及びpks)を欠失し、更にトリプトファン要求性を解除した枯草菌変異株を構築した。
始めに、prophage7(yrkM-yraK)領域の欠失変異導入を行った。本変異株の作製は、実施例(1−5)にて記載したマーカーフリーの欠失方法にて構築した。

0149

始めに、枯草菌野生株168株から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、表9記載のプライマーpro7−DF1及びpro7−DR1.2(new)を用いて、prophage7領域の上流である断片(A)をPCRにより増幅した。また、同ゲノムDNAを鋳型とし、表9記載のプライマーpro7−DF2.2(new)及びpro7−DR2を用いて、prophage7領域の下流である断片(B)をPCRにより増幅した。さらに、同ゲノムDNAを鋳型とし、表9記載のプライマーpro7−IF2及びpro7−IRを用いて、prophage7領域内と相同領域である断片(C)をPCRにより増幅した。さらに、枯草菌変異株TOM310(Morimoto,T. et al.,In Strain Engineering,pp345−358.Springer)を鋳型とし、表5記載のプライマーpAPNC−F及びchpA−Rを用いて、スペクチノマイシン耐性遺伝子を含むmazFカセット断片(D)をPCRにより増幅した。

0150

次に、得られた断片(A)、断片(B)、断片(D)及び断片(C)をこの順となる様に表9のプライマーpro7−DF1及びpro7−IRを用いてSOE−PCR法によって結合させ、最終DNA断片を得た。得られたDNA断片を用いて、コンピテント法(J.Bacteriol.,1960,81:741−746)により枯草菌変異株MGB469株(Morimoto T.et al.,DNA Res.,2008,15:73−81)の形質転換を行い、IPTGを含まずスペクチノマイシンを含むLB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。本株は、SPβ、PBSX、prophage1−6領域、pps及びpksを欠失し、upp遺伝子内にエリスロマイシン耐性遺伝子が導入された変異(upp::erm)を有し、更にprophage7::mazFカセットが導入された枯草菌変異株である(以下、MGB469_pro7株と称する)。

0151

次に、mazF遺伝子カセットを除くため、IPTGを含むLB寒天培地上で培養し、生育したコロニーを選択した。得られた変異株は、断片(B)において細胞内相同組換えによりmazFカセットが除去された変異株となる(以下、MGB12株と称する)。

0152

次に、枯草菌変異株MGB12株のトリプトファン要求性解除株の構築を行った。
実施例(1−1)と同様の手法を用いて、トリプトファン要求性が解除された枯草菌変異株MGB12T株の構築をした。

0153

最後に、枯草菌変異株MGB12T株のupp::erm変異の除去を行った。

0154

実施例(1−1)にて構築した枯草菌変異株168T株及び枯草菌変異株MGB469_pro7株のゲノムDNAを用いてコンピテント法(J.Bacteriol.,1960,81:741−746)により枯草菌変異株MGB12_T株の形質転換を行い、スペクチノマイシン耐性且つエリスロマイシン感受性の形質転換体を選択した。次いで、IPTGを含むLB寒天培地上に生育したコロニーを選択し、目的とした枯草菌野生株168株のゲノム上に存在する2つの溶原化ファージ領域(SPβ、PBSX)、1つの潜在性溶原化ファージ残遺物領域(skin)、7つのプロファージ様領域(prophage1−7)、2つの抗菌性物質plipastatin及びbacillaeneの合成遺伝子(pps及びpks)を欠失し、更にトリプトファン要求性を解除した枯草菌変異株を構築した(以下、枯草菌変異株OA105T株と称する)。

0155

得られた枯草菌変異株のゲノムを用いたPCR法を用いて、ゲノム上の所定の位置に目的変異が導入されていること、及び欠失されていることを確認した。

0156

0157

(5−2)abrB遺伝子恒常発現変異が導入された枯草菌変異株(OA105T_abrB*株)の構築
始めに、実施例(1−4)にて構築した枯草菌変異株168_abrB*ΔkinA株のゲノムDNAを用いてコンピテント法(J.Bacteriol.,1960,81:741−746)により枯草菌変異株OA105T株の形質転換を行い、エリスロマイシンを含むLB寒天培地上に生育したコロニーを枯草菌変異株OA105T_abrB*株として構築した。

0158

得られた枯草菌変異株のゲノムを用いたPCR法を用いて、ゲノム上の所定の位置に目的変異が導入されていることを確認した。

0159

(5−3)kinA遺伝子が欠失した枯草菌変異株(OA105T_ΔkinA株)の構築
実施例(1−4)にて構築した枯草菌変異株168_abrB*ΔkinA株のゲノムDNAを用いてコンピテント法(J.Bacteriol.,1960,81:741−746)により枯草菌変異株OA105T株の形質転換を行い、カナマイシンを含むLB寒天培地上に生育したコロニーを枯草菌変異株OA105T_ΔkinA株として構築した。

0160

得られた枯草菌変異株のゲノムを用いたPCR法を用いて、ゲノム上の所定の位置に目的遺伝子が欠失されていることを確認した。

0161

(5−4)abrB遺伝子恒常発現変異の導入、及びkinA遺伝子が欠失された枯草菌変異株(OA105T_abrB*ΔkinA株)の構築

0162

実施例(1−4)にて構築した枯草菌変異株168_abrB*ΔkinA株のゲノムDNAを用いてコンピテント法(J.Bacteriol.,1960,81:741−746)により枯草菌変異株OA105T_ΔkinA株の形質転換を行い、エリスロマイシンを含むLB寒天培地上に生育したコロニーを枯草菌変異株OA105T_abrB*ΔkinA株として構築した。

0163

得られた枯草菌変異株のゲノムを用いたPCR法を用いて、ゲノム上の所定の位置に目的変異が導入されていること、及び欠失されていることを確認した。

0164

(5−5)アルカリセルラーゼ生産用ベクター(pHY−S237)の構築
バチルス属細菌KSM−S237株(FERM BP−7875)由来のS237セルラーゼ遺伝子(特開2000−210081号公報参照)(配列番号6)をコードするDNA断片(3.1kb;配列番号6の塩基番号13〜3124)を鋳型として、表10に示されるプライマーEgl−S237.F及びプライマーEgl−S237.Rのプライマーセットを用いてPCRを行い、シャトルベクターpHY300PLKのBamHI制限酵素切断点に挿入された組換えプラスミドpHY−S237を構築した。

0165

0166

(5−6)アルカリセルラーゼ生産用ベクター(pHY−S237)が導入された組換え枯草菌変異株の作製
上記(5−2)〜(5−4)で作製した枯草菌変異株OA105T株、枯草菌変異株OA105T_abrB*株、枯草菌変異株MOA105T_ΔkinA株及び枯草菌変異株OA105T_abrB*ΔkinA株を宿主とした。
上記(5−5)で作製したアルカリセルラーゼ生産用ベクター(pHY−S237)を用いて、プロトプラスト形質転換法(Mol.Gen.Genet.,1979,168:111−115)により各宿主を形質転換した。テトラサイクリン塩酸塩50ppmを添加したDM3プロトプラスト再生培地(0.5Mコハク酸ナトリウム(pH7.3)、0.5%カザミノ酸ディフコ社製)、0.5%酵母エキス(ディフコ社製)、0.35% K2HPO4、0.15% KH2PO4、0.5%グルコース、20mM MgCl2、0.01%牛血清アルブミンシグマ社製)、1%バクト寒天(ディフコ社製))上に生育したコロニーを目的とする枯草菌形質転換体として選抜した。

0167

(実施例6)セルラーゼ生産性評価
実施例5にて得られた形質転換体を、15ppmのテトラサイクリンを含む5mLのLB培地(1.0%トリプトン(ディフコ社製)、0.5%酵母エキス(ディフコ社製)、1.0%NaCl)で、30℃で15時間振盪培養し、更にこの培養液0.6mLを15ppmのテトラサイクリンを含む30mLの2×L−マルトース培地(2% トリプトン、1% 酵母エキス、1%塩化ナトリウム、7.5% マルトース、7.5ppm硫酸マンガン4−5水和物)に接種し、30℃で3日間振盪培養した。培養後、遠心分離によって菌体を除いた培養上清のアルカリセルラーゼ活性を測定し、菌体外に分泌生産されたアルカリセルラーゼの量を算出した。
生産性の比較は、親株の生産性を100%とする相対値により行った。この結果、親株としてOA105T株を用いた場合、abrBを恒常的に発現させ、kinA遺伝子を欠失したOA105T_abrB*ΔkinA株では、高いアルカリセルラーゼの分泌生産量が確認された(表11)。

0168

0169

<アルカリセルラーゼの活性測定>
セルラーゼ活性測定は、1/7.5Mリン酸緩衝液(pH7.4和光純薬工業社製)で適宜希釈したサンプル溶液50μLに0.4mM p−ニトロフェニル−β−D−セロトリオシド(生化学工業社製)を50μL添加して混合し、30℃にて反応させた際に遊離するp−ニトロフェノールの量を、420nmにおける吸光度OD420nm)変化により定量することにより行った。セルラーゼ活性は、1分間に1μmolのp−ニトロフェノールを遊離させる酵素量を1Uとして定義した。

0170

参考例 abrB遺伝子恒常発現の確認
abrB遺伝子恒常発現変異によりabrB遺伝子が恒常的に発現されていることを確認するために、lacZ遺伝子とその直前にプロモーター領域を導入した変異株を構築し、βガラクトシダーゼアッセイを行った。
(1−1)lacZ遺伝子が導入された枯草菌変異株(OC−014株)の構築
まず、枯草菌amyE遺伝子領域にlacZ遺伝子の導入を行った。pDL2プラスミド(Fukuchi K. et al., Microbiology,2000,146:1573-1583)を用いて枯草菌野生株168株を形質転換し、amyE遺伝子領域にlacZ遺伝子、及びクロラムフェニコール耐性遺伝子を持つ枯草菌変異株OC−014株を構築した。

0171

(1−2)野生型abrBプロモーター領域又はabrB遺伝子恒常発現変異型abrBプロモーター領域とlacZ遺伝子が導入された枯草菌変異株(OA−021株及びOA−022株)の構築

0172

枯草菌変異株OC−014株のゲノムDNAを鋳型とし、表12記載のプライマーlacZ−FF及びlacZ−FRを用いて、amyE遺伝子下流領域を含むlacZ上流領域の断片(A)をPCRにより増幅した。また、表12記載のプライマーlacZ−BF及びlacZ−BRを用いて、lacZ遺伝子のSD配列を含むlacZ遺伝子中流領域の断片(B)をPCRにより増幅した。また、枯草菌野生株168株のゲノムDNAを鋳型とし、表12記載のプライマーabrBP−lacZ−F及びabrBP−lacZ−Rを用いて、野生型abrBプロモーター領域の断片(C)をPCRにより増幅した。次いで、スペクチノマイシン耐性遺伝子保有のプラスミドpJL62(LeDeaux and Grossman,J. Bacteriol.,1995,177:166−175)を鋳型とし、表12記載のプライマーrPCR−specF及びrPCR−specRを用いて、PCR増幅を行い、スペクチノマイシン耐性遺伝子の断片(D)をPCR増幅した。

0173

次に、得られた断片(A)及び断片(D)を表12記載のプライマーlacZ−FF及びrPCR−specFを用いてOE−PCR法によって結合させ、断片(C)及び断片(B)を表12記載のプライマーabrBP−lacZ−F及びlacZ−BRを用いてOE−PCR法によって結合させた。最後に、断片(A+D)及び断片(C+B)を表12記載のプライマーlacZ−FF及びlacZ−BRを用いてOE−PCR法によって結合させ、最終PCR産物(A+D+C+B)を得た。得られた最終PCR産物を用いて枯草菌変異株OC−014株を形質転換し、クロラムフェニコール感受性且つスペクチノマイシン耐性の形質転換体を取得し、野生型abrBプロモーター領域とlacZ遺伝子が導入された枯草菌変異株OA−021株を得た。

0174

次に、枯草菌変異株168_abrB*_Cm株のゲノムDNAを鋳型とし、表12記載のプライマーabrBP−lacZ−F及びabrBP−lacZ−Rを用いて、abrB遺伝子恒常発現変異型abrBプロモーター領域の断片(E)をPCRにより増幅した。上記手法と同様にして、最終PCR産物(A+D+E+B)を得た。得られた最終PCR産物を用いて枯草菌変異株OC−014株を形質転換し、クロラムフェニコール感受性且つスペクチノマイシン耐性の形質転換体を取得し、abrB遺伝子恒常発現変異型abrBプロモーター領域とlacZ遺伝子が導入された枯草菌変異株OA−022株を得た。

0175

得られたそれぞれの枯草菌変異株のゲノムを用いたPCR及びそれに続くサンガー法によるシークエンシングによって、ゲノム上の所定の位置に目的変異が導入されていることを確認した。

0176

0177

(1−3)βガラクトシダーゼアッセイ
(1−2)にて構築した枯草菌変異株OA−021株及び枯草菌変異株OA−022をスペクチノマイシンを含むLB寒天培地上に画線塗布し、得られたコロニーをS7(50)培地(Jaacks K.,et al.,J.Bacteriol.,1989,171:4121−4129)に接種し、37℃で振盪培養した。培養後、遠心分離によって菌体を集菌し、得られた菌体を用いてβガラクトシダーの活性を測定した。

0178

その結果、野生型abrBプロモーター領域を有する枯草菌変異株OA−021株の場合、定常期に入ると転写抑制が認められるが、abrB遺伝子恒常発現変異型abrBプロモーター領域を有する枯草菌変異株OA−022株の場合には、定常期でも高い転写活性を示した(図4)。以上のことから、abrB遺伝子恒常発現変異株では、abrB遺伝子が恒常的に発現していることが示唆された。

0179

<βガラクトシダーゼの活性測定>
βガラクトシダーゼ活性測定は、集菌した菌体を1mLのZバッファー(60mMNa2HPO4、40mM NaH2PO4、10mM KCl、1mM MgSO4・7H2O及び1mM DTT)にて懸濁し、得られたサンプル溶液10μLを0.63mLのZバッファーと混合した。次いで、得られた混合溶液にZバッファーに溶解したリゾチーム・DNaseI溶液(2.5mg/mLリゾチーム及び0.05mg/mL DNaseI)0.16mLを添加し、37℃で5分間保温した。次いで、8μLの10% Trition−X100を加え攪拌し、上に静置した。調製した最終サンプル溶液を30℃で3分間保温し、Zバッファーに溶解したONPG溶液(4.0mg/mL o−Nitrophenyl−B−D−galactoside(ONPG))0.2mLを加え混合し、黄色く呈色するまで保温した。最後に0.4mLのNa2CO3溶液を加え反応を停止させ、420nmにおける吸光度(OD420nm)を測定し、以下の式(1)より算出される活性値を求めた。

0180

式(1)
Miller unit = (1000×OD420nm) / (T× V ×OD600 unit of cell)

実施例

0181

OD600 unit of cell:集菌時の濁度(OD600 nm)
T:反応時間(min)
V:活性測定に使用した培養液量(mL)

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