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技術 観測装置、観測プログラム及び観測方法

出願人 ソニー株式会社
発明者 堂脇優松居恵理子辰田寛和玉井正信中川和博
出願日 2016年11月29日 (4年7ヶ月経過) 出願番号 2016-231489
公開日 2017年3月9日 (4年4ヶ月経過) 公開番号 2017-049611
状態 特許登録済
技術分野 蛍光または発光による材料の調査,分析 光学的手段による材料の調査、分析 顕微鏡、コンデンサー
主要キーワード 観測プログラム 観測項目 所定範囲毎 照明タイミング 偏光顕微鏡像 観測対象物 観測条件 赤外分光分析装置
関連する未来課題
重要な関連分野

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図面 (14)

課題

観測対象物の検出及びその観測に適した観測装置を提供すること

解決手段

本技術に係る観測装置は、顕微鏡光学系と、顕微鏡光学系を介して画像を撮像する撮像部と、顕微鏡光学系を介して紫外可視または赤外領域における吸収スペクトルを取得する紫外・可視・赤外分光部と、顕微鏡光学系を介してラマンスペクトルを取得するラマン分光部とを具備する。

概要

背景

顕微鏡を介して観測対象物観測する際、ユーザが観測したい観測対象物は観測試料のごく一部である場合は多い。例えば、培養液に含まれる細胞を観測する場合である。このような場合、ユーザは、観測試料において観測対象物を探索する必要があり、大きな負担となる。

何らかの分析方法を用いて、観測試料における観測対象物を検出することも可能である。例えば特許文献1に開示されている赤外分光分析装置を利用すれば、測定領域の赤外分光スペクトルから、測定領域に観測対象物が含まれているか否かを判断することも可能である。

概要

観測対象物の検出及びその観測に適した観測装置を提供すること本技術に係る観測装置は、顕微鏡光学系と、顕微鏡光学系を介して画像を撮像する撮像部と、顕微鏡光学系を介して紫外可視または赤外領域における吸収スペクトルを取得する紫外・可視・赤外分光部と、顕微鏡光学系を介してラマンスペクトルを取得するラマン分光部とを具備する。

目的

以上のような事情に鑑み、本技術の目的は、観測対象物の検出及びその観測に適した観測装置を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
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牽制数
0件

この技術が所属する分野

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請求項1

顕微鏡光学系と、前記顕微鏡光学系を介して画像を撮像する撮像部と、前記顕微鏡光学系を介して紫外可視または赤外領域における吸収スペクトルを取得する紫外・可視・赤外分光部と、前記顕微鏡光学系を介してラマンスペクトルを取得するラマン分光部とを具備する観測装置

技術分野

0001

本技術は、顕微鏡光学系を介して観測対象物観測が可能な観測装置に関する。

背景技術

0002

顕微鏡を介して観測対象物を観測する際、ユーザが観測したい観測対象物は観測試料のごく一部である場合は多い。例えば、培養液に含まれる細胞を観測する場合である。このような場合、ユーザは、観測試料において観測対象物を探索する必要があり、大きな負担となる。

0003

何らかの分析方法を用いて、観測試料における観測対象物を検出することも可能である。例えば特許文献1に開示されている赤外分光分析装置を利用すれば、測定領域の赤外分光スペクトルから、測定領域に観測対象物が含まれているか否かを判断することも可能である。

先行技術

0004

特開平7−270311号公報

発明が解決しようとする課題

0005

しかしながら、観測試料を分析装置顕微鏡装置の間で移動させれば、観測試料中で観測対象物が移動してしまい、検出した観測対象物の位置が無意味となるおそれがある。また、時間の経過と共に観測対象物が移動あるいは変質する可能性もある。

0006

以上のような事情に鑑み、本技術の目的は、観測対象物の検出及びその観測に適した観測装置を提供することにある。

課題を解決するための手段

0007

以上のような事情に鑑み、本技術の一形態に係る観測装置は、顕微鏡光学系と、撮像部と、分光部と、検出部とを具備する。
上記撮像部は、上記顕微鏡光学系を介して画像を撮像する。
上記分光部は、顕微鏡光学系を介して紫外可視または赤外領域における吸収スペクトルまたはラマンスペクトルを取得する。
上記検出部は、上記吸収スペクトルまたは上記ラマンスペクトルを用いて観測試料における観測対象物を検出する。

0008

この構成によれば、分光部と撮像部が共通の顕微鏡光学系を利用しているため、分光部が吸収スペクトルまたはラマンスペクトルを取得した位置と、撮像部の視野相対的位置関係が規定されている。したがって、撮像部は、検出部が吸収スペクトルまたはラマンスペクトルによって検出した観測対象物の位置情報を利用して観測対象物を撮像することが可能となる。これにより、ユーザは自ら観測対象物を探索する必要がなく、簡単に観測対象物の顕微鏡画像を撮像することが可能となる。

0009

上記観測装置は、上記検出部によって検出された観測対象物を、上記撮像部に撮像させる制御部をさらに具備してもよい。

0010

この構成によれば、制御部が、顕微鏡光学系や照明等を制御することによって、検出部によって検出された観測対象物を撮像させるため、観測対象物の検出及び撮像を自動化することが可能となる。

0011

上記検出部は、上記撮像部によって撮像された観測試料の画像に基づいて観測対象物候補を検出し、上記吸収スペクトルまたは上記ラマンスペクトルを用いて観測対象物候補が観測対象物か否かを判別してもよい。

0012

この構成によれば、検出部は、予め観測試料の画像に基づいて、例えば輝度値等を利用することにより検出された観測対象物候補に対して、吸収スペクトルまたは上記ラマンスペクトルによる判別を実行すればよく、観測対象物を高速に検出することが可能となる。

0013

上記検出部は、所定時間毎に観測対象物を検出し、上記制御部は、上記所定時間毎に上記検出部によって検出された観測対象物を、上記撮像部に撮像させてもよい。

0014

この構成によれば、観測対象物が時間の経過と共に移動した場合であっても、検出部が観測対象物を追跡することができ、所定時間に渡る観測対象物の観測(タイムラプス観測)が可能となる。

0015

上記検出部は、上記所定時間毎に、上記撮像部によって撮像された画像もしくは上記分光部によって取得された吸収スペクトルまたはラマンスペクトルに基づいて観測対象物の状態を判別し、観測対象とするか否かを決定してもよい。

0016

この構成によれば、時間の経過に伴なって観測対象物が観測に適しない状態となった場合に、観測を終了させることが可能となる。

0017

以上のような事情に鑑み、本技術の一形態に係る観測プログラムは、検出部と、制御部とを具備する。
上記検出部は、顕微鏡光学系を介して分光部によって取得された紫外、可視または赤外領域における吸収スペクトルまたはラマンスペクトルを用いて、観測試料における観測対象物を検出する。
上記制御部は、検出部によって検出された観測対象物を、撮像部に撮像させる。

0018

以上のよな事情に鑑み、本技術の一形態に係る観測方法は、検出部が、顕微鏡光学系を介して分光部によって取得された紫外、可視または赤外領域における吸収スペクトルまたはラマンスペクトルを用いて、観測試料における観測対象物を検出する。
制御部が、上記検出部によって検出された観測対象物を、撮像部に撮像させる。

0019

以上のような事情に鑑み、本技術の別の形態に係る観測装置は、顕微鏡光学系と、撮像部と、紫外・可視・赤外分光部と、ラマン分光部とを具備する。
上記撮像部は、上記顕微鏡光学系を介して画像を撮像する。
上記紫外・可視・赤外分光部は、上記顕微鏡光学系を介して紫外、可視または赤外領域における吸収スペクトルを取得する。
上記ラマン分光部は、上記顕微鏡光学系を介してラマンスペクトルを取得する。

発明の効果

0020

以上のように、本技術によれば、観測対象物の検出及びその観測に適した観測装置を提供することが可能となる。

図面の簡単な説明

0021

本技術の実施形態に係る観測装置の構成を示す模式図である。
同観測装置の動作を示すフローチャートである。
同観測装置の紫外・可視・赤外分光部によって取得される紫外、可視または赤外領域の2次元分光画像と、その吸収スペクトルの例である。
同観測装置の紫外・可視・赤外分光部によって取得される紫外、可視または赤外領域の2次元分光画像と、その吸収スペクトルの例である。
同観測装置のラマン分光部によって取得されるラマンスペクトルの例である。
同観測装置を用いるタイムラプス観測のフローチャートである。
同観測装置を用いるタイムラプス観測における観測対象物候補の提示観測条件の設定に係るフローチャートである。
同観測装置によってユーザに提示される観測結果の例である。
同観測装置を用いるタイムラプス観測における観測位置修正に係るフローチャートである。
同観測装置を用いるタイムラプス観測における観測対象物の探索に係るフローチャートである。
同観測装置を用いるタイムラプス観測における観測結果の提示と観測条件の変更に係るフローチャートである。
同観測装置の撮像部によって撮像される、経過時間が異なる観測対象物の画像の例である。
同観測装置の紫外・可視・赤外分光部によって取得される蛍光の2次元分光画像と、その蛍光スペクトルの例である。

実施例

0022

本実施形態に係る観測装置について説明する。図1は本実施形態に係る観測装置1の構成を示す模式図である。同図に示すように、観測装置1は、ステージ2、顕微鏡光学系3、撮像部4、紫外・可視・赤外分光部5、ラマン分光部6、透過照明7、落射照明8及び制御ユニット9を有する。また、ステージ2には、観測試料を収容するためのインキュベータSが載置されている。

0023

顕微鏡光学系3はステージ2と対向して配置され、撮像部4、紫外・可視・赤外分光部5、ラマン分光部6及び落射照明8は顕微鏡光学系3に接続されている。透過照明7は、ステージ2について顕微鏡光学系3の反対側に配置されている。制御ユニット9は撮像部4、紫外・可視・赤外分光部5及びラマン分光部6に接続されると共に、必要に応じてステージ2あるいは顕微鏡光学系3等の各部に接続されている。

0024

ステージ2は、インキュベータSを支持し、インキュベータSと顕微鏡光学系3の相対距離を規定する。ステージ2は、モータ等の駆動源によって、水平方向(X−Y方向)及び鉛直方向(Z方向)に移動可能に構成されたものとすることができる。なお、ステージ2の替わりに、顕微鏡光学系3がステージ2に対して移動可能に構成されていてもよい。

0025

インキュベータSは、観測対象物(細胞等)が培養されるディッシュウェルプレートが収容され、培養環境を維持したまま、即ち細胞を生かしたまま、各種観測が可能に構成されている。インキュベータSは培地交換薬剤サイトカイン等)の添加、あるいは薬剤に対する細胞の反応を見るような場合に、蓋を開け閉めする機会が多く、培養環境の維持に影響がある場合には、観測装置1の全体を覆って培養環境を維持するようにする方が望ましい。また、培地交換や試薬の添加も自動で行えるように構成されていてもよい。

0026

顕微鏡光学系3は、観測試料を透過した、あるいは観測試料において生じた光(紫外線及び赤外線を含む)を紫外・可視・赤外分光部5、ラマン分光部6及び撮像部4に導く。顕微鏡光学系3の詳細な構成については後述するが、紫外・可視・赤外分光部5は顕微鏡光学系3を介して観測試料の吸収スペクトルを取得し、ラマン分光部6は顕微鏡光学系3を介して観測試料のラマンスペクトルを取得する。撮像部4は顕微鏡光学系3を介して観測試料の顕微鏡像を取得する。

0027

撮像部4は、観測試料の顕微鏡光学系3による顕微鏡像を撮像する。撮像部4は、CCD(Charge Coupled Device)イメージセンサやCMOS(Complementary Metal Oxide Semiconductor)イメージセンサ等の撮像素子を備え、観測試料の静止画あるいは動画を撮像可能に構成されている。撮像部4は、顕微鏡光学系3や透過照明7等の構成に応じて、観測試料の明視野像暗視野像、位相差像蛍光像偏光顕微鏡像等の全部または少なくともいずれかを撮像するものとすることができる。撮像部4は、撮像した画像を制御ユニット9あるいは図示しない他の情報処理装置等に出力する。

0028

紫外・可視・赤外分光部5は、顕微鏡光学系3を介して観測試料の紫外、可視または赤外領域における2次元分光画像を生成し、その2次元分光画像から紫外、可視または赤外領域における吸収スペクトル(紫外・可視・赤外分光スペクトル)を取得する。

0029

透過照明7から出射された紫外、可視または赤外光は、観測試料を透過し、顕微鏡光学系3によって紫外・可視・赤外分光部5に導かれ、2次元分光画像が生成される。紫外・可視・赤外分光部5は、生成した2次元分光画像のうち、観測対象物の存在しない領域のフラット透過スペクトルを抽出した後、その透過スペクトルと各画素の透過スペクトルの比の常用対数を取ることで吸収スペクトルを得ることが可能である。紫外・可視・赤外分光スペクトル(図3参照)は、観測試料を透過した紫外、可視または赤外光の波長に対する吸光度プロットであり、観測試料の特性(分子構造化学的状態)の情報を含んでいる。

0030

なお、紫外・可視・赤外分光部5は、少なくとも紫外、可視または赤外領域の少なくともいずれかにおいて吸収スペクトルが取得できるものであればよく、紫外、可視または赤外領域の全領域にておいて吸収スペクトルが取得できるものであってもよい。また、紫外・可視・赤外分光部5は、観測試料に予め蛍光標識を施しておくことにより、蛍光の紫外・可視・赤外分光スペクトルを取得するものとすることも可能である。紫外・可視・赤外分光部5は、取得した吸収スペクトルを制御ユニット9に出力する。

0031

ラマン分光部6は、顕微鏡光学系3を介して観測試料によるラマン散乱の2次元分光画像を生成し、その2次元分光画像からラマン散乱のスペクトル(ラマンスペクトル)を取得する。ラマン分光部6は、特定の波長を有する励起光レーザ光)を顕微鏡光学系3を介して観測試料に照射する。それによって観測試料から放出された光(以下、放出光とする)は顕微鏡光学系3を介してラマン分光部6に導かれ、撮像される。

0032

ラマン分光部6は、生成した2次元分光画像のうち、観測対象物の存在しない領域のフラットなスペクトルを抽出した後、そのスペクトルと各画素のスペクトルの差を取ることで観測対象物自体のラマンスペクトルを得ることも可能である。ラマンスペクトル(図5参照)は、放出光の強度を波長に対してプロットしたものである。放出光は、ラマン散乱による散乱光を含んでおり、ラマン散乱による散乱光の波長遷移ラマンシフト)は、観測試料の特性(分子構造や結晶構造)によって異なり、即ち、ラマンスペクトルは観測試料の特性の情報を含んでいる。ラマン分光部6は、取得したラマンスペクトルを制御ユニット9に出力する。

0033

透過照明7は、観測試料に対して照明光を照射する。上述のように、撮像部4は、明視野像、暗視野像、位相差像、蛍光像、偏光顕微鏡像等の全部または少なくともいずれかを撮像可能に構成されており、透過照明7はそれに応じた照明を観測試料に照射できるように構成されている。

0034

具体的には、透過照明7は、撮像部4の撮像対象が明視野像である場合には通常の白色光を、暗視野像である場合には対物レンズ開口数(NA)より大きい開口数成分の照明光を観測試料に照射する。また、撮像部4の撮像対象が位相差像である場合には、対物レンズに応じて選択されたリングアパチャーを介して観測試料に照明光を照射する。透過照明7はこのような各種撮像手法あるいは撮像倍率に応じて適宜最適な照明光を照射できるように、制御ユニット9によってその構成が自動的に切り替えられるものが好適である。

0035

落射照明8は、顕微鏡光学系3を介して観測試料に各種照明光を照射する。落射照明8は、透過照明7に対して補助的に、あるいは代替的に動作するものとすることができ、必要に応じて設けられるものとすることが可能である。

0036

制御ユニット9は、紫外・可視・赤外分光部5またはラマン分光部6の出力に基づいて、ステージ2、顕微鏡光学系3等、観測装置1の各部を制御し、撮像部4に観測試料の顕微鏡像を撮像する。制御ユニット9は、PC(Personal computer)等の情報処理装置であり、機能的構成として検出部91及び制御部92を有する。

0037

検出部91は、紫外・可視・赤外分光部5によって取得された吸収スペクトルまたはラマン分光部6によって取得されたラマンスペクトルの少なくともいずれか一方によって、観測試料における観測対象物を検出する。観測対象物は、例えば細胞や細胞塊であり、インキュベータSに収容された観測試料に含まれるものである。

0038

検出部91は、紫外・可視・赤外分光部5またはラマン分光部6によって吸収スペクトルまたはラマンスペクトルが取得された位置に、観測対象物が存在するか否かを吸収スペクトルまたはラマンスペクトルの解析によって判定するものとすることができる。即ち、検出部91は、吸収スペクトルまたはラマンスペクトルの取得位置を、2次元的あるいは3次元的に走査することによって、観測試料における観測対象物を検出することが可能である。検出部91による観測対象物の検出方法については後述する。

0039

制御部92は、検出部91によって検出された、観測試料における観測対象物を撮像部4によって撮像させる。具体的には制御部92は、観測対象物が撮像部4の撮像範囲に含まれるように、ステージ2と顕微鏡光学系3の相対位置を制御し、顕微鏡光学系3の撮像倍率や透過照明7等の照明タイミング等を制御すると共に撮像部4に撮像を指示するものとすることができる。

0040

[顕微鏡光学系の構成について]
顕微鏡光学系3の構成について説明する。図1に示すように、顕微鏡光学系3は、対物レンズ31、第1光路切替部32及び第2光路切替部33を有するものとすることができる。対物レンズ31は観測試料(即ちインキュベータS)に対向して配置され、第1光路切替部32は対物レンズ31に後続し、第2光路切替部33は第1光路切替部32に後続して配置されている。

0041

対物レンズ31は、観測試料を透過し、あるいは観測試料から放出された光を所定の拡大倍率に拡大する。対物レンズ31は、明視野像、暗視野像、位相差像、蛍光像あるいは偏光顕微鏡像等の撮像手法及び拡大倍率に応じて切替可能に構成されたものとすることができる。

0042

第1光路切替部32は、対物レンズ31から入射する光の光路を切り替える。具体的には、落射照明8から観測試料の照明が実施される場合には、第1光路切替部32はハーフミラーとすることができ、落射照明8からの照明光を対物レンズに向けて反射し、一方で対物レンズ31からの入射光を第2光路切替部33に向けて透過するものとすることができる。

0043

また、撮像部4あるいは紫外・可視・赤外分光部5によって観測試料の蛍光が観測される場合には、第1光路切替部32はダイクロイックミラーであるものとすることができる。即ち、落射照明8から観測試料に照射された励起光の波長帯域はダイクロイックミラーでカットされ、蛍光の波長帯域のみが第2光路切替部33に向けて透過される。第1光路切替部32は、必要に応じて切替が可能であるものが好適であり、あるいはこのような光路の切替が不必要な場合には設けられないものとすることも可能である。

0044

第2光路切替部33は、第1光路切替部32から入射する光の光路を切り替える。第2光路切替部33は入射光を撮像部4、紫外・可視・赤外分光部5及びラマン分光部6のそれぞれの方向に、所定の割合で振り分けるものとすることができる。また、第2光路切替部33は、撮像部4、紫外・可視・赤外分光部5及びラマン分光部6のうち観測試料の観測に用いられるいずれか一つあるいは二つの方向に所定の割合で入射光を振り分けるものとすることもできる。例えば第1光路切替部32は、紫外、可視、赤外領域の2次元分光画像(またはラマン散乱の2次元分光画像)が測定されている際には入射光の全てを紫外・可視・赤外分光部5(またはラマン分光部6)に振り分け、撮像部4による観測試料の撮像が行われる際には入射光の全てを撮像部4に振り分けるものとすることも可能である。

0045

本実施形態においては、撮像部4、紫外・可視・赤外分光部5及びラマン分光部6は、顕微鏡光学系3において共通の光路を利用するものとしたがこれに限られない。顕微鏡光学系3において撮像部4、紫外・可視・赤外分光部5及びラマン分光部6のそれぞれの光路が独立して設けられていても、それぞれの相対的位置関係が特定されていればよい。即ち、紫外・可視・赤外分光部5あるいはラマン分光部6による2次元分光画像の視野と、撮像部4の視野の位置関係が規定されていればよい。より具体的には、紫外・可視・赤外分光部5あるいはラマン分光部6によるスペクトルに基づいて検出された観測対象物の存在位置が、撮像部4の視野に対してどの位置に相当するかがわかればよい。

0046

観測装置1は以上のような構成を有するものとすることができるが、観測装置1には必要に応じて異なる構成とすることも可能である。例えば、観測試料の偏光顕微鏡像が撮像される場合には、透過照明7内に偏光子が、顕微鏡光学系3内に検光子が設けられるものとすることも可能である。

0047

[観測装置の動作]
観測装置1の動作について説明する。図2は、観測装置1の動作を示すフローチャートである。事前に、ステージ2には、観測対象物を含む観測試料が収容されたインキュベータSが載置されているものとする。

0048

まず、観測対象物候補を抽出するか否かがユーザによって指定される(St1)。ユーザは、制御ユニット9等に対する操作入力によってこの指定をすることができる。例えばユーザは、観測試料における観測対象物の存在量が少ない場合や、観測試料における観測対象物の存在位置が予めある程度特定できている場合には、観測対象候補を抽出することを選択することができる。

0049

観測対象物候補を抽出するようにユーザによって選択された場合(St1:Yes)には、観測対象物候補が抽出される(St2)。具体的には、検出部91が、撮像部4によって観測試料が低倍率で撮像された画像(以下、低倍率画像とする)に対して画像処理等を実施し、観測対象候補物を抽出するものとすることができる。検出部91は、例えば所定範囲毎の輝度値の差異に基づいて観測対象物候補を抽出するものとすることができる。また、ユーザが低倍率画像に基づいて、観測対象物候補を抽出するものとすることも可能である。検出部91またはユーザは、観測対象物候補の空間座標(X、Y、Z座標)を制御部92に登録するものとすることができる。

0050

続いて、紫外・可視・赤外分光部5またはラマン分光部6の少なくともいずれか一方によって、上記観測対象物候補に対して分光スキャンが実行される(St3)。紫外・可視・赤外分光部5によって分光スキャンが実行される場合には、制御部92による制御を受けて透過照明7から照明光が出射され、顕微鏡光学系3を介して紫外・可視・赤外分光部5に入射する。これを受けて紫外・可視・赤外分光部5おいて観測対象物候補の位置における紫外、可視または赤外領域の2次元分光画像が撮像され、吸収スペクトルが取得される。制御部92によってステージ2と顕微鏡光学系3の相対位置が調整され、観測対象物候補の周辺領域も含めてスキャンされるものとすることができる。なお、この際、顕微鏡光学計3の拡大倍率が小さい方が、広い視野を高速にスキャンすることができ、好適である。

0051

ラマン分光部6によって分光スキャンが実行される場合には、制御部92による制御を受けてラマン分光部6から励起光が出射され、顕微鏡光学系3を介して観測試料に照射される。観測試料からの放出光(ラマン散乱光を含む)は顕微鏡光学系3を介してラマン分光部6に入射する。これを受けてラマン分光部6において観測対象物候補の位置におけるラマン散乱の2次元分光画像が撮像され、ラマンスペクトルが取得される。制御部92によってステージ2と顕微鏡光学系3の相対位置が調整され、観測対象物候補の周辺領域も含めてスキャンされるものとすることができる。なお、この際、顕微鏡光学計3の拡大倍率が小さい方が、広い視野を高速にスキャンすることができ、好適である。

0052

一方、観測対象物の存在候補領域を抽出するようにユーザによって選択されなかった場合(St1:No)には、観測試料の存在する空間(試料空間)の全体に対して分光スキャンが実行される(St4)。観測対象物候補が抽出される場合(St2)と同様に、制御部92によって、ステージ2と顕微鏡光学系3の相対位置が調整され、観測対象物候補の周辺領域も含めてスキャンされるものとすることができる。

0053

続いて、検出部91は、紫外・可視・赤外分光部5によって取得された吸収スペクトルまたはラマン分光部6によって取得されたラマンスペクトルに特徴的なスペクトルがあるか否かを確認する(St5)。

0054

図3及び図4は、紫外・可視・赤外分光部5によって取得された紫外、可視または赤外領域の2次元分光画像と、その一箇所における吸収スペクトルの例である。図3における観測対象物は赤血球であり、図4における観測対象物はHepG2(ヒト肝ガン由来細胞株)である。

0055

図3に示す吸収スペクトルは、観測対象物(赤血球)が存在しない位置をリファレンスとして生成されたものである。同図に示すように、観測対象物が赤血球である場合、2次元分光画像において赤血球が存在する位置の吸収スペクトルでは波長380nm〜460nm付近のSoret帯において、ヘモグロビン由来する強い吸収が確認される。一方、2次元分光画像において赤血球が存在しない位置の吸収スペクトルでは、ヘモグロビンに由来する強い吸収は確認されない。即ち、観測対象物が赤血球である場合には、Soret帯における吸収に基づいて、赤血球を検出することが可能である。

0056

図4に示す吸収スペクトルは、観測対象物(HepG2)が存在しない位置をリファレンスとして生成されたものである。同図に示すように、観測対象物がHepG2である場合、2次元分光画像においてHepG2が存在する位置の吸収スペクトルではSoret帯において、細胞内の小胞膜等に含まれるヘムに由来する強い吸収が確認される。一方、2次元分光画像においてHepG2が存在しない位置の吸収スペクトルでは、当該成分に由来する強い吸収は確認されない。即ち、観測対象物がHepG2である場合には、波長400nm〜480nmにおける吸収に基づいて、HePG2を検出することが可能である。

0057

この他にも検出部91は、観測対象物に特有の吸収スペクトルから観測対象物を検出するものとすることが可能である。吸収スペクトルによって検出可能な観測対象物は細胞に限られず、特徴的な吸収スペクトルを有するものであればよい。

0058

図5は、ラマン分光部によって取得されたラマンスペクトルの例である。図5における観測対象物はHepG2である。

0059

図5は、ラマン分光部6によって生成されたラマン散乱の2次元分光画像においてHepG2が存在する位置のラマンスペクトルと、HepG2が存在しない位置のラマンスペクトル(background)である。同図に示すように、HepG2が存在する位置のラマンスペクトルには、HepG2存在しない位置のラマンスペクトルには存在しないピークが表れている。これらのピークはHepG2のRNA(ribo nucleic acid)またはDNA(deoxyribonucleic acid)に由来するものと考えられる。観測対象物がHepG2以外の場合にも、RNAあるいはDNAに由来するピークが存在すれば、細胞であるものと判断することが可能である。

0060

この他にも検出部91は、観測対象物に特有のラマンスペクトルから、観測対象物を検出するものとすることが可能である。ラマンスペクトルによって検出可能な観測対象物は細胞に限られず、特徴的なラマンスペクトルを有するものであればよい。

0061

検出部91は上記のように2次元分光画像の特定の位置における吸収スペクトルまたはラマンスペクトルに特徴的なスペクトルがあることを確認した場合(St5:Yes)には、当該位置の座標(X、Y、Z座標)を観測位置として登録する(St6)。また、検出部91は特徴的なスペクトルが確認された領域の大きさ、即ち観測対象物と推定される領域の大きさによって当該位置の座標を登録するか否かをさらに選別するものとすることも可能である。検出部91は、当該位置の座標を制御部92に提供するものとすることができる。

0062

また、検出部91が当該位置における吸収スペクトルまたはラマンスペクトルに特徴的なスペクトルがないことを確認した場合(St5:No)には、当該位置を観測対象から除外する(St7)。検出部91は、2次元分光画像の全領域における吸収スペクトルまたはラマンスペクトルの特徴的なスペクトルを有無を確認することにより、2次元分光画像における観測対象物を検出することが可能である。

0063

以上のようにして、検出部91は、紫外・可視・赤外分光部5によって取得された吸収スペクトルまたはラマン分光部6によって取得されたラマンスペクトルに基づいて、観測対象物を検出することが可能である。この検出結果は、制御部92に提供され、制御部92による撮像シーケンスに用いられてもよく、ユーザに提示されてもよい。

0064

制御部92は、検出部91から提供された観測対象物の位置を利用して、ステージ2と顕微鏡光学系3の相対位置を調整し、撮像部4の視野を観測対象物に合わせることができる。さらに、制御部92は、透過照明7や撮像部4を制御し、撮像部4に観測対象物を撮像させることも可能である。これにより、ユーザは自ら観測対象物を探索する必要がなく、容易に観測対象物の高倍率画像を得ることが可能となる。

0065

[タイムラプス観測]
観測装置1を用いたタイムラプス(経時的)観測について説明する。タイムラプス観測は、観測対象物を長時間に渡って撮像し、観測対象物の経時的変化を観測するものである。ここで、観測対象物が培養液中の細胞や細胞塊である場合等には、時間の経過と共に観測対象物が移動し、あるいは死滅することも考えられる。したがって、観測試料中の一箇所のみを撮像し続けた場合には、観測対象物が視野から外れ、あるいは既に死滅して観測する価値がなくなっているものもそのまま撮像されることが発生し得る。ここで、本実施形態に係る観測装置1を用いることにより、このような問題を解消することが可能となる。

0066

図6は、観測装置1を用いるタイムラプス観測のフローチャートである。同図に示すように、タイムラプス観測が開始されると、観測対象物候補が検出される(St11)。観測対象物候補は、上述の説明のように、観測試料の低倍率画像に対する画像処理によって検出することが可能である。

0067

続いて、観測対象物候補の提示と観測条件の設定が実施される(St12)。図7は、観測対象物候補の提示と観測条件の設定に係るフローチャートである。図7に示すように、観測対象物候補の観測結果がユーザに提示される(St121)。観測対象物候補は、観測試料の低倍率画像に対して画像処理によって抽出された物体であり、観測対象物であるか、観測対象物ではない物体(ゴミあるいは死滅した細胞等)であるかはこの時点では判別されていない。

0068

観測装置1は、観測対象物候補の観測結果、例えば撮像部4によって撮像された観測対象物候補の明視野像、位相差像、吸収スペクトルあるいはラマンスペクトル等をユーザに提示する。図8は、観測装置1によってユーザに提示される観測結果の例としてディスプレイに表示される表示画像を示す模式図である。図8(a)に示すように、観測対象物候補の像(明視野像等)が、観測対象物候補毎にトリミングして表示されるものとすることができる。

0069

ユーザが観測対象物候補を選択すると、図8(b)に示すように、選択された観測対象物候補のより詳細な観測結果が表示されるものとするとも可能である。ユーザは、表示された観測対象物候補の観測結果をみて、観測すべき観測対象物候補を観測対象物として選択するものとすることができる。

0070

観測対象物候補が観測対象物として選択された場合(St122:Yes)には、観測対象物として保持される(St123)。続いて、観測対象物に対し、観測条件(測定項目観測時間間隔等)が設定される(St124)。一方、観測対象物候補が観測対象物として選択されなかった場合(St122:No)には、当該観測対象物候補は観測対象から除外される(St125)。

0071

図6戻り、顕微鏡光学系3の視野が観測位置(最初の、又は次の観測位置)に移動する(St13)。続いて観測装置1は、観測位置を修正する(St14)。図9は観測位置の修正に係るフローチャートである。同図に示すように、顕微鏡光学系3の視野が次の観測位置に移動され(St141)ると、観測対象物が存在するか否かが確認される(St142)。例えば、観測対象物が細胞等の場合には、時間の経過と共に移動し、顕微鏡光学系3の視野から外れている可能性がある。

0072

顕微鏡光学系3の視野内に観測対象物が存在している場合(St142:Yes)には、そのまま観測対象物として保持される(St143)。一方、顕微鏡光学系3の視野内に観測対象物が存在していない場合(st142:No)には、観測対象物の探索(St144)が実施される。図10は、観測対象物の探索に係るフローチャートである。

0073

図10に示すように、観測位置の周囲において観測対象物が探索される(St151)。観測対象物の探索は、図2に示すフローチャートに従ってなされる。観測対象物がひとつ検出された場合(St152:Yes)には、当該観測対象物が、前回の観測位置から移動した観測対象物であるとして、当該観測対象物の観測位置が修正される(St153)。

0074

一方、観測対象物が複数検出された場合には、複数の観測対象物が一塊として認識される(St154)。これは、観測対象物が細胞である場合において、細胞分裂生じたことが想定されるためである。この場合には、この観測対象物の塊の中心に、観測対象物の観測位置が修正される(St155)。

0075

図9に戻り、上記のように観測対象物の観測位置が修正され(St145)た後、観測対象物が保持される(St143)。図6に戻り、所定の観測、例えば明視野像、位相差像、蛍光像等の撮像が実施される(St15)。続いて、観測結果の提示と観測条件の変更が実施される(St16)。図11は、観測結果の提示と観測条件の変更に係るフローチャートである。

0076

図11に示すように、観測対象物の観測結果がユーザに提示される(St161)。観測結果は、例えば図8に示したようにユーザに提示されるものとすることができる。続いて、観測条件を変更するか否かが確認される(St162)。観測条件の変更は例えば、観測対象物の細胞が死滅した場合、観測を終了するものとすることができる。また、観測対象物の細胞が未分化であった場合、分化促進のための薬剤(サイトカイン等)を添加する工程を追加し、あるいは観測時間間隔を短くし、あるいはさらなる観測項目(例えば吸収スペクトル等)を追加するものとすることも可能である。

0077

観測対象物の状態変化は、吸収スペクトルあるいはラマンスペクトルの他に、明視野像、暗視野像、位相差像等の画像解析を用いて観測対象物の大きさの変化に基づいて判断することも可能である。図12には、経過時間が異なる観測対象物(HeLa細胞)の明視野像が示されている。図12(a)と図12(b)を比較すると、下側の細胞が死滅していることが画像解析によって判別可能である。また、観測対象物の状態変化は偏光顕微鏡像によって、観測対象物の細胞の屈折率方性の変から判別することも可能である。

0078

さらに、観測対象物の細胞が特定の細胞に分化した場合には、観測を終了するものとすることができる。また、観測対象物が心筋細胞である場合には、動画、電気測定磁場変化測定、超音波観測等により心筋細胞の拍動を検出することが可能である。心筋細胞の拍動が標準的な拍動に達した場合には、薬剤を添加する工程を添加し、あるいは観測時間間隔を短くし、あるいは新たに測定項目を追加するものとすることも可能である。

0079

観測条件が変更される場合(St162:Yes)には、当該観測対象物に対する観測条件が再設定され、あるいは観測が終了する(St163)。観測条件が変更されない場合(St162:No)には、その観測条件が維持される(St164)。

0080

図6に戻り、次の観測位置について、上記の工程(St13〜St16)が繰り返し実行される。これらの工程は予め設定された所定時間毎に実施されるものとすることが可能である。以上のようにして、タイムラプス観測が実施される。上記のように、紫外、可視、赤外領域の吸収スペクトルまたはラマンスペクトルに基づいて観測対象物の情報が得られるため、観測対象物の追跡が可能となり、ユーザが容易にタイムラプス観測を実施することが可能となる。

0081

本技術は、上記各実施形態にのみ限定されるものではなく、本技術の要旨を逸脱しない範囲内において変更することが可能である。

0082

上記紫外・可視・赤外分光部5は、観測対象物に蛍光標識が施されている場合には、2次元分光画像から、蛍光スペクトルを取得するものとすることも可能である。図13は蛍光の2次元分光画像及び蛍光スペクトルの例である。図13(a)は、RC−1(ウサギ角膜上皮細胞中カルボキシSNARF−1がローディングされた観測試料の蛍光分光画像と、その蛍光スペクトルである。図13(b)は、バックグラウンドが除去された同観測試料の蛍光分光画像とその蛍光スペクトルである。これらの図に示すように、蛍光分光画像において観測対象物の有無によって蛍光スペクトルが異なるため、検出部91は紫外・可視・赤外分光部5において取得された蛍光スペクトルから観測対象物を検出することも可能である。

0083

なお、本技術は以下のような構成も採ることができる。

0084

(1)
顕微鏡光学系と、
上記顕微鏡光学系を介して画像を撮像する撮像部と、
上記顕微鏡光学系を介して紫外、可視または赤外領域における吸収スペクトルまたはラマンスペクトルを取得する分光部と、
上記吸収スペクトルまたは上記ラマンスペクトルを用いて観測試料における観測対象物を検出する検出部と
を具備する観測装置。

0085

(2)
上記(1)に記載の観測装置であって、
上記検出部によって検出された観測対象物を、上記撮像部に撮像させる制御部をさらに具備する
観測装置。

0086

(3)
上記(1)または(2)に記載の観測装置であって、
上記検出部は、上記撮像部によって撮像された観測試料の画像に基づいて観測対象物候補を検出し、上記吸収スペクトルまたは上記ラマンスペクトルを用いて観測対象物候補が観測対象物か否かを判別する
観測装置。

0087

(4)
上記(1)から(3)のうちいずれか一つに記載の観測装置であって、
上記検出部は、所定時間毎に観測対象物を検出し、
上記制御部は、上記所定時間毎に上記検出部によって検出された観測対象物を、上記撮像部に撮像させる
観測装置。

0088

(5)
上記(1)から(4)のうちいずれか一つに記載の観測装置であって、
上記検出部は、上記所定時間毎に、上記撮像部によって撮像された画像もしくは上記分光部によって取得された吸収スペクトルまたはラマンスペクトルに基づいて観測対象物の状態を判別し、観測対象とするか否かを決定する
観測装置。

0089

(6)
顕微鏡光学系を介して分光部によって取得された紫外、可視または赤外領域における吸収スペクトルまたはラマンスペクトルを用いて、観測試料における観測対象物を検出する検出部と、
上記検出部によって検出された観測対象物を、撮像部に撮像させる制御部と
としてコンピュータを機能させる観測プログラム。

0090

(7)
検出部が、顕微鏡光学系を介して分光部によって取得された紫外、可視または赤外領域における吸収スペクトルまたはラマンスペクトルを用いて、観測試料における観測対象物を検出し、
制御部が、上記検出部によって検出された観測対象物を、撮像部に撮像させる
観測方法。

0091

(8)
顕微鏡光学系と、
上記顕微鏡光学系を介して画像を撮像する撮像部と、
上記顕微鏡光学系を介して紫外、可視または赤外領域における吸収スペクトルを取得する紫外・可視・赤外分光部と、
上記顕微鏡光学系を介してラマンスペクトルを取得するラマン分光部と
を具備する観測装置。

0092

1…観測装置
3…顕微鏡光学系
4…撮像部
5…紫外・可視・赤外分光部
6…ラマン分光部
91…検出部
92…制御部

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