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技術 付加環化を用いたモノマーおよびオリゴヌクレオチドの化学修飾

出願人 アルニラムファーマスーティカルズインコーポレイテッド
発明者 ムシアーマノハランカラントタットヒルジーラジーフ山田剛史デイヴィッドバトラーケイナラヤナンナエージャヤプラカシュムスサミージャイラマン松田成夫ラジェンドラケイパンディーチャンゲンペン
出願日 2016年11月29日 (3年5ヶ月経過) 出願番号 2016-231739
公開日 2017年3月9日 (3年2ヶ月経過) 公開番号 2017-048242
状態 特許登録済
技術分野 化合物または医薬の治療活性 他の有機化合物及び無機化合物含有医薬 糖類化合物 蛋白脂質酵素含有:その他の医薬 プリン,テリジン系化合物 医薬品製剤 突然変異または遺伝子工学
主要キーワード 介在位置 カプセル封じ材料 赤外プローブ 実測量 多孔性隔膜 連結子 切断製品 リン酸塩ベース
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課題

リガンドオリゴヌクレオチドとを共役させるための化合物およびプロセスを提供する。

解決手段

本発明は、「クリックケミストリーをとおして、様々なリガンドとオリゴヌクレオチド、例えばiRNA剤とを共役するために、リボース置換として使用できる、またはユニバーサル塩基として使用できる化合物に関する。本発明は、式(I)または(II)に示す構造を有する化合物を特徴とする。

概要

背景

オリゴヌクレオチド化合物は、医学分野において重要な治療用途を有する。オリゴヌクレオチドは、特定の疾病関与する遺伝子をサイレンシングさせるために使用することができる。遺伝子サイレンシングは、翻訳を抑制することによってタンパク質の形成を防止する。重要なことに、遺伝子サイレンシング剤は、疾病に結び付けられるタンパク質の機能を抑制する、従来の小さな有機化合物代わる有望なものである。siRNA、アンチセンスRNA、およびマイクロRNAは、遺伝子サイレンシングによってタンパク質の形成を防止するオリゴヌクレオチドである。

RNA干渉または「RNAi」は、二本鎖RNAdsRNA)が遺伝子発現遮断することができるという知見を説明するために、Fireおよび共同研究者によって最初に作り出された用語である(非特許文献1および2)。短鎖dsRNAは、脊椎動物を含む多くの生物における、遺伝子特異的な転写後サイレンシングを誘導し、遺伝子機能調査するための新しい手段を提供している。RNAiは、サイレンシングトリガーと類似しているメッセンジャーRNA破壊するRNA誘導サイレンシング複合体RISC)、配列特異的な、多成分性ヌクレアーゼによって媒介される。RISCは、二本鎖RNAトリガーに由来する短鎖RNA(約22個のヌクレオチド)を含有することで知られているが、この活性タンパク質成分は、依然として不明である。

siRNA化合物は様々な診断および治療目的に対する有望な薬剤である。siRNA化合物を遺伝子の機能を同定するために使用することができる。さらに、siRNA化合物は、病原遺伝子をサイレンシングすることによって作用する医薬品の新タイプとして膨大な可能性を提供する。研究は、中枢神経系疾病、炎症性疾患代謝疾患腫瘍学感染症、および眼疾患を含む多くの疾病の治療のための干渉RNA治療薬を開発するために現在進行中である。

多くの疾病(例えば、癌、造血障害内分泌疾患、および免疫異常)は、特定の遺伝子もしくは遺伝子群の異常もしくは別の不要発現または活性から起こる。例えば、疾病は不正に制御した遺伝子発現、タンパク質の突然変異体の形の発現、またはウイルス性細菌性、もしくは他の病原体由来の遺伝子の発現を介して生じることができる。RNAi経路は、かかる遺伝子の不要発現を抑制するまたは低下するために使用することができる(非特許文献3および4)。

さらなる態様において、本発明は対象における疾病または疾患を治療するための方法に関する。その方法は、疾病を発症しているまたは発症する危険性のある対象を同定すること、修飾したヌクレオチドまたは上記の結合のうちの1つ以上および薬学的に許容される担体を有する免疫的選択iRNA剤を含有する医薬組成物投与すること、を含む。対象は、上記のようにサイトカインまたは細胞表面受容体(例えば、Toll様受容体)等の成長因子の発現の増加に対して監視することによる等、免疫システム、例えば免疫賦活性または免疫制御反応に対する影響に対して、監視することができる。対象のサイトカインは、対象のT細胞B細胞単球マクロファージ樹状細胞、または天然キラー細胞から発現されたものであり得る。アッセイは、対象からの血液または血清試料を使用して実施することができる。疾病または疾患は、例えば臓器組織、または骨髄移植を受けた患者において、免疫システムを刺激することが特に望ましくないものであり得る。別の代替案としては、疾病または疾患は、例えば癌またはウイルス性の疾病を患う患者において、免疫システムを刺激することが特に望ましいものであり得る。一実施形態において、対象は易感染性であり、ヌクレオチド修飾を含むiRNA剤は、ヌクレオチド修飾を含まないiRNA剤よりも大きい範囲で、細胞において免疫応答を刺激する。対象はヒト等の哺乳動物であり得る。

好ましい実施形態では、免疫的選択iRNA剤の投与は、対象に存在する疾病または疾患の治療のためである。別の好ましい実施形態では、iRNA剤の投与は予防的治療のためである。

したがって、抗ウイルス性反応、特にI型のIFN反応を刺激することが可能であるポリヌクレオチド/オリゴヌクレオチドを提供することが、本発明の目的である。ウイルス感染等の疾病および疾患の防止および治療のために、患者において抗ウイルス性反応、特にI型のIFN産生を含むことが可能である医薬組成物を提供することが、本発明の別の目的である。腫瘍を治療するために医薬組成物を提供することが、本発明の目的でもある。

疾病および/または疾患は、感染、腫瘍、アレルギー多発性硬化症、および免疫異常を含むがこれらに限定されない。

感染は、ウイルス感染、細菌感染炭疽寄生虫感染真菌症、およびプリオン感染を含むがこれらに限定されない。

ウイルス感染は、C型肝炎B型肝炎単純ヘルペスウイルス(HSV)、HIVAIDS、ポリオウイルス脳心筋炎ウイルスEMCV)、および天然痘ウイルスによる感染を含むがこれらに限定されない。抑制するために標的にすることができる(+)鎖RNAウイルスの例は、ピコルナウイルスカリシウイルスノダウイルスコロナウイルスアルテリウイルスフラビウイルス、およびトガウイルスを含むがこれらに限定されない。ピコルナウイルスの例は、エンテロウイルス(ポリオウイルス1)、ライノウイルスヒトライノウイルス1A)、ヘパトウイルス(A型肝炎ウイルス)、カルジオウイルス(脳心筋炎ウイルス)、アフトウイルス(口蹄疫疾病ウイルスO)、およびパレコウイルス(ヒトエコーウイルス22)を含む。カリシウイルスの例は、ベジクロウイルス(ブタ水疱疹ウイルスウイルス)、ラゴウイルス(ウサギ出血病ウイルス)、「ノーウォーク様ウイルス」(ノーウォークウイルス)、「サッポロ様ウイルス」(サッポロウイルス)、および「E型肝炎様ウイルス」(E型肝炎ウイルス)を含む。ベータノダウイルスシマアジ神経壊死症ウイルス)は、代表的なノダウイルスである。コロナウイルスは、コロナウイルス(トリ伝染性気管支炎ウイルス)およびトロウイルス(ベルンウイルス)を含む。アルテリウイルス(ウマ動脈炎ウイルス)は、代表的なアルテリウイルスである。トガウイルスは、アルファウイルスシンドビスウイルス)およびルビウイルス(風疹ウイルス)を含む。最後に、フラビウイルスは、フラビウイルス(黄熱病ウイルス)、ペスチウイルスウシウイルス性下痢症ウイルス)、およびヘパシウイルスC型肝炎ウイルス)を含む。

ある実施形態では、ウイルス感染は、慢性B型肝炎、慢性C型肝炎、HIV感染RSV感染、HSV感染、VSV感染、CMV感染、およびインフルエンザ感染から選択される。

一実施形態において、防止されるおよび/または治療される感染は、ウイルスおよび/または細菌によって起きる上気道感染である。別の実施形態では、防止されるおよび/または治療される感染は鳥類インフルエンザである。

細菌感染は、連鎖球菌ブドウ球菌大腸菌シュードモナスを含むがこれらに限定されない。

一実施形態において、細菌感染は細胞内細菌感染である。細胞内細菌感染は、マイコバクテリア結核)、クラミジアマイコプラズマリステリア、および黄色ブドウ球菌等の通性細胞内細菌等の、細胞内細菌による感染を指す。

寄生虫感染は、蠕虫感染、特に腸管虫感染を含むがこれに限定されない。

腫瘍は良性および悪性腫瘍(すなわち癌)の両方を含む。

癌は、胆道癌、脳癌、乳癌子宮頸癌絨毛癌結腸癌子宮内膜癌食道癌胃癌上皮内新生物白血病リンパ腫肝癌肺癌メラノーマ骨髄腫神経芽細胞腫口腔癌卵巣癌膵癌前立腺癌直腸癌肉腫皮膚癌精巣癌、甲状腺癌、および腎癌を含むがこれらに限定されない。

ある実施形態では、癌は、ヘアリー細胞白血病慢性骨髄性白血病、皮膚T細胞白血病、慢性骨髄性白血病、非ホジキンリンパ腫多発性骨髄腫濾胞性リンパ腫悪性メラノーマ扁平上皮癌腫、腎細胞癌腫、前立腺癌腫、膀胱細胞癌腫、乳癌腫、卵巣癌腫、非小細胞肺癌小細胞肺癌肝細胞癌腫基底細胞癌、結腸癌腫、子宮頸部異形成、およびカポジ肉腫(AIDS関連および非AIDS関連)から選択される。

アレルギーは、呼吸アレルギー、接触アレルギー、および食物アレルギーを含むがこれらに限定されない。

免疫異常は、自己免疫疾病免疫不全、および免疫抑制を含むがこれらに限定されない。

自己免疫疾病は、糖尿病関節炎関節リウマチ若年性関節リウマチ変形性関節症乾癬性関節炎を含む)、多発性硬化症、脳脊髄炎重症筋無力症全身性エリテマトーデス自己免疫性甲状腺炎皮膚炎アトピー性皮膚炎および湿疹性皮膚炎を含む)、乾癬シェーグレン症候群クローン病アフタ性潰瘍虹彩炎結膜炎角結膜炎潰瘍性大腸炎喘息アレルギー性喘息皮膚エリテマトーデス強皮症腟炎直腸炎薬疹ハンセン病逆転反応、らい性結節性紅斑、自己免疫性ブドウ膜炎アレルギー性脳脊髄炎急性壊死性出血性脳症特発性両側進行性感音難聴再生不良性貧血赤芽球癆、特発性血小板減少症多発性軟骨炎ウェゲナー肉芽腫症慢性活動性肝炎スティーブンスジョンソン症候突発性スプルー扁平苔癬グレーブス病サルコイドーシス原発性胆汁性肝硬、後部ブドウ膜炎、および間質性肺線維症を含むがこれらに限定されない。免疫不全は、自発性免疫不全、後天性免疫不全(AIDSを含む)、薬剤性免疫不全(移植に使用される免疫抑制剤および癌を治療するために使用される化学療法薬によって誘発されるもの等)、慢性血液透析によって引き起こされる免疫抑制、外傷、または外科手技を含むがこれらに限定されない。

免疫抑制は、細胞毒性化学療法による骨髄抑制を含むがこれに限定されない。

siRNAは近年出版された発表された多数の例で、抗ウイルス性治療の可能性として非常に効果的であることが示された。ウイルス性ゲノムにおける標的に対して作られるsiRNA分子は、インフルエンザ(非特許文献5〜7)、呼吸器多核体ウイルス(RSV)(非特許文献8)、B型肝炎ウイルスHBV)(非特許文献9)、C型肝炎ウイルス(非特許文献10および11)、およびSARSコロナウイルス(非特許文献12)の動物モデルにおいてオーダー分だけによってウイルス性力価を劇的に削減する。

これらのおよび他の核酸ベースセラピーを使用するための機会は、非常に期待でき、現在の、従来の医療では扱われることができない医学的問題に対する解決法を提供する。疾病関連の遺伝子の数の増加の位置および配列は、同定され、様々な疾病に対する核酸ベースの治療の臨床試験は、現在進行中である。

概要

リガンドとオリゴヌクレオチドとを共役させるための化合物およびプロセスを提供する。本発明は、「クリックケミストリーをとおして、様々なリガンドとオリゴヌクレオチド、例えばiRNA剤とを共役するために、リボース置換として使用できる、またはユニバーサル塩基として使用できる化合物に関する。本発明は、式(I)または(II)に示す構造を有する化合物を特徴とする。なし

目的

さらに、siRNA化合物は、病原遺伝子をサイレンシングすることによって作用する医薬品の新タイプとして膨大な可能性を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
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請求項1

式(I)の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグ:式中、Xは、O、S、NRNまたはCRP2であり、Bは、水素置換または未置換の天然もしくは非天然核酸塩基、置換または未置換のトリアゾール、あるいは置換または未置換のテトラゾール、NH−C(O)−O−C(CH2B1)3、NH−C(O)−NH−C(CH2B1)3であり、B1は、独立してハロゲンメシル酸塩、N3、CN、置換または未置換のトリアゾールもしくは置換または未置換のテトラゾールであり、前記核酸塩基は、−J−リンカー−N3、−J−リンカー−CN、−J−リンカー−C≡R8、−J−リンカー−シクロアルキン、−J−リンカー−RL、−リンカー−Q−RL、または−J−リンカー−Q−リンカー−RLによってさらに置換され、R1、R2、R3、R4、およびR5は、それぞれ独立してH、OR6、F、N(RN)2、N3、CN、−J−リンカー−N3、−J−リンカー−CN、−J−リンカー−C≡R8、−J−リンカー−シクロアルキン、−J−リンカー−RL、−リンカー−Q−RL、もしくは−J−リンカー−Q−リンカー−RLであり、Jは存在しないか、O、S、NRN、OC(O)NH、NHC(O)O、C(O)NH、NHC(O)、NHSO、NHSO2、NHSO2NH、OC(O)、C(O)O、OC(O)O、NHC(O)NH、NHC(S)NH、OC(S)NH、OP(N(RP)2)O、またはOP(N(RP)2)であり、R6は、水素、ヒドロキシル保護基、置換または未置換のアルキル、置換または未置換のアリール、置換または未置換のシクロアルキル、置換または未置換のアラルキル、置換または未置換のアルケニル、置換または未置換のヘテロアリールポリエチレングリコール(PEG)、リン酸塩二リン酸塩三リン酸塩ホスホン酸塩ホスホノチオエート、ホスホノジチオエート、ホスホロチオエートホスホチオレート、ホスホロジチオエート、ホスホロチオロチオネート、リン酸ジエステルリン酸トリエステル活性化されたリン酸基、活性化された亜リン酸基ホスホラミダイト固形支持体、−P(Z1)(Z2)−O−ヌクレオシド、−P(Z1)(Z2)−O−オリゴヌクレオチド、−P(Z1)(Z2)−式(I)、−P(Z1)(O−リンカー−Q−リンカー−RL)−O−ヌクレオシド、P(Z1)(O−リンカー−RL)−O−ヌクレオシド、−P(Z1)(O−リンカー−N3)−O−ヌクレオシド、P(Z1)(O−リンカー−CN)−O−ヌクレオシド、P(Z1)(O−リンカー−C≡R8)−O−ヌクレオシド、P(Z1)(O−リンカー−シクロアルキン)−O−ヌクレオシド、−P(Z1)(O−リンカー−Q−リンカー−RL)−O−オリゴヌクレオチド、P(Z1)(O−リンカー−RL)−O−オリゴヌクレオチド、P(Z1)(O−リンカー−N3)−O−オリゴヌクレオチド、−P(Z1)(O−リンカー−CN)−O−オリゴヌクレオチド、P(Z1)(O−リンカー−C≡R8)−O−オリゴヌクレオチド、P(Z1)(O−リンカー−シクロアルキン)−O−オリゴヌクレオチド、−P(Z1)(−リンカー−Q−リンカー−RL)−O−ヌクレオシド、−P(Z1)(−リンカー−Q−RL)−O−ヌクレオシド、−P(Z1)(−リンカー−N3)−O−ヌクレオシド、P(Z1)(−リンカー−CN)−O−ヌクレオシド、P(Z1)(−リンカー−C≡R8)−O−ヌクレオシド、P(Z1)(−リンカー−シクロアルキン)−O−ヌクレオシド、−P(Z1)(−リンカー−Q−リンカー−RL)−O−オリゴヌクレオチド、−P(Z1)(−リンカー−RL)−O−オリゴヌクレオチド、P(Z1)(−リンカー−N3)−O−オリゴヌクレオチド、−P(Z1)(−リンカー−CN)−O−オリゴヌクレオチド、P(Z1)(−リンカー−C≡R8)−O−オリゴヌクレオチド、またはP(Z1)(−リンカー−シクロアルキン)−O−オリゴヌクレオチドであり、RNは、H、置換または未置換のアルキル、置換または未置換のアルケニル、置換または未置換のアルキニル、置換または未置換のアリール、置換または未置換のシクロアルキル、置換または未置換のアラルキル、置換または未置換のヘテロアリール、またはアミノ保護基であり、RPは、独立してH、置換または未置換のアルキル、置換または未置換のアルケニル、置換または未置換のアルキニル、置換または未置換のアリール、置換または未置換のシクロアルキル、あるいは置換または未置換のヘテロアリールであり、Qは、であり、RLは、水素またはリガンドであり、R8は、NまたはCR9であり、R9は、H、置換または未置換のアルキル、またはシリルであり、Z1およびZ2は、それぞれ独立してO、S、あるいは置換または未置換のアルキルであるが、但し、Q、−N3、−CN、−C≡R8、置換または未置換のトリアゾール、あるいは置換または未置換のテトラゾールが、前記化合物中に少なくとも1つ存在する。

請求項2

式(II)の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグ:式中、AおよびBはそれぞれ独立して水素、保護基、置換または未置換の脂肪族、置換または未置換のアリール、置換または未置換のヘテロアリール、ポリエチレングリコール(PEG)、リン酸塩、二リン酸塩、三リン酸塩、ホスホン酸塩、ホスホノチオエート、ホスホノジチオエート、ホスホロチオエート、ホスホロチオレート、ホスホロジチオエート、ホスホロチオロチオネート、リン酸ジエステル、リン酸トリエステル、活性化されたリン酸基、活性化された亜リン酸基、ホスホラミダイト、固形支持体、−P(Z1)(Z2)−O−ヌクレオシド、または−P(Z1)(Z2)−O−オリゴヌクレオチドであり、Z1およびZ2はそれぞれ存在ごとに独立してO、S、あるいは置換または未置換のアルキルであり、J1およびJ2は、それぞれ独立してO、S、NRN、置換または未置換のアルキル、OC(O)NH、NHC(O)O、C(O)NH、NHC(O)、OC(O)、C(O)O、OC(O)O、NHC(O)NH、NHC(S)NH、OC(S)NH、OP(N(RP)2)O、またはOP(N(RP)2)であり、は、環式基または非環式基であり、RNは、H、置換または未置換のアルキル、置換または未置換のアルケニル、置換または未置換のアルキニル、置換または未置換のアリール、置換または未置換のシクロアルキル、置換または未置換のアラルキル、置換または未置換のヘテロアリール、またはアミノ保護基であり、RPは、独立してH、置換または未置換のアルキル、置換または未置換のアルケニル、置換または未置換のアルキニル、置換または未置換のアリール、置換または未置換のシクロアルキル、あるいは置換または未置換のヘテロアリールであり、Qは、であり、L10およびL11は、独立して存在しないかまたはリンカーである。

請求項3

式(III)で表され、式中、R1、R2、R3、R4、R5、およびBは、請求項1ですでに定義された通りである、請求項1記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグ。

請求項4

式(IV)で表され、式中、R10およびR20は、それぞれ独立して水素、置換または未置換の脂肪族、置換または未置換のアリール、あるいは置換または未置換のヘテロアリールであり、R1、R2、R3、R4、R5、およびXは、請求項1ですでに定義された通りである、請求項1記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグ。

請求項5

式(V)で表され、式中、B1は、ハロゲン、N3、CN、置換または未置換のトリアゾール、あるいは置換または未置換のテトラゾールであり、R1、R2、R3、R4、およびR5は請求項1で定義された通りである、請求項1記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグ。

請求項6

式(VI)の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグ:式中、Eは存在しないか、C(O)、C(O)O、C(O)NH、C(S)、C(S)NH、SO、SO2、またはSO2NHであり、R11、R12、R13、R14、R15、R16、R17、およびR18は、それぞれ独立してH、CH2ORa、またはORbであり、RaおよびRbは、それぞれ独立して水素、ヒドロキシル保護基、置換または未置換のアルキル、置換または未置換のアリール、置換または未置換のシクロアルキル、置換または未置換のアラルキル、置換または未置換のアルケニル、置換または未置換のヘテロアリール、ポリエチレングリコール(PEG)、リン酸塩、二リン酸塩、三リン酸塩、ホスホン酸塩、ホスホノチオエート、ホスホノジチオエート、ホスホロチオエート、ホスホロチオレート、ホスホロジチオエート、ホスホロチオロチオネート、リン酸ジエステル、リン酸トリエステル、活性化されたリン酸基、活性化された亜リン酸基、ホスホラミダイト、固形支持体、−P(Z1)(Z2)−O−ヌクレオシド、−P(Z1)(Z2)−O−オリゴヌクレオチド、−P(Z1)(Z2)−式(I)、−P(Z1)(O−リンカー−Q−リンカー−RL)−O−ヌクレオシド、−P(Z1)(O−リンカー−N3)−O−ヌクレオシド、P(Z1)(O−リンカー−CN)−O−ヌクレオシド、P(Z1)(O−リンカー−C≡R8)−O−ヌクレオシド、P(Z1)(O−リンカー−シクロアルキン)−O−ヌクレオシド、−P(Z1)(O−リンカー−RL)−O−オリゴヌクレオチド、−P(Z1)(O−リンカー−Q−リンカー−RL)−O−オリゴヌクレオチド、−P(Z1)(O−リンカー−RL)−O−オリゴヌクレオチド、P(Z1)(O−リンカー−N3)−O−オリゴヌクレオチド、−P(Z1)(O−リンカー−CN)−O−オリゴヌクレオチド、P(Z1)(O−リンカー−C≡R8)−O−オリゴヌクレオチド、P(Z1)(O−リンカー−シクロアルキン)−O−オリゴヌクレオチド、−P(Z1)(−リンカー−Q−リンカー−RL)−O−ヌクレオシド、P(Z1)(−リンカー−RL)−O−ヌクレオシド、−P(Z1)(−リンカー−N3)−O−ヌクレオシド、P(Z1)(−リンカー−CN)−O−ヌクレオシド、P(Z1)(−リンカー−C≡R8)−O−ヌクレオシド、P(Z1)(−リンカー−シクロアルキン)−O−ヌクレオシド、−P(Z1)(−リンカー−Q−リンカー−RL)−O−オリゴヌクレオチド、(Z1)(−リンカー−RL)−O−オリゴヌクレオチド、P(Z1)(−リンカー−N3)−O−オリゴヌクレオチド、−P(Z1)(−リンカー−CN)−O−オリゴヌクレオチド、P(Z1)(−リンカー−C≡R8)−O−オリゴヌクレオチド、またはP(Z1)(−リンカー−シクロアルキン)−O−オリゴヌクレオチドであり、R30は、−リンカー−Q−リンカー−RL、−リンカー−RL、またはR31であり、Qは、であり、RLは、リガンド、−N3、−CN、または−C≡R8であり、R8は、NまたはCR9であり、R9は、H、置換または未置換のアルキル、またはシリルであり、R31は、−C(O)CH(N(R32)2)(CH2)hN(R32)2であり、R32は、独立してH、−リンカー−Q−リンカー−RL、−リンカー−RL、またはR31であり、hは、1〜20の整数であり、Z1およびZ2は、それぞれ独立してO、S、あるいは置換または未置換のアルキルであるが、但し、Q、−N3、−CN、または−C≡R8が、前記化合物中に少なくとも1つ存在する。

請求項7

式(VII)の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグ:式中、Wは存在しないか、O、S、またはN(RN)であり、RNは、H、置換または未置換のアルキル、置換または未置換のアルケニル、置換または未置換のアルキニル、置換または未置換のアリール、置換または未置換のシクロアルキル、置換または未置換のアラルキル、置換または未置換のヘテロアリール、またはアミノ保護基であり、Eは存在しないか、C(O)、C(O)O、C(O)NH、C(S)、C(S)NH、SO、SO2、またはSO2NHであり、RaおよびRbは、それぞれ独立して水素、ヒドロキシル保護基、置換または未置換のアルキル、置換または未置換のアリール、置換または未置換のシクロアルキル、置換または未置換のアラルキル、置換または未置換のアルケニル、置換または未置換のヘテロアリール、ポリエチレングリコール(PEG)、リン酸塩、二リン酸塩、三リン酸塩、ホスホン酸塩、ホスホノチオエート、ホスホノジチオエート、ホスホロチオエート、ホスホロチオレート、ホスホロジチオエート、ホスホロチオロチオネート、リン酸ジエステル、リン酸トリエステル、活性化されたリン酸基、活性化された亜リン酸基、ホスホラミダイト、固形支持体、−P(Z1)(Z2)−O−ヌクレオシド、−P(Z1)(Z2)−O−オリゴヌクレオチド、−P(Z1)(Z2)−式(I)、−P(Z1)(O−リンカー−Q−リンカー−RL)−O−ヌクレオシド、−P(Z1)(O−リンカー−N3)−O−ヌクレオシド、P(Z1)(O−リンカー−CN)−O−ヌクレオシド、P(Z1)(O−リンカー−C≡R8)−O−ヌクレオシド、P(Z1)(O−リンカー−シクロアルキン)−O−ヌクレオシド、−P(Z1)(O−リンカー−RL)−O−オリゴヌクレオチド、−P(Z1)(O−リンカー−Q−リンカー−RL)−O−オリゴヌクレオチド、−P(Z1)(O−リンカー−RL)−O−オリゴヌクレオチド、P(Z1)(O−リンカー−N3)−O−オリゴヌクレオチド、−P(Z1)(O−リンカー−CN)−O−オリゴヌクレオチド、P(Z1)(O−リンカー−C≡R8)−O−オリゴヌクレオチド、P(Z1)(O−リンカー−シクロアルキン)−O−オリゴヌクレオチド、−P(Z1)(−リンカー−Q−リンカー−RL)−O−ヌクレオシド、P(Z1)(−リンカー−RL)−O−ヌクレオシド、−P(Z1)(−リンカー−N3)−O−ヌクレオシド、P(Z1)(−リンカー−CN)−O−ヌクレオシド、P(Z1)(−リンカー−C≡R8)−O−ヌクレオシド、P(Z1)(−リンカー−シクロアルキン)−O−ヌクレオシド、−P(Z1)(−リンカー−Q−リンカー−RL)−O−オリゴヌクレオチド、(Z1)(−リンカー−RL)−O−オリゴヌクレオチド、P(Z1)(−リンカー−N3)−O−オリゴヌクレオチド、−P(Z1)(−リンカー−CN)−O−オリゴヌクレオチド、P(Z1)(−リンカー−C≡R8)−O−オリゴヌクレオチド、またはP(Z1)(−リンカー−シクロアルキン)−O−オリゴヌクレオチドであり、R30は、−リンカー−Q−リンカー−RL、−リンカー−RL、またはR31であり、Qは、であり、RLはリガンドであり、R8はNまたはCR9であり、R9は、H、置換または未置換のアルキル、またはシリルであり、R31は−C(O)CH(N(R32)2)(CH2)hN(R32)2であり、R32は、独立してH、−リンカー−Q−リンカー−RL、またはR31であり、hは、1〜20の整数であり、Z1およびZ2は、それぞれ独立してO、S、または置換または未置換のアルキルであり、r、s、およびtは、それぞれ独立して0、1、2、または3であるが、但し、Q、−N3、−CN、または−C≡R8は、前記化合物中に少なくとも1つ存在する。

請求項8

式(VIII)の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグ:式中、Eは存在しないか、C(O)、C(O)O、C(O)NH、C(S)、C(S)NH、SO、SO2、またはSO2NHであり、RaおよびRbは、それぞれ独立して水素、ヒドロキシル保護基、置換または未置換のアルキル、置換または未置換のアリール、置換または未置換のシクロアルキル、置換または未置換のアラルキル、置換または未置換のアルケニル、置換または未置換のヘテロアリール、ポリエチレングリコール(PEG)、リン酸塩、二リン酸塩、三リン酸塩、ホスホン酸塩、ホスホノチオエート、ホスホノジチオエート、ホスホロチオエート、ホスホロチオレート、ホスホロジチオエート、ホスホロチオロチオネート、リン酸ジエステル、リン酸トリエステル、活性化されたリン酸基、活性化された亜リン酸基、ホスホラミダイト、固形支持体、−P(Z1)(Z2)−O−ヌクレオシド、−P(Z1)(Z2)−O−オリゴヌクレオチド、−P(Z1)(Z2)−式(I)、−P(Z1)(O−リンカー−Q−リンカー−RL)−O−ヌクレオシド、−P(Z1)(O−リンカー−N3)−O−ヌクレオシド、P(Z1)(O−リンカー−CN)−O−ヌクレオシド、P(Z1)(O−リンカー−C≡R8)−O−ヌクレオシド、P(Z1)(O−リンカー−シクロアルキン)−O−ヌクレオシド、−P(Z1)(O−リンカー−RL)−O−オリゴヌクレオチド、−P(Z1)(O−リンカー−Q−リンカー−RL)−O−オリゴヌクレオチド、−P(Z1)(O−リンカー−RL)−O−オリゴヌクレオチド、P(Z1)(O−リンカー−N3)−O−オリゴヌクレオチド、−P(Z1)(O−リンカー−CN)−O−オリゴヌクレオチド、P(Z1)(O−リンカー−C≡R8)−O−オリゴヌクレオチド、P(Z1)(O−リンカー−シクロアルキン)−O−オリゴヌクレオチド、−P(Z1)(−リンカー−Q−リンカー−RL)−O−ヌクレオシド、P(Z1)(−リンカー−RL)−O−ヌクレオシド、−P(Z1)(−リンカー−N3)−O−ヌクレオシド、P(Z1)(−リンカー−CN)−O−ヌクレオシド、P(Z1)(−リンカー−C≡R8)−O−ヌクレオシド、P(Z1)(−リンカー−シクロアルキン)−O−ヌクレオシド、−P(Z1)(−リンカー−Q−リンカー−RL)−O−オリゴヌクレオチド、(Z1)(−リンカー−RL)−O−オリゴヌクレオチド、P(Z1)(−リンカー−N3)−O−オリゴヌクレオチド、−P(Z1)(−リンカー−CN)−O−オリゴヌクレオチド、P(Z1)(−リンカー−C≡R8)−O−オリゴヌクレオチド、またはP(Z1)(−リンカー−シクロアルキン)−O−オリゴヌクレオチドであり、R30は、−リンカー−Q−リンカー−RL、−リンカー−RL、またはR31であり、Qは、であり、RLはリガンドであり、R8はNまたはCR9であり、R9は、H、置換または未置換のアルキル、またはシリルであり、R31は、−C(O)CH(N(R32)2)(CH2)hN(R32)2であり、R32は、H、−リンカー−Q−リンカー−RL、またはR31であり、hは、1〜20の整数であり、Z1およびZ2は、それぞれ独立してO、S、あるいは置換または未置換のアルキルであり、rおよびsは、それぞれ独立して0、1、2、または3であるが、但し、Q、−N3、−CN、または−C≡R8は、前記化合物中に少なくとも1つ存在する。

請求項9

請求項10

前記リンカーが、構造−[P−Q1−R]q−T−で表され、式中、P、R、およびTは、それぞれ独立して存在しないか、CO、NH、O、S、OC(O)、NHC(O)、CH2、CH2NH、CH2O、NHCH(Ra)C(O)、−C(O)−CH(Ra)−NH−、−C(O)−(置換または未置換のアルキル)−NH−、CH=N−O、であり、Q1は存在しないか、−(CH2)n−、−C(R100)(R200)(CH2)n−、−(CH2)nC(R100)(R200)−、−(CH2CH2O)mCH2CH2−、または−(CH2CH2O)mCH2CH2NH−であり、Raは、Hまたはアミノ酸側鎖であり、R100およびR200は、それぞれ独立してH、CH3、OH、SH、またはN(RX)2であり、RXは、独立してH、メチルエチルプロピルイソプロピルブチル、またはベンジルであり、qは0〜20の整数であり、nは1〜20の整数であり、mは0〜50の整数であるが、但し、P、R、T、およびQ1のうちの少なくとも1つは、前記リンカー中に存在する、請求項1または2記載の化合物。

請求項11

前記環式基は、ピロリジニルピラゾニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニルピペラジニル、[1,3]ジオキソランオキサゾリジニルイソオキサゾリジニル、モルホリニルチアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニルピリダジノニル、テトラヒドロフリル、およびデカリンよりなる群から選択され、前記非環式基は、セリノールまたはジエタノールアミン誘導体である、請求項2記載の化合物。

請求項12

請求項1〜11のうちのいずれか1項記載の化合物から調製される、オリゴヌクレオチド。

請求項13

前記オリゴヌクレオチドは一本鎖オリゴヌクレオチドである、請求項12記載のオリゴヌクレオチド。

請求項14

前記一本鎖オリゴヌクレオチドは一本鎖siRNAである、請求項13記載のオリゴヌクレオチド。

請求項15

前記一本鎖オリゴヌクレオチドはマイクロRNAである、請求項13記載のオリゴヌクレオチド。

請求項16

前記オリゴヌクレオチドは二本鎖オリゴヌクレオチドである、請求項12記載のオリゴヌクレオチド。

請求項17

前記二本鎖オリゴヌクレオチドは二本鎖siRNAである、請求項16記載のオリゴヌクレオチド。

請求項18

生物における標的特異的RNA干渉(RNAi)を活性化するための組成物であって、請求項14または17記載のsiRNAを含み、該siRNAは、標的mRNAの分解が生じるのに十分な量で投与され、それによって前記生物における標的特異的RNAiを活性化する組成物。

請求項19

前記標的mRNAは、ヒト疾病または疾患に関与するかまたは関与することが予想されるタンパク質アミノ酸配列を指定することを特徴とする、請求項18記載の組成物。

請求項20

前記疾病または疾患が、ウイルス感染細菌感染寄生虫感染、癌、アレルギー自己免疫疾病免疫不全、および免疫抑制から選択されることを特徴とする、請求項19記載の組成物。

請求項21

請求項1〜11のうちのいずれか1項記載の化合物、および薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物

請求項22

請求項21記載の医薬組成物、および使用説明書を含む、薬学的キット

請求項23

脊椎動物におけるウイルス感染、細菌感染、寄生虫感染、腫瘍多発性硬化症、アレルギー、自己免疫疾病、免疫抑制、および免疫不全よりなる群から選択される疾病および/または疾患を防止および/または治療するための細菌RNAの調製のための、請求項12記載のオリゴヌクレオチドの使用。

請求項24

標識付パッケージ中に請求項12記載のオリゴヌクレオチドを含み、前記パッケージ上の標識が、前記オリゴヌクレオチドが少なくとも1つのウイルスに対して使用できることを示す、キット

関連出願の相互参照

0001

本出願は、2008年9月23日に出願された米国仮特許出願第61/099,497号の優先権の利益を主張する。

技術分野

0002

本発明は、「クリックケミストリーを用いたリガンドオリゴヌクレオチドとの共役の分野に関する。

背景技術

0003

オリゴヌクレオチド化合物は、医学分野において重要な治療用途を有する。オリゴヌクレオチドは、特定の疾病関与する遺伝子をサイレンシングさせるために使用することができる。遺伝子サイレンシングは、翻訳を抑制することによってタンパク質の形成を防止する。重要なことに、遺伝子サイレンシング剤は、疾病に結び付けられるタンパク質の機能を抑制する、従来の小さな有機化合物代わる有望なものである。siRNA、アンチセンスRNA、およびマイクロRNAは、遺伝子サイレンシングによってタンパク質の形成を防止するオリゴヌクレオチドである。

0004

RNA干渉または「RNAi」は、二本鎖RNAdsRNA)が遺伝子発現遮断することができるという知見を説明するために、Fireおよび共同研究者によって最初に作り出された用語である(非特許文献1および2)。短鎖dsRNAは、脊椎動物を含む多くの生物における、遺伝子特異的な転写後サイレンシングを誘導し、遺伝子機能調査するための新しい手段を提供している。RNAiは、サイレンシングトリガーと類似しているメッセンジャーRNA破壊するRNA誘導サイレンシング複合体RISC)、配列特異的な、多成分性ヌクレアーゼによって媒介される。RISCは、二本鎖RNAトリガーに由来する短鎖RNA(約22個のヌクレオチド)を含有することで知られているが、この活性タンパク質成分は、依然として不明である。

0005

siRNA化合物は様々な診断および治療目的に対する有望な薬剤である。siRNA化合物を遺伝子の機能を同定するために使用することができる。さらに、siRNA化合物は、病原遺伝子をサイレンシングすることによって作用する医薬品の新タイプとして膨大な可能性を提供する。研究は、中枢神経系疾病、炎症性疾患代謝疾患腫瘍学感染症、および眼疾患を含む多くの疾病の治療のための干渉RNA治療薬を開発するために現在進行中である。

0006

多くの疾病(例えば、癌、造血障害内分泌疾患、および免疫異常)は、特定の遺伝子もしくは遺伝子群の異常もしくは別の不要発現または活性から起こる。例えば、疾病は不正に制御した遺伝子発現、タンパク質の突然変異体の形の発現、またはウイルス性細菌性、もしくは他の病原体由来の遺伝子の発現を介して生じることができる。RNAi経路は、かかる遺伝子の不要発現を抑制するまたは低下するために使用することができる(非特許文献3および4)。

0007

さらなる態様において、本発明は対象における疾病または疾患を治療するための方法に関する。その方法は、疾病を発症しているまたは発症する危険性のある対象を同定すること、修飾したヌクレオチドまたは上記の結合のうちの1つ以上および薬学的に許容される担体を有する免疫的選択iRNA剤を含有する医薬組成物投与すること、を含む。対象は、上記のようにサイトカインまたは細胞表面受容体(例えば、Toll様受容体)等の成長因子の発現の増加に対して監視することによる等、免疫システム、例えば免疫賦活性または免疫制御反応に対する影響に対して、監視することができる。対象のサイトカインは、対象のT細胞B細胞単球マクロファージ樹状細胞、または天然キラー細胞から発現されたものであり得る。アッセイは、対象からの血液または血清試料を使用して実施することができる。疾病または疾患は、例えば臓器組織、または骨髄移植を受けた患者において、免疫システムを刺激することが特に望ましくないものであり得る。別の代替案としては、疾病または疾患は、例えば癌またはウイルス性の疾病を患う患者において、免疫システムを刺激することが特に望ましいものであり得る。一実施形態において、対象は易感染性であり、ヌクレオチド修飾を含むiRNA剤は、ヌクレオチド修飾を含まないiRNA剤よりも大きい範囲で、細胞において免疫応答を刺激する。対象はヒト等の哺乳動物であり得る。

0008

好ましい実施形態では、免疫的選択iRNA剤の投与は、対象に存在する疾病または疾患の治療のためである。別の好ましい実施形態では、iRNA剤の投与は予防的治療のためである。

0009

したがって、抗ウイルス性反応、特にI型のIFN反応を刺激することが可能であるポリヌクレオチド/オリゴヌクレオチドを提供することが、本発明の目的である。ウイルス感染等の疾病および疾患の防止および治療のために、患者において抗ウイルス性反応、特にI型のIFN産生を含むことが可能である医薬組成物を提供することが、本発明の別の目的である。腫瘍を治療するために医薬組成物を提供することが、本発明の目的でもある。

0010

疾病および/または疾患は、感染、腫瘍、アレルギー多発性硬化症、および免疫異常を含むがこれらに限定されない。

0011

感染は、ウイルス感染、細菌感染炭疽寄生虫感染真菌症、およびプリオン感染を含むがこれらに限定されない。

0012

ウイルス感染は、C型肝炎B型肝炎単純ヘルペスウイルス(HSV)、HIVAIDS、ポリオウイルス脳心筋炎ウイルスEMCV)、および天然痘ウイルスによる感染を含むがこれらに限定されない。抑制するために標的にすることができる(+)鎖RNAウイルスの例は、ピコルナウイルスカリシウイルスノダウイルスコロナウイルスアルテリウイルスフラビウイルス、およびトガウイルスを含むがこれらに限定されない。ピコルナウイルスの例は、エンテロウイルス(ポリオウイルス1)、ライノウイルスヒトライノウイルス1A)、ヘパトウイルス(A型肝炎ウイルス)、カルジオウイルス(脳心筋炎ウイルス)、アフトウイルス(口蹄疫疾病ウイルスO)、およびパレコウイルス(ヒトエコーウイルス22)を含む。カリシウイルスの例は、ベジクロウイルス(ブタ水疱疹ウイルスウイルス)、ラゴウイルス(ウサギ出血病ウイルス)、「ノーウォーク様ウイルス」(ノーウォークウイルス)、「サッポロ様ウイルス」(サッポロウイルス)、および「E型肝炎様ウイルス」(E型肝炎ウイルス)を含む。ベータノダウイルスシマアジ神経壊死症ウイルス)は、代表的なノダウイルスである。コロナウイルスは、コロナウイルス(トリ伝染性気管支炎ウイルス)およびトロウイルス(ベルンウイルス)を含む。アルテリウイルス(ウマ動脈炎ウイルス)は、代表的なアルテリウイルスである。トガウイルスは、アルファウイルスシンドビスウイルス)およびルビウイルス(風疹ウイルス)を含む。最後に、フラビウイルスは、フラビウイルス(黄熱病ウイルス)、ペスチウイルスウシウイルス性下痢症ウイルス)、およびヘパシウイルスC型肝炎ウイルス)を含む。

0013

ある実施形態では、ウイルス感染は、慢性B型肝炎、慢性C型肝炎、HIV感染RSV感染、HSV感染、VSV感染、CMV感染、およびインフルエンザ感染から選択される。

0014

一実施形態において、防止されるおよび/または治療される感染は、ウイルスおよび/または細菌によって起きる上気道感染である。別の実施形態では、防止されるおよび/または治療される感染は鳥類インフルエンザである。

0015

細菌感染は、連鎖球菌ブドウ球菌大腸菌シュードモナスを含むがこれらに限定されない。

0016

一実施形態において、細菌感染は細胞内細菌感染である。細胞内細菌感染は、マイコバクテリア結核)、クラミジアマイコプラズマリステリア、および黄色ブドウ球菌等の通性細胞内細菌等の、細胞内細菌による感染を指す。

0017

寄生虫感染は、蠕虫感染、特に腸管虫感染を含むがこれに限定されない。

0018

腫瘍は良性および悪性腫瘍(すなわち癌)の両方を含む。

0020

ある実施形態では、癌は、ヘアリー細胞白血病慢性骨髄性白血病、皮膚T細胞白血病、慢性骨髄性白血病、非ホジキンリンパ腫多発性骨髄腫濾胞性リンパ腫悪性メラノーマ扁平上皮癌腫、腎細胞癌腫、前立腺癌腫、膀胱細胞癌腫、乳癌腫、卵巣癌腫、非小細胞肺癌小細胞肺癌肝細胞癌腫基底細胞癌、結腸癌腫、子宮頸部異形成、およびカポジ肉腫(AIDS関連および非AIDS関連)から選択される。

0021

アレルギーは、呼吸アレルギー、接触アレルギー、および食物アレルギーを含むがこれらに限定されない。

0022

免疫異常は、自己免疫疾病免疫不全、および免疫抑制を含むがこれらに限定されない。

0023

自己免疫疾病は、糖尿病関節炎関節リウマチ若年性関節リウマチ変形性関節症乾癬性関節炎を含む)、多発性硬化症、脳脊髄炎重症筋無力症全身性エリテマトーデス自己免疫性甲状腺炎皮膚炎アトピー性皮膚炎および湿疹性皮膚炎を含む)、乾癬シェーグレン症候群クローン病アフタ性潰瘍虹彩炎結膜炎角結膜炎潰瘍性大腸炎喘息アレルギー性喘息皮膚エリテマトーデス強皮症腟炎直腸炎薬疹ハンセン病逆転反応、らい性結節性紅斑、自己免疫性ブドウ膜炎アレルギー性脳脊髄炎急性壊死性出血性脳症特発性両側進行性感音難聴再生不良性貧血赤芽球癆、特発性血小板減少症多発性軟骨炎ウェゲナー肉芽腫症慢性活動性肝炎スティーブンスジョンソン症候突発性スプルー扁平苔癬グレーブス病サルコイドーシス原発性胆汁性肝硬、後部ブドウ膜炎、および間質性肺線維症を含むがこれらに限定されない。免疫不全は、自発性免疫不全、後天性免疫不全(AIDSを含む)、薬剤性免疫不全(移植に使用される免疫抑制剤および癌を治療するために使用される化学療法薬によって誘発されるもの等)、慢性血液透析によって引き起こされる免疫抑制、外傷、または外科手技を含むがこれらに限定されない。

0024

免疫抑制は、細胞毒性化学療法による骨髄抑制を含むがこれに限定されない。

0025

siRNAは近年出版された発表された多数の例で、抗ウイルス性治療の可能性として非常に効果的であることが示された。ウイルス性ゲノムにおける標的に対して作られるsiRNA分子は、インフルエンザ(非特許文献5〜7)、呼吸器多核体ウイルス(RSV)(非特許文献8)、B型肝炎ウイルスHBV)(非特許文献9)、C型肝炎ウイルス(非特許文献10および11)、およびSARSコロナウイルス(非特許文献12)の動物モデルにおいてオーダー分だけによってウイルス性力価を劇的に削減する。

0026

これらのおよび他の核酸ベースセラピーを使用するための機会は、非常に期待でき、現在の、従来の医療では扱われることができない医学的問題に対する解決法を提供する。疾病関連の遺伝子の数の増加の位置および配列は、同定され、様々な疾病に対する核酸ベースの治療の臨床試験は、現在進行中である。

先行技術

0027

Fire et al.(1998)Nature391,806−811
Elbashir et al.(2001)Genes Dev.15,188−200
Agrawal et al.,Microbiol Mol Biol Rev.,2003,67,657−685
Alisky&Davidson,Am.J.Pharmacogenomics,2004,4,45−51
Ge et al.,(2004)Proc.Natl.Acd.Sci.USA,101,8676−8681
Tompkins et al.(2004)Proc.Natl.Acd.Sci.USA,101,8682−8686
Thomas et al.(2005)ExpertOpin.Biol.Ther.5,495−505
Bitko et al.(2005)Nat.Med.11,50−55
Morrissey et al.(2005)Nat.Biotechnol.23,1002−1007
Kapadia et al.(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,100,2014−2018
Wilson et al.(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,100,2783−2788
Li et al.(2005)Nat.Med.11,944−951

発明が解決しようとする課題

0028

様々なリガンドとオリゴヌクレオチドとの結合のために開発された異なる合成戦略にも関わらず、リガンドオリゴヌクレオチド共役体の合成は、決してわずかではなく、有機化学および固相合成における豊富な専門的知識を必要とする。実際の進展多種多様のリガンドおよびオリゴヌクレオチドに対して利用することができる共役反応を使用することであろう。アルキンおよびアジ化物のHuisgen1、3双極性付加環化、[クリック」反応は、穏やかな条件下で2つの分子不可逆的な共役のために特に魅力的である。「クリック」ケミストリーは、オリゴヌクレオチドと炭水化物ペプチドおよびタンパク質、蛍光標識および脂質とを共役するために効率的な戦略として近年浮上した。したがって、リガンドとオリゴヌクレオチドとの結合のために「クリック」ケミストリーに利用することができる新しい試薬の明確な必要性がある。本発明は、この重要な目的に向けられる。

課題を解決するための手段

0029

本発明は、「クリック」ケミストリーをとおして、様々なリガンドとオリゴヌクレオチド、例えばiRNA剤とを共役するために、リボース置換として使用できる、またはユニバーサル塩基として使用できる化合物に関する。これらの化合物は、本明細書において「クリック担体」と呼ばれる。

0030

例えば、本発明は、式(I)に示す構造を有する化合物を特徴とする。

0031

0032

式中、
XはO、S、NRNまたはCRP2であり、
Bはそれぞれ存在ごとに独立して水素、任意に置換された天然または非天然核酸塩基、任意に置換されたトリアゾールまたは任意に置換されたテトラゾール、NH−C(O)−O−C(CH2B1)3、NH−C(O)−NH−C(CH2B1)3であり、B1はハロゲンメシル酸塩、N3、CN、任意に置換されたトリアゾールまたは任意に置換されたテトラゾールであり、
R1、R2、R3、R4、およびR5はそれぞれ存在ごとに独立してH、OR6、F、N(RN)2、N3、CN、−J−リンカー−N3、−J−リンカー−CN、−J−リンカー−C≡R8、−J−リンカー−シクロアルキン、−J−リンカー−RL、または−J−リンカー−Q−リンカー−RLであり、
Jは存在しないか、O、S、NRN、OC(O)NH、NHC(O)O、C(O)NH、NHC(O)、NHSO、NHSO2、NHSO2NH、OC(O)、C(O)O、OC(O)O、NHC(O)NH、NHC(S)NH、OC(S)NH、OP(N(RP)2)O、もしくはOP(N(RP)2)であり、
R6はそれぞれ存在ごとに独立して水素、ヒドロキシル保護基、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたシクロアルキル、任意に置換されたアラルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたヘテロアリールポリエチレングリコール(PEG)、リン酸塩二リン酸塩三リン酸塩ホスホン酸塩ホスホノチオエート、ホスホノジチオエート、ホスホロチオエートホスホチオレート、ホスホロジチオエート、ホスホロチオロチオネート、リン酸ジエステルリン酸トリエステル、活性化されたリン酸基、活性化された亜リン酸基ホスホラミダイト固形支持体、−P(Z1)(Z2)−O−ヌクレオシド、−P(Z1)(Z2)−O−オリゴヌクレオチド、−P(Z1)(Z2)−式(I)、−P(Z1)(O−リンカー−Q−リンカー−RL)−O−ヌクレオシド、P(Z1)(O−リンカー−RL)−O−ヌクレオシド、−P(Z1)(O−リンカー−N3)−O−ヌクレオシド、P(Z1)(O−リンカー−CN)−O−ヌクレオシド、P(Z1)(O−リンカー−C≡R8)−O−ヌクレオシド、P(Z1)(O−リンカー−シクロアルキン)−O−ヌクレオシド、−P(Z1)(O−リンカー−Q−リンカー−RL)−O−オリゴヌクレオチド、P(Z1)(O−リンカー−RL)−O−オリゴヌクレオチド、P(Z1)(O−リンカー−N3)−O−オリゴヌクレオチド、−P(Z1)(O−リンカー−CN)−O−オリゴヌクレオチド、P(Z1)(O−リンカー−C≡R8)−O−オリゴヌクレオチド、P(Z1)(O−リンカー−シクロアルキン)−O−オリゴヌクレオチド、−P(Z1)(−リンカー−Q−リンカー−RL)−O−ヌクレオシド、−P(Z1)(−リンカー−Q−RL)−O−ヌクレオシド、−P(Z1)(−リンカー−N3)−O−ヌクレオシド、P(Z1)(−リンカー−CN)−O−ヌクレオシド、P(Z1)(−リンカー−C≡R8)−O−ヌクレオシド、P(Z1)(−リンカー−シクロアルキン)−O−ヌクレオシド、−P(Z1)(−リンカー−Q−リンカー−RL)−O−オリゴヌクレオチド、−P(Z1)(−リンカー−RL)−O−オリゴヌクレオチド、P(Z1)(−リンカー−N3)−O−オリゴヌクレオチド、−P(Z1)(−リンカー−CN)−O−オリゴヌクレオチド、P(Z1)(−リンカー−C≡R8)−O−オリゴヌクレオチド、またはP(Z1)(−リンカー−シクロアルキン)−O−オリゴヌクレオチドであり、
RNはそれぞれ存在ごとに独立してH、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたシクロアルキル、任意に置換されたアラルキル、任意に置換されたヘテロアリール、またはアミノ保護基であり、
RPはそれぞれ存在ごとに独立してH、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたシクロアルキル、または任意に置換されたヘテロアリールであり、
Qは存在しないか、またはそれぞれ存在ごとに独立して

0033

0034

であり、
RLは水素またはリガンドであり、
R8はNまたはCR9であり、
R9はH、任意に置換されたアルキル、もしくはシリルであり、
Z1およびZ2はそれぞれ存在ごとに独立してO、S、または任意に置換されたアルキルである、
但し、Bが未置換の天然塩基である場合、R1、R2、R3、R4、およびR5のうちの少なくとも1つは、−J−リンカー−Q−リンカー−RL、または−リンカー−Q−RLである。

0035

一態様において、本発明は、式(Ia)に示す構造を有する化合物を特徴とする。

0036

0037

式中、T1およびT2はそれぞれ独立してH、C1−C9アルキル、C2−C9アルケニル、C2−C9アルキニル、置換したC1−C9アルキル、置換したC1−C9アルケニルおよび置換したC2−C9アルキニルであり、R1、R2、R3、R4、R5、X、およびBは以前に定義された通りである。

0038

一実施形態において、本発明は、式(II)に示す構造を有する化合物を特徴とする。

0039

0040

AおよびBはそれぞれ存在ごとに独立して水素、保護基、任意に置換された脂肪族、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリール、ポリエチレングリコール(PEG)、リン酸塩、二リン酸塩、三リン酸塩、ホスホン酸塩、ホスホノチオエート、ホスホノジチオエート、ホスホロチオエート、ホスホロチオレート、ホスホロジチオエート、ホスホロチオロチオネート、リン酸ジエステル、リン酸トリエステル、活性化されたリン酸基、活性化された亜リン酸基、ホスホラミダイト、固形支持体、−P(Z1)(Z2)−O−ヌクレオシド、または−P(Z1)(Z2)−O−オリゴヌクレオチドであり、Z1およびZ2はそれぞれ存在ごとに独立してO、S、または任意に置換されたアルキルであり、
J1およびJ2は、独立してO、S、NRN、任意に置換されたアルキル、OC(O)NH、NHC(O)O、C(O)NH、NHC(O)、OC(O)、C(O)O、OC(O)O、NHC(O)NH、NHC(S)NH、OC(S)NH、OP(N(RP)2)O、またはOP(N(RP)2)であり、

0041

0042

は、環式基または非環式基であり、好ましくは、環式基はピロリジニルピラゾニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニルピペラジニル、[1、3]ジオキソランオキサゾリジニルイソオキサゾリジニル、モルホリニルチアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニルピリダジノニル、テトラヒドロフリル、およびデカリンから選択され、好ましくは、非環式基はセリノール骨格またはジエタノールアミン骨格から選択され、
Qはそれぞれ存在ごとに独立して

0043

0044

であり、
L10およびL11は独立して存在しないかまたはリンカーである。

0045

本発明の別の実施形態では、薬学的に許容される担体または賦形剤と組み合わせて、治療上の本発明のiRNA剤の有効量を含む、開示された医薬組成物が存在する。本発明のさらに別の実施形態では、化合物を調製するためのプロセスを記載する。

図面の簡単な説明

0046

一本鎖オリゴヌクレオチドの代表的なクリック−共役体の概略図。5’末端との複数の共役および複数のものの全ての組み合わせは、リンカー骨格設計で可能であり、したがってリガンドが結合する。化学を選択することおよび共役の順序で、ヘテロ−リガンド(別々のリガンドまたはハイブリッドリガンド)共役が行われる。
二本鎖オリゴヌクレオチドの代表的なクリック−共役体の概略図。5’末端との複数の共役および複数のものの全ての組み合わせは、リンカー骨格設計で可能であり、したがってリガンドが結合する。化学を選択することおよび共役の順序で、ヘテロ−リガンド(別々のリガンドまたはハイブリッドリガンド)共役が行われる。
銅を含まないクリックケミストリーに対する環ひずみアルキン。
クリックケミストリーを使用した、リガンドとアンタゴmir、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびsiRNAとの3’−の共役。使用されるアルキンは、鎖式または環状制約される。銅がない場合にクリック反応に対して使用された環状制約されたもの。経路1。リガンド−アジ化物と固形支持体の結合後、固相合成、脱保護、およびオリゴヌクレオチドの精製。経路2。リガンド−アジ化物と固体結合のオリゴヌクレオチドとの共役後、脱保護および精製。経路3。合成後のリガンド−アジ化物とオリゴヌクレオチドを有するアルキンとの共役。相補鎖を用いたアニーリングは、siRNAを与える。共役する一本鎖の直接使用は、共役体のアンタゴmirおよびアンチセンスの適用を可能にする。Lはリンカー骨格であり、XはOまたはSであり、Rはリガンドであり、pは環炭素の置換の有無に関わらずゼロまたは3〜8である。環は、N、S、O、SO、SO2等のヘテロ原子を有することもできる。環炭素上の置換は、QがOH、NH2、NHMe、NMe2、COOMe、NH(アルキル)、パーフルオロ置換である場合、F、OMe、COQとの単一または双生児ジ置換である。環状アルキンのサイトテザリングは、OrganicLetters,2008,10,3097−99においてSlettenとBertoszzによって説明される窒素原子であり得る。アルキンと固体結合したアジ化物とのの逆共役は、別のアプローチである、または逆共役はポスト合成を介して達成することができる。いくつかの場合において、他の位置異性体は、入ってくるアジ化物の性質およびアルキンの性質に依存する主要産物または唯一の産物として期待される。別の場合において、産物は同じ反応から形成することができる2つの位置選択的産物の等モル混合物であり得る。銅を含まないクリックケミストリーのための環ひずみ環状アルキンを使用するために関連した参照は、Johnson et al.,Copper−free click chemistry for the in situ cross−linking of photodegradable star polymers.ChemicalCommunications,2008,(26),3064−3066;Sletten and Bertoszzi in Organic Letters,A hydrophilic azacyclooctyne for Cu−free click chemistry,2008,10,3097−99;Baskin et al.,Copper−free chlick chemistry for dynamic in vivo imaging.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2007,104(43),16793;Agard et al.,A comparative study of bioorthogonal reactions with azides.,ACS Chem.Biol.,2006, 1,644、およびChen,Fish ‘n clicks,Nature Chemical Biology,2008,4(7),391−92、を含む。
クリックケミストリーを使用した、リガンドとアンタゴmir、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびsiRNAとの5’−の共役。使用されるアルキンは、環状制約の鎖式である。銅がない場合にクリック反応に対して使用された環状制約されたもの。経路1。リガンド−アジ化物と固形支持体結合のオリゴヌクレオチドとの共役後、脱保護およびオリゴヌクレオチドの精製。経路2。合成後のリガンド−アジ化物とオリゴヌクレオチドを有するアルキンとの共役。相補鎖を含むアニーリングは、siRNAを与える。共役する一本鎖の直接使用は、共役体のアンタゴmirおよびアンチセンスの適用を可能にする。詳細な説明について図4を参照。
脱塩基リンカーおよびクリックケミストリーを使用してリガンドとアンタゴmir、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびsiRNAとの共役。脱塩基リンカーおよびクリックケミストリーを使用してリガンドとアンタゴmir、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびsiRNAとの共役。Rは、リガンドであり、使用されるアルキンは、環状制約の鎖式である。銅がない場合にクリック反応に対して使用された環状制約されたもの。詳細については、図4レジェンドを参照。
siRNAのリガンド結合点を表す概略図。
オリゴヌクレオチドのリガンド結合点を表す概略図。
クリックケミストリーによるリガンドとオリゴヌクレオチドの結合のための共役戦略。
クリックケミストリーに対する脱塩基リンカー。
クリックケミストリーに対する脱塩基リンカー。
クリックケミストリーによるリガンド共役のHPLC解析
精製したクリックケミストリー共役のHPLC解析
アジド標識したオリゴヌクレオチドを表す概略図。
クリックケミストリーによってアジド標識したオリゴヌクレオチドと共役する6−カルボキシフルオセインプロパルギルアミンを表す概略図。
6−カルボキシフルオセイン−プロパルギルアミンとアジ化物標識したオリゴヌクレオチドとの間のクリックケミストリー反応の粗産物のLC−MS解析。
RNAアルキンとの遊離スペルミンアジ化物のクリック反応の逆相HPLC解析。
アルキンとBoc保護スペルミン−アジ化物との共役の粗い反応混合物の逆相HPLC(a)およびLC−MS解析。
表6の修飾したRNA配列を作製するために使用する特別なアミダイトおよびCPGを表す概略図。
RNA−アルキン骨格を作製するために使用する特別なアミダイトおよびCPGを表す概略図。これらのモノマーを組み込んだ配列は、表7に示す。
図21(a)は表8および9の修飾したRNA配列を作製するためのクリック反応に使用される例示的なアジ化物を表す概略図であり、(b)はクリック反応後のモノマーを表す概略図である。
オリゴヌクレオチドに組み込まれた後の修飾したモノマーを表す概略図。これらのモノマーを組み込んだ配列は、表10に示す。
修飾したRNA(配列番号38)を表す概略図。
精製されたクリック産物のRP−HPLC解析(表11を参照)(解析条件、1反応完了は、RP−HPLCによって測定された(DeltaPak C4カラム、150x3.9mm I.D.、5μm、300Å、緩衝液A:50mM TEAA、pH7.0、緩衝液B:ACN、勾配:24分で0〜70%緩衝液B、30℃、1mL/分)。
精製されたクリック産物(配列番号113、75−76、82−83、および95−98)のRP−HPLC解析(表11を参照)(解析条件、1反応完了は、RP−HPLCによって測定された(DeltaPak C4カラム、150x3.9mm I.D.、5μm、300Å、緩衝液A:50mM TEAA、pH7.0、緩衝液B:ACN、勾配:24分で0〜70%緩衝液B、30℃、1mL/分)。
選択した修飾したsiRNAの用量反応曲線

0047

一実施形態において、本発明の化合物は上記に図示されるように式IまたはIIによって表される化合物である、またはその薬学的に許容される塩、エステルもしくはプロドラッグである。

0048

あるいは、式I、またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグは、以下のように表することができる。

0049

0050

一実施形態において、XはO、S、NRN、またはCRP2である。

0051

一実施形態において、Bは水素、任意に置換された天然もしくは非天然核酸塩基、任意に置換されたトリアゾール、または任意に置換されたテトラゾール、NH−C(O)−O−C(CH2B1)3、NH−C(O)−NH−C(CH2B1)3であり、式中B1は独立してハロゲン、メシル酸塩、N3、CN、任意に置換されたトリアゾール、または任意に置換されたテトラゾールであり、式中核酸塩基を−J−リンカー−N3、−J−リンカー−CN、−J−リンカー−C≡R8、−J−リンカー−シクロアルキン、−J−リンカー−RL、−リンカー−Q−RL、または−J−リンカー−Q−リンカー−RLによってさらに置換することができる。B1は、水素でもあり得る。

0052

一実施形態において、R1、R2、R3、R4、およびR5は、それぞれ独立してH、OR6、F、N(RN)2、N3、CN、−J−リンカー−N3、−J−リンカー−CN、−J−リンカー−C≡R8、−J−リンカー−シクロアルキン、−J−リンカー−RL、−リンカー−Q−RL、または−J−リンカー−Q−リンカー−RLである。R1、R2、R3、R4、およびR5はそれぞれ独立してR6であることもできる。

0053

一実施形態において、Jは存在しないか、O、S、NRN、OC(O)NH、NHC(O)O、C(O)NH、NHC(O)、NHSO、NHSO2、NHSO2NH、OC(O)、C(O)O、OC(O)O、NHC(O)NH、NHC(S)NH、OC(S)NH、OP(N(RP)2)O、またはOP(N(RP)2)である。

0054

一実施形態において、R6は水素、ヒドロキシル保護基、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたシクロアルキル、任意に置換されたアラルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたヘテロアリール、ポリエチレングリコール(PEG)、リン酸塩、二リン酸塩、三リン酸塩、ホスホン酸塩、ホスホノチオエート、ホスホノジチオエート、ホスホロチオエート、ホスホロチオレート、ホスホロジチオエート、ホスホロチオロチオネート、リン酸ジエステル、リン酸トリエステル、活性化されたリン酸基、活性化された亜リン酸基、ホスホラミダイト、固形支持体、−P(Z1)(Z2)−O−ヌクレオシド、−P(Z1)(Z2)−O−オリゴヌクレオチド、−P(Z1)(Z2)−式(I)、−P(Z1)(O−リンカー−Q−リンカー−RL)−O−ヌクレオシド、P(Z1)(O−リンカー−RL)−O−ヌクレオシド、−P(Z1)(O−リンカー−N3)−O−ヌクレオシド、P(Z1)(O−リンカー−CN)−O−ヌクレオシド、P(Z1)(O−リンカー−C≡R8)−O−ヌクレオシド、P(Z1)(O−リンカー−シクロアルキン)−O−ヌクレオシド、−P(Z1)(O−リンカー−Q−リンカー−RL)−O−オリゴヌクレオチド、P(Z1)(O−リンカー−RL)−O−オリゴヌクレオチド、P(Z1)(O−リンカー−N3)−O−オリゴヌクレオチド、−P(Z1)(O−リンカー−CN)−O−オリゴヌクレオチド、P(Z1)(O−リンカー−C≡R8)−O−オリゴヌクレオチド、P(Z1)(O−リンカー−シクロアルキン)−O−オリゴヌクレオチド、−P(Z1)(−リンカー−Q−リンカー−RL)−O−ヌクレオシド、−P(Z1)(−リンカー−Q−RL)−O−ヌクレオシド、−P(Z1)(−リンカー−N3)−O−ヌクレオシド、P(Z1)(−リンカー−CN)−O−ヌクレオシド、P(Z1)(−リンカー−C≡R8)−O−ヌクレオシド、P(Z1)(−リンカー−シクロアルキン)−O−ヌクレオシド、−P(Z1)(−リンカー−Q−リンカー−RL)−O−オリゴヌクレオチド、−P(Z1)(−リンカー−RL)−O−オリゴヌクレオチド、P(Z1)(−リンカー−N3)−O−オリゴヌクレオチド、−P(Z1)(−リンカー−CN)−O−オリゴヌクレオチド、P(Z1)(−リンカー−C≡R8)−O−オリゴヌクレオチド、またはP(Z1)(−リンカー−シクロアルキン)−O−オリゴヌクレオチドである。

0055

一実施形態において、RNはH、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたシクロアルキル、任意に置換されたアラルキル、任意に置換されたヘテロアリール、またはアミノ保護基である。

0056

一実施形態において、RPは独立してH、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたシクロアルキル、または任意に置換されたヘテロアリールである。

0057

一実施形態において、Qは

0058

0059

である。

0060

一実施形態において、RLは水素またはリガンドである。

0061

一実施形態において、R8はNまたはCR9である。

0062

一実施形態において、R9はH、任意に置換されたアルキル、またはシリルである。

0063

一実施形態において、Z1およびZ2はそれぞれ独立してO、S、または任意に置換されたアルキルである。

0064

式Iの本実施形態において、Q、−N3、−CN、−C≡R8、任意に置換されたトリアゾール、または任意に置換されたテトラゾールは化合物において少なくとも一度は存在しなければならない。例えば、R1は、少なくとも1つの事例において、N3、CN、−J−リンカー−N3、−J−リンカー−CN、−J−リンカー−C≡R8、−リンカー−Q−RL、または−J−リンカー−Q−リンカー−RLであり、R2は、少なくとも1つの事例において、N3、CN、−J−リンカー−N3、−J−リンカー−CN、−J−リンカー−C≡R8、−リンカー−Q−RL、または−J−リンカー−Q−リンカー−RLであり、R3は、少なくとも1つの事例において、N3、CN、−J−リンカー−N3、−J−リンカー−CN、−J−リンカー−C≡R8、−リンカー−Q−RL、または−J−リンカー−Q−リンカー−RLであり、R4は、少なくとも1つの事例において、N3、CN、−J−リンカー−N3、−J−リンカー−CN、−J−リンカー−C≡R8、−リンカー−Q−RL、または−J−リンカー−Q−リンカー−RLであり、R5は、少なくとも1つの事例において、N3、CN、−J−リンカー−N3、−J−リンカー−CN、−J−リンカー−C≡R8、−リンカー−Q−RL、または−J−リンカー−Q−リンカー−RLであり、Bは、少なくとも1つの事例において、任意に置換されたトリアゾール、または任意に置換されたテトラゾール、NH−C(O)−O−C(CH2B1)3、NH−C(O)−NH−C(CH2B1)3、式中、B1はN3、CN、任意に置換されたトリアゾールまたは任意に置換されたテトラゾールであり、式中核酸塩基は−J−リンカー−N3、−J−リンカー−CN、−J−リンカー−C≡R8、−リンカー−Q−RL、または−J−リンカー−Q−リンカー−RLによってさらに置換される、またはこれらの組み合わせ。一実施形態において、R1は−J−リンカー−Q−リンカー−RLまたは−リンカー−Q−RLである。したがって、一実施形態において、R2は−J−リンカー−Q−リンカー−RLまたは−リンカー−Q−RLであり、一実施形態において、R3は−J−リンカー−Q−リンカー−RLまたは−リンカー−Q−RLであり、一実施形態において、R4は−J−リンカー−Q−リンカー−RLまたは−リンカー−Q−RLであり、一実施形態において、R5は−J−リンカー−Q−リンカー−RLまたは−リンカー−Q−RLであり、一実施形態において、Bは−J−リンカー−Q−リンカー−RLまたは−リンカー−Q−RLを含む。

0065

別の実施形態では、担体は式(III)に示すようにリボース糖である。本実施形態において、化合物、例えばクリック−担体化合物は、ヌクレオシド/ヌクレオチドまたはヌクレオシド/ヌクレオチド類似体である。

0066

0067

一実施形態において、同じ化合物のR2およびR4はロックされた核酸(LNA)と同様の「ロックされた」化合物を形成するために一緒に結合される。

0068

一実施形態において、R1およびR4はHである。

0069

一実施形態において、R1は−O−リンカー−Q−リンカー−RL、−OC(O)N(RN)−リンカー−Q−リンカー−RL、または−リンカー−Q−リンカー−RLであり、BはHである。

0070

一実施形態において、同じ化合物のR2およびR4はロックされた核酸(LNA)と同様の「ロックされた」化合物を形成するために一緒に結合される。

0071

一実施形態において、Bが水素の場合、R1は−O−リンカー−Q−リンカー−RL、−OC(O)N(R7)−リンカー−Q−リンカー−RL、または−リンカー−Q−リンカー−RLである。

0072

一実施形態において、BはHである。

0073

一実施形態において、BはC5の位置においてピリミジン置換される。

0074

一実施形態において、R2はOR6であり、R3は−O−リンカー−Q−リンカー−RL、−OC(O)N(RN)−リンカー−Q−リンカー−RL、または−リンカー−Q−リンカー−RLであり、RLは存在する。

0075

一実施形態において、R3はOR6であり、R2は−O−リンカー−Q−リンカー−RL、−OC(O)N(RN)−リンカー−Q−リンカー−RL、または−リンカー−Q−リンカー−RLであり、RLは存在する。

0076

一実施形態において、R2はOHである。

0077

一実施形態において、R9はHである。

0078

一実施形態において、R5は−O−リンカー−Q−リンカー−RL、−OC(O)N(RN)−リンカー−Q−リンカー−RL、または−リンカー−Q−リンカー−RLであり、RLは存在する。

0079

一実施形態において、R5は−OC(O)NH(CH2)fC≡CR9であり、fは1〜20である。

0080

一実施形態において、R4は−OC(O)NH(CH2)fC≡CR9であり、fは1〜20である。

0081

一実施形態において、R3は−OC(O)NH(CH2)fC≡CR9であり、fは1〜20である。

0082

一実施形態において、R2は−OC(O)NH(CH2)fC≡CR9であり、fは1〜20である。

0083

一実施形態において、R1は−OC(O)NH(CH2)fC≡CR9であり、fは1〜20である。

0084

一実施形態において、Bは−OC(O)NH(CH2)fC≡CHで置換される核酸塩基であり、fは1〜20である。

0085

一実施形態において、R5は

0086

0087

であり、式中fは1〜20である。

0088

一実施形態において、R4は

0089

0090

であり、式中fは1〜20である。

0091

一実施形態において、R3は

0092

0093

であり、式中fは1〜20である。

0094

一実施形態において、R2は

0095

0096

であり、fは1〜20である。

0097

一実施形態において、R1は

0098

0099

であり、式中fは1〜20である。

0100

一実施形態において、Bは

0101

0102

で置換される核酸塩基であり、fは1〜20である。

0103

一実施形態において、Bは

0104

0105

で置換される核酸塩基である。

0106

一実施形態において、Bは

0107

0108

で置換される核酸塩基である。

0109

一実施形態において、R5は−O−(CH2)fC≡CR9であり、式中fは1〜20である。

0110

一実施形態において、R4は−O−(CH2)fC≡CR9であり、式中fは1〜20である。

0111

一実施形態において、R3は−O−(CH2)fC≡CR9であり、式中fは1〜20である。

0112

一実施形態において、R2は−O−(CH2)fC≡CR9であり、式中fは1〜20である。

0113

一実施形態において、R1は−O−(CH2)fC≡CR9であり、式中fは1〜20である。

0114

一実施形態において、Bは−O−(CH2)fC≡CHで置換される核酸塩基であり、式中fは1〜20である。

0115

一実施形態において、R5は

0116

0117

であり、式中fは1〜20である。

0118

一実施形態において、R4は

0119

0120

であり、式中fは1〜20である。

0121

一実施形態において、R3は

0122

0123

であり、式中fは1〜20である。

0124

一実施形態において、R2は

0125

0126

であり、式中fは1−20である。

0127

一実施形態において、R1は

0128

0129

であり、式中fは1〜20である。

0130

一実施形態において、Bは

0131

0132

で置換される核酸塩基であり、式中fは1〜20である。

0133

一実施形態において、fは1、2、3、4、または5である。好ましい実施形態では、式中fは1である。

0134

一実施形態において、Qは

0135

0136

である。

0137

一実施形態において、Qは

0138

0139

である。

0140

一実施形態において、Qは

0141

0142

である。

0143

一実施形態において、Qは

0144

0145

である。

0146

一実施形態において、式(I)のリボース糖は式(I’)

0147

0148

に示す構造を有し、変数は式(I)に対して上記に定義される通りである。

0149

一実施形態において、式(I)のリボース糖は式(I’a)

0150

0151

に示す構造を有する。

0152

式中、T1およびT2はそれぞれ独立してH、C1−C9アルキル、C2−C9アルケニル、C2−C9アルキニル、置換したC1−C9アルキル、置換したC1−C9アルケニル、および置換したC2−C9アルキニルであり、R1、R2、R3、R4、R5、X、およびBは以前に定義された通りである。

0153

一実施形態において、式(I)のリボース糖は、式(I’’)

0154

0155

に示す構造を有し、変数は式(I)に対して上記に定義される通りである。

0156

一実施形態において、式(I)のリボース糖は式(II’a)に示される構造を有し、

0157

0158

式中、T1およびT2はそれぞれ独立してH、C1−C9アルキル、C2−C9アルケニル、C2−C9アルキニル、置換したC1−C9アルキル、置換したC1−C9アルケニルおよび置換したC2−C9アルキニルであり、R1、R2、R3、R4、R5、X、およびBは以前に定義された通りである。

0159

一実施形態において、式(I)のクリック−担体化合物がオリゴヌクレオチドの5’末端にある場合、オリゴヌクレオチドはクリック−担体化合物のR5位置において結び付けられる。

0160

一実施形態において、式(I)のクリック−担体化合物がオリゴヌクレオチドの3’末端にある場合、オリゴヌクレオチドはクリック−担体化合物のR3またはR2の位置で結び付けられる。

0161

一実施形態において、式(I)のクリック−担体化合物がオリゴヌクレオチドの末端の位置にない場合、化合物のR5の位置は、片方はオリゴヌクレオチドの3’−または2’−の位置に結び付けられ、化合物のR2またはR3の位置はもう一方のオリゴヌクレオチドの5’−位置に結び付けられる。

0162

一実施形態において、2つの異なるクリック−担体化合物は相補官能基を含み、相互にクリックされる。一実施形態において、相補官能基はあるクリック−化合物のR5位置および二次化合物のR2またはR3の位置にある。一実施形態において、相補官能基はあるクリック−化合物のR5の位置および二次化合物のR5の位置にある。一実施形態において、相補官能基はあるクリック−化合物のR2またはR3の位置、および二次化合物のR2またはR3の位置にある。

0163

いくつかの実施形態において、Bはリンカーと担体を結ぶクリック−担体の一部を形成することができる。例えば、−リンカー−Q−リンカー−RLプリン核酸塩基のC2、C6、C7、もしくはC8の位置、またはピリミジン核酸塩基のC2、C5、またはC6の位置において存在することができる。リンカーは、核酸塩基に直接、またはO、N、S、C(O)、C(O)O C(O)NHなどの1つ以上の介在基を介して間接的に、結合することができる。ある実施形態では、上記のクリック−担体において、Bはウラシリル、またはユニバーサル塩基、例えばアリール部分、例えば任意に追加置換基を有するフェニル、例えば1つ以上のフルオロ基である。

0164

一実施形態において、本発明は式(IV)に示す構造を有する化合物を特徴とする。

0165

0166

式中、R10およびR20はそれぞれ存在ごとに独立して水素、任意に置換された脂肪族、任意に置換されたアリール、または任意に置換されたヘテロアリールであり、R1、R2、R3、R4、R5、およびXは第1の実施形態に定義された通りである。

0167

一実施形態において、本発明は式(IVa)に示す構造を有する化合物を特徴とする。

0168

0169

式中、T1およびT2は、それぞれ独立してH、C1−C9アルキル、C2−C9アルケニル、C2−C9アルキニル、置換したC1−C9アルキル、置換したC1−C9アルケニル、および置換したC2−C9アルキニルであり、R1、R2、R3、R4、R5、R10、R20、およびXは以前に定義された通りである。

0170

一実施形態において、本発明は式(V)に示す構造を有する化合物を特徴とする。

0171

0172

式中、B1はハロゲン、N3、CN、任意に置換されたトリアゾール、または任意に置換されたテトラゾールである。B1はメシル酸塩でもあり得る。R1、R2、R3、R4、およびR5が第1の実施形態に定義された通りである。

0173

一実施形態において、本発明は式(Va)に示す構造を有する化合物を特徴とする。

0174

0175

式中、B1はハロゲン、N3、CN、任意に置換されたトリアゾール、または任意に置換されたテトラゾールであり、T1およびT2はそれぞれ独立してH、C1−C9アルキル、C2−C9アルケニル、C2−C9アルキニル、置換したC1−C9アルキル、置換したC1−C9アルケニル、および置換したC2−C9アルキニルであり、R1、R2、R3、R4、およびR5は以前に定義した通りである。

0176

一実施形態において、担体は式(VI)に示されるピロリン環系を基づくことができる。

0177

0178

式中、E存在しないかもしくはC(O)、C(O)O、C(O)NH、C(S)、C(S)NH、SO、SO2、またはSO2NHであり、
R11、R12、R13、R14、R15、R16、R17、およびR18はそれぞれ存在ごとに独立してH、−CH2ORa、またはORbであることができ、
RaおよびRbはそれぞれ存在ごとに独立して水素、ヒドロキシル保護基、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたシクロアルキル、任意に置換されたアラルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたヘテロアリール、ポリエチレングリコール(PEG)、リン酸塩、二リン酸塩、三リン酸塩、ホスホン酸塩、ホスホノチオエート、ホスホノジチオエート、ホスホロチオエート、ホスホロチオレート、ホスホロジチオエート、ホスホロチオロチオネート、リン酸ジエステル、リン酸トリエステル、活性化されたリン酸基、活性化された亜リン酸基、ホスホラミダイト、固形支持体、−P(Z1)(Z2)−O−ヌクレオシド、−P(Z1)(Z2)−O−オリゴヌクレオチド、−P(Z1)(Z2)−式(I)、−P(Z1)(O−リンカー−Q−リンカー−RL)−O−ヌクレオシド、−P(Z1)(O−リンカー−N3)−O−ヌクレオシド、P(Z1)(O−リンカー−CN)−O−ヌクレオシド、P(Z1)(O−リンカー−C≡R8)−O−ヌクレオシド、P(Z1)(O−リンカー−シクロアルキン)−O−ヌクレオシド、−P(Z1)(O−リンカー−RL)−O−オリゴヌクレオチド、−P(Z1)(O−リンカー−Q−リンカー−RL)−O−オリゴヌクレオチド、−P(Z1)(O−リンカー−RL)−O−オリゴヌクレオチド、P(Z1)(O−リンカー−N3)−O−オリゴヌクレオチド、−P(Z1)(O−リンカー−CN)−O−オリゴヌクレオチド、P(Z1)(O−リンカー−C≡R8)−O−オリゴヌクレオチド、P(Z1)(O−リンカー−シクロアルキン)−O−オリゴヌクレオチド、−P(Z1)(−リンカー−Q−リンカー−RL)−O−ヌクレオシド、P(Z1)(−リンカー−RL)−O−ヌクレオシド、−P(Z1)(−リンカー−N3)−O−ヌクレオシド、P(Z1)(−リンカー−CN)−O−ヌクレオシド、P(Z1)(−リンカー−C≡R8)−O−ヌクレオシド、P(Z1)(−リンカー−シクロアルキン)−O−ヌクレオシド、−P(Z1)(−リンカー−Q−リンカー−RL)−O−オリゴヌクレオチド、(Z1)(−リンカー−RL)−O−オリゴヌクレオチド、P(Z1)(−リンカー−N3)−O−オリゴヌクレオチド、−P(Z1)(−リンカー−CN)−O−オリゴヌクレオチド、P(Z1)(−リンカー−C≡R8)−O−オリゴヌクレオチド、またはP(Z1)(−リンカー−シクロアルキン)−O−オリゴヌクレオチドであり、
R30はそれぞれに発生に対して独立して−リンカー−Q−リンカー−RL、−リンカー−RL、またはR31であり、
Qは存在しないか、またはそれぞれ存在ごとに独立して

0179

0180

であり、
RLは水素またはリガンドであり、
R8はNまたはCR9であり、
R9はH、任意に置換されたアルキル、もしくはシリルであり、
R31は−C(O)CH(N(R32)2)(CH2)hN(R32)2であり、
R32はそれぞれ存在ごとに独立してH、−リンカー−Q−リンカー−RL、−リンカー−RL、またはR31であり、
fおよびhはそれぞれ存在ごとに独立して1〜20であり、
Z1およびZ2はそれぞれ存在ごとに独立してO、S、または任意に置換されたアルキルである。

0181

ピロリンベースのクリック−担体に対して、R11は−CH2ORaであり、R3はORbである、またはR11は−CH2ORaであり、R9はORbである、またはR11は−CH2ORaであり、R17はORbである、またはR13は−CH2ORaであり、R11はORbである、またはR13は−CH2ORaであり、R15はORbである、またはR13は−CH2ORaであり、R17はORbである。ある実施形態では、CH2ORaおよびORbをジェミナルに置換することができる。4−ヒドロキシプロリンベースの担体に対して、R11は−CH2ORaであり、R17はORbである。ピロリン−および4−ヒドロキシプロリンベースの化合物は、したがって結合(例えば、炭素炭素結合)を含むことができ、結合回転は特定の連鎖、例えば環が存在することから生じる制限について限定される。したがって、CH2ORaおよびORbは、上記に描写される対形成のうちのいずれかにおいてお互いに関してシスまたはトランスであり得る。その結果、全てのシス/トランス異性体は特に含まれる。化合物は、1つ以上の不斉中心も含むことができ、したがってラセミ化合物およびラセミ混合物単一鏡像異性体、個々のジアステレオマーおよびジアステレオマー混合物として発生する。全てのかかる化合物の異性体は、特に含まれる(例えば、CH2ORaおよびORbを有している中心は、両方ともR配置を有することができる、または両方ともS配置をふくむことができる、または1つの中心は、R配置を有することができ、他の中心はS配置を有することができ、逆もまた同じである)。

0182

一実施形態において、R11はCH2ORaであり、R9はORbである。

0183

一実施形態において、Rbは固形支持体である。

0184

一実施形態において、R30は−C(O)(CH2)fNHC(O)(CH2)gC≡CR9であり、式中fおよびgは独立して1〜20である。

0185

一実施形態において、R30は

0186

0187

であり、式中、fは1〜20である。

0188

一実施形態において、R30は

0189

0190

であり、式中、fは1〜20である。

0191

一実施形態において、R30は

0192

0193

であり、式中、fは1〜20である。

0194

一実施形態において、R30は

0195

0196

である。

0197

一実施形態において、R30は

0198

0199

である。

0200

ある好ましい実施形態において、R30はR31である。

0201

ある好ましい実施形態において、R31は−C(O)CH(N(R32)2)(CH2)4N(R32)2であり、少なくとも1つのR32は−C(O)(CH2)fC≡R8または−リンカー−Q−リンカー−RLであり、RLは存在する。

0202

ある好ましい実施形態において、R31は−C(O)CH(N(R32)2)(CH2)4NH2であり、少なくとも1つのR32は−C(O)(CH2)fC≡R8または−リンカー−Q−リンカー−RLであり、RLは存在する。

0203

一実施形態において、R32は−C(O)(CH2)fC≡R8である。

0204

一実施形態において、R32は−C(O)(CH2)3C≡Hである。

0205

一実施形態において、R31は−C(O)CH(NH2)(CH2)4NH2である。

0206

一実施形態において、特性の非環状糖交換ベースの化合物、例えば糖交換ベースのクリック−担体化合物は、本明細書においてリボース置換化合物サブユニットRRMS)化合物の化合物としても称される。好ましい非環状担体は、以下の式(III)または式(IV)に示す構造を有することができる。

0207

一態様において、本発明は、式(VII)に示す構造を有する非環状クリック−担体化合物を特徴とする。

0208

0209

式中、
Wは存在しないか、O、S、およびN(RN)であり、式中、RNはそれぞれ存在ごとに独立してH、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたシクロアルキル、任意に置換されたアラルキル、任意に置換されたヘテロアリール、またはアミノ保護基であり、
Eは存在しないかもしくはC(O)、C(O)O、C(O)NH、C(S)、C(S)NH、SO、SO2、またはSO2NHであり、
RaおよびRbは、それぞれ存在ごとに独立して、水素、ヒドロキシル保護基、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたシクロアルキル、任意に置換されたアラルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたヘテロアリール、ポリエチレングリコール(PEG)、リン酸塩、二リン酸塩、三リン酸塩、ホスホン酸塩、ホスホノチオエート、ホスホノジチオエート、ホスホロチオエート、ホスホロチオレート、ホスホロジチオエート、ホスホロチオロチオネート、リン酸ジエステル、リン酸トリエステル、活性化されたリン酸基、活性化された亜リン酸基、ホスホラミダイト、固形支持体、−P(Z1)(Z2)−O−ヌクレオシド、−P(Z1)(Z2)−O−オリゴヌクレオチド、−P(Z1)(Z2)−式(I)、−P(Z1)(O−リンカー−Q−リンカー−RL)−O−ヌクレオシド、−P(Z1)(O−リンカー−N3)−O−ヌクレオシド、P(Z1)(O−リンカー−CN)−O−ヌクレオシド、P(Z1)(O−リンカー−C≡R8)−O−ヌクレオシド、P(Z1)(O−リンカー−シクロアルキン)−O−ヌクレオシド、−P(Z1)(O−リンカー−RL)−O−オリゴヌクレオチド、−P(Z1)(O−リンカー−Q−リンカー−RL)−O−オリゴヌクレオチド、−P(Z1)(O−リンカー−RL)−O−オリゴヌクレオチド、P(Z1)(O−リンカー−N3)−O−オリゴヌクレオチド、−P(Z1)(O−リンカー−CN)−O−オリゴヌクレオチド、P(Z1)(O−リンカー−C≡R8)−O−オリゴヌクレオチド、P(Z1)(O−リンカー−シクロアルキン)−O−オリゴヌクレオチド、−P(Z1)(−リンカー−Q−リンカー−RL)−O−ヌクレオシド、P(Z1)(−リンカー−RL)−O−ヌクレオシド、−P(Z1)(−リンカー−N3)−O−ヌクレオシド、P(Z1)(−リンカー−CN)−O−ヌクレオシド、P(Z1)(−リンカー−C≡R8)−O−ヌクレオシド、P(Z1)(−リンカー−シクロアルキン)−O−ヌクレオシド、−P(Z1)(−リンカー−Q−リンカー−RL)−O−オリゴヌクレオチド、(Z1)(−リンカー−RL)−O−オリゴヌクレオチド、P(Z1)(−リンカー−N3)−O−オリゴヌクレオチド、−P(Z1)(−リンカー−CN)−O−オリゴヌクレオチド、P(Z1)(−リンカー−C≡R8)−O−オリゴヌクレオチド、またはP(Z1)(−リンカー−シクロアルキン)−O−オリゴヌクレオチドであり、
R30はそれぞれに発生に対して独立して−リンカー−Q−リンカー−RL、−リンカー−RL、またはR31であり、
Qは存在しないか、またはそれぞれ存在ごとに独立して

0210

0211

であり、
RLは水素またはリガンドであり、
R8はNまたはCR9であり、
R9はH、任意に置換されたアルキル、もしくはシリルであり、
R31は−C(O)CH(N(R32)2)(CH2)hN(R32)2であり、
R32はそれぞれ存在ごとに独立してH、−リンカー−Q−リンカー−RL、またはR31であり、
fおよびhはそれぞれ存在ごとに独立して1〜20であり、
Z1およびZ2はそれぞれ存在ごとに独立してO、S、または任意に置換されたアルキルであり、
r、s、およびtはそれぞれ存在ごとに独立して0、1、2、または3である。

0212

rおよびsが異なる場合、第三炭素はRまたはS配置であり得る。好ましい実施形態において、xおよびyは1であり、zはゼロである(例えば担体はセリノールを基にする)。非環状担体は任意に例えばヒドロキシアルコキシペルハロアルキーに置換することができる。

0213

別の態様において、本発明は、式(VIII)に示す構造を有する非環状クリック−担体化合物を特徴とする。

0214

0215

式中、Eは存在しないかもしくはC(O)、C(O)O、C(O)NH、C(S)、C(S)NH、SO、SO2、またはSO2NHであり、
RaおよびRbはそれぞれ存在ごとに独立して水素、ヒドロキシル保護基、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたシクロアルキル、任意に置換されたアラルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたヘテロアリール、ポリエチレングリコール(PEG)、リン酸塩、二リン酸塩、三リン酸塩、ホスホン酸塩、ホスホノチオエート、ホスホノジチオエート、ホスホロチオエート、ホスホロチオレート、ホスホロジチオエート、ホスホロチオロチオネート、リン酸ジエステル、リン酸トリエステル、活性化されたリン酸基、活性化された亜リン酸基、ホスホラミダイト、固形支持体、−P(Z1)(Z2)−O−ヌクレオシド、−P(Z1)(Z2)−O−オリゴヌクレオチド、−P(Z1)(Z2)−式(I)、−P(Z1)(O−リンカー−Q−リンカー−RL)−O−ヌクレオシド、−P(Z1)(O−リンカー−N3)−O−ヌクレオシド、P(Z1)(O−リンカー−CN)−O−ヌクレオシド、P(Z1)(O−リンカー−C≡R8)−O−ヌクレオシド、P(Z1)(O−リンカー−シクロアルキン)−O−ヌクレオシド、−P(Z1)(O−リンカー−RL)−O−オリゴヌクレオチド、−P(Z1)(O−リンカー−Q−リンカー−RL)−O−オリゴヌクレオチド、−P(Z1)(O−リンカー−RL)−O−オリゴヌクレオチド、P(Z1)(O−リンカー−N3)−O−オリゴヌクレオチド、−P(Z1)(O−リンカー−CN)−O−オリゴヌクレオチド、P(Z1)(O−リンカー−C≡R8)−O−オリゴヌクレオチド、P(Z1)(O−リンカー−シクロアルキン)−O−オリゴヌクレオチド、−P(Z1)(−リンカー−Q−リンカー−RL)−O−ヌクレオシド、P(Z1)(−リンカー−RL)−O−ヌクレオシド、−P(Z1)(−リンカー−N3)−O−ヌクレオシド、P(Z1)(−リンカー−CN)−O−ヌクレオシド、P(Z1)(−リンカー−C≡R8)−O−ヌクレオシド、P(Z1)(−リンカー−シクロアルキン)−O−ヌクレオシド、−P(Z1)(−リンカー−Q−リンカー−RL)−O−オリゴヌクレオチド、(Z1)(−リンカー−RL)−O−オリゴヌクレオチド、P(Z1)(−リンカー−N3)−O−オリゴヌクレオチド、−P(Z1)(−リンカー−CN)−O−オリゴヌクレオチド、P(Z1)(−リンカー−C≡R8)−O−オリゴヌクレオチド、またはP(Z1)(−リンカー−シクロアルキン)−O−オリゴヌクレオチドであり、
R30はそれぞれに発生に対して独立して−リンカー−Q−リンカー−RL、−リンカー−RL、またはR31であり、
Qは存在しないか、またはそれぞれ存在ごとに独立して

0216

0217

であり、
RLは水素またはリガンドであり、
R8はNまたはCR9であり、
R9はH、任意に置換されたアルキル、もしくはシリルであり、
R31は−C(O)CH(N(R32)2)(CH2)hN(R32)2であり、
R32はそれぞれ存在ごとに独立してH、−リンカー−Q−リンカー−RL、またはR31であり、
fおよびhはそれぞれ存在ごとに独立して1〜20であり、
Z1およびZ2はそれぞれ存在ごとに独立してO、S、または任意に置換されたアルキルであり、
rおよびsはそれぞれ存在ごとに独立して0、1、2、または3である。

0218

好ましくは、Q、−N3、−CN、または−C≡R8は式(VI)、(VII)、および(VIII)の化合物において少なくとも1回は存在する。

0219

本発明に従う他の担体化合物は全ての目的に対して全てが参照により組み込まれる、2004年8月10日に出願された同時係属中の米国特許出願第10/916,185号、2004年9月21日に出願された米国特許出願第10/946,873号、2004年11月9日に出願された米国特許出願第10/985,426号、2007年8月3日に出願された米国特許出願第10/833,934号、2005年4月27日に出願された米国特許出願第11/115,989号、2005年4月29日に出願された米国特許出願第11/119,533号の各明細書に記載される。

0220

リンカー
「リンカー」という用語は、化合物の2つの部分を接続する有機質部分を意味する。リンカーは、典型的に直接結合または、酸素もしくは硫黄等の原子、NR1、C(O)、C(O)NH、SO、SO2、SO2NH等のユニット、または1つ以上のメチレンはO、S、S(O)、SO2、N(R1)2、C(O)、置換したもしくは非置換のアリール、置換したもしくは非置換のヘテロアリール、置換したもしくは非置換のヘテロ環状によって中断されるまたは終結され得る、置換したもしくは非置換のアルキル、置換したもしくは非置換のアルケニル、置換したもしくは非置換のアルキニル、アリールアルキルアリールアルケニルアリールアルキニルヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、ヘテロシクリルアルキルヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニルアルキルアリールアルキル、アルキルアリールアルケニル、アルキルアリールアルキニル、アルケニルアリールアルキル、アルケニルアリールアルケニル、アルケニルアリールアルキニル、アルキニルアリールアルキル、アルキニルアリールアルケニル、アルキニルアリールアルキニル、アルキルヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリールアルケニル、アルキルヘテロアリールアルキニル、アルケニルヘテロアリールアルキル、アルケニルヘテロアリールアルケニル、アルケニルヘテロアリールアルキニル、アルキニルヘテロアリールアルキル、アルキニルヘテロアリールアルケニル、アルキニルヘテロアリールアルキニル、アルキルヘテロシクリルアルキル、アルキルヘテロシクリルアルケニル、アルキルヘテロシクリルアルキニル、アルケニルヘテロシクリルアルキル、アルケニルヘテロシクリルアルケニル、アルケニルヘテロシクリルアルキニル、アルキニルヘテロシクリルアルキル、アルキニルヘテロシクリルアルケニル、アルキニルヘテロシクリルアルキニル、アルキルアリール、アルケニルアリール、アルキニルアリール、アルキルヘテロアリール、アルケニルヘテロアリール、アルキニルヘテロアリール等の原子鎖を含む、但し、R1は水素、アシル、脂肪族、または置換した脂肪族である。

0221

一実施形態において、リンカーは構造:
−[P−Q1−R]q−T−
によって表され、
式中、
P、R、およびTはそれぞれ存在ごとに独立して存在しないか、CO、NH、O、S、OC(O)、NHC(O)、CH2、CH2NH、CH2O;NHCH(Ra)C(O)、−C(O)−CH(Ra)−NH−、−C(O)−(任意に置換されたアルキル)−NH−、CH=N−O、

0222

0223

であり、
Q1はそれぞれ存在ごとに独立して存在しないか、−(CH2)n−、−C(R100)(R200)(CH2)n−、−(CH2)nC(R100)(R200)−、−(CH2CH2O)mCH2CH2−、または−(CH2CH2O)mCH2CH2NH−であり、
RaはHまたはアミノ酸側鎖であり、
R100およびR200はそれぞれ存在ごとに独立してH、CH3、OH、SH、またはN(RX)2であり、
RXはそれぞれ存在ごとに独立してH、メチルエチルプロピルイソプロピルブチル、またはベンジルであり、
qはそれぞれ存在ごとに独立して0〜20であり、
nはそれぞれ存在ごとに独立して1〜20であり、
mはそれぞれ存在ごとに独立して0〜50である。

0224

一実施形態において、リンカーは構造−[(P−Q1−R)q−X−(P’−Q1’−R’)q’]q’’−Tを有し、式中、
P、R、T、P’、R’、およびT’はそれぞれ存在ごとに独立して存在しないか、CO、NH、O、S、OC(O)、NHC(O)、CH2、CH2NH、CH2O、NHCH(Ra)C(O)、−C(O)−CH(Ra)−NH−、−C(O)−(任意に置換されたアルキル)−NH−、CH=N−O、

0225

0226

であり、
Q1およびQ1’は、それぞれ存在ごとに独立して存在しないか、−(CH2)n−、−C(R100)(R200)(CH2)n−、−(CH2)nC(R100)(R200)−、−(CH2CH2O)mCH2CH2−、または−(CH2CH2O)mCH2CH2NH−であり、
Xは切断可能な結合基であり、
RaはHまたはアミノ酸側鎖であり、
R100およびR200はそれぞれ存在ごとに独立してH、CH3、OH、SH、またはN(RX)2であり、
RXはそれぞれ存在ごとに独立してH、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、またはベンジルであり、
q、q’、およびq’はそれぞれ存在ごとに独立して0〜20であり、
nはそれぞれ存在ごとに独立して1〜20であり、
mはそれぞれ存在ごとに独立して0〜50である。

0227

一実施形態において、リンカーは少なくとも1つの切断可能な結合基を含む。

0228

切断可能な結合基
切断可能な結合基は、細胞外で十分に安定しているが、標的細胞侵入する際、リンカーが結合している2つの部分を放出するために切断されるものである。好ましい実施形態では、切断可能な結合基は少なくとも10回以上、標的細胞においてまたは(例えば細胞内状態を模倣するまたは表すために選択され得る)第1の参照状態の下、対象の血液内、または(例えば血液または血清に見られる状態を模倣するまたは表すために選択され得る)第2の参照の状態の下よりも、好ましくは少なくとも100回速く切断される。

0229

切断可能な結合基は、切断剤、たとえばpH、レドックスの可能性、または分解分子の存在に影響されやすい。一般的に、切断剤はより蔓延する、または高レベルに見られる、または血清または血液内よりも細胞内の活性である。かかる分解剤の例は、還元によってレドックス切断可能な結合基を分解することができる、特定の基質に対して選択される、または細胞に存在する例えば酸化的もしくは還元的酵素またはメルカプタン等の還元剤を含む基質特異性を有さないレドックス剤エステラーゼエンドソームまたは酸性環境、例えば5pH以下を生じるものを作ることができる薬剤、一般酸、(基質特異的であり得る)ペプチダーゼ、およびホスファターゼとして作用することによって、酸性の切断可能な結合基を加水分解または分解することができる酵素を含む。

0230

ジスルフィド結合等の切断可能な連鎖基は、pHに影響されやすい。ヒト血清のpHは7.4であるが、平均細胞内pHは、約7.1〜7.3の範囲で、少し低い。エンドソームは、5.5〜6.0の範囲のより多くの酸性のpHを有し、リソソームは約5.0のさらに酸性のpHを有する。いくつかのスペーサーは、好ましいpHにおいて切断される連鎖基を有し、その結果、細胞内、または細胞の好ましいコンパートメントに担体オリゴマーからiRNA剤を放出するであろう。

0231

スペーサーは、特定の酵素によって切断可能な結合基を含むことができる。スペーサーに組み込まれる結合基の種類は、iRNA剤によって標的にされる細胞に依存することができる。例えば、肝細胞においてmRNAを標的とするiRNA剤は、エステル基を含むスペーサーを介して担体オリゴマーと結び付けられ得る。肝細胞は、エステラーゼに富んでいて、その結果テザーはエステラーゼが豊富でない細胞型においてよりも肝細胞においてより効率的に切断されるであろう。スペーサーの切断は、担体オリゴマーよりiRNA剤を放出する、その結果iRNA剤のサイレンシングする活性を強める可能性がある。エステラーゼが豊富な他の細胞型は、腎皮質、および精巣の細胞を含む。

0232

iRNA剤が肝細胞および滑膜細胞等のペプチダーゼに富んでいる細胞型を標的としている場合、ペプチド結合を含有するスペーサーを使用することができる。例えば、炎症性疾患(例えば、関節リウマチ)の治療に対する等の滑膜細胞を標的としたiRNA剤は、ペプチド結合を含むスペーサーを介して担体オリゴマーと結びつけられ得る。

0233

一般に、切断可能な結合基候補の適合性は、結合基候補を切断するために分解剤の能力(または状態)を試験することによって評価することができる。血液中で、または他の非標的組織、例えば対象に投与した場合にiRNA剤に曝される組織と接触したときに、切断に抵抗する能力について、切断可能な結合基候補を試験することも望ましいであろう。したがって、第1の条件と第2の条件との間で切断に対する相対的感受性を測定することができ、ここで、第1の条件は標的細胞における切断を示すために選択され、第2の条件は、他の組織または生体液、例えば血液または血清における切断を示すように選択される。評価は、無細胞系、細胞、細胞培養、臓器もしくは組織培養、または動物の全体において実施することができる。無細胞または培養状態における初期評価を実施するため、および動物の全体におけるさらなる評価によって確認するために有用であり得る。好ましい実施形態において、有用な候補化合物は、血液または血清(または細胞外状態を模倣するために選択されたインビトロ状態下で)と比べて、細胞内(細胞内状態を模倣するために選択されたインビトロ状態下で)で少なくとも2、4、10、または100回速く切断される。

0234

レドックス切断可能な結合基
切断可能な結合基の1種類は、還元または酸化の際に切断するレドックスの切断可能な結合基である。還元的に切断可能な結合基の例はジスルフィド結合基(−S−S−)である。切断可能な結合基候補が適切な「還元的に切断可能な結合基」であるか、例えば特定のiRNA部分および特定の標的薬剤とともに使用することに適しているか測定するため、本明細書に記載される方法を試みることができる。例えば、候補を、ジチオスレイトール(DTT)、または細胞、例えば標的細胞に認められる切断率を模倣する、当業者に知られる試薬を使用する他の還元剤とともにインキュベートされることによって評価することができる。候補を、血液または血清状態を模倣するように選択された条件下でも評価することができる。

0235

好ましい実施形態では、候補化合物は血液中で最大10%で切断される。好ましい実施形態において、有用な候補化合物は、血液(または細胞外条件を模倣するために選択されたインビトロ条件下)と比べて、細胞において(または細胞内条件を模倣するために選択されたインビトロ条件下で)少なくとも2、4、10、または100倍速く分解される。候補化合物の切断率は、細胞外培地を模倣するために選択した状態と比べて、細胞内培地を模倣するために選択した条件下で酵素反応速度アッセイを使用して測定することができる。

0236

リン酸塩ベースの切断可能な結合基
リン酸塩ベースの結合基はリン酸塩基を分解または加水分解する薬剤によって切断される。細胞においてリン酸塩基を切断する薬剤の例は、細胞におけるホスファターゼ等の酵素である。リン酸塩ベースの結合基の例は、−O−P(O)(ORk)−O−、−O−P(S)(ORk)−O−、−O−P(S)(SRk)−O−、−S−P(O)(ORk)−O−、−O−P(O)(ORk)−S−、−S−P(O)(ORk)−S−、−O−P(S)(ORk)−S−、−S−P(S)(ORk)−O−、−O−P(O)(Rk)−O−、−O−P(S)(Rk)−O−、−S−P(O)(Rk)−O−、−S−P(S)(Rk)−O−、−S−P(O)(Rk)−S−、−O−P(S)(Rk)−S−である。好ましい実施形態は、−O−P(O)(OH)−O−、−O−P(S)(OH)−O−、−O−P(S)(SH)−O−、−S−P(O)(OH)−O−、−O−P(O)(OH)−S−、−S−P(O)(OH)−S−、−O−P(S)(OH)−S−、−S−P(S)(OH)−O−、−O−P(O)(H)−O−、−O−P(S)(H)−O−、−S−P(O)(H)−O−、−S−P(S)(H)−O−、−S−P(O)(H)−S−、−O−P(S)(H)−S−である。好ましい実施形態は、−O−P(O)(OH)−O−である。これらの候補は、上記のものと類似している方法を使用して評価され得る。

0237

酸性の切断可能な結合基
酸性の切断可能な結合基は酸性の状態下で切断される結合基である。好ましい実施形態において、酸性の切断可能な結合基は、約6.5以下(例えば、約6.0、5.5、5.0以下)のpHである酸性環境において、または一般酸として作用することができる酵素等の薬剤で、切断される。細胞内で、エンドソームおよびリソソーム等の特異的に低いpHの小器官は、酸性の切断可能な結合基に対する切断環境を提供することができる。酸性の切断可能な結合基の例は、ヒドラゾン、エステル、およびアミノ酸のエステルを含むがこれらに限定されない。酸性の切断可能な基は一般式の−C=NN−、C(O)O、または−OC(O)を有することができる。好ましい実施形態は、エステル(アルコキシ基)の酸素に結合した炭素がアリール基である場合、置換したアルキル基、またはジメチルペンチルもしくはt−ブチル等の第三アルキル基を供する。これらの候補は、上記のものと類似している方法を使用して評価され得る。

0238

エステルベースの結合基
エステルベースの結合基は、細胞におけるエステラーゼおよびアミダーゼ等の酵素によって切断される。エステルベースの切断可能な結合基の例は、アルキレンアルケニレン、およびアルキニレン基のエステルを含むがこれらに限定されない。エステルの切断可能な結合基は、一般式の−C(O)O−、または−OC(O)−を有することができる。これらの候補は、上記のものと類似している方法を使用して評価され得る。

0239

ペプチドベースの切断基
ペプチドベースの結合基は細胞におけるペプチダーゼおよびプロテアーゼ等の酵素によって切断される。ペプチドベースの切断可能な結合基は、オリゴペプチド(例えば、ジペプチドトリペプチド等)およびポリペプチドを産生するためにアミノ酸間で形成されるペプチド結合である。ペプチドベースの切断可能な基は、アミド基(−C(O)NH−)を含まない。アミド基は、任意のアルキレン、アルケニレン、またはアルキニレン間で形成され得る。ペプチド結合は、ペプチドおよびタンパク質を産生するためにアミノ酸間で形成されるアミド結合の特別な種類である。ペプチドベースの切断基は、一般的に、ペプチドおよびタンパク質を産生するアミノ酸間で形成されるペプチド結合(すなわち、アミド結合)に限定され、アミド官能基の全体を含まない。R1およびR2が2つの隣接アミノ酸R基である場合、ペプチド切断可能な結合基は、一般式の−NHCHR1C(O)NHCHR2C(O)−を有する。これらの候補は、上記のものと類似している方法を使用して評価され得る。

0240

[クリック」反応
本発明の合成方法は、リガンドとクリック−担体化合物とを共役するためのクリックケミストリーを利用する。クリックケミストリー技術は、例えば、本明細書に全てが参考として組み込まれる以下の参照に記載される:
Kolb,H.C.;Finn,M.G.and Sharpless,K.B.Angew.Chem.,Int.Ed.(2001)40:2004−2021.
Kolb,H.C.and Shrapless,K.B.DrugDisc.Today(2003)8:112−1137.
Rostovtsev,V.V.;Green L.G.;Fokin,V.V.and Shrapless,K.B.Angew.Chem.,Int.Ed.(2002)41:2596−2599.
Tornoee,C.W.;Christensen,C.and Meldal,M.J.Org.Chem.(2002)67:3057−3064.
Wang,Q.et al.,J.Am.Chem.Soc.(2003)125:3192−3193.
Lee,L.V.et al.,J.Am.Chem.Soc.(2003)125:9588−9589.
Lewis,W.G.et al.,Angew.Chem.,Int.Ed.(2002)41:1053−1057.
Manetsch,R.et al.,J.Am.Chem.Soc.(2004)126:12809−12818.
Mocharla,V.P.et al.,Angew.Chem.,Int.Ed.(2005)44:116−120。

0241

他のクリックケミストリー官能基を、上記の参照で記載されるもの等、利用することができるが、付加環化反応の使用は、特にアルキニル基を含むアジ化物の反応が好まれる。Cu(I)塩の存在下で、末端アルキンおよびアジ化物は、1,3−双極性付加環化を経て1,4−二置換1,2,3−トリアゾールを形成する。Ru(II)塩(例えばCu*RuCl(PPh3)2)の存在下で、末端アルキンおよびアジ化物は、1,3−双極性付加環化を経て1.5−二置換1,2,3−トリアゾールを形成する(Folkin,V.V.et al.,Org.Lett.(2005)127:15998−15999)。あるいは、1,5−二置換1,2,3−トリアゾールは、アジ化物およびアルキニル試薬を使用して形成され得る(Kraniski,A.;Fokin,V.V.and Sharpless,K.B.Org.Lett.(2004)6:1237−1240。ヘテロ−ディールスアルダー反応または1,3−双極性付加環化反応も使用することができる(例えばPadwa,A.1,3−Dipolar Cycloaddition Chemistry:Volume 1,John Wiley,New York,(1984)1−176、Joergensen,K.A.Angew.Chem.,Int.Ed.(2000)39:3558−3588、およびTietze,L.F.and Kettschau,G.Top.Curr.Chem.(1997)189:1−120)を参照。

0242

(銅がない場合)お互いに対して本質的に非反応であり、他の官能基および反応状態に非常に耐えるため、共役パートナーとしてアジ化物およびアルキンの選択は特に有利である。この化学的適合性は、アジ化物およびアルキンの多くの異なる種類が、最低限の副反応で相互に共役することができることを確実にすることを助ける。

0243

必要な銅種(I)は、安定化リガンドで大抵は第一銅塩、例えばCuI,CuOTf.C6H6、または[Cu(CH3CN)4][PF6]として直接添加される(例えばTornoee,C.W.;Christensen,C.and Meldal,M.J.Org.Chem.(2002)67:3057−3064、Chan,T.R.et al.,Org.Lett.(2004)6:2853−2855、Lewis,W.G.et al.,J.Am.Chem.Soc.(2004)126:9152−9153、Mantovani,G.et al.,Chem.Comm.(2005)2089−2091、Diez−Gonzalez,S.et al.,Chem.Eur.J.(2006)12:7558−7564、およびCandelon,N.et al.,Chem.Comm.(2008)741−743を参照)、またはより多くの場合、還元剤で銅(II)塩から精製される(Rostovtsev,V.V.et al.,Angew.Chem.(2002)114:2708−2711、およびAngew.Chem.,Int.Ed.(2002)41:2596−2599)。金属銅(例えばHimo,F.et al.,J.Am.Chem.Soc.(2005)127:210−216を参照)またはクラスター(例えばPachon,L.D.et al.,Adv.Synth.Catal.(2005)347:811−815、およびMolteni,G.et al.,New J.Chem(2006)30:1137−1139を参照)も利用され得る。Chassaing等は、近年アジ化物−アルキン付加環化に対する触媒として銅(I)ゼオライト報告した(Chem.Eur.J.(2008)14:6713−6721)。銅(I)塩はレドックス処理を起こしやすいため、窒素または亜リン酸ベースのリガンドは、付加環化反応の間に活性銅の触媒を保護および安定するために、添加されなければならない。

0244

反応は、非常に簡単である。アジ化物およびアルキンは、大抵は同時に水およびtert−ブチルアルコール、THF、DMSO、トルエン、またはDMF等の共溶媒に混合される。水/共溶媒は、大抵1:1〜1:9の割合である。軽度の加熱は反応時間を短くするが、反応は、大抵夜通し行われる(Sharpless,W.D.;Wu,P.;Hansen,T.V.;およびLi,J.G.J.Chem.Ed.(2005)82:1833)。水溶液系は、還元剤が必要ないように直接銅(I)種も使用することができる。反応の状態は、その後大抵、共溶媒としてアセトニトリル(必須ではないが(Chan,T.R.;Hilgraf,R.;Shrapless,K.B.およびFokin,V.V.Org.Lett.(2004)6:2853))およびトリエチルアミン、2,6−ルチジンピリジン、およびジイソプロピルアミン等の窒素塩基を必要とする。この場合、銅(I)種はCuI、CuOTf.C6H6、または[Cu(CH3CN)4][PF6]として供給される(Rostoctsev,V.V.;GreenL.G.;Fokin,V.V.およびShrapless,K.B.Angew.Chem.,Int.Ed.(2002)41:2596−2599)。

0245

水ベースの方法は、多くの用途に対して魅力的であるが、溶媒系アジ化物−アルキンの付加環化方法は、溶解度および/または他の問題が生じた場合における有用性を見出した、例えば、以下を参照されたい:
Malkoch,M.et al.,Macromolecules(2005)38:3663.
Gujadhur,R.;Venkataraman,D.and J.T.Kintigh.J.T.Tet.Lett.(2001)42:4791.
Laurent,B.A.and Grayson,S.M.J.Am.Chem.Soc.(2006)128:4238.
Opsteen,J.A.;van Hest,J.C.M.Chem.Commun.(2005)57.
Tsarevsky,N.V.;Sumerlin,B.S.and Matyjaszewski,K.Macromolecules(2005)38:3558.
Johnson,J.A.et al.,J.Am.Chem.Soc.(2006)128:6564.
Sumerlin,B.S.et al.,Macromolecules(2005)38:7540.
Gao,H.F.and Matyjaszewski,K.Macromolecules(2006)39:4960.
Gao,H.et al,Macromolecules(2005)38:8979.
Vogt,A.P.and Sumerlin,B.S.Macromolecules(2006)39:5286.
Lutz,J.F.;Borner,H.G.and Weichenhan,K.Macromol.RapidComm.(2005)26:514.
Mantovani,G.;Ladmiral,V.;Tao,L.and Haddleton,D.M.Chem.Comm.(2005)2089。

0246

クリック反応は、熱的に実施され得る。一態様において、クリック反応は、25℃〜100℃の微熱で実行される。一態様において、反応は25℃〜75℃、または25℃〜65℃、または25℃〜50℃で実施することができる。一実施形態において、反応は室温で実施される。別の態様において、クリック反応はマイクロ波を使用して実施することができる。マイクロ波補助クリック反応は、銅の有無に関わらず実施することができる。

0247

一態様において、本発明は、クリック反応を介してクリック−担体化合物とリガンドとの共役方法を提供する。好ましい実施形態では、クリック反応はアジ化物とアルキニル基との付加環化反応であり銅によって触媒される。一実施形態において、等モル量のアルキンおよびアジ化物は、DCM/MeOH(10:1〜1:1の割合v/v)で混合され、それぞれ0.05〜0.5モル%の[Cu(CH3CN)4][PF6]および銅が反応に添加される。一実施形態において、DCM/MeOHの割合は、5:1〜1:1である。好ましい実施形態では、DCM/MeOHの割合は4:1である。一実施形態において、等モル量の[Cu(CH3CN)4][PF6]および銅が添加される。好ましい実施形態では、それぞれ0.05〜0.25モル%の[Cu(CH3CN)4][PF6]および銅が反応に添加される。より好ましい実施形態において、それぞれ0.05モル%、0.1モル%、0.15モル%、0.2モル%、または0.25モル%の[Cu(CH3CN)4][PF6]および銅が反応に添加される。

0248

「プロドラッグ」という用語は、内因性酵素の作用または他の化学物質および/または状態によって、体内またはその細胞内で活性型(すなわち、薬物)に変換される不活性型に調製された治療薬を示す。特に、本発明のオリゴヌクレオチドのプロドラッグバージョンは、Gosselinらに対して1993年12月9日に公開された国際公開第93/24510号または国際公開第94/26764号の各パンフレットおよびImbachらに対する米国特許第5,770,713号明細書に開示される方法によってSATE[(S−アセチル−2−チオエチル)リン酸塩]の誘導体として調製された。

0249

「薬学的に許容される塩」という用語は、本発明のオリゴマー化合物生理学的におよび薬学的に許容される塩、すなわち親化合物の好ましい生物学的活性を維持しそれに加えて不要中毒学的影響を与えない塩、を指す。オリゴヌクレオチドについて、薬学的に許容される塩の好ましい例およびそれらの使用は、本明細書にずべてが組み込まれる米国特許第6,287,860号明細書にさらに開示される。

0250

リガンド
様々な実体は[クリック」反応を使用してオリゴヌクレオチド、例えばiRNA剤と共役することができる。好ましい実体は様々な場所例えば、3’末端、5’末端、および/または内部の位置でオリゴヌクレオチドと共役することができる。

0251

好ましい実施形態において、リガンドはリンカーを介入してiRNA剤に結合される。化合物が成長している鎖に組み込まれる場合、リガンドは化合物上に存在することができる。いくつかの実施形態において、リガンドを「前駆物質」化合物が成長している鎖に組み込んだ後、「前駆物質」化合物に共役することで組み込むことができる。例えば、アジ化物終結リンカー(すなわち、関連リガンドを有さない)を有する化合物、例えば−リンカー−N3を、成長しているセンスまたはアンチセンス鎖に組み込むことができる。次の作業において、すなわち鎖に前駆体化合物が組み込まれた後、アルキンを有するリガンド、例えば末端アセチレン、例えばリガンド−C≡CHは次に[クリック」反応によって前駆体化合物に結合することができる。あるいは、化合物リンカーはアルキン、例えば末端アセチレンを含み、リガンドは[クリック」反応を起こすためのアジ化物機能を含む。アジ化物またはアルキン機能を、当業者に知られる方法によってリガンドに組み込むことができる。例えば、アジ化物またはアルキン機能を保有する部分をリガンドと結び付けることができるまたはリガンドにおける官能基を、アジ化物またはアルキンに転換することができる。一実施形態において、オリゴヌクレオチドが固形支持体に結合されている間、前駆体化合物とリガンドとの結合は生じる。一実施形態において、オリゴヌクレオチドを保有する前駆物質は、先ず脱保護されるが、リガンド共役が起きる前に精製されない。一実施形態において、オリゴヌクレオチドを保有する前駆体化合物は先ず脱保護され、リガンド共役が起きる前に精製される。ある実施形態では、[クリック」反応はマイクロ波で実施される。

0252

好ましい実施形態において、リガンドは分布、標的または組み込まれるiRNA剤の寿命を変更する。好ましい実施形態において、リガンドは、例えばリガンドなどの不在の種と比較して、選択された標的、例えば分子、細胞もしくは細胞型、コンパートメント、例えば細胞性もしくは臓器コンパートメント、組織、臓器、または体の領域に対して親和性を提供する。好ましいリガンドは二重鎖核酸において二重鎖対形成を起こさないであろう。

0253

好ましいリガンドはエンドソーム溶解の性質を有することができる。エンドソーム溶解リガンドは、エンドソームの溶解および/または本発明の組成物輸送、またはエンドソームから細胞の細胞質までのその成分を促進する。エンドソーム溶解リガンドはポリアニオンペプチドまたはpH依存膜活性および膜融合性を示すペプチド模倣であり得る。ある実施形態では、エンドソーム溶解リガンドはエンドソームのpHにおける活性高次構造を想定する。「活性」高次構造は、エンドソーム溶解リガンドにおける高次構造が、エンドソームの溶解および/または本発明の組成物の輸送、エンドソームから細胞の細胞質までのその成分を促進することである。例示的なエンドソーム溶解リガンドは、GALAペプチド(Subbarao et al.,Biochemistry,1987,26:2964−2972)、EALAペプチド(Vogel et al.,J.Am.Chem.Soc.,1996,118:1581−1586)、およびそれらの誘導体(Turk et al.,Biochem.Biophys.Acta,,2002,1559:56−68)を含む。ある実施形態では、エンドソーム溶解成分電荷における変化またはpHにおける変更に対する反応におけるプロトン化を起こすであろう化学基(例えばアミノ酸)を含むことができる。エンドソーム溶解成分は直線状であるまたは分岐することができる。例示的なペプチドベースのエンドソーム溶解リガンドの一次配列は表1に示される。

0254

0255

好ましいリガンドは、輸送、ハイブリダイゼーション、および特異性の性質を改善することができ、結果としての天然もしくは修飾したオリゴリボヌクレオチドヌクレアーゼ耐性、または本明細書に記載される任意の化合物の組み合わせを含む高分子、および/または天然もしくは修飾したリボヌクレオチドをも改善することができる。

0256

一般にリガンドは、例えば吸収を高めるために、治療の修飾因子、例えば分布を監視するために、診断の化合物またはレポーター基架橋剤、およびヌクレアーゼ耐性授与部分を含むことができる。一般的な例は、脂質、ステロイドビタミン、糖、タンパク質、ペプチド、ポリアミン、およびペプチド模倣体を含む。

0257

リガンドは、タンパク質(例えば、ヒト血清アルブミンHSA)、低密度リポタンパク質(LDL)、高密度リポタンパク質HDL)、またはグロブリン)等の自然発生する物質、炭水化物(例えばデキストランプルランキチンキトサンイヌリンシクロデキストリン、またはヒアルロン酸)、または脂質を含むことができる。リガンドは、合成ポリマー、例えば合成ポリアミノ酸、オリゴヌクレオチド(例えばアプタマー)等の組換えまたは合成分子でもあり得る。ポリアミノ酸の例は、ポリリジンPLL)、ポリアスパラギン酸、ポリL−グルタミン酸スチレン無水マレイン酸共重合体、ポリ(L−ラクチド−co−グリコリド共重合体ジビニルエーテル無水マレイン酸共重合体、N−(2−ヒドロキシプロピルメタクリルアミド共重合体(HMPA)、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリビニルアルコールPVA)、ポリウレタン、ポリ(2−エチル酢酸)、N−イソプロピルアクリルアミドポリマー、またはポリホスファジンを含む。ポリアミンの例は、ポリエチレンイミン、ポリリジン(PLL)、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、疑似ペプチドポリアミン、ペプチド模倣物のポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニンアミジンプロタミンカチオン脂質カチオンポルフィリン、ポリアミンの四級塩、またはアルファヘリックスのペプチドを含む。

0258

リガンドは標的基、例えば細胞または組織標的薬剤、例えばレクチン糖タンパク質、脂質、またはタンパク質、例えば腎細胞等の特定の細胞型と結合する抗体を含むこともできる。標的基は、甲状腺刺激ホルモンメラニン細胞刺激ホルモン、レクチン、糖タンパク質、サーファクタントタンパク質A、ムチン糖鎖、多価ラクトース、多価ガラクトース、N−アセチル−ガラクトサミン、N−アセチル−グルコサミン多価マンノース、多価フコースグリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリンビスホスホネートポリグルタミン酸塩ポリアスパラギン酸塩、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸葉酸ビタミンB12、ビオチン、RGDペプチド、RGDペプチド模倣薬、またはアプタマーであることができる。表2はリガンドおよびその関連受容体を標的とした例のいくつかを示す。

0259

リガンドの他の例は、染色、挿入剤(例えばアクリジン)、架橋剤(例えばソラレンマイトマイシンC)、ポルフィリン(TPPC4、テキサフィリンサフィリン)、ポリ環状芳香族炭化水素(例えばフェナジンジヒドロフェナジン)、人工エンドヌクレアーゼ(例えばEDTA)、親油性分子、例えばコレステロール、コール酸アダマンタン酢酸、1−ピレン酪酸ジヒドロテストステロン、1,3−ビス−O(ヘキサデシルグリセリンゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセリン、ボルネオールメントール、1,3−プロパンジオールヘプタデシル基パルミチン酸ミリスチン酸、O3−(オレオイルリトコール酸、O3−(オレオイル)コレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン)、およびペプチド共役体(例えばアンテナペディアペプチド、Tatペプチド)、アルキル化剤、リン酸塩、アミノ、メルカプト、PEG(例えばPEG−40K)、MPEG、[MPEG]2、ポリアミノ、アルキル、置換したアルキル、放射性標識マーカー、酵素、ハプテン(例えばビオチン)、輸送/吸収促進薬(例えばアスピリンビタミンE、葉酸)、合成リボヌクレアーゼ(例えばイミダゾールビスイミダゾールヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン−イミダゾール共役体、テトラアザ大環状化合物のEu3+複合体)、ジニトロフェニル、HRP、またはAPを含む。

0260

0261

リガンドは、タンパク質、例えば糖タンパク質、またはペプチド、例えばコリガンドに対する特異的親和性を有する分子、または抗体、例えば癌細胞内皮細胞、または骨細胞等の特定の細胞型に結合する抗体であることができる。リガンドは、ホルモンおよびホルモン受容体をも含むことができる。それらは、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補助因子、多価ラクトース、多価ガラクトース、NアセチルガラクトサミンNアセチルグルコサミン多価マンノース、多価フコース、またはアプタマー等の非ペプチド種を含むことができる。リガンドは例えば、リポ多糖、p38MAPキナーゼ活性化因子、またはNF−κBの活性化因子であることができる。

0262

リガンドは、例えば、細胞の細胞骨格分裂するために、例えば細胞の微小管微小線維、および/または中間径フィラメントを分裂するために、物質、例えば細胞へiRNA剤の吸収を増加させることができる薬物であることができる。薬物は、例えば分類群ビンクリスチンビンブラスチンサイトカラシン、ノコダゾール、ジャスプラキノリド、ラトランクリンA、ファロイジン、スウィンホリドA、インダノシン、またはミオセルビンであり得る。

0263

リガンドは、例えば炎症性反応を活性化することによって細胞へのiRNA剤の吸収を増加することができる。かかる影響を有する可能性のある例示的なリガンドは、腫瘍壊死因子アルファ(TNFアルファ)、インターロイキンベータ、またはガンマインターフェロンを含む。

0264

一態様において、リガンドは脂質または脂質ベースの分子である。かかる脂質または脂質ベースの分子は、好ましくは血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン(HSA)と結合する。リガンドと結合するHSAは、標的組織、例えば体の非腎臓標的組織に対する共役体の分布を可能にさせる。例えば、標的組織は肝臓実質細胞を含む肝臓であり得る。HSAと結合する他の分子は、リガンドとして使用されることもできる。例えば、ネプロキシンまたはアスピリンは使用することができる。脂質もしくは脂質ベースのリガンドは、(a)共役体の分解に対する耐性を増加する、(b)標的細胞もしくは細胞膜を標的もしくは輸送を増加することができ、および/または(c)血清タンパク質、例えばHSAとの結合を調整するために使用することができる。

0265

脂質ベースのリガンドは、調節する、例えば共役体と標的組織との結合を制御するために使用することができる。例えば、HASとより強く結合する脂質または脂質ベースリガンドは、腎臓に対して標的とされる可能性が低い、そのため体から取り除かれる可能性は低いであろう。HSAとあまり強く結合しない脂質または脂質ベースのリガンドは、腎臓に対して共役体を標的とするために使用することができる。

0266

好ましい実施形態では、脂質ベースのリガンドはHSAと結合する。好ましくは、共役体が好ましくは非腎臓組織に分布されるように、十分な親和性でHSAと結合される。しかし、HSAリガンド結合は逆行され得ないほど強い親和性が好ましい。

0267

別の好ましい実施形態では、共役体が腎臓に好ましく分布されるように、脂質ベースのリガンドはHSAと弱く結合するまたは全くしない。腎細胞を標的とする他の部分は、脂質ベースのリガンドの変わりにまたは加えて使用されることもできる。

0268

別の態様において、リガンドは、標的細胞、例えば増殖細胞によって取り込まれる部分、例えばビタミンである。これらは、例えば悪性または非悪性型、例えば癌細胞の不必要細胞増殖を特徴とする疾患を治療するために特に有用である。例示的なビタミンはビタミンA、E、およびKを含む。他の例示的なビタミンはBビタミン、例えば葉酸、B12、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサール、または癌細胞によって吸収されたその他のビタミンもしくは栄養素を含む。また、HAS、低密度リポタンパク質(LDL)および高密度リポタンパク質(HDL)も含む。

0269

別の態様において、リガンドは細胞浸透剤、好ましくはらせん細胞浸透剤である。好ましくは、製剤は両親媒性である。例示的な製剤は、tatまたはアンテナペディア等のペプチドである。製剤がペプチドの場合、修飾され得、ペプチジル模倣、インバートマー、非ペプチド、または疑似ペプチド結合、およびD−アミノ酸の使用を含む。らせん製剤は、好ましくは親油性および疎油性相を有するアルファらせん製剤であることが好ましい。

0270

リガンドはペプチドまたはペプチド模倣物であることができる。ペプチド模倣物(本明細書でオリゴペプチド模倣物としても引用される)は、天然ペプチドに似た定義された三次元構造折りたたむことが可能な分子である。ペプチドおよびペプチド模倣物のiRNA剤への結合は、細胞認識および吸収の増強をすることによって等、iRNAの薬物動態分布に影響することができる。ペプチドまたはペプチド模倣部分は、約5〜50アミノ酸長、例えば約5、10、15、20、25、30、35、40、45、または50アミノ酸長であり得る(例については表3を参照)。

0271

0272

ペプチドまたはペプチド模倣物は、例えば細胞浸透ペプチド、カチオンペプチド、両親媒性ペプチド、または疎水性ペプチドであり得る(例えば、第一にTyr、Trp、またはPheからなる)。ペプチド部分はデンドリマーペプチド、制約されたペプチド、または架橋されたペプチドであり得る。別の代替案としては、ペプチド部分は疎水性膜移行配列MTS)を含むことができる。例示的な疎水性MTSを含有するペプチドは、アミノ酸配列AAVALLPAVLLALLAP(配列番号26)を有するRFGFである。疎水性MTSを含むRFGF類似体(例えば、アミノ酸配列AALLPVLLAAP(配列番号27))は、標的部分であることもできる。ペプチド部分は、細胞膜に渡ってペプチド、オリゴヌクレオチド、およびタンパク質を含む大きい極性分子を保有することができる「送達」ペプチドであり得る。例えば、HIVTatタンパク質(GRKKRRQRRRPPQ(配列番号177))およびショウジョウバエアンテナペディアタンパク質(RQKIWFQNRRMKWKK(配列番号11))からの配列は、送達ペプチドとして機能することが可能であることが分かった。ペプチドまたはペプチド模倣物を、ファージディスプレイライブラリー、または1ビーズ1化合物(OBOC)コンビナトリアルライブラリーから同定されたペプチド等のDNAのランダム配列によってコードすることができる(Lam et al.,Nature,354:82−84,1991)。好ましくは組み込まれた化合物ユニットを通してiRNA剤につながれたペプチドまたはペプチド模倣物は、アルギニングリシンアスパラギン酸(RGD)ペプチド、またはRGD模倣物等のペプチドを標的とした細胞である。ペプチド部分は、約5個のアミノ酸〜約40個のアミノ酸の範囲の長さであることができる。ペプチド部分は、安定または直接立体構造性質を増加させる等の構造修飾を有することができる。以下に記載された構造修飾のいずれかを利用することができる。

0273

RGDペプチド部分を、内皮腫瘍細胞または乳癌腫瘍細胞等の腫瘍細胞を標的とするために使用することができる(Zitzmann et al.,Cancer Res.,62:5139−43,2002)。RGDペプチドは、肺、腎臓、脾臓、または肝臓を含む様々な他の組織の腫瘍をiRNA剤の標的にすることを容易にすることができる(Aoki et al.,Cancer Gene Therapy8:783−787,2001)。好ましくは、RGDペプチドは、腎臓をiRNA剤の標的にすることを容易にするであろう。RGDペプチドは直線状または環状であり得、修飾される、例えば、特異的組織を標的とすることを容易にするためにグリコシル化またはメチル化され得る。例えば、グリコシル化されたRGDペプチドは、αVβ3を発現する腫瘍細胞にiRNA剤を送達することができる(Haubner et al.,Jour.Nucl.Med.,42:326−336,2001)。

0274

増殖細胞において濃縮されたマーカーを標的にするペプチドを使用することができる。例えば、ペプチドおよびペプチド模倣物を含むRGDは、癌細胞、特に
インテグリンを示す細胞を標的とすることができる。したがって、RGDペプチド、D−アミノ酸、ならびに合成RGD模倣物を含むRGD、RGDペプチドを含む環状ペプチドを使用することもできる。RGDに加えて、
インテグリンリガンドを標的にする他の部分を使用することができる。一般的に、かかるリガンドを、増殖細胞および血管新生を制御するために使用することができる。PECAM−1、VEGF、または他の癌遺伝子、例えば本明細書に記載される癌遺伝子を標的とするこの種のリガンドの好ましい共役体。

0275

0276

「細胞浸透ペプチド」は、細胞、例えば細菌性もしくは真菌細胞等の微生物細胞、またはヒト細胞等の哺乳動物細胞浸透することができる。微生物細胞に浸透するペプチドは、例えば、αらせん線状ペプチド(例えばLL−37またはCeropin P1)、ジスルフィド結合を含有するペプチド(例えば、αデフェンシン、βデフェンシン、またはバクテネシン)、または1つまたは2つのみの支配的なアミノ酸(例えば、PR−39またはインドリシジン)を含有するペプチドであり得る。細胞浸透ペプチドは、核移行シグナルNLS)も含むことができる。例えば、細胞浸透ペプチドは、HIV−1gp41の融合ペプチドドメインおよびSV40大型T抗原のNLSに由来するMPG等の二分両親媒性ペプチドであることができる(Simeoni et al.,Nucl.AcidsRes.31:2717−2724,2003)。

0277

一実施形態において、iRNA剤および/または担体オリゴマーにつながれた標的ペプチドは、両親媒性α−らせんペプチドであり得る。例示的な両親媒性αらせんペプチドは、セクロピンリコトキシン(lycotoxin)、パラダキシン、ブフォリン、CPF、ボンビニン様ペプチドBLP)、カテリシジンセラトトキシン(ceratotoxin)、S.clavaペプチド、メクラウナギ腸管抗菌ペプチド(HFIAP)、マガイニンブレビニン2、デルマセプチンメリチンプルロシジン(pleurocidin)、H2Aペプチド、ツメガエルペプチド、エスクレンチニス(esculentinis)1、およびカエリン(caerin)を含むがこれらに限定されない。要因の多くは、好ましくはらせん安定の完成性を維持すると考えられるであろう。例えば、らせん安定残基の最大数は、利用され(例えば、ロイシンアラニン、またはリシン)、らせん不安定残基の最小数は、利用されるであろう(例えば、プロリン、または環状化合物ユニット)。キャッピング残基は、検討され(例えばグリシンは例示的なNキャッピング残基であり、および/またはC末端アミド化を、らせんを安定するために必要以上のH結合を提供するために使用することができる。i±3、またはi±4位置によって単離された対立する電荷を含む残基間の塩橋の形成は、安定を提供することができる。例えば、リジン、アルギニン、ホモアルギニンオルニチン、またはヒスチジン等のカチオン残基は、陰イオン性残基グルタミン酸またはアスパラギン酸を含む塩橋を形成することができる。

0278

ペプチドおよびペプチド模倣物のリガンドは、天然発生または修飾したペプチド、例えばDもしくはLペプチドを有するもの、α、β、もしくはγペプチド、Nメチルペプチド、アザペプチド、1つ以上のアミド、すなわちペプチドを有するペプチド、1つ以上の尿素チオ尿素カルバミン酸、もしくはスルホニル尿素結合と交換される結合、または環状ペプチドを含む。

0279

標識リガンドは、特異的受容体を標的とすることが可能である任意のリガンドであり得る。例は、葉酸、GalNAc、GalNAc3、ガラクトース、マンノース、マンノース−6P、GalNAcクラスター、マンノースクラスター、ガラクトースクラスター、またはアプタマー等の糖のクラスター。クラスターは、2つ以上の糖ユニットの組み合わせである。標的リガンドは、インテグリン受容体リガンド、ケモカイン受容体リガンド、トランスフェリン、ビオチン、セロトニン受容体リガンド、PSMA、内皮GCPII、ソマトスタチン、LDL、およびHDLリガンドも含む。リガンドは、核酸、例えばアプタマーを基にすることもできる。アプタマーは、未修飾であるか、または本明細書に開示される修飾の任意の組み合わせを有することができる。

0280

エンドソーム放出剤は、イミダゾール、ポリまたはオリゴイミダゾール、PEI、ペプチド、膜融合ペプチドポリカルボキシレートポリカチオン遮蔽されるオリゴまたはポリカチオンもしくはアニオンアセタールポリアセタールケタールポリケタールオルトエステル、遮蔽されるまたは曝露されるカチオンまたは陰イオン性電荷を含むポリマー、遮蔽されるまたは曝露されるカチオンまたは陰イオン性電荷を含むデンドリマーを含む。

0281

PK修飾薬は薬物動態修飾薬を表す。PK修飾薬は、脂肪親和性、胆汁酸、ステロイド、リン脂質類似体、ペプチド、タンパク質結合剤、PEG、ビタミン等を含む。例示的PK修飾薬は、コレステロール、脂肪酸、コール酸、リトコール酸、ジアルキルグリセリドジアシルグリセリドリン脂質スフィンゴ脂質ナプロキセンイブプロフェン、ビタミンE、ビオチン等を含むがこれらに限定されない。多くのホスホロチオエート結合を含むオリゴヌクレオチドは、血清タンパク質と結合することで知られる、したがって主鎖においてホスホロチオエート結合の複数を含む短オリゴヌクレオチド、例えば約5塩基、10塩基、15塩基、または20塩基のオリゴヌクレオチドは、リガンドとして(例えばリガンドを調節するPKとして)本発明も受け入れられる。

0282

さらに、血清成分(例えば血清タンパク質)と結合するアプタマーは、リガンドを調節するPKとして本発明も受け入れられる。

0283

本発明を受け入れられる他のリガンドは、全ての目的に対して全てが参照により組み込まれる2004年8月10日に出願された同時係属中の米国特許出願第10/916,185号、2004年9月21日に出願された同第10/946,873号、2007年8月3日に出願された同第10/833,934号、2005年4月27日に出願された同第11/115,989号、および2007年9月21日に出願された同第11/944,227号の各明細書に記載される。

0284

2つ以上のリガンドが存在する場合は、全てのリガンドは同じ性質を有すること、異なる性質を有する、またはいくつかのリガンドは同じ性質を有するが他は異なる性質を有することができる。例えば、リガンドは標的性質を有し、エンドソーム溶解活性を有する、または性質を調節するPKを有することができる。好ましい実施形態では、全てのリガンドは異なる性質を有する。

0285

リガンド、例えばクリック担体化合物を含む化合物は、オリゴヌクレオチド、例えばiRNA剤の任意の位置において存在することができる。いくつかの実施形態において、クリック担体化合物は、iRNA剤の5’または3’末端等の終端において存在することができる。クリック担体化合物はiRNA剤の内部位置において存在することもできる。二本鎖iRNA剤に対して、クリック担体化合物を1つのまたは両方の鎖に組み込むことができる。いくつかの実施形態において、二本鎖iRNA剤のセンス鎖はクリック担体化合物を含む。他の実施形態において、二本鎖iRNA剤のアンチセンス鎖は、クリック担体化合物を含む。

0286

いくつかの実施形態において、リガンドを、核酸塩基、糖部分、または核酸分子インターヌクレオシド結合と共役することができる。プリン核酸塩基またはその誘導体との共役は、環内および環外原子を含む任意の位置で発生することができる。いくつかの実施形態において、プリン核酸塩基の2−、6−、7−、または8−の位置は、共役体部分に結合する。ピリミジン核酸塩基またはその誘導体との共役は、任意の位置で発生することもできる。いくつかの実施形態において、ピリミジン核酸塩基の2−、5−、および6−の位置を、共役体部分と置換することができる。ヌクレオシドの糖部分との共役は、任意の炭素原子で発生することができる。共役体部分に結合することができる糖部分の炭素原子の例は、2’、3’、および5’の炭素原子を含む。1’の位置は脱塩基残基等の共役体部分に結合することもできる。インターヌクレオシド結合は、共役体部分を有することもできる。リンを含有する結合(例えばリン酸ジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミド酸等)に対して、共役体部分はリン原子に直接またはリン原子に結合されたO、N、またはS原子に結合することができる。アミンもしくはアミドを含有するインターヌクレオシド結合(例えばPNA)に対して、共役体部分はアミンもしくはアミドの窒素原子または隣接する炭素原子に結合することができる。

0287

オリゴマー化合物の共役体を調製するための方法がいくつもある。一般的に、オリゴマー化合物は、共役体部分における反応基でオリゴマー化合物における反応基(例えばOH、SH、アミン、カルボキシルアルデヒド等)に接触することによって共役体部分に結合する。いくつかの実施形態において、1つの反応基は求電子性であり、他は求核性である。

0288

例えば、求電子基カルボニルを含有する機能であり得、求核基アミンまたはチオールであり得る。結合基の有無の関係なしに、核酸と関係オリゴマー化合物との結合の方法は、例えば、本明細書において全体が参照により組み込まれるManoharanのAntisense Research and Applications,Crooke and LeBleu,eds.,CRCPress,Boca Raton,Fla.,1993,Chapter 17等の文献によく記載される。

0289

オリゴヌクレオチドの共役体の調製を教える代表的な米国特許は、それぞれが本明細書に参照により組み込まれる、米国特許第4,828,979号、同第4,948,882号、同第5,218,105号、同第5,525,465号、同第5,541,313号、同第5,545,730号、同第5,552,538号、同第5,578,717号、同第5,580,731号、同第5,580,731号、同第5,591,584号、同第5,109,124号、同第5,118,802号、同第5,138,045号、同第5,414,077号、同第5,486,603号、同第5,512,439号、同第5,578,718号、同第5,608,046号、同第4,587,044号、同第4,605,735号、同第4,667,025号、同第4,762,779号、同第4,789,737号、同第4,824,941号、同第4,835,263号、同第4,876,335号、同第4,904,582号、同第4,958,013号、同第5,082,830号、同第5,112,963号、同第5,214,136号、同第5,082,830号、同第5,112,963号、同第5,149,782号、同第5,214,136号、同第5,245,022号、同第5,254,469号、同第5,258,506号、同第5,262,536号、同第5,272,250号、同第5,292,873号、同第5,317,098号、同第5,371,241号、同第5,391,723号、同第5,416,203号、同第5,451,463号、同第5,510,475号、同第5,512,667号、同第5,514,785号、同第5,565,552号、同第5,567,810号、同第5,574,142号、同第5,585,481号、同第5,587,371号、同第5,595,726号、同第5,597,696号、同第5,599,923号、同第5,599,928号、同第5,672,662号、同第5,688,941号、同第5,714,166号、同第6,153,737号、同第6,172,208号、同第6,300,319号、同第6,335,434号、同第6,335,437号、同第6,395,437号、同第6,444,806号、同第6,486,308号、同第6,525,031号、同第6,528,631号、および同第6,559,279号の各明細書を含むがこれらに限定されない。

0290

オリゴヌクレオチド
本明細書で使用されるとき、「オリゴヌクレオチド」という用語は、全てが本明細書に定義される未修飾RNA、修飾RNA、またはヌクレオシド代替を指す。修飾はiRNA剤と関連して記載されるが、これらの修飾はアンチセンス、アンタゴmir、アプタマー、リボザイム、およびデコイオリゴヌクレオチド等の本発明の他のオリゴヌクレオチドに適用されることもできると理解される。多数の修飾RNAおよびヌクレオシド代替は記載されるが、好ましい例はヌクレアーゼ分解に対して未修飾RNAよりも大きい抵抗を有するものを含む。好ましい例は、2’糖修飾を有するもの、一本鎖オーバーハングにおける修飾、好ましくは3’一本鎖オーバーハング、または特に一本鎖の場合、1つ以上のリン酸塩基またはリン酸塩基の1つ以上の類似体を含む5’修飾を含む。

0291

本明細書で使用されるとき、「iRNA剤」は、標的遺伝子、好ましくは内在性または病原体標的RNAの発現を下方制御することができるRNA剤に切断され得るRNA剤である。理論に縛られることを望まないが、iRNA剤は、当業者にRNAi、または転写前もしくは翻訳前メカニズムと称されることもある標的mRNAの転写後の切断を含む多くのメカニズムのうちの1つ以上によって作用することができる。iRNA剤は一本鎖を含むことができる、または一つ以上の鎖を含むことができる、例えば二本鎖iRNA剤であることができる。iRNA剤が一本鎖である場合、1つ以上のリン酸塩基または1つ以上のリン酸塩基の類似体を含む5’修飾を含むことが特に好ましい。iRNA剤は二本鎖である場合、二本鎖領域は二本鎖領域における2つ以上の鎖、例えば2つの鎖、例えば3つの鎖を含むことができる。

0292

iRNA剤は、標的遺伝子に対する十分な相同性の領域を含み、iRNA剤、またはその断片が標的遺伝子の下方制御を媒介することができるように、ヌクレオチドに関して十分な長さであるべきである。(解説を簡単にするために、ヌクレオチドまたはリボヌクレオチドという用語は、本明細書でRNA剤の1つ以上の化合物サブユニットに関連して使用されることがある。本明細書における「リボヌクレオチド」または「ヌクレオチド」という用語の使用は、修飾RNAまたはヌクレオチド代替の場合、1つ以上の位置における修飾ヌクレオチドまたは代替交換部分も指すことが理解されるであろう。)したがって、iRNA剤は、少なくとも部分的およびいくつかの実施形態において、標的RNAに対して完全に、相補的である領域であるまたは含む。iRNA剤と標的との間に完全相補性があることは必要ではないが、一致は、例えば標的RNA、例えばmRNAのRNAi切断によって直接配列特異的サイレンシングするためにiRNA剤またはその切断製品を可能にするために十分でなければならない。

0293

iRNA剤は、多くの場合、修飾されるまたはクリック担体化合物に加えてヌクレオシド代替を含むであろう。iRNA剤の一本鎖領域は、多くの場合修飾されるまたはヌクレオシド代替を含む、例えば不対領域またはヘアピン構造の領域、例えば2つの相補的領域に連結する領域は、修飾またはヌクレオシド代替を有することができる。1つ以上のiRNA剤の3’または5’終端、例えばエキソヌクレアーゼに対して安定するため、またはRISCに進入するためにアンチセンスsRNA剤を支持するための修飾も支持される。修飾はC3(またはC6、C7、C12)アミノリンカーチオールリンカー、カルボキシルリンカー、非ヌクレオチドスペーサー(C3、C6、C9、C12、脱塩基、トリエチレングリコールヘキサエチレングリコール)、特別なビオチンまたはホスホラミダイトとして生じる、および合成の間複数の共役を可能にする別のDMT保護ヒドロキシル基を有するフルオレセイン試薬を含むことができる。

0294

本明細書で使用されるとき、「一本鎖iRNA剤」は、単一分子で構成されているiRNA剤である。iRNA剤は鎖内対形成で形成される二重鎖領域を含む、例えば、ヘアピンまたはパンハンドル構造である、または含むことができる。一本鎖iRNA剤は、標的分子に関して好ましくはアンチセンスである。好ましい実施形態において、一本鎖iRNA剤は5’リン酸化である、または5’終端でホスホリル類似体を含む。5’リン酸塩修飾は、RISC媒介遺伝子サイレンシングに矛盾しないものを含む。適切な修飾は、5’モノリン酸塩((HO)2(O)P−O−5’)、5’二リン酸塩((HO)2(O)P−O−P(HO)(O)−O−5’)、5’三リン酸塩((HO)2(O)P−O−(HO)(O)P−O−P(HO)(O)−O−5’)、5’グアノシンキャップ(7メチル化または非メチル化)(7m−G−O−5’−(HO)(O)P−O−(HO)(O)P−O−P(HO)(O)−O−5’)、5’アデノシンキャップ(Appp)、および任意の修飾または未修飾ヌクレオチドキャップ構造(N−O−5’−(HO)(O)P−O−(HO)(O)P−O−P(HO)(O)−O−5’)、5’モノチオリン酸塩(ホスホロチオエート、(HO)2(S)P−O−5’)、5’モノホスホロジチオエート塩(ホスホロジチオエート、(HO)(HS)(S)P−O−5’)、5’ホスホロチオレート((HO)2(O)P−S−5’)、任意の酸素/硫黄交換モノリン酸塩の追加組み合わせ、二リン酸塩および三リン酸塩(例えば、5’アルファチオ三リン酸塩、5’ガンマチオ三リン酸等)、5’ホスホロアミド酸((HO)2(O)P−NH−5’、(HO)(NH2)(O)P−O−5’)、5’アルキルホスホン酸塩(R=アルキル=メチル、エチル、イソプロピル、プロピル等、例えばRP(OH)(O)−O−5’−、(OH)2(O)P−5’−CH2−)、5’アルキルエーテルホスホン酸塩(R=アルキルエーテル=メトキシメチル(MeOCH2−)、エトキシメチル等、例えばRP(OH)(O)−O−5’−)を含む。(これらの修飾は、複数鎖iRNA剤のアンチセンス鎖と使用されることもできる。)
本明細書で使用されるとき、「複数鎖iRNA剤」は、2つ以上の鎖、例えば二本鎖iRNA剤を含むiRNA剤である。鎖は、二重鎖領域を形成し、ヘアピン、パンハンドル構造、ループ、またはバルジを含むことができる。iRNA剤の少なくとも1つの鎖は、標的分子に関して、好ましくはアンチセンスである。

0295

複数鎖iRNA剤の1つのみ、2つのみ、または全ての鎖を修飾することが望ましいであろう。場合によっては、それらは同じ修飾または同じ種類の修飾を有するであろうが、他の場合は、異なる鎖は異なる修飾を有するであろう、例えば一部の場合、一つの鎖のみを修飾することが望ましい。いくつかの鎖のみを修飾する、例えば不活性化することが望ましいであろう、例えば鎖は不活性化するおよび活性iRNA/タンパク質またはRISCの形成を防止することができるために修飾される。これは、例えば5’−O−メチルリボヌクレオチドで修飾によって、鎖の5’リン酸化を防止する修飾で達成され得る(Nykaenen et al.,(2001)ATPrequirements and small interfering RNA structure in the RNA interference pathway.Cell 107,309−321を参照。)。リン酸化を防止する他の修飾は、使用されることもできる、例えば単にO−Meよりも、5’−OHをHで置換する。あるいは、リン酸ジエステラーゼが、連鎖を切断し、機能iRNA5’末端放出することができるため、これは望ましくないかもしれないが、大型の巨大基は、5’リン酸塩に添加され得、リン酸ジエステル連鎖に変化する。アンチセンス鎖修飾は、5’リン酸化ならびに本明細書に論じられる他の5’修飾のいずれか、特定に一本鎖iRNA分子の項に論じられる5’修飾を含む。

0296

場合によっては、異なる鎖は、異なる修飾を含むであろう。複数の異なる修飾を、鎖のそれぞれに含むことができる。ある鎖における修飾は、相互に異なることができ、他の鎖における様々な修飾と異なることもできる。例えば、1つの鎖は修飾、例えば本明細書に記載される修飾を有することができ、異なる鎖は異なる修飾、例えば本明細書に記載される修飾を含むことができる。他の場合、1つの鎖は、2つ以上の異なる修飾を有することができ、別の鎖は、他の鎖における少なくとも2つの修飾と異なる修飾を含むことができる。

0297

iRNA剤が分子の一方または両方の末端において一本鎖または不対領域を含むように、鎖が選択されることが好ましい。したがって、iRNA剤は、好ましくはオーバーハング、例えば1つまたは2つの5’または3’のオーバーハング、しかし好ましくは2〜3のヌクレオチドの3’のオーバーハングを含有するために対にされた、鎖を2つ以上含有する。ほとんどの実施形態は3’オーバーハングを有するであろう。好ましいiRNA剤は、それぞれの末端に1個または好ましくは2個または3個のヌクレオチド長の、一本鎖のオーバーハング、好ましくは3’のオーバーハングを有するであろう。オーバーハングは、1つの鎖が他よりも長い、または同じ長さの2つの鎖がねじれ型であるため生じることができる。

0298

鎖間の二重鎖領域の好ましい長さは、6〜30個のヌクレオチド長である。好ましい二重鎖領域は、15〜30、最も好ましくは18、19、20、21、22、および23個のヌクレオチド長である。他の好ましい二重鎖領域は、6〜20個のヌクレオチド、最も好ましくは6、7、8、9、10、11、および12ヌクレオチド長である。複数鎖のiRNA剤では、形成された異なる二重鎖は異なる長さを有することができる、例えば鎖AとBとの間に形成された二重鎖領域は、鎖AとCとの間に形成された二重鎖領域よりも異なる長さを有することができる。

0299

2つより多くの鎖の二重鎖剤を含むiRNA剤において、同じ長さであり、長いdsRNAの天然ダイサー処理製品構築することができる。iRNA剤の2つ以上の鎖の実施形態は、連結される、例えば共有結合的な連結も含まれる。必要な二本鎖領域および好ましくは3’のオーバーハングを提供するヘアピンまたは他の一本鎖構造も本発明内である。

0300

核酸はサブユニットのポリマーまたは化合物であるため、以下に記載される多くの修飾は核酸内で繰り返される位置、例えば塩基の修飾、またはリン酸塩部分、またはリン酸塩部分の非架橋酸素において発生する。場合によっては、修飾は核酸の全ての対象位置において発生されるであろうが、多くの場合および実際はほとんどの事例で発生しないであろう。一例として、修飾は3’または5’末端の位置にのみ発生することができ、内部不対領域にのみ発生することができ、末端領域にのみ、例えば末端ヌクレオチド上の位置において、または鎖の最後の2、3、4、5、または10個のヌクレオチドにおいて発生することができる。修飾は二本鎖領域、一本鎖領域、または両方において発生することができる。修飾はRNA剤の二本鎖領域においてのみ発生することができる、またはRNA剤の一本鎖領域においてのみ発生することができる。例えば、非架橋酸素の位置におけるホスホロチオエート修飾は一方または両方の終端においてのみ発生することができ、末端領域でのみ、例えば末端ヌクレオチド上の位置においてまたは鎖の最後の2、3、4、5、または10個のヌクレオチドにおいて、発生することができ、二本鎖および一本鎖領域、特に終端において発生することができる。5’末端またはその複数を、リン酸化することができる。

0301

いくつかの実施形態において、例えば安定を増強すること、オーバーハングにおける特定の塩基を含むこと、または一本鎖オーバーハングにおいて、例えば5’または3’オーバーハング、または両方において、修飾したヌクレオチドまたはヌクレオチド代替を含むことが特に好ましい。例えば、オーバーハングにおいてプリンヌクレオチドを含むことは望ましいことであり得る。いくつかの実施形態において、例えば本明細書に記載される修飾で、3’または5’のオーバーハングにおける全てまたはいくつかの塩基は修飾されるであろう。修飾は例えばリボース糖の2’のOH基における修飾の使用、例えばデオキシリボヌクレオチドの使用、例えばリボヌクレオチドの代わりにチミジン、およびリン酸塩基、例えばホスホチオエート修飾における修飾を含むことができる。オーバーハングは標的配列相同である必要はない。

0302

マイクロRNA
マイクロRNA(miRNAまたはmir)は、植物および動物のゲノムにおけるDNAから転写される小さいRNA分子の高度に保存された種類であるが、タンパク質に翻訳されない。プレマイクロRNAは、miRNAに処理される。処理されたマイクロRNAは、RNA誘導サイレンシング複合体(RISC)に組み込まれる一本鎖〜17〜25ヌクレオチド(nt)RNA分子であり、発症、細胞増殖、アポトーシス、および分化の主要制御因子として同定された。それらは、特異的mRNAの3’非翻訳領域と結合することによって、遺伝子発現の制御において役割を果たすと考えられている。RISCは翻訳抑制、転写物切断、または両方を通して、遺伝子発現の下方制御を媒介する。RISCは、幅広い範囲の真核生物の核において転写サイレンシングにも結びつけられる。

0303

マイクロRNAは宿主における病原体の調節にも結びつけられる。例えば、Jopling,C.Lら、Science(2005)vol.309,pp1577−1581を参照。理論に縛られることを望まないが、マイクロRNA、マイクロRNA模倣物、および/または抗マイクロRNAオリゴヌクレオチドの投与は、病原体の生存率、成長、発症、および/または複製の調節を引き起こす。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドはマイクロRNA、マイクロRNA模倣物、および/または抗マイクロRNAであり、マイクロRNAは宿主マイクロRNAである。

0304

これまでに同定されたmiRNA配列の数は大きく、増加しており、それらの説明に役立つ実例は、例えば、“miRBase:microRNA sequences,targets and gene nomenclature”Griffiths−Jones S,Grocock RJ,van Dongen S,Bateman A,Enright AJ.NAR,2006,34,Database Issue,D140−D144、“The microRNA Registry”Griffiths−Jones S.NAR,2004,32,Database Issue,D109−D111、およびワールドワイドウェブhttp://microrna.dot.sanger.dot.ac.dot.uk/sequences/においても見出すことができる。

0305

リボザイム
リボザイムは、エンドヌクレアーゼ活性を持つ特異的触媒ドメインを有するオリゴヌクレオチドである(Kim and Cech,Proc Natl Acad Sci U S A.1987 Dec;84(24):8788−92;Forster and Symons,Cell.1987Apr 24;49(2):211−20)。少なくとも6つの基本的な種類の天然発生酵素RNAは現在知られている。一般に、酵素核酸は標的RNAと先ず結合することによって作用する。かかる結合は、標的RNAを切断するために作用する分子の酵素部分の近くに保持される酵素核酸の標的結合部分を通して発生する。したがって、酵素核酸は、先ず認識し、そして標的RNAを、相補的塩基対形成を通じて結合し、正しい部位に結合された時点で、標的RNAを切断するために酵素的に作用する。かかる標的RNAの戦略的な切断は、コードされたタンパク質の直接合成をする能力を破壊するであろう。酵素核酸が結合しそのRNA標的を切断した後、別の標的を探すためにそのRNAから放出され、繰り返し結合し新しい標的を切断することができる。

0306

任意の標的配列を標的にしたリボザイムの産生の方法は、当該技術分野において既知である。リボザイムは、国際公開第93/23569号および国際公開第94/02595号の各パンフレットに記載されるように設計され得、それぞれ具体的に本明細書に参照により組み込まれ、その中に記載されるようにインビトロおよびインビボで試験されるために合成される。

0307

アプタマー
アプタマーは、高い親和性および特異性で、対象の特定の分子に結合する核酸またはペプチド分子である(Tuerk and Gold,Science 249:505(1990);Ellington and Szostak,Nature 346:818(1990))。DNAまたはRNAアプタマーは、うまく産生され、大きいタンパク質から小さい有機分子までの多くの異なる実体と結合する。Eaton,Curr.Opin.Chem.Biol.1:10−16(1997)、Famulok,Curr.Opin.Struct.Biol.9:324−9(1999)、およびHermann and Patel,Science 287:820−5(2000)を参照。アプタマーは、RNAまたはDNAベースであることができる。一般的に、アプタマーは、小分子、タンパク質、核酸、およびさらに細胞、組織、および生物等の様々な分子標的と結合するために、インビトロ選択のラウンドを繰り返してまたは同等に、SELEX(試験管進化法)で操作された。アプタマーは、合成、組換え、および精製方法を含む、任意の既知の方法で調製され得、単独でまたは同じ標的に対して特異的な他のアプタマーと組み合わせて使用することができる。さらに、本明細書でより詳細に記載される、「アプタマー」という用語は具体的に、ある規定の標的と2つ以上の既知のアプタマーを比べることによって生じる共通配列を含有する「二次アプタマー」を含む。

0308

デコイオリゴヌクレオチド
転写因子は、周囲のゲノムDNAがなくても、それらの比較的短い結合配列を認めるため、特定の転写因子の共通結合配列を有する短いオリゴヌクレオチドは、生細胞において遺伝子発現を操縦するための道具として使用され得る。この戦略は、標的因子によって認められて結合されるかかる「デコイオリゴヌクレオチド」の細胞内送達に関与する。デコイによる転写因子のDNA結合部位占領は、標的遺伝子のプロモーター領域と次に結合することができない転写因子を与える。デコイは、転写因子によって活性化される遺伝子の発現を抑制するため、または転写因子の結合によって抑制される遺伝子を上方制御するため、治療薬として使用され得る。デコイオリゴヌクレオチドの例は、Mann et al.,J.Clin.Invest.,2000,106:1071−1075に見出すことができ、本文献は、参照により本明細書に明確に組み込まれる。

0309

miRNA模倣物
miRNA模倣物は、1つ以上のmiRNAの遺伝子調節活性を模倣するために使用され得る分子の種類を表す。したがって、「マイクロRNA模倣物」という用語は、RNAi経路に侵入することができる合成非コードRNA(すなわち、miRNAは、内在性miRNAの源からの精製によって得られない)および制御遺伝子発現を指す。miRNA模倣物は、成熟分子(例えば一本鎖)または模倣前駆物質(例えばpriまたはpre−miRNA)として設計され得る。

0310

一設計において、miRNA模倣物は、二本鎖分子であり(例えば、約16〜約31個の間のヌクレオチド長の二重鎖領域とともに)、あるmiRNAの成熟鎖と同定される1つ以上の配列を含む。二本鎖miRNA模倣物は、二本鎖オリゴヌクレオチドに対して上記されるものに似た設計を有する。

0311

一実施形態において、miRNA模倣物は、16〜31個の間のヌクレオチドの二重鎖領域および以下の化学修飾パターンのうちの1つ以上を含む。センス鎖は、(センスオリゴヌクレオチドの5’末端から数えて)ヌクレオチド1および2の2’−O−メチル修飾およびCおよびUの全てを含み、アンチセンス鎖修飾は、CおよびUの全ての2’F修飾、オリゴヌクレオチドの5’末端のリン酸化、および2ヌクレオチド3’オーバーハングと関連する安定したヌクレオチド間結合を含む。

0312

スーパーmir(Supermir)
スーパーmirは、実質的にmiRNAと同一であるヌクレオチド配列を有し、その標的に関してアンチセンスであるオリゴヌクレオチド、例えば一本鎖、二本鎖、または部分的に二本鎖を指す。この用語は、同様に機能する少なくとも1つの非天然発生部分を含むオリゴヌクレオチドを含む。好ましい実施形態では、スーパーmirは、センス鎖を含まない、および別の好ましい実施形態では、スーパーmirはかなりの範囲で自己ハイブリッド形成しない。本発明に特性付けられたスーパーmirは二次構造を有すことができるが、生理学的状態下で、実質的に一本鎖である。実質的に一本鎖であるスーパーmirは、スーパーmirの約50%未満(例えば、約40%、30%、20%、10%、または5%未満)が、それ自身と二重鎖にすると言う点で一本鎖である。スーパーmirは、ヘアピンセグメント、例えば配列を含むことができ、好ましくは3’末端で自己ハイブリッド形成でき、二重鎖領域、例えば少なくとも1、2、3、または4の二重鎖領域、および好ましくは8、7、6、または5個のヌクレオチド未満、例えば5個のヌクレオチドを形成する。二重鎖領域は、リンカー、例えばヌクレオチドリンカー、例えば3、4、5、または6dT、例えば修飾dTによって結合され得る。別の実施形態では、スーパーmirは、例えば3’および5’末端の一方または両方において、または一方の末端および非末端において、またはスーパーmirの真ん中において、短いオリゴ、例えば5、6、7、8、9、または10個のヌクレオチド長で二重鎖にされる。

0313

アンチmirまたはmiRNA抑制剤
「アンチmir」「マイクロRNA抑制剤」または「miR抑制剤」という用語は、同義語であり、オリゴヌクレオチドまたは特異的miRNAの活性を妨げる修飾したオリゴヌクレオチドを指す。抑制剤は、一本鎖、二本鎖(RNA/RNAまたはRNA/DNA二重鎖)、およびヘアピン設計を含む、様々な配置を採用することができ、一般に、マイクロRNA抑制剤は、標的にするために、miRNAの成熟鎖(または鎖)と相補的である配列または配列部分のうちの1つ以上を含み、さらに、miRNA抑制剤は成熟miRNAの逆相補体である配列と5’および3’に位置する追加配列も含むことができる。追加配列は、成熟miRNA由来のpri−miRNAにおいて成熟miRNAに隣接する配列の逆相補体であることができる、または追加配列は、(A、G、C、U、またはdTの混合物を有する)任意の配列であることができる。いくつかの実施形態において、追加配列の一方または両方は、ヘアピンを形成することができる任意の配列である。したがって、いくつかの実施形態において、miRNAの逆相補体である配列は、ヘアピン構造によって5’側および3’側上で隣接される。マイクロRNA抑制剤は、二本鎖の場合、反対の鎖においてヌクレオチド間のミスマッチを含むことができる。さらに、マイクロRNA抑制剤は、細胞の抑制剤の吸収を容易にするために共役体部分と結び付けることができる。

0314

ヘアピンmiRNA抑制剤を含むマイクロRNA抑制剤は、それぞれが参照により本明細書に全てが組み込まれる、Vermeulenらの“Double−Stranded Regions Are Essential Design Components Of Potent Inhibitors ofRISCFunction”RNA13:723−730(2007)および国際公開第2007/095387号、および国際公開第2008/036825号の各パンフレットに詳細が記載される。当業者は、所望のmiRNAに対してデータベースから配列を選択し、本明細書に開示される方法に対して有用な抑制剤を設計することができる。

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