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課題

可動部を備えたハイブリッド免疫グロブリン、並びに関連する組成物及び使用方法及び製造方法の提供。更に、類似の遺伝子デバイス、並びに関連する組成物及び使用方法及び製造方法の提供。

解決手段

連続アミノ酸の第1区域と連続アミノ酸の第2区域ははそれぞれ、その予め定めた末端システイン残基またはセレノシステイン残基を有し、それらのシステイン残基またはそれらのセレノシステイン残基は下記の構造を有する結合で連結している。(各Xは同一であり、硫黄(S)またはセレン(Se)を表わし、各Cは前記のシステイン残基またはセレノシステイン残基のうちの1つのベータ炭素を表わす)。

概要

背景

本明細書全体を通して種々の刊行物を参照する。本明細書および特許請求の範囲に記載する本発明の時点で当業者既知である技術水準をより十分に記載するために、これらの刊行物の開示内容全体を本明細書に援用する。

あらゆるマシーンおよびデバイス可動部をもつ。可動部の機能は、有用なタスクを実行するためにエネルギー源を変換することにより作業を行なうことである。可動部は、ある範囲のサイズおよび形状に及ぶ。その範囲の一端には、機械的タスクを実行するマシーンに明らかな可視世界がある。その領域の他端には、電気的作業を実行するデバイスに用いられる電荷担体不可視世界がある。

この範囲はきわめて広いので、その特定の領域は技術開発が始まったばかりである。これらには、数ナノメートルないし数百ナノメートルの可動部を備えたデバイスが含まれる。それは化学物質基本単位である分子のサイズそのものに匹敵するので、このサイズ範囲は多くの科学者および技術者にかなりの関心が持たれている。ナノマシーンは、分子間結合または触媒作用など独特分子特性開拓する可能性をもつ。

想定しうるいかなるサイズおよび形状の分子も作製できる能力は、ナノマシーンの構築に際してきわめて重要なことのひとつである。
したがって、それは医薬エレクトロニクス光学、および他の多くの分野で広く期待されている。膨大な商業活動が化学的に異なるきわめて多数の分子の合成に注目している。しかし、分子コンフィギュレーション分子形態)(結合の相異)は多様性を生み出す実際的手段のひとつにすぎない。分子コンホメーション(結合の回転の相異)は、連続したサイズおよび形状の領界を生み出すためのもうひとつの重要な手段を提供する。

分子コンホメーションは、可動部を備えた分子を作製するための方法において特定の独自の利点をもつ。原子および化学結合は線および角度において厳密な寸法をもつけれども、コンホメーション変化は分子のサイズおよび形状における無限の変動をもたらす可能性がある。共有結合および非共有化学結合は共に回転自由度をもたらす。分子の異なる部分(ドメイン)を接続する一連の結合それぞれの周りの二面体回転は、ナノマシーンの本質的な動的構成要素を提供することができる。

通常は、単結合(すなわち、単一の電子対)で相互に連結されたいずれか2つの特定の原子は、相互に、およびそれぞれが結合している他の原子に対して、完全に360度回転できる。一連の連続単結合は、一連の相互に連結された玉継手に類似する。回転運動に限定されるが、一連の連続単結合は、一連の連続した玉継手と同様に、他のタイプの相互連結された可動部(たとえば一連の連続ヒンジ)の運動再現することができる。

有用なナノマシーン作製のひとつの難点は、可動部の個数と相互連結の個数のバランスをとることである。特定の閾値を超えると、いずれかのマシーン中の部品または接続の個数を増加させるのは逆効果である。よって自動車エンジンには、最適個数ピストンバルブカム軸プーリーなどを用いる。

化学分野における同様な難点は、関連するけれども著しく異なる2つのタイプの分子、すなわち有機ポリマーおよび生物学的ポリマーにより例示される。ポリエチレンタンパク質が好適な比較となる。ポリエチレンは連続エチレン区域(stretch)(CH2)nが連続単結合(−C−)nにより相互連結したものであり、一方、タンパク質は連
アミノ酸の区域(NHCHRCO)nが連続ペプチド結合(=N−C−C=)nにより相互連結したものである。非分枝ポリエチレンは単結合の反復鎖であり、一方、タンパク質は1つの二重結合に2つの単結合が続く反復鎖である。これら2タイプの鎖の間の最も重要な相異は、ポリエチレンはほとんどいかなるコンホメーションも受け入れることができ、したがって明確なサイズまたは形状がなく(統計的に平均したものにすぎない)、一方、タンパク質はきわめて剛性であり、したがってきわめて明確な(かつ変化しない)サイズおよび形状をもつことである。

機械的デバイスとの単純ではあるが妥当な比較は、可動部と接続部の比率が高いマシーンとしてのポリエチレンと、可動部と接続部の比率が低いマシーンとしてのタンパク質であろう。それぞれが形成しうるさらに高次の構造を利用しない限り、いずれの分子もマシーン様タスクにきわめて好適というわけではない。たとえば、ポリエチレンは分子間繊維を形成するその能力を利用すれば有用である。興味深いことに、ポリエチレンがそのような三次元構造を示す能力はそれの固有フレキシビリティーに依存する。あるタンパク質は商業的に価値のある繊維(たとえば羊毛およびコラーゲン)を形成しうるが、大部分のタンパク質は小球状であり、繊維を形成しない。

小球状タンパク質は、ほとんどすべての実用的な目的にとって可動部をほとんど(たとえ含むとしても)含まないマシーンである;たとえば、それを操作するヒトとそれが押し込まれる物体など、他の物体との組合わせにおいてその効力を発揮しなければならない金てこと同様。それにもかかわらず、相対的ではあるがなおかつ協調した(coordinated)運動が可能なある様式で互いに連結した明確な領域(たとえば結合ドメイン)をもつタンパク質様の分子に、大きな価値があると思われる多くの例がある。一例は、2以上の同一結合部位をもつ疾患ターゲット協同的に(cooperatively)結合しうるタンパク質様の分子であろう。これは小球状タンパク質結合ドメインの独特の特性、すなわちターゲット、特に疾患に関連する他のタンパク質に対するそれらの大きな特異性を十分に利用していると思われる。

疾患ターゲットを協同結合しうるタンパク質様の分子の潜在的な商業的価値を、定量的に推定することができる。出発点となる仮定は、現在用いられている大部分の療法薬は低分子または生物製剤のいずれであっても、一般にそれらのターゲットをナノモル濃度水準アフィニティー定数(10−9M)で非協同的に結合することである。注目すべきことに、協同作用療法薬は同一ターゲットをナノモル×ナノモル濃度(10−9M×10−9M)[すなわちアトモル濃度(10−18M)]で結合することができると考えられる。

療法薬は一般にそれらのターゲットより大幅に過剰モル濃度(約100万倍)で必要なので、協同作用療法薬は10−6少ない用量で非協同作用療法薬と同等であろう。現在の多くの生物製剤(たとえば抗体およびイムノアドヘンシン(immunoadhesin)類)について、この差は1回量当たり1グラムの代わりに1回量当たり1マイクログラムになる。グラム当たり1,000米ドルを超える患者コストに関して、この因数新規薬物の知見および開発において、ならびに既存の生物製剤について、大きな重要性をもつ。

抗体およびイムノアドヘシン類に関連する1つのアイニーは、それらは2つの同一結合ドメインをもつ対称タンパク質であるけれども通常は対称的ターゲットに対称的に結合するわけではないということである。2つの結合ドメイン間の連結がフレキシブルでないことにより、協同結合を可能にするマシーン様の動きが得られない。対称的に結合する抗体およびイムノアドヘシン類を工学的に作製する多数の試みは、結合部位とターゲット部位の間の相補的対称性に必要な厳密な幾何学的構造を達成するのが困難であるため失敗している。一般的なマシーンの作製に用いられる材料、たとえば木材、金属、プラスチック
セラミックなどと異なり、分子は厳密なサイズおよび形状に切断、工作鋳造機械加工または接合するのが容易ではない。

したがって、いずれか単一の固定されたサイズおよび形状では協同結合は容易には達成できないが、結合ドメイン間のコンホメーションのフレキシビリティーは有望な解決策を実際に提供する。“1サイズがすべてに適合する(one size fits all)”方策は、対称的に動く結合ドメインを備えたタンパク質様の分子は対称的に(すなわち協同的に)結合することもできるであろうという提案に基づく。これらの結合ドメインはコンホメーションにおいて両ターゲット部位の同時結合に最も適合する状態へ熱力学的に駆動される;それがコンホメーションにおいてエネルギー的に好ましい最低状態だからである。

概要

可動部を備えたハイブリッド免疫グロブリン、並びに関連する組成物及び使用方法及び製造方法の提供。更に、類似の遺伝子デバイス、並びに関連する組成物及び使用方法及び製造方法の提供。連続アミノ酸の第1区域と連続アミノ酸の第2区域ははそれぞれ、その予め定めた末端システイン残基またはセレノシステイン残基を有し、それらのシステイン残基またはそれらのセレノシステイン残基は下記の構造を有する結合で連結している。(各Xは同一であり、硫黄(S)またはセレン(Se)を表わし、各Cは前記のシステイン残基またはセレノシステイン残基のうちの1つのベータ炭素を表わす)。なし

目的

分子コンホメーション(結合の回転の相異)は、連続したサイズおよび形状の領界を生み出すためのもうひとつの重要な手段を提供する

効果

実績

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請求項1

下記を含む化合物連続アミノ酸の第1区域:そのそれぞれはその前のアミノ酸ペプチド結合により結合しており、その配列はあるターゲットに対する結合部位を含む;および連続アミノ酸の第2区域:そのそれぞれはその前のアミノ酸にペプチド結合により結合しており、その配列は連続アミノ酸の第1区域の配列と同一であり、かつ前記ターゲットに対する同一結合部位を含む;その際、アミノ酸の第1区域およびアミノ酸の第2区域はそれぞれ、その予め定めた末端システイン残基またはセレノシステイン残基を有し、それらのシステイン残基またはそれらのセレノシステイン残基は下記の構造を有する結合で連結している:(各Xは同一であり、硫黄(S)またはセレン(Se)を表わし、各Cは前記のシステイン残基またはセレノシステイン残基のうちの1つのベータ炭素を表わす)。

請求項2

請求項1の化合物であって、結合が下記の構造を有する化合物:

請求項3

請求項1の化合物であって、結合が下記の構造を有する化合物:

請求項4

請求項1の化合物であって、連続アミノ酸の第1区域および第2区域のそれぞれの予め定めた末端にある残基がシステイン残基である化合物。

請求項5

請求項1の化合物であって、連続アミノ酸の第1区域および第2区域のそれぞれの予め定めた末端にある残基がセレノシステイン残基である化合物。

請求項6

請求項1の化合物であって、連続アミノ酸の第1区域または連続アミノ酸の第2区域が少なくとも20個のアミノ酸を含む化合物。

請求項7

請求項1の化合物であって、連続アミノ酸の第1区域または連続アミノ酸の第2区域が少なくとも100個のアミノ酸を含む化合物。

請求項8

下記を含む化合物:連続アミノ酸の第1区域:そのそれぞれはその前のアミノ酸にペプチド結合により結合しており、その配列はあるターゲットに対する結合部位を含む;および連続アミノ酸の第2区域:そのそれぞれはその前のアミノ酸にペプチド結合により結合しており、その配列は連続アミノ酸の第1区域の配列と異なり、かつ異なる部分に対する結合部位を含む;その際、アミノ酸の第1区域およびアミノ酸の第2区域はそれぞれ、その予め定めた末端にシステイン残基またはセレノシステイン残基を有し、それらの残基は下記の構造を有する結合で連結している:(各Xは同一でも異なってもよく、硫黄(S)またはセレン(Se)を表わし、各Cは前記のシステイン残基またはセレノシステイン残基のうちの1つのベータ−炭素を表わす)。

請求項9

請求項8の化合物であって、結合が下記の構造を有する化合物:

請求項10

請求項8の化合物であって、結合が下記の構造を有する化合物:

請求項11

請求項8の化合物であって、結合が下記の構造を有する化合物:

請求項12

請求項8の化合物であって、結合が下記の構造を有する化合物:

請求項13

請求項8の化合物であって、アミノ酸の第1区域およびアミノ酸の第2区域のそれぞれの予め定めた末端にある残基が両方ともシステイン残基である化合物。

請求項14

請求項8の化合物であって、アミノ酸の第1区域およびアミノ酸の第2区域のそれぞれの予め定めた末端にある残基が両方ともセレノシステイン残基である化合物。

請求項15

請求項8の化合物であって、連続アミノ酸の第1区域または第2区域のうちの1つの予め定めた一方の末端にある残基がシステイン残基であり、予め定めた他方の末端にある残基がセレノシステイン残基である化合物。

請求項16

請求項8の化合物であって、連続アミノ酸の第1区域または連続アミノ酸の第2区域が少なくとも20個のアミノ酸を含む化合物。

請求項17

請求項8の化合物であって、連続アミノ酸の第1区域または連続アミノ酸の第2区域が少なくとも100個のアミノ酸を含む化合物。

請求項18

請求項1または8のいずれかに記載される2以上の同一化合物が少なくとも1つの結合により互いに連結したものを含む多量体

請求項19

請求項18の多量体であって、二量体である多量体。

請求項20

請求項18の多量体であって、三量体である多量体。

請求項21

請求項18の多量体であって、四量体である多量体。

請求項22

請求項1または8のいずれかの化合物であって、アミノ酸の第1区域とアミノ酸の第2区域の両方の予め定めた末端がそのN−末端である化合物。

請求項23

請求項1または8のいずれかの化合物であって、アミノ酸の第1区域とアミノ酸の第2区域の両方の予め定めた末端がそのC−末端である化合物。

請求項24

請求項1または8のいずれかの化合物であって、アミノ酸の第1区域およびアミノ酸の第2区域のうちの一方の予め定めた末端がC末端であり、他方の予め定めた末端がN末端である化合物。

請求項25

請求項1または8の化合物であって、アミノ酸の第1区域がL−アミノ酸を含む化合物。

請求項26

請求項1または8の化合物であって、アミノ酸の第1区域がD−アミノ酸を含む化合物。

請求項27

請求項1または8の化合物であって、アミノ酸の第1区域がL−アミノ酸およびD−アミノ酸を含む化合物。

請求項28

請求項8の化合物であって、アミノ酸の第2区域がL−アミノ酸を含む化合物。

請求項29

請求項8の化合物であって、アミノ酸の第2区域がD−アミノ酸を含む化合物。

請求項30

請求項8の化合物であって、アミノ酸の第2区域がL−アミノ酸およびD−アミノ酸を含む化合物。

請求項31

請求項1または8の化合物であって、アミノ酸の第1区域が少なくとも50個の連続アミノ酸を含む化合物。

請求項32

請求項8の化合物であって、アミノ酸の第2区域が少なくとも50個の連続アミノ酸を含む化合物。

請求項33

請求項1または8の化合物であって、アミノ酸の第1区域が1種類より多いアミノ酸を含む化合物。

請求項34

請求項1または8の化合物であって、アミノ酸の第2区域が1種類より多いアミノ酸残基を含む化合物。

請求項35

請求項18の多量体であって、1以上の結合がジスルフィド結合を含む多量体。

請求項36

請求項8の化合物であって、アミノ酸の第2区域の配列が免疫グロブリン定常部の配列に相応する化合物。

請求項37

請求項8の化合物であって、免疫グロブリンがヒト免疫グロブリンである化合物。

請求項38

請求項8の化合物であって、免疫グロブリンの定常部が、IgGIgAIgEIgD、またはIgM免疫グロブリンの定常部である化合物。

請求項39

請求項8の化合物であって、免疫グロブリンの定常部が、IgG−1、IgG−2、IgG−3、またはIgG−4免疫グロブリンの定常部である化合物。

請求項40

請求項8の化合物であって、免疫グロブリンの定常部がIgG免疫グロブリンの定常部であり、そして、ヒンジ部、CH6領域およびCH3領域を含む化合物。

請求項41

請求項8の化合物であって、異なる部分がイムノエフェクターまたはイムノレギュレーターである化合物。

請求項42

請求項1または8の化合物であって、ターゲットがタンパク質である化合物。

請求項43

請求項1または8の化合物であって、ターゲットが、EGF受容体HER2、VEGF受容体、CD20抗原、CD11a、IgE免疫グロブリン、グリコプロテインIIa受容体、グリコプロテインIIIa受容体、TNFアルファ、またはTNF受容体、gp120である化合物。

請求項44

請求項1の化合物であって、連続アミノ酸の第1区域および第2区域のそれぞれが、TNFRSF1a、TNFRSF1b、VEGFR1、VEGFR6、VEGFR3、ヒトErb1、ヒトErb2、ヒトErb6、ヒトErb3、またはヒトErb4のうちのいずれか1つのアミノ酸配列を含む化合物。

請求項45

請求項8の化合物であって、連続アミノ酸の第1区域または第2区域が、前記のTNFRSF1a、TNFRSF1b、VEGFR1、VEGFR6、VEGFR3、ヒトErb1、ヒトErb2、ヒトErb6、ヒトErb3、またはヒトErb4のうちのいずれか1つのアミノ酸配列を含む化合物。

請求項46

ターゲットを結合するのに有効な量の請求項1の化合物、およびキャリヤーを含む、組成物

請求項47

ターゲットを結合するのに有効な量の請求項8の化合物、およびキャリヤーを含む、組成物。

請求項48

ターゲットを結合するのに有効な量の請求項18の多量体、およびキャリヤーを含む、組成物。

請求項49

請求項48の組成物であって、多量体が異なる部分をも結合するのに有効な量で存在する組成物。

請求項50

請求項46、47、48または49のいずれか1項の組成物であって、キャリヤーが医薬的に許容できるキャリヤーである組成物。

請求項51

ターゲットの活性に影響を及ぼす方法であって、化合物がターゲットに結合してその活性に影響を及ぼす条件下で、ターゲットを請求項46、47、48または49の組成物と接触させることを含む方法。

請求項52

請求項51の方法であって、ターゲットへの組成物の結合によりターゲットの活性が増大する方法。

請求項53

請求項51の方法であって、ターゲットへの組成物の結合によりターゲットの活性が低下する方法。

請求項54

請求項51の方法であって、ターゲットが、EGF受容体、HER2タンパク質、VEGF受容体、CD20抗原、CD11a、IgE免疫グロブリン、グリコプロテインIIa受容体、グリコプロテインIIIa受容体、TNFアルファ、またはTNF受容体である方法。

請求項55

請求項1、8または18のいずれかの組成物、および連続アミノ酸の第3区域を含む複合体であって、連続アミノ酸の第3区域が連続アミノ酸の第1区域または第2区域のうち一方に1またはそれ以上の結合により結合している複合体。

請求項56

請求項55の複合体であって、1またはそれ以上の結合がファンデルワールス力を含む複合体。

請求項57

請求項55の複合体であって、1またはそれ以上の結合が水素結合を含む複合体。

請求項58

請求項55の複合体であって、1または結合が共有結合を含む複合体。

請求項59

請求項55の複合体であって、1または結合がジスルフィド結合を含む複合体。

請求項60

請求項18の多量体であって、少なくとも1つの結合がジスルフィド結合である多量体。

請求項61

請求項18の多量体であって、ジスルフィド結合が2つの非末端アミノ酸残基の間にある多量体。

請求項62

請求項18の多量体であって、ジスルフィド結合が2つのアミノ酸残基の間にあり、それらのうち少なくとも一方は非末端アミノ酸残基である多量体。

請求項63

請求項1の化合物を調製する方法であって、下記を含む方法:(a)(i)その配列がN−末端シグナル配列である第1部分、これと接した(ii)その配列が連続アミノ酸の区域をコードする第2部分、これと接した(iii)その配列がC−末端インテイン含有結合ドメインをコードする第3部分を含む、組換え核酸により、連続アミノ酸の区域がC−末端インテイン含有結合ドメインと接したものを含むキメラポリペプチドの合成を可能にする条件下で、細胞トランスフェクションし;(b)工程(a)で産生されたキメラポリペプチドを単離し;(c)キメラポリペプチドを、連続アミノ酸の区域からC−末端インテイン含有結合ドメインのチオ仲介開裂が起き、それがC−末端チオエステル置換されるように処理し;(d)工程(c)の生成物を、生成物へのシステイン残基の結合が可能となり、これによりC−末端システインを含む生成物が形成されるように処理し;そして(e)工程(e)の生成物を工程(e)の別の生成物の存在下において、前記化合物の形成が可能な条件下で酸化する。

請求項64

請求項63の方法であって、組換え核酸がSEQIDNO.1〜8のいずれかの1つに示す配列を有する方法。

請求項65

請求項63の方法であって、C−末端インテイン含有結合ドメインがインテイン−キチン結合ドメインである方法。

請求項66

請求項63の方法であって、C−末端インテイン含有結合ドメインがMthRIR1インテイン−キチン結合ドメインである方法。

請求項67

請求項63の方法であって、工程b)においてアフィニティークロマトグラフィーによりキメラポリペプチドを単離する方法。

請求項68

請求項63の方法であって、工程b)において生成物をキチン誘導体樹脂曝露することによりキメラポリペプチドを単離する方法。

請求項69

請求項63の方法であって、酸化条件は生成物それぞれのC−末端システイン間にジスルフィド結合の形成が可能になるものである方法。

請求項70

独立してフォールディングするタンパク質ドメインが第2の独立してフォールディングするタンパク質ドメインに非ペプチド結合により融合したものを含む化合物。

請求項71

末端システイン残基を含む第1ポリペプチド鎖がそれのS−末端において末端システイン残基を含む第2ポリペプチド鎖のS−末端に融合したものを含む化合物。

請求項72

末端セレノシステイン残基を含む第1ポリペプチド鎖がそれのSe−末端において末端システイン残基を含む第2ポリペプチド鎖のS−末端に融合したものを含む化合物。

請求項73

末端セレノシステイン残基を含む第1ポリペプチド鎖がそれのSe−末端において末端セレノシステイン残基を含む第2ポリペプチド鎖のSe−末端に融合したものを含む化合物。

請求項74

請求項70〜73のいずれかの1項に記載される2以上の同一化合物が少なくとも1つの結合により互いに連結したものを含む多量体。

請求項75

N−末端システインを含む連続アミノ酸の区域を調製する方法であって、下記を含む方法:(a)(i)その配列がN−末端シグナル配列をコードする第1部分、これと接した(ii)その配列がN−末端システイン残基を含む連続アミノ酸の区域をコードする第2部分を含む、組換え核酸により、下記を可能にする条件下で細胞をトランスフェクションし:(i)N−末端シグナル配列がそれのC−末端においてペプチド結合により連続アミノ酸の区域のN−末端システインに連結したものを含む、キメラポリペプチドが合成され、そして(ii)N−末端シグナル配列が細胞内でキメラポリペプチドから開裂し、これによりN−末端システインを含む連続アミノ酸の区域が産生される;(b)工程(a)で産生された連続アミノ酸の区域を回収する。

請求項76

請求項75の方法であって、連続アミノ酸の区域が免疫グロブリンFcポリペプチドを含む方法。

請求項77

請求項76の方法であって、免疫グロブリンFcポリペプチドがヒト免疫グロブリンFcポリペプチドである方法。

請求項78

請求項77の方法であって、N−末端システイン残基がヒト免疫グロブリンFcポリペプチドのCys−5残基である方法。

請求項79

請求項75の方法であって、細胞が293ヒト胚細胞またはCHO−K1ハムスター卵巣細胞である方法。

請求項80

請求項75の方法であって、トランスフェクションがプラスミドpSAを用いて実施される方法。

請求項81

請求項75の方法であって、N−末端シグナル配列がN−末端システインを有するタンパク質から選択される方法。

請求項82

請求項83

請求項75の方法であって、連続アミノ酸の区域をアフィニティークロマトグラフィーにより回収する方法。

請求項84

請求項75の方法であって、細胞内でのキメラポリペプチドの開裂が細胞性シグナルペプチダーゼにより行なわれる方法。

請求項85

N−末端システインまたはセレノシステインを含む連続アミノ酸の区域を調製する方法であって、下記を含む方法:(a)(i)その配列がN−末端シグナル配列をコードする第1部分、これと接した(ii)その配列がN−末端システイン残基を含む連続アミノ酸の区域をコードする第2部分を含む、組換え核酸により、下記を可能にする条件下で細胞をトランスフェクションし:(i)N−末端シグナル配列がそれのC−末端においてFcポリペプチドのN−末端システインに連結したものを含む、キメラポリペプチドが合成され、そして(ii)N−末端シグナル配列が細胞内でキメラポリペプチドから開裂し、これによりN−末端システインを含む連続アミノ酸の区域が産生される;(b)工程(a)で産生された連続アミノ酸の区域のN−末端を、アミノ酸配列cys−asp−lys−thr−his−thrを含むペプチドのC−末端と、またはアミノ酸配列sec−asp−lys−thr−his−thrを含むペプチドとライゲートさせ、これによりN−末端システインまたはセレノシステインを含む連続アミノ酸の区域を生成させ;そして(c)工程(b)で生成した連続アミノ酸の区域を回収する。

請求項86

請求項85の方法であって、連続アミノ酸の区域が免疫グロブリンFcポリペプチドを含む方法。

請求項87

請求項85の方法であって、免疫グロブリンFcポリペプチドがヒト免疫グロブリンFcポリペプチドである方法。

請求項88

請求項87の方法であって、N−末端システイン残基がヒト免疫グロブリンFcポリペプチドのcys−5残基である方法。

請求項89

請求項85の方法であって、N−末端システイン残基がヒト免疫グロブリンFcポリペプチドのcys−11残基である方法。

請求項90

請求項85の方法であって、工程(b)のペプチドがアミノ酸配列cys−asp−lys−thr−his−thrを含み、生成した連続アミノ酸の区域がN−末端システインを含む方法。

請求項91

請求項85の方法であって、工程(b)のペプチドがアミノ酸配列sec−asp−lys−thr−his−thrを含み、生成した連続アミノ酸の区域がN−末端セレノシステインを含む方法。

請求項92

請求項85の方法であって、工程(b)のペプチドをライゲーションの前にN−末端Msc保護基で保護する方法。

請求項93

請求項85の方法であって、細胞が293ヒト胚細胞またはCHO−K1ハムスター卵巣細胞である方法。

請求項94

請求項85の方法であって、トランスフェクションがプラスミドpSAを用いて実施される方法。

請求項95

請求項85の方法であって、N−末端シグナル配列がN−末端システインを有するタンパク質から選択される方法。

請求項96

請求項85の方法であって、シグナルペプチドがソニックヘッジホッグ、インターフェロンアルファ−2またはコレステロールエステルトランスフェラーゼである方法。

請求項97

請求項85の方法であって、連続アミノ酸の区域をアフィニティークロマトグラフィーにより回収する方法。

請求項98

請求項85の方法であって、細胞内でのキメラポリペプチドの開裂が細胞性シグナルペプチダーゼにより行なわれる方法。

請求項99

C−末端システインまたはC−末端セレノシステインを含む連続アミノ酸の区域を調製する方法であって、下記を含む方法:(a)(i)その配列がN−末端シグナル配列をコードする第1部分、これと接した(ii)その配列が連続アミノ酸の区域をコードする第2部分、これと接した(iii)その配列がC−末端インテイン含有結合ドメインをコードする第3部分を含む、組換え核酸により、下記を可能にする条件下で細胞をトランスフェクションし:(i)N−末端シグナル配列、これと接した連続アミノ酸の区域、これと接したC−末端インテイン含有結合ドメインを含む、キメラポリペプチドが合成され、そして(ii)N−末端シグナル配列がキメラポリペプチドから開裂し、これによりN−末端リジン残基を有しかつ連続アミノ酸の区域がC−末端インテイン含有結合ドメインと接したものを含む、第2キメラポリペプチドが産生される;(b)工程(a)で産生された第2キメラポリペプチドを単離し;(c)第2キメラポリペプチドを、連続アミノ酸の区域からC−末端インテイン含有結合ドメインのチオ仲介開裂が起き、これによりC−末端チオエステルが形成されるように処理し;(d)工程(c)の生成物をそれのC−末端においてシステイン残基またはセレノシステイン残基とライゲートさせ、これによりC−末端システインまたはC−末端セレノシステインを含む生成物を形成させ;そして(e)工程(d)の生成物を回収する。

請求項100

請求項99の方法であって、接した連続アミノ酸の区域がIgG免疫グロブリンFcポリペプチドおよびIgGM1エキソンを含む方法。

請求項101

請求項100の方法であって、IgG免疫グロブリンがヒトIgG免疫グロブリンである方法。

請求項102

請求項99の方法であって、接した連続アミノ酸の区域がCD4細胞外ドメインを含む方法。

請求項103

請求項99の方法であって、N−末端シグナル配列がN−末端リジンを有するタンパク質から選択される方法。

請求項104

請求項99の方法であって、N−末端シグナル配列がCD2T細胞表面糖タンパク質またはCD4T細胞表面糖タンパク質である方法。

請求項105

請求項99の方法であって、細胞が293ヒト胚細胞またはCHO−K1ハムスター卵巣細胞である方法。

請求項106

請求項99の方法であって、トランスフェクションがプラスミドpSAを用いて実施される方法。

請求項107

請求項99の方法であって、C−末端インテイン含有結合ドメインがインテイン−キチン結合ドメインである方法。

請求項108

請求項99の方法であって、C−末端インテイン含有結合ドメインがMthRIR1インテイン−キチン結合ドメインである方法。

請求項109

請求項99の方法であって、C−末端インテイン含有結合ドメインが自己スプライシングインテイン含有結合ドメインである方法。

請求項110

請求項99の方法であって、工程b)において生成物をキチン誘導体化樹脂に曝露することによりキメラポリペプチドを単離する方法。

請求項111

請求項99の方法であって、細胞内での第2キメラポリペプチドの開裂が細胞性シグナルペプチダーゼにより行なわれる方法。

請求項112

請求項99の方法であって、工程(c)の生成物がシステイン残基とライゲートさせる方法。

請求項113

請求項99の方法であって、工程(c)の生成物がセレノシステイン残基とライゲートさせる方法。

請求項114

N−末端システインおよびC−末端システインまたはセレノシステインを含む連続アミノ酸の区域を調製する方法であって、下記を含む方法:(a)(i)その配列がN−末端シグナル配列をコードする第1部分、これと接した(ii)その配列が連続アミノ酸の区域をコードする第2部分、これと接した(iii)その配列がC−末端インテイン含有結合ドメインをコードする第3部分を含む、組換え核酸により、下記を可能にする条件下で細胞をトランスフェクションし:(i)N−末端シグナル配列、これと接した連続アミノ酸の区域、これと接したC−末端インテイン含有結合ドメインを含む、キメラポリペプチドが合成され、そして(ii)N−末端シグナル配列がキメラポリペプチドから開裂し、これによりN−末端システイン残基を有しかつ連続アミノ酸の区域がC−末端インテイン含有結合ドメインと接したものを含む、第2キメラポリペプチドが産生される;(b)工程(a)で産生された第2キメラポリペプチドを単離し;(c)第2キメラポリペプチドを、連続アミノ酸の区域からC−末端インテイン含有結合ドメインのチオ仲介開裂が起き、これによりC−末端チオエステルが形成されるように処理し;(d)工程(c)の生成物をそれのC−末端においてシステイン残基またはセレノシステイン残基とライゲートさせ、これによりC−末端システインまたはC−末端セレノシステインを含む生成物を形成させ;そして(e)工程(d)の生成物を回収する。

請求項115

請求項114の方法であって、接した連続アミノ酸の区域がIgG免疫グロブリンFcポリペプチドおよびIgGM1エキソンを含む方法。

請求項116

請求項115の方法であって、IgG免疫グロブリンがヒトIgG免疫グロブリンである方法。

請求項117

請求項114の方法であって、N−末端シグナル配列がN−末端システインを有するタンパク質から選択される方法。

請求項118

請求項114の方法であって、N−末端システイン残基がヒト免疫グロブリンFcポリペプチドのcys−5残基である方法。

請求項119

請求項114の方法であって、N−末端システイン残基がヒト免疫グロブリンFcポリペプチドのcys−11残基である方法。

請求項120

請求項114の方法であって、N−末端シグナルがソニックヘッジホッグ、インターフェロンアルファ−2またはコレステロールエステルトランスフェラーゼである方法。

請求項121

請求項114の方法であって、細胞が293ヒト胚細胞またはCHO−K1ハムスター卵巣細胞である方法。

請求項122

請求項114の方法であって、トランスフェクションがプラスミドpSAを用いて実施される方法。

請求項123

請求項114の方法であって、C−末端インテイン含有結合ドメインがインテイン−キチン結合ドメインである方法。

請求項124

請求項114の方法であって、C−末端インテイン含有結合ドメインがMthRIR1インテイン−キチン結合ドメインである方法。

請求項125

請求項114の方法であって、C−末端インテイン含有結合ドメインが自己スプライシングインテイン含有結合ドメインである方法。

請求項126

請求項114の方法であって、工程b)において生成物をキチン誘導体化樹脂に曝露することにより第2キメラポリペプチドを単離する方法。

請求項127

請求項114の方法であって、工程e)においてアフィニティークロマトグラフィーにより生成物を回収する方法。

請求項128

請求項114の方法であって、細胞内でのキメラポリペプチドの開裂が細胞性シグナルペプチダーゼにより行なわれる方法。

請求項129

請求項114の方法であって、工程(c)の生成物がシステイン残基とライゲートさせる方法。

請求項130

請求項114の方法であって、工程(c)の生成物がセレノシステイン残基とライゲートさせる方法。

請求項131

N−末端システインまたはセレノシステインおよびC−末端システインまたはセレノシステインを含む連続アミノ酸の区域を調製する方法であって、下記を含む方法:(a)(i)その配列がN−末端シグナル配列をコードする第1部分、これと接した(ii)その配列が連続アミノ酸の区域をコードする第2部分、これと接した(iii)その配列がC−末端インテイン含有結合ドメインをコードする第3部分を含む、組換え核酸により、下記を可能にする条件下で細胞をトランスフェクションし:(i)N−末端シグナル配列、これと接した連続アミノ酸の区域、これと接したC−末端インテイン含有結合ドメインを含む、キメラポリペプチドが合成され、そして(ii)N−末端シグナル配列がキメラポリペプチドから開裂し、これによりN−末端システイン残基を有しかつ連続アミノ酸の区域がC−末端インテイン含有結合ドメインと接したものを含む、第2キメラポリペプチドが産生される;(b)工程(a)で産生された第2キメラポリペプチドを単離し;(c)(i)工程(a)で産生された連続アミノ酸の区域のN−末端を、cys−asp−lys−thr−his−thrを含むペプチドのC−末端と、またはアミノ酸配列sec−asp−lys−thr−his−thrを含むペプチドとライゲートさせ、これによりそれぞれN−末端システインまたはN−末端セレノシステインを含む連続アミノ酸の区域を形成させ;(ii)キメラポリペプチドを、連続アミノ酸の区域からC−末端インテイン含有結合ドメインのチオ仲介開裂が起き、それがC−末端チオエステルで置換されるように処理し;(iii)工程(c)の生成物をそれのC−末端においてシステイン残基またはセレノシステイン残基とライゲートさせ、これによりC−末端システインまたはセレノシステインを含む生成物を形成させ;そして(d)工程(c)(iii)の生成物を回収する。

請求項132

請求項131の方法であって、接した連続アミノ酸の区域がIgG免疫グロブリンFcポリペプチドおよびIgGM1エキソンを含む方法。

請求項133

請求項132の方法であって、IgG免疫グロブリンがヒトIgG免疫グロブリンである方法。

請求項134

請求項131の方法であって、N−末端シグナル配列がN−末端システインを有するタンパク質から選択される方法。

請求項135

請求項131の方法であって、N−末端システイン残基がヒト免疫グロブリンFcポリペプチドのcys−11残基である方法。

請求項136

請求項131の方法であって、N−末端シグナル配列がN−末端システインを有するタンパク質から選択される方法。

請求項137

請求項131の方法であって、N−末端シグナルがソニックヘッジホッグ、インターフェロンアルファ−2またはコレステロールエステルトランスフェラーゼである方法。

請求項138

請求項131の方法であって、細胞が293ヒト胚細胞またはCHO−K1ハムスター卵巣細胞である方法。

請求項139

請求項131の方法であって、トランスフェクションがプラスミドpSAを用いて実施される方法。

請求項140

請求項131の方法であって、C−末端インテイン含有結合ドメインがインテイン−キチン結合ドメインである方法。

請求項141

請求項131の方法であって、C−末端インテイン含有結合ドメインがMthRIR1インテイン−キチン結合ドメインである方法。

請求項142

請求項131の方法であって、工程b)において生成物をキチン誘導体化樹脂に曝露することによりキメラポリペプチドを単離する方法。

請求項143

請求項131の方法であって、免疫グロブリンFcポリペプチドがヒト免疫グロブリンFcポリペプチドである方法。

請求項144

請求項131の方法であって、FcポリペプチドのN−末端システイン残基がcys−11残基である方法。

請求項145

請求項131の方法であって、工程(c)(i)のペプチドがアミノ酸配列cys−asp−lys−thr−his−thrを含み、生成した連続アミノ酸の区域がN−末端システインを含む方法。

請求項146

請求項131の方法であって、工程(c)(i)のペプチドがアミノ酸配列sec−asp−lys−thr−his−thrを含み、生成した連続アミノ酸の区域がN−末端セレノシステインを含む方法。

請求項147

請求項131の方法であって、工程(c)(i)のペプチドをライゲーションの前にN−末端Msc保護基で保護する方法。

請求項148

請求項131の方法であって、細胞が293ヒト胚細胞またはCHO−K1ハムスター卵巣細胞である方法。

請求項149

請求項131の方法であって、トランスフェクションがプラスミドpSAを用いて実施される方法。

請求項150

請求項131の方法であって、N−末端シグナル配列がN−末端システインを有するタンパク質から選択される方法。

請求項151

請求項131の方法であって、シグナルペプチドがソニックヘッジホッグ、インターフェロンアルファ−2またはコレステロールエステルトランスフェラーゼである方法。

請求項152

請求項131の方法であって、連続アミノ酸の区域をアフィニティークロマトグラフィーにより回収する方法。

請求項153

請求項131の方法であって、工程(c)を工程(c)(i);工程(c)(ii);工程(c)(iii)の順序で実施する方法。

請求項154

請求項131の方法であって、工程(c)を工程(c)(ii);工程(c)(iii);工程(c)(i)の順序で実施する方法。

請求項155

下記の連続アミノ酸の区域を還元条件下で接触させてこれにより化合物を製造すること含む、化合物の製造方法:連続アミノ酸の区域:そのそれぞれはその前のアミノ酸にペプチド結合により結合しており、その配列はあるターゲットに対する結合部位を含む;および連続アミノ酸の第2区域:そのそれぞれはその前のアミノ酸にペプチド結合により結合しており、その配列は連続アミノ酸の第1区域の配列と同一であり、かつ前記ターゲットに対する同一結合部位を含む;その際、アミノ酸の第1区域およびアミノ酸の第2区域はそれぞれ、その予め定めた末端にシステイン残基またはセレノシステイン残基を含む。

請求項156

下記の連続アミノ酸の区域を還元条件下で接触させてこれにより化合物を製造すること含む、化合物の製造方法:連続アミノ酸の区域:そのそれぞれはその前のアミノ酸にペプチド結合により結合しており、その配列はあるターゲットに対する結合部位を含む;および連続アミノ酸の第2区域:そのそれぞれはその前のアミノ酸にペプチド結合により結合しており、その配列は連続アミノ酸の第1区域の配列と異なり、かつ前記ターゲットに対する同一結合部位を含む;その際、アミノ酸の第1区域およびアミノ酸の第2区域はそれぞれ、その予め定めた末端にシステイン残基またはセレノシステイン残基を含む。

請求項157

請求項155または156の方法であって、還元条件が連続アミノ酸の区域を変性させない方法。

請求項158

請求項155または156の方法であって、還元条件が、Tris−HCLおよびメルカプトエタノールを含む緩衝液に連続アミノ酸の区域を曝露することを含む方法。

請求項159

請求項158の方法であって、緩衝液がpH7.6〜8.4である方法。

請求項160

請求項158の方法であって、緩衝液がpH8である方法。

請求項161

請求項158の方法であって、さらに生成物を酸化用緩衝液中へ入れ替えることを含む方法。

請求項162

請求項155または156の方法であって、連続アミノ酸の区域がCD4細胞外ドメインを含む方法。

請求項163

請求項155または156の方法であって、連続アミノ酸の区域が免疫グロブリンFcポリペプチドの配列を含む方法。

請求項164

請求項163の方法であって、免疫グロブリンがヒト免疫グロブリンである方法。

請求項165

下記を含む化合物:連続アミノ酸の第1区域:そのそれぞれはその前のアミノ酸にペプチド結合により結合しており、その配列はあるターゲットに対する結合部位を含む;および連続アミノ酸の第2区域:そのそれぞれはその前のアミノ酸にペプチド結合により結合しており、その配列は連続アミノ酸の第1区域の配列と同一であり、かつ前記ターゲットに対する同一結合部位を含む;その際、アミノ酸の第1区域およびアミノ酸の第2区域はそれぞれ独立して、その予め定めた末端に、硫黄(S)またはセレン(Se)を含む直鎖状脂肪族鎖酸を有する天然アミノ酸または非天然アミノを有し、それらの硫黄(S)またはセレン(Se)は下記の構造を有する結合で連結している:(各Xは硫黄(S)またはセレン(Se)であり、各(C)は前記の天然または非天然アミノ酸のうちの1つの直鎖状脂肪族側鎖の炭素を表わし、nおよびmは独立して2、3、4、5、6、7、8、9または10である)。

請求項166

請求項165の化合物であって、天然アミノ酸がホモシステインまたはホモセレノシステインである化合物。

請求項167

請求項165の化合物であって、アミノ酸の第1区域および第2区域がその予め定めた末端にホモシステイン残基を有する化合物。

請求項168

請求項165の化合物であって、アミノ酸の第1区域および第2区域がその予め定めた末端にホモセレノシステイン残基を有する化合物。

請求項169

請求項165の化合物であって、アミノ酸の第1区域および第2区域がその予め定めた末端にホモシステイン残基を有する化合物。

請求項170

請求項168または169の化合物であって、予め定めた末端がC−末端である化合物。

請求項171

下記を含む化合物:連続アミノ酸の第1区域:そのそれぞれはその前のアミノ酸にペプチド結合により結合しており、その配列はあるターゲットに対する結合部位を含む;および連続アミノ酸の第2区域:そのそれぞれはその前のアミノ酸にペプチド結合により結合しており、その配列は連続アミノ酸の第1区域の配列と異なり、かつ異なる部分に対する結合部位を含む;その際、アミノ酸の第1区域およびアミノ酸の第2区域はそれぞれ独立して、その予め定めた末端に、硫黄(S)またはセレン(Se)を含む直鎖状脂肪族側鎖酸を有する天然アミノ酸または非天然アミノを有し、それらの硫黄(S)またはセレン(Se)は下記の構造を有する結合で連結している:(各Xは同一でも異なってもよく、硫黄(S)またはセレン(Se)を表わし、各(C)は前記の天然または非天然アミノ酸のうちの1つの直鎖状脂肪族側鎖の炭素を表わし、nおよびmは独立して1、2、3、4、5、6、7、8、9または10である)。

請求項172

請求項171の化合物であって、天然アミノ酸がホモシステインまたはホモセレノシステインである化合物。

請求項173

請求項171の化合物であって、アミノ酸の第1区域および第2区域がその予め定めた末端にホモシステイン残基を有する化合物。

請求項174

請求項171の化合物であって、アミノ酸の第1区域および第2区域がその予め定めた末端にホモセレノシステイン残基を有する化合物。

請求項175

請求項171の化合物であって、アミノ酸の第1区域および第2区域がその予め定めた末端にホモシステイン残基を有する化合物。

請求項176

請求項174または175の化合物であって、予め定めた末端がC−末端である化合物。

請求項177

第1ポリペプチドがインテインと接し、このインテインが結合ドメインを含む第2ポリペプチドと接したものを含む、タンパク質を製造する方法であって、動物細胞に動物細胞が該タンパク質を発現および分泌する条件下で核酸をトランスフェクションすることを含み、この核酸が(i)該ポリペプチドをコードする第1部分、これと接した(ii)インテインをコードする第2部分、これと接した、結合ドメインをコードする第3部分を含む、前記方法。

請求項178

請求項177の方法であって、動物細胞が哺乳動物由来する方法。

請求項179

請求項177の方法であって、結合ドメインがキチン結合ドメインである方法。

請求項180

固体表面に末端ジスルフィド結合を介して結合したポリペプチドを含む組成物。

請求項181

請求項180の組成物であって、固体表面がチップまたはビーズである組成物。

請求項182

下記を含む化合物:連続アミノ酸の第1区域:そのそれぞれはその前のアミノ酸にペプチド結合により結合しており、この連続アミノ酸の第1区域はカルコゲン官能基を含有する側鎖を有するアミノ酸残基を含む;および連続アミノ酸の第2区域:少なくとも100個のアミノ酸を含み、そのそれぞれはその前のアミノ酸にペプチド結合により結合しており、連続アミノ酸の第2区域のうち少なくとも90個の連続アミノ酸はヒト免疫グロブリン定常部ポリペプチドの一部と同一の配列を有し、かつ連続アミノ酸の第2区域はその予め定めた末端にカルコゲン官能基を含有する側鎖を有するアミノ酸残基を含む;その際、連続アミノ酸の第1区域のカルコゲン官能基を含有する側鎖を有するアミノ酸残基と、連続アミノ酸の第2区域のカルコゲン官能基を含有する側鎖を有するアミノ酸残基は下記の構造を有する結合で連結している:(各Xは独立してカルコゲンを表わし、C1は連続アミノ酸の第1区域のカルコゲン官能基を含有する側鎖を有するアミノ酸残基の側鎖炭素を表わし、C2は連続アミノ酸の第2区域の側鎖炭素を表わす)。

請求項183

請求項182の化合物であって、C1およびC2のうち少なくとも1つはアミノ酸のベータ炭素である化合物。

請求項184

請求項182の化合物であって、結合が下記の構造を有する化合物:(Sは硫黄である)。

請求項185

請求項182の化合物であって、結合が下記の構造を有する化合物:(Sは硫黄であり、Seはセレンである)。

請求項186

請求項182の化合物であって、連続アミノ酸の第2区域の予め定めた末端にあるカルコゲン官能基を含有する側鎖を有するアミノ酸残基がシステインである化合物。

請求項187

請求項182の化合物であって、連続アミノ酸の第2区域の予め定めた末端にあるカルコゲン官能基を含有する側鎖を有するアミノ酸残基がセレノシステイン、ホモシステインまたはホモセレノシステインである化合物。

請求項188

請求項182の化合物であって、連続アミノ酸の第1区域のカルコゲン官能基を含有する側鎖を有するアミノ酸残基がシステインである化合物。

請求項189

請求項182の化合物であって、連続アミノ酸の第1区域のカルコゲン官能基を含有する側鎖を有するアミノ酸残基がセレノシステイン、ホモシステインまたはホモセレノシステインである化合物。

請求項190

請求項182の化合物であって、連続アミノ酸の第1区域のカルコゲン官能基を含有する側鎖を有するアミノ酸残基が末端残基である化合物。

請求項191

請求項182の化合物であって、連続アミノ酸の第1区域のカルコゲン官能基を含有する側鎖を有するアミノ酸残基がピナルト、アンテピナルトまたはプレアンテピナルト末端残基である化合物。

請求項192

請求項182の化合物であって、連続アミノ酸の第2区域がヒト免疫グロブリン定常部と同一の配列を有する化合物。

請求項193

請求項192の化合物であって、連続アミノ酸の第2区域がヒト免疫グロブリン定常部の一部である化合物。

請求項194

請求項182の化合物であって、連続アミノ酸の第1区域がヒト免疫グロブリン定常部と同一の配列を有する化合物。

請求項195

請求項182の化合物であって、ヒト免疫グロブリンの定常部ポリペプチドが、ヒトIgG1、ヒトIgG2、ヒトIgG3、またはヒトIgG4である化合物。

請求項196

請求項195の化合物であって、カルコゲン官能基を含有する側鎖を有するアミノ酸残基のうち少なくとも1つの側鎖がC1−C10アルキレンである化合物。

請求項197

請求項182の化合物の2つがそれぞれの化合物の連続アミノ酸の第2区域間で少なくとも1つのジスルフィド結合により互いに結合したものを含む組成物。

請求項198

SEQIDNO:35〜46のうちの1つに示す配列を有する、またはSEQIDNO:53〜67のうちの1つに示す配列を有する、またはSEQIDNO:74〜82のうちの1つに示す配列を有する、またはSEQIDNO:89〜97のうちの1つに示す配列を有する連続アミノ酸からなるポリペプチド。

請求項199

請求項198のポリペプチドおよびキャリヤーを含む組成物。

請求項200

請求項199の組成物であって、キャリヤーがリン酸緩衝化生食塩水である組成物。

請求項201

請求項198のポリペプチドの2つが2つのポリペプチド間で少なくとも1つのジスルフィド結合により互いに結合したものを含む組成物。

請求項202

SEQIDNO:44、SEQIDNO:64、SEQIDNO:81またはSEQIDNO:96に示す配列の一部と同一の配列を有する連続アミノ酸からなり、ポリペプチドの末端残基のうち少なくとも1つがカルコゲン官能基を含有する側鎖を有するポリペプチド。

請求項203

請求項202のポリペプチドであって、カルコゲン官能基を含有する側鎖を有する末端残基がシステインまたはその類似体であるポリペプチド。

背景技術

0001

本明細書全体を通して種々の刊行物を参照する。本明細書および特許請求の範囲に記載する本発明の時点で当業者既知である技術水準をより十分に記載するために、これらの刊行物の開示内容全体を本明細書に援用する。

0002

あらゆるマシーンおよびデバイス可動部をもつ。可動部の機能は、有用なタスクを実行するためにエネルギー源を変換することにより作業を行なうことである。可動部は、ある範囲のサイズおよび形状に及ぶ。その範囲の一端には、機械的タスクを実行するマシーンに明らかな可視世界がある。その領域の他端には、電気的作業を実行するデバイスに用いられる電荷担体不可視世界がある。

0003

この範囲はきわめて広いので、その特定の領域は技術開発が始まったばかりである。これらには、数ナノメートルないし数百ナノメートルの可動部を備えたデバイスが含まれる。それは化学物質基本単位である分子のサイズそのものに匹敵するので、このサイズ範囲は多くの科学者および技術者にかなりの関心が持たれている。ナノマシーンは、分子間結合または触媒作用など独特分子特性開拓する可能性をもつ。

0004

想定しうるいかなるサイズおよび形状の分子も作製できる能力は、ナノマシーンの構築に際してきわめて重要なことのひとつである。
したがって、それは医薬エレクトロニクス光学、および他の多くの分野で広く期待されている。膨大な商業活動が化学的に異なるきわめて多数の分子の合成に注目している。しかし、分子コンフィギュレーション分子形態)(結合の相異)は多様性を生み出す実際的手段のひとつにすぎない。分子コンホメーション(結合の回転の相異)は、連続したサイズおよび形状の領界を生み出すためのもうひとつの重要な手段を提供する。

0005

分子コンホメーションは、可動部を備えた分子を作製するための方法において特定の独自の利点をもつ。原子および化学結合は線および角度において厳密な寸法をもつけれども、コンホメーション変化は分子のサイズおよび形状における無限の変動をもたらす可能性がある。共有結合および非共有化学結合は共に回転自由度をもたらす。分子の異なる部分(ドメイン)を接続する一連の結合それぞれの周りの二面体回転は、ナノマシーンの本質的な動的構成要素を提供することができる。

0006

通常は、単結合(すなわち、単一の電子対)で相互に連結されたいずれか2つの特定の原子は、相互に、およびそれぞれが結合している他の原子に対して、完全に360度回転できる。一連の連続単結合は、一連の相互に連結された玉継手に類似する。回転運動に限定されるが、一連の連続単結合は、一連の連続した玉継手と同様に、他のタイプの相互連結された可動部(たとえば一連の連続ヒンジ)の運動再現することができる。

0007

有用なナノマシーン作製のひとつの難点は、可動部の個数と相互連結の個数のバランスをとることである。特定の閾値を超えると、いずれかのマシーン中の部品または接続の個数を増加させるのは逆効果である。よって自動車エンジンには、最適個数ピストンバルブカム軸プーリーなどを用いる。

0008

化学分野における同様な難点は、関連するけれども著しく異なる2つのタイプの分子、すなわち有機ポリマーおよび生物学的ポリマーにより例示される。ポリエチレンタンパク質が好適な比較となる。ポリエチレンは連続エチレン区域(stretch)(CH2)nが連続単結合(−C−)nにより相互連結したものであり、一方、タンパク質は連
アミノ酸の区域(NHCHRCO)nが連続ペプチド結合(=N−C−C=)nにより相互連結したものである。非分枝ポリエチレンは単結合の反復鎖であり、一方、タンパク質は1つの二重結合に2つの単結合が続く反復鎖である。これら2タイプの鎖の間の最も重要な相異は、ポリエチレンはほとんどいかなるコンホメーションも受け入れることができ、したがって明確なサイズまたは形状がなく(統計的に平均したものにすぎない)、一方、タンパク質はきわめて剛性であり、したがってきわめて明確な(かつ変化しない)サイズおよび形状をもつことである。

0009

機械的デバイスとの単純ではあるが妥当な比較は、可動部と接続部の比率が高いマシーンとしてのポリエチレンと、可動部と接続部の比率が低いマシーンとしてのタンパク質であろう。それぞれが形成しうるさらに高次の構造を利用しない限り、いずれの分子もマシーン様タスクにきわめて好適というわけではない。たとえば、ポリエチレンは分子間繊維を形成するその能力を利用すれば有用である。興味深いことに、ポリエチレンがそのような三次元構造を示す能力はそれの固有フレキシビリティーに依存する。あるタンパク質は商業的に価値のある繊維(たとえば羊毛およびコラーゲン)を形成しうるが、大部分のタンパク質は小球状であり、繊維を形成しない。

0010

小球状タンパク質は、ほとんどすべての実用的な目的にとって可動部をほとんど(たとえ含むとしても)含まないマシーンである;たとえば、それを操作するヒトとそれが押し込まれる物体など、他の物体との組合わせにおいてその効力を発揮しなければならない金てこと同様。それにもかかわらず、相対的ではあるがなおかつ協調した(coordinated)運動が可能なある様式で互いに連結した明確な領域(たとえば結合ドメイン)をもつタンパク質様の分子に、大きな価値があると思われる多くの例がある。一例は、2以上の同一結合部位をもつ疾患ターゲット協同的に(cooperatively)結合しうるタンパク質様の分子であろう。これは小球状タンパク質結合ドメインの独特の特性、すなわちターゲット、特に疾患に関連する他のタンパク質に対するそれらの大きな特異性を十分に利用していると思われる。

0011

疾患ターゲットを協同結合しうるタンパク質様の分子の潜在的な商業的価値を、定量的に推定することができる。出発点となる仮定は、現在用いられている大部分の療法薬は低分子または生物製剤のいずれであっても、一般にそれらのターゲットをナノモル濃度水準アフィニティー定数(10−9M)で非協同的に結合することである。注目すべきことに、協同作用療法薬は同一ターゲットをナノモル×ナノモル濃度(10−9M×10−9M)[すなわちアトモル濃度(10−18M)]で結合することができると考えられる。

0012

療法薬は一般にそれらのターゲットより大幅に過剰モル濃度(約100万倍)で必要なので、協同作用療法薬は10−6少ない用量で非協同作用療法薬と同等であろう。現在の多くの生物製剤(たとえば抗体およびイムノアドヘンシン(immunoadhesin)類)について、この差は1回量当たり1グラムの代わりに1回量当たり1マイクログラムになる。グラム当たり1,000米ドルを超える患者コストに関して、この因数新規薬物の知見および開発において、ならびに既存の生物製剤について、大きな重要性をもつ。

0013

抗体およびイムノアドヘシン類に関連する1つのアイニーは、それらは2つの同一結合ドメインをもつ対称タンパク質であるけれども通常は対称的ターゲットに対称的に結合するわけではないということである。2つの結合ドメイン間の連結がフレキシブルでないことにより、協同結合を可能にするマシーン様の動きが得られない。対称的に結合する抗体およびイムノアドヘシン類を工学的に作製する多数の試みは、結合部位とターゲット部位の間の相補的対称性に必要な厳密な幾何学的構造を達成するのが困難であるため失敗している。一般的なマシーンの作製に用いられる材料、たとえば木材、金属、プラスチック
セラミックなどと異なり、分子は厳密なサイズおよび形状に切断、工作鋳造機械加工または接合するのが容易ではない。

0014

したがって、いずれか単一の固定されたサイズおよび形状では協同結合は容易には達成できないが、結合ドメイン間のコンホメーションのフレキシビリティーは有望な解決策を実際に提供する。“1サイズがすべてに適合する(one size fits all)”方策は、対称的に動く結合ドメインを備えたタンパク質様の分子は対称的に(すなわち協同的に)結合することもできるであろうという提案に基づく。これらの結合ドメインはコンホメーションにおいて両ターゲット部位の同時結合に最も適合する状態へ熱力学的に駆動される;それがコンホメーションにおいてエネルギー的に好ましい最低状態だからである。

課題を解決するための手段

0015

ある態様において、本発明は、下記を含む化合物を提供する:連続アミノ酸の第1区域:そのそれぞれはその前のアミノ酸にペプチド結合により結合しており、その配列はあるターゲットに対する結合部位を含む;および連続アミノ酸の第2区域:そのそれぞれはその前のアミノ酸にペプチド結合により結合しており、その配列は連続アミノ酸の第1区域の配列と同一であり、かつ前記ターゲットに対する同一結合部位を含む;その際、アミノ酸の第1区域およびアミノ酸の第2区域はそれぞれ、その予め定めた末端システイン残基またはセレノシステイン残基を有し、それらのシステイン残基またはそれらのセレノシステイン残基は下記の構造を有する結合で連結している:

0016

0017

(各Xは同一であり、硫黄(S)またはセレン(Se)を表わし、各Cは前記のシステイン残基またはセレノシステイン残基のうちの1つのベータ炭素を表わす)。
ある態様において、本発明は、下記を含む化合物をも提供する:連続アミノ酸の第1区域:そのそれぞれはその前のアミノ酸にペプチド結合により結合しており、その配列はあるターゲットに対する結合部位を含む;および連続アミノ酸の第2区域:そのそれぞれはその前のアミノ酸にペプチド結合により結合しており、その配列は連続アミノ酸の第1区域の配列と異なり、かつ異なる部分に対する結合部位を含む;その際、アミノ酸の第1区域およびアミノ酸の第2区域はそれぞれ、その予め定めた末端にシステイン残基またはセレノシステイン残基を有し、それらの残基は下記の構造を有する結合で連結している:

0018

0019

(各Xは同一でも異なってもよく、硫黄(S)またはセレン(Se)を表わし、各Cは前記のシステイン残基またはセレノシステイン残基のうちの1つのベータ−炭素を表わす)。

0020

本明細書に開示する遺伝子デバイスは、連続アミノ酸の2以上の区域を含み、これらは予め定めた末端において非ペプチド結合により連結している。そのような遺伝子デバイス
は、対称的であり、かつ1以上の重要なターゲットに対して対称的に(すなわち協同的に)結合する。本発明の遺伝子デバイスはタンパク質様の分子であり、下記を含む多数の関連用語記述することができる:シンメトロアドヘシン(symmetroadhesin)類、イムノシンメトロアドヘシン(immuno−symmetroadhesins)類、ヘミ−シンメトロアドヘシン(hemi−symmetroadhesins)類、ビ−シンメトロアドヘシン(bi−symmetroadhesin)類[“釣り合って付着する(stick to proportionately)”を意味する;ギリシャ語のsymmetros、“共通の尺度をもつ、さらには、釣り合っている”、およびラテン語のadhaerentem、すなわちadhaerere、“付着する”の現在分詞由来する]。

0021

本明細書には、2以上の独立してフォールディングするタンパク質ドメインを含み、これらが互いに非ペプチド結合により連結しており、その(それらの)結合の周りで二面体回転が起きうる化合物を開示する。

図面の簡単な説明

0022

図1は、1つのX−末端をもつ連続アミノ酸の区域を示し、N−、C−、S−、およびSe−末端の位置を表わす。ニューマン様式の投影図として描いたN−末端およびC−末端アミノ酸残基をそれぞれ投影面の上および下に示す:(i)遊離α−アミノ(NH2)基をもつN−末端アミノ酸残基(側鎖=R1)、および遊離α−カルボキシル(COOH)基をもつC−末端アミノ酸残基(側鎖=Rn)を含む、連続アミノ酸の区域(一般化した構造)。(ii)遊離α−アミノ(NH2)基およびβ−スルフヒドリル(SH)基をもつN−末端システイン、ならびに遊離α−カルボキシル(COOH)基をもつC−末端アミノ酸残基を含む、N−末端側S−末端を備えた連続アミノ酸の区域。(iii)遊離α−アミノ(NH2)基をもつN−末端アミノ酸残基、ならびに遊離α−カルボキシル(COOH)基およびβ−スルフヒドリル(SH)基をもつC−末端システインを含む、C−末端側S−末端を備えた連続アミノ酸の区域。(iv)遊離α−アミノ(NH2)基およびβ−セレノドリル(SeH)基をもつN−末端セレノシステイン、ならびに遊離α−カルボキシル(COOH)基をもつC−末端アミノ酸残基を含む、N−末端側Se−末端を備えた連続アミノ酸の区域。(v)遊離α−アミノ(NH2)基をもつN−末端アミノ酸残基、ならびに遊離α−カルボキシル(COOH)基およびβ−セレノヒドリル(SeH)基をもつC−末端セレノシステインを含む、C−末端側Se−末端を備えた連続アミノ酸の区域。
図2は、2つのX−末端をもつ連続アミノ酸の区域を示し、N−、C−、S−、およびSe−末端の位置を表わす。ニューマン様式の投影図として描いたN−末端およびC−末端アミノ酸残基をそれぞれ投影面の上および下に示す:(i)遊離α−アミノ(NH2)基をもつN−末端アミノ酸残基(側鎖=X1)、および遊離α−カルボキシル(COOH)基をもつC−末端アミノ酸残基(側鎖=Xn)を含む、2つのX−末端を備えた連続アミノ酸の区域(一般化した構造)。(ii)遊離α−アミノ(NH2)基およびβ−スルフヒドリル(SH)基をもつN−末端システイン、ならびに遊離α−カルボキシル(COOH)基およびβ−スルフヒドリル(SH)基をもつC−末端システインを含む、N−末端側S−末端およびC−末端側S−末端を備えた連続アミノ酸の区域。(iii)遊離α−アミノ(NH2)基およびβ−スルフヒドリル(SH)基をもつN−末端システイン、ならびに遊離α−カルボキシル(COOH)基およびβ−セレノヒドリル(SeH)基をもつC−末端セレノシステインを含む、N−末端側S−末端およびC−末端側Se−末端を備えた連続アミノ酸の区域。(iv)遊離α−アミノ(NH2)基およびβ−セレノヒドリル(SeH)基をもつN−末端セレノシステイン、ならびに遊離α−カルボキシル(COOH)基およびβ−スルフヒドリル(SH)基をもつC−末端システインを含む、N−末端側Se−末端およびC−末端側S−末端を備えた連続アミノ酸の区域。(v)遊離α−アミノ(NH2)基およびβ−セレノヒドリル(SeH)基をもつN−末端セレノシステイン、ならびに遊離α−カルボキシル(COOH)基およびβ−セレノヒドリル(SeH)基をもつC−末端セレノシステインを含む、N−末端側Se−末端およびC−末端側Se−末端を備えた連続アミノ酸の区域。
図3は、キメラポリペプチド一般構造であって、連続アミノ酸の第1区域がそれのC−末端においてペプチド結合により連続アミノ酸の第2区域のN−末端に連結した構造を示す。キメラポリペプチドは、自然界でみられるタンパク質と同様に、連続アミノ酸の連続的な区域がそれぞれ前のアミノ酸にペプチド結合により連結したものである。キメラポリペプチドは、他のタンパク質と同様にコンホメーションフレキシビリティーが制限されている;ペプチド結合自体が、ペプチド鎖の周りで二面体回転できる連続単結合を2より多く備えていないからである。図中のアミノ酸残基に下記に従って番号を付ける:連続アミノ酸の第1区域は長さ=n個の残基をもち、番号=1、2、3、・・・、(n−2)、(n−1)、n。連続アミノ酸の第2区域は長さ=p個の残基をもち、番号=1’、2’、3’、・・・、(p−2)、(p−1)、p。キメラポリペプチドは長さ=(n+p)個の残基をもち、番号=1、2、3、・・・、(n−2)、(n−1)、n、(n+1)、(n+2)、(n+3)、・・・、(n+p−2)、(n+p−1)、(n+p)。主および副互変異性形ならびに共鳴構造を、それぞれ左、中央および右に示す。
図4Aは、ヘッドテイル(head−to−tail)コンフィギュレーションをもつ“シンメトロアドヘシン”の一般構造であって、連続アミノ酸の第1区域がそれのC−末端側−X−末端において連続アミノ酸の第2区域のN−末端側−X−末端に−X−X−結合により連結したものからなる構造を示す。−X−X−結合はペプチド結合ではない。本発明において考慮するこの結合の例には、限定ではないが各XがSまたはSe原子であるいずれかの組合わせが含まれる。ヘッド−テイルシンメトロアドヘシンの総極性はN−末端からC−末端へ向かう。シンメトロアドヘシンはタンパク質と同様に連続アミノ酸の区域であり、そのそれぞれが前のアミノ酸に連結しているが、ペプチド結合が1以上の−X−X−結合で置き換わっていることによりタンパク質と異なる。各−X−X−結合は二面体回転しうる7つの単結合を備えているので、シンメトロアドヘシンはポリペプチドより大きいコンホメーションフレキシビリティーをもつ。アミノ酸残基に下記に従って番号を付ける:連続アミノ酸の第1区域は長さ=n個の残基をもち、番号=1、2、3、・・・、(n−2)、(n−1)、n。連続アミノ酸の第2区域は長さ=p個の残基をもち、番号=1’、2’、3’、・・・、(p−2)、(p−1)、p。ヘッド−テイルシンメトロアドヘシンは長さ=(n+p)個の残基をもち、番号=1、2、3、・・・、(n−2)、(n−1)、n、(n+1)、(n+2)、(n+3)、・・・、(n+p−2)、(n+p−1)、(n+p)。主および副互変異性形ならびに共鳴構造を、それぞれ左、中央および右に示す。
図4Bは、図4Aのシンメトロアドヘシン(左)と、連続アミノ酸の第1区域がそれのピナルト(penultimate、末端の前)C−末端残基のX−末端において連続アミノ酸の第2区域のピナルトN−末端残基のX−末端に−X−X−結合により連結したもの(右)からなるシンメトロアドヘシンの比較を示す。各構造につき共鳴構造を示す。
図4Cは、図4Aのシンメトロアドヘシン(左)と、連続アミノ酸の第1区域がそれのアンテピナルト(antepenultimate)C−末端前残基のX−末端において連続アミノ酸の第2区域のアンテピナルトN−末端残基のX−末端に−X−X−結合により連結したもの(右)からなるシンメトロアドヘシンの比較を示す。各構造につき共鳴構造を示す。
図4Dは、図4Aのシンメトロアドヘシン(左)と、連続アミノ酸の第1区域がそれのプレアンテピナルト(preantepenultimate)C−末端前残基のX−末端において連続アミノ酸の第2区域のプレアンテピナルトN−末端残基のX−末端に−X−X−結合により連結したもの(右)からなるシンメトロアドヘシンの比較を示す。各構造につき共鳴構造を示す。
図5は、ヘッド−ヘッド(head−to−head)コンフィギュレーションをもつシンメトロアドヘシンの一般構造であって、連続アミノ酸の第1区域がそれのN−末端側−X−末端において連続アミノ酸の第2区域のN−末端側−X−末端に−X−X−結合により連結したものからなる構造を示す。ヘッド−ヘッドシンメトロアドヘシンの総極性は−X−X−結合の位置で変化し、C−からN−末端へ、N−からC−末端へと向かう。アミノ酸残基に下記に従って番号を付ける:連続アミノ酸の第1区域は長さ=n個の残基をもち、番号=1、2、3、・・・、(n−2)、(n−1)、n。連続アミノ酸の第2区域は長さ=p個の残基をもち、番号=1’、2’、3’、・・・、(p−2)、(p−1)、p。ヘッド−ヘッドシンメトロアドヘシンは長さ=(n+p)個の残基をもち、番号=n、(n−1)、(n−2)、・・・、3、2、1、(逆転)、1’、2’、3’、・・・、(p−2)、(p−1)、p。主および副互変異性形ならびに共鳴構造を、それぞれ左、中央および右に示す。
図6は、テイル−テイル(tail−to−tail)コンフィギュレーションをもつシンメトロアドヘシンの一般構造であって、連続アミノ酸の第1区域がそれのC−末端側−X−末端において連続アミノ酸の第2区域のC−末端側−X−末端に−X−X−結合により連結したものからなる構造を示す。テイル−テイルシンメトロアドヘシンの総極性は−X−X−結合の位置で変化し、N−からC−末端へ、C−からN−末端へと向かう。アミノ酸残基に下記に従って番号を付ける:連続アミノ酸の第1区域は長さ=n個の残基をもち、番号=1、2、3、・・・、(n−2)、(n−1)、n。連続アミノ酸の第2区域は長さ=p個の残基をもち、番号=1’、2’、3’、・・・、(p−2)、(p−1)、p。テイル−テイルシンメトロアドヘシンは長さ=(n+p)個の残基をもち、番号=1、2、3、・・・、(n−2)、(n−1)、n、(逆転)、p、(p−1)、(p−2)、・・・、3’、2’、1’。主および副互変異性形ならびに共鳴構造を、それぞれ左、中央および右に示す。
図7は、ヘッド−テイル型ヘミ−シンメトロアドヘシンの模式図であり、全トランスコンホメーションを示す。C−末端側−X−末端とN−末端側−X−末端を連結する7つの連続単結合がすべてトランスである(N−C−C−X−X−C−C−C)。2つの結合ドメインがこのコンホメーションでは互いに反対方向を向いている;7つの連続単結合のいずれか1つの周りに180度回転させると、2つの結合ドメインは互いに向き合うであろう。ヘッド−テイルコンフィギュレーションをもつヘミ−シンメトロアドヘシンは、コンホメーションに関係なく非対称分子である(図7と8を比較);しかし、2以上のヘッド−テイル型ヘミ−シンメトロアドヘシンが一緒になって対称分子を形成することができる。
図8は、ヘッド−テイル型ヘミ−シンメトロアドヘシンの模式図であり、X−cis−Xコンホメーションを示す。C−末端側−X−末端とN−末端側−X−末端を連結する7つのうち1つ以外のすべての連続単結合がトランスである(N−C−C−X−cis−X−C−C−C)。2つの結合ドメインがこのコンホメーションでは互いに向き合っている;さらに、7つの連続単結合のいずれか1つの周りに180度回転させると、2つの結合ドメインは互いに反対方向を向くであろう。ヘッド−テイルコンフィギュレーションをもつヘミ−シンメトロアドヘシンは、コンホメーションに関係なく非対称分子である(図7と8を比較);しかし、2以上のヘッド−テイル型ヘミ−シンメトロアドヘシンが一緒になって対称分子を形成することができる。
図9は、ヘッド−ヘッド型ヘミ−シンメトロアドヘシンの模式図であり、全トランスコンホメーションを示す。第1N−末端側−X−末端と第2N−末端側−X−末端を連結する7つの連続単結合がすべてトランスである(C−C−C−X−X−C−C−C)。2つの結合ドメインがこのコンホメーションでは互いに反対方向を向いている;7つの連続単結合のいずれか1つの周りに180度回転させると、2つの結合ドメインは互いに向き合うであろう。ヘッド−ヘッドコンフィギュレーションをもつヘミ−シンメトロアドヘシンは、それらの可能なコンホメーションのうち2つだけが対称分子である:全トランスおよびX−cis−X(図9と10を比較);しかし、2以上のヘッド−ヘッド型ヘミ−シンメトロアドヘシンのサブユニットが無限数の対称コンホメーションをもつ分子を形成することができる。
図10は、ヘッド−ヘッド型ヘミ−シンメトロアドヘシンの模式図であり、X−cis−Xコンホメーションを示す。第1N−末端側−X−末端と第2N−末端側−X−末端を連結する7つのうち1つ以外のすべての連続単結合がトランスである(C−C−C−X−cis−X−C−C−C)。2つの結合ドメインがこのコンホメーションでは互いに向き合っている;さらに、7つの連続単結合のいずれか1つの周りに180度回転させると、2つの結合ドメインは互いに反対方向を向くであろう。ヘッド−ヘッドコンフィギュレーションをもつヘミ−シンメトロアドヘシンは、それらの可能なコンホメーションのうち2つだけが対称分子である:全トランスおよびX−cis−X(図9と10を比較);しかし、2以上のヘッド−ヘッド型ヘミ−シンメトロアドヘシンのサブユニットが無限数の対称コンホメーションをもつ分子を形成することができる。
図11は、テイル−テイル型ヘミ−シンメトロアドヘシンの模式図であり、全トランスコンホメーションを示す。第1C−末端側−X−末端と第2C−末端側−X−末端を連結する7つの連続単結合がすべてトランスである(N−C−C−X−X−C−C−N)。2つの結合ドメインがこのコンホメーションでは互いに反対方向を向いている;7つの連続単結合のいずれか1つの周りに180度回転させると、2つの結合ドメインは互いに向き合うであろう。テイル−テイルコンフィギュレーションをもつヘミ−シンメトロアドヘシンは、それらの可能なコンホメーションのうち2つだけが対称分子である:全トランスおよびX−cis−X(図11と12を比較);しかし、2以上のテイル−テイル型ヘミ−シンメトロアドヘシンのサブユニットが無限数の対称コンホメーションをもつ分子を形成することができる。
図12は、テイル−テイル型ヘミ−シンメトロアドヘシンの模式図であり、X−cis−Xコンホメーションを示す。第1−C末端側−X−末端と第2C−末端側−X−末端を連結する7つのうち1つ以外のすべての連続単結合がトランスである(N−C−C−X−cis−X−C−C−N)。2つの結合ドメインがこのコンホメーションでは互いに向き合っている;さらに、7つの連続単結合のいずれか1つの周りに180度回転させると、2つの結合ドメインは互いに反対方向を向くであろう。テイル−テイルコンフィギュレーションをもつヘミ−シンメトロアドヘシンは、それらの可能なコンホメーションのうち2つだけが対称分子である:全トランスおよびX−cis−X(図9と10を比較);しかし、2以上のテイル−テイル型ヘミ−シンメトロアドヘシンのサブユニットが無限数の対称コンホメーションをもつ分子を形成することができる。
図13は、2つの免疫グロブリンFab結合ドメインからなるテイル−テイル型ヘミ−シンメトロアドヘシンの模式図である。ここには全トランスコンホメーションを示す。第1C−末端側−X−末端と第2C−末端側−X−末端を連結する7つの連続単結合がすべてトランスである(N−C−C−X−X−C−C−N)。2つのFab結合ドメインがこのコンホメーションでは互いに反対方向を向いている;7つの連続単結合のいずれか1つの周りに180度回転させると、これらのFab結合ドメインは互いに向き合うであろう(図13と14を比較)。重鎖領域はX−X結合により互いに連結している;軽鎖領域は内部ジルフィド結合により重鎖領域に連結している。略号:VL、軽鎖可変部;CL、軽鎖定常部;VH、重鎖可変部;CH1、重鎖定常部1。
図14は、2つの免疫グロブリンFab結合ドメインからなるテイル−テイル型ヘミ−シンメトロアドヘシンの模式図である。ここにはX−cis−Xコンホメーションを示す。第1−C末端側−X−末端と第2C−末端側−X−末端を連結する7つのうち1つ以外のすべての連続単結合がトランスである(N−C−C−X−cis−X−C−C−N)。2つのFab結合ドメインがこのコンホメーションでは互いに向き合っている;さらに、7つの連続単結合のいずれか1つの周りに180度回転させると、これらのFab結合ドメインは互いに反対方向を向くであろう(図13と14を比較)。重鎖領域はX−X結合により互いに連結している;軽鎖領域は内部ジルフィド結合により重鎖領域に連結している。略号:VL、軽鎖可変部;CL、軽鎖定常部;VH、重鎖可変部;CH1、重鎖定常部1。
図15は、イムノアドヘシン分子の模式図である(Capon et al. (1989) Nature 337, 525-530)。イムノアドヘシンは、ジルフィド結合した二量体を形成するキメラポリペプチドである。各キメラポリペプチドは、結合ドメインがそれのC−末端においてペプチド結合により免疫グロブリンFcドメインのN−末端に連結したものからなる。イムノアドヘシンは対称構造であるが、それらは通常は二量体または多量体ターゲット分子に協同結合することはない。略号:CH2、重鎖定常部2;CH3、重鎖定常部3。
図16は、免疫グロブリン(抗体)分子の模式図である。免疫グロブリンは、2つの重鎖および2つの軽鎖からなるヘテロ四量体である。免疫グロブリンは対称構造であるが、それらは通常は二量体または多量体ターゲット分子に協同結合することはない。略号:VL、軽鎖可変部;CL、軽鎖定常部;VH、重鎖可変部;CH1、重鎖定常部1;CH2、重鎖定常部2;CH3、重鎖定常部3。
図17は、ヘッド−テイル型イムノシンメトロアドヘシンの模式図であり、全トランスコンホメーションを示す。ヘッド−テイル型イムノシンメトロアドヘシンは、ヘッド−テイル型ヘミ−シンメトロアドヘシンがジルフィド結合二量体を形成したものである。各ヘミ−シンメトロアドヘシンは、C−末端側−X−末端をもつ免疫グロブリンFab結合ドメインがN−末端側−X−末端をもつ免疫グロブリンサブユニットに−X−X−結合により連結したものからなる。この二量体は2つの機能性Fab結合ドメインおよび1つの機能性Fc結合ドメインを含む。各FabドメインをFcサブユニットに連結する7つの連続単結合がすべてトランスである(N−C−C−X−X−C−C−C)。第1(N−C)、第3(C−X)、第5(X−C)または第7(C−C)対の連続単結合の周りに対称的に180度回転させると、2つのFabドメインは第1の一般方向(general direction)へ動くであろう(図17と18を比較)。第2(C−C)、第4(X−X)または第6(C−C)の単結合対の周りに対称的に180度回転させると、2つのFabドメインは第2の一般方向へ動くであろう(図17と19を比較)。
図18は、ヘッド−テイル型イムノシンメトロアドヘシンの模式図であり、X−cis−Xコンホメーションを示す。このX−cis−Xコンホメーションは、全トランスコンホメーションから、7つの連続単結合のうち第5対の対称回転により得られる(N−C−C−X−X−cis−C−C−C)(図17と18を比較)。ここに示すX−cis−Xコンホメーションに類似する他のコンホメーションは、全トランスコンホメーションから、連続単結合のうちの第1対の対称回転(N−cis−C−C−X−X−C−C−C)、第3対の対称回転(N−C−C−cis−X−X−C−C−C)、または第7対(N−C−C−X−X−C−C−cis−C)の対称回転により得られる。
図19は、ヘッド−テイル型イムノシンメトロアドヘシンの模式図であり、X−cis−Xコンホメーションを示す。このX−cis−Xコンホメーションは、全トランスコンホメーションから、7つの連続単結合のうち第4対の対称回転により得られる(N−C−C−X−cis−X−C−C−C)(図17と19を比較)。ここに示すX−cis−Xコンホメーションに類似する他のコンホメーションは、全トランスコンホメーションから、連続単結合のうちの第2対の対称回転(N−C−cis−C−X−X−C−C−C)または第4対の対称回転(N−C−C−X−X−C−cis−C−C)の対称回転により得られる。
図20は、テイル−テイル型イムノシンメトロアドヘシンの模式図であり、全トランスコンホメーションを示す。テイル−テイル型イムノシンメトロアドヘシンは、テイル−テイル型ヘミ−シンメトロアドヘシンがジルフィド結合二量体を形成したものである。各ヘミ−シンメトロアドヘシンは、C−末端側−X−末端をもつ免疫グロブリンFab結合ドメインがC−末端側−X−末端をもつ免疫グロブリンFcサブユニットに−X−X−結合により連結したものからなる。この二量体は2つの機能性Fab結合ドメインおよび1つの機能性Fc結合ドメインを含む。各FabドメインをFcサブユニットに連結する7つの連続単結合がすべてトランスである(N−C−C−X−X−C−C−N)。第1(N−C)、第3(C−X)、第5(X−C)または第7(C−N)対の連続単結合の周りに対称的に180度回転させると、2つのFabドメインは第1の一般方向へ動くであろう(図20と21を比較)。第2(C−C)、第4(X−X)または第6(C−C)の単結合対の周りに対称的に180度回転させると、2つのFabドメインは第2の一般方向へ動くであろう(図20と22を比較)。
図21は、テイル−テイル型イムノシンメトロアドヘシンの模式図であり、X−cis−Xコンホメーションを示す。このX−cis−Xコンホメーションは、全トランスコンホメーションから、7つの連続単結合のうち第5対の対称回転により得られる(N−C−C−X−X−cis−C−C−N)(図20と21を比較)。ここに示すX−cis−Xコンホメーションに類似する他のコンホメーションは、全トランスコンホメーションから、連続単結合のうちの第1対の対称回転(N−cis−C−C−X−X−C−C−N)、第3対の対称回転(N−C−C−cis−X−X−C−C−n)、または第7対(N−C−C−X−X−C−C−cis−N)の対称回転により得られる。
図22は、テイル−テイル型イムノシンメトロアドヘシンの模式図であり、X−cis−Xコンホメーションの模式図である。このX−cis−Xコンホメーションは、全トランスコンホメーションから、7つの連続単結合のうち第4対(N−C−C−X−cis−X−C−C−N)の対称回転により得られる(図20と22を比較)。ここに示すX−cis−Xコンホメーションに類似する他のコンホメーションは、全トランスコンホメーションから、連続単結合のうちの第2対の対称回転(N−C−cis−C−X−X−C−C−N)または第4対(N−C−C−X−X−C−cis−C−N)の対称回転により得られる。
図23は、4つのFab結合ドメインをもつビ−シンメトロアドヘシンの模式図であり、全トランスコンホメーションを示す。この分子は、それぞれ連続アミノ酸の区域3つからなる2つのヘミ−シンメトロアドヘシンの二量体である。ここに示すビ−シンメトロアドヘシンは、ヘッド−テイル、テイル−テイル型ヘミ−シンメトロアドヘシンがジルフィド結合二量体を形成したものである。各ヘミ−シンメトロアドヘシンは、C−末端側−X−末端をもつ2つの免疫グロブリンFabドメインが−X−X−結合により免疫グロブリンFcサブユニットに連結したものからなる;第1のFabドメインはFcのN−末端側−X−末端に連結し、第2のFabはFcのC−末端側−X−末端に連結している。この二量体は4つの機能性Fab結合ドメインおよび1つの機能性Fc結合ドメインを含む。4つすべてのFabドメインをFcサブユニットに連結する7つの連続単結合がすべてトランスである(N−C−C−X−X−C−C−C/N)。第1(N−C)、第3(C−X)、第5(X−C)または第7(C−C/N)対の連続単結合の周りに対称的に180度回転させると、4つのFabドメインは第1の一般方向へ動くであろう(図23と24を比較)。第2(C−C)、第4(X−X)または第6(C−C)の単結合対の周りに対称的に180度回転させると、4つのFabドメインは第2の一般方向へ動くであろう(図23と25を比較)。
図24は、4つのFab結合ドメインおよび1つのFcドメインからなるビ−シンメトロアドヘシンのX−cis−Xコンホメーションの模式図である。この分子は、それぞれ連続アミノ酸の区域3つからなる2つのヘミ−シンメトロアドヘシンの二量体である。
図25は、4つのFab結合ドメインおよび1つのFcドメインからなるビ−シンメトロアドヘシンのX−cis−Xコンホメーションの模式図である。この分子は、それぞれ連続アミノ酸の区域3つからなる2つのヘミ−シンメトロアドヘシンの二量体である。
図26は、2つのFab結合ドメイン、1つのFcドメインおよび2つの非Fab結合ドメインからなるビ−シンメトロアドヘシンの全トランスコンホメーションの模式図である。この分子は、それぞれ連続アミノ酸の区域3つからなる2つのヘミ−シンメトロアドヘシンの二量体である。ここに示すビ−シンメトロアドヘシンは、ジルフィド結合二量体を形成したヘッド−テイル、テイル−テイル型ヘミ−シンメトロアドヘシンである。各ヘミ−シンメトロアドヘシンは、C−末端側−X−末端をもつ1つの免疫グロブリンFabドメインが免疫グロブリンFcサブユニットのN−末端側−X−末端に−X−X−結合により連結し、かつC−末端側−X−末端をもつ1つの非免疫グロブリン結合ドメインが免疫グロブリンFcサブユニットのC−末端側−X−末端に−X−X−結合により連結したものからなる。この二量体は2つの機能性Fab結合ドメイン、2つの機能性非免疫グロブリン結合ドメイン、および1つの機能性Fc結合ドメインを含む。4つすべての結合ドメインをFcサブユニットに連結する7つの連続単結合がすべてトランスである(N−C−C−X−X−C−C−C/N)。第1(N−C)、第3(C−X)、第5(X−C)または第7(C−C/N)対の連続単結合の周りに対称的に180度回転させると、4つの結合ドメインは第1の一般方向へ動くであろう(図26と27を比較)。第2(C−C)、第4(X−X)または第6(C−C)の単結合対の周りに対称的に180度回転させると、4つの結合ドメインは第2の一般方向へ動くであろう(図26と28を比較)。
図27は、2つのFab結合ドメイン、1つのFcドメインおよび2つの非Fab結合ドメインからなるビ−シンメトロアドヘシンのX−cis−Xコンホメーションの模式図である。この分子は、それぞれ連続アミノ酸の区域3つからなる2つのヘミ−シンメトロアドヘシンの二量体である。
図28は、2つのFab結合ドメイン、1つのFcドメインおよび2つの非Fab結合ドメインからなるビ−シンメトロアドヘシンのX−cis−Xコンホメーションの模式図である。この分子は、それぞれ連続アミノ酸の区域3つからなる2つのヘミ−シンメトロアドヘシンの二量体である。
図29は、第1の対称的ターゲットへの免疫グロブリン結合の模式図である。この相互作用は対称的かつ協同的である。両方のターゲットに両方の免疫グロブリンが結合している。
図30は、第1の対称的ターゲットへのシンメトロアドヘシン結合の模式図である。この相互作用は対称的かつ協同的である。両方のターゲットに、第1コンホメーション(全トランス)にある両方のシンメトロアドヘシンが結合している。
図31は、第2の対称的ターゲットへの免疫グロブリン結合の模式図である。この相互作用は対称的でもなく、協同的でもない。1つのターゲットにのみ各免疫グロブリンが結合している。
図32は、第2の対称的ターゲットへのシンメトロアドヘシン結合の模式図である。この相互作用は対称的かつ協同的である。両方のターゲットに、第2コンホメーション(X−cis−C)にある両方のシンメトロアドヘシンが結合している。
図33は、第3の対称的ターゲットへの免疫グロブリン結合の模式図である。この相互作用は対称的でもなく、協同的でもない。1つのターゲットにのみ各免疫グロブリンが結合している。
図34は、第3の対称的ターゲットへのシンメトロアドヘシン結合の模式図である。この相互作用は対称的かつ協同的である。両方のターゲットに、第3コンホメーション(X−cis−X)にある両方のシンメトロアドヘシンが結合している。
図35Aは、N−末端側−S−末端をもつヒトIgG1 Fcシンメトロアドヘシン前駆体サブユニットの種々のポリペプチド合成中間体アミノ酸配列を示す。パート(i)は、下記のものを含む3つの異なるプレ−Fc(PRE−FC)ポリペプチドを示す:ヒトソニックヘッジホッグ(sonic hedgehog)(SHH)、ヒトインターフェロンアルファ−2(IFN)、またはヒトコレステロールエステルトランスフェラーゼ(CETPシグナル配列(それぞれ、残基−23〜−1、−23〜−1、または−17〜−1)のいずれか、およびヒトIGHG1 Fcドメイン(残基1〜228):ヒンジ部エキソンがコードする第5アミノ酸から開始、CDKTHTCPPCP(Ellison et al. (1982) Nuc. AcidsRes. 10, 4071-4079)。これら3つの異なるプレ−Fcポリペプチドは、それぞれ251、251、および245残基の長さをもつ。パート(ii)は、N−末端側−S−末端をもつ成熟Fcドメイン(長さ=228)を示す。N−末端システイン残基に下線を施してある。(IGHG1、UniProtKB/Swiss−Prot entry P01857、Igガンマ−1鎖C領域ホモサピエンス(Homo sapiens))。
図35Bは、N−末端側−S−末端をもつヒトIgG2 Fcシンメトロアドヘシン前駆体サブユニットの種々のポリペプチド合成中間体のアミノ酸配列を示す。パート(i)は、下記のものを含む3つの異なるプレ−Fcポリペプチドを示す:ヒトソニックヘッジホッグ(SHH)、ヒトインターフェロンアルファ−2(IFN)、またはヒトコレステロールエステルトランスフェラーゼ(CETP)シグナル配列(それぞれ、残基−23〜−1、−23〜−1、または−17〜−1)のいずれか、およびヒトIGHG2 Fcドメイン(残基1〜225):ヒンジ部エキソンがコードする第4アミノ酸から開始、CCVECPPCP(Ellison et al. (1982) Nuc. Acids Res. 10, 4071-4079)。これら3つの異なるプレ−Fcポリペプチドは、それぞれ248、248、および242残基の長さをもつ。パート(ii)は、N−末端側−S−末端をもつ成熟Fcドメイン(長さ=225)を示す。N−末端システイン残基に下線を施してある。(IGHG2、UniProtKB/Swiss−Prot entry P01859、Igガンマ−2鎖C領域、ホモ・サピエンス)。
図35Cは、N−末端側−S−末端をもつヒトIgG3 Fcシンメトロアドヘシン前駆体サブユニットの種々のポリペプチド合成中間体のアミノ酸配列を示す。パート(i)は、下記のものを含む3つの異なるプレ−Fcポリペプチドを示す:ヒトソニックヘッジホッグ(SHH)、ヒトインターフェロンアルファ−2(IFN)、またはヒトコレステロールエステルトランスフェラーゼ(CETP)シグナル配列(それぞれ、残基−23〜−1、−23〜−1、または−17〜−1)のいずれか、およびヒトIGHG3 Fcドメイン(残基1〜267):第1ヒンジ部エキソンがコードする第13アミノ酸から開始、CPRCP(Strausberg et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. 99, 16899-1690)。これら3つの異なるプレ−Fcポリペプチドは、それぞれ290、290、および284残基の長さをもつ。パート(ii)は、N−末端側−S−末端をもつ成熟Fcドメイン(長さ=267)を示す。N−末端システイン残基に下線を施してある。(IGHG3、UniProtKB/Swiss−Prot entry Q8N4Y9、Igガンマ−3鎖C領域、ホモ・サピエンス)。
図35Dは、N−末端側−S−末端をもつヒトIgG4 Fcシンメトロアドヘシン前駆体サブユニットの種々のポリペプチド合成中間体のアミノ酸配列を示す。パート(i)は、下記のものを含む3つの異なるプレ−Fcポリペプチドを示す:ヒトソニックヘッジホッグ(SHH)、ヒトインターフェロンアルファ−2(IFN)、またはヒトコレステロールエステルトランスフェラーゼ(CETP)シグナル配列(それぞれ、残基−23〜−1、−23〜−1、または−17〜−1)のいずれか、およびヒトIGHG4 Fcドメイン(残基1〜222):第1ヒンジ部エキソンがコードする第8アミノ酸から開始、CPSCP(Strausberg et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. 99, 16899-1690)。これら3つの異なるプレ−Fcポリペプチドは、それぞれ245、245、および239残基の長さをもつ。パート(ii)は、N−末端側−S−末端をもつ成熟Fcドメイン(長さ=222)を示す。N−末端システイン残基に下線を施してある。(IGHG4、UniProtKB/Swiss−Prot entry Q8TC63、Igガンマ−4鎖C領域、ホモ・サピエンス)。
図36Aは、N−末端側−X−末端をもつヒトFcシンメトロアドヘシン前駆体サブユニットの種々のポリペプチド合成中間体のアミノ酸配列を示す。パート(i)は、下記のものを含む3つの異なるプレ−Fcポリペプチドを示す:ヒトソニックヘッジホッグ(SHH)、ヒトインターフェロンアルファ−2(IFN)、またはヒトコレステロールエステルトランスフェラーゼ(CETP)シグナル配列(それぞれ、残基−23〜−1、−23〜−1、または−17〜−1)のいずれか、およびヒトIGHG1 Fcドメイン(残基1〜222):ヒンジ部エキソンがコードする第11アミノ酸から開始、CPPCP(Ellison et al. (1982) Nuc. Acids Res. 10, 4071-4079)。これら3つの異なるプレ−Fcポリペプチドは、それぞれ245、245、および239残基の長さをもつ。パート(ii)は、N−末端側−S−末端をもつ成熟Fcドメイン(長さ=222)を示す。N−末端システイン残基に下線を施してある。パート(iii)は、N−末端側−X−末端をもつように天然化学ライゲーションにより延長した成熟Fcドメイン(長さ=226)を示す。N−末端Xアミノ酸(たとえばシステイン、セレノシステイン)に下線を施した;ヒンジ部エキソンがコードする第6アミノ酸がこれに続く、XDKTHTCPPCP。(IGHG1、UniProtKB/Swiss−Prot entry P01857、Igガンマ−1鎖C領域、ホモ・サピエンス)。
図36Bは、N−末端側−X−末端をもつヒトFcシンメトロアドヘシン前駆体サブユニットの種々のポリペプチド合成中間体のアミノ酸配列を示す。パート(i)は、下記のものを含む3つの異なるプレ−Fcポリペプチドを示す:ヒトソニックヘッジホッグ(SHH)、ヒトインターフェロンアルファ−2(IFN)、またはヒトコレステロールエステルトランスフェラーゼ(CETP)シグナル配列(それぞれ、残基−23〜−1、−23〜−1、または−17〜−1)のいずれか、およびヒトIGHG1 Fcドメイン(残基1〜219):ヒンジ部エキソンがコードする第14アミノ酸から開始、CP(Ellison et al. (1982) Nuc. Acids Res. 10, 4071-4079)。これら3つの異なるプレ−Fcポリペプチドは、それぞれ242、242、および236残基の長さをもつ。パート(ii)は、N−末端側−S−末端をもつ成熟Fcドメイン(長さ=219)を示す。N−末端システイン残基に下線を施してある。パート(iii)は、N−末端側−X−末端をもつように天然化学ライゲーションにより延長した成熟Fcドメイン(長さ=222)を示す。N−末端Xアミノ酸(たとえばシステイン、セレノシステイン)に下線を施した;ヒンジ部エキソンがコードする第12アミノ酸がこれに続く、XPPCP。(IGHG1、UniProtKB/Swiss−Prot entry P01857、Igガンマ−1鎖C領域、ホモ・サピエンス)。
図37Aは、インテインベースの合成における、C−末端側−X−末端をもつヒトFcシンメトロアドヘシン前駆体サブユニットの種々のポリペプチド中間体のアミノ酸配列を示す。パート(i)は、下記のものを含む2つの異なるプレ−Fc−インテインポリペプチドを示す:ヒトCD2またはCD4シグナル配列(それぞれ、残基−24〜−1、または−25〜−1)のいずれか、ヒトIGHG1 Fcドメイン(残基1〜224):ヒンジ部エキソンがコードする第7アミノ酸から開始(KTHTCPPCP)、ヒトIGHG3 M1ドメイン(残基225〜241)、およびMthRIR1インテイン−キチン結合ドメイン(残基242〜441)。これら2つの異なるプレ−Fc−インテインキメラポリペプチドは、それぞれ465、および466残基の長さをもつ。パート(ii)は、ヒトFc/M1ドメインおよびMth RIR1インテイン−キチン結合ドメインを含む、成熟Fc−インテインキメラポリペプチド(長さ=441)を示す。インテイン自動開裂(autocleavage)部位に下線を施してある。パート(iii)は、チオエステル末端付きヒトFc/M1ドメイン(長さ=242)を示す。C−末端チオ−グリシン残基(Z)に下線を施してある。パート(iv)は、C−末端側−X−末端をもつヒトFc/M1ドメイン(長さ=243)を示す。C−末端Xアミノ酸残基(たとえばシステイン、セレノシステイン)に下線を施した(IGHG1、UniProtKB/Swiss−Prot entry P01857、Igガンマ−1鎖C領域、ホモ・サピエンス;IGHG3、NCBI/GenBank寄託BAA11363、膜結合型Igガンマ鎖、ホモ・サピエンス)。
図37Bは、C−末端側−S−末端をもつヒトFcシンメトロアドヘシン前駆体サブユニットの種々のポリペプチド合成中間体のアミノ酸配列を示す。パート(i)は、下記のものを含む2つの異なるプレ−Fcポリペプチドを示す:ヒトCD2またはCD4シグナル配列(それぞれ、残基−24〜−1、または−25〜−1)のいずれか、ヒトIGHG1 Fcドメイン(残基1〜224):ヒンジ部エキソンがコードする第7アミノ酸から開始(KTHTCPPCP)、およびヒトIGHG3 M1ドメインの一部(残基225〜232)。これら2つの異なるプレ−Fcポリペプチドは、それぞれ256および257残基の長さをもつ。パート(ii)は、N−末端側−S−末端をもつ成熟Fcドメイン(長さ=232)を示す。N−末端システイン残基に下線を施してある。(IGHG1、UniProtKB/Swiss−Prot entry P01857、Igガンマ−1鎖C領域、ホモ・サピエンス)。
図38Aは、インテイン−ベースの合成における、N−末端側−S−末端およびC−末端側−X−末端をもつヒトFcシンメトロアドヘシン前駆体サブユニットの種々のポリペプチド中間体のアミノ酸配列を示す。パート(i)は、下記のものを含む3つの異なるプレ−Fc−インテインポリペプチドを示す:ヒトソニックヘッジホッグ(SHH)、ヒトインターフェロンアルファ−2(IFN)、またはヒトコレステロールエステルトランスフェラーゼ(CETP)シグナル配列(それぞれ、残基−23〜−1、−23〜−1、または−17〜−1)のいずれか、ヒトIGHG1 Fcドメイン(残基1〜226):ヒンジ部エキソンがコードする第5アミノ酸から開始(CDKTHTCPPCP)、ヒトIGHG3 M1ドメイン(残基227〜243)、およびMth RIR1インテイン−キチン結合ドメイン(残基244〜443)。これら3つの異なるプレ−Fcポリペプチドは、それぞれ466、466および460残基の長さをもつ。パート(ii)は、N−末端側−S−末端をもつヒトFc/M1ドメインおよびMth RIR1インテイン−キチン結合ドメインを含む、成熟Fc−インテインキメラポリペプチド(長さ=443)を示す。N−末端システイン残基およびインテイン自動開裂部位に下線を施してある。
図38Bは、インテイン−ベースの合成における、N−末端側−S−末端およびC−末端側−X−末端をもつヒトFcシンメトロアドヘシン前駆体サブユニットの種々のポリペプチド中間体のアミノ酸配列を示す。パート(iii)は、チオエステル末端付きヒトFc/M1ドメイン(長さ=244)を示す。N−末端システイン残基およびC−末端チオ−グリシン残基(Z)に下線を施してある。パート(iv)は、N−末端システイン残基およびC−末端側−X−末端をもつFc/M1ドメイン(長さ=245)を示す。N−末端システイン残基およびC−末端Xアミノ酸残基(たとえばシステイン、セレノシステイン)に下線を施してある。(IGHG1、UniProtKB/Swiss−Prot entry P01857、Igガンマ−1鎖C領域、ヒト;IGHG3、NCBI/GenBank寄託BAA11363、膜結合型Igガンマ鎖、ホモ・サピエンス)。
図39Aは、インテイン−ベースの合成における、N−末端側−X−末端およびC−末端側−X−末端をもつヒトFcシンメトロアドヘシン前駆体サブユニットの種々のポリペプチド中間体のアミノ酸配列を示す。パート(i)は、下記のものを含む3つの異なるプレ−Fc−インテインポリペプチドを示す:ヒトソニックヘッジホッグ(SHH)、ヒトインターフェロンアルファ−2(IFN)、またはヒトコレステロールエステルトランスフェラーゼ(CETP)シグナル配列(それぞれ、残基−23〜−1、−23〜−1、または−17〜−1)のいずれか、ヒトIGHG1 Fcドメイン(残基1〜220):ヒンジ部エキソンがコードする第11アミノ酸から開始(CPPCP)、ヒトIGHG3 M1ドメイン(残基221〜237)、およびMth RIR1インテイン−キチン結合ドメイン(残基238〜437)。これら3つの異なるプレ−Fcポリペプチドは、それぞれ460、460および454残基の長さをもつ。パート(ii)は、N−末端側−S−末端をもつヒトFc/M1ドメインおよびMth RIR1インテイン−キチン結合ドメインを含む、成熟Fc−インテインキメラポリペプチド(長さ=437)を示す。N−末端システイン残基およびインテイン自動開裂部位に下線を施してある。
図39Bは、インテイン−ベースの合成における、N−末端側−X−末端およびC−末端側−X−末端をもつヒトFcシンメトロアドヘシン前駆体サブユニットの種々のポリペプチド中間体のアミノ酸配列を示す。パート(iii)は、N−末端側−X−末端をもつように天然化学ライゲーションにより延長した成熟Fcドメインキメラポリペプチド(長さ=443)を示す。N−末端Xアミノ酸(たとえばシステイン、セレノシステイン)に下線を施してある。パート(iv)は、チオエステル末端付きヒトFc/M1ドメイン(長さ=244)を示す。N−末端Xアミノ酸残基およびC−末端チオ−グリシン残基(Z)に下線を施してある。パート(v)は、N−末端側−X−末端およびC−末端側−X−末端をもつFc/M1ドメイン(長さ=245)を示す。N−末端Xアミノ酸残基およびC−末端Xアミノ酸残基に下線を施してある。(IGHG1、UniProtKB/Swiss−Prot entry P01857、Igガンマ−1鎖C領域、ホモ・サピエンス;IGHG3、NCBI/GenBank寄託BAA11363、膜結合型Igガンマ鎖、ホモ・サピエンス)。
図40Aは、インテイン−ベースの合成における、C−末端側−X−末端をもつヒトCD4シンメトロアドヘシン前駆体サブユニットの種々のポリペプチド中間体のアミノ酸配列を示す。パート(i)は、ヒトCD4シグナル配列(残基−25〜−1)および細胞外ドメイン(残基1〜371)、ならびにMth RIR1インテイン−キチン結合ドメイン(残基372〜571)を含む、プレ−CD4−インテインポリペプチド(長さ=596)を示す。パート(ii)は、ヒトCD4細胞外ドメインおよびMth RIR1インテイン−キチン結合ドメインを含む、成熟CD4−インテインキメラポリペプチド(長さ=571)を示す。インテイン自動開裂部位の位置に下線を施してある。
図40Bは、インテイン−ベースの合成における、C−末端側−X−末端をもつヒトCD4シンメトロアドヘシン前駆体サブユニットの種々のポリペプチド中間体のアミノ酸配列を示す。パート(iii)は、チオエステル末端付きヒトCD4細胞外ドメイン(長さ=372)を示す。C−末端チオ−グリシン残基(Z)に下線を施してある。パート(iv)は、C−末端側−X−末端をもつヒトCD4細胞外ドメイン(長さ=373)を示す。C−末端Xアミノ酸残基(たとえばシステイン、セレノシステイン)に下線を施してある。(CD4、UniProtKB/Swiss−Prot entry P01730、T−細胞表面糖タンパク質CD4)。
図41Aは、インテイン−ベースの合成における、C−末端側−X−末端をもつDi62−VHシンメトロアドヘシン前駆体サブユニットの種々のポリペプチド中間体のアミノ酸配列を示す。パート(i)は、マウスDi62−VHシグナル配列(残基−19〜−1)および可変ドメイン(残基1〜117)、ヒトCH1定常ドメイン(残基118〜225)、ならびにMth RIR1インテイン−キチン結合ドメイン(残基226〜425)を含む、プレ−Di62−VH−インテインポリペプチド(長さ=444)を示す。パート(ii)は、マウスDi62−VH可変ドメイン、ヒトCH1定常ドメイン、およびMth RIR1インテイン−キチン結合ドメインを含む、成熟Di62−VH−インテインキメラポリペプチド(長さ=425)を示す。インテイン自動開裂部位の位置に下線を施してある。
図41Bは、インテイン−ベースの合成における、C−末端側−X−末端をもつDi62−VHシンメトロアドヘシン前駆体サブユニットの種々のポリペプチド中間体のアミノ酸配列を示す。パート(iii)は、チオエステル末端付きマウスDi62−VH可変ドメイン/ヒトCH1定常ドメイン(長さ=226)を示す。C−末端チオ−グリシン残基(Z)に下線を施してある。パート(iv)は、C−末端側−X−末端をもつマウスDi62−VH可変ドメイン/ヒトCH1定常ドメイン(長さ=227)を示す。C−末端Xアミノ酸残基(たとえばシステイン、セレノシステイン)に下線を施してある。(Di62−VH、NCBI/GenBank寄託CAA05416、IgG重鎖、ヒトTNFアルファ抗原結合サブユニットハツカネズミ(Mus musculus))。
図42は、Di62−Vkシンメトロアドヘシン前駆体サブユニットの種々のポリペプチド合成中間体のアミノ酸配列を示す。パート(i)は、マウスDi62−Vkシグナル配列(残基−20〜−1)および可変ドメイン(残基1〜107)、およびヒトCk定常ドメイン(残基108〜214)を含む、プレ−Di62−Vk−ポリペプチド(長さ=234)を示す。パート(ii)は、マウスDi62−Vk可変ドメイン、およびヒトCk定常ドメインを含む、成熟Di62−Vk−キメラポリペプチド(長さ=214)を示す。(Di62−Vk、NCBI/GenBank寄託CAA05417、IgG軽鎖、ヒトTNFアルファ抗原結合サブユニット、ハツカネズミ)。
図43は、インテイン−ベースの合成における、C−末端側−X−末端をもつヒトTNR1Aシンメトロアドヘシン前駆体サブユニットの種々のポリペプチド中間体のアミノ酸配列を示す。パート(i)は、ヒトTNR1Aシグナル配列(残基−21〜−1)および細胞外ドメイン(残基1〜190)、ならびにMth RIR1インテイン−キチン結合ドメイン(残基191〜390)を含む、プレ−TNR1A−インテインポリペプチド(長さ=411)を示す。パート(ii)は、ヒトTNR1A細胞外ドメインおよびMth RIR1インテイン−キチン結合ドメインを含む、成熟TNR1A−インテインキメラポリペプチド(長さ=390)を示す。インテイン自動開裂部位の位置に下線を施してある。パート(iii)は、チオエステル末端付きヒトTNR1A細胞外ドメイン(長さ=191)を示す。C−末端チオ−グリシン残基(Z)に下線を施してある。パート(iv)は、C−末端側−X−末端をもつヒトTNR1A細胞外ドメイン(長さ=192)を示す。C−末端Xアミノ酸残基(たとえばシステイン、セレノシステイン)に下線を施してある。(TNR1A、UniProtKB/Swiss−Prot entry P19438、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー1A)。
図44Aは、インテイン−ベースの合成における、C−末端側−X−末端をもつヒトTNR1Bシンメトロアドヘシン前駆体サブユニットの種々のポリペプチド中間体のアミノ酸配列を示す。パート(i)は、ヒトTNR1Bシグナル配列(残基−22〜−1)および細胞外ドメイン(残基1〜235)、ならびにMth RIR1インテイン−キチン結合ドメイン(残基236〜435)を含む、プレ−TNR1B−インテインポリペプチド(長さ=457)を示す。パート(ii)は、ヒトTNR1B細胞外ドメインおよびMth RIR1インテイン−キチン結合ドメインを含む、成熟TNR1B−インテインキメラポリペプチド(長さ=435)を示す。インテイン自動開裂部位の位置に下線を施してある。パート(iii)は、チオエステル末端付きヒトTNR1B細胞外ドメイン(長さ=236)を示す。C−末端チオ−グリシン残基(Z)に下線を施してある。パート(iv)は、C−末端側−X−末端をもつヒトTNR1B細胞外ドメイン(長さ=237)を示す。C−末端Xアミノ酸残基(たとえばシステイン、セレノシステイン)に下線を施してある。(TNR1B、UniProtKB/Swiss−Prot entry 20333、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー1B)。
図44Bは、TNR1Bイムノアドヘシン前駆体サブユニットの種々のポリペプチド合成中間体のアミノ酸配列を示す。パート(i)は、TNR1Bシグナル配列(残基−22〜−1)および細胞外ドメイン(残基1〜235)、ならびにヒト重鎖定常ドメイン(残基236〜467)を含む、プレ−TNR1B−イムノアドヘシンポリペプチド(長さ=489)を示す。パート(ii)は、成熟TNR1B−イムノアドヘシン(長さ=467)を示す。
図45Aは、インテイン−ベースの合成における、C−末端側−X−末端をもつヒトVGFR1シンメトロアドヘシン前駆体サブユニットの種々のポリペプチド中間体のアミノ酸配列を示す。パート(i)は、ヒトVGFR1シグナル配列(残基−26〜−1)および細胞外ドメイン(残基1〜732)、ならびにMth RIR1インテイン−キチン結合ドメイン(残基733〜932)を含む、プレ−VGFR1−インテインポリペプチド(長さ=958)を示す。
図45Bは、インテイン−ベースの合成における、C−末端側−X−末端をもつヒトVGFR1シンメトロアドヘシン前駆体サブユニットの種々のポリペプチド中間体のアミノ酸配列を示す。パート(ii)は、ヒトVGFR1細胞外ドメインおよびMth RIR1インテイン−キチン結合ドメインを含む、成熟VGFR1−インテインキメラポリペプチド(長さ=932)を示す。インテイン自動開裂部位の位置に下線を施してある。
図45Cは、インテイン−ベースの合成における、C−末端側−X−末端をもつヒトVGFR1シンメトロアドヘシン前駆体サブユニットの種々のポリペプチド中間体のアミノ酸配列を示す。パート(iii)は、チオエステル末端付きヒトVGFR1細胞外ドメイン(長さ=733)を示す。C−末端チオ−グリシン残基(Z)に下線を施してある。パート(iv)は、C−末端側−X−末端をもつヒトVGFR1細胞外ドメイン(長さ=734)を示す。C−末端Xアミノ酸残基(たとえばシステイン、セレノシステイン)に下線を施してある。(VGFR1、UniProtKB/Swiss−Prot entry P17948、血管内皮増殖因子受容体1)。
図46Aは、インテイン−ベースの合成における、C−末端側−X−末端をもつヒトVGFR2シンメトロアドヘシン前駆体サブユニットの種々のポリペプチド中間体のアミノ酸配列を示す。パート(i)は、ヒトVGFR2シグナル配列(残基−19〜−1)および細胞外ドメイン(残基1〜745)、ならびにMth RIR1インテイン−キチン結合ドメイン(残基746〜945)を含む、プレ−VGFR2−インテインポリペプチド(長さ=964)を示す。
図46Bは、インテイン−ベースの合成における、C−末端側−X−末端をもつヒトVGFR2シンメトロアドヘシン前駆体サブユニットの種々のポリペプチド中間体のアミノ酸配列を示す。パート(ii)は、ヒトVGFR2細胞外ドメインおよびMth RIR1インテイン−キチン結合ドメインを含む、成熟VGFR2−インテインキメラポリペプチド(長さ=945)を示す。インテイン自動開裂部位の位置に下線を施してある。
図46Cは、インテイン−ベースの合成における、C−末端側−X−末端をもつヒトVGFR2シンメトロアドヘシン前駆体サブユニットの種々のポリペプチド中間体のアミノ酸配列を示す。パート(iii)は、チオエステル末端付きヒトVGFR2細胞外ドメイン(長さ=746)を示す。C−末端チオ−グリシン残基(Z)に下線を施してある。パート(iv)は、C−末端側−X−末端をもつヒトVGFR2細胞外ドメイン(長さ=747)を示す。C−末端Xアミノ酸残基(たとえばシステイン、セレノシステイン)に下線を施してある。(VGFR2、UniProtKB/Swiss−Prot entry P35968、血管内皮増殖因子受容体2)。
図47Aは、インテイン−ベースの合成における、C−末端側−X−末端をもつヒトVGFR3シンメトロアドヘシン前駆体サブユニットの種々のポリペプチド中間体のアミノ酸配列を示す。パート(i)は、ヒトVGFR3シグナル配列(残基−24〜−1)および細胞外ドメイン(残基1〜751)、ならびにMth RIR1インテイン−キチン結合ドメイン(残基752〜951)を含む、プレ−VGFR3−インテインポリペプチド(長さ=975)を示す。
図47Bは、インテイン−ベースの合成における、C−末端側−X−末端をもつヒトVGFR3シンメトロアドヘシン前駆体サブユニットの種々のポリペプチド中間体のアミノ酸配列を示す。パート(ii)は、ヒトVGFR3細胞外ドメインおよびMth RIR1インテイン−キチン結合ドメインを含む、成熟VGFR3−インテインキメラポリペプチド(長さ=951)を示す。インテイン自動開裂部位の位置に下線を施してある。
図47Cは、インテイン−ベースの合成における、C−末端側−X−末端をもつヒトVGFR3シンメトロアドヘシン前駆体サブユニットの種々のポリペプチド中間体のアミノ酸配列を示す。パート(iii)は、チオエステル末端付きヒトVGFR3細胞外ドメイン(長さ=752)を示す。C−末端チオ−グリシン残基(Z)に下線を施してある。パート(iv)は、C−末端側−X−末端をもつヒトVGFR3細胞外ドメイン(長さ=753)を示す。C−末端Xアミノ酸残基(たとえばシステイン、セレノシステイン)に下線を施してある。(VGFR3、UniProtKB/Swiss−Prot entry P35916、血管内皮増殖因子受容体3)。
図48Aは、インテイン−ベースの合成における、C−末端側−X−末端をもつヒトERBB1シンメトロアドヘシン前駆体サブユニットの種々のポリペプチド中間体のアミノ酸配列を示す。パート(i)は、ヒトERBB1シグナル配列(残基−24〜−1)および細胞外ドメイン(残基1〜621)、ならびにMth RIR1インテイン−キチン結合ドメイン(残基622〜821)を含む、プレ−ERBB1−インテインポリペプチド(長さ=845)を示す。パート(ii)は、ヒトERBB1細胞外ドメインおよびMth RIR1インテイン−キチン結合ドメインを含む、成熟ERBB1−インテインキメラポリペプチド(長さ=821)を示す。インテイン自動開裂部位の位置に下線を施してある。
図48Bは、インテイン−ベースの合成における、C−末端側−X−末端をもつヒトERBB1シンメトロアドヘシン前駆体サブユニットの種々のポリペプチド中間体のアミノ酸配列を示す。パート(iii)は、チオエステル末端付きヒトERBB1細胞外ドメイン(長さ=622)を示す。C−末端チオ−グリシン残基(Z)に下線を施してある。パート(iv)は、C−末端側−X−末端をもつヒトERBB1細胞外ドメイン(長さ=623)を示す。C−末端Xアミノ酸残基(たとえばシステイン、セレノシステイン)に下線を施してある。(ERBB1、UniProtKB/Swiss−Prot entry P00533、上皮増殖因子受容体)。
図49Aは、インテイン−ベースの合成における、C−末端側−X−末端をもつヒトERBB2シンメトロアドヘシン前駆体サブユニットの種々のポリペプチド中間体のアミノ酸配列を示す。パート(i)は、ヒトERBB2シグナル配列(残基−22〜−1)および細胞外ドメイン(残基1〜630)、ならびにMth RIR1インテイン−キチン結合ドメイン(残基631〜830)を含む、プレ−ERBB2−インテインポリペプチド(長さ=852)を示す。パート(ii)は、ヒトERBB2細胞外ドメインおよびMth RIR1インテイン−キチン結合ドメインを含む、成熟ERBB2−インテインキメラポリペプチド(長さ=830)を示す。インテイン自動開裂部位の位置に下線を施してある。
図49Bは、インテイン−ベースの合成における、C−末端側−X−末端をもつヒトERBB2シンメトロアドヘシン前駆体サブユニットの種々のポリペプチド中間体のアミノ酸配列を示す。パート(iii)は、チオエステル末端付きヒトERBB2細胞外ドメイン(長さ=631)を示す。C−末端チオ−グリシン残基(Z)に下線を施してある。パート(iv)は、C−末端側−X−末端をもつヒトERBB2細胞外ドメイン(長さ=632)を示す。C−末端Xアミノ酸残基(たとえばシステイン、セレノシステイン)に下線を施してある。(ERBB2、UniProtKB/Swiss−Prot entry P04626、受容体型チロシンタンパク質キナーゼerbB−2)。
図50Aは、インテイン−ベースの合成における、C−末端側−X−末端をもつヒトERBB3シンメトロアドヘシン前駆体サブユニットの種々のポリペプチド中間体のアミノ酸配列を示す。パート(i)は、ヒトERBB3シグナル配列(残基−19〜−1)および細胞外ドメイン(残基1〜624)、ならびにMth RIR1インテイン−キチン結合ドメイン(残基625〜824)を含む、プレ−ERBB3−インテインポリペプチド(長さ=843)を示す。パート(ii)は、ヒトERBB3細胞外ドメインおよびMth RIR1インテイン−キチン結合ドメインを含む、成熟ERBB3−インテインキメラポリペプチド(長さ=824)を示す。インテイン自動開裂部位の位置に下線を施してある。
図50Bは、インテイン−ベースの合成における、C−末端側−X−末端をもつヒトERBB3シンメトロアドヘシン前駆体サブユニットの種々のポリペプチド中間体のアミノ酸配列を示す。パート(iii)は、チオエステル末端付きヒトERBB3細胞外ドメイン(長さ=625)を示す。C−末端チオ−グリシン残基(Z)に下線を施してある。パート(iv)は、C−末端側−X−末端をもつヒトERBB3細胞外ドメイン(長さ=626)を示す。C−末端Xアミノ酸残基(たとえばシステイン、セレノシステイン)に下線を施してある。(ERBB3、UniProtKB/Swiss−Prot entry P21860、受容体型チロシンタンパク質キナーゼerbB−3)。
図51Aは、インテイン−ベースの合成における、C−末端側−X−末端をもつヒトERBB4シンメトロアドヘシン前駆体サブユニットの種々のポリペプチド中間体のアミノ酸配列を示す。パート(i)は、ヒトERBB4シグナル配列(残基−25〜−1)および細胞外ドメイン(残基1〜626)、ならびにMth RIR1インテイン−キチン結合ドメイン(残基627〜826)を含む、プレ−ERBB4−インテインポリペプチド(長さ=851)を示す。パート(ii)は、ヒトERBB4細胞外ドメインおよびMth RIR1インテイン−キチン結合ドメインを含む、成熟ERBB4−インテインキメラポリペプチド(長さ=826)を示す。インテイン自動開裂部位の位置に下線を施してある。
図51Bは、インテイン−ベースの合成における、C−末端側−X−末端をもつヒトERBB4シンメトロアドヘシン前駆体サブユニットの種々のポリペプチド中間体のアミノ酸配列を示す。パート(iii)は、チオエステル末端付きヒトERBB4細胞外ドメイン(長さ=627)を示す。C−末端チオ−グリシン残基(Z)に下線を施してある。パート(iv)は、C−末端側−X−末端をもつヒトERBB4細胞外ドメイン(長さ=628)を示す。C−末端Xアミノ酸残基(たとえばシステイン、セレノシステイン)に下線を施してある。(ERBB4、UniProtKB/Swiss−Prot entry Q15303、受容体型チロシンタンパク質キナーゼerbB−4)。
図52は、293腎細胞におけるN−末端側−S−末端をもつヒトIgG1 Fcシンメトロアドヘシンサブユニットの発現を示す。列1〜6および列7〜12は、それぞれ図35A(ii)および図36A(ii)のIgG1 Fcポリペプチドを示す。細胞上清:列1、3、5、7、9および11;細胞溶解物:列2、4、6、8、10および12。用いたシグナル配列:SHH(列1、2、7および8);IFNA(列3、4、9、10);CETP(列5、6、11および12)。
図53は、293腎細胞におけるヒトIgG1 Fcシンメトロアドヘシンサブユニットの発現を示す。列1〜2、3〜4および列5〜6は、それぞれ図35A(ii)、図36A(ii)および図37B(ii)のIgG1 Fcポリペプチドを示す。細胞上清:列1〜6。用いたシグナル配列:SHH(列1〜6)。
図54は、293腎細胞に発現したヒトIgG1 Fcシンメトロアドヘシンサブユニットの精製を示す。列2および8は、それぞれ図36Aおよび図35AのIgG1 Fcポリペプチドを示す。列1〜7:図36AのIgG1 Fcポリペプチドに関するプロテインAセファロースカラム画分。
図55は、図54に示したプロテインA−精製ヒトIgG1 Fcシンメトロアドヘシンサブユニットのチオール−セファロース結合を示す。列1〜3および列4〜6は、それぞれ図35Aおよび図36AのヒトIgG1 Fcポリペプチドを示す。列1および4:出発材料;列2および5:チオール−セファロース通過画分;列3および6:チオール−セファロース結合画分
図56は、ヒト293腎細胞におけるヒトCD4−インテイン融合タンパク質の発現を示す。列1〜4は、図40A(ii)のCD4−インテイン融合ポリペプチドを示す。細胞上清:列1および3;細胞溶解物:列2および4。
図57は、ヒト293腎細胞におけるヒトTNR1B融合タンパク質の発現を示す。列2および5は、図44A(ii)のヒトTNR1B−インテイン融合タンパク質を示す。列1および3は、図44B(ii)のヒトTNR1B−イムノアドヘシン融合タンパク質を示す。列3および6は、模擬トランスフェクション細胞からのタンパク質を示す。細胞上清:列1〜3;細胞溶解物:列4〜7。列7:対照TNR1B−イムノアドヘシン(R&D Systems)。
図58は、C−末端側−S−末端をもつTNR1Bシンメトロアドヘシンサブユニットを示す。列1〜2は、キチンアフィニティークロマトグラフィーおよびMESNAによる開裂/溶離による精製後の図44A(iii)のTNR1Bポリペプチドを示す。列3は、図44A(iii)のTNR1Bポリペプチドと蛍光標識ペプチド(New England Biolabs)との自然ライゲーション生成物を示す。パネル(i):直接蛍光;パネル(ii):抗−TNR1B抗体(R&D Systems)を用いたウェスタンブロット;(iii):SYPRO Ruby染色(Sigma−Aldrich)。
図59は、C−末端側−S−末端をもつTNR1Bシンメトロアドヘシンサブユニットを示す。列5は、キチンアフィニティークロマトグラフィーおよびシステインによる開裂/溶離による精製後の図44A(iv)のTNR1Bポリペプチドを示す。列1〜4は、TNR1B−イムノアドヘシンを示す。
図60は、TNR1Bシンメトロアドヘシンを示す。列1〜4は、酸化前(列1および4)、および10mM CuSO4の存在下で酸化した後の図44A(iv)のTNR1Bシンメトロアドヘシンを示す。列3および6は、TNR1B−イムノアドヘシン対照を示す。列1〜3:還元条件下;列4〜6:非還元条件下。TNR1Bシンメトロアドヘシンモノマー(42kd)および二量体(84kd)を、それぞれ列2および5および列5に示す。
図61Aは、Biacore T−100上の種々のTNR1BポリペプチドによるTNF−アルファ飽和結合分析を示す。図44A(iv)のTNR1Bシンメトロアドヘシンを、標準Biacoreアミン化学によりBiacore CM−5チップに共有結合させた。結合後、TNF−アルファ(R&D Systems)を指示された濃度で用いて飽和結合分析を実施した。
図61Bは、Biacore T−100上の種々のTNR1BポリペプチドによるTNF−アルファ飽和結合分析を示す。TNR1Bイムノアドヘシン(R&D Systems)を、標準Biacoreアミン化学によりBiacore CM−5チップに共有結合させた。結合後、TNF−アルファ(R&D Systems)を指示された濃度で用いて飽和結合分析を実施した。
図61Cは、Biacore T−100上の種々のTNR1BポリペプチドによるTNF−アルファ飽和結合分析を示す。図44A(iv)のTNR1B−シンメトロアドヘシンを、標準Biacoreチオール化学によりBiacore CM−5チップに共有結合させた。結合後、TNF−アルファ(R&D Systems)を指示された濃度で用いて飽和結合分析を実施した。
図62Aは、図61Aに示したTNF−アルファ飽和結合分析のスカッチャード(Scatchard)分析を示す。図44A(iv)のTNR1Bシンメトロアドヘシンをアミン化学により共有結合させた;Kd=Kd=4.697x10−9M。
図62Bは、図61Bに示したTNF−アルファ飽和結合分析のスカッチャード分析を示す。TNR1B−イムノアドヘシン(R&D Systems)をアミン化学により共有結合させた;Kd=4.089x10−9M。
図62Cは、図61Cに示したTNF−アルファ飽和結合分析のスカッチャード分析を示す。図44A(iv)のTNR1Bシンメトロアドヘシンをチオール化学により共有結合させた;Kd=0.84767x10−9M。

0023

本発明は、下記を含む化合物を提供する:連続アミノ酸の第1区域:そのそれぞれはその前のアミノ酸にペプチド結合により結合しており、その配列はあるターゲットに対する結合部位を含む;および連続アミノ酸の第2区域:そのそれぞれはその前のアミノ酸にペプチド結合により結合しており、その配列は連続アミノ酸の第1区域の配列と同一であり、かつ前記ターゲットに対する同一結合部位を含む;その際、アミノ酸の第1区域およびアミノ酸の第2区域はそれぞれ、その予め定めた末端にシステイン残基またはセレノシステイン残基を有し、それらのシステイン残基またはそれらのセレノシステイン残基は下記の構造を有する結合で連結している:

0024

0025

(各Xは同一であり、硫黄(S)またはセレン(Se)を表わし、各Cは前記のシステイン残基またはセレノシステイン残基のうちの1つのベータ−炭素を表わす)。
ある態様において、結合は下記の構造をもつ:

0026

0027

ある態様において、連続アミノ酸の第1区域および第2区域のそれぞれの予め定めた末端にある残基はシステイン残基である。1態様において、連続アミノ酸の第1区域および第2区域のそれぞれの予め定めた末端にある残基はセレノシステイン残基である。

0028

本発明は、下記を含む化合物をも提供する:連続アミノ酸の第1区域:そのそれぞれはその前のアミノ酸にペプチド結合により結合しており、その配列はあるターゲットに対する結合部位を含む;および連続アミノ酸の第2区域:そのそれぞれはその前のアミノ酸にペプチド結合により結合しており、その配列は連続アミノ酸の第1区域の配列と異なり、かつ異なる部分に対する結合部位を含む;その際、アミノ酸の第1区域およびアミノ酸の第2区域はそれぞれ、その予め定めた末端にシステイン残基またはセレノシステイン残基を有し、それらの残基は下記の構造を有する結合で連結している:

0029

0030

(各Xは同一でも異なってもよく、硫黄(S)またはセレン(Se)を表わし、各Cは前記のシステイン残基またはセレノシステイン残基のうちの1つのベータ−炭素を表わす)。

0031

ある態様において、結合は下記の構造をもつ:

0032

0033

ある態様において、アミノ酸の第1区域およびアミノ酸の第2区域のそれぞれの予め定めた末端にある残基は両方ともシステイン残基である。ある態様において、アミノ酸の第1区域およびアミノ酸の第2区域のそれぞれの予め定めた末端にある残基は両方ともセレ
ノシステイン残基である。ある態様において、アミノ酸の第1区域またはアミノ酸の第2区域のうちの1つの予め定めた一方の末端にある残基はシステイン残基であり、予め定めた他方の末端にある残基はセレノシステイン残基である。

0034

本発明は、2以上の同一の本発明化合物が少なくとも1つの結合により互いに連結したものを含む多量体を提供する。ある態様において、多量体は二量体である。ある態様において、多量体は三量体である。ある態様において、多量体は四量体である。多量体のある態様においては、1以上の結合がジスルフィド結合を含む。

0035

化合物のある態様において、アミノ酸の第1区域およびアミノ酸の第2区域の両方の予め定めた末端はそのN−末端である。ある態様において、アミノ酸の第1区域およびアミノ酸の第2区域の両方の予め定めた末端はそのC−末端である。ある態様においては、アミノ酸の第1区域およびアミノ酸の第2区域のうちの1つの予め定めた一方の末端がC末端であり、予め定めた他方の末端がN末端である。

0036

化合物のある態様において、アミノ酸の第1区域はL−アミノ酸を含む。ある態様において、アミノ酸の第1区域はD−アミノ酸を含む。ある態様において、アミノ酸の第1区域はL−アミノ酸およびD−アミノ酸を含む。

0037

ある態様において、アミノ酸の第2区域はL−アミノ酸を含む。ある態様において、アミノ酸の第2区域はD−アミノ酸を含む。ある態様において、アミノ酸の第2区域はL−アミノ酸およびD−アミノ酸を含む。

0038

ある態様において、アミノ酸の第1区域は少なくとも50個の連続アミノ酸を含む。ある態様において、アミノ酸の第2区域は少なくとも50個の連続アミノ酸を含む。ある態様において、アミノ酸の第1区域および/または第2区域は、1〜100、100〜200または200〜300個のアミノ酸の長さである。ある態様において、アミノ酸の第1区域または第2区域は、少なくとも20、25、30、35、40または45個の連続アミノ酸を含む。

0039

ある態様において、アミノ酸の第1区域は1種類より多いアミノ酸を含む。ある態様において、アミノ酸の第2区域は1種類より多いアミノ酸残基を含む。
本発明化合物のある態様において、アミノ酸の第1区域および/または第2区域は、免疫グロブリンの定常部の配列に相応する。ある態様において、免疫グロブリンはヒト免疫グロブリンである。ある態様において、免疫グロブリンの定常部は、IgG、IgAIgEIgD、またはIgM免疫グロブリンの定常部である。ある態様において、免疫グロブリンの定常部は、IgG−1、IgG−2、IgG−3、またはIgG−4免疫グロブリンの定常部である。ある態様において、IgG−1、IgG−2、IgG−3、またはIgG−4免疫グロブリンの定常部である免疫グロブリン定常部は、本明細書に示す配列の1つを有する。ある態様において、免疫グロブリンの定常部はIgG免疫グロブリンの定常部であり、そして、ヒンジ部、CH6領域およびCH3領域を含む。ある態様において、異なる部分はイムノエフェクターまたはイムノレギュレーターである。

0040

ある態様において、ターゲットはタンパク質である。ある態様において、ターゲットは、EGF受容体HER2、VEGF受容体、CD20抗原、CD11a、IgE免疫グロブリン、グリコプロテインIIa受容体、グリコプロテインIIIa受容体、TNFアルファ、またはTNF受容体、gp120である。ある態様において、連続アミノ酸の第1区域および第2区域は、TNFRSF1a、TNFRSF1b、VEGFR1、VEGFR6、VEGFR3、ヒトErb1、ヒトErb2、ヒトErb6、ヒトErb3、またはヒトErb4のうちのいずれか1つのアミノ酸配列を含む。ある態様において、連続
アミノ酸の第1区域または第2区域は、TNFRSF1a、TNFRSF1b、VEGFR1、VEGFR6、VEGFR3、ヒトErb1、ヒトErb2、ヒトErb6、ヒトErb3、またはヒトErb4のうちのいずれか1つのアミノ酸配列を含む。

0041

本発明は、ターゲットを結合するのに有効な量の本発明のいずれかの化合物、およびキャリヤーを含む、組成物を提供する。ある態様において、化合物はターゲットを結合するのに有効な量である、およびキャリヤー。ある態様において、化合物は多量体であってターゲットを結合するのに有効な量である、およびキャリヤー。ある態様において、多量体は異なる部分をも結合するのに有効な量で存在する。ある態様において、キャリヤーは医薬的に許容できるキャリヤーである。ある態様において、キャリヤーはリン酸緩衝化生食塩水である。そのような組成物を凍結乾燥することができる。

0042

本発明は、ターゲットの活性に影響を及ぼす方法であって、化合物がターゲットに結合してその活性に影響を及ぼす条件下で、ターゲットを1以上の本発明化合物の組成物と接触させることを含む方法を提供する。1態様においては、ターゲットへの組成物の結合によりターゲットの活性が増大する。1態様においては、ターゲットへの組成物の結合によりターゲットの活性が低下する。1態様において、ターゲットはEGF受容体、HER2タンパク質、VEGF受容体、CD20抗原、CD11a、IgE免疫グロブリン、グリコプロテインIIa受容体、グリコプロテインIIIa受容体、gp40、gp120、TNFアルファ、またはTNF受容体である。

0043

本発明は、本発明のいずれかの組成物、および連続アミノ酸の第3区域を含む複合体であって、連続アミノ酸の第3区域が連続アミノ酸の第1区域または第2区域のうち一方に1またはそれ以上の結合により結合している複合体を提供する。ある態様において、1またはそれ以上の結合はファンデルワールス力を含む。1態様において、1またはそれ以上の結合は水素結合を含む。1態様において、1または結合は共有結合を含む。ある態様において、1または結合はジスルフィド結合を含む。ある態様において、少なくとも1つの結合はジスルフィド結合である。ある態様において、ジスルフィド結合は2つの非末端アミノ酸残基の間にある。ある態様において、ジスルフィド結合は2つのアミノ酸残基の間にあり、それらのうち少なくとも一方は非末端アミノ酸残基である。

0044

本発明は、本発明化合物の1つを調製する方法であって、下記を含む方法を提供する:
(a)(i)その配列がN−末端シグナル配列である第1部分、これと接した(ii)その配列が連続アミノ酸の区域をコードする第2部分、これと接した(iii)その配列がC−末端インテイン含有結合ドメインをコードする第3部分を含む、組換え核酸により、連続アミノ酸の区域がC−末端インテイン含有結合ドメインと接したものを含むキメラポリペプチドの合成を可能にする条件下で、細胞をトランスフェクションし;
(b)工程(a)で産生されたキメラポリペプチドを単離し;
(c)キメラポリペプチドを、連続アミノ酸の区域からC−末端インテイン含有結合ドメインのチオ仲介開裂が起き、それがC−末端チオエステルで置換されるように処理し;
(d)工程(c)の生成物を、生成物へのシステイン残基の結合が可能となり、これによりC−末端システインを含む生成物が形成されるように処理し;そして
(e)工程(e)の生成物を工程(e)の他の生成物の存在下において、前記化合物の形成が可能な条件下で酸化する。

0045

1態様において、組換え核酸はSEQID NO.1〜8のいずれかの1つに示す配列を有する。1態様において、C−末端インテイン含有結合ドメインはインテイン−キチン結合ドメインである。1態様において、C−末端インテイン含有結合ドメインはMth
RIR1インテイン−キチン結合ドメインである。1態様においては、工程b)においてアフィニティークロマトグラフィーによりキメラポリペプチドを単離する。1態様にお
いては、工程b)において生成物をキチン誘導体樹脂曝露することによりキメラポリペプチドを単離する。1態様において、酸化条件は生成物それぞれのC−末端システイン間にジスルフィド結合の形成が可能となるものである。

0046

本発明は、独立してフォールディングするタンパク質ドメインが第2の独立してフォールディングするタンパク質ドメインに非ペプチド結合により融合したものを含む化合物を提供する。本発明は、末端システイン残基を含む第1ポリペプチド鎖がそれのS−末端において末端システイン残基を含む第2ポリペプチド鎖のS−末端に融合したものを含む化合物を提供する。本発明は、末端セレノシステイン残基を含む第1ポリペプチド鎖がそれのSe−末端において末端システイン残基を含む第2ポリペプチド鎖のS−末端に融合したものを含む化合物を提供する。本発明は、末端セレノシステイン残基を含む第1ポリペプチド鎖がそれのSe−末端において末端セレノシステイン残基を含む第2ポリペプチド鎖のSe−末端に融合したものを含む化合物を提供する。本発明は、請求項66〜69のいずれかの1項に記載される2以上の同一化合物が少なくとも1つの結合により互いに連結したものを含む多量体を提供する。

0047

本発明は、N−末端システインを含む連続アミノ酸の区域を調製する方法であって、下記を含む方法を提供する:
(a)(i)その配列がN−末端シグナル配列をコードする第1部分、これと接した(ii)その配列がN−末端システイン残基を含む連続アミノ酸の区域をコードする第2部分を含む、組換え核酸により、下記を可能にする条件下で細胞をトランスフェクションし:(i)N−末端シグナル配列がそれのC−末端においてペプチド結合により連続アミノ酸の区域のN−末端システインに連結したものを含む、キメラポリペプチドが合成され、そして(ii)N−末端シグナル配列が細胞内でキメラポリペプチドから開裂し、これによりN−末端システインを含む連続アミノ酸の区域が産生される;
(b)工程(a)で産生された連続アミノ酸の区域を回収する。

0048

本明細書に開示する1態様においては、連続アミノ酸の区域を工程(b)において単離する。
1態様において、連続アミノ酸の区域は免疫グロブリンFcポリペプチドを含む。1態様において、免疫グロブリンFcポリペプチドはヒト免疫グロブリンFcポリペプチドである。1態様において、N−末端システイン残基はヒト免疫グロブリンFcポリペプチドのCys−5残基である。1態様において、細胞は293ヒト胚細胞またはCHO−K1ハムスター卵巣細胞である。1態様において、トランスフェクションはプラスミドpSAを用いて実施される。1態様において、N−末端シグナル配列はN−末端システインを有するタンパク質から選択される。1態様において、シグナルペプチドはソニックヘッジホッグ、インターフェロンアルファ−2またはコレステロールエステルトランスフェラーゼである。1態様においては、連続アミノ酸の区域をアフィニティークロマトグラフィーにより回収する。1態様において、細胞内でのキメラポリペプチドの開裂は細胞性シグナルペプチダーゼにより行なわれる。

0049

本発明は、N−末端システインまたはセレノシステインを含む連続アミノ酸の区域を調製する方法であって、下記を含む方法を提供する:
(a)(i)その配列がN−末端シグナル配列をコードする第1部分、これと接した(ii)その配列がN−末端システイン残基を含む連続アミノ酸の区域をコードする第2部分を含む、組換え核酸により、下記を可能にする条件下で細胞をトランスフェクションし:(i)N−末端シグナル配列がそれのC−末端においてFcポリペプチドのN−末端システインに連結したものを含む、キメラポリペプチドが合成され、そして(ii)N−末端シグナル配列が細胞内でキメラポリペプチドから開裂し、これによりN−末端システインを含む連続アミノ酸の区域が産生される;
(b)工程(a)で産生された連続アミノ酸の区域のN−末端を、アミノ酸配列cys−asp−lys−thr−his−thrを含むペプチドのC−末端と、またはアミノ酸配列sec−asp−lys−thr−his−thrを含むペプチドとライゲートさせ、これによりN−末端システインまたはセレノシステインを含む連続アミノ酸の区域を生成させ;そして
(c)工程(b)で生成した連続アミノ酸の区域を回収する。

0050

ある態様において、連続アミノ酸の区域は免疫グロブリンFcポリペプチドを含む。ある態様において、免疫グロブリンFcポリペプチドはヒト免疫グロブリンFcポリペプチドである。ある態様において、N−末端システイン残基はヒト免疫グロブリンFcポリペプチドのcys−5残基である。1態様において、N−末端システイン残基はヒト免疫グロブリンFcポリペプチドのcys−11残基である。ある態様において、工程(b)のペプチドはアミノ酸配列cys−asp−lys−thr−his−thrを含み、生成した連続アミノ酸の区域はN−末端システインを含む。ある態様において、工程(b)のペプチドはアミノ酸配列sec−asp−lys−thr−his−thrを含み、生成した連続アミノ酸の区域はN−末端セレノシステインを含む。ある態様においては、工程(b)のペプチドをライゲーションの前にN−末端Msc保護基で保護する。ある態様において、細胞は293ヒト胚細胞またはCHO−K1ハムスター卵巣細胞である。ある態様において、トランスフェクションはプラスミドpSAを用いて実施される。ある態様において、N−末端シグナル配列はN−末端システインを有するタンパク質から選択される。ある態様において、シグナルペプチドはソニックヘッジホッグ、インターフェロンアルファ−2またはコレステロールエステルトランスフェラーゼである。ある態様においては、連続アミノ酸の区域をアフィニティークロマトグラフィーにより回収する。ある態様において、細胞内でのキメラポリペプチドの開裂は細胞性シグナルペプチダーゼにより行なわれる。ある態様において、N−末端システインまたはセレノシステインをもつ他の短いペプチド配列を前記配列の代わりに用いる。

0051

本発明は、C−末端システインまたはC−末端セレノシステインを含む連続アミノ酸の区域を調製する方法であって、下記を含む方法を提供する:
(a)(i)その配列がN−末端シグナル配列をコードする第1部分、これと接した(ii)その配列が連続アミノ酸の区域をコードする第2部分、これと接した(iii)その配列がC−末端インテイン含有結合ドメインをコードする第3部分を含む、組換え核酸により、下記を可能にする条件下で細胞をトランスフェクションし:(i)N−末端シグナル配列、これと接した連続アミノ酸の区域、これと接したC−末端インテイン含有結合ドメインを含む、キメラポリペプチドが合成され、そして(ii)N−末端シグナル配列がキメラポリペプチドから開裂し、これによりN−末端リジン残基を有しかつ連続アミノ酸の区域がC−末端インテイン含有結合ドメインと接したものを含む、第2キメラポリペプチドが産生される;
(b)工程(a)で産生された第2キメラポリペプチドを単離し;
(c)第2キメラポリペプチドを、連続アミノ酸の区域からC−末端インテイン含有結合ドメインのチオ仲介開裂が起き、これによりC−末端チオエステルが形成されるように処理し;
(d)工程(c)の生成物をそれのC−末端においてシステイン残基またはセレノシステイン残基とライゲートさせ、これによりC−末端システインまたはC−末端セレノシステインを含む生成物を形成させ;そして
(e)工程(d)の生成物を回収する。

0052

ある態様において、接した連続アミノ酸の区域はIgG免疫グロブリンFcポリペプチドおよびIgG M1エキソンを含む。ある態様において、IgG免疫グロブリンはヒトIgG免疫グロブリンである。ある態様において、接した連続アミノ酸の区域はCD4細
胞外ドメインを含む。ある態様において、N−末端シグナル配列はN−末端リジンを有するタンパク質から選択される。ある態様において、N−末端シグナル配列はCD2 T細胞表面糖タンパク質またはCD4 T細胞表面糖タンパク質である。ある態様において、細胞は293ヒト胚細胞またはCHO−K1ハムスター卵巣細胞である。ある態様において、トランスフェクションはプラスミドpSAを用いて実施される。ある態様において、C−末端インテイン含有結合ドメインはインテイン−キチン結合ドメインである。ある態様において、C−末端インテイン含有結合ドメインはMthRIR1インテイン−キチン結合ドメインである。ある態様において、C−末端インテイン含有結合ドメインは自己スプライシングインテイン含有結合ドメインである。ある態様においては、工程b)において生成物をキチン誘導体化樹脂に曝露することによりキメラポリペプチドを単離する。ある態様において、細胞内での第2キメラポリペプチドの開裂は細胞性シグナルペプチダーゼにより行なわれる。ある態様においては、工程(c)の生成物をシステイン残基とライゲートさせる。ある態様においては、工程(c)の生成物をセレノシステイン残基とライゲートさせる。

0053

本発明は、N−末端システインおよびC−末端システインまたはセレノシステインを含む連続アミノ酸の区域を調製する方法であって、下記を含む方法を提供する:
(a)(i)その配列がN−末端シグナル配列をコードする第1部分、これと接した(ii)その配列が連続アミノ酸の区域をコードする第2部分、これと接した(iii)その配列がC−末端インテイン含有結合ドメインをコードする第3部分を含む、組換え核酸により、下記を可能にする条件下で細胞をトランスフェクションし:(i)N−末端シグナル配列、これと接した連続アミノ酸の区域、これと接したC−末端インテイン含有結合ドメインを含む、キメラポリペプチドが合成され、そして(ii)N−末端シグナル配列がキメラポリペプチドから開裂し、これによりN−末端システイン残基を有しかつ連続アミノ酸の区域がC−末端インテイン含有結合ドメインと接したものを含む、第2キメラポリペプチドが産生される;
(b)工程(a)で産生された第2キメラポリペプチドを単離し;
(c)第2キメラポリペプチドを、連続アミノ酸の区域からC−末端インテイン含有結合ドメインのチオ仲介開裂が起き、これによりC−末端チオエステルが形成されるように処理し;
(d)工程(c)の生成物をそれのC−末端においてシステイン残基またはセレノシステイン残基とライゲートさせ、これによりC−末端システインまたはC−末端セレノシステインを含む生成物を形成させ;そして
(e)工程(d)の生成物を回収する。

0054

ある態様において、接した連続アミノ酸の区域はIgG免疫グロブリンFcポリペプチドおよびIgG M1エキソンを含む。ある態様において、IgG免疫グロブリンはヒトIgG免疫グロブリンである。ある態様において、N−末端シグナル配列はN−末端システインを有するタンパク質から選択される。ある態様において、N−末端システイン残基はヒト免疫グロブリンFcポリペプチドのcys−5残基である。ある態様において、N−末端システイン残基はヒト免疫グロブリンFcポリペプチドのcys−11残基である。ある態様において、N−末端シグナルはソニックヘッジホッグ、インターフェロンアルファ−2またはコレステロールエステルトランスフェラーゼである。ある態様において、細胞は293ヒト胚細胞またはCHO−K1ハムスター卵巣細胞である。ある態様において、トランスフェクションはプラスミドpSAを用いて実施される。ある態様において、C−末端インテイン含有結合ドメインはインテイン−キチン結合ドメインである。ある態様において、C−末端インテイン含有結合ドメインはMthRIR1インテイン−キチン結合ドメインである。ある態様において、C−末端インテイン含有結合ドメインは自己スプライシングインテイン含有結合ドメインである。ある態様においては、工程b)において生成物をキチン誘導体化樹脂に曝露することにより第2キメラポリペプチドを単離す
る。ある態様においては、工程e)においてアフィニティークロマトグラフィーにより生成物を回収する。ある態様において、細胞内でのキメラポリペプチドの開裂は細胞性シグナルペプチダーゼにより行なわれる。ある態様においては、工程(c)の生成物をシステイン残基とライゲートさせる。ある態様においては、工程(c)の生成物をセレノシステイン残基とライゲートさせる。

0055

本発明は、N−末端システインまたはセレノシステインおよびC−末端システインまたはセレノシステインを含む連続アミノ酸の区域を調製する方法であって、下記を含む方法を提供する:
(a)(i)その配列がN−末端シグナル配列をコードする第1部分、これと接した(ii)その配列が連続アミノ酸の区域をコードする第2部分、これと接した(iii)その配列がC−末端インテイン含有結合ドメインをコードする第3部分を含む、組換え核酸により、下記を可能にする条件下で細胞をトランスフェクションし:(i)N−末端シグナル配列、これと接した連続アミノ酸の区域、これと接したC−末端インテイン含有結合ドメインを含む、キメラポリペプチドが合成され、そして(ii)N−末端シグナル配列がキメラポリペプチドから開裂し、これによりN−末端システイン残基を有しかつ連続アミノ酸の区域がC−末端インテイン含有結合ドメインと接したものを含む、第2キメラポリペプチドが産生される;
(b)工程(a)で産生された第2キメラポリペプチドを単離し;
(c)(i)工程(a)で産生された連続アミノ酸の区域のN−末端を、cys−asp−lys−thr−his−thrを含むペプチドのC−末端と、またはアミノ酸配列sec−asp−lys−thr−his−thrを含むペプチドとライゲートさせ、これによりそれぞれN−末端システインまたはN−末端セレノシステインを含む連続アミノ酸の区域を形成させ;
(ii)キメラポリペプチドを、連続アミノ酸の区域からC−末端インテイン含有結合ドメインのチオ仲介開裂が起き、それがC−末端チオエステルで置換されるように処理し;
(iii)工程(c)の生成物をそれのC−末端においてシステイン残基またはセレノシステイン残基とライゲートさせ、これによりC−末端システインまたはセレノシステインを含む生成物を形成させ;そして
(d)工程(c)(iii)の生成物を回収する。

0056

ある態様において、接した連続アミノ酸の区域はIgG免疫グロブリンFcポリペプチドおよびIgG M1エキソンを含む。ある態様において、IgG免疫グロブリンはヒトIgG免疫グロブリンである。ある態様において、N−末端シグナル配列はN−末端システインを有するタンパク質から選択される。ある態様において、N−末端システイン残基はヒト免疫グロブリンFcポリペプチドのcys−11残基である。ある態様において、N−末端シグナル配列はN−末端システインを有するタンパク質から選択される。ある態様において、N−末端シグナルはソニックヘッジホッグ、インターフェロンアルファ−2またはコレステロールエステルトランスフェラーゼである。ある態様において、細胞は293ヒト胚細胞またはCHO−K1ハムスター卵巣細胞である。ある態様において、トランスフェクションはプラスミドpSAを用いて実施される。ある態様において、C−末端インテイン含有結合ドメインはインテイン−キチン結合ドメインである。ある態様において、C−末端インテイン含有結合ドメインはMthRIR1インテイン−キチン結合ドメインである。ある態様においては、工程b)において生成物をキチン誘導体化樹脂に曝露することによりキメラポリペプチドを単離する。

0057

ある態様において、免疫グロブリンFcポリペプチドはヒト免疫グロブリンFcポリペプチドである。ある態様において、FcポリペプチドのN−末端システイン残基はcys−11残基である。ある態様において、工程(c)(i)のペプチドはアミノ酸配列cy
s−asp−lys−thr−his−thrを含み、連続アミノ酸の区域。ある態様において、工程(c)(i)のペプチドはアミノ酸配列sec−asp−lys−thr−his−thrを含み、生成した連続アミノ酸の区域はN−末端セレノシステインを含む。ある態様においては、工程(c)のペプチドをライゲーションの前にN−末端Msc保護基で保護する。ある態様において、細胞は293ヒト胚細胞またはCHO−K1ハムスター卵巣細胞である。ある態様において、トランスフェクションはプラスミドpSAを用いて実施される。ある態様において、N−末端シグナル配列はN−末端システインを有するタンパク質から選択される。ある態様において、シグナルペプチドはソニックヘッジホッグ、インターフェロンアルファ−2またはコレステロールエステルトランスフェラーゼである。ある態様においては、連続アミノ酸の区域をアフィニティークロマトグラフィーにより回収する。

0058

ある態様においては、工程(c)を工程(c)(i);工程(c)(ii);工程(c)(iii)の順序で実施する。ある態様においては、工程(c)を工程(c)(ii);工程(c)(iii);工程(c)(i)の順序で実施する。

0059

本発明は、下記の連続アミノ酸の区域を還元条件下で接触させてこれにより化合物を製造すること含む、化合物の製造方法を提供する:連続アミノ酸の区域:そのそれぞれはその前のアミノ酸にペプチド結合により結合しており、その配列はあるターゲットに対する結合部位を含む;および連続アミノ酸の第2区域:そのそれぞれはその前のアミノ酸にペプチド結合により結合しており、その配列は連続アミノ酸の第1区域の配列と同一であり、かつ前記ターゲットに対する同一結合部位を含む;その際、アミノ酸の第1区域およびアミノ酸の第2区域はそれぞれ、その予め定めた末端にシステイン残基またはセレノシステイン残基を含む。

0060

本発明は、下記の連続アミノ酸の区域を還元条件下で接触させてこれにより化合物を製造すること含む、化合物の製造方法を提供する:連続アミノ酸の区域:そのそれぞれはその前のアミノ酸にペプチド結合により結合しており、その配列はあるターゲットに対する結合部位を含む;および連続アミノ酸の第2区域:そのそれぞれはその前のアミノ酸にペプチド結合により結合しており、その配列は連続アミノ酸の第1区域の配列と異なり、かつ前記ターゲットに対する同一結合部位を含む;その際、アミノ酸の第1区域およびアミノ酸の第2区域はそれぞれ、その予め定めた末端にシステイン残基またはセレノシステイン残基を含む。

0061

本発明の方法のある態様において、還元条件は連続アミノ酸の区域を変性させない。ある態様において、還元条件は、トリス−HCLおよびメルカプトエタノールを含む緩衝液に連続アミノ酸の区域を曝露することを含む。ある態様において、緩衝液はpH7.6〜8.4である。ある態様において、緩衝液はpH8である。ある態様においては、さらに生成物を酸化用緩衝液中へ入れ替えることを含む。ある態様において、連続アミノ酸の区域はCD4細胞外ドメインを含む。ある態様において、連続アミノ酸の区域は免疫グロブリンFcポリペプチドの配列を含む。ある態様において、免疫グロブリンはヒト免疫グロブリンである。

0062

ある態様において、本発明のトランスフェクションした細胞を、前記ポリペプチドを発現させるのに適切な条件下で増殖させる。
ある態様においては、下記を含む化合物を提供する:
連続アミノ酸の第1区域:そのそれぞれはその前のアミノ酸にペプチド結合により結合しており、その配列はあるターゲットに対する結合部位を含む;および
連続アミノ酸の第2区域:そのそれぞれはその前のアミノ酸にペプチド結合により結合しており、その配列は連続アミノ酸の第1区域の配列と同一であり、かつ前記ターゲット
に対する同一結合部位を含む;
その際、アミノ酸の第1区域およびアミノ酸の第2区域はそれぞれ独立して、その予め定めた末端に、硫黄(S)またはセレン(Se)を含む直鎖状脂肪族鎖酸を有する天然アミノ酸または非天然アミノを有し、それらの硫黄(S)またはセレン(Se)は下記の構造を有する結合で連結している:

0063

0064

(各Xは硫黄(S)またはセレン(Se)であり、各(C)は前記の天然または非天然アミノ酸のうちの1つの直鎖状脂肪族側鎖の炭素を表わし、nおよびmは独立して2、3、4、5、6、7、8、9または10である)。

0065

ある態様において、天然アミノ酸はホモシステインまたはホモセレノシステインである。ある態様において、アミノ酸の第1区域および第2区域はその予め定めた末端にホモシステイン残基を有する。ある態様において、アミノ酸の第1区域および第2区域はその予め定めた末端にホモセレノシステイン残基を有する。ある態様において、アミノ酸の第1区域および第2区域はその予め定めた末端にホモシステイン残基を有する。ある態様において、予め定めた末端はC−末端である。

0066

下記を含む化合物が提供される:
連続アミノ酸の第1区域:そのそれぞれはその前のアミノ酸にペプチド結合により結合しており、その配列はあるターゲットに対する結合部位を含む;および
連続アミノ酸の第2区域:そのそれぞれはその前のアミノ酸にペプチド結合により結合しており、その配列は連続アミノ酸の第1区域の配列と異なり、かつ異なる部分に対する結合部位を含む;
その際、アミノ酸の第1区域およびアミノ酸の第2区域はそれぞれ独立して、その予め定めた末端に、硫黄(S)またはセレン(Se)を含む直鎖状脂肪族側鎖酸を有する天然アミノ酸または非天然アミノを有し、それらの硫黄(S)またはセレン(Se)は下記の構造を有する結合で連結している:

0067

0068

(各Xは同一でも異なってもよく、硫黄(S)またはセレン(Se)を表わし、各(C)は前記の天然または非天然アミノ酸のうちの1つの直鎖状脂肪族側鎖の炭素を表わし、nおよびmは独立して1、2、3、4、5、6、7、8、9または10である)。

0069

ある態様において、天然アミノ酸はホモシステインまたはホモセレノシステインである。ある態様において、アミノ酸の第1区域および第2区域はその予め定めた末端にホモシステイン残基をもつ。ある態様において、アミノ酸の第1区域および第2区域はその予め定めた末端にホモセレノシステイン残基をもつ。ある態様において、アミノ酸の第1区域および第2区域はその予め定めた末端にホモシステイン残基をもつ。ある態様において、予め定めた末端はC−末端である。

0070

インテインと接した第1ポリペプチドを含み、このインテインが結合ドメインを含む第2ポリペプチドと接したタンパク質を製造する方法であって、動物細胞に動物細胞が該タンパク質を発現および分泌する条件下で核酸をトランスフェクションすることを含み、この核酸が(i)該ポリペプチドをコードする第1部分、これと接した(ii)インテインをコードする第2部分、これと接した、結合ドメインをコードする第3部分を含む、前記方法が提供される。ある態様において、動物細胞は哺乳動物に由来する。ある態様において、結合ドメインはキチン結合ドメインである。

0071

固体表面に末端ジスルフィド結合により結合したポリペプチドを含む組成物が提供される。ある態様において、固体表面はチップまたはビーズである。
下記を含む化合物が提供される:
連続アミノ酸の第1区域:そのそれぞれはその前のアミノ酸にペプチド結合により結合しており、その連続アミノ酸の第1区域はカルコゲン官能基を含む側鎖を有するアミノ酸残基を含む;および
連続アミノ酸の第2区域:少なくとも100個のアミノ酸を含み、そのそれぞれはその前のアミノ酸にペプチド結合により結合しており、連続アミノ酸の第2区域のうち少なくとも90個の連続アミノ酸はヒト免疫グロブリン定常部ポリペプチドの一部と同一の配列を有し、かつ連続アミノ酸の第2区域はその予め定めた末端にカルコゲン官能基を含む側鎖を有するアミノ酸残基を含む;
その際、連続アミノ酸の第1区域のカルコゲン官能基を含む側鎖を有するアミノ酸残基と、連続アミノ酸の第2区域のカルコゲン官能基を含む側鎖を有するアミノ酸残基は下記の構造を有する結合で連結している:

0072

0073

(各Xは独立してカルコゲンを表わし、C1は連続アミノ酸の第1区域のカルコゲン官能基を含む側鎖を有するアミノ酸残基の側鎖炭素を表わし、C2は連続アミノ酸の第2区域の側鎖炭素を表わす)。

0074

ある態様においては、連続アミノ酸の第2区域の少なくとも91、92、93、94、95、96、97、98、99または100個の連続アミノ酸が、ヒト免疫グロブリン定常部ポリペプチドの一部と同一の配列をもつ。

0075

ある態様において、C1およびC2のうち少なくとも1つはアミノ酸のベータ炭素である。ある化合物の態様において、結合は下記の構造をもつ:

0076

0077

(Sは硫黄である)。ある態様において、結合は下記の構造をもつ:

0078

0079

(Sは硫黄であり、Seはセレンである)。
ある態様において、連続アミノ酸の第2区域の予め定めた末端にカルコゲン官能基を含む側鎖を有するアミノ酸残基はシステインである。ある態様において、連続アミノ酸の第2区域の予め定めた末端にカルコゲン官能基を含む側鎖を有するアミノ酸残基はセレノシステイン、ホモシステインまたはホモセレノシステインである。ある態様において、連続アミノ酸の第1区域のカルコゲン官能基を含む側鎖を有するアミノ酸残基はシステインである。ある態様において、連続アミノ酸の第1区域のカルコゲン官能基を含む側鎖を有するアミノ酸残基はセレノシステイン、ホモシステインまたはホモセレノシステインである。ある態様において、連続アミノ酸の第1区域のカルコゲン官能基を含む側鎖を有するアミノ酸残基は末端残基である。ある態様において、連続アミノ酸の第1区域のカルコゲン官能基を含む側鎖を有するアミノ酸残基はピナルト、アンテピナルトまたはプレアンテピナルト末端残基である。

0080

ある態様において、連続アミノ酸の第2区域はヒト免疫グロブリン定常部と同一の配列をもつ。ある態様において、連続アミノ酸の第2区域はヒト免疫グロブリン定常部の一部である。ある態様において、連続アミノ酸の第1区域はヒト免疫グロブリン定常部と同一の配列をもつ。

0081

ある態様において、ヒト免疫グロブリンの定常部ポリペプチドは、ヒトIgG1、ヒトIgG2、ヒトIgG3、またはヒトIgG4である。カルコゲン官能基を含む側鎖を有するアミノ酸残基のうち少なくとも1つの側鎖はC1−C10アルキレンである化合物が提供される。

0082

2つの本発明化合物がそれぞれの化合物の連続アミノ酸の第2区域間で少なくとも1つのジスルフィド結合により互いに結合したものを含む組成物が提供される。
SEQID NO:35〜46のうちの1つに示す配列を有する、またはSEQ ID NO:53〜67のうちの1つに示す配列を有する、またはSEQ ID NO:74〜82のうちの1つに示す配列を有する、またはSEQ ID NO:89〜97のうちの1つに示す配列を有する連続アミノ酸からなるポリペプチドを含む組成物が提供され、その際、ポリペプチドは天然免疫グロブリンポリペプチド(その酵素開裂フラグメントを含む)から構成されない。

0083

SEQID NO:35〜46のうちの1つに示す配列を有する、またはSEQ ID NO:53〜67のうちの1つに示す配列を有する、またはSEQ ID NO:74〜82のうちの1つに示す配列を有する、またはSEQ ID NO:89〜97のうちの1つに示す配列を有する連続アミノ酸からなるポリペプチドを含む組成物が提供される。

0084

本発明のポリペプチドおよびキャリヤーを含む組成物が提供される。化合物の態様において、キャリヤーはリン酸緩衝化生理食塩水である。
独立して選択される本発明の2つのポリペプチドが非ペプチド結合により結合したものを含む組成物が提供される。1態様において、結合はジ−カルコゲニド(di−chalcogenide)結合である。1態様において、結合はジスルフィド結合である。

0085

本発明の2つのポリペプチドが2つのポリペプチド間で少なくとも1つのジスルフィド結合により互いに結合したものを含む組成物が提供される。
SEQID NO:44、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:81またはSEQ ID NO:96に示す配列の一部と同一の配列を有する連続アミノ酸からなり、ポリペプチドの末端残基のうち少なくとも1つはカルコゲン官能基を含む側鎖をもつものを含む組成物が提供される。

0086

化合物のある態様において、カルコゲン官能基を含む側鎖を有する末端残基はシステインまたはその類似体である。
前記に示した種々のN−末端シグナル配列、プラスミド、発現ベクター、組換え核酸、連続アミノ酸の区域、インテイン結合ドメイン、細胞タイプ、回収/単離法などは限定ではない例であり、それらをさらに後記の実施例に示す。

0087

用語の定義
連続アミノ酸の区域(stretch of amino acids):鎖状に配列した複数のアミノ酸であって、そのそれぞれはその前のアミノ酸にペプチド結合により結合しており、ただし、その鎖の第1アミノ酸はその前のアミノ酸に結合していない。鎖のアミノ酸は自然界に存在するものまたは自然界に存在しないものであってもよく、あるいはその混合物を含むこともできる。別途指摘しない限り、アミノ酸は遺伝子によりコードされるもの、自然界に存在するけれども遺伝子によりコードされないもの、または自然界に存在しないもの、およびそのいずれの選択肢であってもよい。

0088

ある態様において、連続アミノ酸の区域は生物活性をもつ;これにはターゲット結合活性またはイムノエフェクター活性が含まれるが、これらに限定されない;この生物活性は連続アミノ酸の区域が他の連続アミノ酸の区域に−X−X−結合(たとえば−S−S−、−S−Se−、−Se−Se−、または−Se−S−結合)により結合した際に保持される。“連続アミノ酸のセグメント”は“連続アミノ酸の区域”の別の記述である。

0089

N−末端アミノ酸残基:2個以上の連続アミノ酸の区域の末端残基であって、遊離α−アミノ(NH2)官能基、またはα−アミノ(NH2)官能基の誘導体をもつもの。
N−末端:N−末端アミノ酸残基の遊離α−アミノ(NH2)基(またはその誘導体)。

0090

C−末端アミノ酸残基:2個以上の連続アミノ酸の区域の末端残基であって、遊離α−カルボキシル(COOH)官能基、またはα−カルボキシル(COOH)官能基の誘導体をもつもの。

0091

C−末端:C−末端アミノ酸残基の遊離α−カルボキシル(COOH)基(またはその誘導体)。
S−末端システイン残基:連続アミノ酸の区域のN−および/またはC−末端残基であるシステインであって、遊離β−スルフヒドリル(SH)官能基、またはβ−スルフヒドリル(SH)官能基の誘導体をもつもの。

0092

S−末端:S−末端システイン残基の遊離β−スルフヒドリル(SH)基(またはその
誘導体)。
Se−末端セレノシステイン残基:連続アミノ酸の区域のN−および/またはC−末端残基であるセレノシステインであって、遊離β−セレノヒドリル(SeH)官能基、またはβ−セレノヒドリル(SeH)官能基の誘導体をもつもの。

0093

Se−末端:Se−末端セレノシステイン残基の遊離β−セレノヒドリル(SeH)基(またはその誘導体)。
X−末端アミノ酸残基:連続アミノ酸の区域のN−および/またはC−末端残基であるシステイン(またはシステイン誘導体)またはホモシステイン(またはホモシステイン誘導体)またはセレノシステイン(またはセレノシステイン誘導体)またはホモセレノシステイン(またはホモセレノシステイン誘導体)であって、それぞれ遊離β−スルフヒドリル(SH)もしくはβ−セレノヒドリル(SeH)官能基、またはその硫黄含有もしくはセレン含有誘導体をもつもの。

0094

X−末端:それぞれ、S−末端システイン/システイン誘導体残基またはSe−末端セレノシステイン/セレノシステイン誘導体残基の遊離β−スルフヒドリル(SH)またはβ−セレノヒドリル(SeH)基。さらに、X−末端はS−末端ホモシステイン残基またはSe−末端ホモセレノシステイン残基の遊離β−スルフヒドリル(SH)またはβ−セレノヒドリル(SeH)基の可能性がある。

0095

ターゲット:連続アミノ酸の区域またはその三次元構造体の一部の明確に区別される選択部位に結合するもの;受容体、輸送タンパク質ホルモン細胞接着タンパク質組織特異的接着因子増殖因子、および酵素が含まれるが、これらに限定されない。ターゲットの具体例には、ヒトEGF受容体、HER2タンパク質、VEGF受容体、ヒトCD20抗原、ヒトCD11a、ヒトIgE免疫グロブリン、ヒトグリコプロテインIIa受容体、ヒトグリコプロテインIIIa受容体、ヒトTNFアルファ、およびTNF受容体が含まれる。

0096

“結合(bond)”は、別途特定しない限り、または状況に反しない限り、共有結合、双極子−双極子相互作用、たとえば水素結合、および分子間相互作用、たとえばファンデルワールス力を含むと理解される。

0097

“シグナル配列”は、ポリペプチドの翻訳後輸送を導く短い(アミノ酸3〜60個の長さ)ペプチド鎖である。
明細書中で用いる“アミノ酸”は、1態様において、遺伝子コードされるアミノ酸、すなわちイソロイシンアラニンロイシンアスパラギン、リジン、アスパラギン酸メチオニン、システイン、フェニルアラニングルタミン酸トレオニングルタミントリプトファングリシンバリンプロリンアルギニンセリンヒスチジン、チロシン、セレノシステイン、ピロリジンのLまたはD異性体を意味し、ホモシステインおよびホモセレノシステインも含まれる。

0098

アミノ酸の他の例には、タウリンギャバγ−アミノ酪酸、gaba)、ドーパミンランチオニン、2−アミノイソ酪酸デヒドロアラニンオルニチンおよびシトルリン、ならびに非天然相同体およびその合成修飾形が含まれ、これには最高2個の炭素原子が短縮または延長されたアルキレン鎖をもつアミノ酸、場合により置換されたアリール基を含むアミノ酸、およびハロゲン化された基(ハロゲン化されたアルキル基およびアリール基を含む)を含むアミノ酸、ならびにベータまたはガンマアミノ酸、ならびに環状類似体が含まれる。

0099

イオン化しうるアミノ基およびカルボキシル基が存在するため、これらの態様における
アミノ酸は酸塩または塩基塩の形のであってもよく、あるいは中性の形であってもよい。個々のアミノ酸残基を酸化または還元により修飾することもできる。考慮される他の修飾には、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化セリルまたはトレオニル残基のヒドロキシル基リン酸化、ならびにリジン、アルギニンおよびヒスチジン側鎖のアルファ−アミノ基のメチル化が含まれる。

0100

共有結合誘導体は、特定の官能基をアミノ酸側鎖またはN−もしくはC−末端に連結させることにより製造できる。
本明細書中で用いる“カルコゲン(chalcogen)”は、硫黄、セレン、テルルおよびポロニウムのみに限定される;すなわち、本明細書中で用いる“カルコゲン”には酸素およびウンウンヘキシウム(ununhexium)は含まれない。

0101

本明細書中で用いる“カルコゲン官能基を含む側鎖”は、末端の反応性非酸素、非ウンウンヘキシウム原子を含むアミノ酸残基の側鎖である。限定ではない例として、カルコゲン官能基を含む側鎖をもつアミノ酸はシステイン、セレノシステイン、ホモシステインなどであるが、たとえばカルコゲン原子(S)を含むけれども末端の反応性カルコゲン原子を含まないメチオニンは含まれない。

0102

R−基置換をもつアミノ酸を含む化合物が本発明の範囲に含まれる。本発明化合物における置換基および置換パターンを当業者が選択して、容易に入手できる出発物質から化学的に安定な化合物を得ることができると理解される。

0103

本明細書中で用いる“天然アミノ酸”は、遺伝子コードされるアミノ酸、すなわちイソロイシン、アラニン、ロイシン、アスパラギン、リジン、アスパラギン酸、メチオニン、システイン、フェニルアラニン、グルタミン酸、トレオニン、グルタミン、トリプトファン、グリシン、バリン、プロリン、アルギニン、セリン、ヒスチジン、チロシン、セレノシステイン、ピロリジン、ならびにホモシステインおよびホモセレノシステインのLまたはD異性体を意味する。

0104

本明細書中で用いる“非天然アミノ酸”は、化学修飾されたイソロイシン、アラニン、ロイシン、アスパラギン、リジン、アスパラギン酸、メチオニン、システイン、フェニルアラニン、グルタミン酸、トレオニン、グルタミン、トリプトファン、グリシン、バリン、プロリン、アルギニン、セリン、ヒスチジン、チロシン、セレノシステイン、ピロリジン、ホモシステイン、ホモセレノシステイン、タウリン、ギャバ、ドーパミン、ランチオニン、2−アミノイソ酪酸、デヒドロアラニン、オルニチンまたはシトルリンのLまたはD異性体を意味し、これにはアルファ炭素とSまたはSeとの間にC3−C10脂肪族側鎖をもつシステイン誘導体およびセレノシステイン誘導体が含まれる。1態様において、脂肪族側鎖はアルキレンである。他の態様において、脂肪族側鎖はアルケニレンまたはアルキニレンである。

0105

本明細書に記載する連続アミノ酸の区域のほか、適切なヌクレオチド変化エンコーディングDNAに導入することにより、および/または目的とする連続アミノ酸配列を合成することにより、そのバリアントを製造できることを考慮する。選択した合成法が発現である(たとえば化学合成ではなく)場合、アミノ酸の変更が本明細書に記載する連続アミノ酸の区域の翻訳後プロセスを変化させる可能性があることは当業者には認識されるであろう;たとえばグリコレーション部位の個数もしくは位置の変更、または膜付着特性の変化。

0106

本明細書に記載する配列の変更は、たとえば保存的および非保存的変異のためのいずれかの技術および指針、たとえばU.S.Pat.No.5,364,934に示されたも
のを用いて行なうことができる。変更は、目的とする連続アミノ酸配列をコードする1以上のコドンの置換、欠失または挿入であって、天然配列と比較してアミノ酸配列の変化をもたらすものであってもよい。場合により、変更は1以上のドメインにおいて少なくとも1個のアミノ酸を他のいずれかのアミノ酸で置換するものであってもよい。目的活性に有害な影響を与えることなく挿入、置換または欠失するアミノ酸残基を決定する際の指針は、その配列を既知の相同タンパク質分子の配列と比較し、相同性の高い領域において行なうアミノ酸配列変化の個数を最小限に抑えることにより見いだすことができる。アミノ酸置換は、1つのアミノ酸を、類似の構造特性および/または化学的特性をもつ他のアミノ酸で置換した結果であってもよい;たとえば、ロイシンをセリンと交換、すなわち類似(保存的)アミノ酸置換。挿入または欠失は、場合により約1〜5個のアミノ酸の範囲であってもよい。許容される変更は、系統的に配列中のアミノ酸の挿入、欠失または置換を行ない、得られたバリアントを全長または成熟天然配列が示す活性について試験することにより決定できる。末端の変更はいずれも本明細書に開示する概念の範囲内で行なわれると理解される。

0107

結合パートナーのアミノ酸配列バリアントは多様な目的を考慮して製造でき、これにはリガンドに対する結合パートナーのアフィニティーの増大、結合パートナーの安定性、精製および製造の促進、それの血漿半減期改変、療法効果の改善、ならびに結合パートナーを療法に使用する際の副作用重症度および発生率の低下が含まれる。

0108

本明細書においては、挿入、置換または欠失バリアントを含めたこれらの配列のアミノ酸配列バリアントも考慮される。それらのバリアントは、通常はターゲット結合モノマーをコードするDNA中のヌクレオチド部位特異的変異誘発し、これによりバリアントをコードするDNAを得た後、そのDNAを組換え細胞培養で発現させることにより製造できる。最高で約100〜150個のアミノ酸残基をもつフラグメントは、インビトロ合成好都合に製造することもできる。そのようなアミノ酸配列バリアントは予め定めたバリアントであり、自然界ではみられない。バリアントは、必ずしも量的に同一値ではないが非バリアント型の質的生物活性(ターゲット結合性を含む)を示す。アミノ酸配列変更を導入する部位は予め定められるが、変異自体は必ずしも予め定められている必要はない。たとえば、特定部位における変異の性能を最適化するために、ランダムまたは飽和変異誘発(この場合は可能な残基20個すべてを導入する)をターゲットコドンにおいて実施し、発現したバリアントをスクリーニングして最適組合わせの目的活性を求める。そのようなスクリーニングは当業者が容易になしうる範囲のものである。

0109

アミノ酸の挿入は、通常はアミノ酸残基1〜10個の水準であろう;置換は、一般に単一残基に導入される;欠失は約1〜30残基の範囲であろう。欠失または挿入は、好ましくは隣接対において行なわれる;すなわち、2個の残基の欠失または2個の残基の挿入。置換、欠失、挿入またはそのいずれかの組合わせを導入または組み合わせて最終構築体が得られることは、以下の考察から十分に明らかになるであろう。

0110

1観点において、本発明は、本発明の明細書、図面、SEQID NO.または配列表に開示するアミノ酸配列に対して、少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも81%の配列同一性、より好ましくは少なくとも82%の配列同一性、よりさらに好ましくは少なくとも83%の配列同一性、よりさらに好ましくは少なくとも84%の配列同一性、よりさらに好ましくは少なくとも85%の配列同一性、よりさらに好ましくは少なくとも86%の配列同一性、よりさらに好ましくは少なくとも87%の配列同一性、よりさらに好ましくは少なくとも88%の配列同一性、よりさらに好ましくは少なくとも89%の配列同一性、よりさらに好ましくは少なくとも90%の配列同一性、よりさらに好ましくは少なくとも91%の配列同一性、よりさらに好ましくは少なくとも92%の配列同一性、よりさらに好ましくは少なくとも93%の配列同一性、よりさらに好ましくは少
なくとも94%の配列同一性、よりさらに好ましくは少なくとも95%の配列同一性、よりさらに好ましくは少なくとも96%の配列同一性、よりさらに好ましくは少なくとも97%の配列同一性、よりさらに好ましくは少なくとも98%の配列同一性、よりさらに好ましくは少なくとも99%の配列同一をもつ連続アミノ酸の区域を含む化合物に関する。

0111

アミノ酸配列同一性%値は、たとえばWUBLAST−2コンピュータープログラム(Altschul et al., Methodsin Enzymology 266:460-480 (1996))を用いて容易に求める
ことができる。

0112

天然配列のフラグメントを本明細書に示す。それらのフラグメントは、全長天然タンパク質と比較した場合にN−末端またはC−末端がトランケートしていてもよく、あるいは内部残基が欠如していてもよい。この場合も、末端変更はいずれも本明細書に開示する発明の範囲内で行なわれると理解される。特定のフラグメントは、その配列の目的とする生物活性に必須ではないアミノ酸残基を欠如する。

0113

多数の一般的な方法をいずれも使用できる。目的とするペプチドフラグメントまたは連続アミノ酸の区域のフラグメントを化学的に合成することができる。他の方法は、酵素消化により、たとえばタンパク質を特定のアミノ酸残基が規定する部位において開裂させる酵素でタンパク質を処理し、または適切な制限酵素でDNAを消化し、目的フラグメントを単離することにより、フラグメントを調製することを伴う。さらに他の適切な方法は、目的とするポリペプチド/配列フラグメントをコードするDNAフラグメントを単離し、ポリメラーゼ連鎖反応PCR)により増幅することを伴う。DNAフラグメントの目的末端を規定するオリゴヌクレオチドをPCRの5’および3’プライマーに使用する。

0114

特定の態様において、目的とする同類置換は好ましい置換という項目の下に表1に示される。そのような置換により生物活性の変化を生じさせる場合、表1に例示置換と表示した、または後記にアミノ酸クラスに関して記載する、より実質的な変化を導入し、生成物をスクリーニングする。

0115

0116

配列の機能または免疫学的同一性の実質的な改変は、下記に対するそれらの作用が有意に異なる置換を選択することにより達成される(a)置換領域におけるポリペプチド主鎖の構造、たとえばシートまたはらせんコンホメーションの維持、(b)ターゲット部位における分子の電荷もしくは疎水性の維持、または(c)側鎖の嵩の維持。自然界に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいてグループ分けすることができる:
(1)疎水性:ノルロイシン、met、ala、val、leu、ile;
(2)中性親水性:cys、ser、thr;
(3)酸性:asp、glu;
(4)塩基性:asn、gln、his、lys、arg;
(5)鎖の配向に影響を及ぼす残基:gly、pro;
(6)芳香族:trp、tyr、phe。

0117

非同類置換は、これらのクラスのうちのひとつのメンバーで他のクラスを交換することを伴うであろう。それらの置換残基を同類置換部位に、またはより好ましくは残りの(非同類)部位に導入することもできる。

0118

これらの変異は当技術分野で既知の方法、たとえばオリゴヌクレオチド仲介(部位特異的)変異誘発、アラニンスキャン、およびPCR変異誘発を用いて行なうことができる。
部位特異的変異誘発(Carter et al., Nucl. AcidsRes., 13:4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987))、カセット変異誘発(Wells et al., Gene, 34:315 (1985))、制限選択変異誘発(Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986))、または他の既知の技術をクローン化DNAについて実施して、バリアン
トDNAを製造することができる。

0119

スキャンニングアミノ酸分析は、連続アミノ酸配列に沿って1以上のアミノ酸を同定するためにも採用できる。好ましいスキャンニングアミノ酸には、比較的小さい中性アミノ酸が含まれる。そのようなアミノ酸には、アラニン、グリシン、セリンおよびシステインが含まれる。このグループのうちアラニンが一般に好ましいスキャンニングアミノ酸である;アラニンでは側鎖がベータ−炭素より遠ざかっており、バリアントの主鎖コンホメーションを変化させる可能性がより低いからである(Cunningham and Wells, Science, 244:1081-1085 (1989))。アラニンは最も一般的なアミノ酸であるという理由からも好ましい
。さらに、それは埋め込まれた位置および露出した位置の両方にしばしばみられる(Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976))。アラニン置換によって適切な量のバリアントが得られない場合、アイソテリック
(isoteric)アミノ酸を使用できる。

0120

共有結合修飾:連続アミノ酸の区域を共有結合修飾することができる。1タイプの共有結合修飾には、標的アミノ酸残基を、選択した側鎖または−x−x−結合に関与しないN−もしくはC−末端残基と反応しうる有機誘導体化剤と反応させることが含まれる。目的とする抗体のアンチ配列を精製する方法およびその逆の方法に使用するために水不溶性支持体マトリックスまたは表面に架橋させるには、二官能性試薬による誘導体化が有用である。一般に用いられる架橋剤には、たとえば下記のものが含まれる:1,1−ビスジアゾアセチル)−2−フェニルエタングルタルアルデヒド、N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、たとえば4−アジドサリチル酸とのエステル、ホモ二官能性イミドエステル:ジスクシンイミジルエステル、たとえば3,3’−ジチオビススクシンイミジルプロピオネート)を含む;二官能性マレイミド、たとえばビス−N−マレイミド−1,8−オクタン、およびメチル−3−((p−アジドフェニルジチオプロピイミデートのような剤。

0121

他の修飾には下記のものが含まれる:グルタミニルおよびアスパラギニル残基からそれぞれ対応するグルタミルおよびアスパルチル残基へのアミド分解、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリルまたはトレオニル残基のヒドロキシ基のリン酸化、リジン、アルギニンおよびヒスチジン側鎖のアルファ−アミノ基のメチル化(T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co.,サンフランシスコ, pp. 79-86 (1983))、N−末端アミンアセチル化、ならびにいずれかのC−末端カルボキシル基アミド化

0122

他のタイプの共有結合修飾は、連続アミノ酸の区域またはポリペプチドの天然グリコシレーションパターンの変更を含む。“天然グリコシレーションパターンの変更”は、本発明の目的について、アミノ酸配列中にみられる1以上の炭水化物部分を欠失させること(基礎となるグリコシレーション部位を除去することによるか、あるいは化学的手段および/または酵素手段でグリコシレーションを欠失させることによる)、および/または天然配列中に存在しない1以上のグリコシレーション部位を付加することを意味するものとする。さらにこのは、天然タンパク質のグリコシレーションにおける質的変化であって、存在する種々の炭水化物部分の性質および割合の変化を伴うものを含む。

0123

アミノ酸配列へのグリコシレーション部位の付加は、アミノ酸配列を変更することにより達成できる。この変更は、たとえば天然配列への1個以上のセリンまたはトレオニン残
基の付加、またはそれらによる置換によって行なうことができる(O−連結グリコシレーション部位について)。アミノ酸配列は、場合によりDNAレベルでの変化により、特にそのアミノ酸配列をコードするDNAを予め選択した塩基において変異させて、これにより目的アミノ酸に翻訳されるであろうコドンを形成することにより変更できる。

0124

アミノ酸配列上の炭水化物部分の数を増加させる他の手段は、化学的に、または酵素によりグリコシドをポリペプチドに結合させるものである。そのような方法は当技術分野で記載されている;たとえばWO 87/05330、1987年9月11日公開、およびAplin and Wriston,CRCCrit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)。

0125

アミノ酸配列上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的に、もしくは酵素により、またはグリコシレーションの標的となるアミノ酸残基をコードするコドンの変異置換により達成できる。化学的デグリコシレーション技術は当技術分野で既知であり、たとえばHakimuddin, et al., Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987)、およびEdge et al., Anal.
Biochem., 118:131 (1981)に記載されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素開
裂は、種々のエンド−およびエキソグリコシダーゼを用いて達成できる;Thotakura et
al., Meth. Enzymol., 138:350 (1987)に記載。

0126

他のタイプの共有結合修飾は、アミノ酸配列を下記のものに連結させることを含む:種々の非タンパク質ポリマーのひとつ、たとえばポリエチレングリコール(PEG)、ポリプロピレングリコールもしくはポリオキシアルキレンに、たとえばU.S.Pat.Nos.4,640,835;4,496,689;4,301,144;4,670,417;4,791,192もしくは4,179,337に示された方法で;またはタグポリペプチドに連結させ、これによりアンチタグ抗体がこれに選択的に結合しうるエピトープを得る。種々のタグポリペプチドおよびそれらの各抗体は当技術分野で周知である。例には下記のものが含まれる:ポリヒスチジンポリ−his)またはポリ−ヒスチジン−グリシン(ポリ−his−gly)タグ;fluHAタグポリペプチドおよびその抗体12CA5(Field et al., Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988));c−mycタグならびにそれに対する8F9、3C7、6E10、G4、B7および9E10抗体(Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985);ならびに単純ヘルペスウイルスグリコプロテインD(gD)タグおよびそれの抗体(Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990))。他のタグポリペプチドには、Flag−ペプチド(Hopp
et al., BioTechnology, 6:1204-1210 (1988));KT3エピトープペプチド(Martin et al., Science, 255:192-194 (1992));アルファ-チューブリンエピトープペプチド(Skinner et al., J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991));ならびにT7遺伝子10タンパ
ク質ペプチドタグ(Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990))が含まれる。

0127

塩類
本明細書に開示する化合物の塩類は本発明の範囲に含まれる。本明細書中で用いる“塩類”は、本発明化合物の酸塩または塩基塩を調製することにより修飾した本発明化合物の塩である。

0128

医薬
前記の塩類は医薬的に許容できる。医薬的に許容できる塩類の例には、塩基性残基、たとえばアミンの鉱酸塩または有機酸塩;酸性残基、たとえばカルボン酸残基アルカリ塩または有機塩が含まれるが、これらに限定されない。これらの塩類は、有機酸または無機酸を用いて調製できる。そのような酸性塩は、クロリドブロミド硫酸塩、硝酸塩リン酸塩スルホン酸塩ギ酸塩酒石酸塩マレイン酸塩リンゴ酸塩クエン酸塩安息香酸塩サリチル酸塩アスコルビン酸塩などである。カルボン酸塩は、アルカリ土類
金属塩ナトリウム塩カリウム塩またはリチウム塩である。

0129

本明細書に開示する医薬的に許容できる塩類は、いずれか好都合な方法で、たとえば対応する遊離塩基または遊離酸溶液または懸濁液を1化学当量の医薬的に許容できる酸または塩基で処理することにより調製できる。好都合な濃縮法または結晶化法を用いて塩類を単離できる。適切な酸の具体例は、酢酸乳酸コハク酸マレイン酸酒石酸クエン酸グルコン酸アスコルビン酸安息香酸ケイ皮酸フマル酸、硫酸、リン酸塩酸臭化水素酸ヨウ化水素酸スルファミン酸スルホン酸、たとえばメタンスルホン酸ベンゼンスルホン酸p−トルエンスルホン酸および関連の酸である。具体的な塩基は、ナトリウムカリウムおよびカルシウムである。

0130

用語“医薬的に許容できるキャリヤー”は、賦形剤、キャリヤーまたは希釈剤を含むと理解される。用いられる特定のキャリヤー、希釈剤または賦形剤は、有効成分を適用する手段および目的に依存するであろう。

0131

本発明化合物は単独で、または1種類以上の医薬的に許容できるキャリヤーと組み合わせて、1回量または多数回量で投与できる。適切な医薬的に許容できるキャリヤーには、不活性固体希釈剤または充填剤無菌水性溶液および種々の有機溶剤が含まれる。本明細書に開示する医薬組成物は、種々の剤形、たとえば注射用液剤錠剤散剤トローチ剤シロップ剤などで容易に投与できる。これらの医薬組成物は、所望により他の成分、たとえば着香剤結合剤、賦形剤などを含有することができる。さらに、滑沢剤、たとえばステアリン酸マグネシウムラウリル硫酸ナトリウムおよびタルクを錠剤製造のために使用できる。同様なタイプの固体組成物を、充填済み軟および硬ゼラチンカプセル剤中の充填剤として使用することもできる。これに好ましい物質には、乳糖(lactoseまたはmilk sugar)および高分子量ポリエチレングリコールが含まれる。経口投与のために水性懸濁液剤またはエリキシル剤が望ましい場合、それに含まれる必須有効成分を種々の甘味剤または着香剤、着色剤または色素、および所望により乳化剤または懸濁化剤、ならびに希釈剤、たとえば水、エタノールプロピレングリコールおよびその組合わせと組み合わせることができる。

0132

非経口投与のためには、本発明化合物またはその医薬的に許容できる塩を無菌水溶液中に含有する液剤を使用できる。それらの水性液剤は必要に応じて適切に緩衝化すべきであり、液体希釈剤は十分な生理食塩水またはグルコースでまず等張にすべきである。これらの特定の水性液剤は、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与に特に適切である。用いる無菌媒質はすべて、当業者に既知の標準法によって容易に入手できる。

0133

最終的な医薬組成物を単位剤形に加工し(たとえばバイアル中の散剤もしくは凍結乾燥製剤、バイアル中の液剤、錠剤、カプセル剤またはサッシェ)、次いで販売のために包装することができる。加工工程は個々の単位剤形に応じて異なるであろう。たとえば、錠剤は通常は加圧下で圧縮して目的形状にされ、カプセル剤またはサッシェには単純な充填操作を用いる。種々の単位剤形を製造するために用いられる手法は当業者には自明である。

0134

本発明組成物は多様な形態をとることができる。これらには、たとえば液体半固体および固体剤形、たとえば液剤(たとえば注射用および注入用液剤)、分散液剤または懸濁液剤、錠剤、丸剤、散剤、リポソームおよび坐剤が含まれる。好ましい形態は意図する投与様式および療法用途に依存する。ある組成物は注射用または注入用液剤の形態である。ある投与様式は非経口(たとえば静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内)である。ある態様においては、本発明化合物を静脈内注入または注射により投与する。他の態様においては、本発明化合物を筋肉内または皮下注射により投与する。

0135

本発明において意図する療法用組成物は、一般に無菌でありかつ製造および貯蔵の条件下で安定でなければならない。本発明組成物は、高い薬物濃度に適切な液剤、マイクロエマルション、分散液剤、リポソーム、または他の特注構造として配合することができる。無菌の注射用液剤は、必要量の本発明化合物を、必要に応じて1種類または組み合わせた成分と共に、適切な溶剤に含有させ、続いて濾過滅菌することにより調製できる。一般に分散液剤は、基本的な分散媒質および前記に挙げたもののうち必要な他の成分を含有する無菌ビヒクルに有効化合物を取り込ませることにより調製される。無菌注射液剤を調製するための無菌散剤の場合、好ましい調製法真空乾燥および凍結乾燥であり、これにより有効成分といずれかの希望する追加成分を合わせた散剤が、予め無菌濾過したその溶液から得られる。液剤の適正な流動性は、たとえばレシチンなどのコーティングの採用により、分散液剤の場合は必要な粒径の維持により、および界面活性剤の使用により、維持することができる。注射用組成物持続的な吸収は、吸収を遅延させる物質、たとえばモノステアリン酸塩およびゼラチンを組成物に含有させることによってもたらすことができる。

0136

ある態様において、有効化合物は化合物が急速に放出されるのを防ぐキャリヤーと共に調製することができる;たとえば埋込み剤、経皮パッチ、およびマイクロカプセル化送達系を含む、制御放出配合物生分解性生体適合性ポリマー、たとえばエチレンビニルアセテート、ポリアンヒドリドポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸を使用できる。それらの配合物を調製するための多数の方法が特許査定されており、または当業者に一般的に知られている。たとえばSustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc.,ニューヨーク, 1978を参照。特定の態様において、本発明化合物は、たとえば不活性希釈剤または同化しうる食用キャリヤーと共に経口投与することができる。本発明化合物(および、所望により他の成分)を硬殻もしくは軟殻ゼラチンカプセルに内包するか、圧縮して錠剤にするか、または対象の食事に直接取り込ませることもできる。経口療法投与のためには、本発明化合物を賦形剤と共に含有させ、摂取可能な錠剤、口腔錠、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁液剤、シロップ剤、カシェ剤などの形で使用できる。本発明化合物を非経口投与以外で投与する場合、化合物の不活性化を阻止する物質で化合物をコーティングし、またはそれと共に投与することができる。

0137

補助有効成分、たとえば化学療法薬抗新生物薬または抗腫瘍薬を組成物に取り込ませることもできる。さらに、本発明化合物を1種類以上の追加の療法薬と共配合および/または共投与することができる。これらの薬剤には、限定ではないが、他のターゲットに結合する抗体(たとえば1種類以上の増殖因子またはサイトカイン、それらの細胞表面受容体に結合する抗体)、結合タンパク質、抗新生物薬、化学療法薬、抗腫瘍薬、アンチセンスオリゴヌクレオチド、増殖因子が含まれる。1態様において、本明細書に開示する化合物の医薬組成物は1種類以上の追加療法薬を含むことができる。

0138

療法用として、本明細書に開示する組成物を多様な様式で投与でき、これには可溶性形態ボーラス注射連続注入、埋込み剤からの持続放出経口摂取局所注射(たとえば心臓内、筋肉内)、全身注射、または医薬技術分野で周知の他の適切な方法によるものが含まれる。医薬投与のための他の方法には経口、皮下、経皮、静脈内、筋肉内および非経口投与法が含まれるが、これらに限定されない。典型的には、可溶性組成物は精製した化合物を生理的に許容できるキャリヤー、賦形剤または希釈剤と共に含むであろう。それらのキャリヤーは、使用する用量および濃度でレシピエントに対して無毒性であろう。それらの組成物の調製は、化合物と、緩衝剤酸化防止剤炭水化物(グルコース、ショ糖またはデキストリンを含む)、キレート化剤、たとえばEDTAグルタチオン、ならびに他の安定剤および賦形剤との混和を伴うことができる。中性緩衝化生理食塩水または同種血清アルブミンと混合した生理食塩水は、適切な希釈剤の例である。適切な賦形剤溶液(たとえばショ糖)を希釈剤として用いて、製品凍結乾燥品として配合することができる

0139

他の誘導体は、非タンパク質ポリマーに共有結合した本発明化合物/組成物を含む。ポリマーへの結合は、通常は、化合物の好ましい生物活性、たとえば化合物がターゲットに結合する活性を妨げないように行なわれる。非タンパク質ポリマーは普通は親水性合成ポリマー、すなわち合成しなければ自然界にみられないポリマーである。しかし、自然界に存在し、組換えまたはインビトロ法で製造されるポリマーも、自然界から単離したポリマーと同様に有用である。親水性ポリビニルポリマー、たとえばポリビニルアルコールおよびポリビニルピロリドンが本発明の範囲に含まれる。特に有用なものは以下のものである:ポリアルキレンエーテル、たとえばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチレンエステルまたはメトキシポリエチレングリコール;ポリオキシアルキレン、たとえばポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン、およびポリオキシエチレンとポリオキシプロピレンのブロックコポリマープルロニック(Pluronic));ポリメタクリレートカルボマー(carbomer);下記を含む分枝または非分枝多糖類糖モノマーであるD−マンノース、D−およびL−ガラクトースフコースフルクトースD−キシロース、L−アラビノース、D−グルクロン酸シアル酸D−ガラクツロン酸、D−マンヌロン酸(たとえばポリマンヌロン酸またはアルギン酸)、D−グルコサミン、D−ガラクトサミン、D−グルコースならびにノイラミン酸ホモ多糖類およびヘテロ多糖類、たとえば乳糖、アミロペクチンデンプンヒドロキシエチルデンプンアミロースデキストラン硫酸デキストラン、デキストリン、グリコーゲン、または酸性ムコ多糖類多糖サブユニット、たとえばヒアルロン酸を含む;糖アルコールのポリマー、たとえばポリソルトールおよびポリマニトール;ならびにヘパリンまたはヘパロン

0140

本発明の医薬組成物は、“治療有効量”または“予防有効量”の本発明化合物を含有することができる。“治療有効量”は、必要な用量または期間で目的とする治療結果を達成するのに有効な量を表わす。本発明化合物の治療有効量は、個体の疾病状態年齢性別および体重などの要因に従って異なる可能性がある。治療有効量は、その治療上有益な効果の方が化合物の毒性または有害作用を上回る量でもある。“予防有効量”は、必要な用量または期間で目的とする予防結果を達成するのに有効な量を表わす。典型的には、予防量は疾病の前または初期段階の対象に用いられるので、予防有効量は治療有効量より少ないであろう。

0141

医薬組成物の例
限定ではないが、そのような組成物および用量の例を以下に示す:
ベバシズマブ(bevacizumab)(たとえばAvastin)の配列をもつ連続アミノ酸を含む連続アミノ酸の区域を含む化合物を含有する組成物は、トレハロース水和物、リン酸ナトリウム一塩基性、1水和物)、リン酸ナトリウム(二塩基性無水物)、ポリソルベート20(polysorbate 20)、およびUSP注射用水を含有することができる。この組成物を凍結乾燥することもでき、これに再構成のために水を添加することができる。ある態様において、組成物は6.2または約6.2のpHをもつ。1態様においては、本発明化合物を化学療法薬、たとえば静脈内5−フルオロウラシルと組み合わせて、結腸または直腸転移性癌を伴う患者の処置のために投与することができる。1態様においては、本発明化合物を0.1〜10mg/kgの用量で14日毎に1回、静脈内注入として投与する。他の態様において、用量は5mg/kgであり、14日毎に1回投与される。ある態様において、用量は1.0〜2.0mg/kgであり、14日毎に1回投与される。ある態様において、用量は0.01〜1.5mg/kgであり、14日毎に1回投与される。ある態様において、用量は0.001〜10mg/kgであり、1〜21日毎に1回投与される。

0142

トラスツヅマブ(trastuzumab)(たとえばHerceptin)の配列をもつ連続アミノ酸を含む連続アミノ酸の区域を含む化合物を含有する組成物は、トレハロース2水和物、塩酸L−ヒスチジン、L−ヒスチジンおよびポリソルベート20、USPを含有することができる。これは、保存剤として1.1%のベンジルアルコールまたはその均等物を含有する静菌注射用水(Bacteriostatic Water for
Injection)(BWFI)USPまたはその均等物を用いて再構成することができる。ある態様において、組成物は約6.0のpHをもつ。この組成物を凍結乾燥することもでき、これに再構成のために水を添加することができる。1態様においては、転移性乳癌を伴う対象であってその腫瘍がHER2タンパク質を過剰発現している対象に、本発明化合物を投与することができる。ある態様において、対象は化学療法を受けた/受けている。他の態様においては、本発明化合物をパクリタキセル(paclitaxel)と組み合わせて、転移性乳癌を伴う対象であってその腫瘍がHER2タンパク質を過剰発現しておりかつそれらの転移性疾患に対する化学療法を受けていない対象に投与する。1態様においては、本発明化合物を0.1〜10mg/kgの初回量で連続45〜120分間注入静脈注入により投与する。他の態様においては、本発明化合物を4mg/kgの用量で90分間の注入により投与する。ある態様においては、1週間の維持量を対象に2mg/kgの用量で30分間の注入により投与する。ある態様においては、0.5〜1.5mg/kgの用量で90分間の注入により投与する。ある態様においては、1週間の維持量を対象に0.5〜1.0mg/kgの用量で30分間の注入により投与する。ある態様においては、本発明化合物を0.04〜0.5mg/kgの用量で90分間の注入により投与する。ある態様においては、本発明化合物を0.001〜10mg/kgの用量で90分間の注入により投与する。

0143

リツキシマブ(rituximab)(たとえばRituxin)の配列をもつ連続アミノ酸を含む連続アミノ酸の区域を含む化合物を含有する組成物は、塩化ナトリウムクエン酸ナトリウム2水和物、ポリソルベート80、および注射用水(USP)またはその均等物を含有することができる。ある態様においては、組成物のpHを6.5に調整する。この組成物を凍結乾燥することもでき、これに再構成のために水を添加することができる。1態様においては、本発明化合物を再発性または難治性、軽度または濾胞性、CD20陽性、B細胞性非ホジキンリンパ腫の処置のために対象に投与する。1態様においては、本発明化合物を250〜500mg/m2の用量で週1回、4または8用量、静脈内注入投与する。他の態様においては、本発明化合物を375mg/m2の用量で週1回、4または8用量、静脈内注入投与する。1態様においては、本発明化合物を150〜250mg/m2の用量で週1回、4または8用量、静脈内注入投与する。1態様においては、本発明化合物を1.5〜5mg/m2の用量で週1回、4または8用量、静脈内注入投与する。1態様においては、本発明化合物を1.0〜500mg/m2の用量で週1回、4または8用量、静脈内注入投与する。

0144

エファリズマブ(efalizumab)(たとえばRaptiva)の配列をもつ連続アミノ酸を含む連続アミノ酸の区域を含む化合物を含有する組成物は、ショ糖、塩酸L−ヒスチジン1水和物、L−ヒスチジンおよびポリソルベート20を含有することができる。そのような組成物を無菌の非USP水もしくは無菌注射用水USPまたはその均等物で希釈して適切な剤形にすることができる。この組成物を凍結乾燥することもでき、これに再構成のために水を添加することができる。1態様においては、本発明化合物を慢性中等度ないし重篤斑状乾癬の処置のために対象に投与する。そのような対象は全身療法または光線療法の候補であってもよい。ある態様においては、本発明化合物を0.1〜1.1mg/kg皮下(SC)コンディショニング量で1回投与し、続いて0.8〜1.5mg/kg(最大1回量は合計250mgを超えない)を週1回、皮下投与する。他の態様においては、本発明化合物を0.7mg/kg皮下コンディショニング量で1回投与し、続いて1mg/kg(最大1回量は合計200mgを超えない)を週1回、皮下投与す
る。ある態様においては、本発明化合物を0.001〜1.0mg/kg皮下コンディショニング量で1回投与し、続いて0.008〜0.015mg/kgを週1回、皮下投与する。

0145

オマリズマブ(omalizumab)(たとえばXolair)の配列をもつ連続アミノ酸を含む連続アミノ酸の区域を含む化合物を含有する組成物は、ショ糖、塩酸L−ヒスチジン1水和物、L−ヒスチジンおよびポリソルベート20を含有することができる。そのような組成物を凍結乾燥することができる。ある態様においては、この組成物を無菌注射用水USPまたはその均等物で希釈して適切な剤形にする。1態様においては、本発明化合物を中等度ないし重篤な持続性喘息の処置のために対象に投与する。他の態様においては、本発明化合物を、多年草空中アレルゲンに対して陽性皮膚検査またはインビトロ反応性を示す対象、および喘息増悪の発生率を低下させるための吸入コルチコステロイドによって適切に症状制御されない対象に投与する。ある態様においては、本発明化合物を100〜400mgの用量で2または4週毎に皮下投与する。ある態様においては、本発明化合物を150〜375mgの用量で2または4週毎に皮下投与する。ある態様においては、本発明化合物を25〜150mgの用量で2または4週毎に皮下投与する。ある態様においては、本発明化合物を1〜4mgの用量で2または4週毎に皮下投与する。

0146

エタネルセプト(etanercept)(たとえばEnbrel)の配列をもつ連続アミノ酸を含む連続アミノ酸の区域を含む化合物を含有する組成物は、マンニトール、ショ糖およびトロメタミンを含有することができる。ある態様において、組成物は凍結乾燥品の形態である。ある態様においては、この組成物をたとえば無菌の静菌注射用水(BWFI)USP(0.9%ベンジルアルコールを含有)またはその均等物で再構成することができる。ある態様においては、本発明化合物を、中等度ないし重篤な活動性リウマチ性関節炎を伴う対象における徴候および症状の軽減、主臨床応答誘導構造損傷進行抑制、ならびに身体機能の改善のために対象に投与する。本発明化合物をメトトレキセート(methotrexate)(MTX)と組み合わせて、または単独で初回投与することができる。ある態様においては、本発明化合物を、1種類以上のDMARDに対して適切な応答が得られない対象における中等度ないし重篤な活動性多関節型若年性リウマチ性関節炎の徴候および症状を軽減するために対象に投与する。ある態様においては、本発明化合物を、乾癬性関節炎を伴う対象における徴候および症状の軽減、活動性関節炎の構造損傷の進行抑制、ならびに身体機能の改善のために対象に投与する。ある態様においては、本発明化合物を、強直性脊椎炎を伴う対象における徴候および症状の軽減のために対象に投与する。ある態様においては、本発明化合物を、慢性の中等度ないし重篤な斑状乾癬の処置のために対象に投与する。対象がリウマチ性関節炎、乾癬性関節炎または強直性脊椎炎を伴う態様においては、本発明化合物を25〜75mg/週で、1回以上の皮下(SC)注射として投与する。他の態様においては、本発明化合物を50mg/週で、1回の皮下注射として投与する。対象が斑状乾癬を伴う態様においては、本発明化合物を25〜75mgで週2回または4日間空けて3カ月間投与し、続いて25〜75mg/週の維持量に減らす。他の態様においては、本発明化合物を50mgの用量で週2回または4日間空けて3カ月間投与し、続いて50mg/週の維持量に減らす。ある態様において、用量は上記用量より2〜100倍少ない。対象が活動性多関節型若年性リウマチ性関節炎を伴う態様においては、本発明化合物を0.2〜1.2mg/kg/週の用量(最大75mg/週まで)で投与することができる。他の態様においては、本発明化合物を0.8mg/kg/週の用量(最大50mg/週まで)で投与する。ある態様において、用量は上記用量より2〜100倍少ない。

0147

インフリキシマブ(infliximab)(たとえばRemicade)の配列をもつ連続アミノ酸を含む連続アミノ酸の区域を含む化合物を含有する組成物は、ショ糖、ポリソルベート80、一塩基性リン酸ナトリウム1水和物、および二塩基性リン酸ナトリウ
ム2水和物を含有することができる。保存剤は1態様においては存在しない。ある態様において、組成物は凍結乾燥品の形態である。ある態様においては、この組成物をたとえば注射用水(BWFI)USPで再構成する。ある態様において、組成物のpHは7.2または約7.2である。1態様においては、本発明化合物を、リウマチ性関節炎を伴う対象に、2〜4mg/kgの用量で静脈内注入として投与し、続いて同様な追加量を第1回注入の2および6週後、次いでその後8週毎に投与する。他の態様においては、本発明化合物を、3mg/kgの用量で静脈内注入として投与し、続いて同様な追加量を第1回注入の2および6週後、次いでその後8週毎に投与する。さらなる態様においては、用量を最大10mg/kgに調整し、または4週毎の頻度で処置する。ある態様においては、本発明化合物をメトトレキセートと組み合わせて投与する。1態様においては、本発明化合物を、クローン病または瘻孔形成クローン病を伴う対象に、中等度ないし重篤な活動性クローン病または瘻孔形成疾患の処置のために、2〜7mg/kgの用量で誘導レジメンとして0、2および6週目に投与し、続いてその後8週毎に4〜6mg/kgの維持レジメンを施す。さらなる態様においては、本発明化合物を、中等度ないし重篤な活動性クローン病または瘻孔形成疾患の処置のために、5mg/kgの用量で誘導レジメンとして0、2および6週目に投与し、続いてその後8週毎に5mg/kgの維持レジメンを施す。ある態様においては、用量を最大10mg/kgに調整する。1態様においては、本発明化合物を、強直性脊椎炎を伴う対象に、2〜7mg/kgの用量で静脈内注入として投与し、続いて第1回注入の2および6週後、次いでその後6週毎に、同様な追加量を投与する。他の態様においては、本発明化合物を、5mg/kgの用量で静脈内注入として投与し、続いて第1回注入の2および6週後、次いでその後6週毎に、同様な追加量を投与する。1態様においては、本発明化合物を、乾癬性関節炎を伴う対象に、2〜7mg/kgの用量で静脈内注入として投与し、続いて第1回注入の2および6週後、次いでその後8週毎に、同様な追加量を投与する。さらなる態様においては、本発明化合物を、5mg/kgの用量で静脈内注入として投与し、続いて第1回注入の2および6週後、次いでその後8週毎に、同様な追加量を投与する。ある態様においては、本発明化合物をメトトレキセートと共に投与する。1態様においては、本発明化合物を、潰瘍性大腸炎を伴う対象に中等度ないし重篤な活動性潰瘍性大腸炎の処置のために、2〜7mg/kgの用量で誘導レジメンとして0、2および6週目に投与し、続いてその後8週毎に2〜7mg/kgの維持レジメンを施す。他の態様においては、本発明化合物を、潰瘍性大腸炎を伴う対象に、5mg/kgの用量で誘導レジメンとして0、2および6週目に投与し、続いてその後8週毎に5mg/kgの維持レジメンを施す。ある態様において、個々の疾患の処置につき用量は上記用量より2〜100倍少ない。

0148

セツキシマブ(cetuximab)(たとえばErbitux)の配列をもつ連続アミノ酸を含む連続アミノ酸の区域を含む化合物を含有する組成物は、塩化ナトリウム、二塩基性リン酸ナトリウム7水和物、一塩基性リン酸ナトリウム1水和物を含有し、保存剤を含有しない組成物を含むことができる。ある態様において、組成物は凍結乾燥品の形態である。ある態様においては、この組成物をたとえば注射用水USPで再構成する。ある態様において、組成物のpHは約7.0〜約7.4の範囲である。1態様においては、本発明化合物を、EGFR発現性転移性結腸直腸癌の処置のために対象に投与する。他の態様においては、本発明化合物を、イリノテカン(irinotecan)ベースの化学療法に対して治療抵抗性である患者の処置のためにイリノテカンと併用する。ある態様においては、本発明化合物を、300〜500mg/m2の用量で120分間の静脈内注入(最大注入速度5mL/分)で投与する初回負荷量初回注入)として投与する。さらなる態様においては、本発明化合物を、400mg/m2の用量で120分間の静脈内注入(最大注入速度5mL/分)で投与する初回負荷量(初回注入)として投与する。ある態様において、週間維持量(他のすべての注入)は200〜300mg/m2であり、60分間かけて注入される(最大注入速度5mL/分)。ある態様において、週間維持量(他のすべての注入)は250mg/m2であり、60分間かけて注入される(最大注入速度
5mL/分)。ある態様において、個々の疾患の処置につき用量は上記用量より2〜100倍少ない。

0149

アブシキシマブ(abciximab)(たとえばRecopro)の配列をもつ連続アミノ酸を含む連続アミノ酸の区域を含む化合物を含有する組成物は、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウムおよびポリソルベート80を含有し、保存剤を含有しない組成物を含むことができる。ある態様において、組成物は凍結乾燥品の形態である。ある態様においては、この組成物をたとえば注射用水USPで希釈または再構成する。ある態様において、組成物のpHは7.2または約7.2である。ある態様においては、本発明化合物を経皮冠状動脈介入PCI)に対する補助として用いる。そのような用途においては、本発明組成物を0.15〜0.35mg/kgの静脈内ボーラスとしてPCI開始の10〜60分前に投与することができる。他の態様において、用量は0.2mg/kgである。ある態様においては、ボーラス投与に続いて0.1〜0.15g/kg/分を最高12時間、静脈内連続注入する。他の態様において、用量は0.125g/kg/分で最高12時間である。1態様においては、本発明組成物を、不安定狭心症罹患している対象に経皮冠状動脈介入(PCI)に対する補助として用いる。そのような用途の1態様においては、本発明組成物を0.1〜0.4mg/kgの静脈内ボーラスとしてPCI開始前に投与し、続いて5〜15g/分を最高24時間、静脈内連続注入し、PCI後1時間で終了する。他の態様においては、本発明組成物を0.25mg/kgの静脈内ボーラスとしてPCI開始前に投与し、続いて10g/分を最高24時間、静脈内連続注入し、PCI後1時間で終了する。ある態様において、個々の疾患の処置につき用量は上記用量より2〜100倍少ない。

0150

本明細書に記載する組成物の各態様において、凍結乾燥品の形態である場合、組成物をたとえば無菌水溶液、無菌水、無菌注射用水(USP)、無菌の静菌注射用水(USP)、および当業者に既知であるその均等物で再構成することができる。

0151

本発明化合物のいずれかを投与する際、化合物を単独で、キャリヤー中において、医薬組成物の一部として、またはいずれか適切なビヒクル中において、投与することができると理解される。

0152

用量
本明細書中に用量範囲、たとえば1〜10mg/kg/週と記載した場合、本発明は上限〜下限のそれぞれの整数、およびその10分の1をも含むと理解される。したがって、上記のに挙げた例の場合、本発明は1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、・・・・・mg/kg、最大10mg/kgまでを意図する。

0153

各態様において、本発明化合物は1回量として投与でき、あるいは多数回量として投与できる。
一般に、前記の方法により障害または状態を処置するための1日量は、通常は約0.01から約10.0mg/kg(処置される対象の体重)までの範囲である。

0154

通常の技術をもつ医師が、処置される者の体重、年齢および状態、疾患の重症度、ならびに選択した特定の投与経路など既知の事項を考慮して、前記用量範囲に基づく変更を行なうことができる。

0155

本明細書に開示する化合物が、付随する予後との相互関係で、必要な有効量に影響を及ぼすことも予想される。
キット
本発明の他の観点は、本明細書に開示する化合物およびこれらの化合物を含む医薬組成物を含むキットを提供する。キットは、本発明の化合物または医薬組成物のほかに、診断薬または療法薬を含むことができる。キットは、診断法または療法に使用するための指示も含むことができる。診断態様において、キットは本発明の化合物または医薬組成物および診断薬を含む。療法態様において、キットは抗体またはその医薬組成物、および1種類以上の療法薬、たとえば追加の抗新生物薬、抗腫瘍薬または化学療法薬を含む。

0156

対象
ある態様において、対象はヒトである。ある態様において、対象は18以上である。他の態様において、対象は18歳未満である。

0157

本明細書に開示する種々の要素の組合わせはすべて本発明の範囲に含まれる。
本発明は以下の実験の詳細を参照することによってより良く理解されるであろう。ただし、詳述した具体例は特許請求の範囲にさらに十分に記載した本発明の説明にすぎないことは当業者に自明であろう。

0158

シンメトロアドヘシン
本明細書には、遺伝子デバイスであって、連続アミノ酸の機能性区域が新規な様式で連結したものを含むデバイスを記載する。現在まで、タンパク質を遺伝子工学的に操作して、それらが新たな固定された構造またはコンホメーションをとることにより新たな機能が作り出されてきた。遺伝子工学的に作製されたそのようなこれまでのタンパク質と対照的に、本明細書に開示する遺伝子デバイスは2以上の識別可能なタンパク質ドメインを含み、それらが新規な化学結合により、それらのドメイン間での相対的な運動が可能な様式で連結している。タンパク質ドメイン間の相対的な運動によりこの遺伝子デバイスの可動部分が構成され、これによりそれらは有用な作業を行なうことができる。この作業のための入力エネルギーは、これらのタンパク質ドメイン自体に固有の運動および回転エネルギー、ならびにこれらのタンパク質ドメインと溶剤分子の間の機械的相互作用エネルギーなどにより供給される。

0159

ここには、遺伝子デバイスの特定クラスである“シンメトロアドヘシン”について開示する。シンメトロアドヘシンは化学結合した2以上のアドヘシン(独立してフォールディングするポリペプチド結合ドメインまたは連続アミノ酸の区域)を含む。これらの化学結合したアドヘシンは互いに相対的に動くことができ、その結果、二量体リガンド、三量体リガンド、四量体リガンドなどを結合するのに有用な2以上の対称的に配向した結合ドメインを形成し、アフィニティーが大幅に増大する。シンメトロアドヘシン−Fcハイブリッドタンパク質は、特に有用な遺伝子デバイスの態様である。

0160

療法用タンパク質の有効性における対称性の重要さは、大部分のタンパク質疾患ターゲット自体がそのような高次対称構造を示すという事実による。たとえば疾患ターゲットが2つのタンパク質からなる場合、それは二量体であると言われ、それが3つのタンパク質からなる場合、それは三量体であるなどと言われる。タンパク質療法薬がタンパク質疾患ターゲットに一度に1つの基準で(one−at−a−time basis)結合するにすぎない場合、その結合の強度は一般にナノモル濃度範囲(nano−molar range)の水準である。今日の療法タンパク質に一般的なこの通常レベルの結合では、タンパク質疾患ターゲットに対比して著しくかつ無駄に過剰な療法タンパク質を身体に大量供給することが必要になる(100万対1の基準)。

0161

各シンメトロアドヘシンは、タンパク質をより対称的にすることによってより有用な療法薬にする簡単な一連の規則を用いて工学的に作製される。タンパク質疾患ターゲットに一度に2つの基準で(two−at−a−time basis)結合するように設計さ
れたシンメトロアドヘシンについては、結合強度ナノHナノモル範囲(nano H nano−molar range)の水準であろう。協同結合によりそのような異例のレベルの結合が可能になる。この異例のレベルの結合では、タンパク質疾患ターゲットに対比してはるかに少ない療法タンパク質を投与する必要があるにすぎない(1対1の基準)。

0162

ペプチド結合化学
すべてのタンパク質は1以上のペプチド鎖、すなわち連続アミノ酸の区域からなり、それぞれがその前のアミノ酸にペプチド結合により連結している。アミド結合に起きる単結合形態(−C−N−)と二重結合形態(−C=N−)の間の共鳴のため、ペプチド結合は有意程度の二重結合性をもつ(−C=N−Cα−C=N−)。その結果、タンパク質中のペプチド結合はほぼ平面である。隣接するN−CαとCα−C結合は比較的自由に回転するが、ペプチド結合の剛性により、フォールディングしたポリペプチド鎖の自由度はそれが単一の静的物体のような挙動を示す点まで低下する。

0163

1に示すペプチド結合をもつN個の連続アミノ酸の第1区域およびP個の連続アミノ酸の第2区域、AA1−[ ]−AAnおよびAA1−[ ]−AApについて考える:

0164

0165

連続アミノ酸の第1区域がそのN−末端において新たなペプチド結合により連続アミノ酸の第2区域のC−末端に連結すると、2に示すペプチド結合をもつキメラポリペプチドAA1−[ ]−AAn−AAn+1−[ ]−AAn+pが形成されるであろう:

0166

0167

このキメラポリペプチドは、それの前駆体と同様に連続アミノ酸の単一区域であり、そのそれぞれが同様にがその前のアミノ酸にペプチド結合により連結している。したがって、フォールディングしたキメラポリペプチド鎖も通常は単一の静的物体のように挙動するであろう。

0168

本発明は、本明細書中で遺伝子デバイスと呼ぶ新規なタンパク質様の分子を提供する;これは機械的デバイスと同様に動的物体であり、相対的な動きが可能な様式で相互に連結した2以上の可動部分をもつ。遺伝子デバイスにおけるそれぞれの部分、またはドメインは、連続アミノ酸の区域であり、それぞれの相互連結はそれぞれの連続アミノ酸の区域の予め定めた末端を連結する非ペプチド結合により行なわれる。好ましくは、遺伝子デバイス中のドメインは結合ドメインである。それらの相互連結のトポロジーにより、3、4および5に示す3つの異なるタイプの遺伝子デバイスが区別される:

0169

0170

異なる末端において連結した2つの同一結合ドメインを備えた遺伝子デバイス(6)は非対称的なコンフィギュレーションをもつ:

0171

0172

同一末端において連結した2つの同一結合ドメインを備えた遺伝子デバイス(7および8)は点対称性を備えたコンフィギュレーションをもつ:

0173

0174

7および8に示す遺伝子デバイスを、本明細書中でヘミ−シンメトロアドヘシンと呼ぶ。ヘミ−シンメトロアドヘシンは点対称性を備えたコンフィギュレーションをもつが、それらはそれらの両方の結合ドメインを独立して回転させることはできず、したがってそれらは通常は対称的ターゲット中の1より多い結合部位に結合することはできない。

0175

本発明は、対称的ターゲット中の2以上の結合部位に対称的に(すなわち協同的に)結合できるタンパク質様の分子をも提供する。対称的ターゲットを対称的に結合できる遺伝子デバイスを、本明細書中でシンメトロアドヘシンと呼ぶ。過大サイズではあるが対称的な物体(たとえば医療用体操ボール)を片手ではなく両手で掴むことができる人体のように、シンメトロアドヘシンが対称的ターゲットを結合する能力は通常はタンパク質よりはるかに大きい。

0176

シンメトロアドヘシンサブタイプ
限定ではないが、表2〜11に種々のシンメトロアドヘシンの多様な態様を示す。たとえばCD4−シンメトロアドヘシンを記載した表2の最上列に、CD4ヘミ−シンメトロアドヘシンのコンフィギュレーションを示す;すなわち、C−末端側X−末端を備えたCD4ドメイン、たとえば連続アミノ酸の区域[C−末端システインまたはセレノシステイン残基をもつCD4ドメイン]が、非ペプチド結合(たとえばシステイン−システインジスルフィド結合またはセレノシステイン−セレノシステインジセレニド結合)により、連続アミノ酸の第2区域[C−末端システインまたはセレノシステイン残基をもつCD4ドメイン]に非ペプチド結合により結合したものを、一般的に[CD4−Xc−Xc−CD
4]と記載する。CD4ヘミ−シンメトロアドヘシンとFcヘミ−シンメトロアドヘシンの二量体がイムノ−シンメトロアドヘシンを形成したものを、表2の第2列に示す;たとえば[CD4−Xc−Sn−Fc]2と記載。各表において、XcはC−末端側X−末端、XnはN−末端側X−末端、SnはN−末端システイン残基を表わす。

0177

0178

0179

0180

0181

0182

0183

0184

0185

0186

0187

0188

0189

0190

0191

0192

0193

連続アミノ酸の区域
本明細書中で述べる連続アミノ酸の区域の例には、結合ドメインを含む連続アミノ酸、たとえば分泌型または膜貫通タンパク質、細胞内結合ドメインおよび抗体(全体またはそ
の一部)ならびにその修飾形が含まれるが、これらに限定されない。下記は限定ではない若干例である:
1)免疫グロブリン
免疫グロブリンは、鎖内ジスルフィド結合により互いに保持されたポリペプチド鎖を含む分子であり、その際、結合したアミノ酸のうち少なくとも1個は末端残基でなく、一般に2つの軽鎖および2つの重鎖をもつ。各鎖において、1つのドメイン(V)は分子の抗体特異性に応じた可変アミノ酸配列をもつ。他のドメイン(C)は、同一クラスの分子間に共通のかなり一定の配列をもつ。これらのドメインはアミノ末端から順に番号が付けられる。

0194

免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーは、免疫グロブリン様のドメインをもつ分子からなる。このファミリーのメンバーには下記のものが含まれる:クラスIおよびII主要組織適合性抗原、免疫グロブリン、T細胞受容体アルファ、ベータ、ガンマおよびデルタ鎖、CD1、CD2、CD4、CD8、CD28、CD3のガンマ、デルタおよびイプシロン鎖、OX−2、Thy−1、細胞間または神経細胞接着分子(I−CAMまたはN−CAM)、リンパ球機能関連抗原−3(LFA−3)、神経細胞質タンパク質(NCP−3)、ポリ−Ig受容体ミエリン結合糖タンパク質(MAG)、高アフィニティーIgE受容体、末梢ミエリンの主要糖タンパク質(Po)、血小板由来増殖因子受容体コロニー刺激因子−1受容体、マクロファージFc受容体、Fcガンマ受容体、ならびに癌胎児性抗原

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