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技術 脂肪酸を生成する緑藻類

出願人 味の素株式会社
発明者 長坂雄太臼田佳弘桑原陽子鈴木茂雄
出願日 2013年11月1日 (3年7ヶ月経過) 出願番号 2013-227888
公開日 2017年1月5日 (5ヶ月経過) 公開番号 2017-000001
状態 未査定
技術分野 微生物、その培養処理 突然変異または遺伝子工学 微生物による化合物の製造
主要キーワード 電磁場処理 ガス混合装置 実験室用ミキサー カウンタイオン 乳化促進剤 次亜塩素酸処理 リン酸ポリマー 超臨界処理

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課題

脂肪酸生成する緑藻類およびその利用法を提供する。

解決手段

AJ7846株(FERM BP-22252)、AJ7847株(FERM BP-22253)、およびそれらの誘導株からなる群より選択される緑藻を培養し、得られた藻体を適宜処理することにより、脂肪酸、脂肪酸エステル、糖グリセロール、またはそれらの組み合わせ製造する。

この項目の情報は公開日時点(2017年1月5日)のものです。
また、この項目は機械的に抽出しているため、正しく解析できていない場合があります

背景

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一般的に食用油脂原料として用いられる油糧植物である大豆種子アブラヤシ(oil palm)の果実は、20%程度の油脂を含んでいる。これに対し、非特許文献1に報告されているように、微細藻類には油脂を生産するものが知られており、そのような微細藻類の面積当たりの油脂の収量は、油糧植物を大きく上回る。緑藻では、例えば、デスモデスムス(Desmodesmus)属に属するSUHL0708株が、油脂等を、培養期間における平均で藻体乾燥重量あたり約28%蓄積することが知られている(特許文献1)。しかし、藻体からの油脂の回収は、藻体分離脱水細胞破砕、および油脂の精製等の工程を要し、煩雑かつ困難である。

また、クロレラケスレリ(Chlorella kessleri)の培養物を中温処理することで脂肪酸が生成することが知られている(特許文献2)。その一方で、デスモデスムス属に属する緑藻で中温処理により脂肪酸を生成する株は知られていない。

概要

脂肪酸を生成する緑藻類およびその利用法を提供する。AJ7846株(FERM BP-22252)、AJ7847株(FERM BP-22253)、およびそれらの誘導株からなる群より選択される緑藻を培養し、得られた藻体を適宜処理することにより、脂肪酸、脂肪酸エステル、糖グリセロール、またはそれらの組み合わせを製造する。なし

目的

本発明は、脂肪酸を生成する緑藻類およびその利用法を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項

以下の情報は公開日時点(2017年1月5日)のものです。

請求項1

スモデスムス(Desmodesmus)属に属し、藻体中温処理に供した際に、藻体の乾燥重当たり25%(w/w)以上の脂肪酸を蓄積する緑藻。

請求項2

デスモデスムス・アルマタス(Desmodesmus armatus)、デスモデスムス・コムニス(Desmodesmus communis)、デスモデスムス・ピルレイ(Desmodesmus pirkollei)、デスモデスムス・コスタトグラニュラタス(Desmodesmus costatogranulatus)、デスモデスムス・パノニカス(Desmodesmus pannonicus)、デスモデスムス・ペルフォラタス(Desmodesmus perforatus)、デスモデスムス・インターミディウス(Desmodesmus intermedius)、デスモデスムス・ブラシリエンシス(Desmodesmus brasiliensis)、デスモデスムス・エレガンス(Desmodesmus elegans)、デスモデスムス・ヒストリクス(Desmodesmus hystrix)、デスモデスムス・クアドリカウダ(Desmodesmus quadricauda)、デスモデスムス・シューセラタス(Desmodesmus pseudoserratus)、デスモデスムス・マクシムス(Desmodesmus maximus)、およびデスモデスムス・ビセルリス(Desmodesmus bicellularis)から選択される、請求項1に記載の緑藻。

請求項3

AJ7846株(FERM BP-22252)、AJ7847株(FERM BP-22253)、およびそれらの誘導株からなる群より選択される緑藻。

請求項4

請求項1〜3のいずれか1項に記載の緑藻を培地で培養すること、前記培養により得られた藻体を中温処理に供すること、および前記処理の処理物から脂肪酸を回収すること、を含む、脂肪酸を製造する方法

請求項5

請求項1〜3のいずれか1項に記載の緑藻を培地で培養すること、前記培養により得られた藻体を中温処理に供すること、前記中温処理の処理物をアルコール存在下で中低温処理に供すること、および前記中低温処理の処理物から脂肪酸エステルを回収すること、を含む、脂肪酸エステルを製造する方法。

請求項6

請求項1〜3のいずれか1項に記載の緑藻を培地で培養すること、前記培養により得られた藻体を中温処理および/または有機溶媒処理に供すること、および前記処理の処理物から糖グリセロールを回収すること、を含む、糖グリセロールを製造する方法。

請求項7

請求項1〜3のいずれか1項に記載の緑藻を培地で培養すること、前記培養により得られた藻体を中温処理に供すること、L−アミノ酸生産能を有する細菌を、前記処理の処理物を含有する培地で培養して、L−アミノ酸を該培地中又は該細菌の菌体内に生成蓄積すること、および該培地又は菌体よりL−アミノ酸を採取すること、を含む、L−アミノ酸を製造する方法。

請求項8

前記処理物が、脂肪酸である、請求項7に記載の方法。

請求項9

前記細菌が、脂肪酸資化能が高まるように改変されている、請求項7または8に記載の方法。

請求項10

前記細菌が、腸内細菌科に属する細菌またはコリネ型細菌である、請求項7〜9のいずれか1項に記載の方法。

請求項11

前記有機溶媒が、メタノールである、請求項6に記載の方法。

請求項12

前記中低温処理が、5℃〜60℃であって、且つ、前記中温処理より低い温度で行われる、請求項5に記載の方法。

請求項13

前記中温処理が、35℃〜70℃で行われる、請求項4〜12のいずれか1項に記載の方法。

請求項14

前記中温処理が、pH3.0〜7.0で行われる、請求項4〜13のいずれか1項に記載の方法。

請求項15

前記中温処理の後に、当該処理物をアルカリ処理に供することを含み、当該アルカリ処理の処理物から脂肪酸が回収される、請求項4、13、または14に記載の方法。

請求項16

前記中温処理の前に、酸またはアルカリにより藻体を加水分解することを含む、請求項4〜15のいずれか1項に記載の方法。

詳細

以下の情報は 公開日時点 (2017年1月5日)のものです。

技術分野

0001

本発明は、脂肪酸を生成する緑藻類およびその利用に関する。


背景技術

0002

一般的に食用油脂の原料として用いられる油糧植物である大豆の種子やアブラヤシ(oil palm)の果実は、20%程度の油脂を含んでいる。これに対し、非特許文献1に報告されているように、微細藻類には油脂を生産するものが知られており、そのような微細藻類の面積当たりの油脂の収量は、油糧植物を大きく上回る。緑藻では、例えば、デスモデスムス(Desmodesmus)属に属するSUHL0708株が、油脂等を、培養期間における平均で藻体乾燥重量あたり約28%蓄積することが知られている(特許文献1)。しかし、藻体からの油脂の回収は、藻体分離、脱水、細胞破砕、および油脂の精製等の工程を要し、煩雑かつ困難である。

0003

また、クロレラ・ケスレリ(Chlorella kessleri)の培養物を中温処理することで脂肪酸が生成することが知られている(特許文献2)。その一方で、デスモデスムス属に属する緑藻で中温処理により脂肪酸を生成する株は知られていない。

0004

特開2012-44923号公報
WO 2011/013707 A1


先行技術

0005

Chisti Y. 2007. Biotechnol. Adv. 25:294-306.


発明が解決しようとする課題

0006

本発明は、脂肪酸を生成する緑藻類およびその利用法を提供することを課題とする。


課題を解決するための手段

0007

本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、脂肪酸を生成する新規な緑藻類を自然界から見出し、本発明を完成させた。

0008

すなわち、本発明は以下の通り例示できる。
[1]
デスモデスムス(Desmodesmus)属に属し、藻体を中温処理に供した際に、藻体の乾燥重量当たり25%(w/w)以上の脂肪酸を蓄積する緑藻。
[2]
デスモデスムス・アルマタス(Desmodesmus armatus)、デスモデスムス・コムニス(Desmodesmus communis)、デスモデスムス・ピルコレイ(Desmodesmus pirkollei)、デスモデスムス・コスタトグラニュラタス(Desmodesmus costatogranulatus)、デスモデスムス・パノニカス(Desmodesmus pannonicus)、デスモデスムス・ペルフォラタス(Desmodesmus perforatus)、デスモデスムス・インターミディウス(Desmodesmus intermedius)、デスモデスムス・ブラシリエンシス(Desmodesmus brasiliensis)、デスモデスムス・エレガンス(Desmodesmus elegans)、デスモデスムス・ヒストリクス(Desmodesmus
hystrix)、デスモデスムス・クアドリカウダ(Desmodesmus quadricauda)、デスモデスムス・シュードセラタス(Desmodesmus pseudoserratus)、デスモデスムス・マクシム
ス(Desmodesmus maximus)、およびデスモデスムス・ビセルラリス(Desmodesmus bicellularis)から選択される、前記緑藻。
[3]
AJ7846株(FERM BP-22252)、AJ7847株(FERM BP-22253)、およびそれらの誘導株からなる群より選択される緑藻。
[4]
前記緑藻を培地で培養すること、
前記培養により得られた藻体を中温処理に供すること、および
前記処理の処理物から脂肪酸を回収すること、
を含む、脂肪酸を製造する方法。
[5]
前記緑藻を培地で培養すること、
前記培養により得られた藻体を中温処理に供すること、
前記中温処理の処理物をアルコールの存在下で中低温処理に供すること、および
前記中低温処理の処理物から脂肪酸エステルを回収すること、
を含む、脂肪酸エステルを製造する方法。
[6]
前記緑藻を培地で培養すること、
前記培養により得られた藻体を中温処理および/または有機溶媒処理に供すること、および
前記処理の処理物から糖グリセロールを回収すること、
を含む、糖グリセロールを製造する方法。
[7]
前記緑藻を培地で培養すること、
前記培養により得られた藻体を中温処理に供すること、
L−アミノ酸生産能を有する細菌を、前記処理の処理物を含有する培地で培養して、L−アミノ酸を該培地中又は該細菌の菌体内に生成蓄積すること、および
該培地又は菌体よりL−アミノ酸を採取すること、
を含む、L−アミノ酸を製造する方法。
[8]
前記処理物が、脂肪酸である、前記方法。
[9]
前記細菌が、脂肪酸資化能が高まるように改変されている、前記方法。
[10]
前記細菌が、腸内細菌科に属する細菌またはコリネ型細菌である、前記方法。
[11]
前記有機溶媒が、メタノールである、前記方法。
[12]
前記中低温処理が、5℃〜60℃であって、且つ、前記中温処理より低い温度で行われる、前記方法。
[13]
前記中温処理が、35℃〜70℃で行われる、前記方法。
[14]
前記中温処理が、pH3.0〜7.0で行われる、前記方法。
[15]
前記中温処理の後に、当該処理物をアルカリ処理に供することを含み、当該アルカリ処理の処理物から脂肪酸が回収される、前記方法。
[16]
前記中温処理の前に、酸またはアルカリにより藻体を加水分解することを含む、前記方法。


発明の効果

0009

本発明により、脂肪酸を生成する緑藻類が提供される。当該緑藻類は、脂肪酸、脂肪酸エステル、糖グリセロール、またはそれらの組み合わせの製造等に利用できる。


図面の簡単な説明

0010

18S rDNAの塩基配列に基づく、AJ7846株およびAJ7847株の系統樹を示す図。

0011

以下、本発明を詳細に説明する。

0012

<1>本発明の藻類
本発明の藻類は、デスモデスムス(Desmodesmus)属に属し、藻体を中温処理に供した際に、脂肪酸を蓄積(生成)する緑藻である。本発明の藻類は、藻体を中温処理に供した際に、藻体の乾燥重量当たり25%(w/w)以上の脂肪酸を蓄積(生成)する緑藻であってよい。

0013

Desmodesmus属藻類としては、デスモデスムス・アルマタス(Desmodesmus armatus)、デスモデスムス・コムニス(Desmodesmus communis)、デスモデスムス・ピルコレイ(Desmodesmus pirkollei)、デスモデスムス・コスタトグラニュラタス(Desmodesmus costatogranulatus)、デスモデスムス・パノニカス(Desmodesmus pannonicus)、デスモデスムス・ペルフォラタス(Desmodesmus perforatus)、デスモデスムス・インターミディウス(Desmodesmus intermedius)、デスモデスムス・ブラシリエンシス(Desmodesmus brasiliensis)、デスモデスムス・エレガンス(Desmodesmus elegans)、デスモデスムス・ヒストリクス(Desmodesmus hystrix)、デスモデスムス・クアドリカウダ(Desmodesmus
quadricauda)、デスモデスムス・シュードセラタス(Desmodesmus pseudoserratus)、デスモデスムス・マクシムス(Desmodesmus maximus)、およびデスモデスムス・ビセルラリス(Desmodesmus bicellularis)が挙げられる。

0014

本発明の藻類として、具体的には、例えば、AJ7846株(FERM BP-22252)、AJ7847株(FERM BP-22253)、およびそれらの誘導株から選択される緑藻が挙げられる。

0015

AJ7846株は、2013年5月14日に、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センター郵便番号292-0818、日本国千葉県木更津かずさ足2-5-8 120号室)に、受託番号FERM BP-22252の下に寄託されている。

0016

AJ7847株は、2013年5月14日に、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センター(郵便番号292-0818、日本国千葉県木更津かずさ鎌足2-5-8 120号室)に、受託番号FERM BP-22253の下に寄託されている。

0017

AJ7846株およびAJ7847株は、デスモデスムス・アルマタス(Desmodesmus armatus)やデスモデスムス・コムニス(Desmodesmus communis)等のDesmodesmus属と類縁関係にあると考えられる。

0018

AJ7846株の18S rDNAの塩基配列を配列番号4に示す。AJ7846株は、18S rDNAのBLAST解析によれば、Desmodesmus armatus var. subalternansCCAP276/4A株に対し99.71%、Desmodesmus communis CCAP 276/4B株に対し99.24%の相同性を示す。

0019

AJ7847株の18S rDNAの塩基配列を配列番号3に示す。AJ7847株は、18S rDNAのBLAST解析によれば、Desmodesmus armatus var. subalternansCCAP276/4A株に対し99.77%、Des
modesmus communis CCAP 276/4B株に対し99.31%の相同性を示す。

0020

上記「誘導株」とは、AJ7846株またはAJ7847株を親株祖先株)として構築された株であって、且つ、親株(祖先株)と同等以上の脂肪酸生成能を有するものをいう。誘導株は、例えば、人為的な改変により育種されたものであってよい。人為的な改変としては、遺伝子工学的手法による改変や、突然変異処理による改変が挙げられる。突然変異処理としては、X線照射紫外線の照射、ならびにN−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン(MNNG)、エチルメタンスルフォネートEMS)、およびメチルメタンスルフォネートMMS)等の変異剤による処理が挙げられる。また、誘導株は、例えば、親株(祖先株)の使用の際に自然に生じたものであってもよい。そのような誘導株としては、例えば、AJ7846株またはAJ7847株を培養する際に自然に生じた変異株が挙げられる。誘導株は、1種の改変により構築されてもよく、2種またはそれ以上の改変により構築されてもよい。

0021

「親株と同等以上の脂肪酸生成能を有する」とは、誘導株を培養し、藻体を中温処理に供した際に、親株において同条件で生成する脂肪酸量の、70%以上、80%以上、90%以上、または95%以上の量の脂肪酸が生成することを意味してよい。

0022

<2>本発明の藻類の利用
本発明の藻類は、例えば、脂肪酸、脂肪酸エステル、糖グリセロール、またはそれらの組み合わせの製造に利用できる。具体的には、本発明の藻類を培養し、得られた藻体を適宜処理することにより、脂肪酸、脂肪酸エステル、糖グリセロール、またはそれらの組み合わせが生成する。なお、脂肪酸、脂肪酸エステル、および糖グリセロールを総称して、「目的物質」ともいう。また、目的物質を生成するための処理を総称して、「目的物質生成処理」という場合がある。すなわち、本発明の方法は、本発明の藻類を培地で培養すること、前記培養により得られた藻体を目的物質生成処理に供すること、および前記処理の処理物から目的物質を回収すること、を含む、目的物質を製造する方法である。なお、本発明において、「藻体」とは、藻類を培地で培養して得られる藻類の細胞をいう。また、本発明において、対象物(藻体やその処理物)を特定の条件で「処理する/処理に供する」ことを、対象物を当該条件で「インキュベートする」と読み替えてもよい。

0023

<2−1>培養方法
培養方法は、本発明の藻類が増殖できる限り、特に制限されない。培養条件は、当業者が適宜設定することができる。培養は、例えば、微細藻類の培養に用いられる通常の条件で行うことができる。微細藻類の培養については多くの知見があり、例えば、Chlorella属藻類、Arthrospira属藻類(Spirulina)、およびDunaliella salina等の藻類は、食用として、工業的に大規模な培養が行われている(Spolaore, P. et al. 2006. J. Biosci.
Bioeng. 101: 87-96)。培養は、例えば、このような知見を参照して実施してよい。

0024

培養は、光合成を利用し有機化合物を利用しない独立栄養培養(autotrophic culture)、光合成を利用せず有機化合物を利用する従属栄養培養(heterotrophic culture)、または光合成と有機化合物の両方を利用する混合栄養培養(mixotrophic culture)により実施することができる。培養は、通常は、独立栄養培養(autotrophic culture)により実施してよい。

0025

培養は、解放系で行われてもよく、閉鎖系で行われてもよい。例えば、オープンポンドと呼ばれる解放培養系で培養を行うことができる。また、例えば、クローズドフォトバイオリアクターと呼ばれる閉鎖培養系で培養を行うことができる。

0026

培養に用いられる培地は、本発明の藻類が増殖できる限り、特に制限されない。培地は
、例えば、窒素源や各種無機塩を含有していてよい。また、培地は、例えば、必要に応じて炭素源等の他の成分を含有していてもよい。培地成分の種類や濃度は、当業者が適宜設定することができる。培地としては、例えば、微細藻類の培養に用いられる通常の培地を用いることができる。そのような培地として、具体的には、例えば、0.3×HSM培地(Oyama, Y. et al. 2006. Planta 224: 646-654)、0.2×ガンボーグ培地(Izumo, A. et al. 2007. Plant Science 172: 1138-1147)、modifiedNORO培地(Yamaberi, K. et al. 1998. J. Mar. Biotechnol. 6: 44-48; Takagi, M. et al. 2000. Appl. Microbiol. Biotechnol. 54: 112-117)、Bold's Basal Medium(Tornabene, T. G. et al. 1983. Enzyme and Microb. Technol. 5: 435-440; Archibald, P. A. and Bold, H. C. 1970. Phytomorphology 20: 383-389)、F/2培地(Lie, C.-P. and Lin, L.-P. 2001. Bot. Bull. Acad. Sin. 42: 207-214)、TAP培地が挙げられる。また、藻類は、窒素源が枯渇すると油脂を藻体内に蓄積することが知られている(Thompson GA Jr. 1996. Biochim. Biophys. Acta
1302: 17-45)。本発明においては、窒素源の濃度を制限した培地を本発明の藻類の培養に用いてもよい。

0027

培養は、液体培地を用いて行うことができる。培養温度は、例えば、20〜40℃、好ましくは25℃〜35℃、より好ましくは30℃付近であってよい。培地の初発pHは、例えば、中性付近であってよい。中性付近とは、例えば、pH 7〜9であってよい。培養中はpH調整を行ってもよく、行わなくともよい。pH調整には、適当な無機あるいは有機酸性あるいはアルカリ性物質を使用することができる。培養は、通気しながら行ってよい。通気量は、例えば、培養液単位体積当たりの1分間の通気量として、0.1〜2 vvm(volume per volume per minute)であってよい。培養液には、さらにCO2を供給してもよい。CO2の供給量は、例えば、通気量に対して、0.5〜5%(v/v)であってよい。CO2と空気は、別個に培養液に供給してもよく、混合して培養液に供給してもよい。光合成を利用する場合、培養系に光を供給する。光は、適当な光源を利用して供給することができる。光源としては、例えば、白色蛍光灯白色発光ダイオード高圧ナトリウムランプ太陽光が挙げられる。これらの光源は、適宜組み合わせて利用してもよい。光の照度は、例えば、1,000〜10,000 luxであってよい。培養液は、適宜、撹拌または循環させてよい。光の供給、空気の供給、CO2の供給、撹拌、循環等の各種操作は、連続的に行われてもよく、間欠的に行われてもよい。各種操作の条件は、培養を通じて一定であってもよく、そうでなくてもよい。培養期間は、例えば、1〜40日間であってよい。培養は、回分培養(batch culture)、流加培養(Fed-batch culture)、連続培養(continuous culture)、またはそれらの組み合わせにより実施することができる。また、培養は、種培養本培養とに分けて行われてもよい。本培養は、例えば、本培養の培地に、種培養液を1〜50%(v/v)植菌することにより行ってよい。種培養と本培養の培養条件は、同一であってもよく、そうでなくてもよい。例えば、種培養と本培養を、共に回分培養で行ってもよい。また、例えば、種培養を回分培養で行い、本培養を流加培養または連続培養で行ってもよい。

0028

このようにして本発明の藻類を培養することにより、培地に本発明の藻類の藻体が生成する。

0029

藻体は、培地に含まれたまま目的物質生成処理に供してもよく、培地から回収してから目的物質生成処理に供してもよい。また、藻体は、適宜前処理を行ってから目的物質生成処理に供してもよい。前処理としては、例えば、希釈濃縮凍結融解乾燥等が挙げられる。これらの前処理は、適宜組み合わせて行ってもよい。前処理は、目的物質生成処理の種類等の諸条件に応じて適宜選択することができる。

0030

藻体を培地から回収する手法は特に制限されず、例えば公知の手法(Grima, E. M. et al. 2003. Biotechnol. Advances 20: 491-515)を利用できる。具体的には、例えば、自然沈降、遠心分離濾過等の手法により、藻体を培地から回収することができる。また、
その際、凝集剤(flocculant)を利用してもよい。回収した藻体は、適当な媒体を用いて適宜洗浄することができる。また、回収した藻体は、適当な媒体を用いて適宜再懸濁することができる。洗浄や懸濁に利用できる媒体としては、例えば、水や水性緩衝液等の水性媒体水性溶媒)、メタノール等の有機媒体(有機溶媒)、およびそれらの混合物が挙げられる。媒体は、目的物質生成処理の種類等の諸条件に応じて適宜選択することができる。

0031

藻体は、例えば、所望の程度に希釈または濃縮してから目的物質生成処理に供してよい。藻体は、懸濁液中藻体濃度が、乾燥重量に換算して、例えば、25 g/L以上、または250 g/L以上となるように、希釈または濃縮してから目的物質生成処理に供してよい。藻体の希釈は、上述したような適当な媒体を用いて行うことができる。藻体の濃縮は、例えば、藻体を沈殿させ、上清を適宜除くことにより、行うことができる。また、藻体の濃縮は、例えば、凍結乾燥エバポレーションにより行うこともできる。

0032

藻体は、例えば、一旦凍結させてから目的物質生成処理に供してよい。凍結温度は、例えば、0℃以下、-20℃以下、または-50℃以下であってよく、-80℃以上であってもよい。凍結時間は、例えば、1時間以上であってよく、24時間以下であってもよい。また、凍結融解を繰り返してもよい。

0033

目的物質生成処理の前には、反応系のpHを弱酸性あるいは弱アルカリ性に調整してもよい。弱酸性とは、例えば、pH 3.0〜7.0、またはpH 4.0〜6.0であってよい。弱アルカリ性とは、例えば、pH 7.5〜12.0、またはpH 9.0〜11.0であってよい。pHの調整は、例えば、塩酸等の酸性物質や、NaOHやKOH等のアルカリ性物質を用いて行うことができる。当該pH調整により、藻体が加水分解されてもよく、されなくてもよい。

0034

<2−2>中温処理による脂肪酸生成
培養により得られた藻体を中温処理に供することにより、脂肪酸を生成できる。すなわち、本発明の方法の一態様は、本発明の藻類を培地で培養すること、前記培養により得られた藻体を中温処理に供すること、および前記処理の処理物から脂肪酸を回収すること、を含む、脂肪酸を製造する方法である。本発明においては、1種の脂肪酸のみが製造されてもよく、2種またはそれ以上の脂肪酸が製造されてもよい。

0035

<中温処理>
「中温処理」とは、中温度での処理をいう。中温処理としては、例えば、WO2011/013707に記載の中温度での処理を参照できる。藻体は、上述したような適当な媒体に懸濁した状態で中温処理に供することができる。「中温度」は、脂肪酸が生成する温度であれば特に制限されない。中温度は、処理時間等の諸条件に応じて適宜設定できる。中温度は、例えば、35℃以上、40℃以上、45℃以上、または50℃以上であってよい。また、中温度は、例えば、70℃以下、65℃以下、または60℃以下であってよい。中温処理の時間は、処理温度等の諸条件に応じて適宜設定できる。中温処理の時間は、例えば、1時間以上、または5時間以上であってよい。また、中温処理の時間は、例えば、48時間以下、または24時間以下であってよい。中温処理のpHは、中温処理により脂肪酸が生成する限り特に制限されない。中温処理のpHは、例えば、弱酸性であってもよく、中性付近であってもよく、弱アルカリ性であってもよい。中性付近とは、例えば、pH 7〜9であってよい。中温処理は、静置で行ってもよく、撹拌や振とうしながら行ってもよい。

0036

中温処理は、連続的に行われてもよく、間欠的に行われてもよい。処理温度等の反応条件は、中温処理を通じて一定であってもよく、そうでなくてもよい。すなわち、藻体は、例えば、連続で同じ温度で処理(以下、「連続中温処理」ともいう)してもよく、途中で温度を変動させて処理してもよい。連続中温処理は、例えば、上記例示した中温度の範囲
および上記例示した中温処理の時間の範囲で行われてよい。途中で温度を変動させる態様としては、例えば、途中で温度を低下させる態様が挙げられる。途中で温度を低下させる態様としては、例えば、第一段中温処理として、一旦中温度で処理した後に、第二段中温処理として、第一段中温処理の温度を下回る温度で処理する態様が挙げられる。第一段中温処理の温度は、例えば、上記例示した中温度の範囲であってよい。第二段中温処理の温度は、例えば、30℃以上、35℃以上、または40℃以上であってよい。また、第二段中温処理の温度は、例えば、55℃以下、50℃以下、または45℃以下であってよい。第一段中温処理の時間は、例えば、1分以上、5分以上、10分以上、または20分以上であってよい。第一段中温処理の時間は、例えば、120分以下、または60分以下であってよい。第二段中温処理の時間は、例えば、1時間以上、2時間以上、または4時間以上であってよい。第二段中温処理の時間は、例えば、20時間以下、または15時間以下であってよい。

0037

中温処理による処理物からは、脂肪酸を回収することができる。なお、通常、脂肪酸は、処理物中の藻体内に多く含まれ得る。よって、中温処理後の藻体から脂肪酸を抽出し、脂肪酸を回収するのが好ましい。

0038

脂肪酸を抽出する手法は特に制限されず、例えば公知の手法を利用できる。例えば、一般的な藻類から油脂を抽出する手法を利用できる。そのような手法としては、例えば、有機溶剤処理超音波処理ビーズ破砕処理、酸処理、アルカリ処理、酵素処理水熱処理超臨界処理マイクロ波処理電磁場処理圧搾処理が挙げられる。

0039

中温処理による処理物は、そのまま脂肪酸の抽出に供してもよく、適宜、濃縮、希釈、乾燥等の処理を行ってから脂肪酸の抽出に供してもよい。例えば、中温処理による処理物を、遠心分離等により、沈殿物(藻体)と上清に分離してもよい。その場合、沈殿物から脂肪酸を抽出することができる。中温処理による処理物は、沈殿物濃度が、乾燥重量に換算して、例えば、250 g/L以下、または125 g/L以下となるように、希釈または濃縮してから脂肪酸の抽出に供してよい。具体的には、例えば、アルカリ処理の場合は、沈殿物濃度が125 g/L以下の処理物を処理することが好ましい。また、例えば、有機溶剤処理の場合は、沈殿物を上清液から分離して処理することが好ましい。有機溶剤処理は、中温処理による処理物を乾燥してから行ってもよく、そうでなくてもよい。

0040

有機溶剤処理に用いられる有機溶剤は、中温処理による処理物から脂肪酸を抽出できるものであれば特に制限されない。有機溶剤としては、例えば、メタノール、エタノール2−プロパノールブタノールペンタノールヘキサノールヘプタノールオクタノール等のアルコール類アセトン等のケトン類ジメチルエーテルジエチルエーテル等のエーテル類酢酸メチル酢酸エチル等のエステル類n−ヘキサン等のアルカン類クロロホルムが挙げられる。有機溶剤としては、1種の有機溶剤を用いてもよく、2種またはそれ以上の有機溶剤を組み合わせて用いてもよい。

0041

アルカリ処理のpHは、中温処理による処理物から脂肪酸を抽出できるpHであれば特に制限されない。アルカリ処理のpHは、通常にはpH 8.5以上、好ましくはpH 10.5以上、さらに好ましくはpH 11.5以上であってよく、pH 14以下であってよい。アルカリ処理の温度は、通常には30℃以上、好ましくは50℃以上、さらに好ましくは70℃以上であってよい。アルカリ処理の温度は、好ましくは120℃以下であってよい。アルカリ処理の時間は、通常には10分以上、好ましくは30分以上、さらに好ましくは50分以上であってよい。アルカリ処理の時間は、好ましくは150分以下であってよい。アルカリ処理には、NaOHやKOH等のアルカリ性物質を利用することができる。

0042

溶出した脂肪酸の回収は、化合物の分離精製に用いられる公知の手法により行うことができる。そのような手法としては、例えば、イオン交換樹脂法や膜処理法が挙げられる。
これらの手法は適宜組み合わせて用いることができる。

0043

回収された脂肪酸は、脂肪酸以外に、藻体、培地成分、水分、各種処理に用いられた成分、本発明の藻類の代謝副産物等の成分を含んでいてよい。脂肪酸は、所望の程度に精製されていてよい。脂肪酸の純度は、例えば、30%(w/w)以上、50%(w/w)以上、70%(w/w)以上、90%(w/w)以上、または95%(w/w)以上であってよい。

0044

<2−3>二段階反応による脂肪酸エステル生成
培養により得られた藻体を、中温処理およびアルコール存在下での中低温処理の二段階反応に供することにより、脂肪酸エステルを生成できる。すなわち、本発明の方法の一態様は、本発明の藻類を培地で培養すること、前記培養により得られた藻体を中温処理に供すること、前記中温処理の処理物をアルコールの存在下で中低温処理に供すること、および前記中低温処理の処理物から脂肪酸エステルを回収すること、を含む、脂肪酸エステルを製造する方法である。本発明においては、1種の脂肪酸エステルのみが製造されてもよく、2種またはそれ以上の脂肪酸エステルが製造されてもよい。

0045

二段階反応としては、例えば、WO2012/099172に記載の二段階反応を参照できる。二段階反応は、一段目の処理である中温処理と、二段目の処理であるアルコール存在下での中低温処理、を含む。二段目の処理は、脂肪酸エステルを生成するための処理である。一段目の処理は、二段目の処理における脂肪酸エステルの生成を促進するよう、本発明の藻類の藻体の状態を変化させる処理である。

0046

「中温処理」とは、中温度での処理をいう。「中低温処理」とは、中低温での処理をいう。「中低温」とは、中温度よりも低い温度をいう。「中温度」および「中低温」は、二段階反応により脂肪酸エステルが生成する温度であれば特に制限されない。「中温度」および「中低温」は、処理時間等の諸条件に応じて適宜設定できる。

0047

一段目の処理の温度(中温度)は、例えば、35℃以上、40℃以上、45℃以上、または50℃以上であってよい。また、一段目の処理の温度(中温度)は、例えば、70℃以下、65℃以下、または60℃以下であってよい。一段目の処理の時間は、例えば、1分以上、5分以上、10分以上、または20分以上であってよい。また、一段目の処理の時間は、例えば、120分以下、または60分以下であってよい。

0048

二段目の処理の温度(中低温)は、例えば、5℃以上、20℃以上、または30℃以上であってよい。また、二段目の処理の温度(中低温)は、例えば、60℃以下、50℃以下、または45℃以下であってよい。二段目の処理の時間は、例えば、10分以上、30分以上、1時間以上、または2時間以上であってよい。また、二段目の処理の時間は、例えば、15時間以下、10時間以下、または5時間以下であってよい。

0049

二段階反応のpHは、二段階反応により脂肪酸エステルが生成する限り特に制限されない。二段階反応のpHは、例えば、弱酸性であってもよく、中性付近であってもよく、弱アルカリ性であってもよい。

0050

一段目の処理および二段目の処理は、それぞれ、静置で行ってもよく、撹拌や振とうしながら行ってもよい。処理温度等の反応条件は、一段目の処理を通じて一定であってもよく、そうでなくてもよい。処理温度等の反応条件は、二段目の処理を通じて一定であってもよく、そうでなくてもよい。

0051

一段目の処理後に、反応系の温度を低下させ、アルコールの存在下で二段目の処理を行う。一段目の処理の処理物は、そのまま二段目の処理に供してもよく、適宜、濃縮、希釈
等の処理を行ってから二段目の処理に供してもよい。アルコールは、一段目の処理の処理物と接触するように反応系に存在させればよい。例えば、一段目の処理の処理物にアルコールを添加してもよく、アルコールに一段目の処理の処理物を添加してもよい。また、例えば、一段目の処理の処理物から藻体を分離し、分離した藻体を、アルコールを含む二段目の処理用反応液と混合してもよい。

0052

二段目の処理における反応系でのアルコールの濃度は、通常には5%(v/v)以上、好ましくは10%(v/v)以上、さらに好ましくは20%(v/v)以上であってよい。また、二段目の処理における反応系でのアルコールの濃度は、通常には70%(v/v)以下、好ましくは60%(v/v)以下、さらに好ましくは50%(v/v)以下であってよい。

0053

二段目の処理に用いられるアルコールは、二段階反応により脂肪酸エステルが生成するものであれば特に制限されない。二段目の処理に用いられるアルコールとしては、メタノール、エタノール、プロパノールイソプロパノール、ブタノール、ペンタノール、エチレングリコール等の炭素数5以下の低級アルコールや、ヘキサノール、ヘプタノール、オクタノール、ノナノールデカノールウンデカノールドデカノールトリデカノールテトラデカノール等の炭素数6以上の高級アルコールが挙げられる。

0054

二段階反応の処理物からは、脂肪酸エステルを回収することができる。なお、通常、生成した脂肪酸エステルは、処理物中の藻体内に多く含まれ得る。よって、二段階反応後の藻体から脂肪酸エステルを抽出し、脂肪酸エステルを回収するのが好ましい。

0055

二段階反応の処理物からの脂肪酸エステルの抽出や回収については、<2−2>の中温処理による処理物からの脂肪酸の抽出や回収に関する記載を準用できる。

0056

二段階反応による脂肪酸エステル生成は、触媒の添加を必要としない。その理由は、一段目の処理により、本発明の藻類がもともと有するリパーゼが脂質に作用しやすい状態になり、そのリパーゼによって、脂質、例えば、油脂、セラミド(Ceramide)、リン脂質(Phospholipid)、糖脂質(Glycolipid)等、と外部より添加したアルコールとの間でエステル交換反応が起こるためであると考えられる。

0057

リパーゼによるエステル交換反応は、一般的に、アルコール類以外の有機溶剤の存在下で促進される。よって、例えば、二段目の処理の際に、エステル交換反応を促進させるのに有効な量の有機溶剤を反応系に添加してもよい。そのような有機溶剤としては、例えば、ヘキサンヘプタンイソオクタンクロロホルム、酢酸エチル、石油エーテルが挙げられる。

0058

回収された脂肪酸エステルは、そのまま、あるいは医薬品、化粧品飲食品等配合して利用できる。脂肪酸エステルの配合量は、脂肪酸エステルの機能が発揮される限り、特に制限されない。脂肪酸エステルの配合量は、特に制限されないが、例えば、1 ppm(w/w)以上、100 ppm(w/w)以上、または1%(w/w)以上であってよい。また、脂肪酸エステルの配合量は、特に制限されないが、例えば、100%(w/w)以下、10%(w/w)以下、または1%(w/w)以下であってよい。

0059

<2−4>中温処理および/または有機溶媒処理による糖グリセロール生成
培養により得られた藻体を中温処理および/または有機溶媒処理に供することにより、糖グリセロールを生成できる。すなわち、本発明の方法の一態様は、本発明の藻類を培地で培養すること、前記培養により得られた藻体を中温処理および/または有機溶媒処理に供すること、および前記処理の処理物から糖グリセロールを回収すること、を含む、糖グリセロールを製造する方法である。なお、糖グリセロールの生成に利用される中温処理お
よび有機溶媒処理を総称して、糖グリセロール生成処理という場合がある。

0060

「糖グリセロール」とは、グリセロールの水酸基に糖がグリコシド結合した構造を有する化合物をいう。糖は、グリセロールのいずれの水酸基に結合していてもよい。糖は、グリセロールの3つの水酸基の内、1つの水酸基のみに結合していてもよく、2つまたは3つの水酸基に結合していてもよい。本発明においては、1種の糖グリセロールのみが製造されてもよく、2種またはそれ以上の糖グリセロールが製造されてもよい。

0061

糖の種類は特に制限されない。糖は、単糖多糖、またはそれらの誘導体であってよい。

0062

単糖として、具体的には、例えば、グルコースガラクトースが挙げられる。

0063

「多糖」とは、2分子またはそれ以上の単糖で構成される糖をいう。すなわち、ここでいう多糖には、二糖オリゴ糖も含まれる。多糖は、直鎖状であってもよく、分岐鎖を有していてもよい。多糖は、1種の単糖で構成されていてもよく、2種またはそれ以上の単糖で構成されていてもよい。多糖の重合度は、特に制限されないが、例えば、2〜50、2〜10、または2〜5であってよい。多糖としては、例えば、ガラクトースを構成糖として含む多糖が挙げられる。ガラクトースを構成糖として含む多糖として、具体的には、例えば、ジガラクトースが挙げられる。

0064

「糖の誘導体」とは、原子官能基等の構成要素が導入、置換、または除去された糖をいう。以下、構成要素の導入、置換、および除去を総称して「改変」ともいう。改変を受け箇所は特に制限されず、例えば、炭素原子上であってもよく、酸素原子上であってもよく、それ以外の箇所であってもよい。改変を受ける箇所は、1ヶ所であってよく、2ヶ所またはそれ以上であってもよい。改変の種類は、1種であってもよく、2種またはそれ以上であってもよい。糖の誘導体としては、例えば、デオキシ糖アミノ糖糖酸糖アルコールが挙げられる。また、導入される官能基としては、例えば、アセチル基アミノ基、アルキル基スルホニル基(−SO3−R)が挙げられる。スルホニル基(−SO3−R)の「R」は、特に制限されないが、例えば、水素原子(H)やアルキル基であってよい。スルホニル基(−SO3−R)は、例えば、スルホ基(−SO3H)であってよい(R=Hの場合)。糖の誘導体としては、例えば、グルコース誘導体ガラクトース誘導体が挙げられる。グルコース誘導体として、具体的には、例えば、キノボーススルホニルキノボースが挙げられる。スルホニルキノボースは、例えば、スルホキノボースであってよい(R=Hの場合)。ガラクトース誘導体として、具体的には、例えば、フコースやスルホニルフコースが挙げられる。スルホニルフコースは、例えば、スルホフコースであってよい(R=Hの場合)。

0065

糖グリセロールとして、具体的には、例えば、ガラクトシルグリセロール、ジガラクトシルグリセロール、およびスルホキノシルグリセロールが挙げられる。ガラクトシルグリセロールは、グリセロールのいずれか1つの炭素の水酸基にガラクトースが結合した糖グリセロールである。ジガラクトシルグリセロールは、グリセロールのいずれか1つの炭素の水酸基にジガラクトースが結合した糖グリセロールである。スルホキノボシルグリセロールは、グリセロールのいずれか1つの炭素の水酸基にスルホキノボースが結合した糖グリセロールである。ガラクトシルグリセロール、ジガラクトシルグリセロール、およびスルホキノボシルグリセロールは、特記しない限り、いずれも、グリセロールの1位の炭素の水酸基に糖が結合したもの、グリセロールの2位の炭素の水酸基に糖が結合したもの、グリセロールの3位の炭素の水酸基に糖が結合したもの、またはそれらの混合物であってよい。

0066

<中温処理>
中温処理については、上記<2−2>の中温処理に関する記載を準用できる。

0067

<有機溶媒処理>
「有機溶媒処理」とは、有機溶媒による処理をいう。有機溶媒処理の条件は、有機溶媒処理により糖グリセロールが生成する限り特に制限されない。有機溶媒処理は、藻体と有機溶媒を接触させることにより行うことができる。例えば、回収した藻体を有機溶媒で懸濁してもよいし、藻体の懸濁物に有機溶媒を添加してもよい。有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、2−プロパノール、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、ヘプタノール、オクタノール等のアルコール類、アセトン等のケトン類、ジメチルエーテル、ジエチルエーテル等のエーテル類、酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類、n−ヘキサン等のアルカン類、ベンゼンフェノール、クロロホルムが挙げられる。有機溶媒としては、水溶性のものが好ましい。有機溶媒としては、アルコールが好ましく、メタノールがより好ましい。有機溶媒としては、1種の有機溶媒を用いてもよく、2種またはそれ以上の有機溶媒を組み合わせて用いてもよい。有機溶媒は、純品であってもよく、他の成分との混合物であってもよい。他の成分としては、例えば、水や水性緩衝液等の水性媒体(水性溶媒)が挙げられる。すなわち、例えば、有機溶媒処理には、有機溶媒の水溶液を利用することができる。混合物中の有機溶媒濃度は、例えば、10%(v/v)以上、または20%(v/v)以上であってよく、90%(v/v)以下、70%(v/v)以下、または50%(v/v)以下であってよい。また、有機溶媒処理を行う反応液中の有機溶媒濃度は、例えば、10%(v/v)以上、または20%(v/v)以上であってよく、90%(v/v)以下、70%(v/v)以下、または50%(v/v)以下であってよい。有機溶媒処理の時間は、例えば、10分以上、30分以上、または1時間以上であってよい。また、有機溶媒処理の時間は、例えば、10時間以下、5時間以下、または3時間以下であってよい。有機溶媒処理の温度は、制御されてもよく、制御されなくてもよい。有機溶媒処理の温度は、例えば、10〜70℃であってよく、室温であってもよい。有機溶媒処理は、静置で行ってもよく、撹拌や振とうしながら行ってもよい。

0068

このようにして藻体を糖グリセロール生成処理に供することにより、反応上清中および/または藻体内に、糖グリセロールが生成する。

0069

糖グリセロールが生成したことは、化合物の検出または同定に用いられる公知の手法により確認することができる。そのような手法としては、例えば、HPLC、LC/MS、GC/MS、NMRが挙げられる。これらの手法は適宜組み合わせて用いることができる。

0070

生成した糖グリセロールの回収は、化合物の分離精製に用いられる公知の手法により行うことができる。そのような手法としては、例えば、イオン交換樹脂法や膜処理法が挙げられる。これらの手法は適宜組み合わせて用いることができる。藻体内に糖グリセロールが蓄積する場合には、例えば、藻体を超音波等の手段により破砕し、遠心分離等の手段により藻体を除去して得られる上清から、糖グリセロールを回収すればよい。

0071

回収された糖グリセロールは、糖グリセロール以外に、藻体、培地成分、水分、各種処理に用いられた成分、本発明の藻類の代謝副産物等の成分を含んでいてよい。糖グリセロールは、所望の程度に精製されていてよい。糖グリセロールの純度は、例えば、30%(w/w)以上、50%(w/w)以上、70%(w/w)以上、90%(w/w)以上、または95%(w/w)以上であってよい。

0072

回収された糖グリセロールは、そのまま、あるいは医薬品、化粧品、飲食品等に配合して利用できる。糖グリセロールの配合量は、糖グリセロールの機能が発揮される限り、特
に制限されない。糖グリセロールの配合量は、特に制限されないが、例えば、1 ppm(w/w)以上、100 ppm(w/w)以上、または1%(w/w)以上であってよい。また、糖グリセロールの配合量は、特に制限されないが、例えば、100%(w/w)以下、10%(w/w)以下、または1%(w/w)以下であってよい。糖グリセロールは、例えば、プレバイオティクスα−アミラーゼ活性化、保湿、または細胞賦活等の機能を有し得る。

0073

<3>中温処理の処理物を利用したL−アミノ酸発酵
上記<2−2>に記載の中温処理による処理物(中温処理物)は、例えば、L−アミノ酸発酵の炭素源として利用できる(WO2011/013707)。すなわち、本発明は、(A)本発明の藻類を培地で培養すること、(B)前記培養により得られた藻体を中温処理に供すること、(C)L−アミノ酸生産能を有する細菌を、前記処理の処理物を含有する培地で培養して、L−アミノ酸を該培地中又は該細菌の菌体内に生成蓄積すること、および(D)該培地又は菌体よりL−アミノ酸を採取すること、を含む、L−アミノ酸を製造する方法、を提供する。同方法に用いられる細菌を、「本発明の細菌」ともいう。

0074

L−アミノ酸発酵は、中温処理物を含有する培地を用いること以外は、細菌を用いた通常のL−アミノ酸発酵と同様に実施してよい。

0075

<3−1>L−アミノ酸発酵に用いられる処理物
L−アミノ酸発酵に用いられる中温処理物は、中温処理による処理物そのものであってもよく、中温処理による処理物を適宜、濃縮、希釈、乾燥、抽出、遠心分離等の処理に供したものであってもよく、中温処理による処理物から回収された脂肪酸等の成分であってもよい。

0076

例えば、L−アミノ酸発酵に用いられる処理物は、脂肪酸であってよい。脂肪酸は、脂肪酸以外の成分を含んでいてもよく、含んでいなくてもよい。脂肪酸は、所望の程度に精製されていてよい。

0077

脂肪酸は、フリー体もしくはその塩、またはそれらの混合物であってよい。塩としては、ナトリウム塩カリウム塩等のアルカリ金属塩が挙げられる。脂肪酸のアルカリ金属塩は、水溶性が高く、また、ミセル化して水中に保持されるため、本発明の細菌により効率的に利用され得る。

0078

また、本発明の細菌が脂肪酸をより効率的に利用できるよう、脂肪酸の均一化を促進する処理を行い、脂肪酸の溶解度を高めるのが好ましい。

0079

均一化を促進する処理としては、例えば、乳化が挙げられる。乳化は、例えば、乳化促進剤界面活性剤を添加することにより実施できる。乳化促進剤としては、例えば、リン脂質やステロールが挙げられる。界面活性剤としては、例えば、一般的に生物学の分野で用いられる界面活性剤が利用できる。界面活性剤としては、非イオン界面活性剤では、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレイン酸エステル(Tween 80)などのポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルn-オクチルβ-D-グルコシドなどのアルキルグルコシドショ糖ステアリン酸エステルなどのショ糖脂肪酸エステルポリグリセリンステアリン酸エステルなどのポリグリセリン脂肪酸エステルトライトンX-100(Triton X-100)、ポリオキシエチレン(20)セチルエーテル(Brij-58)、ノニルフェノールエトキシレート(Tergitol NP-40)が挙げられる。また、界面活性剤としては、両性イオン界面活性剤では、例えば、N,N-ジメチル-N-ドデシルグリシンベタインなどのアルキルベタインが挙げられる。

0080

また、均一化を促進する処理としては、例えば、ホモジナイザー処理ホモミキサー
理、超音波処理、高圧処理高温処理が挙げられる。これらの中では、ホモジナイザー処理および/または超音波処理が好ましい。また、ホモジナイザー処理および/または超音波処理と、界面活性剤による処理を、組み合わせて用いるのがより好ましい。

0081

均一化を促進する処理は、脂肪酸が安定に存在できるアルカリ条件下で行われるのが好ましい。アルカリ条件とは、好ましくはpH9以上、より好ましくはpH10以上であってよい。

0082

また、中温処理の処理物を遠心分離して得られた沈殿物には、油脂が残存し得る。油脂は、加水分解により、脂肪酸とグリセロールを生じる。そのようにして得られる脂肪酸および/またはグリセロールは、そのまま、あるいは適宜精製等して、L−アミノ酸発酵の炭素源として利用してよい。油脂の加水分解は、例えば、リパーゼを利用して酵素的に行うことができる(WO2011/013707)。また、油脂の加水分解は、化学的に行ってもよい。化学的な加水分解法としては、例えば、高温(250-260℃)、高圧(5-6MPa)下で油脂と水を向流接触させる連続高温加水分解法が挙げられる。

0083

また、中温処理の処理物を遠心分離して得られた上清には、グリセロール、グルコース、スターチ断片化物等の化合物が含まれ得る。これらの化合物は、そのまま、あるいは適宜精製等して、L−アミノ酸発酵の炭素源として利用してよい。なお、スターチの断片化物は、加水分解により、グルコースを生じる。そのようにして得られるグルコースは、そのまま、あるいは適宜精製等して、L−アミノ酸発酵の炭素源として利用してよい。例えば、そのようにして得られるグルコース濃度が高められた上清を利用してもよい。スターチの断片化物の加水分解は、例えば、アミラーゼを利用して酵素的に行うことができる(WO2011/013707)。

0084

<3−2>L−アミノ酸発酵に用いられる細菌
本発明の細菌は、L−アミノ酸生産能を有する細菌である。本発明において、「L−アミノ酸生産能を有する細菌」とは、培地で培養したときに、目的とするL−アミノ酸を生成し、回収できる程度に培地中または菌体内に蓄積する能力を有する細菌をいう。L−アミノ酸生産能を有する細菌は、非改変株よりも多い量の目的とするL−アミノ酸を培地に蓄積することができる細菌であってよい。非改変株としては、野生株や親株が挙げられる。また、L−アミノ酸生産能を有する細菌は、好ましくは0.5g/L以上、より好ましくは1.0g/L以上の量の目的とするL−アミノ酸を培地に蓄積することができる細菌であってもよい。

0085

L−アミノ酸としては、L−リジン、L−オルニチン、L−アルギニン、L−ヒスチジン、L−シトルリン等の塩基性アミノ酸、L−イソロイシン、L−アラニン、L−バリン、L−ロイシングリシン等の脂肪族アミノ酸、L−スレオニン、L−セリン等のヒドロキシモノアミノカルボン酸であるアミノ酸、L−プロリン等の環式アミノ酸、L−フェニルアラニン、L−チロシン、L−トリプトファン等の芳香族アミノ酸、L−システイン、L−シスチン、L−メチオニン等の含硫アミノ酸、L−グルタミン酸、L−アスパラギン酸等の酸性アミノ酸、L−グルタミン、L−アスパラギン等の側鎖にアミド基を持つアミノ酸が挙げられる。本発明の細菌は、1種のL−アミノ酸の生産能のみを有していてもよく、2種またはそれ以上のL−アミノ酸の生産能を有していてもよい。

0086

本発明において、アミノ酸は、特記しない限り、いずれもL−アミノ酸であってよい。

0087

細菌としては、例えば、腸内細菌科(Enterobacteriaceae)に属する細菌やコリネ型細菌が挙げられる。

0088

腸内細菌科に属する細菌としては、エシェリヒア(Escherichia)属、エンテロバクター(Enterobacter)属、パントエア(Pantoea)属、クレブシエラ(Klebsiella)属、セラチア(Serratia)属、エルニア(Erwinia)属、フォトラブダス(Photorhabdus)属、プロビデンシア(Providencia)属、サルモネラ(Salmonella)属、モルガネラ(Morganella)等の属に属する細菌が挙げられる。具体的には、NCBI(National Center for Biotechnology Information)のデータベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=91347)で用いられている分類法により腸内細菌科に分類されている細菌を用いることができる。

0089

エシェリヒア属細菌としては、特に制限されないが、微生物学専門家に知られている分類によりエシェリヒア属に分類されている細菌が挙げられる。エシェリヒア属細菌としては、例えば、Neidhardtらの著書(Backmann, B. J. 1996. Derivationsand Genotypes
of some mutant derivatives of Escherichia coli K-12, p. 2460-2488. Table 1. In F. D. Neidhardt (ed.), Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology/Second Edition, American Society for Microbiology Press, Washington, D.C.)に記載されたものが挙げられる。エシェリヒア属細菌としては、例えば、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)が挙げられる。エシェリヒア・コリとして、具体的には、例えば、プロトタイプの野生株K12由来のエシェリヒア・コリW3110(ATCC27325)やエシェリヒア・コリMG1655(ATCC 47076)が挙げられる。

0090

エンテロバクター属細菌としては、特に制限されないが、微生物学の専門家に知られている分類によりエンテロバクター属に分類されている細菌が挙げられる。エンテロバクター属細菌としては、例えば、エンテロバクター・アグロメランス(Enterobacter agglomerans)やエンテロバクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)が挙げられる。エンテロバクター・アグロメランスとして、具体的には、例えば、エンテロバクター・アグロメランスATCC12287株が挙げられる。エンテロバクター・アエロゲネスとして、具体的には、例えば、エンテロバクター・アエロゲネスATCC13048株、NBRC12010株(Biotechonol Bioeng. 2007 Mar 27; 98(2) 340-348)、AJ110637株(FERM BP-10955)が挙げられる。また、エンテロバクター属細菌としては、例えば、欧州特許出願公開EP0952221号明細書に記載されたものが挙げられる。なお、Enterobacter agglomeransには、Pantoea agglomeransと分類されているものも存在する。

0091

パントエア属細菌としては、特に制限されないが、微生物学の専門家に知られている分類によりパントエア属に分類されている細菌が挙げられる。パントエア属細菌としては、例えば、パントエア・アナナティス(Pantoea ananatis)、パントエア・スチューアルティ(Pantoea stewartii)、パントエア・アグロメランス(Pantoea agglomerans)、パントエア・シトレア(Pantoea citrea)が挙げられる。パントエア・アナナティスとして、具体的には、例えば、パントエア・アナナティスLMG20103株、AJ13355株(FERM BP-6614)、AJ13356株(FERM BP-6615)、AJ13601株(FERM BP-7207)、SC17株(FERM BP-11091)、及びSC17(0)株(VKPM B-9246)が挙げられる。なお、エンテロバクター・アグロメランスのある種のものは、最近、16SrRNAの塩基配列分析等に基づき、パントエア・アグロメランス、パントエア・アナナティス、パントエア・ステルティイ等に再分類された(Int. J. Syst. Bacteriol., 43, 162-173 (1993))。本発明において、パントエア属細菌には、このようにパントエア属に再分類された細菌も含まれる。

0092

エルビニア属細菌としては、エルビニア・アミロボーラ(Erwinia amylovora)、エルビニア・カロトボーラ(Erwinia carotovora)が挙げられる。クレブシエラ属細菌としては、クレブシエラ・プランティコーラ(Klebsiella planticola)が挙げられる。

0093

コリネ型細菌としては、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、ブレビバクテリ
ウム(Brevibacterium)属、およびミクロバクテリウム(Microbacterium)属等の属に属する細菌が挙げられる。

0094

コリネ型細菌としては、具体的には、下記のような種が挙げられる。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム(Corynebacterium acetoacidophilum)
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム(Corynebacterium acetoglutamicum)
コリネバクテリウム・アルカノリティカム(Corynebacterium alkanolyticum)
コリネバクテリウム・カルナエ(Corynebacteriumcallunae)
コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)
コリネバクテリウム・リリウム(Corynebacterium lilium)
コリネバクテリウム・メラセコーラ(Corynebacterium melassecola)
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス(コリネバクテリウム・エフィシエンス)(Corynebacterium thermoaminogenes (Corynebacterium efficiens))
コリネバクテリウム・ハーキュリス(Corynebacterium herculis)
ブレビバクテリウムディバリカタム(コリネバクテリウム・グルタミカム)(Brevibacterium divaricatum (Corynebacterium glutamicum))
ブレビバクテリウム・フラバム(コリネバクテリウム・グルタミカム)(Brevibacterium
flavum (Corynebacterium glutamicum))
ブレビバクテリウム・イマリオフィラム(Brevibacterium immariophilum)
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム(コリネバクテリウム・グルタミカム)(Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum))
ブレビバクテリウム・ロゼウム(Brevibacterium roseum)
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム(Brevibacterium saccharolyticum)
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス(Brevibacterium thiogenitalis)
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス(コリネバクテリウム・スタティオニス)(Corynebacterium ammoniagenes (Corynebacterium stationis))
ブレビバクテリウム・アルバム(Brevibacterium album)
ブレビバクテリウム・セリナム(Brevibacterium cerinum)
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム(Microbacterium ammoniaphilum)

0095

コリネ型細菌としては、具体的には、下記のような菌株が挙げられる。
Corynebacterium acetoacidophilumATCC13870
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806
Corynebacterium alkanolyticum ATCC 21511
Corynebacteriumcallunae ATCC 15991
Corynebacterium glutamicum ATCC 13020, ATCC 13032, ATCC 13060,ATCC 13869,FERM BP-734
Corynebacterium lilium ATCC 15990
Corynebacterium melassecola ATCC 17965
Corynebacterium efficiens(Corynebacterium thermoaminogenes) AJ12340 (FERM BP-1539)
Corynebacterium herculis ATCC 13868
Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium divaricatum) ATCC 14020
Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) ATCC 13826, ATCC 14067, AJ12418(FERM BP-2205)
Brevibacterium immariophilum ATCC 14068
Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium lactofermentum) ATCC 13869
Brevibacterium roseum ATCC 13825
Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066
Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240
Corynebacterium ammoniagenes (Corynebacterium stationis) ATCC 6871, ATCC 6872
Brevibacterium album ATCC 15111
Brevibacterium cerinum ATCC 15112
Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354

0096

なお、コリネバクテリウム属細菌には、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが、現在コリネバクテリウム属統合された細菌(Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255(1991))も含まれる。また、コリネバクテリウム・スタティオニスには、従来コリネバクテリウム・アンモニアゲネスに分類されていたが、16SrRNAの塩基配列解析等によりコリネバクテリウム・スタティオニスに再分類された細菌も含まれる(Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 60, 874-879(2010))。

0097

これらの菌株は、例えば、アメリカン・タイプカルチャーコレクション住所12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America)より分譲を受けることが出来る。すなわち各菌株に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることが出来る(http://www.atcc.org/参照)。各菌株に対応する登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。

0098

本発明の細菌は、本来的にL−アミノ酸生産能を有するものであってもよく、L−アミノ酸生産能を有するように改変されたものであってもよい。L−アミノ酸生産能を有する細菌は、例えば、上記のような細菌にL−アミノ酸生産能を付与することにより、または、上記のような細菌のL−アミノ酸生産能を増強することにより、取得できる。

0099

L−アミノ酸生産能の付与または増強は、従来、コリネ型細菌又はエシェリヒア属細菌等のアミノ酸生産菌の育種に採用されてきた方法により行うことができる(アミノ酸発酵、(株)学会出版センター、1986年5月30日初版発行、第77〜100頁参照)。そのような方法としては、例えば、栄養要求性変異株の取得、L−アミノ酸のアナログ耐性株の取得、代謝制御変異株の取得、L−アミノ酸の生合成系酵素の活性が増強された組換え株の創製が挙げられる。L−アミノ酸生産菌の育種において、付与される栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質は、単独であってもよく、2種又は3種以上であってもよい。また、L−アミノ酸生産菌の育種において、活性が増強されるL−アミノ酸生合成系酵素も、単独であってもよく、2種又は3種以上であってもよい。さらに、栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質の付与と、生合成系酵素の活性の増強が組み合わされてもよい。

0100

L−アミノ酸生産能を有する栄養要求性変異株、アナログ耐性株、又は代謝制御変異株は、親株又は野生株を通常の変異処理に供し、得られた変異株の中から、栄養要求性、アナログ耐性、又は代謝制御変異を示し、且つL−アミノ酸生産能を有するものを選択することによって取得できる。通常の変異処理としては、X線や紫外線の照射、N−メチル−N’−ニトロ−N−ニトロソグアニジン(MNNG)、エチルメタンスルフォネート(EMS)、メチルメタンスルフォネート(MMS)等の変異剤による処理が挙げられる。

0101

また、L−アミノ酸生産能の付与又は増強は、目的のL−アミノ酸の生合成関与する酵素の活性を増強することによっても行うことができる。酵素活性の増強は、例えば、同酵素をコードする遺伝子の発現が増強するように細菌を改変することにより達成できる。遺伝子の発現を増強する方法としては、遺伝子のコピー数を増加させることや、遺伝子の転写翻訳を増大させることが挙げられる。遺伝子のコピー数を増加させることは、例えば、同遺伝子を搭載したベクター宿主に導入することや、遺伝子を宿主の染色体上に導入することにより達成できる。遺伝子の転写や翻訳を増大させることは、例えば、プロモ
ーター、SD配列(RBS)、またはRBSと開始コドンとの間のスペーサー領域(例えば開始コドンのすぐ上流の配列(5'-UTR))等の発現調節領域を改変することにより達成できる。遺伝子の発現を増強する方法は、WO00/18935号パンフレット、欧州特許出願公開1010755号明細書等に記載されている。

0102

また、L−アミノ酸生産能の付与又は増強は、目的のL−アミノ酸の生合成経路から分岐して目的のL−アミノ酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性を低下させることによっても行うことができる。なお、ここでいう「目的のL−アミノ酸の生合成経路から分岐して目的のL−アミノ酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素」には、目的のアミノ酸の分解に関与する酵素も含まれる。酵素活性の低下は、例えば、同酵素をコードする遺伝子の発現が低下するように細菌を改変することや、同遺伝子を破壊することにより達成できる。遺伝子の発現を低下させることは、例えば、プロモーター、SD配列(RBS)、またはRBSと開始コドンとの間のスペーサー領域(例えば開始コドンのすぐ上流の配列(5'-UTR))等の発現調節領域を改変することにより達成できる。遺伝子を破壊することは、例えば、同遺伝子の一部または全体を欠失させることにより達成できる。

0103

以下、L−アミノ酸生産菌、およびL−アミノ酸生産能を付与または増強する方法について具体的に例示する。なお、以下に例示するようなL−アミノ酸生産菌が有する性質およびL−アミノ酸生産能を付与または増強するための改変は、いずれも、単独で用いてもよく、適宜組み合わせて用いてもよい。

0104

<L−グルタミン酸生産菌>
L−グルタミン酸生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、L−グルタミン酸生合成系酵素から選択される1またはそれ以上の酵素の活性が増大するように細菌を改変する方法が挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ(gdhA)、グルタミンシンテターゼ(glnA)、グルタミン酸シンテターゼ(gltBD)、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ(icdA)、アコニテートヒドラターゼ(acnA, acnB)、クエン酸シンターゼ(gltA)、メチルクエン酸シンターゼ(prpC)、ホスホエノールピルビン酸カルボシラーゼ(ppc)、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ(aceEF, lpdA)、ピルベートキナーゼ(pykA, pykF)、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ(ppsA)、エノラーゼ(eno)、ホスホグリセロムターゼ(pgmA, pgmI)、ホスホグリセリン酸キナーゼ(pgk)、グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(gapA)、トリオースリン酸イソメラーゼ(tpiA)、フルクトースビスリン酸アルドラーゼ(fbp)、ホスホフルクトキナーゼ(pfkA, pfkB)、グルコースリン酸イソメラーゼ(pgi)、6−ホスホグルコン酸デヒドラターゼ(edd)、2−ケト−3−デオキシ−6−ホスホグルコン酸アルドラーゼ(eda)、トランスヒドロゲナーゼが挙げられる。なお、カッコ内は、その酵素をコードする遺伝子の略記号である(以下の記載においても同様)。これらの酵素の中では、例えば、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、クエン酸シンターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、及びメチルクエン酸シンターゼから選択される1またはそれ以上の酵素の活性を増強するのが好ましい。

0105

クエン酸シンターゼ遺伝子、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子、および/またはグルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現が増大するように改変された腸内細菌科に属する株としては、EP1078989A、EP955368A、及びEP952221Aに開示されたものが挙げられる。また、エントナードゥドロフ経路の遺伝子(edd, eda)の発現が増大するように改変された腸内細菌科に属する株としては、EP1352966Bに開示されたものが挙げられる。また、グルタミン酸シンテターゼ遺伝子(gltBD)の発現が増大するように改変されたコリネ型細菌としては、WO99/07853に開示されたものが挙げられる。

0106

また、L−グルタミン酸生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、L−グルタミン酸の生合成経路から分岐してL−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素から選択される1またはそれ以上の酵素の活性が低下するように細菌を改変する方法も挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、イソクエン酸リアーゼ(aceA)、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ(sucA, odhA)、ホスホトランスアセチラーゼ(pta)、酢酸キナーゼ(ack)、アセトヒドロキシ酸シンターゼ(ilvG)、アセト乳酸シンターゼ(ilvI)、ギ酸アセチルトランスフェラーゼ(pfl)、乳酸デヒドロゲナーゼ(ldh)、アルコールデヒドロゲナーゼ(adh)、グルタミン酸デカルボキシラーゼ(gadAB)、コハク酸デヒドロゲナーゼ(sdhABCD)、1−ピロリン−5−カルボキシレートデヒドロゲナーゼ(putA)が挙げられる。

0107

α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下または欠損したエシェリヒア属細菌、及びそれらの取得方法は、米国特許第5,378,616号及び第5,573,945号に記載されている。また、パントエア属細菌、エンテロバクター属細菌、クレブシエラ属細菌、エルビニア属細菌等の腸内細菌においてα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を低下または欠損させる方法は、米国特許6,197,559号公報、米国特許6,682,912号公報、米国特許6,331,419号公報、米国特許8,129,151号公報、およびWO2008/075483に開示されている。α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下または欠損したエシェリヒア属細菌として、具体的には、例えば、下記の株が挙げられる。
E. coli W3110sucA::Kmr
E. coli AJ12624 (FERM BP-3853)
E. coli AJ12628 (FERM BP-3854)
E. coli AJ12949 (FERM BP-4881)

0108

E. coli W3110sucA::Kmr は、E. coli W3110のα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼをコードするsucA遺伝子を破壊することにより得られた株である。この株は、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を完全に欠損している。

0109

α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下または欠損したコリネ型細菌、及びそれらの取得方法は、WO2008/075483に記載されている。α−ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が低下または欠損したコリネ型細菌として、具体的には、例えば、下記の株が挙げられる。
Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium lactofermentum) L30-2株 (特開2006-340603号明細書)
Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium lactofermentum) ΔS株 (国際公開95/34672号パンフレット)
Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium lactofermentum) AJ12821 (FERM BP-4172;フランス特許公報9401748号明細書参照)
Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) AJ12822 (FERM BP-4173;フランス特許公報9401748号明細書)
Corynebacterium glutamicum AJ12823 (FERM BP-4174;フランス特許公報9401748号明細書)
Corynebacterium glutamicum L30-2株 (特開2006-340603号)

0110

また、L−グルタミン酸生産菌又はそれを誘導するための親株としては、Pantoea ananatis AJ13355株(FERM BP-6614)、Pantoea ananatis SC17株(FERM BP-11091)、Pantoea ananatis SC17(0)株(VKPM B-9246)等のパントエア属細菌も挙げられる。AJ13355株は、静岡県磐田市の土壌から、低pHでL−グルタミン酸及び炭素源を含む培地で増殖できる株として分離された株である。SC17株は、AJ13355株から、粘液質低生産変異株として選択された株である(米国特許第6,596,517号)。SC17株は、平成21年2月4日に、独立
行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(現、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センター、郵便番号:292-0818、住所:日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室)に寄託され、受託番号FERM BP-11091が付与されている。AJ13355株は、1998年2月19日に、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター(現、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター、郵便番号:292-0818、住所:日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室)に、受託番号FERM P-16644として寄託され、1999年1月11日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-6614が付与されている。

0111

また、L−グルタミン酸生産菌又はそれを誘導するための親株としては、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下または欠損したパントエア属細菌も挙げられる。そのような株としては、AJ13355株のα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼのE1サブユニット遺伝子(sucA)欠損株であるAJ13356株(米国特許第6,331,419号)、及びSC17株のsucA遺伝子欠損株であるSC17sucA株(米国特許第6,596,517号)が挙げられる。AJ13356株は、1998年2月19日、工業技術院生命工学工業技術研究所(現、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センター、郵便番号:292-0818、住所:日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室)に受託番号FERM P-16645として寄託され、1999年1月11日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-6616が付与されている。また、SC17sucA株は、ブライベートナンバーAJ417が付与され、2004年2月26日に独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター(現、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター、郵便番号:292-0818、住所:日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室)に受託番号FERM BP-8646として寄託されている。

0112

尚、AJ13355株は、分離された当時はEnterobacter agglomeransと同定されたが、近年、16SrRNAの塩基配列解析などにより、Pantoea ananatisに再分類されている。よって、AJ13355株及びAJ13356株は、上記寄託機関にEnterobacter agglomeransとして寄託されているが、本明細書ではPantoea ananatisとして記載する。

0113

また、L−グルタミン酸生産菌又はそれを誘導するための親株としては、Pantoea ananatis SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株、Pantoea ananatis AJ13601株、Pantoea ananatis NP106株、及びPantoea ananatis NA1株等のパントエア属細菌も挙げられる。SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株は、SC17sucA株に、エシェリヒア・コリ由来のクエン酸シンターゼ遺伝子(gltA)、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子(ppc)、およびグルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子(gdhA)を含むプラスミドRSFCPG、並びに、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来のクエン酸シンターゼ遺伝子(gltA)を含むプラスミドpSTVCBを導入して得られた株である。AJ13601株は、このSC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株から低pH下で高濃度のL−グルタミン酸に耐性を示す株として選択された株である。また、NP106株は、AJ13601株からプラスミドRSFCPG+pSTVCBを脱落させた株である。AJ13601株は、1999年8月18日に、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(現、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センター、郵便番号:292-0818、住所:日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室)に受託番号FERM P-17516として寄託され、2000年7月6日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-7207が付与されている。

0114

また、L−グルタミン酸生産菌又はそれを誘導するための親株としては、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ(sucA)活性およびコハク酸デヒドロゲナーゼ(sdh)活性の両方が低下または欠損した株も挙げられる(特開2010-041920号)。そのような株として、具体的には、例えば、Pantoea ananatis NA1のsucAsdhA二重欠損株やCorynebacterium glutamicumATCC14067のodhAsdhA二重欠損株(Corynebacterium glutamicum 8L3GΔSDH株)が挙げられる(特開2010-041920号)。

0115

また、L−グルタミン酸生産菌又はそれを誘導するための親株としては、栄養要求性変異株も挙げられる。栄養要求性変異株として、具体的には、例えば、E. coli VL334thrC+
(VKPM B-8961) (EP 1172433) が挙げられる。E. coli VL334 (VKPM B-1641) は、thrC遺伝子及びilvA遺伝子に変異を有するL−イソロイシン及びL−スレオニン要求性株である
(米国特許第4,278,765号)。E. coli VL334thrC+は、thrC遺伝子の野生型アレルをVL334に導入することにより得られた、L−イソロイシン要求性のL−グルタミン酸生産菌である。thrC遺伝子の野生型アレルは、野生型E. coli K12株 (VKPM B-7) の細胞で増殖したバクテリオファージP1を用いる一般的形質導入法により導入された。

0116

また、L−グルタミン酸生産菌又はそれを誘導するための親株としては、アスパラギン酸アナログに耐性を有する株も挙げられる。これらの株は、例えば、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を欠損していてもよい。アスパラギン酸アナログに耐性を有し、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を欠損した株として、具体的には、例えば、E. coli AJ13199 (FERM BP-5807) (米国特許第5.908,768号)、さらにL−グルタミン酸分解能が低下したE. coliFFRM P-12379 (米国特許第5,393,671号)、E. coli AJ13138 (FERM BP-5565) (米国特許第6,110,714号) が挙げられる。

0117

また、L−グルタミン酸生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、D−キシロース−5−リン酸ホスホケトラーゼ及び/又はフルクトース−6−リン酸ホスホケトラーゼの活性が増大するように細菌を改変する方法も挙げられる(特表2008-509661)。D−キシロース−5−リン酸−ホスホケトラーゼ活性及びフルクトース−6−リン酸ホスホケトラーゼ活性はいずれか一方を増強してもよいし、両方を増強してもよい。なお、本明細書ではD−キシロース−5−リン酸−ホスホケトラーゼとフルクトース−6−リン酸ホスホケトラーゼをまとめてホスホケトラーゼと呼ぶことがある。

0118

D−キシロース−5−リン酸−ホスホケトラーゼ活性とは、リン酸を消費して、キシルロース−5−リン酸をグリセルアルデヒド−3−リン酸とアセチルリン酸変換し、一分子のH2Oを放出する活性を意味する。この活性は、Goldberg, M.らの文献 (MethodsEnzymol., 9,515-520 (1966)) またはL.Meileの文献 (J.Bacteriol. (2001) 183; 2929-2936) に記載の方法によって測定することができる。

0119

また、フルクトース−6−リン酸ホスホケトラーゼ活性とは、リン酸を消費して、フルクトース6−リン酸をエリスロース−4−リン酸とアセチルリン酸に変換し、一分子のH2Oを放出する活性を意味する。この活性は、Racker, Eの文献 (MethodsEnzymol., 5, 276-280 (1962)) またはL.Meileの文献 (J.Bacteriol. (2001) 183; 2929-2936) に記載の方法によって測定することができる。

0120

また、L−グルタミン酸生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、L−グルタミン酸排出遺伝子であるyhfK遺伝子(WO2005/085419)やybjL遺伝子(WO2008/133161)の発現を増強することも挙げられる。

0121

また、コリネ型細菌について、L−グルタミン酸生産能を付与または増強する方法としては、有機酸アナログや呼吸阻害剤などへの耐性を付与する方法や、細胞壁合成阻害剤に対する感受性を付与する方法も挙げられる。そのような方法として、具体的には、例えば、モノフルオロ酢酸耐性を付与する方法(特開昭50-113209)、アデニン耐性またはチミン耐性を付与する方法(特開昭57-065198)、ウレアーゼ弱化させる方法(特開昭52-038088)、マロン酸耐性を付与する方法(特開昭52-038088)、ベンゾピロンまたはナフトキノン類への耐性を付与する方法(特開昭56-1889)、HOQNO耐性を付与する方法(特開昭56-140895)、α-ケトマロン酸耐性を付与する方法(特開昭57-2689)、グアニジン耐性
を付与する方法(特開昭56-35981)、ペニシリンに対する感受性を付与する方法(特開平4-88994)などが挙げられる。

0122

このような耐性菌または感受性菌の具体例としては、下記のような菌株が挙げられる。Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) AJ3949 (FERM BP-2632;特開昭50-113209参照)
Corynebacterium glutamicum AJ11628 (FERM P-5736;特開昭57-065198参照)
Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) AJ11355 (FERM P-5007;特開昭56-1889号公報参照)
Corynebacterium glutamicum AJ11368 (FERM P-5020;特開昭56-1889号公報参照)
Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) AJ11217 (FERM P-4318;特開昭57-2689号公報参照)
Corynebacterium glutamicum AJ11218 (FERM P-4319;特開昭57-2689号公報参照)
Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) AJ11564 (FERM P-5472;特開昭56-140895公報参照)
Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) AJ11439 (FERM P-5136;特開昭56-35981号公報参照)
Corynebacterium glutamicum H7684 (FERM BP-3004;特開平04-88994号公報参照)
Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium lactofermentum) AJ11426(FERM P-5123;特開平56-048890号公報参照)
Corynebacterium glutamicum AJ11440(FERM P-5137;特開平56-048890号公報参照)
Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium lactofermentum) AJ11796(FERM P-6402;特開平58-158192号公報参照)

0123

また、コリネ型細菌について、L−グルタミン酸生産能を付与または増強する方法としては、yggB遺伝子の発現を増強する方法やコード領域内に変異を導入した変異型yggB遺伝子を導入する方法も挙げられる(WO2006/070944)。yggB遺伝子は、メカセンシティブチャンネル(mechanosensitive channel)をコードする遺伝子である。Corynebacterium glutamicumATCC13032のyggB遺伝子は、NCBIデータベースにGenBankAccession No. NC_003450で登録されているゲノム配列中、1,336,091〜1,337,692の配列の相補配列相当し、NCgl1221とも呼ばれる。Corynebacterium glutamicum ATCC13032のyggB遺伝子にコードされるYggBタンパク質は、GenBank accession No. NP_600492として登録されている。

0124

<L−グルタミン生産菌>
L−グルタミン生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、L−グルタミン生合成系酵素から選択される1またはそれ以上の酵素の活性が増大するように細菌を改変する方法が挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ(gdhA)やグルタミンシンセターゼ(glnA)が挙げられる。なお、グルタミンシンセターゼの活性は、グルタミンアデニニルトランスフェラーゼ遺伝子(glnE)の破壊やPII制御タンパク質遺伝子(glnB)の破壊によって増強してもよい(EP1229121)。

0125

また、L−グルタミン生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、L−グルタミンの生合成経路から分岐してL−グルタミン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素から選択される1またはそれ以上の酵素の活性が低下するように細菌を改変する方法も挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、グルタミナーゼが挙げられる。

0126

L−グルタミン生産菌又はそれを誘導するための親株としては、グルタミン酸デヒドロ
ゲナーゼ(gdhA)および/またはグルタミンシンセターゼ(glnA)の活性を増強したコリネ型細菌(EP1229121, EP1424398)やグルタミナーゼ活性が低下したコリネ型細菌(特開2004-187684)が挙げられる。また、L−グルタミン生産菌又はそれを誘導するための親株としては、グルタミンシンセターゼの397位のチロシン残基が他のアミノ酸残基に置換された変異型グルタミンシンセターゼを有するエシェリヒア属に属する株が挙げられる(米国特許出願公開第2003-0148474号明細書)。

0127

また、コリネ型細菌について、L−グルタミン生産能を付与または増強する方法としては、6-ジアゾ-5-オキソ-ノルロイシン耐性を付与する方法 (特開平3-232497)、プリンアナログ耐性及びメチオニンスルホキシド耐性を付与する方法 (特開昭61-202694)、α-ケトマレイン酸耐性を付与する方法 (特開昭56-151495)が挙げられる。L−グルタミン生産能を有するコリネ型細菌として、具体的には、例えば、以下の株が挙げられる。
Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) AJ11573 (FERM P-5492;特開昭56-161495)
Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) AJ11576 (FERM BP-10381;特開昭56-161495)
Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) AJ12212 (FERM P-8123;特開昭61-202694)

0128

<L−プロリン生産菌>
L−プロリン生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、L−プロリン生合成系酵素から選択される1またはそれ以上の酵素の活性が増大するように細菌を改変する方法が挙げられる。そのような酵素としては、グルタミン酸−5−キナーゼ(proB)、γ‐グルタミル−リン酸レダクターゼ、ピロリン−5−カルボキシレートレダクターゼ(putA)が挙げられる。酵素活性の増強には、例えば、L−プロリンによるフィードバック阻害解除されたグルタミン酸−5−キナーゼをコードするproB遺伝子(ドイツ特許第3127361号)が好適に利用できる。

0129

また、L−プロリン生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、L−プロリン分解に関与する酵素の活性が低下するように細菌を改変する方法が挙げられる。そのような酵素としては、プロリンデヒドロゲナーゼやオルニチンアミノトランスフェラーゼが挙げられる。

0130

L−プロリン生産菌又はそれを誘導するための親株として、具体的には、例えば、E. coli NRRL B-12403及びNRRL B-12404 (英国特許第2075056号)、E. coli VKPM B-8012 (ロシア特許出願2000124295)、ドイツ特許第3127361号に記載のE. coliプラスミド変異体、Bloom F.R. et al (The 15th Miami winter symposium, 1983, p.34)に記載のE. coliプラスミド変異体、3,4−デヒドロキシプロリンおよびアザジン−2−カルボキシレートに耐性のE. coli 702株(VKPMB-8011)、702株のilvA遺伝子欠損株であるE. coli 702ilvA株(VKPM B-8012) (EP 1172433) が挙げられる。

0131

<L−スレオニン生産菌>
L−スレオニン生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、L−スレオニン生合成系酵素から選択される1またはそれ以上の酵素の活性が増大するように細菌を改変する方法が挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、アスパルトキナーゼIII(lysC)、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ(asd)、アスパルトキナーゼI(thrA)、ホモセリンキナーゼ(homoserine kinase)(thrB)、スレオニンシンターゼ(threonine synthase)(thrC)、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼアスパラギン酸トランスアミナーゼ)(aspC)が挙げられる。これらの酵素の中では、アスパルトキナーゼIII、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アスパルト
キナーゼI、ホモセリンキナーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、及びスレオニンシンターゼから選択される1またはそれ以上の酵素の活性を増強するのが好ましい。L−スレオニン生合成系遺伝子は、スレオニン分解が抑制された株に導入してもよい。スレオニン分解が抑制された株としては、例えば、スレオニンデヒドロゲナーゼ活性が欠損したE. coli TDH6株(特開2001-346578号)が挙げられる。

0132

L−スレオニン生合成系酵素の活性は、最終産物のL−スレオニンによって阻害される。従って、L−スレオニン生産菌を構築するためには、L−スレオニンによるフィードバック阻害を受けないようにL−スレオニン生合成系遺伝子を改変するのが好ましい。上記thrA、thrB、thrC遺伝子は、スレオニンオペロンを構成しており、スレオニンオペロンは、アテニュエーター構造を形成している。スレオニンオペロンの発現は、培養液中のイソロイシン、スレオニンに阻害を受け、アテニュエーションにより抑制される。スレオニンオペロンの発現の増強は、アテニュエーション領域のリーダー配列あるいはアテニュエーターを除去することにより達成できる(Lynn, S. P., Burton, W. S., Donohue, T. J., Gould, R. M., Gumport, R. I., and Gardner, J. F. J. Mol. Biol. 194:59-69 (1987);
WO02/26993; WO2005/049808; WO2005/049808; WO2003/097839参照)。

0133

スレオニンオペロンの上流には固有のプロモーターが存在するが、同プロモーターを非天然のプロモーターに置換してもよい(WO98/04715号パンフレット参照)。また、スレオニン生合成関与遺伝子がラムダファ−ジのリプレッサーおよびプロモーターの制御下で発現するようにスレオニンオペロンを構築してもよい(欧州特許第0593792号明細書参照)。また、L−スレオニンによるフィードバック阻害を受けないように改変された細菌は、L−スレオニンアナログであるα-amino-β-hydroxyvaleric acid(AHV)に耐性な菌株を選抜することによっても取得できる。

0134

このようにL−スレオニンによるフィードバック阻害を受けないように改変されたスレオニンオペロンは、コピー数の上昇により、あるいは強力なプロモーターに連結されることにより、宿主内での発現量が向上しているのが好ましい。コピー数の上昇は、スレオニンオペロンを含むプラスミドを宿主に導入することにより達成できる。また、コピー数の上昇は、トランスポゾン、Muファ−ジ等を利用して、宿主のゲノム上にスレオニンオペロンを転移させることによっても達成できる。

0135

また、L−スレオニン生産能を付与または増強する方法としては、宿主にL−スレオニン耐性を付与する方法やL−ホモセリン耐性を付与する方法も挙げられる。耐性の付与は、例えば、L−スレオニンに耐性を付与する遺伝子、L−ホモセリンに耐性を付与する遺伝子の発現を強化することにより達成できる。耐性を付与する遺伝子としては、rhtA遺伝子(Res. Microbiol. 154:123−135 (2003))、rhtB遺伝子(欧州特許出願公開第0994190号明細書)、rhtC遺伝子(欧州特許出願公開第1013765号明細書)、yfiK遺伝子yeaS遺伝子(欧州特許出願公開第1016710号明細書)が挙げられる。また、宿主にL−スレオニン耐性を付与する方法は、欧州特許出願公開第0994190号明細書や国際公開第90/04636号パンフレットに記載の方法を参照出来る。

0136

L−スレオニン生産菌又はそれを誘導するための親株として、具体的には、例えば、E.
coli TDH-6/pVIC40 (VKPM B-3996) (米国特許第5,175,107号、米国特許第5,705,371号)、E. coli 472T23/pYN7 (ATCC98081) (米国特許第5,631,157号)、E. coli NRRL−21593
(米国特許第5,939,307号)、E. coli FERM BP-3756 (米国特許第5,474,918号)、E. coli FERM BP-3519及びFERM BP-3520 (米国特許第5,376,538号)、E. coli MG442 (Gusyatiner et al., Genetika (in Russian), 14, 947-956 (1978))、E. coli VL643及びVL2055 (EP 1149911 A)、ならびにE. coli VKPM B-5318 (EP 0593792 B) が挙げられる。

0137

VKPM B-3996株は、TDH-6株に、プラスミドpVIC40を導入した株である。TDH-6株は、スクロース資化性であり、thrC遺伝子を欠損し、ilvA遺伝子にリーキー(leaky)変異を有する。また、VKPM B-3996株は、rhtA遺伝子に、高濃度のスレオニンまたはホモセリンに対する耐性を付与する変異を有する。プラスミドpVIC40は、RSF1010由来ベクターに、スレオニンによるフィードバック阻害に耐性のアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼIをコードする変異型thrA遺伝子と野生型thrBC遺伝子を含むthrA*BCオペロンが挿入されたプラスミドである(米国特許第5,705,371号)。この変異型thrA遺伝子は、スレオニンによるフィードバック阻害が実質的に解除されたアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼIをコードする。B-3996株は、1987年11月19日、オールユニオンサイエンティフィック・センター・オブアンチビオティクス(Nagatinskaya Street 3-A, 117105 Moscow, Russia)に、受託番号RIA1867で寄託されている。この株は、また、1987年4月7日、ルシアンナシナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ (VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia) に、受託番号VKPM
B-3996で寄託されている。

0138

VKPM B-5318株は、イソロイシン非要求性であり、プラスミドpVIC40中のスレオニンオペロンの制御領域を温度感受性ラムダファージC1リプレッサー及びPRプロモーターにより置換したプラスミドpPRT614を保持する。VKPM B-5318は、1990年5月3日、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ (VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia) に、受託番号VKPM B-5318で国際寄託されている。

0139

E. coliのアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼIをコードするthrA遺伝子は明らかにされている(ヌクレオチド番号337〜2799,GenBankaccessionNC_000913.2, gi: 49175990)。thrA遺伝子は、E. coli K-12の染色体において、thrL遺伝子とthrB遺伝子との間に位置する。Escherichia coliのホモセリンキナーゼをコードするthrB遺伝子は明らかにされている(ヌクレオチド番号2801〜3733, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990)。thrB遺伝子は、E. coli K-12の染色体において、thrA遺伝子とthrC遺伝子との間に位置する。E. coliのスレオニンシンターゼをコードするthrC遺伝子は明らかにされている(ヌクレオチド番号3734〜5020, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990)。thrC遺伝子は、E. coli K-12の染色体において、thrB遺伝子とyaaXオープンリーディングフレームとの間に位置する。また、スレオニンによるフィードバック阻害に耐性のアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼIをコードする変異型thrA遺伝子と野生型thrBC遺伝子を含むthrA*BCオペロンは、スレオニン生産株E. coli VKPM B-3996に存在する周知のプラスミドpVIC40(米国特許第5,705,371号)から取得できる。

0140

E. coliのrhtA遺伝子は、グルタミン輸送系要素をコードするglnHPQオペロンに近いE. coli染色体の18分に存在する。rhtA遺伝子は、ORF1 (ybiF遺伝子,ヌクレオチド番号764〜1651,GenBankaccession number AAA218541, gi:440181)と同一であり、pexB遺伝子とompX遺伝子との間に位置する。ORF1によりコードされるタンパク質を発現するユニットは、rhtA遺伝子と呼ばれている(rht: resistant to homoserine and threonine(ホモセリン及びスレオニンに耐性))。また、高濃度のスレオニン又はホモセリンへの耐性を付与するrhtA23変異が、ATG開始コドンに対して-1位のG→A置換であることが判明している(ABSTRACTSof the 17th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract No.
457, EP 1013765 A)。

0141

E. coliのasd遺伝子は既に明らかにされており(ヌクレオチド番号3572511〜3571408,GenBankaccessionNC_000913.1, gi:16131307)、その遺伝子の塩基配列に基づいて作製さ
れたプライマーを用いるPCRにより取得できる(White, T.J. et al., TrendsGenet., 5, 185 (1989)参照)。他の微生物のasd遺伝子も同様に得ることができる。

0142

また、E. coliのaspC遺伝子も既に明らかにされており(ヌクレオチド番号983742〜984932,GenBankaccessionNC_000913.1, gi:16128895)、その遺伝子の塩基配列に基づいて作製されたプライマーを用いるPCRにより得ることができる。他の微生物のaspC遺伝子も同様に得ることができる。

0143

また、L−スレオニン生産能を有するコリネ型細菌としては、例えば、Corynebacterium acetoacidophilum AJ12318 (FERM BP-1172) (米国特許第5,188,949号参照) が挙げられる。

0144

<L−リジン生産菌>
L−リジン生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、L−リジン生合成系酵素から選択される1またはそれ以上の酵素の活性が増大するように細菌を改変する方法が挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ(dihydrodipicolinate synthase)(dapA)、アスパルトキナーゼIII(aspartokinase III)(lysC)、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ(dihydrodipicolinate reductase)(dapB)、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ(diaminopimelate decarboxylase)(lysA)、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ(diaminopimelate dehydrogenase)(ddh)(米国特許第6,040,160号)、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(phosphoenolpyrvate carboxylase)(ppc)、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ(aspartate semialdehyde dehydrogenease)(asd)、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(aspartate aminotransferase)(アスパラギン酸トランスアミナーゼ(aspartate transaminase))(aspC)、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ(diaminopimelate epimerase)(dapF)、テトラヒドロジピコリン酸スクニラーゼ(tetrahydrodipicolinate succinylase)(dapD)、スクシニルジアミノピメリン酸デアシラーゼ(succinyl-diaminopimelate deacylase)(dapE)、及びアスパルターゼ(aspartase)(aspA)(EP 1253195 A)が挙げられる。これらの酵素の中では、例えば、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、テトラヒドロジピコリン酸スクシニラーゼ、及びスクシニルジアミノピメリン酸デアシラーゼから選択される1またはそれ以上の酵素の活性を増強するのが好ましい。また、L−リジン生産菌又はそれを誘導するための親株では、エネルギー効率に関与する遺伝子(cyo)(EP 1170376 A)、ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ(nicotinamide nucleotide transhydrogenase)をコードする遺伝子(pntAB)(米国特許第5,830,716号)、ybjE遺伝子(WO2005/073390)、またはこれらの組み合わせの発現レベルが増大していてもよい。アスパルトキナーゼIII(lysC)はL−リジンによるフィードバック阻害を受けるので、同酵素の活性を増強するには、L−リジンによるフィードバック阻害が解除されたアスパルトキナーゼIIIをコードする変異型lysC遺伝子を利用してもよい(米国特許5,932,453号明細書)。また、ジヒドロジピコリン酸合成酵素(dapA)L−リジンによるフィードバック阻害を受けるので、同酵素の活性を増強するには、L−リジンによるフィードバック阻害が解除されたジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする変異型dapA遺伝子を利用してもよい。

0145

また、L−リジン生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、L−リジンの生合成経路から分岐してL−リジン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素から選択される1またはそれ以上の酵素の活性が低下するように細菌を改変する方法も挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、ホモセリンデヒドロゲナーゼ(homo
serine dehydrogenase)、リジンデカルボキシラーゼ(lysine decarboxylase)(米国特許第5,827,698号)、及びリンゴ酸酵素(malic enzyme)(WO2005/010175)が挙げられる。

0146

また、L−リジン生産菌又はそれを誘導するための親株としては、L−リジンアナログに耐性を有する変異株が挙げられる。L−リジンアナログは腸内細菌科の細菌やコリネ型細菌等の細菌の生育を阻害するが、この阻害は、L−リジンが培地に共存するときには完全にまたは部分的に解除される。L−リジンアナログとしては、特に制限されないが、オキサリジン、リジンヒドロキサメート、S−(2−アミノエチル)−L−システイン(AEC)、γ−メチルリジン、α−クロカプロラクタムが挙げられる。これらのリジンアナログに対して耐性を有する変異株は、細菌を通常の人工変異処理に付すことによって得ることができる。

0147

L−リジン生産菌又はそれを誘導するための親株として、具体的には、例えば、E. coli AJ11442(FERM BP-1543, NRRL B-12185; 米国特許第4,346,170号参照)及びE. coli VL611が挙げられる。これらの株では、アスパルトキナーゼのL−リジンによるフィードバック阻害が解除されている。

0148

L−リジン生産菌又はそれを誘導するための親株として、具体的には、E. coli WC196株も挙げられる。WC196株は、E. coli K-12に由来するW3110株にAEC耐性を付与することにより育種された(米国特許第5,827,698号)。WC196株は、E. coli AJ13069と命名され、1994年12月6日、工業技術院生命工学工業技術研究所(現、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センター、郵便番号:292-0818、住所:日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室)に受託番号FERM P-14690として寄託され、1995年9月29日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-5252が付与されている(米国特許第5,827,698号)。

0149

好ましいL−リジン生産菌として、E. coli WC196ΔcadAΔldcやE. coli WC196ΔcadAΔldc/pCABD2が挙げられる(WO2010/061890)。WC196ΔcadAΔldcは、WC196株より、リジンデカルボキシラーゼをコードするcadA及びldcC遺伝子を破壊することにより構築した株である。WC196ΔcadAΔldc/pCABD2は、WC196ΔcadAΔldcに、リジン生合成系遺伝子を含むプラスミドpCABD2(米国特許第6,040,160号)を導入することにより構築した株である。WC196ΔcadAΔldcは、AJ110692と命名され、2008年10月7日、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(現、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センター、郵便番号:292-0818、住所:日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室)に受託番号FERM BP-11027として寄託された。pCABD2は、L−リジンによるフィードバック阻害が解除された変異を有するエシェリヒア・コリ由来のジヒドロジピコリン酸合成酵素(DDPS)をコードする変異型dapA遺伝子と、L−リジンによるフィードバック阻害が解除された変異を有するエシェリヒア・コリ由来のアスパルトキナーゼIIIをコードする変異型lysC遺伝子と、エシェリヒア・コリ由来のジヒドロジピコリン酸レダクターゼをコードするdapB遺伝子と、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをコードするddh遺伝子を含んでいる。

0150

また、L−リジン生産能を有するコリネ型細菌としては、例えば、AEC耐性変異株(Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium lactofermentum) AJ11082(NRRL B-11470)株など;特公昭56-1914号公報、特公昭56-1915号公報、特公昭57-14157号公報、特公昭57-14158号公報、特公昭57-30474号公報、特公昭58-10075号公報、特公昭59-4993号公報、特公昭61-35840号公報、特公昭62-24074号公報、特公昭62-36673号公報、特公平5-11958号公報、特公平7-112437号公報、特公平7-112438号公報参照);その生育にL−ホモセリン等のアミノ酸を必要とする変異株(特公昭48-28078号公報、特公昭56-6499号公報参照
);AECに耐性を示し、更にL−ロイシン、L−ホモセリン、L−プロリン、L−セリン、L−アルギニン、L−アラニン、L−バリン等のアミノ酸を要求する変異株(米国特許第3708395号及び第3825472号明細書参照);DL−α−アミノ−ε−カプロラクタム、α−アミノ−ラウリルラクタム、アスパラギン酸アナログ、スルファ剤、キノイド、N−ラウロイルロイシンに耐性を示す変異株;オキザロ酢酸デカルボキシラーゼ阻害剤または呼吸系酵素阻害剤に対する耐性を示す変異株(特開昭50-53588号公報、特開昭50-31093号公報、特開昭52-102498号公報、特開昭53-9394号公報、特開昭53-86089号公報、特開昭55-9783号公報、特開昭55-9759号公報、特開昭56-32995号公報、特開昭56-39778号公報、特公昭53-43591号公報、特公昭53-1833号公報);イノシトールまたは酢酸を要求する変異株(特開昭55-9784号公報、特開昭56-8692号公報);フルオロピルビン酸または34℃以上の温度に対して感受性を示す変異株(特開昭55-9783号公報、特開昭53-86090号公報);エチレングリコールに耐性を示す変異株(米国特許第4411997号明細書)が挙げられる。

0151

<L−アルギニン生産菌>
L−アルギニン生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、L−アルギニン生合成系酵素から選択される1またはそれ以上の酵素の活性が増大するように細菌を改変する方法が挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、N−アセチルグルタミン酸シンターゼ(argA)、N−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ(argC)、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ(argJ)、N−アセチルグルタミン酸キナーゼ(argB)、アセチルオルニチントランスアミナーゼ(argD)、アセチルオルニチンデアセチラーゼ(argE)オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ(argF)、アルギニノコハク酸シンターゼ(argG)、アルギニノコハク酸リアーゼ(argH)カルバモイルリン酸シンターゼ(carAB)が挙げられる。N−アセチルグルタミン酸シンターゼ(argA)遺伝子としては、例えば、野生型の15位〜19位に相当するアミノ酸残基が置換され、L−アルギニンによるフィードバック阻害が解除された変異型N−アセチルグルタミン酸シンターゼをコードする遺伝子を用いると好適である(欧州出願公開1170361号明細書)。

0152

L−アルギニン生産菌又はそれを誘導するための親株として、具体的には、例えば、E.
coli 237株 (VKPM B-7925) (米国特許出願公開2002/058315 A1)、変異型N−アセチルグルタメートシンターゼを保持するその誘導株 (ロシア特許出願第2001112869号)、237株由来の酢酸資化能が向上した株であるE. coli 382株 (VKPM B-7926) (EP1170358A1)、及びN−アセチルグルタメートシンテターゼをコードするargA遺伝子が導入されたE. coliアルギニン生産株(EP1170361A1) が挙げられる。E. coli 237株は、2000年4月10日にルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ (VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia) にVKPM B-7925の受託番号で寄託され、2001年5月18日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管された。E. coli 382株は、2000年4月10日にルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ (VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia) にVKPM B-7926の受託番号で寄託されている。

0153

また、L−アルギニン生産菌又はそれを誘導するための親株としては、アミノ酸アナログ等への耐性を有する株も挙げられる。そのような株としては、例えば、α−メチルメチオニン、p−フルオロフェニルアラニン、D−アルギニン、アルギニンヒドロキサム酸、S−(2−アミノエチル)−システイン、α−メチルセリン、β−2−チエニルアラニン、またはスルファグアニジンに耐性を有するエシェリヒア・コリ変異株(特開昭56-106598号公報参照)が挙げられる。

0154

また、L−アルギニン生産菌又はそれを誘導するための親株としては、アルギニンリプレッサーであるArgRを欠損した株(米国特許出願公開2002-0045223号)や細胞内のグルタミンシンテターゼ活性を上昇させた株(米国特許出願公開2005-0014236号公報)等のコリ
ネ型細菌も挙げられる。

0155

また、L−アルギニン生産菌又はそれを誘導するための親株としては、アミノ酸アナログなどへの耐性を有するコリネ型細菌の変異株も挙げられる。そのような株としては、例えば、2−チアゾールアラニン耐性に加えて、L−ヒスチジン、L−プロリン、L−スレオニン、L−イソロイシン、L−メチオニン、またはL−トリプトファン要求性を有する株(特開昭54-44096号公報);ケトマロン酸、フルオロマロン酸、又はモノフルオロ酢酸に耐性を有する株(特開昭57-18989号公報);アルギニノールに耐性を有する株(特公昭62-24075号公報);X−グアニジン(Xは脂肪酸又は脂肪鎖の誘導体)に耐性を有する株(特開平2-186995号公報);アルギニンヒドロキサメート及び6−アザウラシルに耐性を有する株(特開昭57-150381号公報)が挙げられる。L−アルギニン生産能を有するコリネ型細菌の具体例としては、下記のような菌株が挙げられる。
Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) AJ11169(FERM BP-6892)
Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium lactofermentum) AJ12092(FERM BP-6906)
Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) AJ11336(FERM BP-6893)
Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) AJ11345(FERM BP-6894)
Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium lactofermentum) AJ12430(FERM BP-2228)

0156

<L−シトルリン生産菌およびL−オルニチン生産菌>
L−シトルリンおよびL−オルニチンは、L−アルギニンと生合成経路が共通している。よって、N−アセチルグルタミン酸シンターゼ(argA)、N−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ(argC)、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ(argJ)、N-アセチルグルタミン酸キナーゼ(argB)、アセチルオルニチントランスアミナーゼ(argD)、および/またはアセチルオルニチンデアセチラーゼ(argE)の酵素活性を上昇させることによって、L−シトルリンおよび/またはL−オルニチンの生産能を付与または増強することができる(国際公開2006-35831号パンフレット)。

0157

<L−ヒスチジン生産菌>
L−ヒスチジン生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、L−ヒスチジン生合成系酵素から選択される1またはそれ以上の酵素の活性が増大するように細菌を改変する方法が挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、ATPホスホリボシルトランスフェラーゼ(hisG)、ホスホリボシルAMPサイクロヒドロラーゼ(hisI)、ホスホリボシル−ATPピロホスホヒドロラーゼ(hisI)、ホスホリボシルフォルミミノ−5−アミノイミダゾールカルボキサミドリボタイイソメラーゼ(hisA)、アミドトランスフェラーゼ(hisH)、ヒスチジノールフォスフェイトアミノトランスフェラーゼ(hisC)、ヒスチジノールフォスファターゼ(hisB)、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ(hisD)が挙げられる。

0158

これらの内、hisG及びhisBHAFIにコードされるL−ヒスチジン生合成系酵素は、L−ヒスチジンにより阻害されることが知られている。従って、L−ヒスチジン生産能は、例えば、ATPホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子(hisG)にフィードバック阻害への耐性を付与する変異を導入することにより、付与または増強させることができる(ロシア特許第2003677号及び第2119536号)。

0159

L−ヒスチジン生産菌又はそれを誘導するための親株として、具体的には、例えば、E.
coli 24株 (VKPM B-5945, RU2003677)、E. coli 80株 (VKPM B-7270, RU2119536)、E. coli NRRL B-12116〜B-12121 (米国特許第4,388,405号)、E. coli H-9342 (FERM BP-6675)及びH-9343 (FERM BP-6676) (米国特許第6,344,347号)、E. coli H-9341 (FERM BP-6674)
(EP1085087)、E. coliAI80/pFM201 (米国特許第6,258,554号)、L−ヒスチジン生合成系酵素をコードするDNAを保持するベクターを導入したE. coli FERM-P 5038及び5048 (特開昭56-005099号)、アミノ酸輸送の遺伝子を導入したE. coli株(EP1016710A)、スルファグアニジン、DL−1,2,4−トリアゾール−3−アラニン、及びストレプトマイシンに対する耐性を付与したE. coli 80株(VKPM B-7270,ロシア特許第2119536号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられる。

0160

<L−システイン生産菌
L−システイン生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、L−システイン生合成系酵素から選択される1またはそれ以上の酵素の活性が増大するように細菌を改変する方法が挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、セリンアセチルトランスフェラーゼや3−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼが挙げられる。セリンアセチルトランスフェラーゼ活性は、例えば、システインによるフィードバック阻害に耐性の変異型セリンアセチルトランスフェラーゼをコードする変異型cysE遺伝子を細菌に導入することにより増強できる。変異型セリンアセチルトランスフェラーゼは、例えば、特開平11-155571や米国特許公開第20050112731に開示されている。また、3−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ活性は、例えば、セリンによるフィードバック阻害に耐性の変異型3−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼをコードする変異型serA遺伝子を細菌に導入することにより増強できる。変異型3−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼは、例えば、米国特許第6,180,373号に開示されている。

0161

また、L−システイン生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、L−システインの生合成経路から分岐してL−システイン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素から選択される1またはそれ以上の酵素の活性が低下するように細菌を改変する方法も挙げられる。そのような酵素としては、例えば、L−システインの分解に関与する酵素が挙げられる。L−システインの分解に関与する酵素としては、特に制限されないが、シスタチオニン−β−リアーゼ(metC)(特開平11-155571号、Chandra et. al., Biochemistry, 21 (1982) 3064-3069))、トリプトファナーゼ(tnaA)(特開2003-169668、Austin Newton et. al., J. Biol. Chem. 240 (1965) 1211-1218)、O−アセチルセリンスルフヒドリラーゼB(cysM)(特開2005-245311)、malY遺伝子産物(特開2005-245311)、Pantoea ananatisのd0191遺伝子産物(特開2009-232844)、システインデスルフヒドラーゼ(aecD)(特開2002-233384)が挙げられる。

0162

また、L−システイン生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、L−システイン排出系を増強することや硫酸塩/チオ硫酸塩輸送系を増強することも挙げられる。L−システイン排出系のタンパク質としては、ydeD遺伝子にコードされるタンパク質(特開2002-233384)、yfiK遺伝子にコードされるタンパク質(特開2004-49237)、emrAB、emrKY、yojIH、acrEF、bcr、およびcusAの各遺伝子にコードされる各タンパク質(特開2005-287333)、yeaS遺伝子にコードされるタンパク質(特開2010-187552)が挙げられる。硫酸塩/チオ硫酸塩輸送系のタンパク質としては、cysPTWAM遺伝子クラスターにコードされるタンパク質が挙げられる。

0163

L−システイン生産菌又はそれを誘導するための親株として、具体的には、例えば、フィードバック阻害耐性の変異型セリンアセチルトランスフェラーゼをコードする種々のcysEアレル形質転換されたE. coli JM15 (米国特許第6,218,168号、ロシア特許出願第2003121601号)、細胞に毒性の物質を排出するのに適したタンパク質をコードする過剰発現遺伝子を有するE. coli W3110 (米国特許第5,972,663号)、システインデスルフヒドラーゼ活性が低下したE. coli株 (JP11155571A2)、cysB遺伝子によりコードされる正のシステインレギュロン転写制御因子の活性が上昇したE. coli W3110 (WO01/27307A1)が挙げられる。

0164

また、L−システイン生産能を有するコリネ型細菌としては、例えば、L−システインによるフィードバック阻害が低減されたセリンアセチルトランスフェラーゼを保持することにより、細胞内のセリンアセチルトランスフェラーゼ活性が上昇したコリネ型細菌(特開2002-233384)が挙げられる。

0165

<L−メチオニン生産菌>
L−メチオニン生産菌又はそれを誘導するための親株としては、L−スレオニン要求株や、ノルロイシンに耐性を有する変異株が挙げられる(特開2000-139471)。また、L−メチオニン生産菌又はそれを誘導するための親株としては、L−メチオニンによるフィードバック阻害に対して耐性をもつ変異型ホモセリントランスサクシニラーゼを保持する株も挙げられる(特開2000-139471、US20090029424)。なお、L−メチオニンはL−システインを中間体として生合成されるため、L−システインの生産能の向上によりL−メチオニンの生産能も向上させることができる(特開2000-139471、US20080311632)。

0166

L−メチオニン生産菌又はそれを誘導するための親株として、具体的には、例えば、E.
coli AJ11539 (NRRL B-12399)、E. coli AJ11540 (NRRL B-12400)、E. coli AJ11541 (NRRL B-12401)、E. coli AJ11542 (NRRL B-12402) (英国特許第2075055号)、L−メチオニンのアナログであるノルロイシン耐性を有するE. coli 218株 (VKPM B-8125)(ロシア特許第2209248号)や73株 (VKPM B-8126) (ロシア特許第2215782号)、E. coli AJ13425 (FERM P-16808)(特開2000-139471)が挙げられる。AJ13425株は、メチオニンリプレッサーを欠損し、細胞内のS−アデノシルメチオニンシンセターゼ活性が弱化し、細胞内のホモセリントランスサクシニラーゼ活性、シスタチオニンγ−シンターゼ活性、及びアスパルトキナーゼ−ホモセリンデヒドロゲナーゼII活性が増強された、E. coli W3110由来のL−スレオニン要求株である。

0167

<L−ロイシン生産菌>
L−ロイシン生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、L−ロイシン生合成系酵素から選択される1またはそれ以上の酵素の活性が増大するように細菌を改変する方法が挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、leuABCDオペロンの遺伝子にコードされる酵素が挙げられる。また、酵素活性の増強には、例えば、L−ロイシンによるフィードバック阻害が解除されたイソプロピルマレートシンターゼをコードする変異leuA遺伝子(米国特許第6,403,342号)が好適に利用できる。

0168

L−ロイシン生産菌又はそれを誘導するための親株として、具体的には、例えば、ロイシン耐性のE. coli株 (例えば、57株 (VKPM B-7386, 米国特許第6,124,121号))、β−2−チエニルアラニン、3−ヒドロキシロイシン、4−アザロイシン、5,5,5−トリフルオロロイシンなどのロイシンアナログ耐性のE. coli株(特公昭62-34397号及び特開平8-70879号)、WO96/06926に記載された遺伝子工学的方法で得られたE. coli株、E. coli H-9068 (特開平8-70879号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられる。

0169

L−ロイシン生産能を有するコリネ型細菌としては、例えば、2−チアゾールアラニン及びβ−ハイドロキシロイシンに耐性で、且つイソロイシン及びメチオニン要求性である、Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium lactofermentum) AJ3718(FERM P-2516)が挙げられる。

0170

<L−イソロイシン生産菌>
L−イソロイシン生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、L−イソロイシン生合成系酵素から選択される1またはそれ以上の酵素の活性が増大するように細菌を改変する方法が挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、スレオ
デアミナーゼやアセトヒドロキシ酸シンターゼが挙げられる(特開平2-458号, FR 0356739, 及び米国特許第5,998,178号)。

0171

L−イソロイシン生産菌又はそれを誘導するための親株としては、例えば、6−ジメチルアミノプリンに耐性を有する変異株(特開平5-304969号)、チアイソロイシン、イソロイシンヒドロキサメートなどのイソロイシンアナログに耐性を有する変異株、イソロイシンアナログに加えてDL−エチオニン及び/またはアルギニンヒドロキサメートに耐性を有する変異株(特開平5-130882号)等のエシェリヒア属細菌が挙げられる。

0172

L−イソロイシン生産能を有するコリネ型細菌としては、例えば、分岐鎖アミノ酸排出タンパク質をコードするbrnE遺伝子を増幅したコリネ型細菌(特開2001-169788)、L−リジン生産菌とのプロトプラスト融合によりL−イソロイシン生産能を付与したコリネ型細菌(特開昭62-74293)、ホモセリンデヒドロゲナーゼを強化したコリネ型細菌(特開昭62-91193)、スレオニンハイドロサメート耐性株(特開昭62-195293)、α-ケトマロン耐性株(特開昭61-15695)、メチルリジン耐性株(特開昭61-15696)、Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) AJ12149(FERM BP-759)(米国特許第4,656,135号)が挙げられる。

0173

<L−バリン生産菌>
L−バリン生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、L−バリン生合成系酵素から選択される1またはそれ以上の酵素の活性が増大するように細菌を改変する方法が挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、ilvGMEDAオペロンやilvBNCオペロンの遺伝子にコードされる酵素が挙げられる。ilvBNはアセトヒドロキシ酸シンターゼを、ilvCはイソメロリダクターゼ(国際公開00/50624号)を、それぞれコードする。なお、ilvGMEDAオペロンおよびilvBNCオペロンは、L−バリン、L−イソロイシン、および/またはL−ロイシンによる発現抑制(アテニュエーション)を受ける。よって、酵素活性の増強のためには、アテニュエーションに必要な領域を除去または改変し、生成するL−バリンによる発現抑制を解除するのが好ましい。また、ilvA遺伝子がコードするスレオニンデアミナーゼは、L−イソロイシン生合成系の律速段階であるL−スレオニンから2−ケト酪酸への脱アミノ化反応を触媒する酵素である。よって、L−バリン生産のためには、ilvA遺伝子が破壊等され、スレオニンデアミナーゼ活性が減少しているのが好ましい。

0174

また、L−バリン生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、L−バリンの生合成経路から分岐してL−バリン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素から選択される1またはそれ以上の酵素の活性が低下するように細菌を改変する方法も挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、L−ロイシン合成に関与するスレオニンデヒドラターゼやD−パントテン酸合成に関与する酵素が挙げられる(国際公開00/50624号)。

0175

L−バリン生産菌又はそれを誘導するための親株として、具体的には、例えば、ilvGMEDAオペロンを過剰発現するように改変されたE. coli株(米国特許第5,998,178号) が挙げられる。

0176

また、L−バリン生産菌又はそれを誘導するための親株としては、アミノアシルt-RNAシンテターゼに変異を有する株(米国特許第5,658,766号)も挙げられる。そのような株としては、例えば、イソロイシンtRNAシンテターゼをコードするileS遺伝子に変異を有するE. coli VL1970が挙げられる。E. coli VL1970は、1988年6月24日、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ (VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia)に、受託番号VKPM B-4411で寄託されている。
また、L−バリン生産菌又はそれを誘導するための親株としては、生育にリポ酸を要求する、および/または、H+-ATPaseを欠失している変異株(WO96/06926)も挙げられる。

0177

また、L−バリン生産菌又はそれを誘導するための親株としては、アミノ酸アナログなどへの耐性を有する株も挙げられる。そのような株としては、例えば、L−イソロイシンおよびL−メチオニン要求性、ならびにD−リボース、プリンリボヌクレオシド、またはピリミジンリボヌクレオシドに耐性を有し、且つL−バリン生産能を有するコリネ型細菌株(FERM P-1841、FERM P-29、特公昭53-025034)、ポリケトイド類に耐性を有するコリネ型細菌株(FERM P-1763、FERM P-1764、特公平06-065314)、酢酸を唯一の炭素源とする培地でL−バリン耐性を示し、且つグルコースを唯一の炭素源とする培地でピルビン酸アナログ(フルオロピルビン酸等)に感受性を有するコリネ型細菌株(FERM BP-3006、FERM
BP-3007、特許3006929号)が挙げられる。

0178

<L−アラニン生産菌>
L−アラニン生産菌又はそれを誘導するための親株としては、H+-ATPaseを欠失しているコリネ型細菌(Appl Microbiol Biotechnol. 2001 Nov;57(4):534-40)やアスパラギン酸β−デカルボキシラーゼ活性が増強されたコリネ型細菌(特開平07-163383)が挙げられる。

0179

<L−トリプトファン生産菌、L−フェニルアラニン生産菌、L−チロシン生産菌>
L−トリプトファン生産能、L−フェニルアラニン生産能、および/またはL−チロシン生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、L−トリプトファン、L−フェニルアラニン、および/またはL−チロシンの生合成系酵素から選択される1またはそれ以上の酵素の活性が増大するように細菌を改変する方法が挙げられる。

0180

これらの芳香族アミノ酸に共通する生合成系酵素としては、特に制限されないが、3−デオキシ−D−アラビノヘプツロン酸−7−リン酸シンターゼ(aroG)、3−デヒドロキネートシンターゼ(aroB)、シキミ酸デヒドロゲナーゼ(aroE)、シキミ酸キナーゼ(aroL)、5−エノール酸ピルビルシキミ酸3−リン酸シンターゼ(aroA)、コリスミ酸シンターゼ(aroC)が挙げられる(欧州特許763127号)。これらの酵素をコードする遺伝子の発現はチロシンリプレッサー(tyrR)によって制御されており、tyrR遺伝子を欠損させることによって、これらの酵素の活性を増強してもよい(欧州特許763127号)。

0181

L−トリプトファン生合成系酵素としては、特に制限されないが、アントラニル酸シンターゼ(trpE)、トリプトファンシンターゼ(trpAB)、及びホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ(serA)が挙げられる。例えば、トリプトファンオペロンを含むDNAを導入することにより、L−トリプトファン生産能を付与又は増強できる。トリプトファンシンターゼは、それぞれtrpA及びtrpB遺伝子によりコードされるα及びβサブユニットからなる。アントラニル酸シンターゼはL−トリプトファンによるフィードバック阻害を受けるので、同酵素の活性を増強するには、フィードバック阻害を解除する変異を導入した同酵素をコードする遺伝子を利用してもよい。ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼはL−セリンによるフィードバック阻害を受けるので、同酵素の活性を増強するには、フィードバック阻害を解除する変異を導入した同酵素をコードする遺伝子を利用してもよい。さらに、マレートシンターゼ(aceB)、イソクエン酸リアーゼ(aceA)、およびイソクエン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ/フォスファターゼ(aceK)からなるオペロン(aceオペロン)の発現を増大させることによりL−トリプトファン生産能を付与または増強してもよい(WO2005/103275)。

0182

L−フェニルアラニン生合成系酵素としては、特に制限されないが、コリスミ酸ムターゼ及びプレフェン酸デヒドラターゼが挙げられる。コリスミ酸ムターゼ及びプレフェン酸
デヒドラターゼは、2機能酵素としてpheA遺伝子によってコードされている。コリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドラターゼはL−フェニルアラニンによるフィードバック阻害を受けるので、同酵素の活性を増強するには、フィードバック阻害を解除する変異を導入した同酵素をコードする遺伝子を利用してもよい。

0183

L−チロシン生合成系酵素としては、特に制限されないが、コリスミ酸ムターゼ及びプレフェン酸デヒドロゲナーゼが挙げられる。コリスミ酸ムターゼ及びプレフェン酸デヒドロゲナーゼは、2機能酵素としてtyrA遺伝子によってコードされている。コリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドロゲナーゼはL−チロシンによるフィードバック阻害を受けるので、同酵素の活性を増強するには、フィードバック阻害を解除する変異を導入した同酵素をコードする遺伝子を利用してもよい。

0184

L−トリプトファン、L−フェニルアラニン、および/またはL−チロシンの生産菌は、目的の芳香族アミノ酸以外の芳香族アミノ酸の生合成が低下するように改変されていてもよい。また、L−トリプトファン、L−フェニルアラニン、および/またはL−チロシンの生産菌は、副生物取り込み系が増強されるように改変されていてもよい。副生物としては、目的の芳香族アミノ酸以外の芳香族アミノ酸が挙げられる。副生物の取り込み系をコードする遺伝子としては、例えば、L−トリプトファンの取り込み系をコードする遺伝子であるtnaBやmtr、L−フェニルアラニンの取り込み系をコードする遺伝子であるpheP、L−チロシンの取り込み系をコードする遺伝子であるtyrPが挙げられる(EP1484410)。

0185

L−トリプトファン生産菌又はそれを誘導するための親株として、具体的には、例えば、部分的に不活化されたトリプトファニル-tRNAシンテターゼをコードする変異型trpS遺伝子を保持するE. coli JP4735/pMU3028 (DSM10122)及びJP6015/pMU91 (DSM10123) (米国特許第5,756,345号)、トリプトファンによるフィードバック阻害を受けないアントラニル酸シンターゼをコードするtrpEアレルを有するE. coliSV164、セリンによるフィードバック阻害を受けないホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼをコードするserAアレル及びトリプトファンによるフィードバック阻害を受けないアントラニル酸シンターゼをコードするtrpEアレルを有するE. coli SV164 (pGH5) (米国特許第6,180,373号)、トリプトファンによるフィードバック阻害を受けないアントラニル酸シンターゼをコードするtrpEアレルを含むトリプトファンオペロンが導入された株 (特開昭57-71397号, 特開昭62-244382号,
米国特許第4,371,614号)、トリプトファナーゼが欠損したE. coli AGX17 (pGX44) (NRRL
B-12263)及びAGX6(pGX50)aroP (NRRL B-12264) (米国特許第4,371,614号)、ホスホエノールピルビン酸生産能が増大したE. coli AGX17/pGX50,pACKG4-pps (WO9708333, 米国特許第6,319,696号)、yedA遺伝子またはyddG遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増大したエシェリヒア属に属する株 (米国特許出願公開2003/0148473 A1及び2003/0157667 A1) が挙げられる。

0186

L−トリプトファン生産能を有するコリネ型細菌としては、例えば、サルファグアニジンに耐性のCorynebacterium glutamicum AJ12118(FERM BP-478 特許01681002号)、トリプトファンオペロンが導入された株(特開昭63240794号公報)、コリネ型細菌由来のシキミ酸キナーゼをコードする遺伝子が導入された株(特開01994749号公報)が挙げられる。

0187

L−フェニルアラニン生産菌又はそれを誘導するための親株として、具体的には、例えば、コリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドロゲナーゼ及びチロシンリプレッサーを欠損したE. coli AJ12739 (tyrA::Tn10, tyrR) (VKPM B-8197)(WO03/044191)、フィードバック阻害が解除されたコリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドラターゼをコードする変異型pheA34遺伝子を保持するE. coli HW1089 (ATCC55371) (米国特許第 5,354,672号)、E. coli MWEC101-b (KR8903681)、E. coli NRRL B-12141、NRRL B-12145、NRRL B-12146
、NRRL B-12147 (米国特許第4,407,952号)が挙げられる。また、L−フェニルアラニン生産菌又はそれを誘導するための親株として、具体的には、例えば、フィードバック阻害が解除されたコリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドラターゼをコードする遺伝子を保持するE. coli K-12 <W3110 (tyrA)/pPHAB> (FERM BP-3566)、E. coli K-12 <W3110 (tyrA)/pPHAD> (FERM BP-12659)、E. coli K-12 <W3110 (tyrA)/pPHATerm> (FERM BP-12662)、E. coli K-12 AJ 12604 <W3110 (tyrA)/pBR-aroG4, pACMAB> (FERM BP-3579)も挙げられる(EP 488424 B1)。また、L−フェニルアラニン生産菌又はそれを誘導するための親株として、具体的には、例えば、yedA遺伝子またはyddG遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増大したエシェリヒア属に属する株も挙げられる(US2003/0148473、US2003/0157667、WO03/044192)。

0188

L−フェニルアラニン生産能を有するコリネ型細菌としては、例えば、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼまたはピルビン酸キナーゼ活性が低下したCorynebacterium glutamicum BPS-13株 (FERM BP-1777)、Corynebacterium glutamicum K77 (FERM BP-2062)、Corynebacterium glutamicum K78 (FERM BP-2063)(欧州特許公開公報331145号、特開平 02-303495号)、チロシン要求性株(特開平05-049489)が挙げられる。

0189

L−チロシン生産能を有するコリネ型細菌としては、例えば、Corynebacterium glutamicum AJ11655 (FERM P-5836)(特公平2-6517)、Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium lactofermentum) AJ12081 (FERM P-7249)(特開昭60-70093)が挙げられる。

0190

また、L−アミノ酸生産能を付与または増強する方法としては、例えば、細菌の細胞からL−アミノ酸を排出する活性が増大するように細菌を改変する方法が挙げられる。L−アミノ酸を排出する活性は、例えば、L−アミノ酸を排出するタンパク質をコードする遺伝子の発現を上昇させることにより、増大させることができる。各種アミノ酸を排出するタンパク質をコードする遺伝子としては、例えば、b2682遺伝子(ygaZ)、b2683遺伝子(ygaH)、b1242遺伝子(ychE)、b3434遺伝子(yhgN)が挙げられる(特開2002-300874号公報)。

0191

また、L−アミノ酸生産能を付与または増強する方法としては、例えば、糖代謝に関与するタンパク質やエネルギー代謝に関与するタンパク質の活性が増大するように細菌を改変する方法が挙げられる。

0192

糖代謝に関与するタンパク質としては、糖の取り込みに関与するタンパク質や解糖系酵素が挙げられる。糖代謝に関与するタンパク質をコードする遺伝子としては、グルコース6−リン酸イソメラーゼ遺伝子(pgi;国際公開第01/02542号パンフレット)、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ遺伝子(pps;欧州出願公開877090号明細書)、ホスホエノ−ルピルビン酸カルボキシラ−ゼ遺伝子(ppc;国際公開95/06114号パンフレット)、ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子(pyc;国際公開99/18228号パンフレット、欧州出願公開1092776号明細書)、ホスホグルコムターゼ遺伝子(pgm;国際公開03/04598号パンフレット)、フルクトース二リン酸アルドラーゼ遺伝子(pfkB, fbp;国際公開03/04664号パンフレット)、ピルビン酸キナーゼ遺伝子(pykF;国際公開03/008609号パンフレット)、トランスアルドラーゼ遺伝子(talB;国際公開03/008611号パンフレット)、フマラーゼ遺伝子(fum;国際公開01/02545号パンフレット)、non-PTSスクロース取り込み遺伝子(csc;欧州出願公開149911号パンフレット)、スクロース資化性遺伝子(scrABオペロン;国際公開第90/04636号パンフレット)が挙げられる。

0193

エネルギー代謝に関与するタンパク質をコードする遺伝子としては、トランスヒドロゲナーゼ遺伝子(pntAB;米国特許 5,830,716号明細書)、チトクロムbo型オキシダーゼ(cytochromoe bo type oxidase)遺伝子(cyoB;欧州特許出願公開1070376号明細書)が挙げ
られる。

0194

また、本発明の細菌は、例えば、脂肪酸資化能が高まるように改変されていてもよい。そのような改変としては、fadR遺伝子の発現を弱化すること、fadL、fadE、fadD、fadB、及びfadA遺伝子からなる群より選択される1またはそれ以上の遺伝子の発現を増強すること、cyoABCDEオペロンの発現を増強すること、およびそれらの組み合わせが挙げられる(特開2011-167071)。

0195

fadR遺伝子は、fadレギュロンの負の転写因子をコードする(DiRusso, C. C. et al. 1992. J. Biol. Chem. 267: 8685-8691; DiRusso, C. C. et al. 1993. Mol. Microbiol. 7: 311-322)。fadレギュロンには、fadL、fadE、fadD、fadB、及びfadA遺伝子が含まれ、これらの遺伝子は脂肪酸代謝に関与するタンパク質をコードする。fadR遺伝子およびfadレギュロンは、例えば、腸内細菌科に属する細菌に見出される。エシェリヒア・コリK12
MG1655株のfadR遺伝子は、同株のゲノム配列(GenBankaccession No.NC_000913)における1234161〜1234880位の配列に相当する。エシェリヒア・コリK12 MG1655株のFadRタンパク質は、GenBank accession No. NP_415705で登録されている。

0196

fadL遺伝子は、長鎖脂肪酸の取り込み能を有する外膜トランスポーターをコードする(Kumar, G. B. and Black, P. N. 1993. J. Biol. Chem. 268: 15469-15476; Stenberg,
F. et al. 2005. J. Biol. Chem. 280: 34409-34419)。エシェリヒア・コリK12 MG1655株のfadL遺伝子は、同株のゲノム配列(GenBankaccession No.NC_000913)における2459328〜2460668位の配列に相当する。エシェリヒア・コリK12 MG1655株のFadLタンパク質は、GenBank accession No. NP_416846で登録されている。

0197

fadD遺伝子は、長鎖脂肪酸から脂肪酸アシルCoA(fatty acyl-CoA)を生成する反応を触媒するとともに(脂肪酸アシルCoA合成酵素(fatty acyl-CoA synthetase)活性)、内膜を通して取り込むタンパク質をコードする(Dirusso, C. C. and Black, P. N. 2004. J. Biol. Chem. 279: 49563-49566; Schmelter, T. et al. 2004. J. Biol. Chem.
279: 24163-24170)。エシェリヒア・コリK12 MG1655株のfadD遺伝子は、同株のゲノム配列(GenBankaccession No.NC_000913)における1886085〜1887770位の配列の相補配列に相当する。エシェリヒア・コリK12 MG1655株のFadDタンパク質は、GenBank accession No. NP_416319で登録されている。

0198

fadE遺伝子は、脂肪酸アシルCoAを酸化する反応を触媒するアシルCoAデヒドロゲナーゼ(acyl-CoA dehydrogenase)活性を有するタンパク質をコードする(O'Brien, W. J. and Frerman, F. E. 1977. J. Bacteriol. 132: 532-540; Campbell, J. W. and Cronan, J. E. 2002. J. Bacteriol. 184: 3759-3764)。エシェリヒア・コリK12 MG1655株のfadE遺伝子は、同株のゲノム配列(GenBankaccession No.NC_000913)における240859〜243303位の配列の相補配列に相当する。エシェリヒア・コリK12 MG1655株のFadEタンパク質は、GenBank accession No. NP_414756で登録されている。

0199

fadB遺伝子は、脂肪酸酸化複合体(fatty acid oxidation complex)のαサブユニットをコードする。αサブユニットは、エノイルCoAヒドラターゼ(enoyl-CoA hydratase)、3−ヒドロキシアシルCoAデヒドロゲナーゼ(3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase)、3−ヒドロキシアシルCoAエピメラーゼ(3-hydroxyacyl-CoA epimerase)、Δ3−シス−Δ2−トランス−エノイルCoAイソメラーゼ(Δ3-cis-Δ2-trans-enoyl-CoA isomerase)の4つの活性を有する(Pramanik, A. et al. 1979. J. Bacteriol. 137: 469-473; Yang, S. Y. and Schulz, H. 1983. J. Biol. Chem. 258: 9780-9785)。エシェリヒア・コリK12 MG1655株のfadB遺伝子は、同株のゲノム配列(GenBankaccession No.NC_000913)における4026805〜4028994位の配列の相補配列に相当する。エシェリヒア・
コリK12 MG1655株のFadBタンパク質は、GenBank accession No. NP_418288で登録されている。

0200

fadA遺伝子は、脂肪酸酸化複合体(fatty acid oxidation complex)のβサブユニットをコードする。βサブユニットは、3−ケトアシルCoAチオラーゼ(3-ketoacyl-CoAthiolase)活性を有する(Pramanik, A. et al. 1979. J. Bacteriol. 137: 469-473)。エシェリヒア・コリK12 MG1655株のfadA遺伝子は、同株のゲノム配列(GenBankaccession No.NC_000913)における4025632〜4026795位の配列の相補配列に相当する。エシェリヒア・コリK12 MG1655株のFadAタンパク質は、GenBank accession No. YP_026272で登録されている。

0201

fadAおよびfadB遺伝子は、fadBAオペロンを形成している(Yang, S. Y. et al. 1990. J. Biol. Chem. 265: 10424-10429)。よって、例えば、fadBAオペロン全体の発現を増強してもよい。

0202

cyoABCDEオペロン(cyoオペロン)は、末端酸化酵素の一つであるシトクロムbo型酸酵素複合体(cytochrome bo terminal oxidase complex)をコードする。具体的には、cyoB遺伝子がサブユニットIを、cyoA遺伝子がサブユニットIIを、cyoC遺伝子がサブユニットIIIを、cyoC遺伝子がサブユニットIVを、cyoE遺伝子がヘムOシンターゼ(heme O synthase)活性を有するタンパク質をコードする(Gennis, R. B. and Stewart, V. 1996. p.
217-261. In F. D.Neidhardt (ed.), Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology/Second Edition, American Society for Microbiology Press, Washington, D.C; Chepuri et al. 1990. J. Biol. Chem. 265: 11185-11192)。cyoオペロンは、例えば、腸内細菌科に属する細菌に見出される。エシェリヒア・コリK12 MG1655株のcyoABCDE遺伝子は、それぞれ、同株のゲノム配列(GenBankaccession No.NC_000913)における449887〜450834、447874〜449865、447270〜447884、446941〜447270、446039〜446929位の配列の相補配列に相当する。エシェリヒア・コリK12 MG1655株のCyoABCDEタンパク質は、それぞれ、GenBank accession No. NP_414966、NP_414965、NP_414964、NP_414963、NP_414962で登録されている。

0203

なお、細菌の育種に使用される遺伝子は、元の機能が維持されたタンパク質をコードする限り、上記例示した遺伝子や公知の塩基配列を有する遺伝子に限られず、そのバリアントであってもよい。バリアントは、例えば、上記例示した遺伝子や公知の塩基配列を有する遺伝子のホモログや人為的な改変体であってよい。

0204

例えば、使用される遺伝子は、元の機能が維持されたタンパク質をコードする限りにおいて、公知のタンパク質のアミノ酸配列において、1若しくは数個の位置での1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。この場合、タンパク質の機能は、1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加される前のタンパク質に対して、通常70%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上が維持され得る。なお上記「1又は数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、具体的には、1〜50個、1〜40個、1〜30個、好ましくは1〜20個、より好ましくは1〜10個、さらに好ましくは1〜5個、特に好ましくは1〜3個を意味する。

0205

上記の1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加は、タンパク質の機能が正常に維持される保存的変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。保存的置換とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミ
ノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、遺伝子が由来する生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異(mutant又はvariant)によって生じるものも含まれる。

0206

さらに、上記のような保存的変異を有する遺伝子は、公知のタンパク質のアミノ酸配列全体に対して、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有し、かつ、元の機能が維持されたタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。尚、本明細書において、「相同性」(homology)は、「同一性」(identity)を指すことがある。

0207

また、使用される遺伝子は、公知の遺伝子配列から調製され得るプローブ、例えば公知の遺伝子配列の全体または一部に対する相補配列、とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、元の機能が維持されたタンパク質をコードするDNAであってもよい。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いDNA同士、例えば80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有するDNA同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いDNA同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60℃、1×SSC、0.1% SDS、好ましくは60℃、0.1×SSC、0.1% SDS、より好ましくは、68℃、0.1×SSC、0.1% SDSに相当する塩濃度および温度で、1回、好ましくは2〜3回洗浄する条件を挙げることができる。


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