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技術 オリーブからの液体植物複合体の抗炎症使用

出願人 ファットリーアラビアッラディジャンニ,アントーニオエバンディーノロフランコ-ソチエタアグリーコラセンプリチ
発明者 ジャンニロフランコアドリアーナアルビーニマッシモピッツィチーニテレーザロッシアントニーノブルーノアリアンナパガーニ
出願日 2014年10月31日 (6年1ヶ月経過) 出願番号 2016-551095
公開日 2016年12月22日 (4年0ヶ月経過) 公開番号 2016-540037
状態 特許登録済
技術分野 医薬品製剤 他の有機化合物及び無機化合物含有医薬 食品の着色及び栄養改善 化合物または医薬の治療活性 非環式または炭素環式化合物含有医薬 植物物質含有医薬
主要キーワード 塩化ナトリウム分 酸化アルミニウムセラミック 管状形状 窒素含有物質 管区画 多孔性フィルター 植物水 移動能力
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2016年12月22日)のものです。
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図面 (12)

課題・解決手段

本発明は、オイル保有オリーブ圧縮に起因する水(通常、植物水として知られている)、又はオリーブ製粉工程に起因する残留オリーブ搾りかす由来ポリフェノール化合物に富んでいる、特にヒドロキシチロソース及び3,4−DHPA−EDAに富んでいる天然植物複合体血管新生及び/又は炎症の予防及び治療への使用に関する。特に、参照される血管新生及び炎症は、例えば腫瘍の進行及び広がり、又は非腫瘍病理に結び付けられる血管新生及び炎症を維持する病理型のものである。本発明はさらに、ポリフェノール濃縮物を含む飲料、及び血管新生及び炎症の治療及び予防へのその使用に関する。

概要

背景

血管新生は、個人成長及び発育の段階で起こる生理的工程であり、そしてそれは、既存の血管区画のものからの新しい血管の形成を包含する。血管新生は、種々の病理学現象、例えば腫瘍特徴づける工程である。

腫瘍(又は新生物塊状物は、約1−2mm3の大きさまで、自律的に成長し、そして発育するが、しかしながら、さらに成長するためには、それ自体に栄養分及び酸素の不可欠な供給を確保すべきであり、そして従って、それ自体の血管区画を創造する必要がある。

腫瘍は、血管新生因子、例えばVEGF(血管内皮増殖因子)、bFGF(塩基性線維芽細胞増殖因子)及びPDGF(血小板由来増殖因子)を分泌することができ、それらは、血管の発達を促進することができる。腫瘍により分泌される血管新生因子は、内皮細胞活性化し、それに応答して、周囲の組織に移動し、そして侵入するために、細胞マトリックス及び基底膜(例えば、マトリックスメタロプロテアーゼ−MMP)を分解する物質を増殖し、そして分泌し始める。続いて、内皮細胞は、周皮細胞、すなわち新しく形成された血管を取り囲み、そして血流を変更でき、そして血管透過性を調節できる収縮性細胞の存在により安定化される管状構造を形成するよう組織化する。腫瘍由来の血管は、不規則であり、そして「正常」血管とそれらとを区別する構造要素により特徴づけられる。例えば、それらは周皮細胞の不在、大きな卵円窓及び顕著な血管拡張により特徴づけられる。それらの特徴は、血管の透過性及び圧力レベルを変更し、そして従ってまた、抗腫瘍薬剤送達を妨げ、薬剤は腫瘍に達する代わりに、間質液中に分散され、そして従って、それらの機能を実行することができない。

腫瘍の発生、成長及び転移の工程における血管新生の重要性を考慮して、多くの研究が、腫瘍血管の不規則的発生を阻止でき、そして従って、腫瘍部位への薬剤の送達を改善できる物質を同定する目的で行われて来た。特に、大きな努力が、血管の異常発生を防止することができる分子を同定するために行われており;これは、「血管予防(angioprevention)」(すなわち、腫瘍関連血管新生の予防)の概念の策走を導いて来た。

それらの分子の大部分は、天然起源のものであり(又は、何れかの場合でも、合成類似体である)。非常に興味深い例としては、オリーブ油由来の分子である。

心血管病変及び腫瘍の発生率は、オリーブ油の消費に基づいている地中海ダイエットを採用する集団において有意に低いことが、実際、十分に知られている。科学的証拠は、その組成を定義する目的で、及び特に、医学薬理学的可能性のある物質を同定する目的でオリーブ油の研究にかなりのインセンティブを提供して来た。

特に関心を呼んでいるオリーブ油の1つの特徴は、それに含まれるポリフェノール高レベルである。それらの化合物は、遊離基の形成を阻害できる、植物起源天然抗酸化物質である。

オリーブ油の有益な特性が、オリーブ栽培とオリーブ油の生産において、中でもイタリアで相当な増加を誘発している。結果的に、我々はまた、高度に汚染し、そして従って、相当な環境的影響生む、オリーブ油生産の副産物、主に植物水及び搾りかすの強い増加を目撃して来た。

この物質の廃棄は、国家及び地域レベルでイタリアで厳格規制されており、そして法律(11/1996の法574)の実施は、高い医学的及び医薬的可能性を有する分子に富んでいる、それらの廃棄物から何れの利点も引き出すことができない生産者に多額の費用をもたらしている。

ヒドロキシチロソールは、最も研究されて来た植物水に含まれるポリフェノールである。それは植物水及び搾りかすに存在し、そしてまた、中でも、オリーブの木の葉に存在する物質であるオレウロペイン加水分解により形成される。

最近の研究は、ヒドロキシチロソースは、単独で、PC12細胞(褐色細胞腫細胞系)に対する細胞保護効果を有し、U937細胞(ヒト骨髄単球系)及びC2C12細胞(マウス筋芽細胞系)に投与される場合、抗アポトーシスであり、誘発された腫瘍の場合、インビボ乳房腫瘍増殖を阻害し、HL60及びHL60R腫瘍細胞系(ヒト前骨髄性白血病系及びその多剤耐性誘導体)に対する研究における化学予防剤であり、そして月経前症候群及び骨粗鬆症予防剤であることを実証している。

さらに、ヒドロキシチロソールのインビボ投与(また、高濃度での)は毒性効果を有さないことが、実証されている。

他の研究は、オレウロペインが単独で投与される場合、それは抗微生物活性を行い、結腸直腸腫瘍細胞系、転移性乳房腫瘍及びER陰性細胞系において抗腫瘍能力を有し、そして細胞骨格ベルで細胞安定性を変える能力を有することを実証した。多くの研究が植物水に対して行われて来たが、単に、生産者の費用であり、そして環境に危険であるこの廃棄物に価値を与えることができる新規特性を同定するために、大幅な切実な必要性がまだ存在する。この廃棄物に特性を与えることができる新規の栄養及び医学−薬理学的特性を同定するために特に切実な必要性がある。

概要

本発明は、オイル保有オリーブの圧縮に起因する水(通常、植物水として知られている)、又はオリーブ製粉工程に起因する残留オリーブ搾りかす由来のポリフェノール化合物に富んでいる、特にヒドロキシチロソース及び3,4−DHPA−EDAに富んでいる天然の植物複合体の血管新生及び/又は炎症の予防及び治療への使用に関する。特に、参照される血管新生及び炎症は、例えば腫瘍の進行及び広がり、又は非腫瘍病理に結び付けられる血管新生及び炎症を維持する病理型のものである。本発明はさらに、ポリフェノール濃縮物を含む飲料、及び血管新生及び炎症の治療及び予防へのその使用に関する。

目的

本発明のポリフェノール濃縮物(サンプルA009);B)ブランク(サンプルA012);C)精製されたヒドロキシチロソール(HyT);及びD)精製されたヒドロキシチロソールブランク(すなわち、エタノール−EtOH)の漸進的希釈液による処理に続いて、HUVE細胞の増殖の評価を目的とする

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
1件

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請求項1

炎症の治療及び/又は予防への使用のための、ヒドロキシチロソール及び3,4−DHPA−EDAを含む、植物水及び/又はオリーブ搾りかすの濃縮物

請求項2

好ましくは、チロソールクロロゲン酸、bヒドロキシベルバスコシドルチン、ベルバスコシド、及びルテオリンから選択された少なくとも1つのフェノール化合物;及び/又は好ましくは、ナトリウムカルシウムマグネシウム及びカリウムから選択された少なくとも1つの金属;及び/又は好ましくは、塩化物硫酸塩、リン酸塩及び硝酸塩から選択された少なくとも1つのアニオン;及び又はグルコースフルクトースマンニトール及びスクロースから選択された少なくとも1つの炭水化物;及び/又は窒素をさらに含む、請求項1に記載の濃縮物。

請求項3

植物水及び/又はオリーブ搾りかすの濃縮物の製造方法であって、下記工程:(i)マイクロ濾過の濃縮物及び透過物を得るために、植物水及び/又はオリーブ搾りかすのサンプルをマイクロ濾過する工程;及び(ii)工程(i)のマイクロ濾過透過物を逆浸透により濃縮する工程、を含んで成る方法。

請求項4

前記マイクロ濾過工程が、好ましくは管状形状により特徴づけられる、少なくとも1つのセラミック膜の使用を包含する、請求項3に記載の方法。

請求項5

前記膜が、酸化アルミニウム及びジルコニアで製造される、請求項4に記載の方法。

請求項6

前記逆浸透が、好ましくはポリアミドから製造され、好ましくは螺旋形状により特徴づけられるポリマー膜を用いることにより実施される、請求項3〜5のいずれか1項に記載の方法。

請求項7

炎症の治療及び/又は予防への使用のための、請求項3〜6のいずれか1項に記載の方法により得られる、植物水及び/又はオリーブ搾りかすの濃縮物。

請求項8

前記炎症が、病理学的炎症、好ましくは腫瘍性又は非腫瘍性炎症である、請求項1、2又は7のいずれか1項に記載の濃縮物。

請求項9

前記非腫瘍性炎症が、リウマチ性疾患、好ましくはリウマチ性関節炎及び痛風;結腸直腸炎症性疾患、好ましくは、クローン病過敏性及び潰瘍性腸症候群気管支病変、好ましくは気管支慢性閉塞性肺疾患及び喘息;肝疾患、好ましくは、線維症及び肝硬変;前立腺の疾患、好ましくは、良性前立腺肥大症及び急性/慢性前立腺炎;粘膜炎;皮膚炎又は前腫瘍性病変、好ましくは、乳房子宮又は口の病変に関連付けられる、請求項8に記載の濃縮物。

請求項10

請求項1、2又は7のいずれか1項に記載の植物水及び/又はオリーブ搾りかすの濃縮物を含む飲料。

請求項11

炎症の治療及び/又は予防への使用のための、請求項10に記載の飲料。

請求項12

前記炎症が、病理学的炎症、好ましくは腫瘍性又は非腫瘍性炎症である、請求項11に記載の飲料。

請求項13

前記飲料が、水及び/又は果実及び/又は乳を基礎とし;好ましくはグレープジュース及び/又はブドウ液を基礎とする、請求項10〜12のいずれか1項に記載の飲料。

技術分野

0001

本発明は、オイル保有オリーブ圧縮に起因する水(通常、植物水として知られている)、又はオリーブ製粉工程に起因する残留オリーブ搾りかす由来ポリフェノール化合物に富んでいる、特にヒドロキシチロソース及び3,4−DHPA−EDAに富んでいる天然植物複合体血管新生及び/又は炎症の予防及び治療への使用に関する。

0002

特に、参照される血管新生及び炎症は、例えば腫瘍の進行及び広がり、又は非腫瘍病理に結び付けられる血管新生及び炎症を維持する病理型のものである。

背景技術

0003

血管新生は、個人成長及び発育の段階で起こる生理的工程であり、そしてそれは、既存の血管区画のものからの新しい血管の形成を包含する。血管新生は、種々の病理学現象、例えば腫瘍を特徴づける工程である。

0004

腫瘍(又は新生物塊状物は、約1−2mm3の大きさまで、自律的に成長し、そして発育するが、しかしながら、さらに成長するためには、それ自体に栄養分及び酸素の不可欠な供給を確保すべきであり、そして従って、それ自体の血管区画を創造する必要がある。

0005

腫瘍は、血管新生因子、例えばVEGF(血管内皮増殖因子)、bFGF(塩基性線維芽細胞増殖因子)及びPDGF(血小板由来増殖因子)を分泌することができ、それらは、血管の発達を促進することができる。腫瘍により分泌される血管新生因子は、内皮細胞活性化し、それに応答して、周囲の組織に移動し、そして侵入するために、細胞マトリックス及び基底膜(例えば、マトリックスメタロプロテアーゼ−MMP)を分解する物質を増殖し、そして分泌し始める。続いて、内皮細胞は、周皮細胞、すなわち新しく形成された血管を取り囲み、そして血流を変更でき、そして血管透過性を調節できる収縮性細胞の存在により安定化される管状構造を形成するよう組織化する。腫瘍由来の血管は、不規則であり、そして「正常」血管とそれらとを区別する構造要素により特徴づけられる。例えば、それらは周皮細胞の不在、大きな卵円窓及び顕著な血管拡張により特徴づけられる。それらの特徴は、血管の透過性及び圧力レベルを変更し、そして従ってまた、抗腫瘍薬剤送達を妨げ、薬剤は腫瘍に達する代わりに、間質液中に分散され、そして従って、それらの機能を実行することができない。

0006

腫瘍の発生、成長及び転移の工程における血管新生の重要性を考慮して、多くの研究が、腫瘍血管の不規則的発生を阻止でき、そして従って、腫瘍部位への薬剤の送達を改善できる物質を同定する目的で行われて来た。特に、大きな努力が、血管の異常発生を防止することができる分子を同定するために行われており;これは、「血管予防(angioprevention)」(すなわち、腫瘍関連血管新生の予防)の概念の策走を導いて来た。

0007

それらの分子の大部分は、天然起源のものであり(又は、何れかの場合でも、合成類似体である)。非常に興味深い例としては、オリーブ油由来の分子である。

0008

心血管病変及び腫瘍の発生率は、オリーブ油の消費に基づいている地中海ダイエットを採用する集団において有意に低いことが、実際、十分に知られている。科学的証拠は、その組成を定義する目的で、及び特に、医学薬理学的可能性のある物質を同定する目的でオリーブ油の研究にかなりのインセンティブを提供して来た。

0009

特に関心を呼んでいるオリーブ油の1つの特徴は、それに含まれるポリフェノール高レベルである。それらの化合物は、遊離基の形成を阻害できる、植物起源の天然抗酸化物質である。

0010

オリーブ油の有益な特性が、オリーブの栽培とオリーブ油の生産において、中でもイタリアで相当な増加を誘発している。結果的に、我々はまた、高度に汚染し、そして従って、相当な環境的影響生む、オリーブ油生産の副産物、主に植物水及び搾りかすの強い増加を目撃して来た。

0011

この物質の廃棄は、国家及び地域レベルでイタリアで厳格規制されており、そして法律(11/1996の法574)の実施は、高い医学的及び医薬的可能性を有する分子に富んでいる、それらの廃棄物から何れの利点も引き出すことができない生産者に多額の費用をもたらしている。

0012

ヒドロキシチロソールは、最も研究されて来た植物水に含まれるポリフェノールである。それは植物水及び搾りかすに存在し、そしてまた、中でも、オリーブの木の葉に存在する物質であるオレウロペイン加水分解により形成される。

0013

最近の研究は、ヒドロキシチロソースは、単独で、PC12細胞(褐色細胞腫細胞系)に対する細胞保護効果を有し、U937細胞(ヒト骨髄単球系)及びC2C12細胞(マウス筋芽細胞系)に投与される場合、抗アポトーシスであり、誘発された腫瘍の場合、インビボ乳房腫瘍増殖を阻害し、HL60及びHL60R腫瘍細胞系(ヒト前骨髄性白血病系及びその多剤耐性誘導体)に対する研究における化学予防剤であり、そして月経前症候群及び骨粗鬆症予防剤であることを実証している。

0014

さらに、ヒドロキシチロソールのインビボ投与(また、高濃度での)は毒性効果を有さないことが、実証されている。

0015

他の研究は、オレウロペインが単独で投与される場合、それは抗微生物活性を行い、結腸直腸腫瘍細胞系、転移性乳房腫瘍及びER陰性細胞系において抗腫瘍能力を有し、そして細胞骨格ベルで細胞安定性を変える能力を有することを実証した。多くの研究が植物水に対して行われて来たが、単に、生産者の費用であり、そして環境に危険であるこの廃棄物に価値を与えることができる新規特性を同定するために、大幅な切実な必要性がまだ存在する。この廃棄物に特性を与えることができる新規の栄養及び医学−薬理学的特性を同定するために特に切実な必要性がある。

0016

この点に関して、本出願人は、驚くべきことには、植物水が、血管新生及び炎症、特に腫瘍の発生及び広がりを維持する病理学的血管新生及び炎症、又は非腫瘍病理に関連した血管新生及び炎症を、インビトロ及びインビボで阻止し/予防することができることを見出した。特に、本出願人は、マイクロ濾過にゆだねられる植物水の透過物を、逆浸透を介して濃縮することにより、血管新生及び炎症、特に病理学的血管新生及び炎症、例えば腫瘍に関連するそれら又は非腫瘍病理に関連するそれらを予防でき、且つ阻止できるポリフェノール化合物に富んでいる植物複合体を入手し、ある方法においては、これは、同じ化合物が、個別に採取される場合、すなわち精製技術により、植物水及び搾りかすから単離される場合に達成できるものに比較して、より効果的であることを見出した。

0017

この効果は、中でも、血管予防の点で、ヒト健康のために特に好都合である。実際、このためには、本発明の植物水濃縮物は、単独で又はさらなる抗腫瘍及び抗血管新生及び抗炎症物質組合して、例えば血管新生及び炎症、特に、腫瘍に関連する病理学的血管新生及び炎症、又は非腫瘍疾患に関連する病理学的血管新生及び炎症を治療するか、又は予防するために、飲料の形で使用され得る。

0018

本発明のさらなる利点は、添付される図面の助けにより行われる、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。

図面の簡単な説明

0019

図1は、A)本発明のポリフェノール濃縮物(サンプルA009);B)ブランク(サンプルA012);C)精製されたヒドロキシチロソール(HyT);及びD)精製されたヒドロキシチロソールブランク(すなわち、エタノール−EtOH)の漸進的希釈液による処理に続いて、HUVE細胞の増殖の評価を目的とするMTアッセイの結果を示す。

0020

図2は、処理の24及び48時間後、A、C)本発明のポリフェノール濃縮物(サンプルA009);B、D)ブランク(サンプルA012)の漸進的希釈による処理に続いて、アポトーシス及びHUVE細胞死に対するアッセイの結果を示す。

0021

図3は、処理の24及び48時間後、A、C)精製されたヒドロキシチロソール(HyT);B、D)精製されたヒドロキシチロソールブランク(すなわち、エタノール−EtOH)の漸進的希釈による処理に続いて、アポトーシス及びHUVE細胞死に対するアッセイの結果を示す。

0022

図4は、A)血清フリー培養培地SFM)、完全培養培地(CTRL)、本発明のポリフェノール濃縮物の1:500及び1:250希釈液(サンプルA0120);B)血清フリー培養培地(SFM)、完全培養培地(CTRL)、精製されたヒドロキシチロソール(HyT)の1:500及び1:250希釈液、精製されたヒドロキシチロソールブランク(すなわち、エタノール−EtOH)の1:500及び1:250希釈液による処理に続いて、マトリゲルにおいて毛細管型管状構造を形成するHUVE細胞の能力の評価に基いての形態形成アッセイの結果を示す。

0023

図5は、A)完全培養培地(CTRL)、血清フリー培養培地(SFM)、本発明のポリフェノール濃縮物の漸進的希釈液(サンプルA009)、ブランク(サンプルA012);B)完全培養培地(C+)、血清フリー培養培地(SFM)、精製されたヒドロキシチロソール(HyT)及び精製されたヒドロキシチロソールブランク(すなわち、エタノール−EtOH)の漸進的希釈液による処理に続いてのHUVE細胞に対する走化性アッセイの結果を示す。

0024

図6は、A)完全培養培地(CTRL)、血清フリー培養培地(SFM)、本発明のポリフェノール濃縮物の漸進的希釈液(サンプルA009)、ブランク(サンプルA012);B)完全培養培地(CTRL)、血清フリー培養培地(C−)、精製されたヒドロキシチロソール(HyT)及び精製されたヒドロキシチロソールブランク(すなわち、エタノール−EtOH)の漸進的希釈液による処理に続いてのHUVE細胞に対する化学浸潤アッセイの結果を示す。

0025

図7は、H2O2により処理された後に、A)本発明のポリフェノール濃縮物の漸進的希釈液(サンプルA009)及びそれぞれのブランク(サンプルA012);B)精製されたヒドロキシチロソール(HyT)の漸進的希釈液及びそれぞれのブランク(すなわち、エタノール−EtOH)により処理した場合の、HUVE細胞に影響を及ぼす酸化ストレス(DCFH−DA+細胞の%として側定される)についての結果を示す。

0026

図8は、A)本発明のポリフェノール濃縮物の漸進的希釈液(サンプルA009)及びそれぞれのブランク(サンプルA012);B)精製されたヒドロキシチロソール(HyT)の漸進的希釈液及びそれぞれのブランク(すなわち、エタノール−EtOH)による処理の後、H2O2により処理された場合の、HUVE細胞に影響を及ぼす酸化ストレス(DCFH−DA+細胞の%として側定される)についての結果を示す。

0027

図9は、A)処理なしでの(マトリゲルのみ)、VTH−VEGF、TGF、HGF(正の対照C+)の存在下での処理、VTH、及び本発明のポリフェノール濃縮物(サンプルA009)及びそれぞれのブランク(サンプルA012)の1:500希釈液の存在下での処理と伴って;B)処理なしでの(マトリゲルのみ)、VTH−VEGF、TGF、HGF(正の対照C+)の存在下での処理、VTH、及び精製されたヒドロキシチロソール(HyT)の1:500希釈液の存在下での処理を伴って、マウスの皮膚下に移植されたマトリゲル接種物肉眼での比色分析の結果を示す。

0028

図10は、図9外植マトリゲル接種物中のヘモグロビンのアッセイを示す。

0029

本発明は、血管新生及び炎症の治療及び予防への使用のための、ポリフェノール化合物、好ましくはヒドロキシチロソール及び3,4−DHPA−EDAを含む、植物水及び搾りかすの植物複合体又は濃縮物に関する。

0030

好ましくは、参照される血管新生及び炎症は、病理学的血管新生及び炎症、より好ましくは腫瘍関連の血管新生及び炎症である。他方では、血管新生及び炎症は、腫瘍ではなく、むしろ病理、例えばリウマチ性疾患、好ましくはリウマチ性関節炎及び痛風;結腸直腸炎症性疾患、好ましくは、クローン病過敏性及び潰瘍性腸症候群気管支病変、好ましくは気管支慢性閉塞性肺疾患及び喘息;肝疾患、好ましくは、線維症及び肝硬変;前立腺の疾患、好ましくは、良性前立腺肥大症及び急性/慢性前立腺炎;粘膜炎;皮膚炎又は前腫瘍性病変、好ましくは、乳房子宮又は口の病変に関連され得る。

0031

実際、本発明の植物水及び/又はオリーブ搾りかすの濃縮物は驚くべきことには、腫瘍血管の新形成(すなわち、血管新生)の予防において、特に効果的であることが実証されている。それらの血管は、正常血管に比較して、独特物理化学的構造、及び従って、生物学的機能を有する。それらは主として窓状化され、そしてしばしば、周皮細胞を欠いており、そしてこのために、変更された血管透過性を有する。この構造はしばしば、薬剤が血管を通して腫瘍に送達する間、間隙空間に失われ、そして従って、目標に到達することができないか、又は無効的量でそれに到達するので、多くの薬理学的治療の失敗や困難性の基礎である。このタイプの血管構造の形成の阻害が明確に、腫瘍への物質の良好な送達、及び従って、腫瘍治療を改善する可能性を可能にする。

0032

植物水は好ましくは、三相(油、植物水及び搾りかす)及び二相(油及び搾りかす+植物水)を有するオリーブ粉砕工程に由来する。好ましくは、粉砕により生成される植物水は、例えば強酸の添加を通して、酸性pH、好ましくは3〜5、好ましくは4〜5の範囲のpHを有する溶液、及びタンパク質分解酵素、すなわちオリーブ皮のセルロースマトリックスを加水分解する酵素により処理され得る。

0033

搾りかすは好ましくは、ピットされ(穴を開けられ)、希釈され、そして前濾過される。搾りかすは好ましくは、0.5〜1mmの範囲の、より好ましくは約0.7mmのサイズ又はカットオフを有する。カットオフの例は、振動篩を用いて得られたものである。

0034

必要なら、ピットされた搾りかすは、3〜5、好ましくは3.5〜4のpHを有する水性マトリックスに溶解されるか又は分散され得る。可溶化工程は、オリーブ皮の固形マトリックス捕捉されたままで存在するポリフェノールの可溶化のためである。本発明の好ましい実施形態によれば、植物水及びオリーブ搾りかすの濃縮物(この後、「濃縮物」と称す)はさらに、チロソールクロロゲン酸、βヒドロキシベルバスコシドルチン、ベルバスコシド、及びルテオリンから選択された少なくとも1つのフェノール化合物;及び好ましくは、ナトリウムカルシウムマグネシウム及びカリウムから選択された少なくとも1つの金属;及び好ましくは、塩化物硫酸塩、リン酸塩及び硝酸塩から選択された少なくとも1つのアニオン;及び又はグルコースフルクトースマンニトール及びスクロースから選択された少なくとも1つの糖質を含む。

0035

本発明のさらなる実施形態によれば、濃縮物は、窒素含有物質タンパク質アミノ酸)を、好ましくは15〜60mg/kg、より好ましくは20〜40mg/kg(活性溶液1L当たりの窒素のmg)の量で含む。何れの場合でも、最大量で濃縮物に存在するフェノール化合物は、ヒドロキシチロソール及び3,4−DHPA−EDAである。

0036

好ましくは、ヒドロキシチロソールの量は、植物水1L当たり1〜10g(g/L)、より好ましくは1.5〜5g/L、さらにより好ましくは2〜3g/Lの範囲である。

0037

好ましくは、4−DHPA−EDAの量は、0.5〜8g/L、より好ましくは1〜6g/L、さらにより好ましくは、1.5〜2.5g/Lである。

0038

好ましくは、チロソールの量は、0.1〜0.4g/L、より好ましくは0.15〜0.25g/Lである。

0039

好ましくは、クロロゲン酸の量は、0.06〜0.24g/L、より好ましくは0.8〜0.16g/Lである。

0040

好ましくは、β−ヒドロキシベルバスコシドの量は、0.3〜1.5g/L、より好ましくは0.5〜1g/Lである。

0041

好ましくは、ルチンの量は、0.05〜0.2g/L、より好ましくは0.08〜0.15g/Lである。

0042

好ましくは、ベルバスコシドの量は、0.4〜1.7g/L、より好ましくは0.6〜1g/Lである。

0043

好ましくは、ルテオリンの量は、0.1〜0.5g/L、より好ましくは0.15〜0.28g/Lである。

0044

好ましくは、ナトリウムの量は、75〜300mg/L、より好ましくは120〜180mg/Lである。

0045

好ましくは、カルシウムの量は、5〜10g/L、より好ましくは2〜5g/Lである。

0046

好ましくは、マグネシウムの量は、220〜900mg/L、より好ましくは400〜500mg/Lである。

0047

好ましくは、カリウムの量は、3〜15g/L、より好ましくは6〜9g/Lである。

0048

好ましくは、塩化物の量は、1.5〜7g/L、より好ましくは2.5〜4.5g/Lである。

0049

好ましくは、硫酸塩の量は、12〜45g/L、より好ましくは18〜28g/Lである。

0050

好ましくは、リン酸塩の量は、1.5〜7g/L、より好ましくは2.5〜5g/Lである。

0051

好ましくは、硝酸塩の量は、12〜50mg/L、より好ましくは18〜30mg/Lである。

0052

好ましくは、グルコースの量は、15〜60g/L、より好ましくは25〜35g/Lである。

0053

好ましくは、フルクトースの量は、3.5〜15g/L、より好ましくは5〜9g/Lである。

0054

好ましくは、マンニトールの量は、1〜4g/L、より好ましくは1.5〜3g/Lである。

0055

好ましくは、スクロースの量は、4〜16g/L、より好ましくは6〜10g/Lである。

0056

本発明の好ましい実施形態によれば、濃縮物は、(i)マイクロ濾過の濃縮物及び透過物を得るために、植物水及び/又はオリーブ搾りかすのサンプルをマイクロ濾過する工程;及び(ii)工程(i)のマイクロ濾過透過物を逆浸透により濃縮する工程を含んでなる方法により得られる/得ることができる。好ましくは、マトリックス濾過は、前述のような可溶化工程の後、行われる。

0057

マイクロ濾過は、濃縮物、すなわち、植物水/搾りかすの懸濁液における内容物の濃縮画分、例えばマイクロフラグメント、繊維及び赤血球材料、例えば細胞及び細菌を分離するためである。それは、このタイプのマトリックスのための標準条件下で行われる。

0058

濃縮物の他に、マイクロ濾過工程に続いて、浸透物、すなわち、出発材料に応じて変化する色により特徴づけられ、そして植物水/搾りかすの溶解成分を含む透明画分、例えばタンパク質、糖、塩、ポリフェノール、有機酸及び種々の可溶性有機分子を得る。

0059

好ましくは、マイクロ濾過は、少なくとも1つの及び好ましくは2つのセラミック製膜により行われる。前記膜は好ましくは、管状形状により特徴づけられる。

0060

好ましい実施形態によれば、膜は、酸化アルミニウム及びジルコニアから製造される。

0061

好ましくは、膜は、次の特性を有する:約30〜約40mm、好ましくは約25mmの外径;及び約500〜約1500mm、好ましくは約1200mmの長さ;及び約2.5〜約5mm、好ましくは約3.5mmの直径、好ましくは水力直径を有する一連チャネル;及び約0.15〜0.7m2、好ましくは約0.35mm2の濾過面;及び約0.1μm〜約300kDaの範囲の分子カットオフ。

0062

前述のように植物水/搾りかすのマイクロ濾過から得られる浸透物を濃縮するための逆浸透工程は、ポリマー膜、より好ましくはポリアミドから製造された膜を用いることにより、このタイプのマトリックスのための標準条件下で行われる。特に、前記膜は、屈曲したスパイラル形状、及び高い塩拒絶を有する、すなわち塩化ナトリウム分子を、99.9%の百分率で拒絶できる分子カットオフを有する。これは、浸透膜生物医学的目的の分子を捕捉し、そして水分のみの通過を可能にすることを意味する。

0063

好ましくは、ポリマー膜は、約5〜約15m2の範囲であり、そしてより好ましくは、約7m2である濾過面を有する。

0064

逆浸透工程は、マイクロ濾過から得られた透過物を、約4倍、濃縮するよう作用し;これは、100Lのマイクロ濾過透過物から、25Lの濃縮物を得るであろうことを意味する。

0065

この場合、体積濃度比(VCR)は、4、すなわち100/25である。

0066

VCRは、逆浸透工程が、濃縮されるマトリックスの浸透圧打ち消すので、出発マトリックス(植物水)及び中でも、その塩含有物に基づいて変化することができる。

0067

本発明はさらに、上記方法により得ることができる/得られる植物水/搾りかすの濃縮物(又は植物複合体)に関する。

0068

濃縮物は好ましくは、フェノール化合物、金属、炭水化物、アニオン及び窒素の含有量に関して、以前に記載された組成を有する。それは、血管新生及び炎症、好ましくは病理学的血管新生及び炎症、特に腫瘍に関連する血管新生及び炎症、又は非腫瘍性病理学、例えばリウマチ性疾患、好ましくはリウマチ性関節炎及び痛風;結腸直腸の炎症性疾患、好ましくは、クローン病、過敏性及び潰瘍性腸症候群;気管支の病変、好ましくは気管支慢性閉塞性肺疾患及び喘息;肝疾患、好ましくは、線維症及び肝硬変;前立腺の疾患、好ましくは、良性前立腺肥大症及び急性/慢性前立腺炎;粘膜炎;皮膚炎又は前腫瘍性病変、好ましくは、乳房、子宮、肺又は口の病変に関連する血管新生及び炎症の治療及び予防のために、単独で、又は他の物質、分子又は抗腫瘍及び抗血管新生及び抗炎症療法と組合して使用され得る。好ましくは、本発明の濃縮物は、腫瘍血管の形成を阻害するために、好ましくは予防的に、単独で又は他の物質/分子と組合して使用され得る。

0069

本発明が参照する腫瘍は好ましくは、結腸直腸、乳房及び前立腺癌皮膚癌黒色腫など)、膵臓、肺、卵巣膀胱腎臓肝臓の癌である。

0070

本発明が参照する血管新生に関連する炎病状態は、リウマチ性関節炎及び痛風;結腸直腸の炎症性疾患、好ましくは、クローン病、過敏性及び潰瘍性腸症候群;気管支の病変、好ましくは気管支慢性閉塞性肺疾患及び喘息;肝疾患、好ましくは、線維症及び肝硬変;前立腺の疾患、好ましくは、良性前立腺肥大症及び急性/慢性前立腺炎;粘膜炎;皮膚炎又は前腫瘍性病変、好ましくは、乳房、子宮、肺又は口の病変である。

0071

本発明のさらなる側面は、前に記載された植物水/搾りかすの濃縮物、及び種々のタイプの飲料の製造のために通常添加される賦形剤を含む飲料に関する。

0072

飲料は、水及び果実及び乳を基礎とし得る。本発明の特に好ましい実施形態によれば、飲料は、果実を基礎とし、好ましくはそれは、グレープジュースを基礎とする。グレープジュースが特に好ましく、そしてグレープは好ましくは、有機グレープからであるべきである。飲料は任意には、凍結乾燥され得る。

0073

他方では、前に記載された植物水/搾りかすの濃縮物を、経口使用のためのピルロゼンジ剤、又は錠剤として製剤化され得る。

0074

実際上は、飲料又は経口製剤は、特に血管新生及び炎症、好ましくは病理学的血管新生及び炎症、特に腫瘍に関連するか、又は非腫瘍病理学、例えばリウマチ性関節炎及び痛風;結腸直腸の炎症性疾患、好ましくは、クローン病、過敏性及び潰瘍性腸症候群;気管支の病変、好ましくは気管支慢性閉塞性肺疾患及び喘息;肝疾患、好ましくは、線維症及び肝硬変;前立腺の疾患、好ましくは、良性前立腺肥大症及び急性/慢性前立腺炎;粘膜炎;皮膚炎又は前腫瘍性病変、好ましくは、乳房、子宮、肺又は口の病変に関連する血管新生及び炎症を予防するために、食品サプリメントとして摂取され得る。

0075

好ましくは、飲料又は経口製剤は、腫瘍血管の形成を阻害するために、好ましくは予防するために、食品サプリメントとして摂取される。

0076

任意には、飲料は、抗腫瘍及び抗血管新生及び抗炎症物質、分子、薬剤又は治療法に関連して摂取され得る。

0077

本発明のさらなる側面は、前に記載された植物水/搾りかすの濃縮物及び可能な賦形剤を含む、クリーム、オイル、軟膏ミストシャンプー又はゲルに関する。

0078

前記クリーム、オイル、軟膏又はゲルは、高められた及び/又は変更された血管新生、及び炎症により引起される生理病理学的状態の治療、好ましくは局部治療、及び/又は予防のために使用され得る。

0079

実施例
オリーブの植物水/搾りかすからの濃縮されたポリフェノールの製造
全体の製造工程は、膜ベース接線流濾過及び分離技法の使用を中心とする。

0080

オリーブ植物水/搾りかすからポリフェノール濃縮物の製造のために行われる膜工程は、次のわずか2つの濾過段階を使用した:マイクロ濾過及び逆浸透。しかしながら、所望の生成物に依存して、限界濾過及びナノ濾過段階により、前記工程を完結することが可能である。

0081

マイクロ濾過は、懸濁された固形物、細菌及び脂肪の分離を可能にし、一方、逆浸透は、存在する物質、例えばイオン、また単価のイオンのすべてをトラップし、そして水のみの浸透を可能にする。

0082

前記工程は、三相のオリーブ粉砕工程に由来する植物水から出発して行われたが、しかしそれはまた、前処理の後、二相工程に由来する湿潤搾りかすにも適用され得る。

0083

湿潤搾りかすは、ピットされ、希釈され、そして約0.7mmのカットオフにより前濾過され(例えば、振盪節による)、そして次に、膜システムにより処理され;又は他方では、それは、可能な希釈液により三相デカンターにおいて処理され、そして膜工程による処理の前、三相デカンターにおいて再処理され得る。

0084

実施されるマイクロ濾過工程は、植物水/搾りかすに存在する、懸濁液下の全内容物(マイクロフラグメント、繊維及び赤血球材料、例えば細胞及び細菌)の濃縮された画分を分離することを目的とする。

0085

マイクロ濾過透過物は、その色が処理されたオリーブの栽培品種に応じて異なり、そして植物水/搾りかすの溶解された成分、例えばタンパク質、糖、塩、ポリフェノール、有機酸及び種々の溶解性有機分子のすべてを含む透明画分である。

0086

マイクロ濾過に関しては、次の特性を有する酸化ジルコニウム選択層と共に2つの管状酸化アルミニウムセラミック製膜から製造される:25mmの外径、1178mmの長さ、3.5mmのチャネル水力直径を有する23のチャネル、0.35m2の濾過面、及びそれぞれ0.14μm−300kDaの分子カットオフ。

0087

マイクロ濾過においては、3.5mmの水力直径を有する23のチャネルを有する膜を用いることにより、約12%の全固形分を有する濃縮された画分を得るまで、植物水/搾りかすを濃縮することが可能である。

0088

約7%の全固形分と共に、処理された植物水を考慮して、4倍に濃縮することが可能であり、従って、55%の全固形分を有する浸透物及び12.1%の全固形分を有する濃縮物を得る。

0089

本発明のポリフェノール濃縮物は、逆浸透により植物水をマイクロ濾過することにより得られる浸透物を濃縮することにより製造された。

0090

屈曲したらせん形状、高い塩拒絶及び7m2の濾過面を有する、ポリアミドから製造されたポリマー膜を使用するが、しかしまた、低い塩拒絶及び浸透物におけるポリフェノールのマイナー損失を有する膜も使用することができる。

0091

逆浸透においては、約3.6の比で処理された植物のマイクロ濾過浸透物を濃縮することが可能である。

0092

明らかに、体積濃縮比は、初期開始マトリックス、及び中でも、その塩含有量及び従って、浸透圧に依存して変化することができる。

0093

試験される植物水の組成
ポリフェノール濃縮物の組成が、下記表Iに示される:

0094

0095

表Iに示される物質は、識別コードA009でサンプルに含まれ、ところがブランク(すなわち、負の対照)は、コードA012により識別される。

0096

ブランクは、XAD7樹脂によるポリフェノール濃縮物のバッチクロマトグラフィー分離により得られた。

0097

詳細には、約50ccの体積のXAD7樹脂を、蒸留水によりすすぎ、エタノールで再生し、そして再び蒸留水によりすすいだ。

0098

樹脂を、0.45μmのフィルターを用いて真空濾過により回収し、そしてビーカーにおける植物水中の約75mlの濃縮物に添加した。樹脂は、室温で振盪下で約30分間、濃縮物と接触せしめた。

0099

真空濾過は、23.4mS/cmの導電性を有するXAD7樹脂により処理された植物水の濃縮物の回収を可能にした。

0100

XAD7樹脂による処理の後、回収された植物水濃縮物を再び、XAD7樹脂により処理し、エタノールにおいて再生し、そして蒸留水によりすすいだ。

0101

真空濾過の後、16.92mS/cmの導電性を有するXAD7樹脂により2度、処理された植物水濃縮物のブランクの第3サンプルを回収した。

0102

HUVEC(ヒト臍帯静脈内皮細胞)を、内皮細胞が血管新生の工程の基本的単位を構成する事実の考慮から、本発明のポリフェノール濃縮物の標的細胞モデルとして使用した。

0103

ポリフェノール濃縮物により行われた分析から得られた結果を、ヒドロキシチロソールのみにより、同じ条件下でHUVECを処理する場合に得られたそれらの結果と比較した。ヒドロキシチロソールは、それがサンプルA009において最も表されるポリフェノール(2.70g/L)であるので、比較のための物質として選択された。

0104

目的は、植物水(記載されるような濃縮物の形で)は、抗血管新生効果を有する他に、1つの物質のみよりも、より良好な阻害能力を示すことを実証することである。

0105

効果が、実際的に、ヒドロキシチロソールによるものであり、そしてそれが溶解されているエタノール溶液にはよらないかどうかを評価するために、分析を、ヒドロキシチロソールがブランクサンプルとして溶解されている、同じ濃度でエタノールを含む培地を用いて実施した。

0106

植物水の抗血管新生性質の評価
サンプルの希釈度は、以下の表IIに存在するmg/ml及びμMの値に対応する:

0107

0108

内皮細胞に対する植物水の抗増殖効果の評価
ヒト内皮細胞(HUVEC)の増殖に対するサンプルA009及びA012の効果を、MTT生存性アッセイ(テトラゾイル塩、[3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)]−2,5−ジフェニルテトラゾリウム臭化物)により評価した。アッセイは、ミトコンドリア酵素琥珀酸デヒドロゲナーゼにより代謝されるMTT化合物の能力を基礎とする。塩の還元は、水に不溶性である青色生成物ホルマザン結晶の形成を導く。生存細胞は、非生存性細胞とは異なって、塩を還元し、そして生成されるホルマザンの量は、存在する細胞の数に比例する。形成される結晶は、溶解され、そして570nmの波長での吸光度値を、分光光度計により読み取る。

0109

5000個のHUVE細胞を、96ウェルプレートの各ウェル播種した。特に、ウェルを1%ゼラチンにより被覆し、そしてアッセイを、異なった処理時間(24時、48時、72時、96時)で行い、そのたびに、濃縮物の異なった希釈液を試験した(1:10000〜1:100の間隔)。

0110

内皮細胞増殖に対する効果を、濃縮物の次の希釈度について評価した:1:10000 − 1:5000 − 1:2500 − 1:1000 − 1:500 − 1:250 − 1:100。

0111

図1Aから観察されるように、24時間の処理の後、特に1:1000の希釈度から出発して、サンプルA009により処理された内皮細胞の生存性の有意な低下が存在した。

0112

サンプルA012(ブランク)は、HUVEC生存性に対する効果は有さなかった(図1B)。

0113

ヒドロキシチロソールはまた、24時間の処理の後、特に1:250の希釈度から出発して、HUVE細胞の生存性の低下を引起す(図1C)。

0114

対照として使用される、エタノール含有培地は、細胞生存性に対して何れの効果も与えない(図1D)。実験は二重反復して実施され、そして2度、反復される。

0115

従って、サンプルA009は、ヒドロキシチロソールよりも、細胞生存性に対して高い効果を有することが結論づけられ得る。

0116

アポトーシスの評価
濃縮物により処理された内皮細胞のアポトーシス(プログラムされた細胞死)の誘発を、アネキシンV及び7−アミノアクチノマイシンD(7−ADD)によりマーキングすることにより評価した。それらのマーカー細胞蛍光分析は、同じ細胞集団内で、異なる段階(早期、後期、高度)で細胞死を誘発する処理の能力の区別を可能にする。アネキシンVは、ホスファチジルセリンを、結合できる分子、すなわち細胞損傷の結果として細胞外側上に露出される、内部細胞質層に通常関連する、細胞膜グリセロリン脂質である。7−AADは、損傷された細胞又はアポトーシスにおいてのみ細胞膜を通過できる化合物であり;従って、このマーカーに対する陽性は、細胞死及び製品の毒性を示す。

0117

150,000個のHUVE細胞を、サンプルの異なった希釈液により処理し(24及び48時間)、その後、トリプシンによる処理によりプレートから分離し、そしてアポトーシスのレベルを評価するために、7−AAD及びアネキシンVにより染色した。

0118

内皮細胞を、サンプルA009、A012及びHyT−EtOHの異なった希釈度(希釈度1:2500−1:250の範囲)で、24及び48時間、処理し、そして2種のマーカーに対する陽性について分析した。

0119

図2A及び2Cから分かるように、サンプルA009の1:250希釈液は、24時間及び48時間の処理の後、それぞれ、アポトーシスの後期段階の内皮細胞を、それぞれ50%及び75%、誘発した。サンプルA012の同じ希釈液は、何れのプロ−アポトーシス効果も発揮しない(細胞の約95%は生存する)。

0120

対照的に、ヒドロキシチロソール及びエタノール含有培養物による処理は、細胞壊死を高めない(図3)。

0121

実験を二重反復して実施し、そして2度、反復した。

0122

従って、ヒドロキシチロソールは、本発明の濃縮物よりも低い活性を示す。

0123

内皮細胞の形態形成に対する植物水の効果の評価
それらが細胞外マトリックスにおいてインビトロで培養され、そして適切な活性化刺激暴露される場合、内皮細胞は血管の内腔の構造を模倣する管状構造に組織化することができる。

0124

マトリゲル(すなわち、ラミニンコラーゲンIV、ヘパラン硫酸プロテオグリカン成長因子(例えば、PDGF、EGF、TGF−β及びMMP)から成るポリマー)における形態形成のアッセイを通して、選択された化合物の抗血管新生能力を評価することができる。インビトロで細胞の形成を阻害する本発明の濃縮物の能力を評価するために、24ウェルプレートの各ウェルを、300μlのマトリゲル(10mg/ml)により被覆し、そしてマトリックスの重合に続いて、1mlの完全培地当たり50,000個のHUVE細胞を、重合されたマトリックスに播種した。細胞を、サンプルA009、A012、HyT及びEtOHの異なった希釈液(1:500及び1:250)により、24時間、前処理した。

0125

正及び負の対照として、10 ng/ml のaFGF (酸性線維芽細胞増殖因子)、 10 ng/mlの bFGF (塩基性線維芽細胞増殖因子)、 10 ng/ml の EGF (上皮成長因子) 、0.1 mg/ml のへパリン、0.10 μg/mlのヒドロコルチゾン、10% FBS(ウシ胎児血清)、1%グルタミン(Gln)、1%アンピシリン/ストレプトマイシン(P/S)及び成長因子により補充されたM199培地、及び血清フリー培地M199(SFM)から成る完全培養培地(CM)をそれぞれ使用した。

0126

サンプルの阻害効果を、37℃及び5%CO2での6時間のインキュベーションの後、管状構造の形成の顕微鏡下での観察により評価した。

0127

図4Aにおいて観察され得るように、サンプルA009は、内皮細胞による安定した管状構造の形成を、用量依存性態様で阻害することができる。サンプルA012(ブランク)の同じ希釈液は、何れの阻害効果も発揮しない。

0128

ヒドロキシチロソールはまた、内皮細胞による安定した管状構造の形成を、用量依存性態様で阻害することができ、ところが、エタノール(ブランク)の希釈液は、わずかな阻害効果を単に発揮する(図4B)。実験は二重反復して実施され、そして二度、反復された。

0129

従って、ヒドロキシチロソールは、サンプルA009、すなわち本発明の濃縮物よりも著しく低い効果を伴って、内皮形態形成を阻害する。

0130

内皮細胞の移動活性に対する植物水の阻害能力の評価
内皮細胞を、走化性グラジエントに続いて、特定部位の方に移動する能力により特徴づける。HUVECの移動能力を評価するために、移動アッセイを、Boydenチャンバー、及びコラーゲン(50μg/ml)によりソーキングされた、12μmのカットオフを有する多孔性フィルターを用いて設定した。

0131

各チャンバーの低部区画を、10 ng/ml のαFGF、 10 ng/mlの bFGF、 10 ng/ml の EGF、0.1 mg/ml のへパリン、0.10 μg/mlのヒドロコルチゾン、10% FBS、1%Gln、1%P/S又は成長因子及び血清フリー培地M199(SFM)を含むCM210μlにより充填した。

0132

濃縮物、ブランク、ヒドロキシチロソール、又はエタノール含有培地の多様な溶液(1:2500、1:1000、1:500及び1:250)により24時間、前処理された、50000個のHUVE細胞を、500μlの血清フリー培地を含む、チャンバーの上部区画に播種した。

0133

細胞を、37℃、5%CO2で6時間インキュベートした。

0134

アッセイの最後で、フィルターを、機械的に清浄し、上部側の非移動性細胞を排除し;次に、それらを無水エタノールに5分間、固定し、そして続いて、脱水し、そして生存性染色DAPIによりマーキングした。各フィルター上に存在する細胞を、蛍光顕微鏡下で計数した。特に、フィルター当たり5つのフィールドを、ランダム態様で分析した。

0135

図5Aに示されるように、本発明の濃縮物(サンプルA009)は、1:500及び1:250の希釈度(それぞれ、p値=0.0057及びp値=0.0003)で、内皮細胞の移動能力を、統計学的に有意な程度まで妨げることができ、ところがサンプルA012(ブランク)は、同じ移動能力を妨げない。

0136

ヒドロキシチロソールは、p値=0.0302を有する1:250の希釈度で使用されるエタノールを含む培地に比較して、内皮細胞の移動能力を低める(図5B)。ヒドロキシチロソールのより高い希釈度で、内皮細胞は、移動能力の上昇を示し、ところが本発明の濃縮物はそれを阻害することがまた、観察され得る。実験は、二重反復に実施され、そして2度、反復された。

0137

従って、単一物質として使用されるヒドロキシチロソールは、内皮移動を妨げる低い能力を示し、すなわちそれは無効果である。

0138

内皮細胞の浸潤活性に対する植物水の阻害能力の評価
現場リクルートされると、内皮細胞は、走化性部位へのそれらの実際の移動に対する物理バリヤーを構成する、細胞外マトリックスを分解できる因子を生成する、周囲組織に浸潤する能力を有する。

0139

浸潤アッセイを、Boydenチャンバー、及びマトリゲル(1mg/ml)により被覆された、12μmのカットオフを有する多孔性フィルターを用いて設定した。

0140

10 ng/ml のαFGF、 10 ng/mlの bFGF、 10 ng/ml の EGF、0.1 mg/ml のへパリン、0.10 μg/mlのヒドロコルチゾン、10% FBS、1%Gln、1%P/S又は210μlの成長因子及び血清フリー培地M199(SFM)を含む完全培養培地(CM)210μlを、各チャンバーの下部区画に注いだ。

0141

500μlのSFMに再懸濁され、そして濃縮物、ブランク、ヒドロキシチロソール、及びヒドロキシチロソールを有さない溶液の異なった希釈液(1:2500、1:1000、1:500、及び1:250)により前処理された、50000個のHUVE細胞を、37℃、5%CO2で24時間インキュベートした。

0142

アッセイの最後で、フィルターを、機械的に清浄し、マトリックスを越えて浸透しなかった上部側上に存在する細胞を排除した。マトリゲルを浸潤した細胞を含むフィルターを、無水エタノールに5分間、固定し、そして次に、再水和化し、そして生存性染色DAPIによりマーキングした。各フィルター上に存在する細胞を、蛍光顕微鏡下で計数し;ランダム態様で選択されたフィルター当たりの5つの光学フィールドを、分析にゆだねた。

0143

図6Aに示される結果は、サンプルA009(すなわち、本発明の濃縮物)が、1:500及び1:250の希釈度(それぞれ、p値=0.0335及びp値=0.0011)で、統計的に有意な程度まで、内皮細胞の浸潤能力を妨げることができ、ところがサンプルA012(ブランク)はその同じ浸潤能力に影響を及ぼさないことを実証する。

0144

図6Bに示されるように、ヒドロキシチロソールは、p値=0.0016及びp値=0.0159を有する1:500及び1:250希釈度で使用される、エタノール含有培地に比較して、内皮細胞の浸潤能力を低める。ヒドロキシチロソールは、それが細胞浸潤を阻害するが、しかし移動は阻害しないので、長期を考慮して、より良好な有効性を有する。

0145

本発明の濃縮物は、移動及び浸潤の両者に対して効果的に機能する。

0146

H2O2による処理の後、酸化ストレスによる損傷に対して植物水による保護役割の評価
反応性酸素種(ROS)は、細胞損傷の腫瘍機構の1つを表し、そして炎症工程において、及び結果として、炎症に関する血管新生において基本的役割を演じる。従って、DCFH−DA(2′、7′−ジクロロフルオレセインジアセテート)によるマーキングにより、H2O2による処理の後、植物水濃縮物による処理にゆだねられたHUVE細胞に関する抗酸化力による評価が行われた。

0147

DCFH−DAは、細胞内H2O2の濃度を表すことができる物質であり、そしてサイトフルオロメトリーにより検出され得る。

0148

150,000個のHUVE細胞を、1%ゼラチンにより被覆された6−ウェルプレートの各ウェルの完全培地に播種した。続いて、細胞をトリプシン処理し、そして250μMの濃度で完全M199培地において再懸濁した。次に、細胞を、暗室において、15分間、37℃及び5%CO2下インキュベーターに配置した。続いて、細胞を、DPBSにより洗浄し、そして次に、上清液を、1200rpmでの5分間の遠心分離により排除した。最終的に、細胞を、10μMのDCFH−DA及びH2O2(正の対照)を含むDPBS、又は濃縮物(A009及びA012)、ヒドロキシチロソール又は溶媒フリーのヒドロキシチロソールの希釈液に再懸濁した。細胞を、暗室において、45分間、5%CO2を含む雰囲気下で37℃でインキュベートした。最後に、結果をFACSCantを用いて読み取った。

0149

図7Aに要約される結果は、サンプルA009(本発明の濃縮物)が、用量依存性態様で及び高い有意な程度まで(p値=1:2500= 0.0310、p値=1:1000= 0.0001、 p値=1:500= 0.0001、p値=1:250< 0.0001)、保護効果を発揮できることを実証する。

0150

ヒドロキシチロソールは、抗酸化効果を発揮するが(図7B)、ところがエタノールが溶解されている培地は、抗酸化効果を有さない。

0151

その結果は、本発明の濃縮物が、より有意な抗酸化効果を発揮できることを実証する。ヒドロキシチロソールのp値は、実際、低い:p値= 1:2500= 0.0115、p値=1:1000=0.0062、 p値=1:500= 0.0082 及びp値=1:250= 0.0223。

0152

実験は、二重反復して実施され、そして2度、反復された。

0153

H2O2による処理の前、酸化ストレスによる損傷に対して植物水による保護役割の評価
150,000個のHUVE細胞を、1%ゼラチンにより被覆された6−ウェルプレートの各ウェルにおける完全培地に播種した。続いて、細胞をトリプシン処理し、そして完全M199培地、及び植物水濃縮物(A009及びA012)、ヒドロキシチロソール、又はエタノール含有培地(標準希釈素で)に再懸濁した。

0154

次に、細胞を、暗室において、37℃及び5%CO2下で30分間インキュベーターに配置した。DPBSにより洗浄した後、細胞を、分析下で、正の対照及びサンプルの両者において、10μMのDCFH−DA及びH2O2を有するDPBSに再懸濁した。細胞を、暗室において、45分間、37℃及び5%CO2下でインキュベーターに配置した。最終的に、結果を、FACSCantを用いて読み取った。

0155

図8Aにおいては、サンプルA009が用量依存性態様で保護効果を発揮することが観察され、ところがROSの生成は、ブランク(A012)により処理されたサンプルにおいて高いままであることが観察される。ROSの生成の低下は、サンプルA009の場合、非常に有意である:p値= 1:2500= 0.0056、p値= 1:1000= 0.0015、p値= 1:500< 0.0001 及び p値= 1:250< 0.0001。

0156

図8Bに示される結果は、ヒドロキシチロソールが、H2O2による酸化の誘発の後に使用される場合、有意な抗酸化効果を有さないことを実証している。さらに、ヒドロキシチロソールを有さない溶媒は、H2O2による前処理の場合に生じるように、細胞に対する有意な効果を生成しないことを観察することが可能である。

0157

実験は、二重反復して実施され、そして2度、反復された。

0158

結論としては、本発明の濃縮物よりも低い抗酸化力を有する他に、ヒドロキシチロソールは、酸化の誘発の後、前処理に使用される場合、この力を維持しない。

0159

マウスモデルにおける植物水の抗血管新生力の評価
インビボでの血管形成を阻害する植物水濃縮物の能力を、Albini et al. in “Angiogenic potential in vivo by Kaposi's sarcoma cell-free supernatants andHIV-1 tat product: inhibition of KS-like lesions by tissue inhibitor of metalloproteinase-2 (AIDS, 1994)”により記載されるように、マトリゲルスポンジアッセイにより評価した。

0160

特に、C57/BL6株の生後8週の雄マウスを、動物モデルとして使用した。マトリゲルペレットを、異なった希釈度で、サンプルA009、又は対応するブランク(A012)と共に、マウス中に皮下注入した。マトリゲルは、4℃で液体形で存在し、そして室温で急速に重合し;この性質は、前−血管新生物質を分泌する皮下腫瘍シュミレートするために利用される。この実験においては、液体形でのマトリゲルは、血管新生の工程のために必要なすべての要因を含み、そしてVEGF(100ng/μl)、TNFα(1.2ng/μl)及びヘパリン(25U/ml)から成る、VTHと呼ばれる混合物と関連していた。

0161

VEGFは内皮細胞のための主要成長因子を表し、TNFαは炎症性細胞成分のリクルートのために必須であるサイトカインを構成し、そしてヘパリンは内皮のリクルートメント及び活性化の結果としてペレットで形成する血液を保持するよう作用するので、VTHは正の対照と見なされる。動物脇腹皮下注射した後すぐに、マトリゲルは急速に重合し、そしてそれに含まれる因子を放出する。それらは内皮及び炎症細胞のための化学誘引物質として作用し、そしてそれらがマトリゲルに侵入あいた後すぐに、マトリックスにより形成される「微小環境」にトラップされ、そして活性化されたまま存続する。問題のアッセイに関しては、3匹のマウスを各条件のために使用した。使用される条件は次の通りであった:1)マトリゲルのみ(負の対照)、2)マトリゲル及びVTH(正の対照)、3)植物水濃縮物の2希釈液(1:500及び1:250)(両者は、分析下のサンプル及びブランクサンプルのためである)と組合してのマトリゲル及びVTH。さらに、同じ希釈液を、ヒドロキシチロソールのために試験した。

0162

マトリゲルペレットを、日0で注入し;日4で、マウスを殺し、そしてペレットを除いた。移植されたペレットを計量し、そして300μlのPBSに配置し、そして次に、次の2種の部分に分割した:半分は、血管新生のインジケーターであるヘモグロビンのアッセイのために使用され(内皮細胞のリクルートメント及びその活性化の結果としてペレットにおける血液の存在下で)、そして他の半分は、内皮及び炎症成分を評価する免疫組織化学的染色を実施するために、OCTに埋め込まれた。

0163

ヘモグロビンを定量化するために、ペレットを機械的に崩壊し、13000gで12分間、4℃で遠心分離し、そして上清液を除いた。

0164

次に、200μlの上清液を、800μlのドラキン溶液が添加されているエッペンドルフ管に配置した。この物質は、ヘモグロビンに結合し、沈殿する結晶を形成し、従って、分光光度計(540nm)による吸光度読み取りを可能にする:ヘモグロビン濃度は、形成される結晶の数及び記録された吸光度に正比例する。ヘモグロビンの定量化は、以下の数学的モデルに依存する:
HB=(540nmでの吸光度/ペレットの重量g)×100

0165

図9Aにおいては、染色が内皮の浸潤及び血液の続く存在に比例することの観察を可能にする。

0166

図9Bにおいては、ヒドロキシチロソールによる1:500処理のペレットの染色が正の対照のそれよりも強いことの観察を可能にする。

0167

図10は、ペレットのヘモグロビン含有量の定量化に関連するデータを示す。ヘモグロビン濃度は、サンプルA012(ブランク)に関連するペレット及びヒドロキシチロソールに比較して、本発明の濃縮物(A009)に関連するペレットにおいて、統計学的に有意な程度(p=0.0058)まで低下することが注目され得る。

0168

結論としては、上記に報告される実験結果は、植物水から得られるポリフェノール濃縮物(サンプルA009)が抗血管新生活性化に恵まれていることを明確に示唆する。実際、本発明の濃縮物は、内皮細胞の生存能力を阻害し、そしてそのアポトーシスを高める。さらに、それはまた、細胞外マトリックスをシミュレートするために使用される合成マトリックスの移動及び浸潤を妨げる。最終的に、濃縮物によるHUVECの処理により、血管系の管状構造の形成の阻害を観察することも可能である。

0169

インビトロ結果の他に、本発明の濃縮物の抗血管新生能力がまた、生理系においても明確に実証された。

0170

すべての実験は、観察される効果が目的の分子によるものであり、そして実験を妨害している他の要因によるものではないことを確認することができるように、ポリフェノールの精製された同じ濃縮物(ブランクサンプル)と比較して、実施された。

0171

さらに、ヒドロキシチロソールを独自に試験し、そして実施されるすべての試験の結果は、それが本発明の濃縮物よりも有効且つ活性的ではないことを実証した。

0172

従って、上記に示される実験の結果は、逆浸透に植物水のマイクロ濾過透過物をゆだねることにより得られるポリフェノール濃縮物が抗血管新生特性を有することを実証する。

実施例

0173

特に、濃縮物は、植物水に含まれる主ポリフェノール化合物を表すヒドロキシチロソールのみに比較して、改良された抗血管新生効果を有する。

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