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技術 微生物を複雑な試料から単離する方法

出願人 メルクパテントゲゼルシャフトミットベシュレンクテルハフツング
発明者 ホーナデル,マリサジュエット,セバスチャン
出願日 2014年10月9日 (5年4ヶ月経過) 出願番号 2016-527180
公開日 2016年12月15日 (3年2ヶ月経過) 公開番号 2016-538843
状態 不明
技術分野
  • -
主要キーワード 物理的な分離 反応液体 RET供与体 試料汚染 ダービー RET受容体 試料容積 品質制御
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課題・解決手段

本発明は、哺乳動物細胞を含む試料から微生物を単離し、任意に検出する方法であって、Benzonase(登録商標)Nucleaseを含む溶解緩衝液の使用を含む、前記方法に関する。本発明はさらに、Benzonase(登録商標)Nucleaseを含む溶解緩衝液およびその使用に関する。

概要

背景

微生物バイオバーデンモニタリングおよび適時の結果は、バイオリアクターから来る組換えタンパク質または他の生物工学的生成物生産の間の品質制御のために重大である。

典型的に、バイオリアクター試料のバイオバーデンレベルは、膜ろ過および培養培地上でのその後のインキュベーションまたは乏しいプレーティングによって決定される。バイオリアクター試料の微粒子含量により、特に高いレベルの哺乳動物細胞がバイオリアクター中に存在する場合、少量の試料のみをろ過することができ(1ml〜2mlまたはさらに少量)、各試料の代表的な容積試験することができるために多数のろ過ステップが必要である。

この方法を、哺乳動物細胞および微生物を分離するための分画遠心ステップを加えることにより改善することができる。この場合において、微生物を含む上清を、薄膜上でろ過し、培養培地上でインキュベートする。この方法の欠点は、哺乳動物細胞で捕獲されるかまたはそれに固着し得る数種の汚染物質損失の可能性である。

診断目的のために、高い試料容積が、低レベル汚染を検出することができるために必要である。不満足膜ろ過性の結果、臨床的試料の真核細胞を、含まれる微生物を溶解せずに差別的に溶解することができる溶解緩衝液の開発がもたらされた。溶解緩衝液処理の後、試料をろ過し、膜を培養培地上でインキュベートする。ある場合において、分子法を、微生物のより迅速な検出のために使用する。この場合において、特定の処理を、真核細胞の溶解の後に適用して、検出方法干渉し得る高い含量の真核生物DNAを除去する必要がある。後続のステップにおいて、微生物を溶解して、それらのDNAを放出させる。このDNAを精製し、次に分子法、例えばPCRまたはリアルタイムPCRによって検出する。すべてのこれらのステップの組み合わせは、多大な時間を必要とし、多くの手動の取り扱いステップのため骨の折れるものである。

最先端技術において、哺乳動物細胞を選択的に溶解することにより哺乳動物細胞試料の微生物汚染を単離し、検出するための溶液が、記載されている。これらの刊行物は、臨床的試料、例えば体液、特に血液における微生物汚染の検出に関する。
例えば、WO 2009/015484 A1には、微生物および微生物核酸を血液から、血液細胞を選択的に溶解し、その間微生物細胞サポニン配合物を使用して保護することにより単離し、検出するための迅速な方法が開示されている。

WO 2011/070507 A1において、試料中の血液細胞の選択的な溶解は、非イオン性洗浄剤中の試料をアルカリ性条件下でインキュベートすることにより達成される。
US 2008/0131955 A1には、哺乳動物細胞を選択的に溶解するステップを含む、標的DNAを体液試料中の混合DNAから分離する方法が記載されている。
EP 0745849 A2には、赤血球を選択的に溶解する、試料中に存在し得る微生物の核酸分析のための全血を処理する方法が開示されている。

しかしながら、大量の複雑なバイオリアクター試料および高い細胞密度によって、尚微生物汚染の検出に関して難題がもたらされている。本発明の目的は、したがって、哺乳動物細胞を含む複雑な試料中の微生物汚染を単離し、かつ/または検出する方法の開発であった。

概要

本発明は、哺乳動物細胞を含む試料から微生物を単離し、任意に検出する方法であって、Benzonase(登録商標)Nucleaseを含む溶解緩衝液の使用を含む、前記方法に関する。本発明はさらに、Benzonase(登録商標)Nucleaseを含む溶解緩衝液およびその使用に関する。

目的

さらに、DNAまたはRNAを、商業的に入手できるDNAまたはRNA単離キット、例えばグラム陽性菌のためのNucleoSpin(登録商標)組織キットおよび支持プロトコル(Machery-Nagel, Dueren、ドイツ)、細菌からのゲノムDNAのためのNexttec(登録商標)キット(Nexttec GmbH Biotechnologie, Leverkusen、ドイツ)、DNA精製のための電磁ビーズ(Merck MilliporeによるMilliPrep(登録商標)キット)、QIAampDNAミニキット(Qiagen)またはRNeasy Protect Bacteria Mini kit (Qiagen)を使用する増幅に適している形態で提供する

効果

実績

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請求項1

哺乳動物細胞を含む試料から微生物を単離する方法であって、a)試料をBenzonase(登録商標)Nucleaseを含む溶解緩衝液と接触させること、b)哺乳動物細胞を除去することにより微生物を得ることを含む、前記方法。

請求項2

哺乳動物細胞を含む試料から微生物を単離し、検出する方法であって、a)試料をBenzonase(登録商標)Nucleaseを含む溶解緩衝液と接触させること、b)哺乳動物細胞を除去することにより微生物を得ること、c)微生物に対してユニバーサルな溶解を行うこと、d)微生物を検出するための特定的な、またはユニバーサルな検出方法を行うことを含む、前記方法。

請求項3

試料がバイオリアクター試料であることを特徴とする、請求項1または2に記載の方法。

請求項4

哺乳動物細胞の試料中の量が、少なくとも106細胞であることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。

請求項5

試料の容積が少なくとも5mlであることを特徴とする、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。

請求項6

溶解緩衝液がBenzonase(登録商標)Nucleaseを試料当たり2.5U〜175Uの濃度において含むことを特徴とする、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。

請求項7

哺乳動物細胞が、懸濁培養中で成長する細胞、マイクロキャリア上で成長する細胞および/またはハイブリドーマ細胞系からなる群から選択されることを特徴とする、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。

請求項8

哺乳動物細胞が、CRL−8018細胞、CF−10H5細胞、CHO細胞、NSO細胞、Sp2/0細胞、HT−1080細胞、MDCK細胞HeLa細胞またはベロ細胞の群から選択されることを特徴とする、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。

請求項9

微生物が、細菌、酵母菌類および/またはそれらの組み合わせであることを特徴とする、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。

請求項10

テップb)において遠心分離を使用することを特徴とする、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。

請求項11

ステップc)において超音波処理を使用することを特徴とする、請求項2〜10のいずれか一項に記載の方法。

請求項12

ステップd)においてPCR、好ましくはリアルタイムPCRを使用することを特徴とする、請求項2〜11のいずれか一項に記載の方法。

請求項13

以下の成分を含む、溶解緩衝液:−0.05〜0.5重量%のSDS−0.5M〜4Mの尿素−0.5mM〜10mMのMgCl2−2.5〜175UのBenzonase(登録商標)Nuclease −PBS1X〜PBSX1/8。

請求項14

請求項13に記載の溶解緩衝液の、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法における使用。

技術分野

0001

本発明は、哺乳動物細胞を含む試料から微生物を単離し、任意に検出する方法であって、Benzonase(登録商標)Nucleaseを含む溶解緩衝液の使用を含む、前記方法に関する。本発明はさらに、Benzonase(登録商標)Nucleaseを含む溶解緩衝液およびその使用に関する。

背景技術

0002

微生物のバイオバーデンモニタリングおよび適時の結果は、バイオリアクターから来る組換えタンパク質または他の生物工学的生成物生産の間の品質制御のために重大である。

0003

典型的に、バイオリアクター試料のバイオバーデンレベルは、膜ろ過および培養培地上でのその後のインキュベーションまたは乏しいプレーティングによって決定される。バイオリアクター試料の微粒子含量により、特に高いレベルの哺乳動物細胞がバイオリアクター中に存在する場合、少量の試料のみをろ過することができ(1ml〜2mlまたはさらに少量)、各試料の代表的な容積試験することができるために多数のろ過ステップが必要である。

0004

この方法を、哺乳動物細胞および微生物を分離するための分画遠心ステップを加えることにより改善することができる。この場合において、微生物を含む上清を、薄膜上でろ過し、培養培地上でインキュベートする。この方法の欠点は、哺乳動物細胞で捕獲されるかまたはそれに固着し得る数種の汚染物質損失の可能性である。

0005

診断目的のために、高い試料容積が、低レベル汚染を検出することができるために必要である。不満足膜ろ過性の結果、臨床的試料の真核細胞を、含まれる微生物を溶解せずに差別的に溶解することができる溶解緩衝液の開発がもたらされた。溶解緩衝液処理の後、試料をろ過し、膜を培養培地上でインキュベートする。ある場合において、分子法を、微生物のより迅速な検出のために使用する。この場合において、特定の処理を、真核細胞の溶解の後に適用して、検出方法干渉し得る高い含量の真核生物DNAを除去する必要がある。後続のステップにおいて、微生物を溶解して、それらのDNAを放出させる。このDNAを精製し、次に分子法、例えばPCRまたはリアルタイムPCRによって検出する。すべてのこれらのステップの組み合わせは、多大な時間を必要とし、多くの手動の取り扱いステップのため骨の折れるものである。

0006

最先端技術において、哺乳動物細胞を選択的に溶解することにより哺乳動物細胞試料の微生物汚染を単離し、検出するための溶液が、記載されている。これらの刊行物は、臨床的試料、例えば体液、特に血液における微生物汚染の検出に関する。
例えば、WO 2009/015484 A1には、微生物および微生物核酸を血液から、血液細胞を選択的に溶解し、その間微生物細胞サポニン配合物を使用して保護することにより単離し、検出するための迅速な方法が開示されている。

0007

WO 2011/070507 A1において、試料中の血液細胞の選択的な溶解は、非イオン性洗浄剤中の試料をアルカリ性条件下でインキュベートすることにより達成される。
US 2008/0131955 A1には、哺乳動物細胞を選択的に溶解するステップを含む、標的DNAを体液試料中の混合DNAから分離する方法が記載されている。
EP 0745849 A2には、赤血球を選択的に溶解する、試料中に存在し得る微生物の核酸分析のための全血を処理する方法が開示されている。

0008

しかしながら、大量の複雑なバイオリアクター試料および高い細胞密度によって、尚微生物汚染の検出に関して難題がもたらされている。本発明の目的は、したがって、哺乳動物細胞を含む複雑な試料中の微生物汚染を単離し、かつ/または検出する方法の開発であった。

0009

第1の観点において、本発明は、哺乳動物細胞を含む試料から微生物を単離する方法であって、
a)試料をBenzonase(登録商標)Nucleaseを含む溶解緩衝液と接触させること、
b)哺乳動物細胞を除去することにより微生物を得ること
を含む、前記方法に関する。

0010

第2の観点において、本発明は、哺乳動物細胞を含む試料から微生物を単離し、検出する方法であって、
a)試料をBenzonase(登録商標)Nucleaseを含む溶解緩衝液と接触させること、
b)哺乳動物細胞を除去することにより微生物を得ること、
c)微生物に対してユニバーサルな溶解を行うこと、
d)微生物を検出するための特定的な、またはユニバーサルな検出方法を行うこと
を含む、前記方法に関する。

0011

本発明による方法は、いくつかの利点を提供する:
− 大量の試料(50mlまで;20分未満における細菌の単離)の迅速な分析、
− 高い量の哺乳動物細胞(合計5*108までの細胞)の試料中での良好な感受性を伴う微生物の検出、
− 単純であり、限定された手動操作

0012

哺乳動物細胞を含む試料は、微生物の存在および/または成長が疑われるか、または疑われ得るあらゆる臨床的な、または非臨床的な試料、ならびに微生物の存在について常習的に、または時々試験される材料の試料であり得る。試料は、新鮮な、または凍結された試料であり得る。好ましい態様において、試料は、バイオリアクター試料である。

0013

あらゆる種類のバイオリアクターを、本発明の観点において考慮することができる。
試料を、バイオリアクターから、当業者に知られている任意の方法によって、例えば少量の細胞培養物容器中に移送することによって得ることができる。容器は、方法に適している任意のチューブまたは反応容器であってもよい。

0014

典型的には、哺乳動物細胞の試料中の量は、少なくとも106細胞である。好ましい態様において、哺乳動物細胞の試料中の量は、少なくとも107細胞である。
全哺乳動物細胞の試料中の量についての典型的な範囲は、106細胞〜5*108細胞、例えば約107細胞、5*107細胞または108細胞である。

0015

利用される試料の量は、方法の多用途性および感受性により大幅に変化し得る。適切な容積は、試料の源および微生物の試料中の予期されるレベルに依存するだろう。本発明による方法は、より小さな、およびより大きな試料容積に適している。

0016

本発明の好ましい態様において、分析するべき試料の容積は、少なくとも5mlである。より好ましくは、試料の容積は、5〜50ml、好ましくは5〜30mlの範囲内である。本発明の利点は、大容積の試料さえも高い感受性で分析することができるという事実である。本発明のさらなる態様において、容積試料は、少なくとも10mlまたは少なくとも20mlである。

0017

本発明による方法の第1のステップにおいて、試料を、Benzonase(登録商標)Nucleaseを含む溶解緩衝液と接触させる。

0018

Benzonase(登録商標)Nucleaseは、すべての形態のDNAおよびRNAを非特異的に分解する、Serratia marcescensからの遺伝子改変エンドヌクレアーゼである。酵素は、各々30kDaの2つのサブユニットからなる。Benzonase(登録商標)Nucleaseは、Merck Milliporeから商業的に入手できる(品物番号70664−3、71206−3)。

0019

溶解緩衝液効率は、試料の細胞量に関連する。溶解緩衝液は、したがって典型的に、Benzonase(登録商標)Nucleaseを試料当たり2.5U〜175Uの濃度で含む(試料への添加後の最終濃度に関して)。好ましくは、濃度は、2.5〜100U、より好ましくは2.5〜50Uおよび最も好ましくは10〜30Uである。Benzonase(登録商標)Nucleaseの極めて好ましい濃度は、約22.5Uである。1U(単位)のBenzonase(登録商標)Nucleaseを、30分において1.0のΔA260をもたらす酵素の量として定義し、それは、37μgのDNAの完全な消化に相当する。

0020

細胞溶解のために使用する溶解緩衝液の所要の成分は、試料中の溶解するべき哺乳動物細胞のタイプに依存する。Benzonase(登録商標)Nucleaseに加えて、溶解緩衝液の典型的なさらなる成分は、例えばPBSリン酸緩衝生理食塩水;PBS 1X:137mMのNaCl、10mMのリン酸塩、2.7mlのKCl、pH7.4)、SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)、尿素、MgCl2である。

0021

代替の態様において、SDSを、同様の物質、例えばドデシル硫酸リチウムによって置き換えることができる。
本発明の好ましい態様において、緩衝液は、トリスHCl、EDTA、EGTA、トリトンXおよび/またはNP 40を含まない。かかる緩衝液は、細菌、酵母およびカビ破壊が回避されるので、有利である。

0022

本発明の1つの態様において、溶解緩衝液は、以下の成分を含み、ここですべての濃度は、試料への添加の後の最終濃度を指す:
− 0.05〜0.5重量%、好ましくは0.5%のSDS、
− 0.5M〜4M、好ましくは0.5Mの尿素、
− 0.5mM〜10mM、好ましくは2mMのMgCl2、
− 2.5〜175U、好ましくは22.5UのBenzonase(登録商標)Nuclease、
−PBS1X〜PBS 1/8X、好ましくは1/8X。

0023

溶解緩衝液の調製は、当業者に一般的である。典型的には、成分を溶解し、混合する。酵素を有しない緩衝液を、典型的にはその使用の前にろ過および/または加熱する。酵素を、次に第2のステップにおいて加える。

0024

試料の哺乳動物細胞は、典型的には懸濁培養において、つまり表面に付着させずに成長する細胞である。かかる細胞は、懸濁液、例えば血液細胞中に天然生存する細胞、または懸濁培養中で高密度において生存することができるように修正された細胞であり得る。あるいはまた、マイクロキャリア上で成長する細胞系を、使用することができる。

0025

明細書中で使用する用語「哺乳動物細胞」は、ヒト、非ヒト霊長類畜牛ヒツジヤギブタウマネコイヌウサギ、げっ歯動物(例えばラットまたはマウス)などを含むが、これらに限定されない哺乳動物対象由来する任意の細胞を指す。

0026

本発明に従って使用することができる哺乳動物細胞系の例は、ハイブリドーマ細胞系:例えばCRL−8018、CF−10H5および多くの他の細胞タイプ:例えばCHO(チャイニーズハムスター卵巣)細胞、NSO細胞(マウス骨髄腫細胞系)、Sp2/0細胞(マウス骨髄腫細胞系)、HT−1080細胞(線維肉腫細胞系)、MDCK(メイディンダービーイヌ腎臓)、HeLa(ヒト上皮細胞)またはベロ(腎臓上皮細胞)である。

0027

分析するべき試料は、微生物を含むか、または含むことが疑われる。微生物は、バイオリアクター培地中に、および/または哺乳動物細胞(宿主細胞)中に内生的に存在し得る。本発明の方法に従って単離および/または検出される微生物は、細菌、酵母、菌類および/またはそれらの組み合わせであってもよい。微生物は、好気性および/または嫌気性であってもよい。本発明の微生物は、Acinetobacter属、Bacteroides属、Burkholderia属、Capnocytophaga属、Clostridium属、Corynebacterium属、Citrobacter属、Enterobacter属、Enterococcus属、Escherichia属、Haemophilus属、Klebsiella属、Proteus属、Pseudomonas属、Salmonella属、Serratia属、Staphylococcus属、Stenotrophomona属、Streptococcus属、Saccharomyces属、Zygosaccharomyces属、Penicillium属、Aspergillus属および/またはCandida属を含むが、それらには限定されない。

0028

例示的な微生物は、Escherichia coli、Enterococcus faecalis、Salmonella enterica、Staphylococcus aureus、Staphylococcus epidermidis、Pseudomonas aerugionosaであってもよい。酵母の例は、Candida albicans、Saccharomyces cerevisiae、Zygosaccharomyces bailii、Dekkera anomalaである。菌類の例は、Aspergillus brasiliensis、Penicillium chrysogenumである。

0029

ステップa)において、試料を、Benzonase(登録商標)Nucleaseを含む溶解緩衝液と接触させる。当該容積の溶解緩衝液を、試料に、1つまたはいくつかのステップにおいて加えることができる。同様に、溶解緩衝液の成分を1つまたはいくつかのステップにおいて試料に加えることが、可能である。例えば、Benzonase(登録商標)Nucleaseを、第1のステップにおいて加え、続いて残りの溶解緩衝液成分を第2のステップにおいて加えてもよい。

0030

典型的に、試料を溶解緩衝液と接触させた後に、試料を、例えば容器を数回逆転させ、かつ/または容器をボルテックスすることによって均質化するかまたは混合する。さらに、撹拌を伴わないインキュベーションステップを、例えば2〜10分間、好ましくは約5分行うことができる。

0031

本発明による方法のステップb)において、微生物は、哺乳動物細胞を除去することにより得られる。このステップは、いくつかの洗浄および濃縮ステップを含んでもよい。濃縮方法は、例えば遠心分離、ろ過、表面結合および/または磁気的捕獲を含んでもよい。

0032

好ましい態様において、微生物を採集するために、哺乳動物細胞を、例えば10000〜20000g、好ましくは15000gで、5〜15分、好ましくは約8分間の遠心分離によって除去する。次のステップにおいて、上清を、例えばピペットを使用することによって、またはデカントステップによって除去する。残りのペレットペレットは、微生物を含む。

0033

任意に、洗浄ステップを、試料のタイプに依存して後続させてもよい。典型的には、好適な洗浄緩衝液(例えばトリス)を、好適な量(例えば5〜20ml)において加える。試料を次に遠心分離し、上清をペレットから除去する。
本発明において、ステップb)の後に単離した微生物を、任意に2つの追加のステップc)およびd)において検出してもよい:

0034

ステップc)において、ユニバーサルな溶解を、それらの核酸を抽出し、かつ/または精製するために微生物に対して行う。当該分野において知られている様々な方法を使用して、DNAを抽出してもよく、例えばSambrook et al. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.に開示されている方法である。細胞溶解を、標準的な方法によって、例えば酵素的方法、ビーズ方法、超音波処理洗浄剤方法またはそれらの組み合わせによって遂行してもよい。

0035

酵素的細胞溶解に適している酵素は、例えばリゾチームリソスタフィン、ザイモラーゼ(zymolase)、ムタノリシン(mutanolysin)、グリカナーゼプロテアーゼである。
細胞破壊に適しているビーズは、ガラスセラミックスジルコニウムまたは鋼製である。ビーズの細胞への添加の後、混合物の撹拌または振盪によるかきまぜを、適用する。かきまぜを、例えば一般的な研究室ボルテックスミキサーによって、または特別に設計されたクランプにおいて適用することができる。

0036

洗浄剤に基づいた細胞溶解の結果、細胞を包囲する脂質関門の破壊がもたらされる。好適な洗浄剤を、非イオン性両性イオン性およびイオン性洗浄剤、例えばCHAPS、Triton(登録商標)XまたはTWEEN(登録商標)から選択してもよい。
好ましくは、イオン性洗浄剤を使用する。好適なイオン性洗浄剤についての例は、SDSである。

0037

洗浄剤の選択に加えて、最適な細胞溶解についての他の重要な検討事項は、緩衝液、pH、イオン強度および温度を含む:
溶菌液は、典型的には、5より高く9より低い、好ましくは6より高く8より低い、より好ましくは6.5〜7.5のpH値を有する。

0038

使用してもよい緩衝液は、好ましくはリン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水緩衝液(PBS)、2−アミノ−2−ヒドロキシメチル−1,3−プロパンジオール(トリス)緩衝液、トリス緩衝生理食塩水緩衝液(TBS)およびトリス/EDTA(TE)の群から選択される。

0039

任意に、1種または2種以上のキレート試薬を、溶菌液に加えて、2価のカチオンを隔離することができる。好適なキレート剤は、例えばEDTA(エチレンジアミン四酢酸、EGTA(エチレングリコール四酢酸)またはエチレンジアミンである。好ましくは、EDTAを使用する。

0040

本発明の好ましい態様において、溶解を、機械的に、特に好ましくは超音波処理によって行う。超音波処理の前に、ペレットを、典型的には、上に記載したように再懸濁させ、かつ/または好適な緩衝液で洗浄する。

0041

超音波処理を、一般に試料に対する超音波適用(典型的に20〜50kHz)を伴うソニケーター中で達成する。細胞溶解に適しているあらゆるソニケーターを、本発明に従って使用することができ、それは、試料と直接接触するプローブを備えたソニケーター、および力を試料に外部的に適用するソニケーターを含む。好ましくは、外部適用を伴うソニケーターを、試料汚染を回避するために使用する。例として、未公表のEP 13290200.8に開示されているソニケーターを、使用することができる。本発明に従って使用することができるさらなるソニケーターは、商業的に入手でき、例えばVialTweeter (Hielscher)またはBioruptor(登録商標)Picoである。
超音波処理のための典型的なパラメーターは、当業者によって容易に選択され得る。

0042

溶解方法に依存して、遠心分離ステップが後続してもよい:溶解を機械的に、例えば超音波処理によって行う場合、遠心分離は、溶解物をチューブの底で採集するために必要である。ビーズを溶解のために使用する場合、遠心分離ステップはまた、ビーズをチューブの底で採集し、それらを溶解物から分離するために必要である。当業者は、遠心分離のためのパラメーターを容易に決定することができる。典型的には、遠心分離を、Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Yに開示されているように行う。
遠心分離ステップは、溶解を化学的に、例えば酵素を使用することによって行う場合には必要ではない。

0043

細胞溶解の後、核酸(DNA、RNA)を、アルコール、好ましくはエタノールまたはイソプロパノールを加えることにより沈殿させてもよい。さらに、DNAまたはRNAを、商業的に入手できるDNAまたはRNA単離キット、例えばグラム陽性菌のためのNucleoSpin(登録商標)組織キットおよび支持プロトコル(Machery-Nagel, Dueren、ドイツ)、細菌からのゲノムDNAのためのNexttec(登録商標)キット(Nexttec GmbH Biotechnologie, Leverkusen、ドイツ)、DNA精製のための電磁ビーズ(Merck MilliporeによるMilliPrep(登録商標)キット)、QIAampDNAミニキット(Qiagen)またはRNeasy Protect Bacteria Mini kit (Qiagen)を使用する増幅に適している形態で提供することができる。

0044

ステップd)において、特定の、またはユニバーサルな検出方法を、微生物を検出するために行う。検出方法は、例えば微生物の核酸を増幅することおよび核酸を検出することを含んでもよい。核酸配列の増幅を、当該分野において知られている任意のin vitro核酸増幅手法によって遂行してもよい。かかる手法は、温度サイクルを必要とする方法(例えばPCR、リアルタイムPCR、逆転写PCR、リガーゼ連鎖反応転写に基づいた増幅)、および/または等温増幅系を含んでもよい。

0045

本発明の好ましい態様において、微生物の核酸の増幅を、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)および/またはその任意の変形によって行う。

0046

好ましくは、リアルタイムPCR(rtPCRまたはqPCR)を、適用する。リアルタイムPCRは、PCRの各サイクル中に生成した生成物を検出し、測定するための方法であり、それは、PCRの開始前鋳型核酸の量に比例する。得られた情報、例えば増幅曲線を使用して、鋳型核酸配列初期量を定量することができる。

0047

検出は、好ましくは、設定した温度でのすべてのサイクルでの蛍光をモニタリングすることに基づく。蛍光を、通常光学的デバイスを使用してモニタリングして、試料中に存在する特定の蛍光染料についての特定の励起および発光波長でのデータを採集する。試料からの蛍光が背景の上の蛍光の検出についてのしきい値と交差するサイクルは、サイクルしきい値、Ctと称され、出発鋳型の定量を可能にする。

0048

PCR条件は、特定的に限定されないが、最適な条件を、各PCR装置について選択してもよい。例えば、以下の条件を使用してもよい:
二本鎖DNA一本鎖DNAへの熱変性:加熱を、一般に約90〜98℃で、好ましくは約92〜96℃で、一般に約3秒〜1分間、好ましくは約30秒〜1分間行う。
アニーリング:加熱を、一般に約40〜70℃で、好ましくは55〜65℃で、一般に約5秒〜2分、好ましくは約30秒〜90秒間行う。

0049

− DNA伸長反応:加熱を、一般に約60〜75℃で、好ましくは約70〜74℃で、一般に約10秒〜3分間、好ましくは約30秒〜2分間行う。
反応液体中のMgイオン濃度:一般に約1〜5mM、好ましくは約1.5〜3.5mM。

0050

この反応を、典型的には約20〜50サイクルにおいて、好ましくは約45サイクルにおいて行い、それによって標的DNAを、検出可能なレベルに増幅することができる。
リアルタイム逆転写PCRの場合において、追加のステップを、逆転写酵素の結果RNAをDNAに転写し、したがってRNA分子のPCR分析を可能にするために、古典的PCR条件の前に行う。

0051

あらゆる商業的なPCR装置を、使用することができる。増幅を、プライマーおよび/または少なくとも1種の微生物の核酸への特異的結合が可能なものから選択され得るプライマーのコレクションを使用して行ってもよい。一般に、用語「プライマー」は、標的核酸らせんに沿った区分相補的である短い核酸分子、例えば長さが9つのヌクレオチドまたはそれ以上のDNAオリゴヌクレオチドを指し、ここでプライマーの目的は、らせんに沿ったより長い核酸の核酸複製を開始することである。好適なプライマーは、当業者によって容易に同定され得る。

0052

微生物の増幅された核酸を、増幅された核酸に特異的に結合する(ハイブリッド形成する)ことができるプローブおよび/またはプローブのコレクションをハイブリッド形成することにより検出してもよい。
本発明において、用語「ハイブリッド形成する」は、検出可能に、かつ特異的に結合することを意味する。ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよびそれらの断片は、非特異性核酸への相当な量の検出可能な結合を最小化するハイブリッド形成条件の下で、核酸鎖に選択的にハイブリッド形成する。

0053

典型的にリアルタイムPCRに使用する蛍光標識したプローブは、例えば LightCycler(ハイブリッド形成)プローブ、分子指標または加水分解プローブ(またTaqMan(登録商標)プローブと称される)である。
LightCyclerプローブは、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)の手法を利用する。この方法のために、それぞれFRET供与体およびFRET受容体に結合する2種の異なるオリゴヌクレオチドプローブを、各標的配列のために使用する。これらのプローブは、標的配列に並んで結合し、フルオロフォア近接させる。

0054

分子指標(Tyagi et al., Nat. Biotechnol. 14:303-8, 1996)は、レポーターフルオロフォアおよびクエンチャーに結合するオリゴヌクレオチドプローブである。5’末端上のヌクレオチドは、3’末端上のヌクレオチドに相補的であり、ステムループ構造を形成する。フルオロフォアおよびクエンチャーの近接のために、蛍光は観察されない。プローブの標的配列とのリアルタイムPCRの間のハイブリッド形成によって、レポーター−クエンチャー距離の増大がもたらされ、レポーターの蛍光がもたらされる。

0055

好ましくは、加水分解プローブ(TaqMan(登録商標)プローブ)を、使用する(Lee et al., Nucleic AcidsRes. 21:3761-6, 1993)。これらのプローブは、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)の手法を同様に利用する。プローブは、一方の末端で蛍光レポーターを、および対向する末端で蛍光のクエンチャーを示す。レポーターのクエンチャーへの密接な近接のために、レポーター蛍光の検出は、抑制される。PCRのアニーリング段階中に、プライマーおよびプローブの両方を、DNA標的アニールする。新たなDNA鎖重合によって、ポリメラーゼの5’−3’エキソヌクレアーゼ活性によるプローブの分解および蛍光レポーターのクエンチャーからの物理的な分離がもたらされ、蛍光の増大がもたらされる。蛍光を、リアルタイムPCRサーモサイクラー(thermocycler)において検出し、測定することができ、生成物の指数関数的な増大に相当するその幾何学的な増大を使用して、各反応におけるしきい値サイクル(Ct)を決定する(以下を参照)。

0056

例示的なレポーターは、以下のものを含むが、それらには限定されない:6−カルボキシフルオレセイン;カルボキシフルオレセイン(FAM);ホウ素ジピロメテンジフオリドBODIPY);アクリジンスチルベン、6−カルボキシフルオレセインHEX)、TET(テトラメチルフルオレセイン)、6−カルボキシ−X−ローダミン(ROX)、ローダミン−6G、テキサスレッド、2’,7’−ジメトキシ−4’,5’−ジクロロ−6−カルボキシフルオレセイン(JOE)、Cy(登録商標)3、Cy(登録商標)5、VIC(登録商標)(Applied Biosystems)、LCレッド640、LCレッド705、テキサスレッド、Yakima Yellow(登録商標)およびそれらの誘導体

0057

例示的なクエンチャーは、Black Hole Quenchers (WO 01/86001 A1)、例えばBHQ1(商標)およびBHQ2(商標)、MGB(Minor-groove-binder、EP 0819133 B1)、N、N、N’,N’−テトラメチル−6−カルボキシローダミン(TAMRA)、Eclipse(登録商標)Dark Quencher、DABCYL、DABSYL、DDQ IおよびDDQ IIを含むが、それらには限定されない。

0058

当業者は、好適なレポーター−クエンチャーの組み合わせを容易に選択することができる。典型的には、クエンチャーの吸収スペクトルは、最適なクエンチングを可能にするためにレポーターの発光スペクトルとの良好な重複を有する必要がある。

0059

発生した蛍光信号を、次に定性的に、かつ/または定量的に分析してもよい。検出は、好ましくは、蛍光をすべてのサイクルで設定した温度でモニタリングすることに基づく。蛍光を、通常光学的デバイスを使用してモニタリングして、試料中に存在する特定のフルオロフォアについての特定の励起および発光波長でのデータを収集する。

0060

本発明は、哺乳動物細胞の試料中の微生物の単離および任意に検出についての高い感受性を提供する。この方法の特定の利点は、検出の感受性が、極めて高い量の哺乳動物細胞の試料を分析するべきである場合(50mlまでの試料中で合計で5*108までの細胞)、および/または試料がいかなる微生物汚染をもほとんど含まない場合においても付与されることである。方法は、極めて迅速であり、単純である:微生物を、20分未満においてわずかな手動操作を伴うのみで単離することができる。全体の試料調製を、1時間未満において行うことができる。本発明の方法は、qPCR感受性に影響せずに新鮮な、および凍結された試料に対して作動し、一方最先端技術による多くの方法は、凍結された試料に対して貧弱な性能を示す。

0061

本発明のさらなる観点は、以下の成分を含む溶解緩衝液に言及する:
− SDS
−尿素
− MgCl2
− Benzonase(登録商標)Nuclease
−PBS。

0062

好ましい態様において、溶解緩衝液の成分を、溶解緩衝液の試料への添加の後のそれらの最終濃度が以下の通りであるように調節する:
− 0.05〜0.5重量%のSDS
− 0.5M〜4Mの尿素
− 0.5mM〜10mMのMgCl2
− 2.5〜175UのBenzonase(登録商標)Nuclease
−PBS1X〜PBSX1/8。

0063

より好ましい態様において、成分の最終濃度は、以下のとおりである:
− 0.5%のSDS、
− 0.5Mの尿素、
− 2mMのMgCl2、
− 22.5UのBenzonase(登録商標)Nuclease、
−PBS1/8X。

0064

1つの態様において、予め混合した溶解緩衝液は、以下の成分を含んでもよい(濃度は試料への添加前の予め混合した溶解緩衝液に関する):
− 4%のSDS、
− 4Mの尿素、
− 16mMのMgCl2、
−PBS1X。
Benzonase(登録商標)Nucleaseを、試料に好適な量において別個に加えて、好ましくは22.5Uの最終的な使用濃度を得てもよい。

0065

さらなる観点において、本発明は、上に記載した溶解緩衝液の上に記載した方法における使用に関する。
以下の例は、本発明の実際の適用を記載する。

0066

例:
例1:マトリックス溶解プロトコル
種々の容積の哺乳動物細胞試料を、以下のプロトコルによって試験する:
微生物細胞の単離:
Xml(表1を参照)のCHO細胞試料を、50mlのCorningチューブ中に満たす。
試料を微生物で汚染させ、チューブを数回逆転させることにより均質化する。
22.5UのBenzonase(登録商標)Nuclease(Merck Milliporeから入手できる、品物番号70664−3または71206−3)を加え(この酵素を、十分な容積を加えるためにヌクレアーを含まない水で希釈しなければならない)、試料を、50mlのチューブを数回逆転させることにより均質化する。

0067

チューブを、Ymlの緩衝液(4Mの尿素、4%のSDS、16mMのMgCl2、x1PBS)で満たして、試料中で緩衝液の最終濃度を得る:0.5Mの尿素、0.5%のSDS、2mMのMgCl2、1/8 PBS(表1を参照)。試料を、チューブを数回逆転させることにより均質化し、かきまぜを伴わない室温での5分間のインキュベーションステップを後続させる。懸濁液中に何らかの粒子がある場合、粒子を溶解するための迅速なボルテックスステップを、適用する。試料を、15000gで8分間遠心分離する。上清を、ピペットで除去する。
10mlの10mMのトリス pH7を加え、試料をボルテックスする。

0068

微生物細胞の検出:
試料を、15000gで6分間遠心分離する。上清を除去する。500μlの緩衝液(1MのグアニジンHCl、5mMのトリス pH8(+0.5mMのEDTA)、10mMのEDTA、0.5%のNLS(N−ラウロイルサルコシンナトリウム塩溶液))を加え、試料をボルテックスする。
チューブを、3分間超音波処理する。
チューブを、3000gで1分間遠心分離し(任意)、核酸精製機器(Kingfisher(商標), ThermoScientific)中に移送する。
DNAを、マイコプラズマのためのMilliPrep電磁ビーズキット(Merck-Millipore、品物番号MPRPD048)でさらに精製する(50μl中への溶出)。

0069

0070

0071

例2:
以下の例は、極めて低い微生物汚染に関する方法の感受性を例示する。数種の微生物(表2を参照)を、高度に濃縮された新鮮なCHO細胞試料中に添加する(表2を参照)。微生物およびそれらのDNAを単離するために、例1のプロトコルに従う。その後、微生物を、特異的なリアルタイムPCR(25μl、SYBR(登録商標)Green Mastermix QuantiTect (Qiagen)で行う)を使用することにより検出する。
結果を、以下の表2に示す:

0072

0073

結果は、本発明の方法が、2〜3*108の新鮮なCHO細胞の存在下で55cfuまで細菌、酵母および菌類を検出することができることを示す。

0074

例3:
以下の例は、凍結されたCHO細胞の試料についての極めて低い微生物汚染に関する方法の感受性を例示する。数種の微生物(表3を参照)を、高度に濃縮された凍結されたCHO細胞試料中に添加する(表3を参照)。微生物およびそれらのDNAを単離するために、例1のプロトコルに従う。その後、微生物を、ユニバーサルな酵母およびカビリアルタイムPCR(25μl、TaqMan(登録商標)PCR (Biotecon))を使用することにより検出する。
結果を、以下の表3に示す:

0075

0076

結果は、本発明の方法が、3*108の凍結されたCHO細胞の存在下で28cfuまで酵母および菌類を検出することができることを示す。

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