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技術 ヒト中和抗KIT抗体及びその使用

出願人 アンスティチュナショナルドゥラサンテエドゥラルシェルシュメディカルサントル・ナショナル・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・シャンティフィクウニヴェルシテ・ドゥ・モンペリエユニヴェルシテ・パリ・シュドアンスティテュ・レジオナル・デュ・カンセール・ドゥ・モンペリエエコール・ノルマル・シュペリウール・ドゥ・カシャン
発明者 ポール,マリー−アリックスル・ガル,マリアンヌクレパン,ロナン
出願日 2014年11月5日 (5年1ヶ月経過) 出願番号 2016-551045
公開日 2016年11月24日 (3年0ヶ月経過) 公開番号 2016-536017
状態 特許登録済
技術分野 突然変異または遺伝子工学 微生物による化合物の製造 微生物、その培養処理 抗原、抗体含有医薬:生体内診断剤 化合物または医薬の治療活性 ペプチド又は蛋白質
主要キーワード インターフェイス領域 プレフォーミング クラスタ法 二次的効果 非マーク 機能効果 単一処理 モデュレーション
関連する未来課題
重要な関連分野

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図面 (9)

課題・解決手段

本発明は、ヒト中和KIT抗体及びその使用に関する。より具体的には、本発明は、H−CDR1領域に配列番号:2、H−CDR2領域に配列番号:3及びH−CDR3領域に配列番号:4を含む重鎖可変領域と、L−CDR1領域に配列番号:6、L−CDR2領域に配列番号:7及びL−CDR3領域に配列番号:8を含む軽鎖可変領域とを含む抗体に関する。本発明はまた、H−CDR1領域に配列番号:10、H−CDR2領域に配列番号:11及びH−CDR3領域に配列番号:12を含む重鎖可変領域と、L−CDR1領域に配列番号:14、L−CDR2領域に配列番号:15及びL−CDR3領域に配列番号:16を含む軽鎖可変領域とを含む抗体に関する。

概要

背景

発明の背景
KITは、成長因子レセプターとして機能する145kDのIII型チロシンキナーゼレセプターである。KITリガンドは、幹細胞因子(SCF)である(Roskoski 2005)。III型チロシンキナーゼレセプターは、細胞外領域における5つのN−グリコシル化イムノグロブリンドメインの存在と、スプリットチロシンキナーゼ細胞内ドメインとを特徴とする。最初の3つの細胞外ドメイン(D1〜3)は、SCFの結合に関与する一方(Lev, Blechman et al. 1993)、第4(D4)及び第5(D5)のドメインは、レセプターの二量体化とそれに続くSCFの結合に関係する(Blechman and Yarden 1995)。KITの細胞内領域は、ATP結合部位及びホスホトランスフェラーゼドメインから構成される触媒ドメインを含有する。SCFによるKIT刺激は、その二量体化及び自己リン酸化誘導すると、ホスホイノシチド3−キナーゼ(PI3K)/AKT、ホスホリパーゼCシグナル伝達転写因子(STAT)及びRASMAPキナーゼ経路を含む下流のエフェクタータンパク質活性化される(Roskoski 2005)。SCFは、における造血系生殖細胞メラノサイト、腸及び中枢神経系の自己再生、増殖及び分化の主なサイトカインである(Orr-Urtreger, et al. 1990)。成体マウスでは、KITは、限られた数の組織発現しており、KITの欠損は、造血障害組織肥満細胞の数の減少、受精及び色素形成の減少、並びにカハール介在細胞(これは、腸のペースメーカー活動に関与する)の発達不全を誘導する(総説については、Broudy 1997を参照のこと)。

ガンでは、SCF及び/若しくはKITそれ自体の過剰発現により、又はKITシグナル伝達をSCFから独立させる突然変異の活性化により、KITシグナル伝達の異常が観察される。カハール細胞に由来する消化管間質腫瘍GIST)(Demetri, von Mehren et al. 2002)、一部の急性骨髄性白血病コア結合因子急性骨髄性白血病CBF−AML)(Wang, Zhao et al. 2011)及びメラノーマ(Hodi, Corless et al. 2013)、並びにそれほど多くはないが他のガンでは、KITのこれらの突然変異が主な発ガンドライバである。したがって、これらの病状では、チロシンキナーゼ阻害剤による発ガン性KITの阻害成功が証明されている(総説については、Lennartsson and Ronnstrand 2012)。非突然変異KITはまた、一般に、胚形成中にKITを一過性発現した細胞型に由来する多数の悪性疾患に関与する(Bernex, De Sepulveda et al. 1996)。SCF/KIT軸は、ガン細胞の増殖及び/又は遊走支え自己分泌ループ又は傍分泌ループとして機能する。実際、KITは、AMLの50%に存在し(Ikeda, Kanakura et al. 1991)、AML芽球は、増殖の増加によるSCF刺激に高頻度応答する(Pietsch et al., 1992)。一貫して、化学療法難治性AML患者の症例は、TKIによって治癒され得る(Xiang, Kreisel et al. 2007)。また、小細胞ガン(SCLC)、メラノーマ、セミノーマを含む多数の固形腫瘍が、KIT及び/又はSCFを高頻度で発現する(Went, Dirnhofer et al. 2004)。典型的には、SCLCの70%が、SCF及びKITを同時発現し(Hibi, Takahashi et al. 1991; Rygaard, Nakamura et al. 1993; Krystal, Hines et al. 1996)、高いKITレベルが予後不良に関連する一方(Micke, Basrai et al. 2003)、KITキナーゼ阻害剤イマチニブは、in vitroでガン細胞増殖を減少させ(Krystal, Honsawek et al. 2000)、SCF依存性VEGF分泌を減少させる(Litz and Krystal 2006)。小細胞肺ガン(NSCLC)もまた、KITを高頻度で発現し(Yoo, Kim et al. 2004)、興味深いことに、イマチニブ又はSCF遮断mAbは、NSCLCガン幹細胞亜集団壊滅する(Levina, Marrangoni et al. 2010)。乳ガン(Hines et al., 1995)、神経芽細胞腫(Cohen et al., 1994)、結腸ガン(Toyota et al., 1994)、婦人科腫瘍(Inoue et al., 1994)及び神経膠腫(Stanulla et al., 1995)を含む他の固形腫瘍は、KITを発現すると報告されている。

KITの薬理学的阻害は、KITレセプターの活性に部分的又は完全に依存する悪性腫瘍処置するための潜在的なアプローチである。イマチニブ(Heinrich, Griffith et al. 2000)又はダサチニブ(Schittenhelm, Aichele et al. 2003)のようなATP競合チロシンキナーゼ阻害剤は、KITリン酸化を阻害し、細胞の成長又は生存を妨げる。残念なことに、臨床では、活性化ループに位置する多数のKIT突然変異がイマチニブ耐性を示し(Zermati, De Sepulveda et al. 2003; Ma, Mali et al. 2012)、病初では、イマチニブ感受性調節突然変異体は、患者の処置耐性につながる二次突然変異蓄積する(Antonescu, Besmer et al. 2005)。

モノクローナル抗体(mAb)(Adams and Weiner 2005)は、それらの高い特異性及び高い結合親和性と、免疫エフェクターリクルートするそれらの自然能力により、発ガン性KITをターゲティングする魅力的なアプローチを提供する。したがって、最近、抗KITmAb(SR−1、国際特許出願第92/17505号に最初に開示された)は、マウスGISTモデルにおいて、マクロファージ依存性機構によって腫瘍進行を制限すると報告されており(Edris, Willingham et al. 2013)、放射性標識抗KIT抗体(12A8mAb)は、マウスモデルにおいて、SCLC進行を減少させることが示された(Yoshida, Tsuji et al. 2013)。抗体SR1は、KITに対するSCF結合を阻害することが示されており、SCFは、KITに対するSR1結合を阻害する(Ashman, Buhring, et al. 1994)。加えて、KITのドメイン4をターゲティングするモノクローナル抗体は、KITの活性化に必須の同型D4相互作用を阻害することによって、KIT依存性細胞成長を中和すると記載されている(Reshetnyak, Nelson et al. 2013)。

最近、ヒトc−KITの細胞外ドメイン(ECD)を特異的にターゲティングするモノクローナル抗体が開示された(国際特許出願第2012/154480号)。ヒトc−KITのECDを特異的にターゲティングするこれらのモノクローナル抗体(CK6抗体を含む)は、腫瘍細胞におけるc−KITアゴニスト活性を誘導せずに、原形質膜に結合したc−KITのインターナリゼーション及び/又は分解を誘導することができると示されている。しかしながら、抗c−KITmAb CK6が、GIST882ヒト腫瘍細胞によって発現される、Mo7eヒト腫瘍細胞によって発現される、及びMalm−3Mヒト腫瘍細胞によって発現されるc−KITの分解を時間依存的に有意に誘導することは観察されていないので、前記特許出願に開示されている結果はこの主張と矛盾している。

したがって、これまでに、発ガン型KITのインターナリゼーション及び分解を誘導することができるモノクローナル抗体は記載されていない。また、KITのD5に結合する中和抗体も、まだ記載されていない。

概要

本発明は、ヒト中和抗KIT抗体及びその使用に関する。より具体的には、本発明は、H−CDR1領域に配列番号:2、H−CDR2領域に配列番号:3及びH−CDR3領域に配列番号:4を含む重鎖可変領域と、L−CDR1領域に配列番号:6、L−CDR2領域に配列番号:7及びL−CDR3領域に配列番号:8を含む軽鎖可変領域とを含む抗体に関する。本発明はまた、H−CDR1領域に配列番号:10、H−CDR2領域に配列番号:11及びH−CDR3領域に配列番号:12を含む重鎖可変領域と、L−CDR1領域に配列番号:14、L−CDR2領域に配列番号:15及びL−CDR3領域に配列番号:16を含む軽鎖可変領域とを含む抗体に関する。

目的

モノクローナル抗体(mAb)(Adams and Weiner 2005)は、それらの高い特異性及び高い結合親和性と、免疫エフェクターをリクルートするそれらの自然能力により、発ガン性KITをターゲティングする魅力的なアプローチを提供する

効果

実績

技術文献被引用数
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牽制数
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請求項1

KITに結合する単離されたヒト中和抗体であって、KITのインターナリゼーションをさらに誘導し、発ガン型KITの分解のみを誘導する、単離されたヒト中和抗体。

請求項2

KITのドメインD5(配列番号:25)に特異的に結合する、請求項1に記載の抗体。

請求項3

H−CDR1領域に配列番号:2、H−CDR2領域に配列番号:3及びH−CDR3領域に配列番号:4を含む重鎖可変領域と、L−CDR1領域に配列番号:6、L−CDR2領域に配列番号:7及びL−CDR3領域に配列番号:8を含む軽鎖可変領域とを含む、請求項1又は2に記載の抗体。

請求項4

抗体の重鎖可変領域が、配列番号:1に記載されているアミノ酸配列を有する、請求項3に記載の抗体。

請求項5

軽鎖可変領域が、配列番号:5に記載されているアミノ酸配列を有する、請求項3に記載の抗体。

請求項6

抗体の重鎖可変領域が、配列番号:1に記載されているアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域が、配列番号:5に記載されているアミノ酸配列を有する、請求項4又は5に記載の抗体。

請求項7

H−CDR1領域に配列番号:10、H−CDR2領域に配列番号:11及びH−CDR3領域に配列番号:12を含む重鎖可変領域と、L−CDR1領域に配列番号:14、L−CDR2領域に配列番号:15及びL−CDR3領域に配列番号:16を含む軽鎖可変領域とを含む、請求項1又は2に記載の抗体。

請求項8

抗体の重鎖可変領域が、配列番号:9に記載されているアミノ酸配列を有する、請求項7に記載の抗体。

請求項9

軽鎖可変領域が、配列番号:13に記載されているアミノ酸配列を有する、請求項7に記載の抗体。

請求項10

抗体の重鎖可変領域が、配列番号:9に記載されているアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域が、配列番号:13に記載されているアミノ酸配列を有する、請求項8又は9に記載の抗体。

請求項11

H−CDR1領域に配列番号:2、H−CDR2領域に配列番号:3及びH−CDR3領域に配列番号:4を含む重鎖可変領域と、L−CDR1領域に配列番号:27、L−CDR2領域に配列番号:28及びL−CDR3領域に配列番号:29を含む軽鎖可変領域とを含む、請求項1又は2に記載の抗体。

請求項12

軽鎖可変領域が、配列番号:26に記載されているアミノ酸配列を有する、請求項11に記載の抗体。

請求項13

抗体の重鎖可変領域が、配列番号:1に記載されているアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域が、配列番号:26に記載されているアミノ酸配列を有する、請求項11又は12に記載の抗体。

請求項14

H−CDR1領域に配列番号:10、H−CDR2領域に配列番号:11及びH−CDR3領域に配列番号:12を含む重鎖可変領域と、L−CDR1領域に配列番号:31、L−CDR2領域に配列番号:32及びL−CDR3領域に配列番号:33を含む軽鎖可変領域とを含む、請求項1又は2に記載の抗体。

請求項15

軽鎖可変領域が、配列番号:30に記載されているアミノ酸配列を有する、請求項14に記載の抗体。

請求項16

抗体の重鎖可変領域が、配列番号:9に記載されているアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域が、配列番号:30に記載されているアミノ酸配列を有する、請求項14又は15に記載の抗体。

請求項17

Fv、Fab、F(ab’)2、Fab’、dsFv、scFv、sc(Fv)2及びダイアボディからなる群より選択される、請求項1〜16のいずれかに記載の抗体のフラグメント

請求項18

請求項1〜16のいずれかに記載の抗体の重鎖又は軽鎖をコードする、核酸配列

請求項19

請求項18に記載の核酸を含む、ベクター

請求項20

請求項18に記載の核酸又は請求項19に記載のベクターを含む、宿主細胞

請求項21

請求項1〜16のいずれかに記載の抗体又は請求項17に記載のそのフラグメントを含む、医薬組成物

請求項22

薬物として使用するための、請求項1〜16のいずれかに記載の抗体又は請求項17に記載のそのフラグメント。

請求項23

ガンを処置するのに使用するための、請求項1〜16のいずれかに記載の抗体又は請求項17に記載のそのフラグメント。

技術分野

0001

発明の分野:
本発明は、ヒト中和KIT抗体及びその使用に関する。

背景技術

0002

発明の背景
KITは、成長因子レセプターとして機能する145kDのIII型チロシンキナーゼレセプターである。KITリガンドは、幹細胞因子(SCF)である(Roskoski 2005)。III型チロシンキナーゼレセプターは、細胞外領域における5つのN−グリコシル化イムノグロブリンドメインの存在と、スプリットチロシンキナーゼ細胞内ドメインとを特徴とする。最初の3つの細胞外ドメイン(D1〜3)は、SCFの結合に関与する一方(Lev, Blechman et al. 1993)、第4(D4)及び第5(D5)のドメインは、レセプターの二量体化とそれに続くSCFの結合に関係する(Blechman and Yarden 1995)。KITの細胞内領域は、ATP結合部位及びホスホトランスフェラーゼドメインから構成される触媒ドメインを含有する。SCFによるKIT刺激は、その二量体化及び自己リン酸化誘導すると、ホスホイノシチド3−キナーゼ(PI3K)/AKT、ホスホリパーゼCシグナル伝達転写因子(STAT)及びRASMAPキナーゼ経路を含む下流のエフェクタータンパク質活性化される(Roskoski 2005)。SCFは、における造血系生殖細胞メラノサイト、腸及び中枢神経系の自己再生、増殖及び分化の主なサイトカインである(Orr-Urtreger, et al. 1990)。成体マウスでは、KITは、限られた数の組織発現しており、KITの欠損は、造血障害組織肥満細胞の数の減少、受精及び色素形成の減少、並びにカハール介在細胞(これは、腸のペースメーカー活動に関与する)の発達不全を誘導する(総説については、Broudy 1997を参照のこと)。

0003

ガンでは、SCF及び/若しくはKITそれ自体の過剰発現により、又はKITシグナル伝達をSCFから独立させる突然変異の活性化により、KITシグナル伝達の異常が観察される。カハール細胞に由来する消化管間質腫瘍GIST)(Demetri, von Mehren et al. 2002)、一部の急性骨髄性白血病コア結合因子急性骨髄性白血病CBF−AML)(Wang, Zhao et al. 2011)及びメラノーマ(Hodi, Corless et al. 2013)、並びにそれほど多くはないが他のガンでは、KITのこれらの突然変異が主な発ガンドライバである。したがって、これらの病状では、チロシンキナーゼ阻害剤による発ガン性KITの阻害成功が証明されている(総説については、Lennartsson and Ronnstrand 2012)。非突然変異KITはまた、一般に、胚形成中にKITを一過性発現した細胞型に由来する多数の悪性疾患に関与する(Bernex, De Sepulveda et al. 1996)。SCF/KIT軸は、ガン細胞の増殖及び/又は遊走支え自己分泌ループ又は傍分泌ループとして機能する。実際、KITは、AMLの50%に存在し(Ikeda, Kanakura et al. 1991)、AML芽球は、増殖の増加によるSCF刺激に高頻度応答する(Pietsch et al., 1992)。一貫して、化学療法難治性AML患者の症例は、TKIによって治癒され得る(Xiang, Kreisel et al. 2007)。また、小細胞ガン(SCLC)、メラノーマ、セミノーマを含む多数の固形腫瘍が、KIT及び/又はSCFを高頻度で発現する(Went, Dirnhofer et al. 2004)。典型的には、SCLCの70%が、SCF及びKITを同時発現し(Hibi, Takahashi et al. 1991; Rygaard, Nakamura et al. 1993; Krystal, Hines et al. 1996)、高いKITレベルが予後不良に関連する一方(Micke, Basrai et al. 2003)、KITキナーゼ阻害剤イマチニブは、in vitroでガン細胞増殖を減少させ(Krystal, Honsawek et al. 2000)、SCF依存性VEGF分泌を減少させる(Litz and Krystal 2006)。小細胞肺ガン(NSCLC)もまた、KITを高頻度で発現し(Yoo, Kim et al. 2004)、興味深いことに、イマチニブ又はSCF遮断mAbは、NSCLCガン幹細胞亜集団壊滅する(Levina, Marrangoni et al. 2010)。乳ガン(Hines et al., 1995)、神経芽細胞腫(Cohen et al., 1994)、結腸ガン(Toyota et al., 1994)、婦人科腫瘍(Inoue et al., 1994)及び神経膠腫(Stanulla et al., 1995)を含む他の固形腫瘍は、KITを発現すると報告されている。

0004

KITの薬理学的阻害は、KITレセプターの活性に部分的又は完全に依存する悪性腫瘍処置するための潜在的なアプローチである。イマチニブ(Heinrich, Griffith et al. 2000)又はダサチニブ(Schittenhelm, Aichele et al. 2003)のようなATP競合チロシンキナーゼ阻害剤は、KITリン酸化を阻害し、細胞の成長又は生存を妨げる。残念なことに、臨床では、活性化ループに位置する多数のKIT突然変異がイマチニブ耐性を示し(Zermati, De Sepulveda et al. 2003; Ma, Mali et al. 2012)、病初では、イマチニブ感受性調節突然変異体は、患者の処置耐性につながる二次突然変異蓄積する(Antonescu, Besmer et al. 2005)。

0005

モノクローナル抗体(mAb)(Adams and Weiner 2005)は、それらの高い特異性及び高い結合親和性と、免疫エフェクターリクルートするそれらの自然能力により、発ガン性KITをターゲティングする魅力的なアプローチを提供する。したがって、最近、抗KITmAb(SR−1、国際特許出願第92/17505号に最初に開示された)は、マウスGISTモデルにおいて、マクロファージ依存性機構によって腫瘍進行を制限すると報告されており(Edris, Willingham et al. 2013)、放射性標識抗KIT抗体(12A8mAb)は、マウスモデルにおいて、SCLC進行を減少させることが示された(Yoshida, Tsuji et al. 2013)。抗体SR1は、KITに対するSCF結合を阻害することが示されており、SCFは、KITに対するSR1結合を阻害する(Ashman, Buhring, et al. 1994)。加えて、KITのドメイン4をターゲティングするモノクローナル抗体は、KITの活性化に必須の同型D4相互作用を阻害することによって、KIT依存性細胞成長を中和すると記載されている(Reshetnyak, Nelson et al. 2013)。

0006

最近、ヒトc−KITの細胞外ドメイン(ECD)を特異的にターゲティングするモノクローナル抗体が開示された(国際特許出願第2012/154480号)。ヒトc−KITのECDを特異的にターゲティングするこれらのモノクローナル抗体(CK6抗体を含む)は、腫瘍細胞におけるc−KITアゴニスト活性を誘導せずに、原形質膜に結合したc−KITのインターナリゼーション及び/又は分解を誘導することができると示されている。しかしながら、抗c−KITmAb CK6が、GIST882ヒト腫瘍細胞によって発現される、Mo7eヒト腫瘍細胞によって発現される、及びMalm−3Mヒト腫瘍細胞によって発現されるc−KITの分解を時間依存的に有意に誘導することは観察されていないので、前記特許出願に開示されている結果はこの主張と矛盾している。

0007

したがって、これまでに、発ガン型KITのインターナリゼーション及び分解を誘導することができるモノクローナル抗体は記載されていない。また、KITのD5に結合する中和抗体も、まだ記載されていない。

0008

本発明は、KITに結合する単離されたヒト中和抗体であって、発ガン型KITのインターナリゼーション及び分解をさらに誘導する単離されたヒト中和抗体に関する。したがって本発明は、H−CDR1領域に配列番号:2、H−CDR2領域に配列番号:3及びH−CDR3領域に配列番号:4を含む重鎖可変領域と、L−CDR1領域に配列番号:6、L−CDR2領域に配列番号:7及びL−CDR3領域に配列番号:8を含む軽鎖可変領域とを含む抗体に関する。本発明はまた、H−CDR1領域に配列番号:10、H−CDR2領域に配列番号:11及びH−CDR3領域に配列番号:12を含む重鎖可変領域と、L−CDR1領域に配列番号:14、L−CDR2領域に配列番号:15及びL−CDR3領域に配列番号:16を含む軽鎖可変領域とを含む抗体に関する。本発明はまた、H−CDR1領域に配列番号:2、H−CDR2領域に配列番号:3及びH−CDR3領域に配列番号:4を含む重鎖可変領域と、L−CDR1領域に配列番号:27、L−CDR2領域に配列番号:28及びL−CDR3領域に配列番号:29を含む軽鎖可変領域とを含む抗体に関する。本発明はまた、H−CDR1領域に配列番号:10、H−CDR2領域に配列番号:11及びH−CDR3領域に配列番号:12を含む重鎖可変領域と、L−CDR1領域に配列番号:31、L−CDR2領域に配列番号:32及びL−CDR3領域に配列番号:33を含む軽鎖可変領域とを含む抗体に関する。

実施例

0009

発明の詳細な説明:
本発明は、SCF結合を妨げて、その結果として、SCF依存性KITリン酸化及び下流シグナル伝達を阻害した2つの中和scFv−Fcの作製及び特性評価に基づくものである。これらの抗体は、処置の3日後に、SCF依存性KIT野生型を発現する赤白血病細胞株UT−7の生存率を減少させたことから、これらの特性は機能的効果につながるものであった。

0010

興味深いことに、これらの抗KIT scFv−Fcはまた、KITの活性化突然変異を有する2つの肥満細胞白血病細胞株((V560G KIT活性化突然変異を有する)HMC1.1イマチニブ感受性細胞株及び(V560G/D816V KIT活性化突然変異を有する)HMC1.2イマチニブ耐性細胞株を含む)の細胞生存率を減少させた。阻害は、抗体処置による発ガン型KITの強力なインターナリゼーション及び分解に起因するものであった。

0011

これらのモノクローナル抗体(2D1及び3G1と称される)は両方とも、SCFの結合後におけるKIT−D5の膜近位ドメイン間の同型相互作用(これらは、レセプター活性化に重要である)を阻害することによって、KIT野生型KITシグナル伝達を阻害する可能性がある。2D1及び3G1によるKIT−D5のターゲティングは、野生型KIT及び発ガン性KITの両方のインターナリゼーションを誘導し、かつWT KITを損傷させずに、発ガン性KITの分解を誘導する。興味深いことに、KITのインターナリゼーションは、したがって野生型又は突然変異型触媒又は膜近傍突然変異体のいずれか)とは無関係に観察されたが、強力な分解は、突然変異のバックグラウンドにおいてのみ観察された。

0012

したがって、これらの完全ヒト抗体は、KIT又はSCFの過剰発現に関連する疾患をターゲティングするために、及びガン(例えば、AML又はGIST)における発ガン性KITシグナル伝達をターゲティングするために、及び特定の突然変異体のTKI耐性をバイパスするために有用な新たな治療ツールの代表的なものである。

0013

定義:
「KIT」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、ヒトKITを指す。KITはまた、「kit」、「c−kit」、「CD117」又は「幹細胞因子レセプター」として公知である。「KIT」という用語は、天然型及びリコンビナント型のヒト天然KITタンパク質の両方を指す。したがって、この用語は、天然に存在するKIT並びにその変異体及び改変型を含む。KITは、過剰発現又は発ガン性突然変異を介してガンに関与する細胞表面III型チロシンキナーゼレセプターであり、キナーゼを構成的に活性にする。KITリガンドである幹細胞因子(SCF)は、レセプターのホモ二量体化及びリン酸化をトリガーし、細胞型に応じて、細胞の生存、増殖、ホーミング又は分化に関与する下流のエフェクター経路を活性化する。KITシグナル伝達は、白血病及び消化管間質腫瘍(GIST)に関与する。例示的なネイティブKITアミノ酸配列は、UniProtKB/Swiss-ProtにおいてアクセッションナンバーP10721)で示されている。

0014

本明細書で使用される「発ガン型KIT」という語は、SCFにかかわらず、腫瘍の成長及び進行を促す構成的シグナルの伝達をもたらす活性化突然変異を有するKIT突然変異体を指す。ガンでは、2つのグループのKIT活性化突然変異が存在する:GISTにおける調節型突然変異(例えば、KIT V560G)及び急性骨髄性リンパ腫(AML)における酵素型突然変異(例えば、KIT D816V)。

0015

「抗KIT抗体」という用語は、KITに対する抗体を指す。

0016

本発明によれば、「抗体」又は「イムノグロブリン」という用語は、同一の意味を有し、本発明において同様に使用される。本明細書で使用される「抗体」という用語は、イムノグロブリン分子、及びイムノグロブリン分子の免疫学的活性部分(すなわち、抗原免疫特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子)を指す。したがって、抗体という用語は、抗体分子全体だけではなく、抗体フラグメント、並びに抗体及び抗体フラグメントの変異体(誘導体を含む)を包含する。天然抗体では、2本の重鎖ジスルフィド結合によって互いに連結しており、各重鎖はジスルフィド結合によって軽鎖に連結している。ラムダ(l)及びカッパ(k)という2種類の軽鎖がある。抗体分子の機能活性を決定する主要な5つの重鎖クラス(又はアイソタイプ):IgMIgDIgGIgA及びIgEがある。各鎖は、別個の配列ドメインを含有する。軽鎖は、2個のドメイン(可変ドメイン(VL)及び定常ドメイン(CL))を含む。重鎖は、4個のドメイン(可変ドメイン(VH)及び3個の定常ドメイン(CH1、CH2及びCH3。CHと総称される))を含む。軽鎖(VL)及び重鎖(VH)の両方の可変領域は、抗原に対する結合認識及び特異性を決定する。軽鎖(CL)及び重鎖(CH)の定常領域ドメインは、重要な生物学的特性、例えば抗体鎖の会合、分泌、経胎盤移動性補体結合、及びFcレセプター(FcR)に対する結合を付与する。Fvフラグメントは、免疫グロブリンFabフラグメントN末端部分であり、1本の軽鎖及び1本の重鎖の可変部分から構成される。抗体の特異性は、抗体結合部位抗原決定基との間の構造的相補性にある。抗体結合部位は、超可変領域又は相補性決定領域(CDR)に主に由来する残基から構成される。時には、非超可変領域又はフレームワーク領域(FR)に由来する残基が全体的なドメイン構造、したがって結合部位に影響を与える。相補性決定領域又はCDRは、ネイティブな免疫グロブリン結合部位の天然Fv領域の結合親和性及び特異性を共に規定するアミノ酸配列を指す。免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖はそれぞれ、3個のCDR(それぞれL−CDR1、L−CDR2、L−CDR3及びH−CDR1、H−CDR2、H−CDR3と称される)を有する。したがって、抗原結合部位は、重鎖及び軽鎖V領域のそれぞれに由来するCDRセットを含む6個のCDRを含む。フレームワーク領域(FR)は、CDR間に介在するアミノ酸配列を指す。

0017

本明細書で使用される「中和抗体」という語は、抗体が特異的に結合するエピトープを含むポリペプチドの少なくとも1つの活性を遮断又は減少させる抗体を指す。中和抗体は、in vitro及び/又はin vivoで活性を減少させる。典型的には、中和抗体は、KITに対する幹細胞因子(SCF)の結合を遮断して、したがってKITのSCF誘導性活性化を阻害する。したがって、中和抗体は、SCF誘導性KITリン酸化、及びその後のKIT下流シグナル伝達を阻害する(これは、例えば、下記のようにKITのチロシン568、570及び/若しくは823のリン酸化、並びに/又はAKT及びERアッセイのリン酸化を評価するリン酸化アッセイによって評価され得る)。

0018

本明細書で使用される「Fab」という語は、約50,000の分子量及び抗原結合活性を有する抗体フラグメントであって、IgGをプロテアーゼパパイン)で処理することによって得られるフラグメントのうち、H鎖のN末端側のほぼ半分及びL鎖全体がジスルフィド結合によって共に結合している抗体フラグメントを意味する。

0019

本明細書で使用される「F(ab’)2」という語は、約100,000の分子量及び抗原結合活性を有する抗体フラグメントであって、IgGをプロテアーゼ(ペプシン)で処理することによって得られるフラグメントのうち、ヒンジ領域のジスルフィド結合によって結合している、Fabよりもわずかに大きな抗体フラグメントを指す。

0020

本明細書で使用される「Fab’」という用語は、約50,000の分子量及び抗原結合活性を有する抗体フラグメントであって、F(ab’)2のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断することによって得られる抗体フラグメントを指す。

0021

本明細書で使用される一本鎖Fv(「scFv」)ポリペプチドという用語は、ペプチドコードリンカーによって連結されたVH及びVLコード遺伝子を含む遺伝子融合体から、通常、発現される共有結合VH::VLヘテロ二量体である。

0022

本明細書で使用される「dsFv」という用語は、ジスルフィド結合によって安定化されたVH::VLヘテロ二量体である。二価抗体フラグメント及び多価抗体フラグメントは、一価scFvの会合によって自然に形成し得るか、又はペプチドリンカーによって一価scFvをカップリングすることによって作製され得る(例えば、二価sc(Fv)2)。

0023

本明細書で使用される「ダイアボディ」という用語は、2つの抗原結合部位を有する小さな抗体フラグメントであって、重鎖可変ドメイン(VH)が同じポリペプチド鎖軽鎖可変ドメイン(VL)に連結されたもの(VH−VL)を含む小さな抗体フラグメントを指す。同じ鎖上の2個のドメイン間のペアリングを可能にするには短過ぎるリンカーを使用することによって、前記ドメインを別の鎖の相補的ドメインと強制的にペアリングさせて、2つの抗原結合部位を作る。

0024

「精製された」及び「単離された」は、本発明の抗体又はヌクレオチド配列に言及する場合、同じ種類の他の生物学的高分子の実質的な非存在下で、示されている分子が存在することを意味する。好ましくは、本明細書で使用される「精製された」という用語は、少なくとも75重量%、より好ましくは少なくとも85重量%、さらにより好ましくは少なくとも95重量%、最も好ましくは少なくとも98重量%の同じ種類の生物学的高分子が存在することを意味する。特定のポリペプチドをコードする「単離された」核酸分子は、該ポリペプチドをコードしない他の核酸分子を実質的に含まない核酸分子を指す;しかしながら、該分子は、組成物基本的特性に悪影響を与えないいくつかのさらなる塩基又は部分を含み得る。

0025

本発明の抗体:
本発明は、単離された抗KIT抗体又はそのフラグメントを提供する。

0026

したがって、第1の態様では、本発明は、KITに結合する単離されたヒト中和抗体であって、発ガン型KITのインターナリゼーション及び分解をさらに誘導する単離されたヒト中和抗体に関する。より具体的には、本発明は、KITに結合する単離されたヒト中和抗体であって、KITのインターナリゼーションをさらに誘導し、発ガン型KITの分解のみを誘導する単離されたヒト中和抗体に関する。

0027

一実施態様では、本発明は、KITドメインD5(配列番号:25に定義される)に結合する単離されたヒト中和抗体であって、発ガン型KITのインターナリゼーション及び分解をさらに誘導する単離されたヒト中和抗体に関する。

0028

特に、本発明者らは、抗体ファージディスプレイによって、KITのリコンビナント型細胞外ドメインに対して選択された2つの完全ヒト抗KIT一本鎖可変抗体フラグメント(scFv)(2D1及び3G1と称される)を単離した。

0029

本発明者らは、前記scFv 2D1の軽鎖及び重鎖の可変ドメインをクローニング及び特性評価して、したがって表1に記載されているように前記抗体の相補性決定領域(CDR)ドメインを決定した:

0030

したがって、本発明は、KITに対する特異性を有する抗体であって、可変ドメインが、H−CDR1については配列番号:2、H−CDR2については配列番号:3、及びH−CDR3については配列番号:4からなる群より選択される配列を有する少なくとも1つのCDRを含む重鎖を含む抗体に関する。

0031

本発明はまた、KITに対する特異性を有する抗体であって、可変ドメインが、L−CDR1については配列番号:6、L−CDR2については配列番号:7、及びL−CDR3については配列番号:8からなる群より選択される配列を有する少なくとも1つのCDRを含む軽鎖を含む抗体に関する。

0032

本発明の抗体は、可変ドメインが、H−CDR1については配列番号:2、H−CDR2については配列番号:3、及びH−CDR3については配列番号:4からなる群より選択される配列を有する少なくとも1つのCDRを含む重鎖と、可変ドメインが、L−CDR1については配列番号:6、L−CDR2については配列番号:7、及びL−CDR3については配列番号:8からなる群より選択される配列を有する少なくとも1つのCDRを含む軽鎖とを含み得る。

0033

特に、本発明は、
−H−CDR1領域に配列番号:2、H−CDR2領域に配列番号:3及びH−CDR3領域に配列番号:4を含む重鎖可変領域と、
−L−CDR1領域に配列番号:6、L−CDR2領域に配列番号:7及びL−CDR3領域に配列番号:8を含む軽鎖可変領域とを含む抗KIT抗体を提供する。

0034

特定の実施態様では、前記抗体の重鎖可変領域は、配列番号:1に記載されているアミノ酸配列を有し、かつ/又は軽鎖可変領域は、配列番号:5に記載されているアミノ酸配列を有する。

0035

本発明者らはまた、前記scFv 3G1の軽鎖及び重鎖の可変ドメインをクローニング及び特性評価して、したがって表2に記載されているように前記抗体の相補性決定領域(CDR)ドメインを決定した:

0036

したがって、本発明は、KITに対する特異性を有する抗体であって、可変ドメインが、H−CDR1については配列番号:10、H−CDR2については配列番号:11、及びH−CDR3については配列番号:12からなる群より選択される配列を有する少なくとも1つのCDRを含む重鎖を含む抗体に関する。

0037

本発明はまた、KITに対する特異性を有する抗体であって、可変ドメインが、L−CDR1については配列番号:14、L−CDR2については配列番号:15、及びL−CDR3については配列番号:16からなる群より選択される配列を有する少なくとも1つのCDRを含む軽鎖を含む抗体に関する。

0038

本発明の抗体は、可変ドメインが、H−CDR1については配列番号:10、H−CDR2については配列番号:11、及びH−CDR3については配列番号:12からなる群より選択される配列を有する少なくとも1つのCDRを含む重鎖と、可変ドメインが、L−CDR1については配列番号:14、L−CDR2については配列番号:15、及びL−CDR3については配列番号:16からなる群より選択される配列を有する少なくとも1つのCDRを含む軽鎖とを含み得る。

0039

特に、本発明は、
−H−CDR1領域に配列番号:10、H−CDR2領域に配列番号:11及びH−CDR3領域に配列番号:12を含む重鎖可変領域と、
−L−CDR1領域に配列番号:14、L−CDR2領域に配列番号:15及びL−CDR3領域に配列番号:16を含む軽鎖可変領域とを含む抗KIT抗体を提供する。

0040

特定の実施態様では、前記抗体の重鎖可変領域は、配列番号:9に記載されているアミノ酸配列を有し、かつ/又は軽鎖可変領域は、配列番号:13に記載されているアミノ酸配列を有する。

0041

本発明はさらに、KITに対する前記抗体のフラグメント(限定されないが、Fv、Fab、F(ab’)2、Fab’、dsFv、scFv、sc(Fv)2及びダイアボディを含む)を提供する。

0042

一実施態様では、前記フラグメントは、配列番号:17に記載されているアミノ酸配列を有するscFvである。

0043

別の実施態様では、前記フラグメントは、配列番号:18に記載されているアミノ酸配列を有するscFvである。

0044

抗体2D1及び3G1は、マウスKITと交差反応することにさらに留意すべきである(これは、前臨床評価及び毒物学的研究にとって興味深いものである)。

0045

本発明の抗体を生産する方法:
本発明の抗KIT抗体は、当技術分野で公知の任意の技術、例えば限定されないが、任意の化学的技術、生物学的技術、遺伝的技術又は酵素学的技術(単独又は組み合わせのいずれか)によって生産され得る。

0046

所望の配列のアミノ酸配列を認識することにより、当業者であれば、標準的なポリペプチド生産技術により前記抗体を容易に生産できる。例えば、それらは、周知の固相法を使用して、好ましくは商業的に入手可能なペプチド合成装置(Applied Biosystems, FosterCity, Californiaにより製造されているものなど)を使用して、製造業者説明書にしたがって合成され得る。あるいは、本発明の抗体は、当技術分野で周知のリコンビナントDNA技術により合成され得る。例えば、抗体は、発現ベクターの中への抗体をコードするDNA配列の組み込み、及び所望の抗体を発現する適切な真核又は原核宿主生物の中への上記ベクターの導入後に、DNA発現産物として得られ、それらはそこから周知の技術を使用して後に単離され得る。

0047

したがって、本発明のさらなる態様は、本発明の抗体をコードする核酸配列に関する。より具体的には、前記核酸配列は、表3に記載されているように、本発明の抗体の重鎖又は軽鎖をコードする:

0048

典型的には、前記核酸は、DNA又はRNA分子であり、それらはプラスミドコスミドエピソーム人工染色体ファージ又はウイルスベクターなどの任意の適切なベクターに含まれ得る。

0049

本明細書で使用される「ベクター」、「クローニングベクター」及び「発現ベクター」という用語は、宿主生物のトランスフォーメーション及び導入された配列の発現(例えば、転写及び翻訳)の促進のために、DNA又はRNA配列(例えば、外来遺伝子)を宿主細胞内に導入し得るビヒクルを意味する。

0050

そのため本発明のさらなる目的は、本発明の核酸を含むベクターに関する。

0051

このようなベクターは、被験体への投与によって前記抗体の発現を引き起こす又は発現を促すために、プロモーターエンハンサーターミネーターなどの制御エレメントを含み得る。動物細胞のための発現ベクターに使用されるプロモーター及びエンハンサーの例としては、SV40初期プロモーター及びエンハンサー(Mizukami T. et al. 1987)、モロニーマウス白血病ウイルスLTRプロモーター及びエンハンサー(Kuwana Y et al. 1987)、イムノグロブリンH鎖のプロモーター(Mason JO et al. 1985)及びエンハンサー(Gillies SD et al. 1983)などが挙げられる。

0052

動物細胞のための任意の発現ベクターが、ヒト抗体C領域をコードする遺伝子が挿入及び発現され得る限り、使用され得る。適切なベクターの例としては、pAGE107(Miyaji H et al. 1990)、pAGE103(Mizukami T et al. 1987)、pHSG274(Brady G et al. 1984)、pKCR(O’Hare K et al. 1981)、pSG1 beta d2−4−(Miyaji H et al. 1990)などが挙げられる。

0053

プラスミドの他の例としては、複製開始点を含む複製プラスミド、又はpUC、pcDNA、pBRなどの組み込みプラスミドが挙げられる。

0054

ウイルスベクターの他の例としては、アデノウイルスレトロウイルスヘルペスウイルス及びAAVベクターが挙げられる。このようなリコンビナントウイルスは、当技術分野で公知の技術によって、例えばトランスフェクションパッケージング細胞、又はヘルパープラスミド若しくはウイルスを用いた一過性トランスフェクションなどによって生産され得る。ウイルスパッケージング細胞の典型的な例としては、PA317細胞、PsiCRIP細胞、GPenv+細胞、293細胞などが挙げられる。このような複製欠損リコンビナントウイルスを生産するための詳細なプロトコールは、例えば、国際公開公報第95/14785号、国際公開公報第96/22378号、米国特許第5,882,877号、米国特許第6,013,516号、米国特許第4,861,719号、米国特許第5,278,056号及び国際公開公報第94/19478号に見出され得る。

0055

本発明のさらなる目的は、本発明の核酸及び/又はベクターによりトランスフェクション、感染又はトランスフォーメーションされた宿主細胞に関する。

0056

「トランスフォーメーション」という用語は、所望の物質、典型的には、導入される遺伝子又は配列によりコードされたタンパク質又は酵素を産生させるために、宿主細胞が導入された遺伝子又は配列を発現できるように、「外来」(すなわち、外因性又は細胞外の)遺伝子、DNA又はRNA配列の宿主細胞への導入を意味する。導入されたDNA又はRNAを受け入れて発現する宿主細胞は、「トランスフォーメーション」されている。

0057

本発明の核酸は、適切な発現系における本発明の抗体の生産に使用され得る。「発現系」という用語は、例えばベクターにより運ばれる外来DNAによるコードされたタンパク質の発現のための条件、及び宿主への導入の条件などの適切な条件に基づく宿主細胞及び適合性ベクターを意味する。

0058

一般的な発現系としては、E.coli宿主細胞とプラスミドベクター昆虫宿主細胞とバキュロウイルスベクター、及び哺乳動物宿主細胞とベクターが挙げられる。宿主細胞の他の例としては、限定されないが、原核細胞(細菌など)及び真核細胞酵母細胞哺乳動物細胞昆虫細胞植物細胞など)が挙げられる。特定の例としては、E.coli、Kluyveromyces又はSaccharomyces酵母哺乳動物細胞株(例えば、Vero細胞CHO細胞、3T3細胞、COS細胞など)、及び初代哺乳動物細胞又は樹立哺乳動物細胞培養物(例えば、リンパ芽球線維芽細胞胚細胞上皮細胞神経細胞脂肪細胞などから生産される)が挙げられる。また、例としては、マウスSP2/0−Ag14細胞(ATCCCRL1581)、マウスP3X63−Ag8.653細胞(ATCC CRL1580)、ジヒドロ葉酸レダクダーゼ遺伝子(「DHFR遺伝子」)が欠損されたCHO細胞(Urlaub Gら;1980)、ラットYB2/3HL.P2.G11.16Ag.20細胞(ATCC CRL1662、以下、「TB2/0細胞」と称される)などが挙げられる。

0059

本発明はまた、本発明の抗体を発現するリコンビナント宿主細胞を生産する方法であって、(i)上記のとおりのリコンビナント核酸又はベクターをコンピテント宿主細胞にin vitro又はex vivoで導入する工程、(ii)得られたリコンビナント宿主細胞をin vitro又はex vivoで培養する工程、並びに(iii)場合により、前記抗体を発現及び/又は分泌する細胞を選択する工程を含む方法に関する。このようなリコンビナント宿主細胞は、本発明の抗体の生産に使用され得る。

0060

適切には、本発明の抗体は、従来の免疫グロブリン精製手順、例えばタンパク質Aセファロースヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーゲル電気泳動透析又はアフィニティークロマトグラフィーによって、培養培地から分離される。

0061

本明細書に記載される抗体のアミノ酸配列改変企図される。例えば、抗体の結合親和性及び/又は他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。本発明の抗体の構造において、及びそれらをコードするDNA配列において、改変及び変更を行って、望ましい特徴を有する抗体をコードする機能分子をさらに得ることができる。

0062

アミノ酸配列の変更を行う際、アミノ酸ヒドロパシー指標を考慮し得る。タンパク質に相互作用的生物機能を与えることにおけるアミノ酸ヒドロパシー指標の重要性は、当技術分野で一般に理解されている。アミノ酸の相対的なヒドロパシーは、結果物としてのタンパク質の二次構造に寄与することが認められており、それは、例えば酵素、基質、レセプター、DNA、抗体及び抗原などの他の分子とのタンパク質の相互作用を規定する。

0063

各アミノ酸は、それらの疎水性特性及び電荷特性に基づいてヒドロパシー指標が割り当てられており、これらは、イソロイシン(+4.5);バリン(+4.2);ロイシン(+3.8);フェニルアラニン(+2.8);システインシスチン(+2.5);メチオニン(+1.9);アラニン(+1.8);グリシン(−0.4);トレオニン(−0.7);セリン(−0.8);トリプトファン(−0.9);チロシン(−1.3);プロリン(−1.6);ヒスチジン(−3.2);グルタミン酸(−3.5);グルタミン(−3.5);アスパラギン酸(−3.5);アスパラギン(−3.5);リジン(−3.9);及びアルギニン(−4.5)である。

0064

本発明のさらなる態様はまた、本発明の抗体の機能保存変異体を包含する。

0065

「機能保存変異体」は、限定されないが、類似の特性(例えば、極性水素結合ポテンシャル酸性塩基性疎水性芳香性など)を有するアミノ酸との置換を含む、ポリペプチドの全体の立体構造及び機能を改変することなくタンパク質又は酵素における所定のアミノ酸残基が変更されているものである。類似機能の任意の2つのタンパク質間のタンパク質又はアミノ酸配列の類似性の割合は変化し得、例えば類似性がMEGALIGNアルゴリズムに基づくクラスタ法などによるアライメントスキームにしたがって決定した場合に70%〜99%であり得るように、保存されていると示されているもの以外のアミノ酸は、タンパク質において異なり得る。「機能保存変異体」はまた、BLAST又はFASTAアルゴリズムによって決定した場合に、少なくとも60%のアミノ酸同一性、好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも85%、さらに好ましくは少なくとも90%、より一層好ましくは少なくとも95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドであって、比較されるネイティブな又は親のタンパク質と同じ又は実質的に同様の特性又は機能を有するポリペプチドを含む。

0066

2つのアミノ酸配列は、アミノ酸の80%超、好ましくは85%超、好ましくは90%超が同一であるか、またはより短い配列の全長に対して約90%超、好ましくは95%超が類似(機能的に同一)である場合に「実質的に相同」又は「実質的に類似」である。好ましくは、類似配列又は相同配列は、例えば、GCG(Genetics Computer Group, Program Manual for the GCG Package, Version 7, Madison, Wisconsin)pileupプログラム、又はBLAST、FASTAなどの配列比較アルゴリズムのいずれかを使用してアライメントによって同定される。

0067

例えば、特定のアミノ酸は、かなりの活性が欠損することなくタンパク質構造における他のアミノ酸により置換されてもよい。タンパク質の相互作用能力及びタンパク質の性質がタンパク質の生物学的機能活性を規定するため、類似の特性を有するタンパク質を得ることができれば、特定のアミノ酸の置換はタンパク質配列において生じてもよく、また、当然ながらその配列をコードするDNAにおいて生じてもよい。したがって、様々な変更は、抗体の生物学的活性の多くを欠損することが無く、本発明の抗体の配列、又は該抗体をコードする対応のDNA配列において行われ得ると企図される。

0068

特定のアミノ酸が類似のヒドロパシー指標又はスコアを有する他のアミノ酸に置換されてもよく、その結果、類似の生物学的活性を有するタンパク質が生じる(すなわち、生物機能的に同等のタンパク質が得られる)ことが当技術分野で公知である。

0069

したがって、上記のように、アミノ酸置換は、一般に、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性、例えばそれらの疎水性、親水性、電荷及びサイズなどに基づく。様々な上記特性を考慮に入れる例示的な置換は当業者に周知であり、アルギニン及びリジン;グルタミン酸及びアスパラギン酸;セリン及びトレオニン;グルタミン及びアスパラギン;並びにバリン、ロイシン及びイソロイシンが挙げられる。

0070

したがって、本発明はまた、可変ドメインが、
−配列番号:2に記載されている配列と少なくとも90%又は95%の同一性を有するH−CDR1、
−配列番号:3に記載されている配列と少なくとも90%又は95%の同一性を有するH−CDR2、
−配列番号:4に記載されている配列と少なくとも90%又は95%の同一性を有するH−CDR3、
−配列番号:6に記載されている配列と少なくとも90%又は95%の同一性を有するL−CDR1、
−配列番号:7に記載されている配列と少なくとも90%又は95%の同一性を有するL−CDR2、
−配列番号:8に記載されている配列と少なくとも90%又は95%の同一性を有するL−CDR3
を含む重鎖を含み、かつ
−可変ドメインが、H−CDR1については配列番号:2、H−CDR2については配列番号:3、及びH−CDR3については配列番号:4を含む重鎖と、可変ドメインが、L−CDR1については配列番号:6、L−CDR2については配列番号:7、及びL−CDR3については配列番号:8を含む軽鎖とを含む抗体と実質的に同じ親和性で(より好ましくは、二価scFv−Fc 2D1と実質的に同じ親和性で)KITに特異的に結合する抗体を提供する。

0071

本発明者らは、増加した親和性を示す2D1変異体(2D1−C7と称される)の軽鎖の可変ドメインをクローニング及び特性評価して、したがって表4に記載されているように前記抗体の相補性決定領域(CDR)ドメインを決定した:

0072

したがって、本発明は、KITに対する特異性を有する抗体であって、可変ドメインが、H−CDR1については配列番号:2、H−CDR2については配列番号:3、及びH−CDR3については配列番号:4からなる群より選択される配列を有する少なくとも1つのCDRを含む重鎖を含む抗体に関する。

0073

本発明はまた、KITに対する特異性を有する抗体であって、可変ドメインが、L−CDR1については配列番号:27、L−CDR2については配列番号:28、及びL−CDR3については配列番号:29からなる群より選択される配列を有する少なくとも1つのCDRを含む軽鎖を含む抗体に関する。

0074

本発明の抗体は、可変ドメインが、H−CDR1については配列番号:2、H−CDR2については配列番号:3、及びH−CDR3については配列番号:4からなる群より選択される配列を有する少なくとも1つのCDRを含む重鎖と、可変ドメインが、L−CDR1については配列番号:27、L−CDR2については配列番号:28、及びL−CDR3については配列番号:29からなる群より選択される配列を有する少なくとも1つのCDRを含む軽鎖とを含み得る。

0075

特に、本発明は、
−H−CDR1領域に配列番号:2、H−CDR2領域に配列番号:3及びH−CDR3領域に配列番号:4を含む重鎖可変領域と、
−L−CDR1領域に配列番号:27、L−CDR2領域に配列番号:28及びL−CDR3領域に配列番号:29を含む軽鎖可変領域とを含む抗KIT抗体を提供する。

0076

特定の実施態様では、前記抗体の重鎖可変領域は、配列番号:1に記載されているアミノ酸配列を有し、かつ/又は軽鎖可変領域は、配列番号:26に記載されているアミノ酸配列を有する。

0077

本発明はさらに、可変ドメインが、
−配列番号:10に記載されている配列と少なくとも90%又は95%の同一性を有するH−CDR1、
−配列番号:11に記載されている配列と少なくとも90%又は95%の同一性を有するH−CDR2、
−配列番号:12に記載されている配列と少なくとも90%又は95%の同一性を有するH−CDR3、
−配列番号:14に記載されている配列と少なくとも90%又は95%の同一性を有するL−CDR1、
−配列番号:15に記載されている配列と少なくとも90%又は95%の同一性を有するL−CDR2、
−配列番号:16に記載されている配列と少なくとも90%又は95%の同一性を有するL−CDR3
を含む重鎖を含み、かつ
−可変ドメインが、H−CDR1については配列番号:10、H−CDR2については配列番号:11、及びH−CDR3については配列番号:12を含む重鎖と、可変ドメインが、L−CDR1については配列番号:14、L−CDR2については配列番号:15、及びL−CDR3については配列番号:16を含む軽鎖とを含む抗体と実質的に同じ親和性で(より好ましくは、二価scFv−Fc 3G1と実質的に同じ親和性で)KITに特異的に結合する抗体を提供する。

0078

本発明者らは、増加した親和性を示す3G1変異体(3G1−A2と称される)の軽鎖の可変ドメインをクローニング及び特性評価して、したがって表5に記載されているように前記抗体の相補性決定領域(CDR)ドメインを決定した:

0079

したがって、本発明は、KITに対する特異性を有する抗体であって、可変ドメインが、H−CDR1については配列番号:10、H−CDR2については配列番号:11、及びH−CDR3については配列番号:12からなる群より選択される配列を有する少なくとも1つのCDRを含む重鎖を含む抗体に関する。

0080

本発明はまた、KITに対する特異性を有する抗体であって、可変ドメインが、L−CDR1については配列番号:31、L−CDR2については配列番号:32、及びL−CDR3については配列番号:33からなる群より選択される配列を有する少なくとも1つのCDRを含む軽鎖を含む抗体に関する。

0081

本発明の抗体は、可変ドメインが、H−CDR1については配列番号:10、H−CDR2については配列番号:11、及びH−CDR3については配列番号:12からなる群より選択される配列を有する少なくとも1つのCDRを含む重鎖と、可変ドメインが、L−CDR1については配列番号:31、L−CDR2については配列番号:32、及びL−CDR3については配列番号:33からなる群より選択される配列を有する少なくとも1つのCDRを含む軽鎖とを含み得る。

0082

特に、本発明は、
−H−CDR1領域に配列番号:10、H−CDR2領域に配列番号:11及びH−CDR3領域に配列番号:12を含む重鎖可変領域と、
−L−CDR1領域に配列番号:31、L−CDR2領域に配列番号:32及びL−CDR3領域に配列番号:33を含む軽鎖可変領域とを含む抗KIT抗体を提供する。

0083

特定の実施態様では、前記抗体の重鎖可変領域は、配列番号:9に記載されているアミノ酸配列を有し、かつ/又は軽鎖可変領域は、配列番号:30に記載されているアミノ酸配列を有する。

0084

前記抗体は、当技術分野で公知の任意の方法により、特異的な結合についてアッセイされ得る。多くの異なる競合的結合アッセイフォーマットがエピトープビニングのために使用され得る。限定されないが、ウエスタンブロットラジオ免疫アッセイELISA、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降素アッセイ、ゲル拡散沈降素アッセイ、免疫放射線アッセイ、蛍光免疫アッセイ、プロテインA免疫アッセイ及び補体結合アッセイなどの技術を使用する競合アッセイステムを含む免疫アッセイが使用され得る。このようなアッセイは、ルーチンであり、当技術分野で周知である(例えば、Ausubel et al., eds, 1994 Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & sons, Inc., New Yorkを参照のこと)。例えば、BIACORE(登録商標)(GE Healthcare, Piscaataway, NJ)は、モノクローナル抗体のエピトープビンパネルルーチン的に使用される様々な表面プラズモン共鳴アッセイフォーマットの1つである。さらに、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane, 1988に記載されているようなルーチンクロスブロッキングアッセイが行われ得る。

0085

本発明の人工抗体は、例えば抗体の特性を改善するためにVH及び/又はVL内のフレームワーク残基に対して改変を施された抗体を含む。典型的には、このようなフレームワーク改変は、抗体の免疫原性を減少させるために行われる。例えば、1つのアプローチは、1つ以上のフレームワーク残基を対応する生殖細胞系配列に「復帰突然変異」することである。より具体的には、体細胞突然変異を受けた抗体は、その抗体に由来する生殖細胞系配列と異なるフレームワーク残基を含み得る。このような残基は、その抗体に由来する生殖細胞系配列と抗体フレームワーク配列とを比較することにより同定され得る。フレームワーク領域の配列をそれらの生殖細胞系構造に戻すために、体細胞突然変異は、例えば部位特異的突然変異誘発又はPCRによる突然変異誘発により、生殖細胞系配列に復帰突然変異され得る。このような「復帰突然変異」された抗体もまた、本発明に含まれることが意図される。別の種類のフレームワーク改変は、T細胞のエピトープを除去してそれによって抗体の潜在的免疫原性を減少させるために、フレームワーク領域内、又は1つ以上のCDR領域内における1つ以上の残基を突然変異させることを含む。このアプローチは、「脱免疫化」とも称され、さらなる詳細はCarrらによる米国特許出願公開第20030153043号に記載されている。

0086

フレームワーク又はCDR領域内で行われる改変に加えて又は代えて、本発明の抗体は、典型的には血清半減期、補体結合、Fcレセプター結合及び/又は抗原依存性細胞毒性などの抗体の1つ以上の機能的特性を変更するために、Fc領域内における改変を含むように設計されていてもよい。さらに、本発明の抗体は、化学的に改変されていてもよく(例えば、1つ以上の化学的部位が抗体に結合され得る)、また、そのグリコシル化を変更するように改変されていてもよく、また、抗体の1つ以上の機能的特性を変更するように改変されていてもよい。これらの各実施態様は、以下にさらに詳細に記載されている。Fc領域における残基の番号付けは、KabatのEUインデックスの番号付けである。

0087

一実施態様では、CH1のヒンジ領域は、そのヒンジ領域のシステイン残基の数が変更されるように、例えば増える又は減るように改変されている。このアプローチは、Bodmerらによる米国特許第5,677,425号にさらに記載されている。CH1のヒンジ領域におけるシステイン残基の数は、例えば軽鎖及び重鎖の構築を促進する、又は抗体の安定性を増加若しくは減少するように変更される。

0088

別の実施態様では、抗体のFcヒンジ領域は、抗体の生物学的半減期を減少するように突然変異される。より具体的には、1つ以上のアミノ酸突然変異は、その抗体における黄色ブドウ球菌プロテインA(SpA)との結合性が天然FcヒンジドメインのSpA結合性と比較して低くなるように、FcヒンジフラグメントのCH2−CH3ドメインインターフェイス領域内に導入される。このアプローチは、Wardらによる米国特許第6,165,745号にさらに詳細に記載されている。

0089

別の実施態様では、抗体はその生物学的半減期を増加するために改変される。様々なアプローチが可能である。例えば、Wardによる米国特許第6,277,375号に記載されているように、以下の突然変異:T252L、T254S、T256Fの1つ以上が導入され得る。あるいは、生物学的半減期を増加するために、抗体は、Prestaらによる米国特許第5,869,046号及び米国特許第6,121,022号に記載されているように、IgGのFc領域のCH2ドメインにおける2つのループから得られるサルベージレセプター結合エピトープを含むようにCH1又はCL領域内で変更され得る。

0090

また他の実施態様では、Fc領域は、抗体のエフェクター機能を変更するために、少なくとも1つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基に置換することにより変更される。例えば、1つ以上のアミノ酸は、抗体がエフェクターリガンドに対する変更された親和性を有するが親抗体の抗原結合能力を維持するように、異なるアミノ酸残基に置換され得る。親和性が変更されたエフェクターリガンドは、例えばFcレセプター又は補体のC1コンポーネントであり得る。このアプローチは、Winterらによる米国特許第5,624,821号及び米国特許第5,648,260号にさらに詳細に記載されている。

0091

別の実施態様では、抗体が、変更されたC1q結合性、及び/又は減少若しくは抑制された補体依存性細胞傷害作用(CDC)を有するように、アミノ酸残基から選択される1つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸残基と置換され得る。このアプローチは、ldusogieらによる米国特許第6,194,551号にさらに詳細に記載されている。

0092

別の実施態様では、抗体の補体結合能力を変更するように、1つ以上のアミノ酸残基は変更されている。このアプローチは、Bodmerらによる国際公開公報第94/29351号にさらに記載されている。

0093

また別の実施態様では、Fc領域は、1つ以上のアミノ酸を改変することにより、抗体依存性細胞傷害作用(ADCC)を媒介するための抗体の能力を増加する、及び/又はFcレセプターに対する抗体の親和性を増加するように改変されている。このアプローチは、Prestaによる国際公開公報第00/42072号にさらに記載されている。さらに、FcγRI、FcγRII、FcγRIII及びFcRnに対するヒトIgGIにおける結合部位は既に位置決定されており、改善された結合性を有する変異体が記載されている(Shields, R. L. et al., 2001 J. Biol. Chen. 276:6591-6604、国際公開公報第2010106180号を参照のこと)。

0094

さらに別の実施態様では、抗体のグリコシル化が改変されている。例えば、脱グリコシル化抗体が作製され得る(すなわち、抗体がグリコシル化を欠いている)。グリコシル化は、例えば抗原に対する抗体の親和性を増加するために変更され得る。このような炭水化物修飾は、例えば抗体配列内の1つ以上のグリコシル化部位を変更することによって達成され得る。例えば、1つ以上の可変領域フレームワークのグリコシル化部位を除去することによってその部位におけるグリコシル化を除去する1つ以上のアミノ酸置換はなされ得る。このような脱グリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性を増加し得る。このようなアプローチは、Coらによる米国特許第5,714,350号及び米国特許第6,350,861号にさらに詳細に記載されている。

0095

加えて又はあるいは、変更型のグリコシル化を有する抗体、例えばフコシル残基の量が減少しているか、若しくはフコシル残基を有しない低フコシル化若しくは非フコシル化抗体、又は増加した二分GlcNac構造を有する抗体が作製され得る。このような変更されたグリコシル化パターンは、抗体のADCC能を増加すると実証されている。このような炭水化物修飾は、例えば変更されたグリコシル化機構を有する宿主細胞で抗体を発現することにより達成され得る。変更されたグリコシル機構を有する細胞は、当技術分野で説明されており、本発明のリコンビナント抗体を発現し、それにより、変更されたグリコシル化を有する抗体を産生する宿主細胞として使用され得る。例えば、Hangらによる欧州特許出願公開第1,176,195号には、フコシルトランスフェラーゼをコードするFUT8遺伝子が機能的に破壊された細胞株が記載されており、このような細胞株で発現された抗体は、低フコシル化を示すか、又はフコシル残基を欠く。したがって、一実施態様では、本発明の抗体は、低フコシル化又は非フコシル化パターンを示す細胞株、例えばフコシルトランスフェラーゼをコードするFUT8の発現が欠損している哺乳動物細胞株におけるリコンビナント発現により産生され得る。Prestaによる国際公開公報第03/035835号には、Asn(297)結合炭水化物にフコースを結合する能力が低下している変異体CHO細胞株、Lecl3細胞であって、その細胞株で発現される抗体の低フコシル化をもたらす変異体CHO細胞株、Lecl3細胞が記載されている(Shields, R.L. et al., 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740も参照のこと)。Umanaらによる国際公開公報第99/54342号には、人工細胞株で発現される抗体が、抗体のADCC活性の増加をもたらす二分GlcNac構造の増加を示すように、糖タンパク質修飾グリコシルトランスフェラーゼ(例えば、β(1,4)−NアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII(GnTIII))を発現するように操作された細胞株が記載されている(Umana et al., 1999 Nat. Biotech. 17:176-180も参照のこと)。EurekaTherapeuticsには、フコシル残基が欠けた変更された哺乳動物グリコシル化パターンを有する抗体を産生することができる遺伝子的に改変されたCHO哺乳動物細胞がさらに記載されている(http://www.eurekainc.com/a&boutus/companyoverview.html)。

0096

あるいは、本発明の抗体は、哺乳動物様グリコシル化パターンについて改変され、グリコシル化パターンとしてフコースを欠いている抗体を産生することができる酵母又は糸状菌で産生され得る(例えば、欧州特許第1297172号を参照のこと)。

0097

本発明によって企図される本発明の抗体の別の改変はペグ化である。抗体は、例えば抗体の生物学的(例えば、血清半減期の増加のためにペグ化され得る。抗体のペグ化のために、通常、抗体又はそのフラグメントは、1つ以上のPEG基が抗体又は抗体フラグメントに結合する条件下で、PEGの反応性エステル又はアルデヒド誘導体などのポリエチレングリコール(PEG)と反応される。ペグ化は、反応性PEG分子(又は、類似の反応性水溶性ポリマー)とのアシル化反応又はアルキル化反応により行われ得る。本明細書で使用される「ポリエチレングリコール」という用語は、モノ(C1−C10)アルコキシ若しくはアリールオキシポリエチレングリコール、又はポリエチレングリコールマレイミドなどの、他のタンパク質を誘導体化するために使用されるPEGの形態のいずれかを含むことを意図する。特定の実施態様では、ペグ化すべき抗体は、脱グリコシル化抗体である。タンパク質をペグ化するための方法は、当技術分野で公知であり、本発明の抗体に適用され得る。例えば、Nishimuraらによる欧州特許第0154316号及びIshikawaらによる欧州特許第0401384号を参照のこと。

0098

本発明によって企図される抗体の別の改変は、得られる分子の半減期を増加させるための、本発明の抗体の少なくとも抗原結合領域血清タンパク質(例えば、ヒト血清アルブミン又はそのフラグメント)へのコンジュゲート又はタンパク質融合である。このようなアプローチは、例えばBallanceらの欧州特許第0322094号に記載されている。別の可能性は、得られる分子の半減期を増加させるための、本発明の抗体の少なくとも抗原結合領域の、血清タンパク質に結合することができるタンパク質(例えば、ヒト血清アルブミン)への融合である。このようなアプローチは、例えばNygrenらの欧州特許第0486525号に記載されている。

0099

イムノコンジュゲート
本発明の抗体は、抗KITイムノコンジュゲートを形成するために、検出可能な標識とコンジュゲートされ得る。適切な検出可能な標識としては、例えば放射性同位体蛍光標識化学発光標識酵素標識生物発光標識又は金コロイドが挙げられる。このような検出可能に標識されたイムノコンジュゲートを作製及び検出する方法は、当業者に周知であり、以下により詳細に記載する。

0100

検出可能な標識は、オートラジオグラフィーにより検出される放射性同位体であり得る。本発明の目的のために特に有用なアイソトープは、3H、125I、131I、35S及び14Cである。

0101

抗KITイムノコンジュゲートはまた、蛍光化合物により標識され得る。蛍光標識された抗体の存在は、適切な波長の光にそのイムノコンジュゲートを当てて、それにより生じた蛍光を検出することにより決定される。蛍光標識化合物としては、フルオレセインイソチオシアネートローダミンフィコエリトリンフィコシアニンアロフィコシアニンo−フタルアルデヒド及びフルオレスカミンが挙げられる。

0102

あるいは、抗KITイムノコンジュゲートは、化学発光化合物に抗体をカンプリングさせることにより検出可能に標識され得る。化学発光タグ化イムノコンジュゲートの存在は、化学的反応過程の間に生じる発光の存在を検出することにより決定される。化学発光標識化合物の例としては、ルミノールイソルミノール、芳香族アクリジニウムエステルイミダゾールアクリジニウム塩及びシュウ酸エステルが挙げられる。

0103

同様に、生物発光化合物が、本発明の抗KITイムノコンジュゲートを標識するのに使用され得る。生物発光は、触媒タンパク質が化学発光反応の効率を増加する生物学的システムにおいて見出された化学発光の1種である。生物発光タンパク質の存在は、発光の存在を検出することにより決定される。標識に有用な生物発光化合物としては、ルシフェリンルシフェラーゼ及びイクオリンが挙げられる。

0104

あるいは、抗KITイムノコンジュゲートは、酵素に抗KIT抗体を結合させることにより検出可能に標識され得る。抗KIT酵素コンジュゲートが適切な基質の存在下でインキュベーションすると、酵素部分は、基質と反応して、例えば分光光度法蛍光分析法又は可視的手段により検出され得る化学的部分を生成する。多特異的イムノコンジュゲートを検出可能に標識するのに使用され得る酵素の例としては、βガラクトシダーゼグルコースオキシダーゼペルオキシダーゼ及びアルカリホスファターゼが挙げられる。

0105

当業者であれば、本発明にしたがって使用され得る他の適切な標識を認識するであろう。抗KITモノクローナル抗体にマーカー部を結合することは、当技術分野で公知の標準的な技術を使用して達成され得る。これに関する一般の方法論は、Kennedy et al., Clin. Chim. Acta 70:1, 1976; Schurs et al., Clin. Chim. Acta 81:1, 1977; Shih et al., Int’l J. Cancer 46:1101, 1990; Stein et al., Cancer Res. 50:1330, 1990;及び上記Coliganに記載されている。

0106

さらに、免疫化学検出の簡便性及び汎用性は、アビジンストレプトアビジン及びビオチンとコンジュゲートされた抗KITモノクローナル抗体を使用することによって増強され得る(例えば、Wilchek et al. (eds.), “Avidin-Biotin Technology,” Methods In Enzymology (Vol. 184) (Academic Press 1990); Bayer et al., “Immunochemical Applications of Avidin-Biotin Technology,” in Methods In Molecular Biology (Vol. 10) 149-162 (Manson, ed., The Humana Press, Inc. 1992).を参照のこと)。

0107

イムノアッセイを実施するための方法は、十分に確立されている(例えば、Cook and Self, “Monoclonal Antibodies in Diagnostic Immunoassays,” in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering, and Clinical Application 180-208 (Ritter and Ladyman, eds., Cambridge University Press 1995); Perry, “The Role of Monoclonal Antibodies in the Advancement of Immunoassay Technology,” in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications 107-120 (Birch and Lennox, eds., Wiley-Liss, Inc. 1995); Diamandis, Immunoassay (Academic Press, Inc. 1996).を参照のこと)。

0108

別の態様では、本発明は、抗KIT抗体−薬物コンジュゲートを提供する。本明細書で使用される「抗KIT抗体−薬物コンジュゲート」は、治療剤にコンジュゲートされた本発明の抗KIT抗体を指す。このような抗KIT抗体−薬物コンジュゲートは、患者(例えば、KIT発現性ガンを有する患者など)に投与した場合に、典型的には、単独で投与した場合だけではなく他の治療剤と組み合わせて投与した場合にも、KIT発現細胞に対して臨床的に有益な効果をもたらす。

0109

典型的な実施態様では、抗KIT抗体は、得られる抗体−薬物コンジュゲートが、KIT発現細胞(例えば、KIT発現ガン細胞)に取り込まれ、又はインターナリゼーションされると、前記細胞に対する細胞毒性効果又は細胞増殖抑制効果を発揮するように、細胞毒性薬にコンジュゲートされている。抗体にコンジュゲートするのに特に適切な部分は、化学療法剤プロドラッグ変換酵素、放射性同位体若しくは化合物又は毒素である。例えば、抗KIT抗体は、細胞毒性薬、例えば化学療法剤又は毒素(例えば、細胞増殖抑制剤又は細胞破壊剤、例えばアブリンリシンA、緑膿菌外毒素又はジフテリア毒素など)にコンジュゲートされ得る。

0111

個々の細胞毒性薬としては、例えばアンドロゲンアントラマイシン(AMC)、アスパラギナーゼ、5−アザシチジンアザチオプリンブレオマイシン、ブサルファン、ブチオニン、スルホキシミンカンプトテシン、カルボプラチン、カルムスチンBSNU)、CC−1065(Li et al., Cancer Res. 42:999-1004, 1982)、クロランブシル、シスプラチン、コルヒシン、シクロホスファミドシタラビンシチジンアラビノシドシトカラシンB、ダカルバジンダクチノマイシン(以前はアクチノマイシン)、ダウノルビシンデカルバジンドセタキセルドキソルビシンエストロゲン5−フルオロデオキシウリジンリン酸エトポシド(etopside phosphate)(VP−16)、5−フルオロウラシルグラミシジンD、ヒドロキシウレアイダルビシンイホスファミドイリノテカンロムスチン(CCNU)、メクロレタミン、メルファラン、6−メルカプトプリンメトトレキサートミトラマイシンマイトマイシンCミトキサントロンニトロイミダゾールパクリタキセルプリカマイシン、プロカルジンストレプトゾトシン、テノポシド(VM−26)、6−チオグアニンチオTEPA、トポテカンビンブラスチンビンクリスチン及びビノレルビンが挙げられる。

0112

特に適切な細胞毒性薬としては、例えば、ドラスタチン(例えば、オーリスタチンE、AFP、MMAF、MMAE)、DNAマイナーグルーブ結合剤(例えば、エンジイン及びレキシトロプシン)、デュオカルマイシン、タキサン(例えば、パクリタキセル及びドセタキセル)、ピューロマイシン、ビンカアルカロイド、CC−1065、SN−38(7−エチル−10−ヒドロキシ−カンプトテイン)、トポテカン、モルフォリノ−ドキソルビシン、リゾキシンシアノモルフォリノ−ドキソルビシン、エチノマイシン、コンブレタスタチン、ネトロプシン、エポチロンA及びB、エストラムスチンクリプトフィシン、セマドチン、メイタンシノイドディスコデルモリド、エリュテロビン並びにミトキサントロンが挙げられる。特定の実施態様では、細胞毒性薬は、従来の化学療法剤、例えばドキソルビシン、パクリタキセル、メルファラン、ビンカアルカロイド、メトトレキサート、マイトマイシンC又はエトポシドなどである。加えて、CC−1065類似体カリケアミシンメイタンシン、ドラスタチン10の類似体、リゾキシン及びパリトキシンなどの強力な薬剤を抗KIT抗体に連結し得る。

0113

特定のバリエーションでは、細胞毒性薬又は細胞増殖抑制剤は、オーリスタチンE(当技術分野でドラスタチン10としても公知である)又はその誘導体である。典型的には、オーリスタチン誘導体は、例えば、オーリスタチンEとケト酸との間で形成されるエステルである。例えば、オーリスタチンEをパラアセチル安息香酸又はベンゾイル吉草酸と反応させて、AEB及びAEVBをそれぞれ生成し得る。他の典型的なオーリスタチン誘導体としては、AFP(ジメチルバリン−バリン−ドライソロイン−ドラプロリン−フェニルアラニン−p−フェニレンジアミン)、MMAF(ドバリン−バリン−ドライソロイニン−ドラプロリン−フェニルアラニン)及びMAE(モノメチルオーリスタチンE)が挙げられる。オーリスタチンE及びその誘導体の合成及び構造は、米国特許出願公開第20030083263号;国際公開公報第2002/088172号及び国際公開公報第2004/010957号;並びに米国特許第6,884,869号;米国特許第6,323,315号;米国特許第6,239,104号;米国特許第6,034,065号;米国特許第5,780,588号;米国特許第5,665,860号;米国特許第5,663,149号;米国特許第5,635,483号;米国特許第5,599,902号;米国特許第5,554,725号;米国特許第5,530,097号;米国特許第5,521,284号;米国特許第5,504,191号;米国特許第5,410,024号;米国特許第5,138,036号;米国特許第5,076,973号;米国特許第4,986,988号;米国特許第4,978,744号;米国特許第4,879,278号;米国特許第4,816,444号;及び米国特許第4,486,414号に記載されている。

0114

他のバリエーションでは、細胞毒性薬は、DNAマイナーグルーブ結合剤である(例えば、米国特許第6,130,237号を参照のこと)。例えば、特定の実施態様では、マイナーグルーブ結合剤は、CBI化合物である。他の実施態様では、マイナーグルーブ結合剤は、エンジインである(例えばカリケアミシン)。

0115

特定の実施態様では、抗体−薬物コンジュゲートは、抗チューブリン剤を含む。抗チューブリン剤の例としては、例えば、タキサン(例えば、Taxol(登録商標)(パクリタキセル)、Taxotere(登録商標)(ドセタキセル))、T67(Tularik)、ビンカアルカロイド(例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン及びビノレルビン)並びにドラスタチン(例えば、オーリスタチンE、AFP、MMAF、MMAE、AEB、AEVB)が挙げられる。他の抗チューブリン剤としては、例えば、バッカチン誘導体タキサン類似体(例えば、エポチロンA及びB)、ノコダゾール、コルチシン及びコルシミド、エストラムスチン、クリプトフィシン、セマドチン、マイタンシノイド、コンブレタスタチン、ディスコデルモリド並びにエリュテロビンが挙げられる。いくつかの実施態様では、細胞毒性薬は、他のグループの抗チューブリン剤であるメイタンシノイドである。例えば、特定の実施態様では、メイタンシノイドは、メイタンシン又はDM−1である(ImmunoGen, Inc.; また Chari et al., Cancer Res. 52:127-131, 1992を参照のこと)。

0116

他の実施態様では、細胞毒性薬は、代謝拮抗剤である。代謝拮抗剤は、例えば、プリンアンタゴニスト(例えば、アゾチオプリン又はミコフェノレートモフェチル)、ジヒドロフォレートレダクターゼ阻害剤(例えば、メトトレキサート)、アシクロビルガンシクロビルジドブジンビダラビンリババリン、アジドチミジン、シチジン、アラビノシド、アマンタジンジデオキシウリジンヨードデオキシウリジンポスカーネット又はトリフルリジンであり得る。

0117

他の実施態様では、抗KIT抗体は、プロドラッグ変換酵素にコンジュゲートされている。プロドラッグ変換酵素は、公知の方法を使用して、抗体にリコンビナント融合又は化学的にコンジュゲートされ得る。例示的なプロドラッグ変換酵素は、カルボキシペプチダーゼG2、βグルクロニダーゼペニシリン−V−アミダーゼ、ペニシリン−G−アミダーゼ、βラクタマーゼβ−グルコシダーゼニトロレダクターゼ及びカルボキシペプチダーゼAである。

0118

治療剤をタンパク質(特に、抗体)にコンジュゲートするための技術は、周知である(例えば、Arnon et al., “Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy,” in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy (Reisfeld et al. eds., Alan R. Liss, Inc., 1985); Hellstrom et al., “Antibodies For Drug Delivery,” in Controlled Drug Delivery (Robinson et al. eds., Marcel Deiker, Inc., 2nd ed. 1987); Thorpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review,” in Monoclonal Antibodies ’84: Biological And Clinical Applications (Pinchera et al. eds., 1985); “Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy,” in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy (Baldwin et al. eds., Academic Press, 1985);及びThorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58を参照のこと。例えば、国際公開公報第89/12624号も参照のこと)。

0119

診断用途
本発明のさらなる態様は、ガン疾患、及びKITレベルが改変(増加又は減少)している他の疾患を診断及び/又はモニタリングするための本発明の抗KIT抗体に関する。

0120

好ましい実施態様では、本発明の抗体は、蛍光分子放射性分子又は上記の当技術分野で公知の任意の他の標識などの検出可能な分子又は物質を使用して標識され得る。例えば、本発明の抗体は、当技術分野で公知の任意の方法により放射性分子を使用して標識され得る。例えば、放射性分子としては、限定されないが、シンチグラフ検査のための放射性原子、例えばI123、I124、In111、Re186、Re188が挙げられる。本発明の抗体はまた、ヨウ素123、ヨウ素131、インジウム111フッ素19、炭素13窒素15、酸素17ガドリニウムマンガン又は鉄などの核磁気共鳴(NMRイメージング核磁気共鳴画像法、mriとしても公知である)のためのスピン標識を使用して標識され得る。抗体の投与の後、患者内における抗体の分布が検出される。任意の特定の標識の分布を検出する方法は、当業者に公知であり、任意の適切な方法が使用され得る。いくつかの非限定的な例としては、コンピュータ断層撮影(CT)、ポジトロン断層撮影(PET)、核磁気共鳴画像法(MRI)、蛍光、化学発光及び超音波検査法が挙げられる。

0121

本発明の抗体は、(例えば、放射性イメージングにおいて)KIT過剰発現に関連するガン疾患を診断及び病期分類するために有用であり得る。KIT過剰発現に関連するガン疾患としては、典型的には、限定されないが、消化管間質腫瘍(GIST)、血液ガン(例えば、白血病、例えば急性骨髄性白血病(AML))、小細胞肺ガン、膵臓ガン肥満細胞腫卵巣ガン、乳ガン、メラノーマ、結腸ガン、結腸直腸ガン精巣セミノーマ、KITを発現又は過剰発現する他の過剰増殖性疾患が挙げられる。

0122

本発明の抗体は、KIT発現が増加又は減少している(可溶性KIT型又は細胞KIT型)ガン以外の疾患を診断するのに有用であり得る。

0123

典型的には、前記診断方法は、患者から得られた生物学的サンプルの使用を含む。本明細書で使用される「生物学的サンプル」という用語は、被験体から得られた様々な型のサンプルを包含し、診断アッセイ又はモニタリングアッセイに使用され得る。生物学的サンプルとしては、限定されないが、血液及び他の生物起源液体サンプル生検材料若しくは組織培養物又はそれら由来の細胞及びその子孫などの固体組織サンプルが挙げられる。例えば、生物学的サンプルとしては、KIT過剰発現に関連するガン疾患を有すると疑われる個体から回収された組織サンプルから得られた細胞を含み、好ましい実施態様では、GIST、AML、小細胞肺ガン、膵臓ガン、肥満細胞腫、卵巣ガン、乳ガン、メラノーマから得られた細胞が挙げられる。したがって、生物学的サンプルは、臨床サンプル培養液中の細胞、細胞上清細胞溶解液、血清、血漿生物学的流体及び組織サンプルを包含する。

0124

特定の実施態様では、本発明は、本発明の抗体を使用して、被験体由来の細胞上のKITを検出することによって、被験体におけるKIT過剰発現に関連するガン疾患を診断する方法である。特に、前記診断方法は、
(a)KITを発現する生物学的サンプルの細胞と抗体が複合体を形成するのに十分な条件で、KIT過剰発現に関連するガン疾患を患っている可能性がある被験体の生物学的サンプルを本発明の抗体と接触させる工程;
(b)前記複合体を検出及び/又は定量する工程を含み得、それにより、前記複合体の検出は、KIT過剰発現に関連するガン疾患を示す。

0125

ガン疾患をモニタリングするために、本発明の診断方法を異なる時間間隔で反復して、サンプルに対する抗体結合が増加又は減少しているかを決定し、それにより、ガン疾患が進行又は退縮しているか決定し得る。

0126

治療用途
本発明の抗体、フラグメント又はイムノコンジュゲートは、KIT発現に関連する任意の疾患(優先的には、ガン)を処置するために有用であり得る。本発明の抗体は単独で、又は任意の適切な薬剤と組み合わせて使用され得る。

0127

本発明の抗KIT抗体は、KITの発現、過剰発現及び/又は活性化に関連する過剰増殖性疾患の処置として使用され得る。KITの発現、過剰発現又は活性化に関連するこのような疾患の例は、消化管間質腫瘍(GIST)、血液ガン(例えば、白血病、例えば急性骨髄性白血病(AML))、小細胞肺ガン、膵臓ガン、肥満細胞腫、卵巣ガン、乳ガン、メラノーマ、結腸ガン、結腸直腸ガン、精巣セミノーマ、KITを発現又は過剰発現する他の過剰増殖性疾患を包含する。より好ましいガンは、GIST、AML、小細胞肺ガン、膵臓ガン、肥満細胞腫、卵巣ガン、乳ガン及びメラノーマである。

0128

前述のように、KITの過剰発現又は活性化に関連するガンでは、2つのグループの活性化突然変異が存在する:GISTにおける調節型突然変異(例えば、KIT V560G)及び急性骨髄性リンパ腫(AML)における酵素型突然変異(例えば、KIT D816V)。

0129

特定の一実施態様では、KITの発現、過剰発現及び/又は活性化に関連する前記過剰増殖性疾患は、TKI耐性疾患、例えばイマチニブ耐性GIST又はAMLなどである。このような疾患は、KITの触媒突然変異体(活性化ループの突然変異)では一次抵抗を示し、又は薬物結合残基の突然変異(ゲートキーパー突然変異、例えばT670I又はV654A)では二次抵抗を示し得る。

0130

本明細書に記載される処置方法の各実施態様では、抗KIT抗体又は抗KIT抗体−薬物コンジュゲートは、処置しようとする疾患又は障害の管理に関連する従来の方法にしたがって送達される。本明細書の開示にしたがって、有効量の抗体又は抗体−薬物のコンジュゲートは、疾患又は障害を予防又は治療するために十分な時間及び条件下で、このような処置を必要とする患者に投与される。

0131

したがって、本発明の態様は、KITの過剰発現及び/又は活性化に関連する疾患を処置するための方法であって、治療有効量の本発明の抗体、フラグメント又はイムノコンジュゲートを、それを必要とする患者に投与することを含む方法に関する。

0132

本発明との関連では、本明細書で使用される「処置すること」又は「処置」という用語は、このような用語が適用される障害若しくは症状、又はこのような障害若しくは症状の1つ以上の症候の進行を回復緩和、阻害又は予防することを意味する。

0133

本発明によれば、「患者」又は「それを必要とする患者」という用語は、KITの過剰発現及び/又は活性化に関連する疾患に罹患しているか、又は罹患している可能性があるヒトを意図する。

0134

本発明の抗体の「治療有効量」は、医薬的治療に適用できる適切なベネフィットリスク比において、KITの過剰発現及び/又は活性化に関連する前記疾患、例えばガン(例えば、GIST又はCML)を処置するための抗体の十分な量を意味する。しかしながら、本発明の抗体及び組成物の1日当たりの総用量は、健全医学的判断の範囲内で主治医により決められることが理解されよう。任意の特定の患者のための特定の治療的有効用量レベルは、処置される障害及び障害の重症度、使用される特定の抗体の活性、使用される特定の組成物、患者の年齢、体重、総合的な健康状態性別及び食事、投与時間、投与経路、使用される特定の抗体の排出率、治療の期間、使用される特定の抗体と組み合わせで使用される又は同時に使用される薬物、並びに医学分野で周知の因子を含む様々な因子に依存するであろう。例えば、所望の治療効果を達成するために必要なレベルよりも低いレベルの化合物の用量で開始すること、及び所望の効果が達成されるまで用量を徐々に増加することは当業者に周知である。

0135

特定の実施態様では、抗KIT抗体又は抗体−薬物コンジュゲートは、疾患又は障害の処置のための第2の薬物と組み合わせて使用される。ガンの処置に使用される場合、本発明の抗KIT抗体又は抗体−薬物コンジュゲートは、例えば手術放射線療法、化学療法又はそれらの組み合わせなどの従来のガン治療と組み合わせて使用され得る。

0136

特定の態様では、本発明の抗KIT抗体又は抗体−薬物コンジュゲートとの併用ガン治療に有用な他の治療剤としては、抗血管新生薬が挙げられる。いくつかの態様では、本発明の抗体又は抗体−薬物コンジュゲートは、サイトカイン(例えば、腫瘍に対しての免疫応答を刺激するサイトカイン)と同時投与される。

0137

いくつかの実施態様では、本明細書に記載されるとおりの抗KITモノクローナル抗体又は抗体−薬物コンジュゲートは、チロシンキナーゼ阻害剤(TKI)と組み合わせて使用される。

0138

一実施態様では、TKIは、欧州特許出願公開第0564409号に記載されているN−フェニル−2−ピリミジン−アミン誘導体、国際公開公報第2004005281号に記載されているピリミジニルアミノベンズアミド誘導体、国際公開公報第0062778号に記載されている環状化合物、国際公開公報第2007075869号に記載されている二環式ヘテロアリール化合物、米国特許第6002008号に記載されている置換3−シアノキノリン誘導体、国際公開公報第200504669号に記載されている4−アニロ−3−キノリンカルボニトリル誘導体、並びに米国特許第7728131号及び国際公開公報第2005063709号に記載されているアミド誘導体からなる群より選択される。

0139

特定の実施態様では、TKIは、イマチニブ、ニロチニブ、ダサチニブ、ポナチニブボスチニブ及びバフェチニブからなる群より選択される。

0140

好ましい実施態様では、TKIは、イマチニブ又は式(I):




の4−[(4−メチルピペラジン−1−イルメチル]−N−(4−メチル−3−{[4−(ピリジン−3−イル)ピリミジン−2−イル]アミノ}フェニル)ベンズアミド(NovartisによってGLIVEC(登録商標)として販売されており、以前はSTI571として公知である)である。

0141

好ましい実施態様では、TKIは、ニロチニブ又は式(II):




の4−メチル−N−[3−(4−メチル−1H−イミダゾール−1−イル)−5−(トリフルオロメチル)フェニル]−3−[(4−ピリジン−3−イルピリミジン−2−イル)アミノ]ベンズアミド(NovartisによってTASIGNA(登録商標)として販売されており、以前はAMN107として公知である)である。

0142

好ましい実施態様では、TKIは、ダサチニブ又は式(III):




のN−(2−クロロ−6−メチルフェニル)−2−[[6−[4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジニル]−2−メチル−4−ピリミジニル]アミノ]−5−チアゾールカルボキサミド一水和物(BMSによってSPRYCEL(登録商標)として販売されており、以前はBMS−354825として公知である)である。

0143

好ましい実施態様では、TKIは、ポナチニブ又は式(IV):




の3−(2−イミダゾ[1,2−b]ピリダジン−3−イルエチニル)−4−メチル−N−[4−[(4−メチルピペラジン−1−イル)メチル]−3−(トリフルオロメチル)フェニル]ベンズアミド(ICLUSIG(登録商標)として販売されており、以前はAP24534として公知である)である。

0144

好ましい実施態様では、TKIは、ボスチニブ又は式(V):




の4−[(2,4−ジクロロ−5−メトキシフェニル)アミノ]−6−メトキシ−7−[3−(4−メチルピペラジン−1−イル)プロポキシキノリン−3−カルボニトリル(PFIZERによってBOSULIF(登録商標)として販売されており、以前はSKI−606として公知である)である。

0145

いくつかの実施態様では、本明細書に記載されるとおりの抗KIT抗体又は抗体−薬物コンジュゲートは、治療モノクローナル抗体(mAb)と組み合わせて使用される。トラスツズマブハーセプチン、Roche)、ベバシズマブアバスチン、Roche)、及びセツキシマブアービタクス、Merck)は、認可されているこのようなmAb3種である。他のmAbとしては、限定されないが、インフリキシマブレミケード、Johnson&Johnson)、リツキシマブリツキサン、Roche)、アダリムマブヒュミラ、Abbott)及びナタリズマブ(タイサブリ、Biogen)が挙げられる。

0146

医薬組成物
投与のために、抗KIT抗体又は抗体−薬物コンジュゲートは、医薬組成物として製剤化される。抗KIT抗体又は抗体−薬物コンジュゲートを含む医薬組成物は、薬学的に有用な組成物を調製するための公知の方法にしたがって製剤化され得、それにより、治療分子は、薬学的に許容し得る担体との混合物で組み合わされる。組成物は、その投与がレシピエント患者に許容され得る場合、「薬学的に許容し得る担体」と言われる。滅菌リン酸緩衝生理食塩水は、薬学的に許容し得る担体の一例である。他の適切な担体は、当業者に周知である(例えば、Gennaro (ed.), Remington’s Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, 19th ed. 1995)を参照のこと)。製剤は、1つ以上の賦形剤保存剤可溶化剤緩衝剤バイアル表面のタンパク質のロスを防止するためのアルブミンなどをさらに含み得る。

0147

医薬組成物の形態、投与経路、用量及びレジメンは、当然のことながら、処置すべき状態、疾患の重篤度、患者の年齢、体重及び性別などに依存する。

0148

本発明の医薬組成物は、局所投与経口投与非経口投与鼻内投与静脈内投与筋肉内投与皮下投与又は眼内投与などのために製剤化され得る。

0149

好ましくは、医薬組成物は、注射可能な製剤のための薬学的に許容し得るビヒクルを含有する。これらは、特に、等張滅菌生理食塩水溶液リン酸一ナトリウム又は二ナトリウム塩化ナトリウム塩化カリウム塩化カルシウム又は塩化マグネシウムなど又はこのような塩の混合物)、又は乾燥組成物、特に凍結乾燥組成物であり得、これは場合に応じて滅菌水又は生理学食塩水の添加によって、注射液の構成が可能となる。

0150

投与に使用される用量は、様々なパラメータに応じて、特に、使用される投与様式、関連する病変、あるいは所望の処置期間に応じて適合され得る。

0151

医薬組成物を調製するために、有効量の抗体を薬学的に許容し得る担体又は水性媒体に溶解又は分散し得る。

0152

注射用途に適切な医薬形態としては、滅菌水溶液又は分散液;ゴマ油ピーナッツ油又は水性プロピレングリコールを含む製剤;及び滅菌注射液又は分散液の即時調製のための滅菌粉末が挙げられる。全ての場合において、形態は滅菌されていなければならず、容易にシリンジで扱える程度に流動性でなければならない。それは製造及び保存条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌などの微生物汚染作用に対して防腐されていなければならない。

0153

遊離塩基又は薬理学的に許容し得る塩としての活性化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水中で調製され得る。分散液はまた、グリセロール液体ポリエチレングリコール及びその混合物中で及び油中で調製され得る。通常の保存及び使用条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を防ぐための保存剤を含む。

0154

本発明の抗体は、中性形態又は塩形態の組成物に製剤化され得る。薬学的に許容し得る塩としては、(タンパク質の遊離アミノ基を用いて形成される)酸付加塩、及び無機酸(例えば、塩酸又はリン酸)又は有機酸(例えば、酢酸シュウ酸酒石酸マンデル酸など)を用いて形成されるものが挙げられる。遊離カルボキシル基と形成される塩はまた、無機塩基(例えば、水酸化ナトリウム水酸化カリウム水酸化アンモニウム水酸化カルシウム又は水酸化鉄)及び有機塩基(例えば、イソプロピルアミントリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなど)から誘導され得る。

0155

担体はまた、例えば、水、エタノールポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど)、適切なその混合物、及び植物油を含む、溶媒又は分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合には必要な粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物作用の抑制は、様々な抗細菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベンクロロブタノールフェノールソルビン酸チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば糖又は塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射用組成物持続的吸収は、吸収遅延剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物に使用することによってもたらされ得る。

0156

必要に応じて上に列挙されている様々な他の成分と一緒に、必要量の活性化合物を適切な溶媒に組み込み、続いて滅菌ろ過することによって、滅菌注射液を調製する。一般に、基本分散媒体と上に列挙されている必要な他の成分とを含有する滅菌ビヒクルに様々な滅菌有効成分を組み込むことによって、分散液を調製する。滅菌注射液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、予め滅菌ろ過したその溶液から有効成分と任意のさらなる所望の成分との粉末が得られる真空乾燥及び凍結乾燥技術である。

0157

より濃縮された又は高濃縮された直接注射用溶液の調製も企図され、この場合、極めて迅速な浸透をもたらして高濃度活性薬剤を小腫瘍領域に送達するために、溶媒としてDMSOを使用することが想定される。

0158

製剤化したら、投与製剤と適合性の方法によって治療有効量で溶液を投与する。製剤は、上記注射液型などの様々な剤形で容易に投与されるが、薬物放出カプセルなども用いることができる。

0159

水溶液による非経口投与の場合、例えば、必要の場合には前記溶液を適切に緩衝化し、十分な生理食塩水又はグルコースを用いて液体希釈剤を最初に等張にすべきである。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下及び腹腔内投与に特に適切である。これに関して、当業者であれば、本開示を考慮して、用いられ得る滅菌水性媒体を理解するであろう。例えば、1投与量を等張NaCl溶液1mlに溶解し、皮下注入液1000mlに追加し得るか、又は推奨注入部位に注射し得る(例えば、“Remington’s Pharmaceutical Sciences” 15th Edition, pages 1035-1038 and 1570-1580を参照のこと)。処置される被験体の症状に応じて、投与量のいくらかの変更が必ず生じるであろう。いずれにしても、投与責任者は、個々の被験体に適切な用量を決定するであろう。

0160

本発明の抗体は、1用量当たり約0.0001〜1.0ミリグラム又は約0.001〜0.1ミリグラム又は約0.1〜1.0又はさらには約10ミリグラムほどを含むように治療混合物内に製剤化され得る。複数回用量も投与され得る。

0161

静脈内又は筋肉内注射などの非経口投与のために製剤化された化合物に加えて、他の薬学的に許容し得る形態としては、例えば、錠剤又は経口投与のための他の固体;徐放性カプセル;及び現在使用されている任意の他の形態が挙げられる。

0162

特定の実施態様では、抗体を宿主細胞に導入するために、リポソーム及び/又はナノ粒子の使用が企図される。リポソーム及び/又はナノ粒子の形成及び使用は、当業者に公知である。

0163

ナノカプセルは、一般に、化合物を安定かつ再現可能な方法で捕捉し得る。細胞内のポリマーオーバーローディングによる副作用を回避するために、一般に、in vivoで分解可能なポリマーを使用して、このような超微細粒子(約0.1μmのサイズ)を設計する。これらの要件を満たす生分解性ポリアルキルシアノアクリラートナノ粒子が本発明における使用に企図され、このような粒子は容易に作製され得る。

0164

水性媒体に分散されて多層状で同心円状の二層ベシクル多層ベシクル(MLV)とも称される)を自然に形成するリン脂質から、リポソームが形成される。MLVは、一般に、25nm〜4μmの直径を有する。MLVの超音波処理により、200〜500Åの範囲の直径を有する小単層ベシクル(SUV)であって、コアに水溶液を含有する小単層ベシクルが形成される。リポソームの物理的特徴は、pH、イオン強度及び二価カチオンの存在に依存する。

0165

キット
最後に本発明はまた、本発明の少なくとも1つの抗体を含むキットを提供する。本発明の抗体を含有するキットは、KITの発現(増加又は減少)を検出する際に、又は治療的アッセイ若しくは診断的アッセイにおいて使用される。本発明のキットは、例えば組織培養プレート又はビーズ(例えば、セファロースビーズ)などの固体支持体にカップリングされた抗体を含有し得る。例えば、ELISA又はウエスタンブロットでは、KITをin vitroで検出及び定量するための抗体を含有するキットが提供され得る。検出に有用なこのような抗体は、蛍光又は放射性標識などの標識と共に提供され得る。

0166

以下の図面及び実施例によって、本発明をさらに説明する。しかしながら、これらの実施例及び図面は、決して本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。

図面の簡単な説明

0167

抗KIT scFvのパネルの選択及び初期特性評価。(A)リコンビナントバキュロウイルスが感染したHigh Five細胞で産生され、Ni−NTAアフィニティークロマトグラフィー後に精製したKIT−ECDのSDS−PAGE分析。(B)抗KITN末端モノクローナル抗体(Santa Cruz)による精製KIT−ECDのウエスタンブロット分析。(C)2回目及び3回目の選択ラウンドで得られたファージ抗体多様性の分析。KIT−ECDに対する結合についてELISAで陽性であったファージ抗体のクローン配列決定した。(D)HMC1.2細胞に結合するscFvのFACS分析。pHEファージミドを含有するTG1細菌から、IPTG 1mMを用いて、25℃で一晩かけてscFvを誘導した。上清を回収し、Amicon ultra-4 centrifugal unitsで濃縮し、HMC1.2細胞と共に4℃でインキュベーションした。抗c−myc抗体、及びフィコエリトリンにコンジュゲートした抗マウス免疫グロブリンを用いて、細胞に結合したscFvを検出した。FACSによって、蛍光を測定した。9超のMFIシグナル(非特異的Bot−Fcを用いて得られたMFI)を陽性とみなした。
二量体scFv−Fcフォーマットへのファージ抗体フォーマットの変換。(A)非還元条件(左のパネル)対還元条件(右のパネル)における5つの抗KIT ECD scFv−Fc及び無関係なscFv−Fc Bot−FcのSDS−PAGE分析。CHO細胞でScFv−Fcを生産し、プロテインAアガロースで精製する。(B)リコンビナントc−KIT ECDに対する精製scFv−Fc結合のELISA分析(EC50の計算については、表1を参照のこと)。
野生型KITシグナル伝達の抗体干渉。(A)無血清培地中でTF−1細胞を一晩飢餓させ、scFv−Fc(10μg/ml)と共にインキュベーションしてから、SCF(250ng/ml)で5分間刺激した。ホスホ特異的抗体を用いてウエスタンブロットによって、KIT及びAKTのリン酸化を分析した。膜を脱ストリップし、抗KIT及び抗AKT抗体で再プローブした後に、全KIT及びAKTレベルを可視化した。(B)5μg/mL(破線)若しくは50μg/mL(灰色)で示されている抗KIT抗体若しくはコントロール抗体の存在下の、又は抗体なし(黒色)のEPO(上のパネル)又はCHO−KL上清中で、UT7/EPO細胞をインキュベーションした。細胞生存率をOD495nmで表す。
WT状況におけるKITレベルの抗体モデュレーション非競合104D2−抗KIT抗体を使用してFACS(A、B)によって、KITレベルを推定した。(A)EPOを補充した完全IMDM培地中、scFv−Fc抗体(10μg/mL)又はCHO−KL(500倍希釈)と共に、UT7/EPO細胞を1時間、4時間又は24時間インキュベーションした。(B)EPOを補充した完全IMDM培地中、示されているように、単独で、又はCHO−KL若しくは抗体(5又は50μg/mL)と共に、又はCHO−KL(500倍希釈)のみと共に、UT7/EPO細胞をインキュベーションした。NM:非マーク細胞。結果をMFIで表す(平均蛍光強度)。(C)示されているKIT及びホスホKIT特異的抗体を使用してウエスタンブロットによって、全KITレベルも決定した。分析前に、10μg/mLの抗体と共に、細胞を5日間インキュベーションした。
発ガン性KITの抗体モデュレーション。5μg/mL(薄灰色)若しくは50μg/mL(中灰色)で示されている抗KIT抗体若しくはコントロール抗体の存在下の、又は抗体なし(濃灰色)のIMDM 1%血清中で、HMC1.1又はHMC1.2細胞をインキュベーションした。非処理細胞と比較した細胞生存率を%で表す。抗KIT抗体又はコントロール抗体(10μg/mL)の存在下のIMDM 10%血清中で、HMC1.1又はHMC1.2細胞を1時間、2時間又は24時間インキュベーションした。
発ガン性KITの抗体モデュレーション。示されているように、104D2抗KIT抗体を使用してFACSによって分析した。
発ガン性KITの抗体モデュレーション。示されているように、抗KIT及びホスホ特異的抗KIT抗体を使用してウエスタンブロットによって分析した。
発ガン性KITの抗体モデュレーション。抗KIT抗体で3日間処理することにより、両方の肥満細胞腫細胞株で低いKITレベルを維持した。
リコンビナントKIT−ECDに対するscFv−Fc結合のSPR分析及び動態データの決定。BIACORE 3000装置(GE Healthcare, Biacore AB, Uppsala, Sueden)を使用してリアルタイム表面プラズモン共鳴(SPR)分析によって、動態測定を実施した。GEHealthcareの抗ヒト捕捉キットプロトコールにしたがって、抗ヒトIgG(Fc)抗体をCM5センサーチップフローセル上に固定化した。抗体を用いない以外は同じ化学処理を用いて、参照フローセルを作製した。2つのフローセルにおいて、ランニング緩衝液としてHBS−EP(10mM HEPESpH7.4、150mM NaCl、3.4mMEDTA及び0.005%Biacore(商標)界面活性剤)を使用して、流速30μL/分、25℃で全ての分析を実施した。各scFv−Fcを20μg/mLで3分間注入し、続いて、様々な濃度(20nM〜330nM)のKIT−ECDを注入(90μL)した。400秒間の解離工程の後、3M MgCl2溶液を使用して、各ラン間でフローセル表面を再生した。無関係なscFv−Fc(Bot−Fc)をネガティブコントロールとして使用した。各scFvについて、KIT−ECDに代えて緩衝液を用いてランを実施して、減衰表面効果補正した。参照フローセルのシグナルを差し引くことによって、全てのセンサーグラムを補正し、BIAevaluation 3.2ソフトウェアを使用してグローバルフィッティングした。(A)ラングミュア1:1プロットを用いて、2D1−Fc及び3G1−Fcセンサーグラムをフィッティングした。(B)2D1及び3G1の固有親和性は、それぞれ173nM及び66nMであった。

0168

材料及び方法
細胞及び細胞培養条件:ペニシリン/ストレプトマイシン(Invitrogen)を補足した10%ウシ胎児血清(FBS;PAA)を含有するRPMI(Gibco)中で、Ba/F3、Ba/F3−KIT及びTF−1細胞株(Dr. Patrice Dubreuil, INSERM U891, Institut Paoli-Calmettes, Marseille, Franceより寄贈)を成長させた。GMCSF(10ng/mL)(Invitrogen)を含むX63−IL−3(Patrice Dubreuilより寄贈)及びTF−1の0.1%調節培地をBa/F3及びBa/F3−KIT細胞に補充した。FBS及び抗生物質を含有する上記IMDMであって、EPO(2U/mL)又はSCFのいずれかを補充したIMDM中で、UT7/Epo細胞株(Epoの存在下で6カ月超維持したUT−7細胞から樹立した亜系統のUT−7細胞)(Dr. Isabelle Dusanter-Fourt, INSERM U1016, Institut Cochin, Paris, Franceより寄贈)を成長させた。実験に応じて、リコンビナントヒトSCF(Cell Signaling)又はCHO−KL(マウスSCFを分泌するように改変されたCHO細胞株)培養上清(Michel Arock, LBPA, ENS Cachanの寄贈物)をSCF源として使用した。単一突然変異V560G KITアレル又は二重突然変異V560G D816V KITアレルを有するHMC1.1及びHMC1.2細胞株は、Michel Arock, ENS Cachan, Cachan, Franceの寄贈物である。G418(0.5mg/mL)(Gibco)を補充したDMEM−FBS10%−ペニシリン/ストレプトマイシン中で、HEK−T細胞株を成長させた。CO2(5%)が豊富加湿雰囲気中で、これらの細胞全てを37℃で培養した。それぞれ20mM L−グルタミン(Invitrogen)、ペニシリン/ストレプトマイシンを補充したGrace培地又はExpress Five培地(両方ともFisher Scientific製)中で、昆虫細胞であるSf9細胞及びHigh Five細胞(Invitrogen)を27℃で成長させた。また、10%FBSをGrace培地に補充した。

0169

抗体及び薬理学的試薬:ウエスタンブロット分析では、抗KIT細胞外ドメイン(H300)及び抗Erk2抗体はSanta Cruz Biotechnology Inc.から入手したものであり、抗ホスホ−Akt(Ser473)及び抗ホスホ−Erk(Thr202/Tyr204)はCell Signalingから入手したものであり、抗Akt及び抗GAPDHはMilliporeから入手したものであり、抗ホスホ−KIT(Y823)はInvitrogenから入手したものであった。フィコエリトリン(PE)結合104D2ヒトモノクローナル抗体(これは、SCF結合を阻害しない)(Biolegend)及びアロフィコシアニン(APC)結合104D2(BD Biosciences)をフローサイトメトリー分析に使用した。イマチニブは、Serge Roche (Centre de Recherche de Biochimie Macromoleculaire −CNRS UMR5237, Montpellier, France)から寄贈物であり、ダサチニブは、Santa Cruzから入手したものであった。

0170

リコンビナント可溶性KIT−ECDの発現及び精製:可溶性リコンビナントKIT−ECDを、バキュロウイルス/昆虫細胞系において産生した。6xHisタグに融合したKIT−ECDインサートを、プラスミドpSKΔSapI c−Kit(Frederic Subra, LBPA, ENS Cachan, Cachan, Franceからの寄贈物)のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅によって作製した。BamHI(5’末端)及びXbaI(3’末端)制限部位を含有する増幅産物をベクターpGEM−T Easy(Promega)にクローニングし、制限分析によって分析した。Kit−ECD BamHI/XbaIをpGEM−T EasyからBD Baculogold(商標)トランスファーベクターpVL1383(Beckton Dickinson)にサブクローニングした。BD Baculogold(商標)プロトコールにしたがって、Sf9細胞において、リコンビナントKIT−ECDバキュロウイルスを生産した。可溶性リコンビナントKIT−ECDタンパク質を生産するために、High Five細胞を無血清培地に播種し、リコンビナントバキュロウイルスを感染させ、無血清培地中で4日間成長させた。分泌6Hisタグを含有する培養培地を回収し、Ni−NTAアフィニティークロマトグラフィー(Qiagen)による精製前に、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で透析した。Amicon濃縮装置(Millipore)を使用して溶出画分溶出緩衝液PBS−イミダゾール250mM)を濃縮し、PBS中に緩衝化した。BCAアッセイタンパク質定量キット(Interchim)によって総タンパク質濃度を決定し、クマシーブルー染色前に、還元条件下でSDS−PAGEによって、精製タンパク質を分析した。

0171

KIT−ECD特異的ファージ抗体の選択:50μg/mLのKIT−ECD 100μLを使用して、maxisorp96ウェルプレート(Nunc)のウェルを4℃で一晩コーティングした。PBS−2%ミルクでウェルを室温(RT)で2時間飽和させてから、PBS−2%ミルクで希釈した1011cfuのファージライブラリ(Sheets et al., 1998)を追加した。室温で2時間インキュベーションした後、PBS−Tween 0.1%でプレートを20回洗浄し、PBSで10回洗浄した。100mMトリエチルアミンでファージを溶出し、トリス1M溶液(pH7)で中和した。記載されているように(Marks et al., 1991)、Escherichia coli TG1の感染によってインプットファージ及びアウトプットファージを滴定して、選択をモニタリングした。別の選択ラウンドのために、結合したファージを増幅した。3回の選択ラウンドを実施した。記載されているように(Marks et al., 1991)、2回及び3回の選択ラウンドの後、96ウェルプレートで成長させた単一コロニーから可溶性scFvを発現させ、1mMIPTGで一晩誘導した。記載されているように(Schier et al., 1996)、可溶性scFvを含有する未精製の培養上清を、リコンビナントKIT−ECD又はウシ血清アルブミン(BSA)(Sigma)(ネガティブコントロール)に対する結合について、ELISAによって試験した。配列決定によって、ELISAの陽性クローンの多様性を決定した。細胞結合について、蛍光活性細胞選別(FACS)によって、ELISAの陽性クローンを試験した。200000個のHMC1.2細胞を4℃のPBS−1%FBS(FACS緩衝液)100μLに再懸濁した。培養上清100μLを細胞に4℃で2時間かけて追加した。FACS緩衝液で細胞を洗浄し、抗c−myc抗体(9E10;Sigma)、続いてPE結合ヤギ抗マウス免疫グロブリン(Ig)(Beckton Dickinson)を用いて、細胞に対するscFv結合を検出した。

0172

ヒトscFv−Fcの発現及び精製:ヒト免疫グロブリンγ1のFcフラグメントと融合したscFvを発現させるために、scFvcDNAをNcoI/NotI消化し、ファージミドpHEN(Hoogenboom et al., 1991)からpFUSE−hFc2(IL2ss)ベクター(Moutel et al., 2009)(Frank Perez, CNRS-Institut Curie UMR144, 26 rue d’Ulm, Paris, Franceからの寄贈物)にサブクローニングした。150cm2組織培養皿に培養したHEK−T細胞の一過性トランスフェクションの後、110kDの可溶性scFv−Fcを生産した。細胞が80%コンフルエンスに達したら、培養培地を除去し、DMEM−ペニシリン/ストレプトマイシンと交換した。プラスミドDNA 30μg及びポリエチレンイミン(Polyscience)200μgを使用して、トランスフェクションを実施した。37℃で5日間経過した後、細胞上清を回収し、プロテインAセファロースカラム(GE Healthcare)を用いてscFv−Fcを精製した。PBSで溶出画分を希釈し、Amicon ultra-4 centrifugal unitsで濃縮した。同じ条件で生産したscFv−Fc結合ボツリヌス神経毒(Bot)(Amersdorfer et al., 1997)及びCD71(H7)を無関係な抗体フラグメント及び抗増殖ポジティブコントロールとして使用した。

0173

リコンビナントKIT−ECDに対するscFv−Fc結合のELISA分析:PBSで5μg/mLに希釈したKIT−ECD(又はBSA)でmaxisorp96ウェルプレート(Nunc)を4℃で一晩コーティングした。PBS−BSA 1%300μLでウェルを室温で2時間飽和させた。PBS−BSA 1%でscFv−Fcを希釈し、室温で2時間インキュベーションした。PBS−Tween 0.05%でプレートを2回洗浄し、PBSで1回洗浄してから、HRP結合ヤギ抗ヒトFcフラグメント免疫グロブリン(Sigma)を追加した。2,2’−アジノ−ビス(3−エチルベンズチアゾリン6−スルホン酸)(ABTS)溶液(Roche)を用いて、プレートを明らかにした。GraphPadソフトウェアを用いて、フィット及びEC50を決定した。

0174

細胞に対するscFv−Fc結合のフローサイトメトリー分析:FACS緩衝液(PBS、1%FCS)100μLに再懸濁した2×105個の細胞を使用してフローサイトメトリーによって、細胞結合を試験した。全てのインキュベーションを4℃で行って、KITのエンドサイトーシスを防止した。APC結合抗KITを用いて、KITの細胞表面発現を測定した。PE結合ヤギF(ab’)2フラグメント抗ヒトFcフラグメント(Rockland)を用いて、scFv−Fc結合(10μg/mL)を検出した。競合実験では、細胞をSCF(1μg/mL)と共に40分間プレインキュベーションしてから、scFv−Fcを追加した。GraphPadソフトウェアを用いて、フィット及びEC50を決定した。

0175

酵母ディスプレイ及び酵母ディスプレイを使用した親和性測定:2D1及び3G1のKd値を改善するために、本発明者らは、酵母ディスプレイを使用した軽鎖シャッフリングによる親和性成熟を使用した。VH配列をヒトVLラムダライブラリと組み合わせ、ベクターpYD2(Zhao, Qu et al., 2014)を使用して酵母上にディスプレイさせ、KIT親和性がより高いscFvをディスプレイする酵母を、限界濃度の抗原で染色がより強いことに基づいてFACSによって選別した。Kdを測定するために、1000000個の親scFv−2D1をディスプレイする酵母、親和性成熟scFv−2D1C7、scFv−3G1、親和性成熟scFv−3G1A2又は無関係なscFvを、少なくとも6倍モル過剰のビオチン化KIT−ECDと共に4℃で1時間インキュベーションした。次いで、細胞を上に置き、氷冷FACS緩衝液で洗浄し、結合した抗原をPE結合ストレプトアビジンで検出した。

0176

ウエスタンブロット分析:無血清培地中で細胞を37℃で一晩飢餓させ、scFv−Fc(10μg/mL)と共に45分間インキュベーションしてから、リコンビナントSCF(100ng/mL)で5分間刺激した。停止緩衝液[150mM NaCl、50mM Tris−HCl(pH6.7)、1mMEDTA、2mM Na3VO4、7.5mM、Na4P2O7、100mM NaF]で細胞を迅速に洗浄し、1mMPMSF、0.25%DOC、1%NP40及びプロテアーゼ阻害剤カクテル(Roche Diagnostic)を補充した停止緩衝液に溶解した。溶解物を氷上で30分間インキュベーションし、4℃、13000×gで10分間遠心分離することによって清澄化した。BCAアッセイ(Interchim)を用いて、新鮮な溶解物を定量した。タンパク質30μgを還元ローディング緩衝液[2Mトリス(pH6.7)、4%SDS、40mM DTT、40%グリセロール、ブロモフェノールブルー]と混ぜ合わせ、SDS−PAGEによって分離し、ニトロセルロース膜(Amersham Bioscience)に転写した。

0177

増殖アッセイ:UT−7を細胞104個/ウェルで播種し、EPO又はCHO−KL上清(500倍希釈)の存在下、5又は50μg/mLの2D1、3G1、H7又は無関係なBot抗体で4日間処理した。10%に代えて1%SVFを使用し、サイトカインを使用しなかった以外は同様に、HMC1.1及び1.2を7日間処理した。製造業者が推奨するように、MTSアッセイ(PROMEGA)を用いて、細胞生存率を推定した。

0178

インターナリゼーションアッセイ:HMC1.1、HMC1.2及びUT−7/EPO細胞を細胞105個/ウェルの密度プレーティングし、EPO中2D1、3G1若しくはBot−Fc(10μg/mL)又はCHO−KL上清(500倍希釈)と共に37℃で1時間、4時間、24時間又は5日間インキュベーションした。PBSで細胞を室温で洗浄し、4℃で15分間固定し(Cytofix, BD biosciences)、非競合PE/Cy7結合抗ヒトKIT 104D2で染色し、上記のようにFACSによって分析した。

0179

結果
KIT−ECD特異的一本鎖Fv(ScFv)抗体の選択及び初期特性評価:本研究の目的は、KITシグナル伝達を阻害してKIT依存性腫瘍におけるガン細胞成長を妨げ得る完全ヒトKIT特異的抗体を単離することであった。本発明者らは、本発明者らがバキュロウイルス感染によって昆虫細胞で生産したリコンビナント型ヒトKIT細胞外ドメイン(KIT−ECD、アミノ酸26〜509、P10721 UniProtKB/Swiss−Prot)に対する抗体ファージディスプレイ選択を進めた。還元SDS−PAGEゲルにおいて、精製C末端6HisタグリコンナントKIT−ECDを分析し(図1A)、KITの細胞外ドメインに対する市販の抗体(H-300, Santa Cruz)を用いたウエスタンブロットによって検出された、60kDの主要タンパク質も示されたので(図1B)、その産生が証明された。選択のために、7.0×109メンバーヒトscFvファージナイーブ抗体ライブラリ(Sheets, 1998)からファージを調製した。3回の選択ラウンド(表1)の後、2回目及び3回目のラウンドからの94個のクローンを、リコンビナントKIT−ECDに対する結合について、可溶性scFvELISAによって試験した。陽性クローン(2回目のラウンドでは7/94;3回目のラウンドでは13/94)を配列決定及び分析して、異なる選択頻度を示した8個の異なるscFvを同定した(2D1が最も高頻度である)(図1C)。これらのクローンのうちの5個は、2回目の選択ラウンドから存在し(2D1、2A3、2B8、2B12、2A6)、3個は、3回の選択ラウンド後にのみ現れた(3G1、3C12、3A12)。哺乳動物細胞と比較して区別可能なN−グリコシル化酵素機構を有する(Shi and Jarvis 2007)昆虫細胞で生産したリコンビナント型ヒトKITに対する親和性について、これらのクローンを選択したので、本発明者らは、KITを高発現するヒト肥満細胞腫細胞株HMC1.2を使用して、それらが内因性KITに結合し得るかを試験した。scFv可溶性フォーマットの8個のうちの5個の抗体(2D1、2A3、3G1、2B12、2A6)は、HMC1.2細胞を染色し、したがって十分な感度で内因性KITを検出することが見出され(図1D)、さらなる分析のために処理した。

0180

二価scFv−Fcフォーマットへの変換:KITに対する結合活性を増加させるために、5個の抗KIT一価のscFvを、ヒンジドメインのscFvとヒトγ1免疫グロブリンアイソタイプの2つの定常ドメインとのC末端融合物からなる二価scFv−Fcフォーマット(Moutel et al., 2009)に変換した。HEK細胞で一本鎖Fv−Fc分子を生産し、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製した。回収した分子種のSDS−PAGE分析は、共有結合scFv−Fcホモ二量体(各55kD)に対応する予想分子量110kDのタンパク質を示した(図2A)。次に、本発明者らは、リコンビナントKit−ECDに対する結合をELISAにより試験することによって、5個のscFv−Fcを検証した。全てのscFv−FcのKd(見掛け親和性定数又はEC50)(表2)は、2A6を除いてナノモル範囲であり、2A6については、最大試験濃度(10μg/mL又は91nM)でELISAシグナルの飽和が得られず、これは、結合能力が低いことを示唆している。試験した抗体のうち、2D1は、最低の見掛けのKd(0.6nM又は0.067μg/mLのEC50)を示した(図2B)。したがって、全てのscFv−Fcがレセプターに結合した一方、同じ条件で生産した同じフォーマットの無関係な抗体フラグメントは結合しなかったことから、scFvのscFv−Fcへの再フォーマット、及び細菌に代えて哺乳動物細胞における生産は、抗体特異性を保存した。

0181

細胞に対するscFv−Fc結合、及びKITに結合するSCFとの競合:本発明者らは、市販の104D2マウスmAbよって検出されたように(Broudy et al., 1998)、異なるレベルの表面KITを発現する細胞株(ヒト肥満細胞腫HMC1.2細胞株、赤白血病TF−1細胞株、及びヒトKITを発現するように改変したマウスpro−B Ba/F3細胞株(中レベルのKIT、Ba/F3−KIT細胞株)を含む)に対する5個の抗KIT scFv−Fcの結合を試験した。内因性マウスKITを発現しない親マウスBa/F3細胞株をネガティブコントロールとして使用した。FACS分析により、5個の抗KIT scFv−Fc(10μg/mL)全てについて、HMC1.2及びTF−1細胞上におけるKIT検出が示され、2A6−Fcは、両方の細胞株においてより弱い染色を示した。2B12、2D1及び3G1−FcはBa/F3−KIT細胞を染色したが、Ba/F3細胞株では染色は陰性であり、これは、KIT特異性を裏付けている。予想外のことに、2A3は、HMC12細胞の染色が強かったにもかかわらず、Ba/F3 KIT細胞株を染色しなかった。

0182

次いで、本発明者らは、SCFが、KITに対する抗体の結合を遮断し得るかを試験した。KIT高発現細胞HMC1.2を4℃で維持し、SCF(1μg/mL)の有無の下でインキュベーションしてから、抗KIT scFv−Fc(10μg/mL)を追加し、結合した抗体をFACSによって検出した。SCFと共にプレインキュベーションすることによって、2A6、2D1及び3G1−Fcの結合は有意に減少したが、これは、SCF及び抗体が、このレセプター上の重複部位に結合し得ることを示唆している。あるいは、SCFは、抗KIT抗体のさらなる結合を防ぐKITの立体構造変化を誘導し得る。

0183

野生型KITシグナル伝達の抗体干渉:KIT活性化は、SCF結合によって誘導される二量体化によって生じるので、抗KIT scFv−Fcは、それらの二量体フォーマットによりKITをアゴニスティックに活性化し得る。この仮説を試験するために、野生型KITの2つのアレルを示す赤白血病細胞株TF−1を、無血清無GM−CSF培地中で一晩培養してから、scFv−Fc(10μg/mL)で処理した。粗タンパク質抽出物のウエスタンブロット分析により、5個のscFv−Fcはいずれも、KITの完全キナーゼ活性に必要なチロシン823(これは、キナーゼドメインの活性化ループに位置する)のKITリン酸化(Agarwal et al. 2013)を誘導しなかったことが示された。あるいは、本発明者らは、scFv−FcがSCFによるKIT刺激を防ぎ得るかを試験した。飢餓TF−1細胞をscFv−Fc(10μg/mL、45分間)と共にインキュベーションしてから、リコンビナントSCF(100ng/mL、10分間)で刺激した。ウエスタンブロットにより、2A6、2D1及び3G1−Fcは、チロシン823のSCF誘導性KITリン酸化を阻害したが(2D1及び3G1−Fcが最も有効である)、無関係な同一の抗体フォーマットは阻害しなかったことが明らかになった(図3A)。同じ抗体によってAKTリン酸化も減少し、2D1及び3G1−Fcによる減少は、2A6A−Fcよりも強力であった。したがって、本研究の残りの部分において、本発明者らは、2D1及び3G1−Fc抗体フォーマットに焦点を当てた。

0184

SCF依存性KITシグナル伝達に対する2D1及び3G1−Fcのアンタゴニスト効果が機能効果に変わったかを調査するために、本発明者らは、UT−7/EPO細胞株(これは、そのin vitro増殖がEPO又はSCFのいずれかに依存する)(Erickson-Miller, Pelus et al. 2000)を使用した。抗体は単独で、EPO又はSCFの非存在下では、UT−7/EPO細胞の成長を維持しなかったが(示さず)、細胞をEPOではなくSCFと共に培養した場合には、細胞生存率を用量依存的に減少させた一方、同じフォーマットの抗TfR1(輸送レセプター1)抗体は、EPO及びSCF培養細胞の両方において、細胞生存率を減少させ、無関係な抗体は効果がなかった(図3B)。加えて、TF−1細胞のように、2D1及び3G1−Fcは、KITシグナル伝達に関連する下流のエフェクター経路(チロシン823におけるKITのリン酸化、AKT及びERKのリン酸化)を阻害し、単独で使用した場合には、UT−7/EPO細胞株におけるKITシグナル伝達を刺激しなかった(示さず)。

0185

これらの結果は、KIT特異的2D1及び3G1−Fcが、野生型KITを発現する細胞においてSCF依存性KITシグナル伝達を阻害すること、並びにこの効果がおそらく部分的には、KITに対するSCF結合の遮断によるものであることを示している。2D1及び3G1−Fcの特性評価を完了するために、KIT−ECDに対するそれらの固有親和性を表面プラズモン共鳴によって決定したところ、それぞれ173及び66nMであると推測された(図6)。

0186

2D1及び3G1の詳細なエピトープマッピング:KIT細胞外ドメイン(ECD)は、5つのIgドメインから構成される。結晶構造から、ドメイン2及び3に対する二量体KITリガンド結合が、細胞表面におけるKITの二量体化、KIT二量体の各メンバーのドメイン4とドメイン5との間の同型相互作用(これは、このレセプターの細胞内チロシンキナーゼの活性化に有利な細胞内ドメインのねじれを引き起こす)を誘導することが公知である(Yuzawa S, et al. 2007)。2D1及び3G1抗体が結合するドメインを明確に同定するために、本発明者らは、全長KIT又は短縮型KITを酵母の表面にディスプレイさせた。目的の抗原を酵母表面Aga2タンパク質に融合する。目的の抗原とAga2との間の柔軟なリンカーは、抗体に対する抗原のアクセシビリティ保証する。KITのようなチロシンキナーゼレセプターファミリーのメンバーであるヒトEGFRのドメインは、酵母表面上に機能的にディスプレイされ、Abエピトープをマッピングするのに使用されている(Johns, Adams et al. 2004)。Zhao, Qu et al. 2014に記載されているように、酵母発現ベクターpYD2を使用して、全長ヒトKIT細胞外ドメイン(アミノ酸26〜519;ヌクレオチド76〜1542、cDNA配列参照NM_001093772.1)を酵母上にディスプレイさせ、また、短縮型D1−D3(アミノ酸26〜307、ヌクレオチド76〜921)、D4−D5(アミノ酸308〜516、ヌクレオチド922〜1548)、D4(アミノ酸308〜409、ヌクレオチド922〜1227)及びD5(アミノ酸410〜516、ヌクレオチド1228〜1548)のいずれかを発現させた。異なるドメインを発現する酵母を2D1若しくは3G1 scFv−Fc、続いてフィコエリトリン(PE)結合抗ヒトIgGで染色し、又はKITに対するSCF結合を阻害しないと記載されている市販のフィコエリトリン(PE)−シアニン7(PE−Cy7)結合モノクローナル抗ヒトKIT抗体104D2(Biolegend)で染色した。

0187

抗Kit抗体2D1及び3G1−scFv−Fc(15nM)又はPE−Cy7結合104D2(1,5nM)を、KITドメイン1〜3(KIT−D1−3)、KITドメイン4及び5(KIT−D4−5)又は全長KIT細胞外ドメイン(KIT−D1−5)のいずれかをディスプレイする1000000個の酵母と共に室温で1時間インキュベーションした。PE結合抗Hu−FcIgを用いて、2D1及び3G1−scFv−Fcの結合を検出した。104D2がKITD13に結合するかにかかわらず、2D1及び3G1はKIT D4−D5に結合する。抗Kit可溶性2D1及び3G1 scFv−Fcを、酵母上にディスプレイされたKITドメインD4又はKITドメインD5と共にインキュベーションした。2D1及び3G1は両方とも、KITのドメインD5に特異的に結合する。2D1及び3G1−scFv−Fc(15nM)の存在下において、酵母上にディスプレイされたKIT−D1−5に対するPE−Cy7結合104D2(1,5nM)の結合を試験した。2D1及び3G1はいずれも、酵母上にディスプレイされたKITに対する104D2結合を阻害しない。

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