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技術 PCV2B分岐ワクチン組成物及び使用方法

出願人 ゾエティス・サービシーズ・エルエルシー
発明者 ニッツェル,グレゴリー・ポールスレード,デヴィッド・イーウェル
出願日 2014年9月24日 (6年7ヶ月経過) 出願番号 2016-516851
公開日 2016年10月13日 (4年7ヶ月経過) 公開番号 2016-531854
状態 特許登録済
技術分野 化合物または医薬の治療活性 抗原、抗体含有医薬:生体内診断剤
主要キーワード 連続分割 流体ビヒクル デュエル 経済損失 キーパラメータ 技術プロセス シード材料 BEI
関連する未来課題
重要な関連分野

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図面 (8)

課題・解決手段

本発明は、ブタを、強毒性のブタサーコウイルス2b型(PCV2b)分岐株を含むPCV2から保護するためのワクチン組成物を提供し、本組成物は、PCV2b分岐ORF2ポリペプチドを含み、ORF2ポリペプチドは、本明細書の配列番号1の番号付与に従って、89位にロイシン(L)、90位にスレオニン(T)、及び134位にアスパラギン(N)を含む。

概要

背景

サーコウイルス科サーコウイルス属のメンバーであるブタサーコウイルス2型(PCV2)は、1998年に初めて発見された、小さくエンベロープを持たない環状ウイルスである。PCV2は、ブタ産業遭遇した2つの最も流行している病原体のうちの1つであり、もう一方は、マイコプラズマハイオニューモニエ(M.hyo)である。PCV2に感染したブタは、一般的に離乳後多臓器発育不良症候群(PMWS)と称される症状を呈する。PMWSは、衰弱、皮膚の蒼白さ、発育不良、呼吸困難下痢、及び黄疸(icterus、jaundice)によって、臨床的特徴付けられる。PMWSに加え、PCV2は、偽性狂犬病、ブタ生殖及び呼吸症候群PRRS)、流行性肺炎グレーサー病、連鎖球菌性髄膜炎サルモネラ症、離乳後大腸菌病、食事性肝臓症、及び化膿性気管支肺炎を含む、いくつかの他の疾患と関連してきた。あらゆる年齢層のブタにおけるPCV2感染の様々な臨床症状は、ブタサーコウイルス関連疾病(PCVAD)として知られ、衰弱及び発育遅延によって特徴付けられる。PRRSウイルスブタインフルエンザウイルス(SIV)、M.hyo、及び他の細菌が、PCVADの発症における重要な補助因子として、関連があるとされている。PCVADは、絶えず国際的ブタ産業にとっての脅威であり、大きな経済損失をもたらしている。

PCV2分離株は、現在PCV2a、PCV2b、及びPCV2cの3つの遺伝子型にさらに細分される。PCV2は、複製(ORF1、945ヌクレオチド)と関連するタンパク質及びウイルスキャプシド(ORF2、702ヌクレオチド)をコードする2つの主な読み取り枠(ORF)を含む。PCV2は、近年、著しい遺伝的変異を起こしている。典型的なPCV2a及びPCV2b遺伝子型と比較して、ORF2コード化キャプシドタンパク質のC端末に追加のリジン(K)を有する新興PCV2変異体は、2008年に、流産したブタからの血清試料から単離された(Guo et al.,2010,Virology Journal7:273)。この新興PCV2変異体において、ゲノム配列の1039位の1つの塩基欠失が、ORF2の終止コドンの変異(UAAからAAGへ)をもたらし、705ヌクレオチドのORF2遺伝子及び新しい終止コドンを生じさせた(Guo et al.,2011,Virology Journal8:291)。さらに、Knellらは、欠失(T)が1つの株(GenBank番号AY713470)の1767ヌクレオチドのゲノムの1042位に見られ、これが、ORF2コード化キャプシドタンパク質のC末端の1つのアミノ酸(リジン)によって伸長へとつながったために、変異が、ORF2遺伝子で起こり得たと、以前に報告した(Knell et al.,2005,Veterinary Microbiology 109:169−177)。Olveraらもまた、ORF2の終止コドンの変異に起因するキャプシドタンパク質のC末端の1つのリジン残基による伸長を報告した(Olvera et al.,2007,Virology357:175−185)。さらに、GenBank受託番号JQ413808の「JSTZ」と名付けられたPCV2株が、中国の激しく下痢した子ブタ糞便試料において検出及び同定され、その完全な1767ヌクレオチドのゲノムが配列決定された(Li et al.,2012,Journal of Virology(jvi.asm.org),p.4716)。PCV2株JSTZのゲノム及び他の中国のPCV2株のORFに基づく系統発生解析は、PCV2株JSTZが、中国の新規遺伝子型に属することを示した(Li et al.,2012(上記))。

Guoらは、2008年にPMWSで流産したブタからの試料から回収されたPCV2b/rBDHまたはBDH(Gen Bank受託番号HM038017)と名付けられたPCV2変異株の相対毒性を評価し、典型的なPCV2a及びPCV2b遺伝子型と関連するものよりも強力な、子ブタ内のPCV2変異株の毒性を確認した(Guo et al.,2012,PLoS ONE(plosone.org),Vol.7,Issue7,e41463,1−10)。このPCV2変異株は、さらに深刻なPMWSと一致する徴候を示し、衰弱、咳嗽、呼吸困難、下痢、粗い被毛、及び元気消失によって特徴付けられた。加えて、病理学的病変及びウイルス血症、ならびにリンパ節扁桃腺、及び脾臓におけるウイルス量は、典型的なPCV2a及びPCV2bでチャレンジされた群のものたちと比較して、PCV2変異株でチャレンジされた子ブタに関してさらに著しく深刻であった。さらに、PCV2変異株でチャレンジされた群において、一般的なPCV2a及びPCV2b遺伝子型でチャレンジされた群よりも著しく低い日々の平均体重増加が記録された(Guo et al.,2012(上記))。

米国に位置する生産システムのPMWSに罹患したブタのワクチン不全が疑われたケースにおいて、US22625−33及びUS22664−35の2つのPCV2株が、最近同定された(Xiao et al.,2012,Journal of Virology(jvi.asm.org),Vol.86,No.22,p.12469)。これら2つのUS株の全ゲノムは、1767ヌクレオチドからなることが見出され、そのORF2遺伝子の大きさは、705ヌクレオチドであり、一般的なPCV2のものよりもアミノ酸が1つ長い234アミノ酸のORF2タンパク質をコードする。典型的なPCV2a及びPCV2b株のORF2のヌクレオチド配列を用いた系統発生解析は、米国PCV2株のUS22625−33及びUS22664−35の両方が、PCV2bと近縁関係にあることを示唆した。典型的なPCV2bと比較して、ORF2遺伝子内の単一の塩基欠失は、ORF2タンパク質のC端末への単一のアミノ酸(リジン)の追加をもたらした。さらなる配列BLAST及び比較は、両方の米国PCV2株が、中国で発見されたPCV2株のBDHと高レベル同一性を有したことを示し、毒性の増加したものであることを報告した。ORF1における1つの沈黙突然変異(1677A→1677T)が、BDHと2つの米国変異体PCV2sとの間で発見された。新規PCV2遺伝子型定義及び命名基準(Cortey,et al.,2011,Vet.Microbiol.149:522−523;Segales,et al.,2008,Vet.Rec.162:867−868)に従って、これら新規変異体PCV2株のすべてが、ORF2遺伝子のヌクレオチド配列の系統発生解析に基づいて、PCV2b遺伝子型に分類され得る(Xiao et al.,2012(上記))。

新規PCV2b分岐の報告された毒性の増加、ならびに米国におけるワクチン不全の疑いのケースにおけるその存在を考慮すると、求められているものは、この新規PCV2b分岐に対する有効なワクチンである。好ましくは、このワクチンは、M.hyo及びPRRSウイルス等の他のブタ抗原互換性があるであろう。

概要

本発明は、ブタを、強毒性のブタサーコウイルス2b型(PCV2b)分岐株を含むPCV2から保護するためのワクチン組成物を提供し、本組成物は、PCV2b分岐ORF2ポリペプチドを含み、ORF2ポリペプチドは、本明細書の配列番号1の番号付与に従って、89位にロイシン(L)、90位にスレオニン(T)、及び134位にアスパラギン(N)を含む。

目的

一実施形態において、組成物は、典型的なPCV2a株及びPCV2b株に対しても異種保護を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
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牽制数
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請求項1

ブタを、強毒性のブタサーコウイルス2b型(PCV2b)分岐株を含むPCV2から保護するためのワクチン組成物であって、前記組成物は、PCV2b分岐ORF2ポリペプチドを含み、前記ORF2ポリペプチドは、配列番号1の番号付与に従って、89位にロイシン(L)、90位にスレオニン(T)、及び134位にアスパラギン(N)を含む、前記組成物。

請求項2

前記組成物は、前記PCV2b分岐ORF2ポリペプチドを含む及び/または発現する不活化PCV2b分岐全ウイルスの形態である、請求項1に記載の前記組成物。

請求項3

前記組成物は、不活化キメラウイルスの形態であり、前記キメラウイルスは、前記PCV2b分岐ORF2ポリペプチドを含む及び/または発現する不活化組換えブタサーコウイルス1型を含む、請求項1に記載の前記組成物。

請求項4

前記組成物は、単離された組換えPCV2b分岐ORF2ポリペプチドの形態である、請求項1に記載の前記組成物。

請求項5

前記単離された組換えPCV2b分岐ORF2ポリペプチドは、ベクターから発現される、請求項4に記載の前記組成物。

請求項6

前記ベクターは、バキュロウイルスまたはパラポックスウイルスである、請求項5に記載の前記組成物。

請求項7

前記ベクターは、生または不活化ベクターである、請求項5に記載の前記組成物。

請求項8

前記PCV2b分岐ORF2ポリペプチドは、配列番号1の番号付与に従って、残基59にリジン(K)、残基234にリジン(K)、残基190にスレオニン(T)、残基53にイソロイシン(I)、残基68にアスパラギン(N)、残基169にアルギニン(R)またはグリシン(G)、及び残基215にイソロイシン(I)からなる群から選択される少なくとも1つの残基をさらに含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の前記組成物。

請求項9

前記PCV2b分岐ORF2ポリペプチドは、配列番号1の番号付与に従って、残基59にリジン(K)及び残基234にリジン(K)をさらに含む、請求項1〜7のいずれかに一項に記載の前記組成物。

請求項10

前記PCV2b分岐ORF2ポリペプチドは、配列番号1の番号付与に従って、残基190にスレオニン(T)、残基53にイソロイシン(I)、残基68にアスパラギン(N)、残基169にアルギニン(R)またはグリシン(G)、及び残基215にイソロイシン(I)をさらに含む請求項9に記載の前記組成物。

請求項11

前記PCV2分岐ORF2ポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列またはその断片によって表される、請求項1〜10のいずれか一項に記載の前記組成物。

請求項12

少なくとも1つの追加のブタ抗原をさらに含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載の前記組成物。

請求項13

前記少なくとも1つの追加の抗原は、微生物によって引き起こされるブタ内の疾患から保護する、請求項12に記載の前記組成物。

請求項14

前記微生物は、細菌、ウイルス、または原生動物を含む、請求項13に記載の前記組成物。

請求項15

前記微生物は、マイコプラズマハイオニューモニエ(M.hyo)、ブタ生殖及び呼吸症候群ウイルス(PRRSV)、ブタパルボウイルス(PPV)、ヘモフィルスパライスパスツレラマルトシダストレプトコッカム・スイス(Streptococcumsuis)、スタフィロコッカス・ヒカスアクチノバチルスプルニューモニエ気管支敗血症菌サルモネラコレレスイス、サルモネラ・エンテリティディス、ブタ丹毒菌、マイコプラマ(Mycoplama)・ハイオリニス、マイコプラズマ・ハイオシノビエ、レプトスピラ細菌、ローソニアイントラセルラリスブタインフルエンザウイルス(SIV)、大腸菌抗原ブラキスピラヒオディセンテリア、ブタ呼吸器コロナウイルス、ブタ流行性下痢(PED)ウイルス、ロタウイルストルクテノウイルス(TTV)、ブタサイトメガロウイルス、ブタエンテロウイルス脳心筋炎ウイルスオーエスキー病(Aujesky’sDisease)を引き起こす病原体、ブタコレラCSF)、及びブタ伝染性胃腸炎を引き起こす病原体、またはこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項14に記載の前記組成物。

請求項16

前記組成物は、アジュバントをさらに含む、請求項1〜15のいずれか一項に記載の前記組成物。

請求項17

前記アジュバントは、水中油アジュバント、ポリマー及び水アジュバント、油中水アジュバント、水酸化アルミニウムアジュバントビタミンEアジュバント、ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項16に記載の前記組成物。

請求項18

前記組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項1〜17のいずれか一項に記載の前記組成物。

請求項19

ブタをPCV2b分岐株に対して免疫化する方法であって、請求項1〜18のいずれか一項に記載の前記組成物を前記ブタに投与することを含む、前記方法。

請求項20

前記組成物は、鼻腔内、筋肉内、皮内、経皮、皮下、または経口で投与される、請求項19に記載の前記方法。

請求項21

前記組成物は、単回用量で投与される、請求項19または請求項20に記載の前記方法。

請求項22

前記組成物は、2回用量として投与される、請求項19または請求項20に記載の前記方法。

請求項23

前記組成物は、PCV2に対する母性由来の抗体を有するブタに投与される、請求項19〜22のいずれか一項に記載の前記方法。

請求項24

前記組成物は、3週齢以上のブタに投与される、請求項19〜23のいずれか一項に記載の前記方法。

請求項25

ブタを強毒性のブタサーコウイルス2b型(PCV2b)分岐株から保護するためのワクチン組成物を含む瓶を含むキットであって、前記組成物は、PCV2b分岐ORF2ポリペプチドを含み、前記ORF2ポリペプチドは、配列番号1の番号付与に従って、89位にロイシン(L)、90位にスレオニン(T)、及び134位にアスパラギン(N)を含む、前記キット。

請求項26

前記PCV2b分岐ORF2ポリペプチドは、配列番号1の番号付与に従って、残基59にリジン(K)、残基234にリジン(K)、残基190にスレオニン(T)、残基53にイソロイシン(I)、残基68にアスパラギン(N)、残基169にアルギニン(R)またはグリシン(G)、及び残基215にイソロイシン(I)からなる群から選択される少なくとも1つの残基をさらに含む、請求項25に記載の前記キット。

請求項27

前記瓶中の前記組成物は、即使用可能な液体組成物として提供される、請求項25または請求項26に記載の前記キット。

請求項28

前記組成物は、凍結乾燥形態で提供される、請求項25または請求項26に記載の前記キット。

請求項29

希釈剤をさらに含む、請求項28に記載の前記キット。

請求項30

前記ワクチン組成物の投与に関する情報を含む取り扱い説明書をさらに含む、請求項25〜29のいずれか一項に記載の前記キット。

技術分野

0001

本発明は、ブタサーコウイルスに関する。より具体的には、本発明は、強毒性のブタサーコウイルス2b型(PCV2b)分岐株を含むPCV2及び離乳後多臓器発育不良症候群(PMWS)からブタを保護するための、PCV2b分岐ORF2抗原を含むワクチン組成物及びワクチンにおけるその使用に関する。

背景技術

0002

サーコウイルス科サーコウイルス属のメンバーであるブタサーコウイルス2型(PCV2)は、1998年に初めて発見された、小さくエンベロープを持たない環状ウイルスである。PCV2は、ブタ産業遭遇した2つの最も流行している病原体のうちの1つであり、もう一方は、マイコプラズマハイオニューモニエ(M.hyo)である。PCV2に感染したブタは、一般的に離乳後多臓器性発育不良症候群(PMWS)と称される症状を呈する。PMWSは、衰弱、皮膚の蒼白さ、発育不良、呼吸困難下痢、及び黄疸(icterus、jaundice)によって、臨床的特徴付けられる。PMWSに加え、PCV2は、偽性狂犬病、ブタ生殖及び呼吸症候群PRRS)、流行性肺炎グレーサー病、連鎖球菌性髄膜炎サルモネラ症、離乳後大腸菌病、食事性肝臓症、及び化膿性気管支肺炎を含む、いくつかの他の疾患と関連してきた。あらゆる年齢層のブタにおけるPCV2感染の様々な臨床症状は、ブタサーコウイルス関連疾病(PCVAD)として知られ、衰弱及び発育遅延によって特徴付けられる。PRRSウイルスブタインフルエンザウイルス(SIV)、M.hyo、及び他の細菌が、PCVADの発症における重要な補助因子として、関連があるとされている。PCVADは、絶えず国際的ブタ産業にとっての脅威であり、大きな経済損失をもたらしている。

0003

PCV2分離株は、現在PCV2a、PCV2b、及びPCV2cの3つの遺伝子型にさらに細分される。PCV2は、複製(ORF1、945ヌクレオチド)と関連するタンパク質及びウイルスキャプシド(ORF2、702ヌクレオチド)をコードする2つの主な読み取り枠(ORF)を含む。PCV2は、近年、著しい遺伝的変異を起こしている。典型的なPCV2a及びPCV2b遺伝子型と比較して、ORF2コード化キャプシドタンパク質のC端末に追加のリジン(K)を有する新興PCV2変異体は、2008年に、流産したブタからの血清試料から単離された(Guo et al.,2010,Virology Journal7:273)。この新興PCV2変異体において、ゲノム配列の1039位の1つの塩基欠失が、ORF2の終止コドンの変異(UAAからAAGへ)をもたらし、705ヌクレオチドのORF2遺伝子及び新しい終止コドンを生じさせた(Guo et al.,2011,Virology Journal8:291)。さらに、Knellらは、欠失(T)が1つの株(GenBank番号AY713470)の1767ヌクレオチドのゲノムの1042位に見られ、これが、ORF2コード化キャプシドタンパク質のC末端の1つのアミノ酸(リジン)によって伸長へとつながったために、変異が、ORF2遺伝子で起こり得たと、以前に報告した(Knell et al.,2005,Veterinary Microbiology 109:169−177)。Olveraらもまた、ORF2の終止コドンの変異に起因するキャプシドタンパク質のC末端の1つのリジン残基による伸長を報告した(Olvera et al.,2007,Virology357:175−185)。さらに、GenBank受託番号JQ413808の「JSTZ」と名付けられたPCV2株が、中国の激しく下痢した子ブタ糞便試料において検出及び同定され、その完全な1767ヌクレオチドのゲノムが配列決定された(Li et al.,2012,Journal of Virology(jvi.asm.org),p.4716)。PCV2株JSTZのゲノム及び他の中国のPCV2株のORFに基づく系統発生解析は、PCV2株JSTZが、中国の新規遺伝子型に属することを示した(Li et al.,2012(上記))。

0004

Guoらは、2008年にPMWSで流産したブタからの試料から回収されたPCV2b/rBDHまたはBDH(Gen Bank受託番号HM038017)と名付けられたPCV2変異株の相対毒性を評価し、典型的なPCV2a及びPCV2b遺伝子型と関連するものよりも強力な、子ブタ内のPCV2変異株の毒性を確認した(Guo et al.,2012,PLoS ONE(plosone.org),Vol.7,Issue7,e41463,1−10)。このPCV2変異株は、さらに深刻なPMWSと一致する徴候を示し、衰弱、咳嗽、呼吸困難、下痢、粗い被毛、及び元気消失によって特徴付けられた。加えて、病理学的病変及びウイルス血症、ならびにリンパ節扁桃腺、及び脾臓におけるウイルス量は、典型的なPCV2a及びPCV2bでチャレンジされた群のものたちと比較して、PCV2変異株でチャレンジされた子ブタに関してさらに著しく深刻であった。さらに、PCV2変異株でチャレンジされた群において、一般的なPCV2a及びPCV2b遺伝子型でチャレンジされた群よりも著しく低い日々の平均体重増加が記録された(Guo et al.,2012(上記))。

0005

米国に位置する生産システムのPMWSに罹患したブタのワクチン不全が疑われたケースにおいて、US22625−33及びUS22664−35の2つのPCV2株が、最近同定された(Xiao et al.,2012,Journal of Virology(jvi.asm.org),Vol.86,No.22,p.12469)。これら2つのUS株の全ゲノムは、1767ヌクレオチドからなることが見出され、そのORF2遺伝子の大きさは、705ヌクレオチドであり、一般的なPCV2のものよりもアミノ酸が1つ長い234アミノ酸のORF2タンパク質をコードする。典型的なPCV2a及びPCV2b株のORF2のヌクレオチド配列を用いた系統発生解析は、米国PCV2株のUS22625−33及びUS22664−35の両方が、PCV2bと近縁関係にあることを示唆した。典型的なPCV2bと比較して、ORF2遺伝子内の単一の塩基欠失は、ORF2タンパク質のC端末への単一のアミノ酸(リジン)の追加をもたらした。さらなる配列BLAST及び比較は、両方の米国PCV2株が、中国で発見されたPCV2株のBDHと高レベル同一性を有したことを示し、毒性の増加したものであることを報告した。ORF1における1つの沈黙突然変異(1677A→1677T)が、BDHと2つの米国変異体PCV2sとの間で発見された。新規PCV2遺伝子型定義及び命名基準(Cortey,et al.,2011,Vet.Microbiol.149:522−523;Segales,et al.,2008,Vet.Rec.162:867−868)に従って、これら新規変異体PCV2株のすべてが、ORF2遺伝子のヌクレオチド配列の系統発生解析に基づいて、PCV2b遺伝子型に分類され得る(Xiao et al.,2012(上記))。

0006

新規PCV2b分岐の報告された毒性の増加、ならびに米国におけるワクチン不全の疑いのケースにおけるその存在を考慮すると、求められているものは、この新規PCV2b分岐に対する有効なワクチンである。好ましくは、このワクチンは、M.hyo及びPRRSウイルス等の他のブタ抗原と互換性があるであろう。

0007

本発明は、ブタを、強毒性のブタサーコウイルス2b型(PCV2b)分岐株を含むPCV2から保護するためのワクチン組成物を提供し、本組成物は、PCV2b分岐ORF2ポリペプチドを含み、ORF2ポリペプチドは、配列番号1の番号付与に従って、89位にロイシン(L)、90位にスレオニン(T)、及び134位にアスパラギン(N)を含む。一実施形態において、組成物は、典型的なPCV2a株及びPCV2b株に対しても異種保護を提供する。

0008

一実施形態において、組成物は、PCV2b分岐ORF2ポリペプチドを含む及び/または発現する不活化PCV2b分岐全ウイルスの形態である。

0009

別の実施形態において、組成物は、不活化キメラウイルスの形態であり、キメラウイルスは、PCV2b分岐ORF2ポリペプチドを含む及び/または発現する不活化組換えブタサーコウイルス1型を含む。

0010

なおも別の実施形態において、組成物は、単離された組換えPCV2b分岐ORF2ポリペプチドの形態である。一実施形態において、単離された組換えPCV2b分岐ORF2ポリペプチドは、ベクターから発現される。別の実施形態において、ベクターは、バキュロウイルスまたはパラポックスウイルスである。さらなる実施形態において、ベクターは、生または不活化ベクターである。

0011

一実施形態において、配列番号1の番号付与に従って、89位にロイシン(L)、90位にスレオニン(T)、及び134位にアスパラギン(N)を含むPCV2b分岐ORF2ポリペプチドは、配列番号1の番号付与に従って、残基59にリジン(K)、残基234にリジン(K)、残基190にスレオニン(T)、残基53にイソロイシン(I)、残基68にアスパラギン(N)、残基169にアルギニン(R)またはグリシン(G)、及び残基215にイソロイシン(I)からなる群から選択される少なくとも1つの残基をさらに含む。

0012

別の実施形態において、配列番号1の番号付与に従って、89位にロイシン(L)、90位にスレオニン(T)、及び134位にアスパラギン(N)を含むPCV2b分岐ORF2ポリペプチドは、配列番号1の番号付与に従って、残基59にリジン(K)及び残基234にリジン(K)をさらに含む。

0013

さらなる実施形態において、配列番号1の番号付与に従って、89位にロイシン(L)、90位にスレオニン(T)、134位にアスパラギン(N)、残基59にリジン(K)、及び残基234にリジン(K)を含むPCV2b分岐ORF2ポリペプチドは、配列番号1の番号付与に従って、残基190にスレオニン(T)、残基53にイソロイシン(I)、残基68にアスパラギン(N)、残基169にアルギニン(R)またはグリシン(G)、及び残基215にイソロイシン(I)を含む。

0014

一実施形態において、PCV2分岐ORF2ポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列またはその断片によって表される。

0015

別の実施形態において、PCV2分岐ORF2ポリペプチドを含む組成物は、少なくとも1つの追加のブタ抗原をさらに含む。一実施形態において、少なくとも1つの追加の抗原は、微生物によって引き起こされるブタの疾患に対して防御的である。

0016

一実施形態において、微生物は、細菌、ウイルス、または原生動物を含む。別の実施形態において、微生物は、以下から選択されるが、これらに限定されない:ブタ生殖及び呼吸症候群ウイルス(PRRSV)、ブタパルボウイルス(PPV)、ヘモフィルスパライスパスツレラマルトシダストレプトコッカム・スイス(Streptococcum suis)、スタフィロコッカス・ヒカスアクチノバチルスプルニューモニエ気管支敗血症菌サルモネラコレレスイス、サルモネラ・エンテリティディス、ブタ丹毒菌、マイコプラマ(Mycoplama)・ハイオリニスマイコプラズマハイオシノビエ、レプトスピラ細菌、ローソニアイントラセルラリス、ブタインフルエンザウイルス(SIV)、大腸菌抗原ブラキスピラヒオディセンテリア、ブタ呼吸器コロナウイルス、ブタ流行性下痢(PED)ウイルス、ロタウイルストルクテノウイルス(TTV)、ブタサイトメガロウイルス、ブタエンテロウイルス脳心筋炎ウイルスオーエスキー病(Aujesky’s Disease)を引き起こす病原体、ブタコレラCSF)、及びブタ伝染性胃腸炎を引き起こす病原体、またはこれらの組み合わせ。

0017

いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、アジュバントをさらに含む。一実施形態において、アジュバントは、水中油アジュバント、ポリマー及び水アジュバント、油中水アジュバント、水酸化アルミニウムアジュバントビタミンEアジュバント、ならびにこれらの組み合わせから選択されるが、これらに限定されない。別の実施形態において、本発明の組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。

0018

本発明は、上述のとおり、PCV2b分岐株を含むPCV2に対して、ブタを免疫化する方法も提供し、本方法は、本発明の組成物をブタに投与することを含む。投与のためのこの組成物は、PCV2b分岐ORF2ポリペプチドを含み、ORF2ポリペプチドは、配列番号1の番号付与に従って、89位にロイシン(L)、90位にスレオニン(T)、及び134位にアスパラギン(N)を含む。上述のとおり、このPCV2b分岐ORF2ポリペプチドは、以下から選択される少なくとも1つの残基をさらに含み得る:配列番号1の番号付与に従って、残基59にリジン(K)、残基234にリジン(K)、残基190にスレオニン(T)、残基53にイソロイシン(I)、残基68にアスパラギン(N)、残基169にアルギニン(R)またはグリシン(G)、及び残基215にイソロイシン(I)。

0019

一実施形態において、投与のための組成物は、PCV2b分岐ORF2ポリペプチドを含む及び/または発現するウイルスを含む。別の実施形態において、投与のための組成物は、単離された、組換えPCV2b ORF2ポリペプチドを含む。

0020

本発明の方法の一実施形態において、組成物は、筋肉内、皮内、経皮、皮下、鼻腔内、もしくは経口、または当業者既知の他の経路によって投与されてもよい。別の実施形態において、組成物は、単回用量で投与される。なおも別の実施形態において、組成物は、2回用量として投与される。

0021

さらなる実施形態において、組成物は、PCV2に対する母性由来の抗体を有するブタに投与される。

0022

一実施形態において、組成物は、3週齢以上のブタに投与される。

0023

本発明は、キットをさらに提供する。このキットは、ブタを強毒性のブタサーコウイルス2b型(PCV2b)分岐株から保護するための本発明に従ったワクチン組成物を含む瓶を含む。このワクチン組成物は、PCV2b分岐ORF2ポリペプチドを含み、ORF2ポリペプチドは、配列番号1の番号付与に従って、89位にロイシン(L)、90位にスレオニン(T)、及び134位にアスパラギン(N)を含む。上述のとおり、このPCV2b分岐ORF2ポリペプチドは、以下から選択される少なくとも1つの残基をさらに含み得る:配列番号1の番号付与に従って、残基59にリジン(K)、残基234にリジン(K)、残基190にスレオニン(T)、残基53にイソロイシン(I)、残基68にアスパラギン(N)、残基169にアルギニン(R)またはグリシン(G)、及び残基215にイソロイシン(I)。

0024

キットの一実施形態において、ワクチン組成物は、PCV2b分岐ORF2ポリペプチドを含む及び/または発現するウイルスの形態である。キットの別の実施形態において、ワクチン組成物は、単離された組換えPCV2b分岐ORF2ポリペプチドの形態である。

0025

キットの一実施形態において、瓶中のワクチン組成物は、即使用可能な液体組成物として提供される。キットの別の実施形態において、瓶中のワクチン組成物は、凍結乾燥形態で提供される。さらなる実施形態において、キットは、希釈剤を含むことができる。なおも別の実施形態において、キットは、ワクチン組成物の投与に関する情報を含む取り扱い説明書をさらに含むことができる。

図面の簡単な説明

0026

「PCV2B−DIV−MUT」と名付けられたPCV2b分岐株のキャプシド配列と(ISU−40895と名付けられた)典型的なPCV2A株及び(NMBと名付けられた)典型的なPCV2b株のキャプシド配列との間のアミノ酸配列アラインメントを示す。
処置日別DNAコピー数幾何最小二乗平均を示すグラフである。*すべての「0」は、グラフ化の目的のために、1に変換した。
チャレンジ後の処置日別の糞便排出(DNAコピー数)の幾何最小二乗平均を示すグラフである。*すべての「0」は、グラフ化の目的のために、1に変換した。
処置日及び処置別のPCV2ELISAS/P LS平均力価のグラフを示す。
処置日別のDNAコピー数の逆変換幾何最小二乗平均のグラフである。
チャレンジ後処置日別の糞便排出(DNAコピー数)の逆変換幾何最小二乗平均のグラフである。
研究日別の、PCV2 ELISA S/P LS平均力価を示すグラフである。

0027

配列の簡単な説明
本明細書において使用する場合、配列番号1〜57及び66によって表されるPCV2分離株は、PCV2b分岐株の代表的例である。

0028

配列番号1は、本明細書において、PCV2B−DIV−MUTと名付けられたPCV2b分岐株の完全長キャプシドに対応するアミノ酸配列である。
配列番号2は、本明細書において、PCV2B−DIV−MUTと名付けられたPCV2b分岐株の完全長キャプシドをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号3は、GenBank受託番号AB462384のPCV2株:798−1の完全長キャプシドに対応するアミノ酸配列である。
配列番号4は、GenBank受託番号AB462384のPCV2株:798−1の完全長キャプシドをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号5は、GenBank受託番号DQ231516のPCV2株:FFの完全長キャプシドに対応するアミノ酸配列である。
配列番号6は、GenBank受託番号DQ231516のPCV2株:FFの完全長キャプシドをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号7は、GenBank受託番号EF990645のPCV2株:VC2002−k2の完全長キャプシドに対応するアミノ酸配列である。
配列番号8は、GenBank受託番号EF990645のPCV2株:VC2002−k2の完全長キャプシドをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号9は、GenBank受託番号GQ845025のPCV2分離株:GY09の完全長キャプシドに対応するアミノ酸配列である。
配列番号10は、GenBank受託番号GQ845025のPCV2株:GY09の完全長キャプシドをコードするヌクレオチドである。
配列番号11は、GenBank受託番号GQ845028のPCV2分離株:XS09の完全長キャプシドに対応するアミノ酸配列である。
配列番号12は、GenBank受託番号GQ845028のPCV2株:XS09の完全長キャプシドをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号13は、GenBank受託番号HM535640のPCV2分離株:SDld01の完全長キャプシドと対応するアミノ酸配列である。
配列番号14は、GenBank受託番号HM535640のPCV2分離株:SDld01の完全長キャプシドをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号15は、GenBank受託番号HM755880のPCV2分離株:SDld02の完全長キャプシドと対応するアミノ酸配列である。
配列番号16は、GenBank受託番号HM755880のPCV2分離株:SDld02の完全長キャプシドをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号17は、GenBank受託番号HM755881のPCV2分離株:HM01の完全長キャプシドと対応するアミノ酸配列である。
配列番号18は、GenBank受託番号HM755881のPCV2分離株:HM01の完全長キャプシドをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号19は、GenBank受託番号HQ378157のPCV2株:NIVS−1の完全長キャプシドに対応するアミノ酸配列である。
配列番号20は、GenBank受託番号HQ378157のPCV2株:NIVS−1の完全長キャプシドをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号21は、GenBank受託番号JF683394のPCV2分離株:C/2010−2*の完全長キャプシドに対応するアミノ酸配列である。
配列番号22は、GenBank受託番号JF683394のPCV2分離株:C/2010−2*の完全長キャプシドをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号23は、GenBank受託番号JF683408のPCV2分離株:G/2009−2の完全長キャプシドに対応するアミノ酸配列である。
配列番号24は、GenBank受託番号JF683408のPCV2分離株:G/2009−2の完全長キャプシドをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号25は、GenBank受託番号JF927984のPCV2分離株:I/2010の完全長キャプシドに対応するアミノ酸配列である。
配列番号26は、GenBank受託番号JF927984のPCV2分離株:I/2010の完全長キャプシドをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号27は、GenBank受託番号JF927985のPCV2分離株:J/2010の完全長キャプシドに対応するアミノ酸配列である。
配列番号28は、GenBank受託番号JF927985のPCV2分離株:J/2010の完全長キャプシドをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号29は、GenBank受託番号JF927986のPCV2分離株:K/2010の完全長キャプシドに対応するアミノ酸配列である。
配列番号30は、GenBank受託番号JF927986のPCV2分離株:K/2010の完全長キャプシドをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号31は、GenBank受託番号JF927988のPCV2分離株:M/2010の完全長キャプシドに対応するアミノ酸配列である。
配列番号32は、GenBank受託番号JF927988のPCV2分離株:M/2010の完全長キャプシドをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号33は、GenBank受託番号JN006445のPCV2分離株:WB/ROM89の完全長キャプシドに対応するアミノ酸配列である。
配列番号34は、GenBank受託番号JN006445のPCV2分離株:WB/ROM89の完全長キャプシドをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号35は、GenBank受託番号JN382188のPCV2分離株:EU−RO−F4−3の完全長キャプシドに対応するアミノ酸配列である。
配列番号36は、GenBank受託番号JN382188のPCV2分離株:EU−RO−F4−3の完全長キャプシドをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号37は、GenBank受託番号JN411096のPCV2分離株:HNing09の完全長キャプシドに対応するアミノ酸配列である。
配列番号38は、GenBank受託番号JN411096のPCV2分離株:HNing09の完全長キャプシドをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号39は、GenBank受託番号JN411099のPCV2分離株:YWu09の完全長キャプシドに対応するアミノ酸配列である。
配列番号40は、GenBank受託番号JN411099のPCV2分離株:YWu09の完全長キャプシドをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号41は、GenBank受託番号JX984586のPCV2分離株:CH−IVT4の完全長キャプシドに対応するアミノ酸配列である。
配列番号42は、GenBank受託番号JX984586のPCV2分離株:CH−IVT4の完全長キャプシド遺伝子のヌクレオチド配列である。
配列番号43は、GenBank受託番号JX984588のPCV2分離株:CH−IVT6の完全長キャプシドに対応するアミノ酸配列である。
配列番号44は、GenBank受託番号JX984588のPCV2分離株:CH−IVT6の完全長キャプシド遺伝子のヌクレオチド配列である。
配列番号45は、GenBank受託番号JX984589のPCV2分離株:CH−IVT7の完全長キャプシドに対応するアミノ酸配列である。
配列番号46は、GenBank受託番号JX984589のPCV2分離株:CH−IVT7の完全長キャプシド遺伝子のヌクレオチド配列である。
配列番号47は、GenBank受託番号JX984590のPCV2分離株の完全長キャプシドに対応するアミノ酸配列である。
配列番号48は、GenBank受託番号JX984590のPCV2分離株の完全長キャプシド遺伝子のヌクレオチド配列である。
配列番号49は、GenBank受託番号JX984591のPCV2分離株:CH−IVT9の完全長キャプシドに対応するアミノ酸配列である。
配列番号50は、GenBank受託番号JX984591のPCV2分離株:CH−IVT9の完全長キャプシド遺伝子のヌクレオチド配列である。
配列番号51は、GenBank受託番号JX984592のPCV2分離株:CH−IVT10の完全長キャプシドに対応するアミノ酸配列である。
配列番号52は、GenBank受託番号JX984592のPCV2分離株:CH−IVT10の完全長キャプシド遺伝子のヌクレオチド配列である。
配列番号53は、GenBank受託番号JX984593の完全長キャプシドに対応するアミノ酸配列である。
配列番号54は、GenBank受託番号JX984593のPCV2分離株:CH−IVT11の完全長キャプシド遺伝子のヌクレオチド配列である。
配列番号55は、GenBank受託番号JX519293のPCV2分離株:GDYXの完全長キャプシドに対応するアミノ酸配列である。
配列番号56は、GenBank受託番号JX519293のPCV2分離株:GDYXの完全長キャプシドをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号57は、GenBank受託番号JX519293のPCV2分離株:GDYXの全ゲノム配列である。
配列番号58は、GenBank受託番号AF264042の典型的なPCV2a分離株:ISU−40895の完全長キャプシドに対応するアミノ酸配列である。
配列番号59は、GenBank受託番号AF264042のPCV2a分離株:ISU−40895の完全長キャプシドをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号60は、GenBank受託番号AF055392の典型的なPCV2a分離株:Imp.1010−Stoonの完全長キャプシドに対応するアミノ酸配列である。
配列番号61は、GenBank受託番号AF055392の典型的なPCV2a分離株:Imp.1010−Stoonの完全長キャプシドをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号62は、GenBank受託番号GU799576の典型的なPCV2b株:NMBの完全長キャプシドに対応するアミノ酸配列である。
配列番号63は、GenBank受託番号GU799576の典型的なPCV2b分離株:NMBの完全長キャプシドをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号64は、GenBank受託番号EU148503の典型的なPCV2c株:DK1980PMWSfreeの完全長キャプシドに対応するアミノ酸配列である。
配列番号65は、GenBank受託番号EU148503の典型的なPCV2c株:DK1980PMWSfreeの完全長キャプシドをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号66は、「PCV2b−DIV−MUT」と名付けられたPCV2分岐の全ゲノム配列である。

0029

発明を実施するための形態
本明細書及び請求の範囲において使用する場合、単数形「a」、「an」、及び「the」は、その文脈が明らかに指示しない限り、複数の参照を含む。例えば、「1つのタンパク質抗原」という用語は、タンパク質抗原の混合物を含む複数のタンパク質抗原を含む。

0030

本明細書において使用する場合、「を含む」という用語は、組成物及び方法が、引用される要素を含むが、他の要素を除外しないことを意味することが意図される。

0031

本明細書において使用する場合、「PCV2b分岐株」、「PCV2b分岐」、「PCV2変異体」、「新規変異体PCV2」、「変異体PCV2」等の用語は、配列番号1の番号付与に従って、89位にロイシン(L)、90位にスレオニン(T)、及び134位にアスパラギン(N)を含むORF2キャプシドポリペプチドをコードする強毒性のPCV2b株を指す。コードされたPCV2b分岐ORF2ポリペプチドは、配列番号1の番号付与に従って、残基59にリジン(K)、残基234にリジン(K)、残基190にスレオニン(T)、残基53にイソロイシン(I)、残基68にアスパラギン(N)、残基169にアルギニン(R)またはグリシン(G)、及び残基215にイソロイシン(I)から選択される少なくとも1つの残基をさらに含み得る。

0032

本明細書において使用する場合、「PCV2b分岐ORF2ポリペプチド」という用語は、ORF2ポリペプチドが、ウイルス自体の成分(例えば、ウイルスのタンパク膜)であるような、PCV2b分岐ORF2ポリペプチドを含む及び/または発現するウイルスを含むことが意図される。ウイルスは、PCVであり得るが、それに限定されると解釈されるべきではなく、他のウイルスも含み得る。この用語は、また、単離された組換えPCV2b分岐ORF2ポリペプチドも含むことが意図される。

0033

「抗原」という用語は、動物内で抗体またはT細胞反応、またはこれら両方の生成を刺激することができる化合物、組成物、または免疫原性物質を指し、動物に注入されるかそれ内で吸収される組成物を含む。免疫反応は、分子全体、または分子の一部分(例えば、抗原決定基または部分抗原)に生じ得る。「抗原」という用語は、全ウイルス、ポリペプチド、またはこれらの断片を含み得る。

0034

本明細書において使用する場合、「ワクチン組成物」という用語は、宿主内で免疫反応を誘導するのに有用な薬学的に許容されるビヒクル中に少なくとも1つの抗原または免疫原を含む。ワクチン組成物は、年齢性別、体重、種、及び受容動物の状態、ならびに投与経路等の要因を考慮した投与量で、医療または獣医療の分野の当業者に周知の技法によって、投与されてもよい。投与経路は、経皮、粘膜投与(例えば、経口、経鼻、経肛門内)を介して、または非経口経路(皮内、経皮、筋肉内、皮下、静脈内、または腹腔内)を介してもよい。ワクチン組成物は、単独で投与されるか、他の処置または治療とともに、同時投与または連続的に投与されてもよい。投与の形態は、懸濁液、シロップ、またはエリキシル剤、及び滅菌懸濁液またはエマルション等の非経口、皮下、皮内、筋肉内、または静脈内投与(例えば、注入可能な投与)のための調製物を含んでもよい。ワクチン組成物は、噴霧剤として投与されるか、食品及び/もしくは水に混合されるか、または好適な担体、希釈剤、もしくは滅菌水生理食塩水グルコース等の賦形剤との混合剤の状態で投与されてもよい。組成物は、投与経路及び所望の調製によって、湿潤剤もしくは乳化剤、pH緩衝剤、アジュバント、ゲル化もしくは粘度増添加剤保存剤香味剤顔料等の補助剤を含有してもよい。不要な実験をすることなく、調製する好適な調製物を調製するのに「Remington’s Pharmaceutical Sciences」(1990)等の標準薬学的教科書を参考にしてもよい。

0035

本明細書に定義されるとおり、「免疫原性または免疫学的組成物」は、目的の組成物またはワクチンに対する細胞免疫反応及び/または抗体触媒性免疫反応の、宿主内の免疫学的反応を引き出す少なくとも1つの抗原を含む物質の組成物を指す。

0036

「免疫反応」という用語は、本明細書において使用する場合、動物内で引き出された反応を指す。免疫反応は、細胞免疫(CMI)、液性免疫を指し得るか、これらの両方を伴い得る。本発明は、また、免疫系の一部に限定される反応も企図する。通常、「免疫学的反応」には、以下の作用のうちの1つ以上が挙げられるが、これらに限定されない:目的の組成物またはワクチンに含まれる1つの抗原または複数の抗原に特異的に向けられる、抗体、B細胞ヘルパーT細胞サプレッサーT細胞、及び/もしくは細胞傷害性T細胞ならびに/またはyd T細胞の生成ならびに活性化。好ましくは、宿主は、新しい感染に対する耐性が向上する及び/または疾患の臨床的重症度が低減されるような、治療的または防御的免疫学的反応のいずれかを示す。このような防御は、通常感染した宿主によって示される症状の低減もしくは無症状、より迅速な回復時間、及び/または感染した宿主内の低減されたウイルス価によって示されるであろう。

0037

本明細書において使用する場合、「免疫原性」という用語は、宿主動物内に1つの抗原または複数の抗原に対する免疫反応を生成し得ることを意味する。この免疫反応は、ワクチンによって引き出された特異的な感染性生物に対する防御免疫基礎を形成する。

0038

本明細書において使用する場合、「アジュバント」は、抗原(複数可)に対する免疫反応を向上させる1つ以上の物質からなる組成物という意味である。アジュバントがどのような機構で作用するかは、完全にはわかっていない。いくつかのアジュバントが、抗原をゆっくりと放出することにより免疫反応を向上させると考えられている一方で、他のアジュバントは、それら自体が、免疫原性が強く、相乗的に機能すると考えられている。

0039

本明細書において使用する場合、「多価」という用語は、同じ微生物学的種から(例えば、マイコプラズマ・ハイオニューモニエまたはPCVの異なる分離株)、異なる種から(例えば、パスツレラ・ヘモリチカ及びパスツレラ・マルトシダの両方からの分離株)に関わらず、2つ以上の抗原を含むワクチン、または異なる属からの抗原の組み合わせを含むワクチン(例えば、パスツレラ・マルトシダ、サルモネラ、大腸菌、ヘモフィルス・ソムナス、及びクロストリジウムからの抗原を含むワクチン)を意味する。

0040

本明細書において使用する場合、「ブタ」または「子ブタ」という用語が、ブタの血統の動物を意味する一方で、「雌ブタ」は、生殖年齢及び生殖能力のあるメスのブタを指す。「未経産ブタ」は、妊娠したことのないメスブタのことである。

0041

本明細書において使用する場合、「毒性」という用語は、動物宿主内で感染性になる能力を保持し、宿主動物に疾患を生じ得る分離株を意味する。

0042

不活化ワクチン」とは、もはや複製または成長する能力がない感染性生物または病原体を含むワクチン組成物を意味する。病原体は、細菌、ウイルス、原生動物、または菌類起源であり得る。不活性化は、その免疫原性を維持すると同時に、凍結融解化学的処置(例えば、β−プロピオラクトン(BPL)またはホルマリンでの処理)、超音波処理放射線、熱、または生物の複製または成長を阻止するのに十分な任意の他の従来の方法を含む様々な方法によって達成し得る。

0043

本明細書において使用する場合、「変異型」という用語は、ポリペプチドまたは1つ以上の保存的アミノ酸変化もしくは野生型ポリペプチドと比較すると、対応するポリペプチドが実質的に同等機能を有するような他の若干の改変を有するポリペプチドをコードする、核酸配列を指す。「変異型」という用語は、また、前記変異または改変を有するポリペプチドまたは核酸配列を含む微生物も指し得る。

0044

「保存的変異」は、別の生物学的に類似の残基によるアミノ酸残基置換、またはコードされたアミノ酸残基が変化しないか、別の生物学的に類似する残基であるような核酸配列にあるヌクレオチドの置換を意味する。保存的変異の例には、イソロイシン、バリン、ロイシン、もしくはメチオニン等の1つの疎水性残基で別の疎水性残基を置換、またはアルギニンでリジンを、グルタミン酸アスパラギン酸を、もしくはグルタミンでアスパラギンを置換する等の、1つの極性残基で別の極性残基を置換する置換等が挙げられる。「保存的変異」という用語は、親アミノ酸の代わりの置換アミノ酸も含むが、但し、置換ポリペプチドへと作成された抗体も、親(非置換)ポリペプチドと免疫反応することを条件とする。

0045

本明細書において使用する場合、「薬学的に許容される担体」及び「薬学的に許容されるビヒクル」という用語は、互換性があり、有害作用なしに宿主内へと注入され得るワクチン抗原を含有するための流体ビヒクルを指す。当分野で既知の好適な薬学的に許容される担体には、滅菌水、食塩水、グルコース、デキストロース、または緩衝液が挙げられるが、これらに限定されない。担体には、希釈剤、安定剤(すなわち、砂糖及びアミノ酸)、保存剤、湿潤剤、乳化剤、pH緩衝剤、粘度増強添加剤、着色添加剤等を含むが、これらに限定されない助剤を挙げられ得る。

0046

北米PRRSウイルス」とは、1990年代初期に米国で初めて単離されたPRRSウイルス(例えば、Collins,J.E.,et al.,1992,J.Vet.Diagn.Invest.4:117−126を参照)、北米PRRSウイルス分離株MN−1b(Kwang,J.et al.,1994,J.Vet.Diagn.Invest.6:293−296)、PRRSウイルスのケベックLAF−exp91株(Mardassi,H.et al.,1995,Arch.Virol.140:1405−1418)、及び北米PRRSウイルス分離株VR2385(Meng,X.−J et al.,1994,J.Gen.Virol.75:1795−1801)等の、これらに限定されないが、北米PRRSウイルス分離株と関連がある遺伝子特徴を有する任意のPRRSウイルスを意味する。北米PRRSウイルス株の追加の例は、当分野で既知である。遺伝子特徴は、北米PRRSウイルス株と共有する、ゲノムヌクレオチド配列類似性及びアミノ酸配列類似性を指す。中国PRRSウイルス株は、概して、北米株との約80〜93%のヌクレオチド配列類似性を証明する。

0047

「欧州PRRSウイルス」は、1991年頃に欧州で初めて単離されたPRRSウイルスと関連する遺伝子特徴を有するPRRSウイルスの任意の株を指す(例えば、Wensvoort,G.,et al.,1991,Vet.Q.13:121−130を参照)。「欧州PRRSウイルス」は、時折、当分野で「レリースタットウイルス」とも称される。欧州PRRSウイルス株のさらなる例は、当分野で既知である。

0048

本明細書において使用する場合、遺伝子改変のウイルスが、その非改変親株よりも低い毒性である場合、「弱毒化」されている。株が、疾患重症度を決定する1つ以上のパラメータにおいて統計学的に有意な減少を示す場合、その株は、「弱毒性」である。そのようなパラメータには、ウイルス血症の程度、熱、呼吸困難の重症度、生殖の症状の重症度、または病理学的病変の数または重症度等が挙げられ得る。

0049

感染性クローン」は、実験室で特異的かつ意図的に改変され、次いで生きた遺伝子改変生物再形成するために使用され得る病原体(例えばウイルス)の、単離またはクローニングされたゲノムである。感染性クローンから生成された生きた遺伝子改変ウイルスは、生ウイルスワクチンに使用され得る。あるいは、不活化ウイルスワクチンは、感染性クローン由来の生ウイルスを、ホルマリン、ベータプロプリオラクトンバイナリーエチレネミン(ethylenemine)、または疎水性溶媒、酸等の不活化剤で処理することによって、紫外線またはX線照射することによって、加熱することによってなどで、調製することができる。

0050

本発明は、ブタを、強毒性のブタサーコウイルス2b型(PCV2b)分岐株を含むPCV2から保護するためのワクチン組成物を提供し、本組成物は、PCV2b分岐ORF2ポリペプチドを含み、ORF2ポリペプチドは、配列番号1の番号付与に従って、89位にロイシン(L)、90位にスレオニン(T)、及び134位にアスパラギン(N)を含む。上述のとおり、このPCV2b分岐ORF2ポリペプチドは、以下から選択される少なくとも1つの残基をさらに含み得る:配列番号1の番号付与に従って、残基59にリジン(K)、残基234にリジン(K)、残基190にスレオニン(T)、残基53にイソロイシン(I)、残基68にアスパラギン(N)、残基169にアルギニン(R)またはグリシン(G)、及び残基215にイソロイシン(I)。

0051

一実施形態において、配列番号1の番号付与に従って、89位にロイシン(L)、90位にスレオニン(T)、及び134位にアスパラギン(N)を含むPCV2b分岐ORF2ポリペプチドは、配列番号1の番号付与に従って、残基59にリジン(K)及び残基234にリジン(K)をさらに含む。

0052

さらなる実施形態において、配列番号1の番号付与に従って、89位にロイシン(L)、90位にスレオニン(T)、134位にアスパラギン(N)、残基59にリジン(K)、及び残基234にリジン(K)を含むPCV2b分岐ORF2ポリペプチドは、配列番号1の番号付与に従って、残基190にスレオニン(T)、残基53にイソロイシン(I)、残基68にアスパラギン(N)、残基169にアルギニン(R)またはグリシン(G)、及び残基215にイソロイシン(I)をさらに含む。

0053

一実施形態において、PCV2分岐ORF2ポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列またはそれらの断片によって表される。しかしながら、本発明は、この実施形態に限定されない。例えば、他の実施形態において、配列番号3のアミノ酸配列またはその断片、配列番号5のアミノ酸配列またはその断片、配列番号7のアミノ酸配列またはその断片、配列番号9のアミノ酸配列またはその断片、配列番号11のアミノ酸配列またはその断片、配列番号13のアミノ酸配列またはその断片、配列番号13のアミノ酸配列またはその断片、配列番号15のアミノ酸配列またはその断片、配列番号17のアミノ酸配列またはその断片、配列番号19のアミノ酸配列またはその断片、配列番号21のアミノ酸配列またはその断片、配列番号23のアミノ酸配列またはその断片、配列番号25のアミノ酸配列またはその断片、配列番号27のアミノ酸配列またはその断片、配列番号29のアミノ酸配列またはその断片、配列番号31のアミノ酸配列またはその断片、配列番号33のアミノ酸配列またはその断片、配列番号35のアミノ酸配列またはその断片、配列番号37のアミノ酸配列またはその断片、配列番号39のアミノ酸配列またはその断片、配列番号41のアミノ酸配列またはその断片、配列番号43のアミノ酸配列またはその断片、配列番号45のアミノ酸配列またはその断片、配列番号47のアミノ酸配列またはその断片、配列番号49のアミノ酸配列またはその断片、配列番号51のアミノ酸配列またはその断片、配列番号53のアミノ酸配列またはその断片、配列番号55のアミノ酸配列またはその断片から選択され得るが、これらに限定されない。

0054

一実施形態において、本発明のワクチン組成物は、少なくとも1つの追加の抗原を含む。一実施形態において、少なくとも1つの追加の抗原は、微生物によって引き起こされるブタの疾患に対して防御的である。

0055

いくつかの実施形態において、少なくとも1つの追加の抗原成分は、ブタに感染することが知られている細菌、ウイルス、または原生動物によって引き起こされるブタの疾患に対して防御的である。そのような微生物の例には、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない:M.hyo、ブタ生殖及び呼吸症候群ウイルス(PRRSV)、ブタパルボウイルス(PPV)、ヘモフィルス・パラスイス、パスツレラ・マルトシダ、ストレプトコッカム・スイス(Streptococcum suis)、スタフィロコッカス・ヒカス、アクチノバチルス・プルロニューモニエ、気管支敗血症菌、サルモネラ・コレレスイス、サルモネラ・エンテリティディス、ブタ丹毒菌、マイコプラマ(Mycoplama)・ハイオリニス、マイコプラズマ・ハイオシノビエ、レプトスピラ菌、ローソニア・イントラセルラリス、ブタインフルエンザウイルス(SIV)、大腸菌抗原、ブラキスピラ・ヒオディセンテリア、ブタ呼吸器コロナウイルス、ブタ流行性下痢(PED)ウイルス、ブタロタウイルス(例えば、A群、B群、及びC群)、トルクテノウイルス(TTV)、ブタサイトメガロウイルス、ブタエンテロウイルス、脳心筋炎ウイルス、オーエスキー病(Aujesky’s Disease)を引き起こす病原体、ブタコレラ(CSF)、及びブタ伝染性胃腸炎を引き起こす病原体、またはこれらの組み合わせ。

0056

一実施形態において、少なくとも1つの追加の抗原は、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ(M.hyo)である。別の実施形態において、少なくとも1つの追加の抗原は、北米PRRSウイルス株、中国PRRSウイルス株、または欧州PRRSウイルス株等のPRRSウイルスである。また、少なくとも1つの追加の抗原が、典型的なPCV2a株、典型的なPCV2b株、または他のPCV2遺伝子型等のPCV2の異なる分離株になり得ることが予測されている。

0057

一実施形態において、組成物は、PCV2b分岐ORF2ポリペプチドを含む及び/または発現する、不活性化のPCV2b分岐全ウイルスの形態である。

0058

一実施形態において、PCV2b分岐全ウイルスのORF2キャプシド遺伝子は、配列番号2に対応する。さらなる実施形態において、PCV2b分岐全ウイルスによって発現されたPCV2b分岐ORF2ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号1またはその断片に対応する。しかしながら、本発明は、これらの実施形態に限定されない。例えば、いくつかの実施形態において、PCV2b分岐全ウイルスによって発現されるPCV2b分岐ORF2ポリペプチドは、以下の配列またはこれらの断片のいずれかから選択され得る:配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39、配列番号41、配列番号43、配列番号45、配列番号47、配列番号49、配列番号51、配列番号53、または配列番号55。対応するORF2遺伝子配列は、本明細書に記載される。

0059

別の実施形態において、組成物は、PCV2b分岐ORF2ポリペプチド(キメラPCV1−2bウイルス)を含む及び/または発現する不活化組換えブタサーコウイルス1型を含む不活化キメラウイルスの形態である。キメラブタサーコウイルス及びこれらの調製方法は、国際公開第03/049703 A2号、ならびに米国特許第7,279,166号及び同第7,575,752号に記載され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

0060

一実施形態において、キメラPCV1−2ウイルスのORF2キャプシド遺伝子は、配列番号2に対応する。さらなる実施形態において、キメラPCV1−2bウイルスによって発現されるPCV2b分岐ORF2ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号1またはその断片に対応する。しかしながら、本発明は、これらの実施形態に限定されない。例えば、いくつかの実施形態において、キメラPCV1−2bウイルスによって発現されるPCV2b分岐ORF2ポリペプチドは、以下の配列またはこれらの断片のいずれかから選択される:配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39、配列番号41、配列番号43、配列番号45、配列番号47、配列番号49、配列番号51、配列番号53、または配列番号55。

0061

なおも別の実施形態において、組成物は、単離された組換えPCV2b分岐ORF2ポリペプチドの形態である。一実施形態において、単離された組換えPCV2b分岐ORF2ポリペプチドは、バキュロウイルス等のベクターから発現される。あるいは、パラポックスベクター等を含む他の既知の発現ベクターが、使用されてもよいが、これに限定されない。一実施形態において、ベクターは、生または不活化ベクターでもよい。

0062

さらなる実施形態において、組換え的に発現されたPCV2b分岐ORF2ポリペプチドは、配列番号1またはその断片に対応する。あるいは、いくつかの実施形態において、組換え的に発現されたPCV2b分岐ORF2ポリペプチドは、以下のいずれかまたはこれらの断片から選択され得る:配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39、配列番号41、配列番号43、配列番号45、配列番号47、配列番号49、配列番号51、配列番号53、または配列番号55。

0063

いくつかの形態において、PCV2分岐ORF2タンパク質の免疫原性部分が、組成物の抗原成分として使用される。例えば、PCV2分岐ORF2タンパク質の短縮及び/もしくは置換された形態または断片が、本発明の組成物に使用されてもよい。

0064

PCV2b分岐ORF2ポリペプチドの変異型が、本発明の組成物に使用され得るが、但し、これらが、本発明のワクチン組成物内においてそれを有用なものにする抗原的特徴を依然保持することを条件とすることが、当業者によって理解される。好ましくは、PCV2b分岐変異型は、PCV2B−DIV−MUTと名付けられたPCV2分離株の完全長ゲノム配列と、少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、さらに好ましくは少なくとも90%、さらに一層好ましくは少なくとも95%同一であるとみなす、配列を有する。例えば、免疫学的組成物の抗原的特徴は、実施例に提供されるとおりのチャレンジ実験によって推定される。加えて、配列番号1を有する野生型PCV2b分岐ORF2タンパク質と比較して、改変抗原が、防御免疫の少なくとも70%、好ましくは80%、さらに好ましくは90%をもたらすとき、改変PCV2b分岐ORF2抗原の抗原的特徴が、依然として保持される。

0065

PCV2b分岐ORF2抗原成分は、所望の免疫反応を誘導するのに効果的な、すなわち本明細書でPCV2B−DIV−MUTと名付けられたウイルスの例である強毒性のPCV2b株への感染から生じる臨床徴候の発症を低減するか、またはその重症度を減らす抗原包含レベルで、免疫原性/ワクチン組成物に提供される。いくつかの実施形態において、組成物は、典型的なPCV2a及びPCV2b株に対する異種保護も提供する。

0066

一実施形態において、本発明に従ったワクチン組成物は、PCV2b分岐ORF2ポリペプチド(キメラPCV1−2bDIVウイルス)を含む及び/または発現する不活化組換えブタサーコウイルス1型の形態である。このキメラウイルスは、本発明の組成物に少なくとも1.0≦RP≦5.0のレベルで含まれ、RPは、参照ワクチンと比較するELISA抗原定量化(体外力試験)によって決定される、相対的効力単位である。別の実施形態において、キメラPCV1−2bDIVウイルスは、20倍(20×)濃縮バルクPCV1−2bDIV抗原の約0.5%〜約5%の最終濃度で本発明の組成物に含まれる。

0067

別の実施形態において、本発明に従ったワクチン組成物は、PCV2b分岐ORF2ポリペプチドを含む及び/または発現する不活化PCV2b分岐全ウイルスの形態である。このウイルスは、本発明の組成物に少なくとも1.0≦RP≦5.0のレベルで含まれ、RPは、参照ワクチンと比較するELISA抗原定量化(体外力価試験)によって決定される、相対的効力単位である。別の実施形態において、不活化PCV2b分岐全ウイルスは、20倍(20×)濃縮バルクPCV2b分岐ORF2抗原の約0.5%〜約5%の最終濃度で本発明の組成物に含まれる。

0068

なおも別の実施形態において、本発明に従ったワクチン組成物は、単離された組換えPCV2b分岐ORF2ポリペプチドの形態である。PCV2b分岐ORF2組換えタンパク質は、最終免疫原性/ワクチン組成物(μg/ml)の少なくとも0.2μg抗原/mlのレベルで本発明の組成物に含まれてもよい。さらなる実施形態において、組換えPCV2b分岐ORF2ポリペプチド包含レベルは、約0.2〜約400μg/mlである。なおも別の実施形態において、組換えPCV2b分岐ORF2ポリペプチド包含レベルは、約0.3〜約200μg/mlである。さらなる実施形態において、組換えPCV2b分岐ORF2ポリペプチド包含レベルは、約0.35〜約100μg/mlである。さらに別の実施形態において、組換えPCV2b分岐ORF2ポリペプチド包含レベルは、約0.4〜約50μg/mlである。

0069

一実施形態において、本発明のワクチン組成物は、PCV2b分岐ORF2ポリペプチド及び少なくとも1つのM.hyo可溶性抗原(例えば、2つ以上)の組み合わせを含む。一実施形態において、本発明のワクチン組成物は、PCV2b分岐ORF2ポリペプチド及び以下のM.hyo特異的タンパク質抗原のうちの1つ以上を含む:およそ46kD(p46)、64kD(p64)、及び97kD(p97)分子量のM.hyoタンパク質。およそ64kD(p64)のM.hyoタンパク質は、Kimらの「Infect.Immun.58(8):2637−2643(1990)」、及び米国特許第5,788,962号によって記載される、M.hyoからのp65表面抗原代替的に称され得る。Futoらは、本発明の組成物に使用することができるM.hyoからの46kD表面タンパク質のクローニング及び特徴付けを記載した「J.Bact177:1915−1917(1995)」。Zhangらは、M.hyoのp97アドヘシンタンパク質を記載し、特徴付けた「Infect.Immun.63:1013−1019,1995」。さらに、Kingらは、M.hyoのP−5722株からのMhp1と名付けられた124kDタンパク質を記載し、Mhp1及びp97が、同じタンパク質であることを示唆するデータを提示した「Vaccine15:25−35(1997)」。そのようなp97タンパク質は、本発明の組成物に使用され得る。本発明のワクチン組成物は、およそ41kD(p41)、42kD(p42)、89kD(p89)、及び65kD(p65)のタンパク質等のさらなるM.hyo特異的タンパク質抗原を含んでもよいが、これらに限定されない。Okada et al.,2000,J.Vet.Med.B47:527−533及びKim et al.,1990,Infect.Immun.58(8):2637−2643を参照のこと。さらに、M.hyo成分は、およそ102kD(p102)及び216kD(p216)のM.hyo特異的タンパク質抗原を含んでもよい。Minionらへの米国特許第6,162,435号及び同第7,419,806号を参照のこと。

0070

別の実施形態において、本発明のワクチン組成物は、PCV2b分岐ORF2ポリペプチド、少なくとも1つのM.hyo可溶性抗原(例えば、2つ以上)、及びPRRSウイルス抗原の組み合わせを含む。本発明のPCV2b分岐/M.hyo/PRRS組成物への使用のための好適なPRRSウイルス抗原は、北米PRRSウイルス分離株、中国PRRSウイルス株、及び欧州PRRSウイルス株、ならびにそのような分離株/株の遺伝子改変バージョンを含む。一実施形態において、本発明に従った組成物に使用されるPRRSウイルス抗原成分は、北米PRRSウイルスである。

0071

いくつかの実施形態において、本発明の組成物に使用されるPRRSウイルス抗原成分は、P129と名付けられた北米PRRSウイルス分離株またはその生きた遺伝子改変のバージョンである。好ましくは、遺伝子改変PRRSウイルスは、病原性感染を引き起こすことはできないが、野生型PRRSウイルスによる感染に対する、効果的な免疫防御性反応を引き出すことができる。

0072

本発明の組成物での使用のための遺伝子改変PRRSウイルスは、感染性クローンから生成され得る。P129と名付けられた北米PRRSウイルス分離株の感染性cDNAクローンの調製は、米国特許第6,500,662号に記載され、参照により本明細書に完全に組み込まれる。P129cDNAの配列は、Genbank受託番号AF494042及び米国特許第6,500,662号に開示される。

0073

一実施形態において、PCV2b分岐/M.hyo混合ワクチンは、1瓶のワクチンで単一用量として提供される。別の実施形態において、PCV2b分岐/M.hyo/PRRSウイルス混合ワクチンは、2瓶のワクチンで単一の用量として提供される。例えば、いくつかの実施形態において、PCV2b分岐/M.hyo混合は、第1の瓶に安定した液体組成物として提供され、PRRSウイルスは、第2の瓶に凍結乾燥状態で提供される。いくつかの実施形態において、追加のブタ抗原が、第1の瓶または第2の瓶のいずれかに添加されてもよい。

0074

一実施形態において、PRRSウイルス成分は、凍結乾燥の遺伝子改変生ウイルスとして提供される。投与前に、3つの抗原すべてが単一用量で動物に投与されることができるように、第1の瓶からのPCV2b分岐/M.hyo液体が、第2の瓶のPRRSウイルスを再水和するために使用されてもよい。

0075

本発明のワクチンは、標準の緩衝液、安定剤、希釈剤、保存剤、及び/または可溶化剤等の、ヒト(該当する場合)を含む動物のための薬学的に許容される担体を含むために、許容される慣習に従って製剤化されてもよく、持続する放出を促進するように製剤化されてもよい。希釈剤には、水、食塩水、デキストロース、エタノールグリセロール等が挙げられる。等張性のための添加剤には、数あるなかでも、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトールソルビトール、及びラクトースが挙げられる。安定剤には、数ある中でも、アルブミンが挙げられる。改変生ワクチンの製剤化に特に有用なものを含む他の好適なワクチンビヒクル及び添加剤は、当業者に既知であるか、明らかになるであろう。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Remington’s Pharmaceutical Science,18th ed.,1990,Mack Publishingを参照のこと。

0076

本発明のワクチンは、例えば、数ある中でも、アジュバントまたはサイトカイン等の1つ以上追加の免疫調節性成分をさらに含んでもよい。本発明の組成物に使用のための好適なアジュバントの種類には、以下が挙げられる:水中油アジュバント、ポリマー及び水アジュバント、油中水アジュバント、水酸化アルミニウムアジュバント、ビタミンEアジュバント、ならびにこれらの組み合わせ。アジュバントのいくつかの特定の例には、フロイント完全アジュバントフロイント不完全アジュバントコリネバクテリウムパルバム、無菌化ウシ型結核菌水酸化アルミニウムゲルグルカンデキストラン硫酸酸化鉄アルギン酸ナトリウムバクトアジュバント、アミノ酸のポリアミノ酸及びコポリマー等の特定の合成ポリマーブロックコポリマー(CytRx、Atlanta,Ga.)、QS−21(Cambridge Biotech Inc.、Cambridge Mass.)、SAF−M(Chiron、Emeryville Calif.)、AMPHIGEN(登録商標)アジュバント、サポニン、Quil Aまたは他のサポニン画分モノホスホリルリピドA及びAvridineリピド−アミンアジュバント(N,N−ジオタデシル−N’,N’−−ビス(2−ヒドロキシエチル)−プロパンジアミン)、「REGRESSIN」(Vetrepharm、Athens,Ga.)、パラフィン油RIBIアジュバントシステム(Ribi Inc.、Hamilton,Mont.)、ムラミルジペプチド等が挙げられるが、これらに限定されない。

0077

本発明のワクチンに有用な水中油エマルションの非限定的な例には、修飾SEAM62製剤及びSEAM1/2製剤が挙げられる。修飾SEAM62は、5%(v/v)のスクアレンシグマ)、1%(v/v)のSPAN(登録商標)85洗浄剤(ICI界面活性剤)、0.7%(v/v)のTWEEN(登録商標)80洗浄剤(ICI界面活性剤)、2.5%(v/v)のエタノール、200μg/mlのQuil A、100μg/mlのコレステロール、及び0.5%(v/v)のレシチンを含有する水中油エマルションである。修飾SEAM1/2は、5%の(v/v)スクアレン、1%(v/v)のSPAN(登録商標)85洗浄剤、0.7%(v/v)のTween80洗浄剤、2.5%(v/v)のエタノール、100μg/mlのQuil A、及び50μg/mlのコレステロールを含む、水中油エマルションである。

0078

本発明の組成物で有用なアジュバントの別の例は、SP油である。明細書及び請求の範囲において使用する場合、「SP油」という用語は、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマースクアラン、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、及び緩衝塩溶液を含む、油エマルションを示す。ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーは、固形成分及び液体成分を懸濁させる補助をする界面活性剤である。これらの界面活性剤は、Pluronic(登録商標)の商標名の下、ポリマーとして市販されている。好適な界面活性剤は、Pluronic(登録商標)L−121の商標名の下市販されている、poloxamer401である。一般に、SP油エマルションは、約1〜3%vol/volのブロックコポリマー、約2〜6%vol/volのスクアラン、さらに具体的には、約3〜6%のスクアラン、及び約0.1〜0.5%vol/volのポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートを含み、残部は、緩衝塩類溶液である、免疫賦活性アジュバント混合物である。一実施形態において、SP油エマルションは、最終組成物に約1%〜25%のv/v量、好ましくは約2%〜15%、さらに好ましくは約5%〜12%v/vで存在する。

0079

本発明の組成物の使用のための好適なアジュバントのさらに別の例は、通常、軽質流動パラフィンである油に溶解し脱油されたレシチンからなるAMPHIGEN(商標)アジュバントである。

0080

本発明の組成物に有用なアジュバントの他の例は、以下の商標登録されたアジュバントである:Microsol Diluvac Forte(登録商標)デュエルエマルションアジュバントシステム(duel emulsion adjuvant system)、Emunadeアジュバント、及びXsolveアジュバント。EmunadeアジュバントとXsolveアジュバントの両方は、水中の軽油のエマルションであるが、Emunadeは、アルハイドロゲルも含有し、d,l−α−トコフェロール酢酸エステルが、XSolveアジュバントの一部である。本発明の組成物に使用のための好適なアジュバントのさらなる例は、ImpranFLEX(商標)アジュバント(油中水アジュバント)である。好適なアジュバントのさらなる例は、Carbomer(Carbopol(登録商標))系アジュバントである。好適なCarbopol(登録商標)アジュバントには、Carbopol(登録商標)934ポリマー及びCarbopol(登録商標)941ポリマーが挙げられる。

0081

一実施形態において、アジュバントまたはアジュバント混合物が、一用量あたり約100μg〜約10mgの量で添加される。別の実施形態において、アジュバント/アジュバント混合物は、一用量あたり約200μg〜約5mgの量で添加される。なおも別の実施形態において、アジュバント/アジュバント混合物は、約300μg〜約1mg/用量の量で添加される。

0082

アジュバントまたはアジュバント混合物は、典型的に本発明のワクチン組成物中に約1%〜25%のv/v量で、好ましくは約2%〜15%、さらに好ましくは約5%〜12%v/vで存在する。

0083

ワクチンに含むことができる他の「免疫調節剤」には、例えば、1つ以上のインターロイキンインターフェロン、または他の既知のサイトカインが挙げられる。一実施形態において、アジュバントは、米国特許第6,165,995号及び同第6,610,310号それぞれに記載されるもの等の、シクロデキストリン誘導体またはポリアニオン性ポリマーであってもよい。

0084

上述のとおり、本発明は、PCV2b分岐株を含むPCV2に対して、ブタを免疫化する方法も提供し、本方法は、本発明に従って組成物をブタに投与することを含む。投与のためのこの組成物は、PCV2b分岐ORF2ポリペプチドを含み、ORF2ポリペプチドは、配列番号1の番号付与に従って、89位にロイシン(L)、90位にスレオニン(T)、及び134位にアスパラギン(N)を含む。上述のとおり、このPCV2b分岐ORF2ポリペプチドは、以下から選択される少なくとも1つの残基をさらに含み得る:配列番号1の番号付与に従って、残基59にリジン(K)、残基234にリジン(K)、残基190にスレオニン(T)、残基53にイソロイシン(I)、残基68にアスパラギン(N)、残基169にアルギニン(R)またはグリシン(G)、及び残基215にイソロイシン(I)。

0085

一実施形態において、投与のための組成物は、PCV2b分岐ORF2ポリペプチドを含む及び/または発現するウイルスを含む。別の実施形態において、投与のための組成物は、単離された、組換えPCV2b ORF2ポリペプチドを含む。

0086

本発明の方法の一実施形態において、組成物は、筋肉内、皮内、経皮、皮下、または経口で投与される。別の実施形態において、組成物は、単回用量で投与される。なおも別の実施形態において、組成物は、2回用量として投与される。

0087

さらなる実施形態において、組成物は、PCV2に対する母性由来の抗体を有するブタに投与される。

0088

一実施形態において、組成物は、3週齢以上のブタに投与される。

0089

本発明に従ったワクチン組成物は、年齢、性別、体重、種、及び受容動物の状態、ならびに投与経路等の要因を考慮した投与量で、医療または獣医療の分野の当業者に周知の技法によって、投与されてもよい。投与経路は、経皮、粘膜投与(例えば、経口、経鼻、経肛門、膣内)を介して、または非経口経路(皮内、経皮、筋肉内、皮下、静脈内、または腹腔内)を介してもよい。本発明に従ったワクチン組成物は、単独で投与されるか、他の処置または治療とともに、同時投与または連続的に投与されてもよい。投与の形態は、懸濁液、シロップ、またはエリキシル剤、及び滅菌懸濁液またはエマルション等の非経口、皮下、皮内、筋肉内、または静脈内投与(例えば、注入可能な投与)のための調製物を含んでもよい。本発明に従ったワクチン組成物は、噴霧剤として投与されるか、食品及び/もしくは水に混合されるか、または好適な担体、希釈剤、もしくは滅菌水、生理食塩水、グルコース等の賦形剤との混合剤の状態で投与されてもよい。組成物は、投与経路及び所望の調製によって、湿潤剤もしくは乳化剤、pH緩衝剤、アジュバント、ゲル化もしくは粘度増強添加剤、保存剤、香味剤、顔料等の補助剤を含有してもよい。

0090

本発明は、キットをさらに提供する。このキットは、ブタを強毒性のブタサーコウイルス2b型(PCV2b)分岐株から保護するための本発明に従ったワクチン組成物を含有する瓶を含む。このワクチン組成物は、PCV2b分岐ORF2ポリペプチドを含み、ORF2ポリペプチドは、配列番号1の番号付与に従って、89位にロイシン(L)、90位にスレオニン(T)、及び134位にアスパラギン(N)を含む。上述のとおり、このPCV2b分岐ORF2ポリペプチドは、以下から選択される少なくとも1つの残基をさらに含み得る:配列番号1の番号付与に従って、残基59にリジン(K)、残基234にリジン(K)、残基190にスレオニン(T)、残基53にイソロイシン(I)、残基68にアスパラギン(N)、残基169にアルギニン(R)またはグリシン(G)、及び残基215にイソロイシン(I)。

0091

キットの一実施形態において、ワクチン組成物は、PCV2b分岐ORF2ポリペプチドを含む及び/または発現するウイルスの形態である。キットの別の実施形態において、ワクチン組成物は、単離された組換えPCV2b分岐ORF2ポリペプチドの形態である。

0092

本発明のキットの一実施形態において、瓶中のワクチン組成物は、即使用可能な液体組成物として提供される。キットの別の実施形態において、瓶中のワクチン組成物は、凍結乾燥形態で提供される。さらなる実施形態において、キットは、希釈剤を含むことができる。なおも別の実施形態において、キットは、ワクチン組成物の投与に関する情報を含む取り扱い説明書をさらに含むことができる。

0093

本発明の別の態様は、不活化キメラウイルスの形態のワクチン組成物の生成方法を提供し、キメラウイルスは、PCV2b分岐ORF2ポリペプチドを発現する不活化組換えブタサーコウイルス1型を含む。キメラブタサーコウイルス及びこれらの調製方法は、国際公開第03/049703 A2号、ならびに米国特許第7,279,166号及び同第7,575,752号に記載される。PCV2b分岐ORF2ポリペプチドを発現する不活化PCV1を含むキメラブタサーコウイルスの生成方法は、下記実施例1に記載される。一実施形態において、最終組成物は、不活化cPCV1−2bウイルスを、好適なアジュバント及び/または他の薬学的に許容される担体と混合することにより調製される。

0094

本発明のさらなる態様が、PCV2b分岐ORF2ポリペプチドを発現する不活化PCV2b分岐全ウイルスの形態であるワクチン組成物の生成方法を提供する。そのような方法は、下記実施例3に記載される。一実施形態において、最終組成物は、不活化PCV2B−DIV−MUTウイルスを、好適なアジュバント及び/または他の薬学的に許容される担体と混合することにより、調製される。

0095

本発明のさらに別の態様は、i)培養下の感受性のある細胞が、PCV2分岐ORF2のDNAコード配列を含む組換えウイルスベクターに感染することを許容し、ORF2タンパク質は、組換えウイルスベクターによって発現され、ii)その後、上清中のORF2タンパク質を回収することによる、組換えPCV2分岐ORF2タンパク質の生成方法を提供する。典型的に、多量のPCV2分岐ORF2タンパク質は、上清中で回収され得る。多量のPCV2分岐ORF2とは、約20μg/mL超上澄み、好ましくは約25μg/mL超、さらに一層好適な約30μg/mL超、さらに一層好適な約40μg/mL超、さらに一層好適な約50μg/mL超、さらに一層好適な約60μg/mL超、さらに一層好適な約80μg/mL超、さらに一層好適な約100μg/mL超、さらに一層好適な約150μg/mL超、もっとも好適な約190μg/mL超を意味する。

0096

好適な細胞培養は、合計約0.3〜2.0×106個の間の細胞/mL、さらに好ましくは約0.35〜1.9×106個の間の細胞/mL、よりさらに好ましくは約0.4〜1.8×106個の間の細胞/mL、さらに一層好ましくは約0.45〜1.7×106個の間の細胞/mL、もっとも好ましくは約0.5〜1.5×106個の間の細胞/mLの細胞を有する。好適な細胞は、当業者によって決定可能である。好適な細胞は、PCV2分岐ORF2 DNAを含み、PCV2分岐ORF2タンパク質を発現する適切な組換えウイルスベクターへの感染に対して感染性のあるものである。好ましくは、細胞は、昆虫細胞であり、さらに好ましくは、これらは、Sf+昆虫細胞(Protein Sciences Corporation、Meriden,Conn.)の商標の下販売されている昆虫細胞を含む。

0097

適切な成長培地もまた、当業者によって決定可能であり、好適な成長培地は、Ex細胞420(JRH Biosciences、Inc.、Lenexa,Kans.)等の無血清昆虫細胞培地である。好適なウイルスベクターには、特に生成細胞が昆虫細胞である場合、BaculoGold(BD Biosciences Pharmingen、San Diego,Calif.)等のバキュロウイルスが挙げられる。バキュロウイルス発現システムが好適であるが、他の発現システムが本発明の目的、すなわち細胞培養の上清内へのPCV2分岐ORF2の発現に機能するであろうことが当業者によって理解される。そのような他の発現システムは、培地へのORF2発現を生じさせるために、シグナル配列の使用を必要とし得る。しかしながら、ORF2がバキュロウイルス発現システムによって生成されるときには、一般に培地へのORF2の発現を生じさせるための任意のシグナル配列またはさらなる改変は必要ではない。このタンパク質は、ウイルス様粒子を独立して形成することができ(Journal of General Virology 2000,Vol.81,pp.2281−2287)、培養上清内へ分泌され得ると考えられている。感受性のある細胞の感染に対して使用される場合、PCV2分岐ORF2のDNA配列を含む組換えウイルスベクターは、約0.03〜1.5、さらに好ましくは約0.05〜1.3、よりさらに好ましくは約0.09〜1.1、もっとも好ましくは約0.1〜1.0の間の好適な感染の多重度MOI)を有する。好ましくは、上述のMOIは、1mLの細胞培養流体に関する。好ましくは、本明細書に記載される方法は、0.35〜1.9×106個の細胞/mL、よりさらに好ましくは約0.4〜1.8×106個の細胞/mL、さらに一層好ましくは約0.45〜1.7×106個の細胞/mL、もっとも好ましくは約0.5〜1.5×106個の細胞/mLのPCV2分岐ORF2 DNAを含む組換えウイルスベクターへの感染を含み、約0.03〜1.5、さらに好ましくは約0.05〜1.3、よりさらに好ましくは約0.09〜1.1、もっとも好ましくは約0.1〜1.0の間のMOI(感染の多重度)を有するPCV2分岐ORFタンパク質を発現する。

0098

次いで、感染細胞を、最大10日、さらに好ましくは約2日〜約10日、よりさらに好ましくは約4日〜約9日、もっとも好ましくは約5日〜約8日の期間にわたって培養する。好適な培養状態には、約22〜32℃、さらに好ましくは約24〜30℃、よりさらに好ましくは約25〜29℃、さらに一層好ましくは約26〜28℃、もっとも好ましくは約27℃の間の温度が挙げられる。好ましくは、Sf+細胞は、特徴バキュロウイルス誘導変化植え付け後に観察する。そのような観察には、細胞密度傾向及び感染後期間中の生存率の減少の測定が含まれ得る。ピークウイルス価は、典型的に感染から3〜5日後に観察され、細胞から上清内へのピークORF2放出は、典型的に5〜8日目の間及び/または細胞生存率が10%未満に減少したときに得られる。

0099

好ましくは、回収プロセスは、分離ステップを介して、培地で発現したPCV2分岐ORF2ポリペプチドからの細胞残屑の分離から始める。好適な分離ステップには、濾過、最大約20,000×gの速度での遠心分離連続流遠心法イオン交換またはゲル濾過を用いるクロマトグラフ分離、及び従来の免疫親和法が挙げられる。これらの方法は、当業者に知られている(例えば、Harris and Angel(eds.),Protein purification methods−−a practical approach,IRL press Oxford 1995)。好適な濾過方法には、中空糸濾過法を含むデッドエンド精密濾過法及びタンジェント流(または十字流)濾過法が挙げられる。これらの中でも、デッドエンド精密濾過法が好適である。デッドエンド精密濾過法の好適な細孔の大きさは、約0.30〜1.35μmの間、さらに好ましくは約0.35〜1.25μmの間、よりさらに好ましくは約0.40〜1.10μmの間、もっとも好ましくは約0.45〜1.0μmの間である。

0100

免疫原性またはワクチン等の免疫学的組成物に使用されるであろう組換えPCV2分岐ORF2ポリペプチドの回収のためには、不活性化ステップを含めることが、ウイルスベクターを不活性化するために好適である。好ましくは、この不活性化は、濾過ステップ直前か直後のいずれかに行われ、濾過ステップ後が不活性化に好適な時間である。任意の従来の不活性化方法が、本発明の目的のために使用され得る。したがって、不活性化は、化学的及び/または物理的処置によって実施され得る。好適な形態において、採取流体の体積を決定し、温度を、約32〜42℃の間、さらに好ましくは約34〜40℃の間、もっとも好ましくは約35〜39℃の間にもっていく。好適な不活性化方法には、好ましくは約1〜約20mM、好ましくは約2〜約10mM、よりさらに好ましくは約2〜約8mM、よりさらに好ましくは約3〜約7mM、もっとも好ましくは約5mMの濃度の環化バイナリーエチレンイミンBEI)添加が挙げられる。例えば不活性化には、約5mMのBEIの最終濃度を得るために、0.3NのNaOH中で0.2Mのバイナリーエチレンイミン(BEI)に環化された、好ましくは約0.4Mの2−ブロモエチレンアミン(bromoethyleneamine)臭化水素酸塩の溶液の、流体への添加が挙げられる。好ましくは、次いで流体が、72〜96時間連続的撹拌され、不活化採取流体は、−40℃以下または約1〜7℃の間で冷凍保存され得る。不活性化の完了後、好ましくは1.0Mのチオ硫酸ナトリウム溶液が、添加され、任意の残基BEIを中和させる。好ましくは、不活性化のために先に添加されたBEIと比較して、当量チオ硫酸ナトリウムが添加される。例えば、BEIが5mMの最終濃度に添加される場合、1.0Mのチオ硫酸ナトリウム溶液が、5mMの最終最低濃度を得るために添加され、任意の残基BEIを中和させる。

0101

本発明のさらなる態様は、PCV2分岐ORF2タンパク質及び不活化ウイルスベクターを含む組成物の調製方法に関する。この方法は、i)増幅PCV2分岐ORF2遺伝子を移入ベクター内にクローニングするステップと、ii)組換えPCV2分岐ORF2遺伝子を含む移入ベクターの部分を、ウイルス内に導入するステップと、iii)培地の細胞を導入したウイルスベクターで感染させるステップと、iv)導入したウイルスベクターに、PCV2分岐ORF2遺伝子からPCV2分岐ORF2組換えタンパク質を発現させるステップと、v)上清から細胞を分離するステップと、vi)発現したPCV2分岐ORF2タンパク質を上清から回収するステップと、vii)組換えウイルスベクターを不活性化するステップとを含む。好ましくは、組換えウイルスベクターは、バキュロウイルス含有ORF2のDNAコード配列であり、細胞は、Sf+細胞である。好適な分離ステップは、上述のものであり、もっとも好適なものは、濾過ステップである。好適な不活性化ステップは、上述のものである。好ましくは、不活性化は、約35〜39℃の間で、2〜8mMのBEIの存在下、よりさらに好適には約5mMのBEIの存在下で実施される。好ましくは、不活性化は、少なくとも24時間、さらに一層好適には24〜72時間実施される。

0102

さらなる態様に従って、PCV2分岐ORF2タンパク質及び不活化ウイルスベクターを含む組成物の調製方法は、上述のとおり、ステップvii)の後に、中和ステップも含む。このステップviii)は、溶液内で不活性化剤を中和する当量の作用剤を添加することを含む。好ましくは、不活性化剤がBEIである場合、当量のチオ硫酸ナトリウムの添加が好適である。さらなる態様に従って、ステップviii)は、不活性化剤がBEIである場合、約1〜約20mM、好ましくは約2〜約10mM、よりさらに好ましくは約2〜約8mM、よりさらに好ましくは約3〜約7mM、もっとも好ましくは約5mMの最終濃度に、チオ硫酸ナトリウム溶液を添加するステップを含む。

0103

本発明の別の態様において、PCV2分岐株に対する免疫反応を誘導するための組成物、好ましくは、例えばワクチン等の抗原性組成物の調製方法が提供される。一般に、この方法は、構築物をウイルス内に導入するステップを含み、この構築物は、i)PCV2分岐株のORF2からの組換えDNAと、ii)成長培地の細胞を導入したウイルスで感染させることと、iii)ウイルスにPCV2分岐ORF2から組換えタンパク質を発現させることと、iv)発現したORF2タンパク質を上清から回収することと、v)回収されたタンパク質に好適なアジュバント及び/または他の薬学的に許容される担体を混合することによって、組成物を調製することとを含む。

0104

以下の実施例は、本発明に従った好適な材料及び手順を記載する。しかしながら、これらの実施例は、単に例証として提供され、これらのいずれも、本発明の全範囲への制限であるとみなされるべきではないことを理解されたい。

0105

実施例1:キメラブタサーコウイルス(cPCV)1−2の生成方法
非病原性ブタサーコウイルス1型(PCV1)のゲノム骨格内に、(「PCV2B−DIV−MUT」と名付けられた)病原性ブタサーコウイルス2b型分岐株の免疫原性キャプシド遺伝子を、cPCV1−2をクローニングすることにより構築する。キメラDNAクローンの構築手順は、例えば、米国特許第7,279,166号に記載され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。0.05%のラクトアルブミン加水分解物(LAH)、30μg/mLの硫酸ゲンタマイシン、及び5%のウシ胎仔血清を補充した最小必須培地MEM)中で成長したブタの腎臓PK)−15細胞に感染させるのに、キメラウイルスの感染性ストックを使用する。2〜3%のウシ胎仔血清を用いることを除き、同じ成長培地を使用して、得られたcPCV1−2感染PK−15細胞をあと4回連続継代することにより、さらに増殖させる。第5継代を冷凍解凍、及び濾過し、得られた溶解物を、プレマスターシード及び後続マスターシードを調製するのに使用する。

0106

ウイルスシードを生成するのに使用する培地は、ウイルスストックを生成するのに使用するものと同じである。成長培地について、MEM、OptiMEM、または同等のものが、増生のためにPK−15細胞株を植えるのに使用することができる基本培地である。成長培地には、最大10%のウシ血清、最大0.5%のラクトアルブミン加水分解物、最大0.5%のウシ血清アルブミン、及び最大30μg/mLのゲンタマイシンを補充することができる。ウイルス増殖培地について、MEM、OptiMEM、または同等のものを使用する。ウイルス増殖培地には、最大0.5%のラクトアルブミン加水分解物、最大2%のウシ血清、最大0.5%のウシ血清アルブミン、及び最大30μg/mLのゲンタマイシンを補充することができる。細胞を持続させるために必要に応じて、最大5g/Lのグルコース及び最大5mmol/LのL−グルタミンを、成長培地及び/またはウイルス増殖培地に添加することができる。

0107

cPCV1−2マスターシードウイルスを、PK−15細胞の細胞懸濁液に添加し、最大3時間吸収させる。シードウイルスを、成長基本培地内で希釈し、0.1〜0.2の感染の多重度(MOI)を提供する。

0108

細胞を植える際か、細胞がおよそ20%〜50%の密集度に達したときに、PK−15細胞の培養を、最初はワーキングシードウイルスとともに植え付ける。この最初の継代は、抗原ストックの生成のための「ワンステップ染法」と称され得るか、または連続継代のためにさらに使用してもよい。連続継代に関しては、cPCV1−2感染PK−15細胞は、1:5〜20のウイルス増殖率での連続分割によって、最大継代7までさらに増殖する。前の継代からの感染細胞懸濁液を含有する培地は、次の継代のためのシード材料として機能する。細胞が≧90%密集度に達したら、cPCV1−2感染細胞を、36±2℃でそれぞれの継代について3〜14日間培養する。cPCV1−2ウイルスは、ウイルス複製の間、観察可能細胞変性病変を生じる。採取時には、細胞の円形化及び多量の浮遊残屑が観察される。培養では、細菌及び真菌汚染の目に見え痕跡も観察される。cPCV抗原の採取と採取との間の培養時間は、下記表1に提供される。

0109

0110

cPCV1−2培養流体を、滅菌槽に採取し、既知の方法を用いてマイコプラズマ汚染のための試料採取をする。複数の採取は、ローラーボトル生物反応器、及び灌流槽から行われてもよい。

0111

採取したcPCV1−2ウイルスの不活性化の前に、1つ以上の抗原ロットが、限外濾過によって濃縮されてもよい(例えば、最大60倍)。濃縮物平衡塩類溶液洗浄し、血清タンパク質還元してもよい。

0112

cPCV1−2ウイルスの不活性化、弱毒化、または無毒化方法は、これより記載される。cPCV抗原濃縮後、β−プロピオラクトン(BPL)を、プールcPCV1−2ウイルス性物質に添加し、0.2%v/vの近似の濃度を得る。次いで、プールウイルス流体を最低15分間かき混ぜ、次いで、不活性化バルク抗原流体を、第2の滅菌槽に移入する。移入した抗原流体を、最低24時間、一定で撹拌しながら2〜7℃で維持する。最低24時間後、0.2%v/vのBPLの第2の添加を、プール懸濁液に添加する。内容物を、続いてかき混ぜ、第3の槽に移入し、84時間以上の追加時間一定で撹拌しながら2〜7℃で維持する。一般に、総不活性化時間は、108時間以上120時間以下である。不活性化方法は、下記表2に要約される。

0113

0114

チオ硫酸ナトリウムの最終濃度0.1M以下の溶液の添加によって、不活性化を終了させる。NaOHまたはHClを用いて、不活化抗原ストックのpHを、約6.8に調整する。不活性化に続き代表的試料をプールから取り、不活性化の完了を試験する。力価ELISAを介して測定される1.0RP超の目標を達成するために、不活化cPCV1−2抗原生成物標準化する。一実施形態において、最終組成物は、不活化cPCV1−2bウイルスを、好適なアジュバント及び/または他の薬学的に許容される担体と混合することにより調製される。

0115

実施例2:組換えPCV2b分岐キャプシドタンパク質の生成方法
サブユニットワクチンの生成は、2段階プロセスの結果である:第1に、バキュロウイルス発現システムにおけるORF2サブユニット抗原の生成、第2に、最終生成物の製剤化/製造。最初のステップ(組換えバキュロウイルス構築及びORF2抗原の生成)について、使用される基本の技術プロセスが、これより記載される。PCV2b分岐株からのORF2遺伝子の発現のために、バキュロウイルス発現システムを使用する。PCV2 ORF2遺伝子を含む組換えバキュロウイルスを、以下の通り生じさせる:ウイルスDNAを、本明細書で「PCV2B−DIV−MUT」として同定されるPCV2b分岐株感染PK−15細胞から単離する。このPCV2b分岐株からのORF2遺伝子を、5フィートコザック配列(ccgccatg)及び3フィーとのEcoR1部位(gaattc)を含むためにPCR増幅し、pGEM−T−Easyベクター(Promega、Madison,Wis.)へとクローニングする。次いで、続いてこれを摘出し、移入ベクターpVL1392(BD Biosciences Pharmingen、San Diego,Calif.)へとサブクローニングする。次いで、PCV2b分岐ORF2遺伝子を含むpVL1392プラスミドを、BaculoGold(登録商標)(BD Biosciences Pharmingen)バキュロウイルスDNAとともに、スポドプテラフルギペルダ(Sf+)昆虫細胞(Protein Sciences、Meriden,Conn.)内へ共導入し、PCV2b分岐ORF2遺伝子を含む組換えバキュロウイルスを生じさせる。このPCV2b分岐ORF2遺伝子を含む組換えバキュロウイルスを、プラーク純化し、マスターシードウイルス(MSV)を、SF+細胞株上で増殖させ、等分し、−70℃で貯蔵する。バキュロウイルス特異的プライマを用いてPCR−RFLPにより、MSVを、PCV2 ORF2バキュロウイルスとして、明白に同定した。MSVまたはワーキングシードウイルスを生じさせるための、PCV2 ORF2バキュロウイルスに感染させた昆虫細胞は、PCV2 ORF2抗原を発現するウサギ中でPCV2B−DIV−MUTに対して作成された過免疫血清を用いて免疫測定法によってか、またはモノクローナル抗体を用いて間接蛍光抗体法で、PCV2B−DIV−MUTのORF2遺伝子の発現を確認する。あるいは、PCV2b分岐株と交差反応する典型的なPCV2aまたはPCV2bに対して作成された抗体を用いて、PCV2B−DIV−MUTのORF2遺伝子の発現を、免疫測定法によって確認する。さらに、PCV2b分岐ORF2バキュロウイルスの同一性を、N端末アミノ酸配列決定によって確認する。PCV2b分岐ORF2バキュロウイルスMSVは、連邦規則9C.F.R.113.27(c)、同113.28、及び同113.55に従って、純度も試験した。

0116

PCV2 ORF2のDNA配列を含む組換えウイルスベクターは、感受性のある細胞の感染に対して使用される場合、約0.03〜1.5、さらに好ましくは約0.05〜1.3、よりさらに好ましくは約0.09〜1.1、もっとも好ましくは約0.1〜1.0の間の好適な感染の多重度(MOI)を有する。好ましくは、本明細書に記載される方法は、0.35〜1.9×106個の細胞/mL、よりさらに好ましくは約0.4〜1.8×106個の細胞/mL、さらに一層好ましくは約0.45〜1.7×106個の細胞/mL、もっとも好ましくは約0.5〜1.5×106個の細胞/mLのPCV2 ORF2 DNAを含む組換えウイルスベクターへの感染を含み、約0.03〜1.5、さらに好ましくは約0.05〜1.3、よりさらに好ましくは約0.09〜1.1、もっとも好ましくは約0.1〜1.0の間のMOI(感染の多重度)を有するPCV2ORFタンパク質を発現する。

0117

次いで、感染細胞を、最大10日、さらに好ましくは約2日〜約10日、よりさらに好ましくは約4日〜約9日、もっとも好ましくは約5日〜約8日の期間にわたって培養する。好適な培養状態には、約22〜32℃、さらに好ましくは約24〜30℃、よりさらに好ましくは約25〜29℃、さらに一層好ましくは約26〜28℃、もっとも好ましくは約27℃の間の温度が挙げられる。好ましくは、Sf+細胞は、特徴バキュロウイルス誘導変化の植え付け後に観察する。そのような観察には、細胞密度傾向及び感染後期間中の生存率の減少の測定が含まれ得る。ピークウイルス価は、典型的に感染から3〜5日後に観察され、細胞から上清内へのピークORF2放出は、典型的に5〜8日目の間及び/または細胞生存率が10%未満に減少したときに得られる。

0118

一実施形態において、1000mLのスピナーフラスコに、300mLのEx細胞420培地におよそ1.0×106Sf+個の細胞/mlが播種される。次いで、このフラスコを27℃で培養し、100rpmでかき混ぜる。続いて、フラスコに、0.1MOIを有するPCV2b分岐ORF2/Bac(PCV2b分岐ORF2遺伝子を含む組換えバキュロウイルス)ウイルスシードを、培養の24時間後に播種する。

0119

次いで、フラスコを、27℃で合計6日間培養する。培養後、フラスコの内容物を、遠心分離機にかけ、得られた上清を採取し、0.45〜1.0μmの細孔サイズの膜を通過させて精密濾過し、不活化する。上清の温度を37+/−2℃にもっていき、上清に10mMのバイナリーエチリレンイミン(ethlylenimine)(BEI)を添加することによって、上清を不活性化する。次いで、上清を48時間連続して撹拌する。5mMの最終的な最低濃度を得るために、1.0Mのチオ硫酸ナトリウム溶液を添加し、任意の残基BEIを中和する。次いで、中和した上清中のORF2の量を、Eichmeyerらへの米国特許第7,700,285号の実施例1に記載されるもののような、ELISA測定手順を用いて定量化する。使用した検出抗体は、PCV2b分岐ORF2キャプシドタンパク質に対するモノクローナル抗体である。

0120

本発明は、組換えPCV2b分岐ORF2の小規模生成から、組換えPCV2b分岐ORF2の大規模生成まで拡張可能である。

0121

ワクチン生成の第2の段階は、最終生成物の製剤化/製造である。ブレンド計画は、a)1回の用量あたりの固定抗原含有量、及びb)少なくとも1つのアジュバントの定量に基づく。一実施形態において、最終生成物の剤型は、水中油エマルションに相当する。最終ワクチンを調製するために、アジュバントを抗原画分に添加し、均質のエマルションが得られるまで、撹拌する。十分な均質性兆候が提供される。1バッチのワクチンが、特許請求の有効性をもたらすであろうことを確実にするために、その相対的効力を有効な生体内アッセイ法によって決定する。実施する分析に基づき、力価試験は、通常の効力より弱いバッチを検出することが可能である。

0122

実施例3:不活化PCV2b分岐全ウイルスの生成方法
PCV2b分岐ウイルスの感染性ストック:0.05%のラクトアルブミン加水分解物(LAH)、30μg/mLの硫酸ゲンタマイシン、及び5%のウシ胎仔血清を補充した最小必須培地(MEM)内で成長したブタの腎臓(PK)−15細胞に、PCV2B−DIV−MUTを感染させるのに使用する。0.5〜3%のウシ胎仔血清を用いることを除き、同じ成長培地を使用してさらに4回連続継代することにより、得られたPCV2B−DIV−MUT感染PK−15細胞を、さらに増殖させる。第5継代を冷凍、解凍、及び濾過し、得られた溶解物を、プレマスターシード及び後続マスターシードを調製するのに使用する。

0123

ウイルスシードを生成するのに使用する培地は、ウイルスストックを生成するのに使用するものと同じである。成長培地について、MEM、OptiMEM、または同等のものが、増生のためにPK−15細胞株を植えるのに使用することができる基本培地である。成長培地には、最大10%のウシ血清、最大0.5%のラクトアルブミン加水分解物、最大0.5%のウシ血清アルブミン、及び最大30μg/mLのゲンタマイシンを補充することができる。ウイルス増殖培地については、MEM、OptiMEM、または同等のものを使用する。ウイルス増殖培地には、最大0.5%のラクトアルブミン加水分解物、最大2%のウシ血清、最大0.5%のウシ血清アルブミン、及び最大30μg/mLのゲンタマイシンを補充することができる。細胞を持続させるために必要に応じて、最大5g/Lのグルコース及び最大5mmol/LのLグルタミンを、成長培地及び/またはウイルス増殖培地に添加することができる。

0124

PCV2B−DIV−MUTマスターシードウイルスを、PK−15細胞の細胞懸濁液に添加し、最大3時間吸収させる。シードウイルスを、成長基本培地内で希釈し、0.1〜0.2の感染の多重度(MOI)を提供する。

0125

細胞を植える際か、細胞がおよそ20%〜50%の密集度に達したときに、PK−15細胞の培養を、最初はワーキングシードウイルスとともに植え付ける。この最初の継代は、抗原ストックの生成のための「ワンステップ感染法」と称され得るか、または連続継代のためにさらに使用してもよい。連続継代について、感染PCV2B−DIV−MUTPK−15細胞は、1:5〜20のウイルス増殖率での連続分割によって、最大継代7までさらに増殖する。前の継代からの感染細胞懸濁液を含有する培地は、次の継代のためのシード材料として機能する。細胞≧90%密集度に達したら、PCV2B−DIV−MUT感染細胞を、36±2℃で、それぞれの継代に対して3〜14日間培養する。PCV2B−DIV−MUTウイルスは、ウイルス複製の間、観察可能な細胞変性病変を生じ得る。採取時には、細胞の円形化及び多量の浮遊残屑が観察される。培養では、細菌及び真菌汚染の目に見える痕跡も観察される。PCV2B−DIV−MUT抗原の採取と採取との間の培養時間は、下記表1に提供される。

0126

PCV2B−DIV−MUT培養流体を、滅菌槽に採取し、既知の方法を用いてマイコプラズマ汚染の試料採取をする。複数の採取は、ローラーボトル、生物反応器、及び灌流槽から行われてもよい。

0127

採取したPCV2B−DIV−MUTウイルスの不活性化の前に、1つ以上抗原ロットが、限外濾過によって濃縮されてもよい(例えば、最大60倍)。濃縮物を平衡塩類溶液で洗浄し、血清タンパク質を還元してもよい。

0128

PCV2B−DIV−MUTウイルスの不活性化、弱毒化、または無毒化方法は、上記実施例1及び表2に記載されるものと同じである。不活性化を、チオ硫酸ナトリウムの最終濃度0.1M以下の溶液の添加によって終了させる。NaOHまたはHClを用いて、不活化抗原ストックのpHを、約6.8に調整する。不活性化に続き、代表的試料をプールから取り、不活性化の完了を試験する。力価ELISAを介して測定される1.0RP超の目標を達成するために、不活化PCV2B−DIV−MUT抗原生成物を標準化する。一実施形態において、最終組成物は、不活化PCV2B−DIV−MUTウイルスを、好適なアジュバント及び/または他の薬学的に許容される担体と混合することにより、調製される。

0129

実施例4:PCV2bの原理証明研究
本研究の目的は、同種保護及び異種保護のためのPCV2b分岐の候補ワクチンを評価することであった。研究設計は、表3に概説される。T04、T08、及びT12のIVPは、10%のSP油でアジュバント化された死滅PCV2b分岐ウイルスからなる。T02、T06、及びT10のIVPは、10%のSP油でアジュバント化された死滅キメラPCV1:2aウイルスからなる。T03、T07、及びT11のIVPは、10%のSP油でアジュバント化された死滅キメラPCV1:2bウイルスからなる。

0130

0131

ブタは、ワクチン接種した0日目に、3〜4週齢の間であった。単回用量の2mLの指定のワクチンを、首の右側内の筋肉内(IM)に投与した。1インチまたは3/4インチ針を有する単一の3mL滅菌注射器を各ブタに使用した。ワクチン接種の詳細を記録した。ブタを、各ワクチン接種後昏睡努力性呼吸嘔吐、及び協調運動失調を含むが、これらに限定されない異常な臨床徴候を1時間(±30分)以内に観察した。観察されたあらゆる臨床徴候を、一般健康用紙に記録した。獣医師に、全体的な不調及び健康の悪化の徴候を示した2匹のブタの経過観察をするように通知した。これらの動物を、人道的安楽死させた。

0132

ブタが約6〜7週齢である21日目に、チャレンジを行った。各ブタに、事前に4.8〜5.8log10TCID50/mLに希釈した合計3mLのそれぞれのチャレンジウイルスを、各鼻孔の鼻腔内(IN)に1mLずつと、筋肉内(IM)に1mLを投与して、植え付けた。取り置きしていた一定分量のチャレンジウイルスをチャレンジ後に滴定し、実際のチャレンジ用量を確認した。

0133

−1日目(ワクチン接種前)ならびに7日目、14日目、20/21日目、28日目、35日目、及び42日目に血清分離管(SST)に、個々の血液試料(5〜10mL)を採取した。試料を等分し、≦−65℃で貯蔵して、後にELISAによってPCV2抗体力価を、qPCRによってPCV2ウイルス血症を試験した。

0134

個々の糞便拭き取り検体も、チャレンジ前(20/21日目)及びチャレンジ後週1回、各ブタからとった。個々の滅菌ポリエステル綿棒を、糞便拭き取り検体を採取するのに使用し、3mLの滅菌PBS培地を含む管に配置した。拭き取り検体を、廃棄前に5秒間、培地の中で渦流させた。試料を等分し、≦−65℃で貯蔵した。糞便拭き取り検体試料を、標準定量PCR手順により、ウイルス排出の試験をした。

0135

検死中、各ブタに対して、気道内腸間膜リンパ節及び浅鼠径リンパ節、ならびに扁桃腺組織切片も2連で採取し、個々に同定し、10%の緩衝ホルマリン中に固定した。一組は保存し、もう一組は、リンパ球枯渇(PCVAD)及び組織球性置換(組織球性置換)のための標準病理組織学試験に寄託した。結論を、有(+)または無(−)として記録した。ブタが、1つ以上の組織が「+」と評価された場合、リンパ球枯渇または組織球性置換を有するとみなした。さらに、組織を、IHCによってPCV2抗原の試験もした。結果を、0(染色なし)及び1〜3(染色の異なるレベル)として、記録した。0点は、PCV2 IHC(−)としてみなし、1点以上は、PCV2 IHC(+)としてみなした。ブタが、1つ以上の組織がIHC(+)であった場合、IHC(+)とみなした。

0136

プラシーボと比較して、主な成果は、候補ワクチンの同種及び異種保護であった。主要変数は、ウイルス血症であり、副次変数は、糞便排出及び組織病理学的病変であった。

0137

結果は、表4及び表5に示したとおり、チャレンジ前には、ブタが、PCV2ウイルス血症及び糞便排出が陰性のままだったことを示した。しかしながら、研究を通して、PCV2ウイルス血症(表4)及びPCV2糞便排出(表5)の定量PCRによって評価されたとおり、すべての処置群のすべてのブタが、ある時点でPCV2陽性になった。

0138

0139

0140

PCV2ELISAによって測定して、チャレンジ前力価は、すべての処置群の最小二乗(LS)平均力価が、PCV2抗体陰性であったことを示した(表6)。PCV2 ELISA抗体力価>0.5は、PCV2抗体陽性であるとみなされた。

0141

0142

実験的なPCV2b分岐ワクチン処置(T04、T08、及びT12)は、PCV2ウイルス血症(表4)及び糞便排出を数値的に減少させた(表5)。これはまた、免疫組織化学検査(IHC)点(表7)、及びリンパ球枯渇点(表8)によって示されるとおり、プラシーボと比較して、ほとんどの時点で組織病理学的病変の減少をもたらした。チャレンジ後、PCV2ELISA抗体力価におけるわずかな既往反応が、すべてのチャレンジ群で観察され(表6)、ワクチン抗原用量に、さらなる最適化が必要であったことを示唆している可能性がある。この研究で統計的な比較は行わなかったが、PCV2b分岐ワクチン処置が、PCV2a、PCV2b、及びPCV2b分岐チャレンジ株に対して保護したことは明白である。

0143

PCV2ワクチンの有効性の評価において、多くの人が、ウイルス血症及びリンパ球枯渇を、測定のためのキーパラメータとなるとみなしている。この研究において、PCV2b分岐ワクチンが、PCV2b分岐チャレンジに対して、PCV2aまたはPCV2bワクチンのいずれかが収めた成績よりも、数値的によりよい成績を収めたことに気付くことが重要である。

0144

0145

0146

実施例5:PCV2bチャレンジモデル最適化研
この研究の目的は、PCV2bチャレンジ物質の滴定及び投与経路を評価することであった。さらに、新規のPCV2b分岐チャレンジ調製物の予備評価を、現在有効なPCV2a及びPCV2bチャレンジモデルと並行して行った。研究設計の概説が、表9に示される。

0147

0148

0日目におよそ6週齢で、PCV2に対する血清抗体が低程度から陰性、かつPCV2ウイルス血症のない交雑ブタを、分離した空気の空間を有するBSL−2施設内の指定の囲い/部屋内に配置した。3つの部屋のそれぞれ内に、1つの囲いあたり12頭のブタが入っている4つの囲いがあった。ブタは、研究を通して、指定の囲いにとどまった。研究を通して、ブタには、水及び非薬用の年齢に応じた完全飼料への不断アクセスがあった。すべてのブタを、最低3日間、順応させた。

0149

ブタが約6週齢である0日目に、チャレンジを行った。各ブタに、事前に4.0〜6.0+/−0.5log10TCID50/mLに希釈した合計3mLのそれぞれのチャレンジウイルスを、処置群によって、2mLを各鼻孔の鼻腔内(IN)及び1mLを筋肉内(IM)に、または3mLをINに投与して、植え付けた。取り置きしていた一定分量のチャレンジウイルスをチャレンジ後に滴定し、実際のチャレンジ用量を確認した。

0150

−21日目、−1日目(ワクチン接種前)ならびに7日目、14日目、及び21日目に、個々の血液試料(5〜10mL)を血清分離管(SST)に採取した。試料を等分し、≦−65℃で貯蔵した。−21日目、−1日目、7日目、14日目、及び21日目の血清を、ELISAによってPCV2抗体力価を、qPCRによってPCV2ウイルス血症を試験した。

0151

チャレンジ前(−1日目)及びチャレンジ後週1回、個々の糞便拭き取り検体を各ブタからとった。糞便拭き取り検体を採取するのに、個々の滅菌ポリエステル綿棒を使用し、3mLの滅菌PBS培地を含む管に配置した。拭き取り検体を、廃棄前に5秒間、培地の中で渦流させた。試料を等分し、≦−65℃で貯蔵した。糞便拭き取り検体試料を、標準定量PCR手順により、ウイルス排出の試験をした。

0152

検死中、各ブタに対して、気道内、腸間膜リンパ節及び浅鼠径リンパ節、ならびに扁桃腺組織の切片を2連で採取し、個々に同定し、10%の緩衝ホルマリン中に固定した。一組は、リンパ球枯渇(PCVAD)及び組織球性置換(組織球性置換)のための標準病理組織学試験に寄託した。結論を、有(+)または無(−)として記録した。ブタは、1つ以上の組織が「+」と評価された場合、リンパ球枯渇または組織球性置換を有するとみなした。さらに、組織を、IHCによってPCV2抗原の試験もした。結果を、0(染色なし)及び1〜3(染色の異なるレベル)として、記録した。0の点数は、PCV2 IHC(−)としてみなし、1点以上は、PCV2 IHC(+)としてみなした。ブタが、1つ以上の組織がIHC(+)であった場合、IHC(+)とみなした。

0153

PCV疫学の実際の複雑さ及びPCV2 qPCRの感受性に起因して、数頭のブタがチャレンジ前にウイルス血症になる可能性がある。チャレンジ前にウイルス血症の試験をするブタは、研究から除去してもよく、臨床出資者の裁量に基づいて、データ分析に含めなくてもよい。

0154

主な成果は、PCV2a及びPCV2bの有効なモデルと比較して試験した、PCV2b分岐チャレンジ分離株であった。
結果
PCV2b分岐チャレンジ分離株を投与された動物は、処置群全体において、チャレンジ前から研究の終了までに、抗体力価の上昇があった。不希釈チャレンジ群と、続いてT12群(1:5で希釈、INに投与)が、チャレンジ後14日にピークウイルス血症を示し、それぞれ400万個超及び100万個超のDNAコピー数/mLを有していた。不希釈チャレンジ物質のピークPCV2排出は、754,114個のDNAコピー数/mLであった。不希釈IM/IN及び1:5のINのみは、組織病理学的異常及びPCV2コロニー形成に対して、陽性の動物の最大数をもたらした。

0155

このPCV2bチャレンジ最適化研究から採取したデータに基づいて(データは示さず)、チャレンジ経路及び用量を、3mLの鼻腔内に変更した。チャレンジ経路及び用量の変更は、筋肉内投与によって引き起こされ、受けるチャレンジ全体を上昇させると考えられる有害事象の確率を減少させると考えられた。

0156

実施例6:PCV2bチャレンジに対する2つのワクチン候補の評価
本研究の目的は、キメラPCV2bワクチン及びPCV2b分岐ワクチンの、PCV2bチャレンジに対する保護を評価することであり、それぞれが、低抗原用量及び高抗原用量で表される。本研究設計は、表10に概説される。プラシーボ(T01)は、10%のSP油であった。IVPは、以下の通りであった:T02、10%のSP油でアジュバント化した死滅PCV1:PCV2bキャプシドキメラ低用量(cPCV2b低);T03、10%のSP油でアジュバント化した死滅PCV1:PCV2bキャプシドキメラ高用量(cPCV2b高);T04、10%のSP油でアジュバント化した死滅PCV2b分岐ワクチン低用量(PCV2bDIV低);T05、10%のSP油でアジュバント化した死滅PCV2b分岐ワクチン高用量(PCV2bDIV高)。ワクチンを、20倍濃縮抗原を用いて生成し、次いで0.69%の抗原投入量=低用量または3.00%の抗原投入量=高用量で、ワクチンを製剤化した。

0157

0158

ブタは、ワクチン接種の0日目に約3週齢(生後21±7日)だった。処置投与者が、単回用量の2mLの指定のワクチンを、首の右側の筋肉内(IM)に投与した。1インチまたは3/4インチ針を有する単一の3mL滅菌注射器を各ブタに使用した。ワクチン接種の詳細を記録した。ブタを、各ワクチン接種後、昏睡、努力性呼吸、嘔吐、及び協調運動失調を含むが、これらに限定されない異常な臨床徴候を1時間(±30分)以内に観察した。観察されたあらゆる臨床徴候を、一般健康用紙に記録した。獣医師に、上述の徴候のいずれかを示すブタ(複数可)の経過観察をするように通知した。

0159

ブタが約6週齢だった21日目に、チャレンジを行った。各ブタに、事前に4.8〜5.8log10TCID50/mLに希釈した合計3mLの毒性PCV2b株の培養を、鼻腔内(IN)に植え付けた。取り置きしていた一定分量のチャレンジウイルスを、チャレンジ後に滴定し、実際のチャレンジ用量を確認した。

0160

−1日目(ワクチン接種前)、ならびに7日目、14日目、20/21日目、28日目、35日目、及び42日目に、個々の血液試料(5〜10mL)を、血清分離管(SST)に採取した。試料を等分し、≦−65℃で貯蔵した。これらを、ELISAによってPCV2抗体力価を、qPCRによってPCV2ウイルス血症を、後ほど試験した
チャレンジ前(20/21日目)、及びチャレンジ後週1回、個々の糞便拭き取り検体を各ブタからとった。糞便拭き取り検体を採取するのに、個々の滅菌ポリエステル綿棒を使用し、3mLの滅菌PBS培地を含む管に配置した。拭き取り検体を、廃棄前に5秒間、培地の中で渦流させた。試料を等分し、≦−65℃で貯蔵した。糞便拭き取り検体試料を、標準定量PCR手順により、ウイルス排出の試験をした。

0161

検死中、各ブタに対して、気道内、腸間膜リンパ節及び浅鼠径リンパ節、ならびに扁桃腺組織の切片を2連で採取し、個々に同定し、10%の緩衝ホルマリン中に固定した。一組は保存し、もう一組は、リンパ球枯渇(PCVAD)及び組織球性置換(組織球性置換)のための標準病理組織学試験に寄託した。結論を、有(+)または無(−)として記録した。ブタは、1つ以上の組織が「+」と評価された場合、リンパ球枯渇または組織球性置換を有するとみなした。さらに、組織を、IHCによってPCV2抗原の試験もした。結果を、0(染色なし)及び1〜3(染色の異なるレベル)として、記録した。0点は、PCV2 IHC(−)としてみなし、1点以上は、PCV2 IHC(+)としてみなした。ブタは、1つ以上の組織がIHC(+)である場合、IHC(+)とみなした。

0162

プラシーボと比較して、主な成果は、PCV2bチャレンジに対する4つの候補ワクチンのうちの1つの保護だった。主要変数は、ウイルス血症であり、副次変数は、糞便排出及び組織病理学的病変であった。
結果
PCV2ウイルス血症
血清を、週1回採取し、定量PCRによってPCV2ウイルス血症を分析した。各研究日の幾何最小二乗平均が、図2に例示される。すべてのブタが、下記表11に示したとおり、チャレンジ前はPCV2ウイルス血症に対して陰性のままだった。

0163

0164

処置及びチャレンジによるPCV2ウイルス血症(DNAコピー数)は、下記表12に記載される。すべての処置群は、チャレンジ後の35日目及び44日目にT01群と著しく異なった(P<0.0001)。

0165

研究の過程を通して終始陽性だった動物のパーセントは、下記(表12)に列挙される。プラシーボ群は、ワクチン投与を受けた群と比較して、著しく多い数の終始陽性だった動物を有した(P<0.0124)。

0166

0167

PCV2糞便排出
研究日別の糞便排出幾何最小二乗平均は、図3に例示される。処置及びチャレンジによるPCV2糞便排出(DNAコピー数)は、下記表13に記載される。すべての処置群は、チャレンジ後の35日目及び44日目にT01群と著しく異なった(P<0.0001)。

0168

0169

研究の過程を通して排出が終始陽性だった動物のパーセントは、下記(表14)に列挙される。プラシーボ群は、ワクチン投与を受けた群と比較して、著しく多い数の終始排出していた動物を有した(P<0.0124)。

0170

0171

血清抗体反応
研究日別の各処置のPCV2抗体力価平均を、図4に例示する。すべてのブタは、ワクチン接種前にPCV2血清反応陰性だった。プラシーボ群のブタは、チャレンジ前に血清反応陰性のままだった。

0172

PCV2ELISA抗体力価は、下記表15に要約される。すべての力価の>0.5を、PCV2抗体陽性であるとみなした。すべてのワクチン群のブタは、プラシーボと比較するとワクチン接種後28〜44日目にPCV2抗体力価の著しい増加(P≦0.0895)を示し、ワクチン接種後にPCV2に対する活発な免疫反応を示した。さらに、T03及びT05は、ワクチン接種後20日目に著しくより高い力価を有した(それぞれP≦0.0684及びP≦0.0738)。

0173

0174

病理組織学:リンパ球枯渇(LD)及びリンパ組織内のウイルス感染(IHC)
リンパの病変及びPCV2抗原の存在を検討する際、PCV2パーセント異常病理組織学点(データは示さず)は、プラシーボ群とワクチン投与を受けた群との間に有意差を示さなかった。

0175

この研究からのデータは、1)ワクチン接種の時点からチャレンジの時点まで、週1回の間隔で採取した血清中に、検出可能なPCV2 DNAがなく、2)T01群間において、チャレンジ前にPCV2への任意の意図しない暴露があったという、血清学的証拠がないことによって証明されるとおり、21日目のチャレンジまで、研究のすべてのブタが、PCV2への無感染を維持していたことを示した。すべてのワクチンは、ワクチン投与を受けた動物が、チャレンジ後にウイルス血症になることから保護した。また、すべてのワクチンは、チャレンジ後の、ワクチン投与を受けた動物のPCV2の糞便排出を著しく低減した。すべてのワクチン群のブタは、プラシーボと比較すると、ワクチン接種後28〜44日目にPCV2抗体力価の著しい増加(P≦0.0895)を示し、ワクチン接種後にPCV2に対する活発な免疫反応を示した。対照群に対してすべてのワクチン投与を受けた群においてコロニー形成(IHC)の数値的減少があったが、統計学的に有意ではなかった。群間の有意差の欠如は、対照群に見られた弱いチャレンジ獲得に起因した可能性がある。

0176

実施例7:PCV2b分岐チャレンジに対する2つのワクチン候補の評価
本研究の目的は、キメラPCV2bワクチン及びPCV2b分岐ワクチンのそれぞれが、低抗原用量及び高抗原用量で表される、キメラPCV2bワクチン及びPCV2b分岐ワクチン、ならびにバキュロウイルス内で発現したPCV2aキャプシドの、PCV2b分岐チャレンジに対する保護を評価することであった。研究設計は、表16に概説される。プラシーボ(T01)は、10%のSP油であった。IVPは、以下の通りであった:T02、10%のSP油でアジュバント化した死滅PCV1:PCV2bキャプシドキメラ低用量(cPCV2b低);T03、10%のSP油でアジュバント化した死滅PCV1:PCV2bキャプシドキメラ高用量(cPCV2b高);T04、10%のSP油でアジュバント化した死滅PCV2b分岐ワクチン低用量(PCV2bDIV低);T05、10%のSP油でアジュバント化した死滅PCV2b分岐ワクチン高用量(PCV2bDIV高);T06、水系アジュバント中のPCV2aキャプシドを発現する死滅バキュロウイルス(比較生成物)。T02〜T05ワクチンを、20倍濃縮抗原を用いて生成し、次いで0.69%の抗原投入量=低用量または3.00%の抗原投入量=高用量で、ワクチンを製剤化した。

0177

0178

ワクチン接種の0日目に、ブタは、約3週齢(生後21±8日)だった。処置投与者が、単回用量の2mL(T01〜T05)または1mL(T06)の指定のワクチンを、首の右側の筋肉内(IM)に投与した。1インチまたは3/4インチ針を有する単一の3mL滅菌注射器を各ブタに使用した。ワクチン接種の詳細を記録した。ブタを、各ワクチン接種後、昏睡、努力性呼吸、嘔吐、及び協調運動失調を含むが、これらに限定されない異常な臨床徴候を1時間(±30分)以内に観察した。観察されたあらゆる臨床徴候を、一般健康用紙に記録した。獣医師に、上述の徴候のいずれかを示すブタ(複数可)の経過観察をするように通知した。

0179

ブタが約6週齢だった21日目に、チャレンジを行った。各ブタに、事前に4.8〜5.8log10TCID50/mLに希釈した合計3mLの毒性PCV2b分岐株の培養を、鼻腔内(IN)に植え付けた。取り置きしていた一定分量のチャレンジウイルスを、チャレンジ後に滴定し、実際のチャレンジ用量を確認した。

0180

−1日目(ワクチン接種前)、ならびに7日目、14日目、20/21日目、28日目、35日目、及び42日目に、個々の血液試料(5〜10mL)を、血清分離管(SST)に採取した。試料を等分し、≦−65℃で貯蔵した。これらを、ELISAによってPCV2抗体力価を、qPCRによってPCV2ウイルス血症を、後ほど試験した
チャレンジ前(20/21日目)、及びチャレンジ後週1回、個々の糞便拭き取り検体を各ブタからとった。糞便拭き取り検体を採取するのに、個々の滅菌ポリエステル綿棒を使用し、3mLの滅菌PBS培地を含む管に配置した。拭き取り検体を、廃棄前に5秒間、培地の中で渦流させた。試料を等分し、≦−65℃で貯蔵した。糞便拭き取り検体試料を、標準定量PCR手順により、ウイルス排出の試験をした。

0181

検死中、各ブタに対して、気道内、腸間膜リンパ節及び浅鼠径リンパ節、ならびに扁桃腺組織の切片を2連で採取し、個々に同定し、10%の緩衝ホルマリン中に固定した。一組は保存し、もう一組は、リンパ球枯渇(PCVAD)及び組織球性置換(組織球性置換)のための標準病理組織学試験に寄託した。結論を、有(+)または無(−)として記録した。ブタは、1つ以上の組織が「+」と評価された場合、リンパ球枯渇または組織球性置換を有するとみなした。さらに、組織を、IHCによってPCV2抗原の試験もした。結果を、0(染色なし)及び1〜3(染色の異なるレベル)として、記録した。0点は、PCV2 IHC(−)としてみなし、1点以上は、PCV2 IHC(+)としてみなした。ブタが、1つ以上の組織がIHC(+)であった場合、IHC(+)とみなした。

0182

プラシーボと比較して、主な成果は、PCV2b分岐チャレンジに対する4つの候補ワクチンのうちの1つ及びバキュロウイルスワクチンの保護だった。主要変数は、ウイルス血症であり、副次変数は、糞便排出及び組織病理学的病変であった。
PCV2ウイルス血症
血清を、週1回採取し、定量PCRによってPCV2ウイルス血症を分析した。各研究日の幾何最小二乗平均が図5に例示される。下記表17に示したとおり、T04群及びT05群の両方の1頭の動物を除いたすべてのブタは、チャレンジ前に、PCV2ウイルス血症に対して陰性のままだった。

0183

0184

研究の過程を通して終始陽性だった動物のパーセントは、下記(表18)に列挙される。プラシーボ群は、ワクチン投与を受けた群と比較して、著しく高いパーセントの終始陽性だった動物を有した(P≦0.0046)。

0185

0186

PCV2糞便排出
研究日別の糞便排出幾何最小二乗平均が、図6に例示される。処置及びチャレンジによるPCV2糞便排出(DNAコピー数)が、下記表19に記載される。T04群の1頭の動物が、チャレンジの前日に排出していた。すべてのワクチン群が、チャレンジ後である35日目及び43日目に、プラシーボ群よりも著しく少ない(P≦0.0001)最小二乗平均PCV2 DNAコピー数を排出していた。さらに、T03、T05、及びT06群もまた、研究の28日目に、著しく少ない最小二乗平均DNAコピー数(P≦0.0830)を排出したことが認められた。

0187

0188

研究の過程を通して排出が終始陽性だった動物のパーセントは、下記(表20)に列挙される。チャレンジ後、プラシーボ群と比較すると、群T03〜T06が、PCR検出可能なPCV2 DNAを排出していたブタのパーセントに著しい低下(P≦0.0028)があった。

0189

0190

血清抗体反応
PCV2抗体力価に関して、結果は、ELISAによって評価されるとおり、PCV2b分岐ワクチン処置(T04;T05)が、研究1日目に、チャレンジ前の他の処置と比較してより強い血清学的反応を有したことを示した(表21;図7)。しかしながら、チャレンジ後、PCV2b分岐処置は、他の処置ほどは強く反応しなかった(図7)。1つの考えられる結論は、この動物が、すでに特異的強い抗PCV2b分岐抗体反応を有しており、チャレンジウイルスを非常に迅速に中和及び除去することができたということであった。これは、異種ワクチンのものと比べると、チャレンジ後の抗体反応の減少と解釈された、血清学が、有効性と同じではない一方で、有効なワクチンを投与されたブタ内の減少した抗体力価は、保護を示すことを示した(Thacker et al.,2013,Proc AASV,217)。

0191

0192

病理組織学:リンパ球枯渇(LD)及びリンパ組織のウイルス感染(IHC)
検死の時点で、プラシーボ群と比較すると、すべてのワクチン群は、著しく少ないパーセントの顕微鏡的リンパ病変(LD)及びPCV2抗原コロニー形成(IHC)を有する動物を有した(P≦0.0995)。

0193

PCV2 IHCデータは、下記表22に要約される。

0194

0195

PCV2リンパ球枯渇(LD)データは、下記表23に要約される。

0196

0197

この研究からのデータは、すべての処置群の最小二乗平均PCV2力価が、ワクチン接種前に血清反応陰性であったことを示した。プラシーボ群のブタは、チャレンジ前に血清反応陰性のままだった。T04及びT05群の両方の1頭の動物は、チャレンジの前日にウイルス血症であった。T04群の動物もまた排出していたが、10%未満の動物が、チャレンジ前にウイルス血症になり、研究は、有効であるとみなした。チャレンジ後、プラシーボ群と比較すると、すべてのワクチン投与を受けた群には、ウイルス血症ブタのパーセントに著しい低下があった。チャレンジ後、プラシーボ群と比較すると、群T03〜T06が、PCR検出可能なPCV2 DNAを排出していたブタのパーセントに著しい低下があった。検死の時点で、プラシーボ群と比較すると、すべてのワクチン群は、著しく少ないパーセントの顕微鏡的リンパ病変(LD)及びPCV2抗原コロニー形成を有する動物を有した。この研究は、cPCV1−2b、PCV2b分岐、及びPCV2aキャプシドワクチンを発現するバキュロウイルスが、PCV2b分岐株チャレンジに対して、交差防御をすることを示した。

実施例

0198

上記実施例は、単に例証として提供され、これらのいずれも、本発明の全範囲への制限であるとみなされるべきではないことを理解されたい。

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