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技術 GITR抗原結合タンパク質

出願人 アムジエン・インコーポレーテツド
発明者 ビアーズ,コートニーオニール,ジェイソン・シーフォルツ,イアンケッチェム,ランドル・アールパイアセッキ,ジュリア・シー
出願日 2014年8月28日 (5年3ヶ月経過) 出願番号 2016-537860
公開日 2016年9月29日 (3年2ヶ月経過) 公開番号 2016-530278
状態 特許登録済
技術分野 ペプチド又は蛋白質 突然変異または遺伝子工学 微生物による化合物の製造 微生物、その培養処理 蛋白脂質酵素含有:その他の医薬 抗原、抗体含有医薬:生体内診断剤 化合物または医薬の治療活性
主要キーワード 意思決定過程 物理的撹拌 連結子 バルク製品 単一区画 中核領域 抗酸化添加剤 液体領域
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図面 (20)

課題・解決手段

GITRを活性化する抗原結合タンパク質が提供される。抗原結合タンパク質をコードする核酸、並びにかかる核酸を含むベクター及び細胞も提供される。抗原結合タンパク質は、GITRシグナル伝達を刺激し、それによって対象における免疫反応を誘発するまたは向上させることが有用である治療方法において価値を有する。従って、抗原結合タンパク質は、種々のがん及び感染症治療を始めとする様々な免疫療法の治療において有用性を有する。

概要

背景

グルココルチコイド誘導性TNFR関連遺伝子(GITR:TNFRSF18)は、活性誘発性TNFR科メンバーAITR)と称されることもある、TNF受容体スーパーファミリー(TNFRSF)に属する受容体である。GITRはその同族リガンドであるGITRリガンド(CITRL、TNFSF18)により活性化される。GITRは、システイン富む細胞外ドメインを含むI型膜貫通タンパク質であり、該細胞外ドメインはTNFR科メンバーの特徴である。例えば、GITRの細胞質ドメインは、4−1BB及びCD27などの、特定の他のTNFR科メンバーと近接した相同性共有する(Nocentiniら(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.94:6216〜6221)。

ヒトGITRは、休止期レスポンダ細胞において低レベル発現し、CD4+細胞はCD8+細胞に比較して大きな発現を示す。GITRの発現は、T細胞の活性化後数日間顕著に上方制御される。GITRは、CD4+CD25+細胞またはCD8+CD25+細胞などの制御性T細胞(Treg)において高いレベルで構成的に発現し、これらの細胞が活性化されると更に上方制御される(Nocentini及びRiccardi(2005)E.J.Immunol.35:1016〜1022)。但し、GITRの発現はT細胞のみに限定されるものではない。報告によれば、GITRは、NK細胞マクロファージB細胞樹状細胞肥満細胞及び単球上で発現することも示されている(Nocentini及びRiccardi(2005)E.J.Immunol.35:1016〜1022)。

GITRLは、殆どのTNFリガンド科メンバーに関して典型的である通り、II型膜貫通タンパク質である。現在の研究では、ヒトGITRLは、単量体として存在する、または他の多量体の形態に会合する場合もあるが、一般的には三量体として存在することが示されている(Chattopadhyayら(2007)Proc.Natl.Acad.Sci.104:19452〜19457、Zhouら(2008)Proc.Natl.Acad.Sci.105:635〜640)。可溶性の形態のGITRLも産生されていることを示唆する一部の証左がある(Baltzら(2008)Blood 112:3735〜3743、Maheshら(2006)Eur.J.Immunol.36:2128〜2138)。GITRLは主として、マクロファージ、B細胞、樹状細胞及び抗原提示細胞APC)として機能することができる内皮細胞を始めとするAPC上で発現する(Nocentini及びRiccardi(2005)E.J.Immunol.35:1016〜1022、Agostiniら(2005)Infect.Immun.73:7502〜7508、並びにNocentiniら(2007)E.J.Immunol.37:1165〜1169)。

APC上のGITRLがレスポンダT細胞上のGITRに結合することが、GITRシグナル伝達をトリガーし、該シグナル伝達がレスポンダT細胞を同時刺激し、Treg細胞抑制作用阻害する。GITRシグナル伝達は、CD4+ナイーブT細胞及びCD8+ナイーブT細胞の両者に対して同時活性化するシグナルとして機能し、それによって、特にT細胞受容体(TCR)刺激が不十分である場合に、増殖及びエフェクタ機能を誘発するまたは向上させる(Schaerら(2012)Curr.Opin.Immunol.24:217〜224)。より詳細には、GITRは、エフェクタT細胞が阻害に対してより耐性となるような、エフェクタT細胞の同時刺激及び活性化、制御性T細胞の阻害、制御性T細胞による抑制に対するエフェクタT細胞の感受性の低減、並びに循環における制御性T細胞の一部の除去を始めとする、エフェクタT細胞及び制御性T細胞に対するいくつかの効果を奏することができる(Nocentiniら(2007)Eur.J.Immunol.37:1165〜1169)。

まとめると、上述の活性、特にレスポンダT細胞の同時刺激及び制御性T細胞の抑制因子活性の抑止は、GITRの活性化が免疫反応の向上に繋がることを意味する。かかる活性化は、感染症及び腫瘍に対する免疫反応を回復する可能性を有する。従って、GITRを活性化する能力を有する分子は、免疫反応の向上をトリガーすることが望ましい状況において、免疫賦活剤としての価値があることとなる。

概要

GITRを活性化する抗原結合タンパク質が提供される。抗原結合タンパク質をコードする核酸、並びにかかる核酸を含むベクター及び細胞も提供される。抗原結合タンパク質は、GITRシグナル伝達を刺激し、それによって対象における免疫反応を誘発するまたは向上させることが有用である治療方法において価値を有する。従って、抗原結合タンパク質は、種々のがん及び感染症の治療を始めとする様々な免疫療法の治療において有用性を有する。

目的

本明細書において用いられる用語は、特定の実施形態を記述することを目的とする

効果

実績

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請求項1

抗原結合タンパク質であって、a)それぞれ重鎖可変ドメイン(VH)及び軽鎖可変ドメイン(VL)のCDRH3及びCDRL3であって、VH及びVLが、表1に示される抗原結合タンパク質Ab1からAb59のいずれか1種より選択される同一の抗原結合タンパク質の一部である、CDRH3及びCDRL3、b)CDRH1、CDRH2及びCDRH3を含む変異VHであって、CDRH1、CDRH2及びCDRH3の1または複数が、Ab1からAb59の群より選択されるいずれかの単一の抗原結合タンパク質のVHの、対応するCDRH1、CDRH2及びCDRH3と比較して配列が異なり、但し、前記変異VHのCDRH1、CDRH2及びCDRH3の、前記VH配列の対応するCDRと比較した場合の前記配列の違いは、全体の合計で1、2、3、4または5を超えないアミノ酸であるとの条件である、変異VH、c)CDRL1、CDRL2及びCDRL3を含む変異VLであって、CDRL1、CDRL2及びCDRL3の1または複数が、Ab1からAb59の群より選択されるいずれかの単一の抗原結合タンパク質のVLの、対応するCDRL1、CDRL2及びCDRL3と比較して配列が異なり、但し、前記変異VLのCDRL1、CDRL2及びCDRL3の、前記VL配列の対応するCDRと比較した場合の前記配列の違いは、全体の合計で1、2、3、4または5を超えないアミノ酸であるとの条件である、変異VL、d)b)の変異VH及びc)の変異VLであって、それぞれ、変異VH及び変異VLが表1に指定される同一の抗原結合タンパク質のVH及びVLの変異体であるとの条件の、b)の変異VH及びc)の変異VL、e)CDRH1、CDRH2及びCDRH3を含むVHであって、CDRH1が配列X1YGMX2(配列番号436)を含み、X1はSまたはNであり、X2はHまたはYであり、CDRH2が配列VIWYX1GSNKYYADSVX2G(配列番号437)を含み、X1はE、V、A、Pであり、X2はKまたはRであり、CDRH3が配列GGX1LX2X3X4YYX5GMDV(配列番号438)を含み、X1はQ、L、E、またはRであり、X2はG、R、またはSであり、X3はK、Y、L、F、またはRであり、X4はYまたはDであり、X5はYまたはSである、VH、f)CDRL1、CDRL2及びCDRL3を含むVLであって、CDRL1が配列RASQX1IRNDLG(配列番号439)を含み、X1はGまたはVであり、CDRL2が配列X1X2SX3LQS(配列番号440)を含み、X1はAまたはDであり、X2はAまたはTであり、X3はSまたはTであり、CDRL3が配列X1QX2X3X4YPX5T(配列番号441)を含み、X1はLまたはQであり、X2はHまたはLであり、X3はNまたはHであり、X4はS、NまたはTであり、X5はW、LまたはIである、VL、g)e)のVH及びf)のVL、h)それぞれ、表1に指定されるAb1からAb59の抗原結合タンパク質の同一のVH由来の、CDRH1、CDRH2及びCDRH3、i)それぞれ、表1に指定されるAb1からAb59の抗原結合タンパク質の同一のVL由来の、CDRL1、CDRL2及びCDRL3、j)前記VH及び前記VLが同一の抗原結合タンパク質由来である、h)のCDRH1、CDRH2及びCDRH3並びにi)のCDRH1、CDRH2及びCDRH3、k)アミノ酸配列が、表1に指定される抗原結合タンパク質Ab1からAb59のいずれか1種のVHの配列と、少なくも80%、85%、90%、95%、97%または99%同一であるVH、l)アミノ酸配列が、表1に指定される抗原結合タンパク質Ab1からAb59のいずれか1種のVLの配列と、少なくも80%、85%、90%、95%、97%または99%同一であるVL、m)k)のVH及びl)のVLであって、VH及びVLが表1に指定される同一の抗原結合タンパク質由来である、k)のVH及びl)のVL、n)表1に指定される抗原結合タンパク質Ab1からAb59のいずれか1種のVHのアミノ酸配列を含むVH、o)表1に指定される抗原結合タンパク質Ab1からAb59のいずれか1種のVLのアミノ酸配列を含むVL、p)n)のVH及びo)のVLであって、VH及びVLが表1に指定される同一の抗原結合タンパク質由来の、n)のVH及びo)のVL、q)アミノ酸配列が、表1に指定される抗原結合タンパク質Ab1からAb59のいずれか1種の完全長重鎖(HC)の配列と、少なくも90%、95%、97%または99%同一である完全長重鎖、r)アミノ酸配列が、表1に指定される抗原結合タンパク質Ab1からAb59のいずれか1種の完全長軽鎖(LC)の配列と、少なくも90%、95%、97%または99%同一である完全長軽鎖、s)表1に指定される同一の抗原結合タンパク質由来である、q)の完全長重鎖及びr)の完全長軽鎖、t)表1に指定される抗原結合タンパク質Ab1からAb59のいずれか1種の完全長重鎖のアミノ酸配列を含む完全長重鎖、u)表1に指定される抗原結合タンパク質Ab1からAb59のいずれか1種の完全長軽鎖のアミノ酸配列を含む完全長軽鎖、またはv)表1に指定される同一の抗原結合タンパク質由来である、t)の完全長重鎖及びu)の完全長軽鎖を含む、抗原結合タンパク質。

請求項2

CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2及びCDRH3を含む請求項1に記載の抗原結合タンパク質であって、CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2及びCDRH3の1または複数の配列が、Ab1からAb59の群より選択されるいずれかの単一の抗体の対応するCDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2及びCDRH3と比較して異なり、但し、前記CDRの前記配列の違いは、全体の合計で1、2、3、4または5を超えないアミノ酸であるとの条件である、抗原結合タンパク質。

請求項3

CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2及びCDRH3を含む請求項1または2に記載の抗原結合タンパク質であって、a)CDRL1が配列番号5を含み、CDRL2が配列番号11を含み、CDRL3が配列番号19を含み、CDRH1が配列番号31を含み、CDRH2が配列番号36を含み、CDRH3が配列番号47を含む、b)CDRL1が配列番号5を含み、CDRL2が配列番号12を含み、CDRL3が配列番号18を含み、CDRH1が配列番号31を含み、CDRH2が配列番号40を含み、CDRH3が配列番号52を含む、c)CDRL1が配列番号10を含み、CDRL2が配列番号17を含み、CDRL3が配列番号28を含み、CDRH1が配列番号35を含み、CDRH2が配列番号45を含み、CDRH3が配列番号62を含む、d)CDRL1が配列番号5を含み、CDRL2が配列番号12を含み、CDRL3が配列番号29を含み、CDRH1が配列番号31を含み、CDRH2が配列番号37を含み、CDRH3が配列番号58を含む、e)CDRL1が配列番号5を含み、CDRL2が配列番号14を含み、CDRL3が配列番号30を含み、CDRH1が配列番号3を含み、CDRH2が配列番号36を含み、CDRH3が配列番号63を含む、f)CDRL1が配列番号10を含み、CDRL2が配列番号17を含み、CDRL3が配列番号28を含み、CDRH1が配列番号35を含み、CDRH2が配列番号45を含み、CDRH3が配列番号76を含む、g)CDRL1が配列番号5を含み、CDRL2が配列番号12を含み、CDRL3が配列番号29を含み、CDRH1が配列番号31を含み、CDRH2が配列番号37を含み、CDRH3が配列番号58を含む、h)CDRL1が配列番号5を含み、CDRL2が配列番号14を含み、CDRL3が配列番号30を含み、CDRH1が配列番号31を含み、CDRH2が配列番号71を含み、CDRH3が配列番号63を含む、またはi)CDRL1が配列番号5を含み、CDRL2が配列番号11を含み、CDRL3が配列番号19を含み、CDRH1が配列番号31を含み、CDRH2が配列番号71を含み、CDRH3が配列番号47を含む、j)CDRL1が配列番号5を含み、CDRL2が配列番号12を含み、CDRL3が配列番号18を含み、CDRH1が配列番号31を含み、CDRH2が配列番号73を含み、CDRH3が配列番号52を含む、抗原結合タンパク質。

請求項4

VL及びVHを含む請求項1から3のいずれか1項に記載の抗原結合タンパク質であって、a)VLのアミノ酸配列が、配列番号119と、少なくとも80%、85%、90%、95%、97%または99%同一であり、VHのアミノ酸配列が、配列番号138と、少なくとも80%、85%、90%、95%、97%または99%同一である、b)VLのアミノ酸配列が、配列番号124と、少なくとも80%、85%、90%、95%、97%または99%同一であり、VHのアミノ酸配列が、配列番号143と、少なくとも80%、85%、90%、95%、97%または99%同一である、c)VLのアミノ酸配列が、配列番号134と、少なくとも80%、85%、90%、95%、97%または99%同一であり、VHのアミノ酸配列が、配列番号153と、少なくとも80%、85%、90%、95%、97%または99%同一である、d)VLのアミノ酸配列が、配列番号135と、少なくとも80%、85%、90%、95%、97%または99%同一であり、VHのアミノ酸配列が、配列番号154と、少なくとも80%、85%、90%、95%、97%または99%同一である、e)VLのアミノ酸配列が、配列番号136と、少なくとも80%、85%、90%、95%、97%または99%同一であり、VHのアミノ酸配列が、配列番号155と、少なくとも80%、85%、90%、95%、97%または99%同一である、f)VLのアミノ酸配列が、配列番号242と、少なくとも80%、85%、90%、95%、97%または99%同一であり、VHのアミノ酸配列が、配列番号282と、少なくとも80%、85%、90%、95%、97%または99%同一である、g)VLのアミノ酸配列が、配列番号255と、少なくとも80%、85%、90%、95%、97%または99%同一であり、VHのアミノ酸配列が、配列番号295と、少なくとも80%、85%、90%、95%、97%または99%同一である、h)VLのアミノ酸配列が、配列番号262と、少なくとも80%、85%、90%、95%、97%または99%同一であり、VHのアミノ酸配列が、配列番号302と、少なくとも80%、85%、90%、95%、97%または99%同一である、i)VLのアミノ酸配列が、配列番号267と、少なくとも80%、85%、90%、95%、97%または99%同一であり、VHのアミノ酸配列が、配列番号307と、少なくとも80%、85%、90%、95%、97%または99%同一である、j)VLのアミノ酸配列が、配列番号272と、少なくとも80%、85%、90%、95%、97%または99%同一であり、VHのアミノ酸配列が、配列番号312と、少なくとも80%、85%、90%、95%、97%または99%同一である、抗原結合タンパク質。

請求項5

VL及びVHを含む請求項1から4のいずれか1項に記載の抗原結合タンパク質であって、a)VLが配列番号119を含み、VHが配列番号138を含む、b)VLが配列番号124を含み、VHが配列番号143を含む、c)VLが配列番号134を含み、VHが配列番号153を含む、d)VLが配列番号135を含み、VHが配列番号154を含む、e)VLが配列番号136を含み、VHが配列番号155を含む、f)VLが配列番号242を含み、VHが配列番号282を含む、g)VLが配列番号255を含み、VHが配列番号295を含む、h)VLが配列番号262を含み、VHが配列番号302を含む、i)VLが配列番号267を含み、VHが配列番号307を含む、j)VLが配列番号272を含み、VHが配列番号312を含む、抗原結合タンパク質。

請求項6

LC及びHCを含む請求項1から5のいずれか1項に記載の抗原結合タンパク質であって、a)LCのアミノ酸配列が、配列番号317と、少なくとも90%、95%、97%または99%同一であり、HCのアミノ酸配列が、配列番号336と、少なくとも90%、95%、97%または99%同一である、b)LCのアミノ酸配列が、配列番号322と、少なくとも90%、95%、97%または99%同一であり、HCのアミノ酸配列が、配列番号341と、少なくとも90%、95%、97%または99%同一である、c)LCのアミノ酸配列が、配列番号332と、少なくとも90%、95%、97%または99%同一であり、HCのアミノ酸配列が、配列番号351と、少なくとも90%、95%、97%または99%同一である、d)LCのアミノ酸配列が、配列番号333と、少なくとも90%、95%、97%または99%同一であり、HCのアミノ酸配列が、配列番号352と、少なくとも90%、95%、97%または99%同一である、e)LCのアミノ酸配列が、配列番号334と、少なくとも90%、95%、97%または99%同一であり、HCのアミノ酸配列が、配列番号353と、少なくとも90%、95%、97%または99%同一である、f)LCのアミノ酸配列が、配列番号360と、少なくとも90%、95%、97%または99%同一であり、HCのアミノ酸配列が、配列番号400と、少なくとも90%、95%、97%または99%同一である、g)LCのアミノ酸配列が、配列番号373と、少なくとも90%、95%、97%または99%同一であり、HCのアミノ酸配列が、配列番号413と、少なくとも90%、95%、97%または99%同一である、h)LCのアミノ酸配列が、配列番号380と、少なくとも90%、95%、97%または99%同一であり、HCのアミノ酸配列が、配列番号420と、少なくとも90%、95%、97%または99%同一である、i)LCのアミノ酸配列が、配列番号385と、少なくとも90%、95%、97%または99%同一であり、HCのアミノ酸配列が、配列番号425と、少なくとも90%、95%、97%または99%同一である、j)LCのアミノ酸配列が、配列番号390と、少なくとも90%、95%、97%または99%同一であり、HCのアミノ酸配列が、配列番号430と、少なくとも90%、95%、97%または99%同一である、抗原結合タンパク質。

請求項7

LC及びHCを含む請求項1から6のいずれか1項に記載の抗原結合タンパク質であって、a)LCが配列番号317を含み、HCが配列番号336を含む、b)LCが配列番号322を含み、HCが配列番号341を含む、c)LCが配列番号332を含み、HCが配列番号351を含む、d)LCが配列番号333を含み、HCが配列番号352を含む、e)LCが配列番号334を含み、HCが配列番号353を含む、f)LCが配列番号360を含み、HCが配列番号400を含む、g)LCが配列番号373を含み、HCが配列番号413を含む、h)LCが配列番号380を含み、HCが配列番号420を含む、i)LCが配列番号385を含み、HCが配列番号425を含む、j)LCが配列番号390を含み、HCが配列番号430を含む、抗原結合タンパク質。

請求項8

ヒトGITRとの結合に関して、基準となる抗原結合タンパク質と競合する抗原結合タンパク質であって、前記基準となる抗原結合タンパク質が請求項5に記載の抗原結合タンパク質である、抗原結合タンパク質。

請求項9

ヒトGITRとの結合に関して、抗原結合タンパク質と基準となる抗体とが交差競合する、請求項8に記載の抗原結合タンパク質。

請求項10

a)モノクローナル抗体である、b)ヒト抗体ヒト化抗体、またはキメラ抗体である、c)多重特異性抗体である、d)IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4型である、e)抗原結合抗体フラグメントである、f)Fabフラグメント、Fab’フラグメント、F(ab’)2フラグメント、またはFvフラグメントである、g)二特異性抗体、一本鎖抗体ドメイン抗体、またはナノボディーである、h)標識されているの1または複数の特性を有する、請求項1から9のいずれか1項に記載の抗原結合タンパク質。

請求項11

完全ヒト抗体である、請求項1から10のいずれか1項に記載の抗原結合タンパク質。

請求項12

ヒトGITRの活性刺激する、請求項1から11のいずれか1項に記載の抗原結合タンパク質。

請求項13

a)GITRとの結合に関して、GITRLと交差競合する、b)ヒトCD4細胞中内部移行可能である、c)制御性T細胞の抑制を阻害する、d)制御性T細胞の循環を低下させる、e)エフェクタT細胞を活性化する、f)ヒト血清中で、少なくとも6日、7日、9日または12日の半減期を有するの1または複数の活性を有する、請求項1から12のいずれか1項に記載の抗原結合タンパク質。

請求項14

完全ヒトIgG1抗体である、請求項1から13のいずれか1項に記載の抗原結合タンパク質。

請求項15

Fcγ受容体(FcγR)と結合する能力を有する、請求項1から14のいずれか1項に記載の抗原結合タンパク質。

請求項16

抗原結合タンパク質のクラスタが形成されるように、Fcγ受容体(FcγR)と結合する能力を有する、請求項1から15のいずれか1項に記載の抗原結合タンパク質。

請求項17

ヒトGITRと結合する、請求項1から16のいずれか1項に記載の抗原結合タンパク質。

請求項18

a)10nM以下のKDで、配列番号1のヒトGITRポリペプチドと結合する、b)500nM以下のKDで、配列番号2のカニクイザルGITRポリペプチドと結合するの1または複数の特性を有する、請求項1から17のいずれか1項に記載の抗原結合タンパク質。

請求項19

ヒトGITRを刺激する、IgG1型の完全ヒトモノクローナル抗体である、請求項1から18のいずれか1項に記載の抗原結合タンパク質。

請求項20

10nM以下のKDで、配列番号1のヒトGITRと結合し、500nM以下のKDで、配列番号2のカニクイザルGITRと結合する、請求項1から19のいずれか1項に記載の抗原結合タンパク質。

請求項21

a)請求項1から20のいずれか1項に記載の抗原結合タンパク質のVL、VH若しくはそれらの両方、またはb)請求項1から20のいずれか1項に記載の抗原結合タンパク質のLC若しくはHCまたはそれらの両方をコードする核酸

請求項22

a)VL核酸及びVH核酸がそれぞれ、表4に指定されるAb1からAb59の群より選択されるいずれかの単一の抗体に対して示されるVLヌクレオチド配列及びVHヌクレオチド配列を含み、b)LC核酸またはHC核酸がそれぞれ、表4に指定されるAb1からAb59の群より選択されるいずれかの単一の抗体に対して示されるLCヌクレオチド配列及びHCヌクレオチド配列を含む請求項21に記載の核酸。

請求項23

請求項21または22に記載の核酸を含むベクター

請求項24

請求項21若しくは22に記載の核酸または請求項23に記載のベクターを含む細胞

請求項25

請求項1から20のいずれか1項に記載の抗原結合タンパク質の製造方法であって、前記抗原結合タンパク質の発現を可能にする条件下で請求項24に記載の細胞を培養すること、及び、任意選択で、培養物から抗原結合タンパク質を単離することを含む、製造方法。

請求項26

少なくとも1種の請求項1から20のいずれか1項に記載の抗原結合タンパク質及び薬学的に許容される担体または希釈剤を含む医薬組成物

請求項27

免疫賦活剤抗血管新生剤、及び化学療法剤からなる群より選択される付加的な活性成分を更に含む、請求項26に記載の医薬組成物。

請求項28

治療に用いるための、請求項1から20のいずれか1項に記載の抗原結合タンパク質または請求項26若しくは27に記載の医薬組成物。

請求項29

対象における免疫反応の誘発または向上方法に用いるための、請求項1から20のいずれか1項に記載の抗原結合タンパク質、または請求項26若しくは27に記載の医薬組成物であって、前記方法が、前記抗原結合タンパク質を前記対象に投与することを含む、抗原結合タンパク質または医薬組成物。

請求項30

対象における免疫反応の誘発または向上方法であって、前記免疫反応を誘発するまたは向上させるために有効な量で、請求項1から20のいずれか1項に記載の抗原結合タンパク質または請求項26若しくは27に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、方法。

請求項31

免疫反応が腫瘍抗原に向けて生起される、請求項30に記載の方法。

請求項32

免疫反応が感染因子に向けて生起される、請求項30に記載の方法。

請求項33

対象において、a)エフェクタT細胞の活性の制御性T細胞による抑制を低減すること、b)循環制御性T細胞のレベルを低下させること、c)エフェクタT細胞の活性化、d)エフェクタT細胞増殖を誘発するまたは向上させること、e)腫瘍成長を阻害すること、及びf)腫瘍退縮を誘発することの1または複数を達成するために十分な量で、抗原結合タンパク質が投与される、請求項30から32のいずれか1項に記載の方法。

請求項34

がんを有する対象におけるがんの治療方法であって、有効量の請求項1から20のいずれか1項に記載の抗原結合タンパク質または請求項26若しくは27に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、治療方法。

請求項35

がんが固形がんである、請求項34の治療方法。

請求項36

がんが血液がんである、請求項34の治療方法。

請求項37

がんが、黒色腫肺がん頭頚部がん、腎細胞がん、または結腸直腸がんである、請求項34の治療方法。

請求項38

がんが、非小細胞性肺がん、頭頚部扁平上皮がんまたは膀胱がんである、請求項34の治療方法。

請求項39

がんを有する対象における転移阻害方法であって、有効量の請求項1から20のいずれか1項に記載の抗原結合タンパク質または請求項26若しくは27に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、治療方法。

請求項40

a)化学療法を施すこと、b)放射線療法を施すこと、及び/またはc)1種または複数種の付加的な治療薬を投与することの1または複数を更に含む、請求項30から39のいずれか1項に記載の方法。

請求項41

付加的な治療薬が免疫賦活剤である、請求項40に記載の方法。

請求項42

免疫賦活剤が、T−VEC、PD1アンタゴニスト、PDL1アンタゴニスト、CTLA−4アンタゴニスト及びBiTEからなる群より選択される、請求項41に記載の方法。

請求項43

抗原結合タンパク質の前に、それと同時にまたはその後に、化学療法、放射線療法が施され、または治療薬が投与される、請求項40に記載の方法。

請求項44

感染症を有する対象の治療方法であって、請求項1から20のいずれか1項に記載の抗原結合タンパク質、または請求項26若しくは27に記載の医薬組成物を、前記感染症を治療するために有効な量で投与することを含む、治療方法。

背景技術

0001

グルココルチコイド誘導性TNFR関連遺伝子(GITR:TNFRSF18)は、活性誘発性TNFR科メンバーAITR)と称されることもある、TNF受容体スーパーファミリー(TNFRSF)に属する受容体である。GITRはその同族リガンドであるGITRリガンド(CITRL、TNFSF18)により活性化される。GITRは、システイン富む細胞外ドメインを含むI型膜貫通タンパク質であり、該細胞外ドメインはTNFR科メンバーの特徴である。例えば、GITRの細胞質ドメインは、4−1BB及びCD27などの、特定の他のTNFR科メンバーと近接した相同性共有する(Nocentiniら(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.94:6216〜6221)。

0002

ヒトGITRは、休止期レスポンダ細胞において低レベル発現し、CD4+細胞はCD8+細胞に比較して大きな発現を示す。GITRの発現は、T細胞の活性化後数日間顕著に上方制御される。GITRは、CD4+CD25+細胞またはCD8+CD25+細胞などの制御性T細胞(Treg)において高いレベルで構成的に発現し、これらの細胞が活性化されると更に上方制御される(Nocentini及びRiccardi(2005)E.J.Immunol.35:1016〜1022)。但し、GITRの発現はT細胞のみに限定されるものではない。報告によれば、GITRは、NK細胞マクロファージB細胞樹状細胞肥満細胞及び単球上で発現することも示されている(Nocentini及びRiccardi(2005)E.J.Immunol.35:1016〜1022)。

0003

GITRLは、殆どのTNFリガンド科メンバーに関して典型的である通り、II型膜貫通タンパク質である。現在の研究では、ヒトGITRLは、単量体として存在する、または他の多量体の形態に会合する場合もあるが、一般的には三量体として存在することが示されている(Chattopadhyayら(2007)Proc.Natl.Acad.Sci.104:19452〜19457、Zhouら(2008)Proc.Natl.Acad.Sci.105:635〜640)。可溶性の形態のGITRLも産生されていることを示唆する一部の証左がある(Baltzら(2008)Blood 112:3735〜3743、Maheshら(2006)Eur.J.Immunol.36:2128〜2138)。GITRLは主として、マクロファージ、B細胞、樹状細胞及び抗原提示細胞APC)として機能することができる内皮細胞を始めとするAPC上で発現する(Nocentini及びRiccardi(2005)E.J.Immunol.35:1016〜1022、Agostiniら(2005)Infect.Immun.73:7502〜7508、並びにNocentiniら(2007)E.J.Immunol.37:1165〜1169)。

0004

APC上のGITRLがレスポンダT細胞上のGITRに結合することが、GITRシグナル伝達をトリガーし、該シグナル伝達がレスポンダT細胞を同時刺激し、Treg細胞抑制作用阻害する。GITRシグナル伝達は、CD4+ナイーブT細胞及びCD8+ナイーブT細胞の両者に対して同時活性化するシグナルとして機能し、それによって、特にT細胞受容体(TCR)刺激が不十分である場合に、増殖及びエフェクタ機能を誘発するまたは向上させる(Schaerら(2012)Curr.Opin.Immunol.24:217〜224)。より詳細には、GITRは、エフェクタT細胞が阻害に対してより耐性となるような、エフェクタT細胞の同時刺激及び活性化、制御性T細胞の阻害、制御性T細胞による抑制に対するエフェクタT細胞の感受性の低減、並びに循環における制御性T細胞の一部の除去を始めとする、エフェクタT細胞及び制御性T細胞に対するいくつかの効果を奏することができる(Nocentiniら(2007)Eur.J.Immunol.37:1165〜1169)。

0005

まとめると、上述の活性、特にレスポンダT細胞の同時刺激及び制御性T細胞の抑制因子活性の抑止は、GITRの活性化が免疫反応の向上に繋がることを意味する。かかる活性化は、感染症及び腫瘍に対する免疫反応を回復する可能性を有する。従って、GITRを活性化する能力を有する分子は、免疫反応の向上をトリガーすることが望ましい状況において、免疫賦活剤としての価値があることとなる。

先行技術

0006

Nocentiniら(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.94:6216〜6221
Nocentini及びRiccardi(2005)E.J.Immunol.35:1016〜1022
Chattopadhyayら(2007)Proc.Natl.Acad.Sci.104:19452〜19457
Zhouら(2008)Proc.Natl.Acad.Sci.105:635〜640
Baltzら(2008)Blood 112:3735〜3743
Maheshら(2006)Eur.J.Immunol.36:2128〜2138
Agostiniら(2005)Infect.Immun.73:7502〜7508
Nocentiniら(2007)E.J.Immunol.37:1165〜1169
Schaerら(2012)Curr.Opin.Immunol.24:217〜224

0007

本明細書には、ヒトGITRなどのGITRに結合する抗原結合タンパク質が記載される。この抗原結合タンパク質は抗体またはそのフラグメントであってもよく、または、1若しくは複数の相補性決定領域が埋め込まれた若しくは挿入された他のタイプの分子スカフォールド、但し、当該分子はヒトGITRなどのGITRに結合する能力を有するとの条件である、であってもよい。抗原結合タンパク質はGITRのアゴニストであり、従って、GITRシグナル伝達を誘発するまたは向上させることができる。GITRが、免疫反応を刺激することにおいて役割を果たすとの前提で、抗原結合タンパク質は、免疫反応を高めることが望ましい様々なGITR関連疾患または障害治療において有用性を有する。例えば、抗原結合タンパク質は、種々のがんまたは感染症の治療などの、様々な免疫療法用途において用いることができる。

0008

第1の実施形態において、
a)それぞれ重鎖可変ドメイン(VH)及び軽鎖可変ドメイン(VL)のCDRH3及びCDRL3であって、VH及びVLが、抗原結合タンパク質Ab1からAb59のいずれか1種より選択される同一の抗原結合タンパク質の一部であるCDRH3及びCDRL3、
b)CDRH1、CDRH2及びCDRH3を含む変異VHであって、CDRH1、CDRH2及びCDRH3の1または複数が、Ab1からAb59の群より選択されるいずれかの単一の抗原結合タンパク質のVHの、対応するCDRH1、CDRH2及びCDRH3と比較して配列が異なり、但し、変異VHのCDRH1、CDRH2及びCDRH3の、VH配列の対応するCDRと比較した場合の配列の違いは、全体の合計で1、2、3、4または5を超えないアミノ酸であるとの条件である、変異VH、
c)CDRL1、CDRL2及びCDRL3を含む変異VLであって、CDRL1、CDRL2及びCDRL3の1または複数が、Ab1からAb59の群より選択されるいずれかの単一の抗原結合タンパク質のVLの、対応するCDRL1、CDRL2及びCDRL3と比較して配列が異なり、但し、変異VLのCDRL1、CDRL2及びCDRL3の、VL配列の対応するCDRと比較した場合の配列の違いは、全体の合計で1、2、3、4または5を超えないアミノ酸であるとの条件である、変異VL、
d)b)の変異VH及びc)の変異であって、それぞれ変異VH及び変異VLのが、同一の抗原結合タンパク質のVH及びVLの変異体であるとの条件の、b)の変異VH及びc)の変異VL、
e)CDRH1、CDRH2及びCDRH3を含むVHであって、
CDRH1が配列X1YGMX2(配列番号436)を含み、X1はSまたはNであり、X2はHまたはYであり、
CDRH2が配列VIWYX1GSNKYYADSVX2G(配列番号437)を含み、X1はE、V、A、Pであり、X2はKまたはRであり、
CDRH3が配列GGX1LX2X3X4YYX5GMDV(配列番号438)を含み、X1はQ、L、E、またはRであり、X2はG、R、またはSであり、X3はK、Y、L、F、またはRであり、X4はYまたはDであり、X5はYまたはSである、
VH、
f)CDRL1、CDRL2及びCDRL3を含むVLであって、
CDRL1が配列RASQX1YIRNDLG(配列番号439)を含み、X1はGまたはVであり、
CDRL2が配列X1X2SX3LQS(配列番号440)を含み、X1はAまたはDであり、X2はAまたはTであり、X3はSまたはTであり、
CDRL3が配列X1QX2X3X4YPX5T(配列番号441)を含み、X1はLまたはQであり、X2はHまたはLであり、X3はNまたはHであり、X4はS、NまたはTであり、X5はW、LまたはIである、
VL、
g)e)のVH及びf)のVL、
h)それぞれ、Ab1からAb59の抗原結合タンパク質の同一のVH由来の、CDRH1、CDRH2及びCDRH3、
i)それぞれ、Ab1からAb59の抗原結合タンパク質の同一のVL由来の、CDRL1、CDRL2及びCDRL3、
j)VH及びVLが同一の抗原結合タンパク質由来である、h)のCDRH1、CDRH2及びCDRH3並びにi)のCDRH1、CDRH2及びCDRH3、
k)アミノ酸配列が、抗原結合タンパク質Ab1からAb59のいずれか1種のVHの配列と、少なくも80%、85%、90%、95%、97%または99%同一であるVH、
l)アミノ酸配列が、抗原結合タンパク質Ab1からAb59のいずれか1種のVLの配列と、少なくも80%、85%、90%、95%、97%または99%同一であるVL、
m)k)のVH及びl)のVLであって、VH及びVLが同一の抗原結合タンパク質由来である、k)のVH及びl)のVL、
n)抗原結合タンパク質Ab1からAb59のいずれか1種のVHのアミノ酸配列を含むVH、
o)抗原結合タンパク質Ab1からAb59のいずれか1種のVLのアミノ酸配列を含むVL、
p)n)のVH及びo)のVLであって、VH及びVLが同一の抗原結合タンパク質由来の、n)のVH及びo)のVL、
q)アミノ酸配列が、抗原結合タンパク質Ab1からAb59のいずれか1種の完全長重鎖(HC)の配列と、少なくも90%、95%、97%または99%同一である完全長重鎖、
r)アミノ酸配列が、抗原結合タンパク質Ab1からAb59のいずれか1種の完全長軽鎖(LC)の配列と、少なくも90%、95%、97%または99%同一である完全長軽鎖、
s)同一の抗原結合タンパク質由来である、q)の完全長重鎖及びr)の完全長軽鎖、
t)抗原結合タンパク質Ab1からAb59のいずれか1種の完全長重鎖のアミノ酸配列を含む完全長重鎖、
u)抗原結合タンパク質Ab1からAb59のいずれか1種の完全長軽鎖のアミノ酸配列を含む完全長軽鎖、または
v)同一の抗原結合タンパク質由来である、t)の完全長重鎖及びu)の完全長軽鎖
を含む抗原結合タンパク質が提供される。

0009

第2の実施形態において、抗原結合タンパク質は、CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2及びCDRH3を含み、ここで、CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2及びCDRH3の1または複数の配列は、Ab1からAb59の群より選択されるいずれかの単一の抗体の対応するCDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2及びCDRH3と比較して異なり、但し、CDRの配列の違いは、全体の合計で1、2、3、4または5を超えないアミノ酸であるとの条件である。

0010

第3の実施形態において、抗原結合タンパク質は、CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2及びCDRH3を含み、ここで、
a)CDRL1は配列番号5を含み、CDRL2は配列番号11を含み、CDRL3は配列番号19を含み、CDRH1は配列番号31を含み、CDRH2は配列番号36を含み、CDRH3は配列番号47を含むか、
b)CDRL1は配列番号5を含み、CDRL2は配列番号12を含み、CDRL3は配列番号18を含み、CDRH1は配列番号31を含み、CDRH2は配列番号40を含み、CDRH3は配列番号52を含むか、
c)CDRL1は配列番号10を含み、CDRL2は配列番号17を含み、CDRL3は配列番号28を含み、CDRH1は配列番号35を含み、CDRH2は配列番号45を含み、CDRH3は配列番号62を含むか、
d)CDRL1は配列番号5を含み、CDRL2は配列番号12を含み、CDRL3は配列番号29を含み、CDRH1は配列番号31を含み、CDRH2は配列番号37を含み、CDRH3は配列番号58を含むか、
e)CDRL1は配列番号5を含み、CDRL2は配列番号14を含み、CDRL3は配列番号30を含み、CDRH1は配列番号3を含み、CDRH2は配列番号36を含み、CDRH3は配列番号63を含むか、
f)CDRL1は配列番号10を含み、CDRL2は配列番号17を含み、CDRL3は配列番号28を含み、CDRH1は配列番号35を含み、CDRH2は配列番号45を含み、CDRH3は配列番号76を含むか、
g)CDRL1は配列番号5を含み、CDRL2は配列番号12を含み、CDRL3は配列番号29を含み、CDRH1は配列番号31を含み、CDRH2は配列番号37を含み、CDRH3は配列番号58を含むか、
h)CDRL1は配列番号5を含み、CDRL2は配列番号14を含み、CDRL3は配列番号30を含み、CDRH1は配列番号31を含み、CDRH2は配列番号71を含み、CDRH3は配列番号63を含むか、
i)CDRL1は配列番号5を含み、CDRL2は配列番号11を含み、CDRL3は配列番号19を含み、CDRH1は配列番号31を含み、CDRH2は配列番号71を含み、CDRH3は配列番号47を含むか、または
j)CDRL1は配列番号5を含み、CDRL2は配列番号12を含み、CDRL3は配列番号18を含み、CDRH1は配列番号31を含み、CDRH2は配列番号73を含み、CDRH3は配列番号52を含む。

0011

第4の実施形態において、抗原結合タンパク質は、VL及びVHを含み、ここで、
a)VLのアミノ酸配列は、配列番号119と、少なくとも80%、85%、90%、95%、97%または99%同一であり、VHのアミノ酸配列は、配列番号138と、少なくとも80%、85%、90%、95%、97%または99%同一であるか、
b)VLのアミノ酸配列は、配列番号124と、少なくとも80%、85%、90%、95%、97%または99%同一であり、VHのアミノ酸配列は、配列番号143と、少なくとも80%、85%、90%、95%、97%または99%同一であるか、
c)VLのアミノ酸配列は、配列番号134と、少なくとも80%、85%、90%、95%、97%または99%同一であり、VHのアミノ酸配列は、配列番号153と、少なくとも80%、85%、90%、95%、97%または99%同一であるか、
d)VLのアミノ酸配列は、配列番号135と、少なくとも80%、85%、90%、95%、97%または99%同一であり、VHのアミノ酸配列は、配列番号154と、少なくとも80%、85%、90%、95%、97%または99%同一であるか、
e)VLのアミノ酸配列は、配列番号136と、少なくとも80%、85%、90%、95%、97%または99%同一であり、VHのアミノ酸配列は、配列番号155と、少なくとも80%、85%、90%、95%、97%または99%同一であるか、
f)VLのアミノ酸配列は、配列番号242と、少なくとも80%、85%、90%、95%、97%または99%同一であり、VHのアミノ酸配列は、配列番号282と、少なくとも80%、85%、90%、95%、97%または99%同一であるか、
g)VLのアミノ酸配列は、配列番号255と、少なくとも80%、85%、90%、95%、97%または99%同一であり、VHのアミノ酸配列は、配列番号295と、少なくとも80%、85%、90%、95%、97%または99%同一であるか、
h)VLのアミノ酸配列は、配列番号262と、少なくとも80%、85%、90%、95%、97%または99%同一であり、VHのアミノ酸配列は、配列番号302と、少なくとも80%、85%、90%、95%、97%または99%同一であるか、
i)VLのアミノ酸配列は、配列番号267と、少なくとも80%、85%、90%、95%、97%または99%同一であり、VHのアミノ酸配列は、配列番号307と、少なくとも80%、85%、90%、95%、97%または99%同一であるか、あるいは
j)VLのアミノ酸配列は、配列番号272と、少なくとも80%、85%、90%、95%、97%または99%同一であり、VHのアミノ酸配列は、配列番号312と、少なくとも80%、85%、90%、95%、97%または99%同一である。

0012

第5の実施形態において、抗原結合タンパク質は、VL及びVHを含み、ここで、
a)VLは配列番号119を含み、VHは配列番号138を含む、
b)VLは配列番号124を含み、VHは配列番号143を含む、
c)VLは配列番号134を含み、VHは配列番号153を含む、
d)VLは配列番号135を含み、VHは配列番号154を含む、
e)VLは配列番号136を含み、VHは配列番号155を含む、
f)VLは配列番号242を含み、VHは配列番号282を含む、
g)VLは配列番号255を含み、VHは配列番号295を含む、
h)VLは配列番号262を含み、VHは配列番号302を含む、
i)VLは配列番号267を含み、VHは配列番号307を含む、
j)VLは配列番号272を含み、VHは配列番号312を含む。

0013

第6の実施形態において、抗原結合タンパク質は、LC及びHCを含み、ここで、
a)LCのアミノ酸配列は、配列番号317と、少なくとも90%、95%、97%または99%同一であり、HCのアミノ酸配列は、配列番号336と、少なくとも90%、95%、97%または99%同一である、
b)LCのアミノ酸配列は、配列番号322と、少なくとも90%、95%、97%または99%同一であり、HCのアミノ酸配列は、配列番号341と、少なくとも90%、95%、97%または99%同一である、
c)LCのアミノ酸配列は、配列番号332と、少なくとも90%、95%、97%または99%同一であり、HCのアミノ酸配列は、配列番号351と、少なくとも90%、95%、97%または99%同一である、
d)LCのアミノ酸配列は、配列番号333と、少なくとも90%、95%、97%または99%同一であり、HCのアミノ酸配列は、配列番号352と、少なくとも90%、95%、97%または99%同一である、
e)LCのアミノ酸配列は、配列番号334と、少なくとも90%、95%、97%または99%同一であり、HCのアミノ酸配列は、配列番号353と、少なくとも90%、95%、97%または99%同一である、
f)LCのアミノ酸配列は、配列番号360と、少なくとも90%、95%、97%または99%同一であり、HCのアミノ酸配列は、配列番号400と、少なくとも90%、95%、97%または99%同一である、
g)LCのアミノ酸配列は、配列番号373と、少なくとも90%、95%、97%または99%同一であり、HCのアミノ酸配列は、配列番号413と、少なくとも90%、95%、97%または99%同一である、
h)LCのアミノ酸配列は、配列番号380と、少なくとも90%、95%、97%または99%同一であり、HCのアミノ酸配列は、配列番号420と、少なくとも90%、95%、97%または99%同一である、
i)LCのアミノ酸配列は、配列番号385と、少なくとも90%、95%、97%または99%同一であり、HCのアミノ酸配列は、配列番号425と、少なくとも90%、95%、97%または99%同一である、
j)LCのアミノ酸配列は、配列番号390と、少なくとも90%、95%、97%または99%同一であり、HCのアミノ酸配列は、配列番号430と、少なくとも90%、95%、97%または99%同一である。

0014

第7の実施形態において、抗原結合タンパク質は、LC及びHCを含み、ここで、
a)LCは配列番号317を含み、HCは配列番号336を含む、
b)LCは配列番号322を含み、HCは配列番号341を含む、
c)LCは配列番号332を含み、HCは配列番号351を含む、
d)LCは配列番号333を含み、HCは配列番号352を含む、
e)LCは配列番号334を含み、HCは配列番号353を含む、
f)LCは配列番号360を含み、HCは配列番号400を含む、
g)LCは配列番号373を含み、HCは配列番号413を含む、
h)LCは配列番号380を含み、HCは配列番号420を含む、
i)LCは配列番号385を含み、HCは配列番号425を含む、
j)LCは配列番号390を含み、HCは配列番号430を含む。

0015

第8の実施形態において、抗原結合タンパク質は、ヒトGITRとの結合に関して、基準となる抗原結合タンパク質と競合し、ここで、基準となる抗原結合タンパク質は第5の実施形態に関して記載の抗原結合タンパク質である。

0016

第9の実施形態において、第8の実施形態の抗原結合タンパク質と基準となる抗体とは、ヒトGITRとの結合に関して交差競合する。

0017

第10の実施形態において、実施形態1〜9のいずれか1の抗原結合タンパク質は、
a)モノクローナル抗体である、
b)ヒト抗体ヒト化抗体、またはキメラ抗体である、
c)多重特異性抗体である、
d)IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4型である、
e)抗原結合抗体フラグメントである、
f)Fabフラグメント、Fab’フラグメント、F(ab’)2フラグメント、またはFvフラグメントである、
g)二特異性抗体、一本鎖抗体ドメイン抗体、またはナノボディーである、
h)標識されている
の1または複数の特性を有する。

0018

第11の実施形態において、実施形態1〜10のいずれか1の抗原結合タンパク質は、完全ヒト抗体である。

0019

第12の実施形態において、実施形態1〜11のいずれか1の抗原結合タンパク質は、ヒトGITRの活性を刺激する。

0020

第13の実施形態において、実施形態1〜12いずれか1の抗原結合タンパク質は、
a)GITRとの結合に関して、GITRLと交差競合する、
b)ヒトCD4細胞中内部移行可能である、
c)制御性T細胞の抑制を阻害する、
d)制御性T細胞の循環を低下させる、
e)エフェクタT細胞を活性化する、
f)ヒト血清中で、少なくとも6日、7日、9日または12日の半減期を有する
の1または複数の活性を有する。

0021

第14の実施形態において、実施形態1〜13いずれか1の抗原結合タンパク質は、完全ヒトIgG1抗体である。

0022

第15の実施形態において、実施形態1〜14いずれか1の抗原結合タンパク質は、Fcγ受容体(FcγR)と結合する能力を有する。

0023

第16の実施形態において、実施形態1〜15いずれか1の抗原結合タンパク質は、抗原結合タンパク質のクラスタが形成されるように、Fcγ受容体(FcγR)と結合する能力を有する。

0024

第17の実施形態において、実施形態1〜16いずれか1の抗原結合タンパク質は、ヒトGITR(例えば、配列番号1)と結合する。

0025

第18の実施形態において、実施形態1〜17いずれか1の抗原結合タンパク質は、
a)10nM以下のKDで、配列番号1のヒトGITRポリペプチドと結合する、
b)500nM以下のKDで、配列番号2のカニクイザルGITRポリペプチドと結合する
の1または複数の特性を有する。

0026

第19の実施形態において、実施形態1〜18いずれか1の抗原結合タンパク質は、ヒトGITRを刺激する、IgG1型の完全ヒトモノクローナル抗体である。

0027

第20の実施形態において、実施形態1〜19いずれか1の抗原結合タンパク質は、10nM以下のKDで、配列番号1のヒトGITRと結合し、500nM以下のKDで、配列番号2のカニクイザルGITRと結合する。

0028

第21の実施形態において、実施形態1〜20いずれか1の抗原結合タンパク質はグリコシル化されている。

0029

第22の実施形態において、
a)実施形態1〜20のいずれか1の抗原結合タンパク質のVL、VH若しくはそれらの両方、または
b)実施形態1〜20のいずれか1の抗原結合タンパク質のLC若しくHCまたはそれらの両方
をコードする核酸が提供される。

0030

第23の実施形態において、核酸は、
a)Ab1からAb59の群より選択されるいずれかの単一の抗体に対して示されるVLヌクレオチド配列及び/またはVHヌクレオチド配列、
b)Ab1からAb59の群より選択されるいずれかの単一の抗体に対して示されるLCヌクレオチド配列及び/またはHCヌクレオチド配列
を含む。

0031

第24の実施形態において、実施形態22または23の核酸を含むベクターが提供される。

0032

第25の実施形態において、実施形態22若しくは23の核酸または実施形態24のベクターを含む細胞が提供される。

0033

第26の実施形態において、実施形態1〜21のいずれか1の抗原結合タンパク質の製造方法であって、抗原結合タンパク質の発現を可能にする条件下で実施形態25の細胞を培養すること、及び、任意選択で、抗原結合タンパク質を培養物より単離することを含む製造方法が提供される。

0034

第27の実施形態において、少なくとも1種の実施形態1〜21のいずれか1の抗原結合タンパク質及び薬学的に許容される担体または希釈剤を含む医薬組成物が提供される。

0035

第28の実施形態において、実施形態27の医薬組成物は、免疫賦活剤、抗血管新生剤、及び化学療法剤からなる群より選択される付加的な活性成分を更に含む。

0036

第29の実施形態において、実施形態1〜21のいずれか1の抗原結合タンパク質または実施形態27若しくは28の医薬組成物は、治療に用いるためのものである。

0037

第30の実施形態において、実施形態1〜21のいずれか1の抗原結合タンパク質、または実施形態27若しくは28の医薬組成物は、対象における免疫反応の誘発または向上方法であって、抗原結合タンパク質を対象に投与することを含む方法に用いるためのものである。

0038

第31の実施形態において、対象における免疫反応の誘発または向上方法であって、免疫反応を誘発するまたは向上させるために有効な量で、実施形態1〜21のいずれか1の抗原結合タンパク質または実施形態27若しくは28の医薬組成物を対象に投与することを含む、方法が提供される。

0039

第32の実施形態において、実施形態31の方法は、腫瘍抗原に向けた免疫反応を生起させることを含む。

0040

第33の実施形態において、実施形態31の方法は、感染因子に向けた免疫反応を生起させることを含む。

0041

第34の実施形態において、実施形態31〜33のいずれか1の方法は、対象において、
a)エフェクタT細胞の活性の制御性T細胞による抑制を低減すること、
b)循環制御性T細胞のレベルを低下させること、
c)エフェクタT細胞の活性化、
d)エフェクタT細胞増殖を誘発するまたは向上させること、
e)腫瘍の成長を阻害すること、及び
f)腫瘍退縮を誘発すること
の1または複数を達成するために十分な量で、抗原結合タンパク質を投与することを含む。

0042

第35の実施形態において、がんを有する対象におけるがんの治療方法であって、有効量の実施形態1〜21のいずれか1の抗原結合タンパク質または実施形態27若しくは28に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、治療方法が提供される。

0043

第36の実施形態において、実施形態35の治療方法は、固形がんを治療するためのものである。

0044

第37の実施形態において、実施形態35の治療方法は、血液がんを治療するためのものである。

0045

第38の実施形態において、実施形態35の治療方法は、メラノーマ肺がん頭頚部がん、腎細胞がん、または結腸直腸がんを治療するためのものである。

0046

第39の実施形態において、がんを有する対象における転移阻害方法が提供され、該方法は、有効量の実施形態1〜21のいずれか1の抗原結合タンパク質または実施形態27若しくは28の医薬組成物を対象に投与することを含む。

0047

第40の実施形態において、実施形態31〜39のいずれか1の方法は、
a)化学療法を施すこと、
b)放射線療法を施すこと、
c)1種または複数種の付加的な治療薬を投与すること
の1または複数を更に含む。

0048

第41の実施形態において、方法は実施形態40に関して記載された通りであり、付加的な治療薬は免疫賦活剤である。

0049

第42の実施形態において、方法は実施形態41に関して記載された通りであり、免疫賦活剤は、T−VEC、PD1アンタゴニスト、PDL1アンタゴニスト、CTLA−4アンタゴニスト及びBiTEからなる群より選択される。

0050

第43の実施形態において、方法は実施形態40に関して記載された通りであり、抗原結合タンパク質の前に、それと同時にまたはその後に、化学療法、放射線療法が施され、または治療薬が投与される。

0051

第44の実施形態において、感染症を有する対象の治療方法であって、実施形態1〜21のいずれか1の抗原結合タンパク質、または実施形態27若しくは28の医薬組成物を、感染症を治療するために有効な量で投与することを含む、治療方法が提供される。

図面の簡単な説明

0052

全体で、本明細書において提供されるものなどのGITR抗体が、2種の別個のT細胞亜集団、すなわち、CD4+CD25+T細胞及びCD8+CD25+T細胞との結合に関して、ヒトGITRLと交差競合することを示す結合プロットである。特に、図1A及び1Bにまとめた結果は、本明細書において提供されるものなどのGITR抗体が、GITRLのこれらの2種のT細胞亜集団との結合を遮断することを示す。この部分の実験においては、然るべく活性化したT細胞集団を、種々のモル濃度のGITR抗体(9H6、5H7、41G5)と共に10分間インキュベートし、その後、4mMのHisタグ付きヒトGITRLを添加し、この混合物を更に4℃で30分間インキュベートした。次いで細胞を洗浄し、続いて結合したGITRLを検知するための蛍光タグ付き抗His抗体と共にインキュベートした。フローサイトメトリーにより、結合したGITRLのMFI(平均蛍光強度)を測定した。図1A及び1Bは、2種の別個の細胞集団に関する、GITR抗体:GITRLモル濃度比関数としてのMFIのプロットである。図1C及び1Dは、逆実験の結果を示すプロットであり、GITRLが抗GITR抗体の2種のT細胞亜集団との結合を遮断することができることを示す。これらの試験においては、最初に種々の濃度の、GITR抗体ではなくGITRLを、然るべく活性化したT細胞集団と共にインキュベートした。続いてGITR抗体(4mMの9H6、5H7、41G5)を添加し、得られた混合物を4Cで30分間インキュベートした。蛍光標識抗ヒトFcと共にインキュベートすることによって、結合したGITR抗体を検知した。結合はフローサイトメトリー分析によって測定した。図1C及び1Dは、2種の別個の細胞集団に関する、GITRL:GITR抗体モル濃度比の関数としてのMFIのプロットである。
全体で、本明細書において提供されるものなどのGITR抗体が、2種の別個のT細胞亜集団、すなわち、CD4+CD25+T細胞及びCD8+CD25+T細胞との結合に関して、ヒトGITRLと交差競合することを示す結合プロットである。特に、図1A及び1Bにまとめた結果は、本明細書において提供されるものなどのGITR抗体が、GITRLのこれらの2種のT細胞亜集団との結合を遮断することを示す。この部分の実験においては、然るべく活性化したT細胞集団を、種々のモル濃度のGITR抗体(9H6、5H7、41G5)と共に10分間インキュベートし、その後、4mMのHisタグ付きヒトGITRLを添加し、この混合物を更に4℃で30分間インキュベートした。次いで細胞を洗浄し、続いて結合したGITRLを検知するための蛍光タグ付き抗His抗体と共にインキュベートした。フローサイトメトリーにより、結合したGITRLのMFI(平均蛍光強度)を測定した。図1A及び1Bは、2種の別個の細胞集団に関する、GITR抗体:GITRLモル濃度比の関数としてのMFIのプロットである。図1C及び1Dは、逆実験の結果を示すプロットであり、GITRLが抗GITR抗体の2種のT細胞亜集団との結合を遮断することができることを示す。これらの試験においては、最初に種々の濃度の、GITR抗体ではなくGITRLを、然るべく活性化したT細胞集団と共にインキュベートした。続いてGITR抗体(4mMの9H6、5H7、41G5)を添加し、得られた混合物を4Cで30分間インキュベートした。蛍光標識抗ヒトFcと共にインキュベートすることによって、結合したGITR抗体を検知した。結合はフローサイトメトリー分析によって測定した。図1C及び1Dは、2種の別個の細胞集団に関する、GITRL:GITR抗体モル濃度比の関数としてのMFIのプロットである。
全体で、本明細書において提供されるものなどのGITR抗体が、2種の別個のT細胞亜集団、すなわち、CD4+CD25+T細胞及びCD8+CD25+T細胞との結合に関して、ヒトGITRLと交差競合することを示す結合プロットである。特に、図1A及び1Bにまとめた結果は、本明細書において提供されるものなどのGITR抗体が、GITRLのこれらの2種のT細胞亜集団との結合を遮断することを示す。この部分の実験においては、然るべく活性化したT細胞集団を、種々のモル濃度のGITR抗体(9H6、5H7、41G5)と共に10分間インキュベートし、その後、4mMのHisタグ付きヒトGITRLを添加し、この混合物を更に4℃で30分間インキュベートした。次いで細胞を洗浄し、続いて結合したGITRLを検知するための蛍光タグ付き抗His抗体と共にインキュベートした。フローサイトメトリーにより、結合したGITRLのMFI(平均蛍光強度)を測定した。図1A及び1Bは、2種の別個の細胞集団に関する、GITR抗体:GITRLモル濃度比の関数としてのMFIのプロットである。図1C及び1Dは、逆実験の結果を示すプロットであり、GITRLが抗GITR抗体の2種のT細胞亜集団との結合を遮断することができることを示す。これらの試験においては、最初に種々の濃度の、GITR抗体ではなくGITRLを、然るべく活性化したT細胞集団と共にインキュベートした。続いてGITR抗体(4mMの9H6、5H7、41G5)を添加し、得られた混合物を4Cで30分間インキュベートした。蛍光標識抗ヒトFcと共にインキュベートすることによって、結合したGITR抗体を検知した。結合はフローサイトメトリー分析によって測定した。図1C及び1Dは、2種の別個の細胞集団に関する、GITRL:GITR抗体モル濃度比の関数としてのMFIのプロットである。
全体で、本明細書において提供されるものなどのGITR抗体が、2種の別個のT細胞亜集団、すなわち、CD4+CD25+T細胞及びCD8+CD25+T細胞との結合に関して、ヒトGITRLと交差競合することを示す結合プロットである。特に、図1A及び1Bにまとめた結果は、本明細書において提供されるものなどのGITR抗体が、GITRLのこれらの2種のT細胞亜集団との結合を遮断することを示す。この部分の実験においては、然るべく活性化したT細胞集団を、種々のモル濃度のGITR抗体(9H6、5H7、41G5)と共に10分間インキュベートし、その後、4mMのHisタグ付きヒトGITRLを添加し、この混合物を更に4℃で30分間インキュベートした。次いで細胞を洗浄し、続いて結合したGITRLを検知するための蛍光タグ付き抗His抗体と共にインキュベートした。フローサイトメトリーにより、結合したGITRLのMFI(平均蛍光強度)を測定した。図1A及び1Bは、2種の別個の細胞集団に関する、GITR抗体:GITRLモル濃度比の関数としてのMFIのプロットである。図1C及び1Dは、逆実験の結果を示すプロットであり、GITRLが抗GITR抗体の2種のT細胞亜集団との結合を遮断することができることを示す。これらの試験においては、最初に種々の濃度の、GITR抗体ではなくGITRLを、然るべく活性化したT細胞集団と共にインキュベートした。続いてGITR抗体(4mMの9H6、5H7、41G5)を添加し、得られた混合物を4Cで30分間インキュベートした。蛍光標識抗ヒトFcと共にインキュベートすることによって、結合したGITR抗体を検知した。結合はフローサイトメトリー分析によって測定した。図1C及び1Dは、2種の別個の細胞集団に関する、GITRL:GITR抗体モル濃度比の関数としてのMFIのプロットである。
本明細書に記載のものなどのGITR抗体が、制御性T細胞(Treg)によるエフェクタT細胞の抑制を低減できることを図解するグラフである。この実験においては、Treg細胞及びTレスポンダを、等しい数のT細胞活性ビーズと共に、及び種々の濃度の、代表的なGITR抗体で被覆したビーズと共に、5日間インキュベートした。培養の最後の16時間の間に細胞を1μCiの3Hでパルスし、細胞を採取し、カウントを測定した。このプロットは、GITR抗体被覆ビーズ:細胞比の関数としてのカウント数である。
本明細書に開示のもの(9H6v3、5H7v2、41G5v2)などの数種のGITR抗体が、ヒト化NSGマウスモデル(非担腫瘍)における循環制御性T細胞の数の減少を生じさせることを測定した実験の結果の概要を示す図である。この実験においては、NSGマウスにCD34+胎性肝細胞移植することによって、該マウスにヒトCD4+及びCD8+エフェクタT細胞並びに制御性T細胞の産生を誘発させた。25mg/kgのGITR抗体の単回腹腔内投与量をマウスに注射し、制御性T細胞マーカーFoxP3を発現する循環ヒトCD4+T細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーによって測定した。
2種の別個の形態のFcγ受容体(FcγR)が、本明細書において提供されるものなどのGITR抗体のクラスタ形成を生じさせることができることを示すグラフである。図4Aの結果は、増殖アッセイにおいて、FcγRIIaが、代表的なGITR抗体(5H7、9H6、7A10及び41G5)をクラスタ形成させて、一次ヒトT細胞を活性化させることができることを示す。図4Bは、FcγRIIIaが同様なクラスタ化活性を有することを示す。各実験において、種々の濃度のGITR抗体またはヒトIgG1アイソタイプコントロールを、Fcγ受容体の1種を発現するように遺伝子操作した、一次ヒトCD4+T細胞及び293T細胞の共培養に添加した。少数のCD3被覆したビーズを添加して、最適未満のTCR刺激を与えた。細胞を96時間インキュベートし、培養の最後の18時間の間に1μCiの3Hでパルスし、抗体によって誘発される細胞増殖の量を測定した。これらのグラフは、抗体濃度の関数としての3Hのカウントのプロットであり、1種3ウェル平均値±標準偏差を表わし、5のヒトドナー由来の5つの実験を代表したものである。
2種の別個の形態のFcγ受容体(FcγR)が、本明細書において提供されるものなどのGITR抗体のクラスタ形成を生じさせることができることを示すグラフである。図4Aの結果は、増殖アッセイにおいて、FcγRIIaが、代表的なGITR抗体(5H7、9H6、7A10及び41G5)をクラスタ形成させて、一次ヒトT細胞を活性化させることができることを示す。図4Bは、FcγRIIIaが同様なクラスタ化活性を有することを示す。各実験において、種々の濃度のGITR抗体またはヒトIgG1アイソタイプコントロールを、Fcγ受容体の1種を発現するように遺伝子操作した、一次ヒトCD4+T細胞及び293T細胞の共培養に添加した。少数のCD3被覆したビーズを添加して、最適未満のTCR刺激を与えた。細胞を96時間インキュベートし、培養の最後の18時間の間に1μCiの3Hでパルスし、抗体によって誘発される細胞増殖の量を測定した。これらのグラフは、抗体濃度の関数としての3Hのカウントのプロットであり、1種3ウェルの平均値±標準偏差を表わし、5のヒトドナー由来の5つの実験を代表したものである。
本明細書に開示のものなどの特定のGITR抗体が、4種の別個のヒトT細胞亜集団に、差示的に結合することを実証する実験の結果の概要を示す図である。特に、これらの結果は、本明細書に記載の3種の抗体(5H7、9H6及び41G5)が、1)CD4+CD25+T細胞と結合する一方でCD4+CD25−T細胞とは結合しないこと(図5A及び5B)、及び2)CD8+CD25+T細胞と結合する一方でCD8+CD25−T細胞とは結合しないこと(図5C及び5D)を示す。これらの結果は、別な公知のGITR抗体に対して得られた結果と対照をなし、該別なGITR抗体は、1)同様にCD4+CD25+T細胞と結合する一方でCD4+CD25−T細胞とは結合しないが、2)5H7、9H6及び41G5とは異なって、CD8+CD25+T細胞及びCD8+CD25−T細胞の両方と結合することができる。各グラフにおいて、平均蛍光強度(MFI)が抗体濃度(nM)に対してプロットされる。実験の詳細は実施例12に記載される。
本明細書に開示のものなどの特定のGITR抗体が、4種の別個のヒトT細胞亜集団に、差示的に結合することを実証する実験の結果の概要を示す図である。特に、これらの結果は、本明細書に記載の3種の抗体(5H7、9H6及び41G5)が、1)CD4+CD25+T細胞と結合する一方でCD4+CD25−T細胞とは結合しないこと(図5A及び5B)、及び2)CD8+CD25+T細胞と結合する一方でCD8+CD25−T細胞とは結合しないこと(図5C及び5D)を示す。これらの結果は、別な公知のGITR抗体に対して得られた結果と対照をなし、該別なGITR抗体は、1)同様にCD4+CD25+T細胞と結合する一方でCD4+CD25−T細胞とは結合しないが、2)5H7、9H6及び41G5とは異なって、CD8+CD25+T細胞及びCD8+CD25−T細胞の両方と結合することができる。各グラフにおいて、平均蛍光強度(MFI)が抗体濃度(nM)に対してプロットされる。実験の詳細は実施例12に記載される。
本明細書に開示のものなどの特定のGITR抗体が、4種の別個のヒトT細胞亜集団に、差示的に結合することを実証する実験の結果の概要を示す図である。特に、これらの結果は、本明細書に記載の3種の抗体(5H7、9H6及び41G5)が、1)CD4+CD25+T細胞と結合する一方でCD4+CD25−T細胞とは結合しないこと(図5A及び5B)、及び2)CD8+CD25+T細胞と結合する一方でCD8+CD25−T細胞とは結合しないこと(図5C及び5D)を示す。これらの結果は、別な公知のGITR抗体に対して得られた結果と対照をなし、該別なGITR抗体は、1)同様にCD4+CD25+T細胞と結合する一方でCD4+CD25−T細胞とは結合しないが、2)5H7、9H6及び41G5とは異なって、CD8+CD25+T細胞及びCD8+CD25−T細胞の両方と結合することができる。各グラフにおいて、平均蛍光強度(MFI)が抗体濃度(nM)に対してプロットされる。実験の詳細は実施例12に記載される。
本明細書に開示のものなどの特定のGITR抗体が、4種の別個のヒトT細胞亜集団に、差示的に結合することを実証する実験の結果の概要を示す図である。特に、これらの結果は、本明細書に記載の3種の抗体(5H7、9H6及び41G5)が、1)CD4+CD25+T細胞と結合する一方でCD4+CD25−T細胞とは結合しないこと(図5A及び5B)、及び2)CD8+CD25+T細胞と結合する一方でCD8+CD25−T細胞とは結合しないこと(図5C及び5D)を示す。これらの結果は、別な公知のGITR抗体に対して得られた結果と対照をなし、該別なGITR抗体は、1)同様にCD4+CD25+T細胞と結合する一方でCD4+CD25−T細胞とは結合しないが、2)5H7、9H6及び41G5とは異なって、CD8+CD25+T細胞及びCD8+CD25−T細胞の両方と結合することができる。各グラフにおいて、平均蛍光強度(MFI)が抗体濃度(nM)に対してプロットされる。実験の詳細は実施例12に記載される。
GITR抗体ではなくGITRLを用いて実験が行われたこと以外は、図5A〜5Dに関して記載した実験と類似の実験の結果を示すグラフである。この結果は、GITRLが、抗体5H7、9H6及び41G5と同様に、1)CD4+CD25+T細胞と結合する一方でCD4+CD25−T細胞とは結合しないこと、及び2)CD8+CD25+T細胞と結合する一方でCD8+CD25−T細胞とは結合しないことを示す。従って、5H7、9H6及び41G5について観測された結合の選択性は、天然のリガンドについて観測されたものと類似する。
本明細書において提供されるもの(9H6、5H7及び41G5)などの抗体が、一次ヒトCD4+細胞中に内部移行することを示すプロットである。対照的に、別な公知の抗体は、有意に低位の内部移行を示す。この実験において、CD4+細胞をウェル中に載置し、次いでAlexa−488またはAlexa−647で標識した抗体と共に30分間インキュベートした。洗浄後に、細胞を37℃、5%CO2中で種々の時間インキュベートし、その後、当該細胞を採取し、2のウェル中に均等に分割した。一方のウェルを0.2Mの酢酸を含有する溶液と共にインキュベートした一方、もう一方のウェルの細胞を完全培地中でインキュベートした。これらのインキュベーションに続いて、当該細胞を洗浄し、次いで、染色緩衝液中で30分間、抗ヒトCD25APCまたは抗ヒトCD25 PEのいずれかで染色した。細胞を洗浄し、2%のパラホルムアルデヒド固定化し、次いでフローサイトメトリーによって分析した。
本明細書において提供される親抗体の軽鎖の可変ドメイン(VL)のアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。CDR(CDR1、CDR2及びCDR3)並びにフレームワーク領域(FR1、FR2、FR3及びFR4)が示される。全配列は2の図にまたがり、FR1、CDR1、FR2及びCDR2が図8A上に含まれ、FR3、CDR3及びFR4領域が図8B上に広がる。CDRはカバットにより規定される。アラインメントナンバリングAHoナンバリング変換に従って規定される場合、横線は単にナンバリングにおける違いを説明する(例えば、Honegger,A.及びPluckthun,A.(2001)J.Mol.Biol.309:657〜670を参照のこと)。
本明細書において提供される親抗体の軽鎖の可変ドメイン(VL)のアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。CDR(CDR1、CDR2及びCDR3)並びにフレームワーク領域(FR1、FR2、FR3及びFR4)が示される。全配列は2の図にまたがり、FR1、CDR1、FR2及びCDR2が図8A上に含まれ、FR3、CDR3及びFR4領域が図8B上に広がる。CDRはカバットにより規定される。アラインメントナンバリングがAHoナンバリング変換に従って規定される場合、横線は単にナンバリングにおける違いを説明する(例えば、Honegger,A.及びPluckthun,A.(2001)J.Mol.Biol.309:657〜670を参照のこと)。
本明細書において提供される親抗体の重鎖の可変ドメイン(VH)のアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。CDR(CDR1、CDR2及びCDR3)並びにフレームワーク領域(FR1、FR2、FR3及びFR4)が示される。全配列は2の図にまたがり、FR1、CDR1、FR2及びCDR2が図9A上に含まれ、FR3、CDR3及びFR4領域が図9B上に広がる。アラインメントナンバリングがAHoナンバリング変換に従って規定される場合、横線は単にナンバリングにおける違いを説明する(例えば、Honegger,A.及びPluckthun,A.(2001)J.Mol.Biol.309:657〜670を参照されたく、該文献はその全体が参照により本明細書に組み込まれる)。
本明細書において提供される親抗体の重鎖の可変ドメイン(VH)のアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。CDR(CDR1、CDR2及びCDR3)並びにフレームワーク領域(FR1、FR2、FR3及びFR4)が示される。全配列は2の図にまたがり、FR1、CDR1、FR2及びCDR2が図9A上に含まれ、FR3、CDR3及びFR4領域が図9B上に広がる。アラインメントナンバリングがAHoナンバリング変換に従って規定される場合、横線は単にナンバリングにおける違いを説明する(例えば、Honegger,A.及びPluckthun,A.(2001)J.Mol.Biol.309:657〜670を参照されたく、該文献はその全体が参照により本明細書に組み込まれる)。
本明細書において提供される遺伝子操作した抗体の軽鎖の可変ドメイン(VL)のアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。CDR(CDR1、CDR2及びCDR3)並びにフレームワーク領域(FR1、FR2、FR3及びFR4)が示される。全配列は2の図にまたがり、FR1、CDR1、FR2及びCDR2が図10A上に含まれ、FR3、CDR3及びFR4領域が図10B上に広がる。アラインメントナンバリングがAHoナンバリング変換に従って規定される場合、横線は単にナンバリングにおける違いを説明する(例えば、Honegger,A.及びPluckthun,A.(2001)J.Mol.Biol.309:657〜670を参照のこと)。
本明細書において提供される遺伝子操作した抗体の軽鎖の可変ドメイン(VL)のアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。CDR(CDR1、CDR2及びCDR3)並びにフレームワーク領域(FR1、FR2、FR3及びFR4)が示される。全配列は2の図にまたがり、FR1、CDR1、FR2及びCDR2が図10A上に含まれ、FR3、CDR3及びFR4領域が図10B上に広がる。アラインメントナンバリングがAHoナンバリング変換に従って規定される場合、横線は単にナンバリングにおける違いを説明する(例えば、Honegger,A.及びPluckthun,A.(2001)J.Mol.Biol.309:657〜670を参照のこと)。
本明細書において提供される遺伝子操作した抗体の重鎖の可変ドメイン(VH)のアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。CDR(CDR1、CDR2及びCDR3)並びにフレームワーク領域(FR1、FR2、FR3及びFR4)が示される。全配列は2の図にまたがり、FR1、CDR1、FR2及びCDR2が図11A上に含まれ、FR3、CDR3及びFR4領域が図11B上に広がる。アラインメントナンバリングがAHoナンバリング変換に従って規定される場合、横線は単にナンバリングにおける違いを説明する(例えば、Honegger,A.及びPluckthun,A.(2001)J.Mol.Biol.309:657〜670を参照のこと)。
本明細書において提供される遺伝子操作した抗体の重鎖の可変ドメイン(VH)のアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。CDR(CDR1、CDR2及びCDR3)並びにフレームワーク領域(FR1、FR2、FR3及びFR4)が示される。全配列は2の図にまたがり、FR1、CDR1、FR2及びCDR2が図11A上に含まれ、FR3、CDR3及びFR4領域が図11B上に広がる。アラインメントナンバリングがAHoナンバリング変換に従って規定される場合、横線は単にナンバリングにおける違いを説明する(例えば、Honegger,A.及びPluckthun,A.(2001)J.Mol.Biol.309:657〜670を参照のこと)。
GITRシグナル伝達の活性化におけるGITR抗体のグリコシル化の状態の重要性を示す図である。グリコシル化された天然のIgG1 GITR抗体及び、FcのFcγ受容体への結合にとって重要なN−結合型グリコシル化部位を除去する、297位におけるアスパラギングルタミンへのアミノ酸置換を有するように遺伝子操作したIgG1 GITR抗体を用いて、試験を実施した。天然及び非グリコシル化変異体を、FcγRIIaまたはFcγRIIIaのいずれかによってもたらされるGITR抗体のクラスタ化に伴う、CD4+T細胞の活性化を媒介するそれらの能力について試験した。図12A及び12Bから判るように、FcγRIIa(図12A)及びFcγRIIIa(12B)の両方が、天然のIgG1 GITR抗体をクラスタ化し、エフェクタT細胞の増殖を活発化することができた。しかし、非グリコシル化抗体は、そのFcγRに結合しFcγRによってクラスタ化する能力の欠如に起因して、全く活性を示さなかった。
GITRシグナル伝達の活性化におけるGITR抗体のグリコシル化の状態の重要性を示す図である。グリコシル化された天然のIgG1 GITR抗体及び、FcのFcγ受容体への結合にとって重要なN−結合型グリコシル化部位を除去する、297位におけるアスパラギンのグルタミンへのアミノ酸置換を有するように遺伝子操作したIgG1 GITR抗体を用いて、試験を実施した。天然及び非グリコシル化変異体を、FcγRIIaまたはFcγRIIIaのいずれかによってもたらされるGITR抗体のクラスタ化に伴う、CD4+T細胞の活性化を媒介するそれらの能力について試験した。図12A及び12Bから判るように、FcγRIIa(図12A)及びFcγRIIIa(12B)の両方が、天然のIgG1 GITR抗体をクラスタ化し、エフェクタT細胞の増殖を活発化することができた。しかし、非グリコシル化抗体は、そのFcγRに結合しFcγRによってクラスタ化する能力の欠如に起因して、全く活性を示さなかった。

0053

本明細書で用いる節の見出しは構成上の目的のためのものに過ぎず、記載される主題を限定するものと解されるべきではない。

0054

本明細書において別段に定義されない限りにおいて、本願との関係において用いられる科学用語及び技術用語は、当業者によって通常に理解される意味を有する。更に、文脈により特段の必要がない限りにおいて、単数形の用語は複数を包含し、複数形の用語は単数を包含するものとする。

0055

概括的には、本明細書に記載される、細胞培養及び組織培養分子生物学免疫学微生物学、遺伝子化学及びタンパク質化学及び核酸化学、及びハイブリッド化との関係において用いられる命名法、並びにそれらの技法は、本技術分野において周知の及び通常に用いられるものである。本願の方法及び技法は、別段の表示がない限りにおいて、概括的には、本技術分野において周知であり、本明細書全体を通して引用され検討される概括的な及びより詳細な参照文献に記載される、従来の方法に従って実施される。例えば、Sambrookら、「分子クローニング実験室便覧」(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)第3版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、ニューヨークコールドスプリングハーバー(2001)、Ausubelら、「分子生物学における最新プロトコル」(Current Protocols in Molecular Biology)Greene Publishing Associates(1992)並びにHarlow及びLane、「抗体:実験室便覧」(Antibodies:A Laboratory Manual)Cold Spring Harbor Laboratory Press、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー(1990)を参照されたく、文献は参照により本明細書に組み込まれる。酵素反応及び精製の技法は、製造者仕様書に従って、本技術分野において通常実施されるようにして、または本明細書に記載するようにして実施される。本明細書に記載される、分析化学、合成有機化学、並びに医薬品化学及び薬化学との関係において用いられる用語、並びにこれらの実験室での手順及び技法は、本技術分野において周知且つ通常に用いられるものである。化学合成化学分析医薬の製剤、処方、及び送達、並びに患者の治療には、標準的な技法を用いることができる。

0056

本発明は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル、及び試剤などに限定されることはなく、従って変化し得ることが理解されるべきである。本明細書において用いられる用語は、特定の実施形態を記述することを目的とするに過ぎず、開示の範囲を限定することは意図されず、該範囲は特許請求の範囲によってのみ規定される。

0057

実施例、または別段の表示がなされた場合以外において、本明細書で用いられる成分の量または反応条件表現する全ての数字は、全ての例において用語「約」で修飾されたものとして理解されるべきである。パーセンテージに関係して用いられる場合の用語「約」とは、±1%を意味し得る。

0058

本明細書の特定の段落によって規定された変化よりも、いずれかの面で範囲がより狭い全ての実施形態は、本開示に包含されると見なされるべきである。例えば、特定の態様が属として記載され、全ての属のメンバーは、個々に、実施形態とすることができると理解されるべきである。また、属または属のメンバーの選択として記載される態様は、当該属の2以上のメンバーの組み合わせを包含すると理解されるべきである。また、本明細書における様々な実施形態が、様々な状況下で、「含む」との語法を用いて示される一方、関連する例は、「からなる」または「から実質的になる」との語法を用いて記載することができることも理解されるべきである。

0059

本願において「または」(“or”)の使用は、別段の記載がない限りにおいて、「及び/または」を意味する。更に、用語「含む」(“including”)並びに「含む」(“includes”)及び「含まれる」(“included”)などの他の形態は限定されない。また、「要素」または「成分」などの用語は、特に別段の記載がない限りにおいて、1のユニットを含む要素または成分、並びに複数のサブユニットを含む要素または成分の両方を包含する。

0060

I.定義
本明細書において用いられる用語「GITR」とは、本技術分野においてTNF受容体スーパーファミリー18(TNFRSF18)とも呼ばれる、「グルココルチコイド誘導性TNFR関連遺伝子」をいう。ヒト及びマウスの形態のGITRに対するアミノ酸及び核酸配列がWO98/06842に記載され、これは参照により本明細書に組み込まれる。ジェンバンクへの寄託Q9Y5U5(ヒトアミノ酸配列)及びAF109216(マウス核酸及びアミノ酸配列)も参照されたい。成熟したヒトGITRポリペプチドの具体的な1例は、配列番号1に示される。カニクイザル由来の代表的な成熟したGITRタンパク質は、配列番号2に示されるアミノ酸配列を有する。マウス由来の成熟したGITRのアミノ酸配列が配列番号3に示される。本明細書において用いられる用語GITRは、天然に存在する対立遺伝子も包含する。

0061

本明細書において用いられる用語「GITRL」とは、天然に存在するGITRに対するリガンドをいう。GITRLポリペプチドに関するアミノ酸配列が、ジェンバンク寄託AAQ89227に示される。ヒトGITRLに対する代表的なアミノ酸配列は、配列番号4に示される。

0062

本明細書において用いられる「抗原結合タンパク質」とは、GITRポリペプチド(例えば、配列番号1に示されるようなヒトGITRポリペプチド)などの、特定された標的抗原と特異的に結合する任意のタンパク質を意味する。当該用語は、少なくとも1の抗体結合領域を含むポリペプチドを包含する。該用語はまた、少なくとも2の完全長重鎖及び2の完全長軽鎖を含むインタクトなポリペプチド、並びにそれらの誘導体、変異体、フラグメント、及び突然変異体を包含し、それらの例としては、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fvフラグメントが挙げられる。抗原結合タンパク質としてはまた、ナノボディーなどのドメイン抗体及び以下に更に説明する一本鎖抗体、並びに二特異性抗体も挙げられる。該用語はGITRLを含まない。

0063

一般的に、GITR抗原結合タンパク質は、当該抗原結合タンパク質が非GITR分子に対して実質的に自然に存在する程度の結合を示す場合に、その標的GITR抗原と「特異的に結合する」といわれる。但し、GITRと特異的に結合する抗原結合タンパク質は、異なる種由来のGITRポリペプチドと交差反応する場合がある。一般的に、GITR抗原結合タンパク質は、解離定数(KD)が、表面プラズマ共鳴技法(例えば、BIACore、GE−ヘルスケア社、スウェーデン国ウプサラ)によって測定して10−7M以下である場合には、ヒトGITRと特異的に結合する。GITR抗原結合タンパク質は、ここでもBIACoreなどの方法を用いて測定して、KDが5×10−8M以下である場合には「高い親和性」をもって、KDが5×10−9M以下である場合には、「非常に高い親和性」をもって、ヒトGITRと特異的に結合する。

0064

抗原結合領域」とは、抗体またはそのフラグメント、誘導体、若しくは変異体などの、特定された抗原と特異的に結合するタンパク質の一部を意味する。例えば、抗原と相互作用し、当該抗原結合タンパク質に、その当該抗原に対する特異性及び親和性を付与するアミノ酸残基を含む抗原結合タンパク質の当該一部が、「抗原結合領域」と称される。抗原結合領域は、1または複数の「相補性決定領域」(「CDR」)を含むことができる。特定の抗原結合領域はまた、1または複数の「フレームワーク」領域も含む。「CDR」は、抗原結合特異性及び親和性に寄与するアミノ酸配列である。「フレームワーク」領域は、抗原結合タンパク質の特異的結合に直接寄与することもできるが、一般的には、当該CDRの適正な立体構造を維持することを助けて、当該抗原結合領域と抗原との間の結合を促進する。

0065

組換えGITR抗原結合タンパク質を始めとする「組換えタンパク質」とは、組換え技法を用いて、すなわち、本明細書に記載の組換え核酸の発現を通じてつくられるタンパク質である。組換えタンパク質の産生方法及び技法は、本技術分野において周知である。

0066

用語「抗体」とは、任意のアイソタイプのインタクトな免疫グロブリン、または標的抗原に対する特異的結合に関して、インタクトな抗体と競合可能な免疫グロブリンのフラグメントをいい、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、及び二特異性抗体が挙げられる。「抗体」はそれ自体、抗原結合タンパク質の一種である。いくつかの実施形態において、インタクトな抗体は、少なくとも2の完全長重鎖及び2の完全長軽鎖を含む。他の実施形態において、インタクトな抗体は、重鎖のみを含む場合があるラクダ類における天然に存在する抗体などの、より少ない連鎖を含む。抗体は単独で単一の出所に由来してもよく、またはキメラであっても、すなわち、当該抗体の別個の一部が、以下に更に記載される2の別個の抗体に由来してもよい。抗原結合タンパク質、抗体、または結合フラグメントは、ハイブリドーマ中で、組換えDNA技法により、またはインタクトな抗体の酵素的若しくは化学的開裂によって産生することができる。別段の表示がない限りにおいて、用語「抗体」としては、2の完全長重鎖及び2の完全長軽鎖を含む抗体に加えて、それらの誘導体、変異体、フラグメント、及び突然変異体を包含し、それらの例としては、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fvフラグメント、ナノボディー(登録商標)などのドメイン抗体及び以下により詳細に説明する一本鎖抗体が挙げられる。

0067

抗原結合タンパク質、抗体またはそのフラグメントに関して用いられる用語「軽鎖」は、完全長軽鎖及び結合特異性を付与するために十分な可変領域配列を有するそのフラグメントを包含する。完全長軽鎖は、可変領域ドメインVL、及び定常領域ドメインCLを含む。軽鎖の可変領域ドメインはポリペプチドのアミノ末端にある。軽鎖はκ連鎖及びλ連鎖を含む。

0068

抗原結合タンパク質、抗体またはそのフラグメントに関して用いられる用語「重鎖」は、完全長重鎖及び結合特異性を付与するために十分な可変領域配列を有するそのフラグメントを包含する。完全長重鎖は、可変領域ドメインVH、及び3の定常領域ドメインCH1、CH2、及びCH3を含む。VHドメインはポリペプチドのアミノ末端にあり、CHドメインカルボキシル末端にあり、CH3はポリペプチドのカルボキシ末端に最も近い。重鎖は、(IgG1、IgG2、IgG3及びIgG4サプタイプを含む)IgG、(IgA1及びIgA2サブタイプを含む)IgA、IgM及びIgEを含む。

0069

本明細書において用いられる用語、抗体または免疫グロブリン鎖(重鎖または軽鎖)の「免疫学的に機能性のフラグメント」(または、単に「フラグメント」)とは、完全長鎖中に存在するアミノ酸の少なくともいくつかが存在しないが、抗原に対して特異的に結合する能力を有する抗体の一部(当該一部が如何にして得られたかまたは合成されたかに拘わらず)を含む抗原結合タンパク質である。かかるフラグメントは、それらが標的抗原に対して特異的に結合する、及び所与エピトープに対する特異的結合に関して、インタクトな抗体を始めとする他の抗原結合タンパク質と競合することが可能であるとの点において、生物学的に活性である。一態様において、かかるフラグメントは、少なくとも1の、完全長の軽鎖または重鎖中に存在するCDRを保持することとなり、いくつかの実施形態において、単一の重鎖及び/若しくは軽鎖またはそれらの一部を含むこととなる。これらの生物学的に活性なフラグメントは、組換えDNA技法によって産生することができ、またはインタクトな抗体を始めとする抗原結合タンパク質の酵素的または化学的開裂によって産生することができる。免疫学的に機能性の免疫グロブリンフラグメントとしては、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、ドメイン抗体及び一本鎖抗体が挙げられるがこれらに限定されず、ヒト、マウス、ラット、ラクダ類またはウサギを始めとする、但しこれらに限定されない、哺乳類源由来であることができる。本明細書に開示される抗原結合タンパク質の機能性部分、例えば、1種又は複数種のCDRは、第2のタンパク質または低分子に共有結合し、二官能性の治療特性を有する、または長い血清半減期を有する、体内の特定の標的を対象とする治療薬を創生することができることが、更に企図される。

0070

「Fabフラグメント」は、1の軽鎖並びに1の重鎖のCH1及び可変領域から構成される。Fab分子の重鎖は別な重鎖分子とジスルフィド結合を形成できない。

0071

「Fc」領域は、抗体のCH2及びCH3ドメインを含む2の重鎖フラグメントを含む。2の重鎖フラグメントは、2以上のジスルフィド結合によって、及びCH3ドメインの疎水性相互作用によって一体化されている。

0072

「Fab’フラグメント」は、1の軽鎖並びに、2のFab’フラグメントの2の重鎖間に連鎖間ジスルフィド結合を形成し、F(ab’)2分子を形成することができるような、VHドメイン及びCH1ドメイン並びにCH1ドメインとCH2ドメインとの間の領域も含む1の重鎖の一部を含む。

0073

「F(ab’)2フラグメント」は、2の軽鎖並びに、CH1ドメインとCH2ドメインとの間の定常領域の一部を含む2の重鎖であって、該2の重鎖間に連鎖間ジスルフィド結合が形成されるような2の重鎖を含む。従って、F(ab’)2フラグメントは、当該2の重鎖間のジスルフィド結合によって一体化された2のFab’フラグメントから構成される。

0074

「Fv領域」は、重鎖及び軽鎖の両方に由来する可変領域を含むが、定常領域は含まない。

0075

「一本鎖抗体」とは、重鎖及び軽鎖の可変領域が柔軟な結合子によって結合され、単一のポリペプチド鎖を形成するFv分子であり、該ポリペプチド鎖は抗原結合領域を形成する。一本鎖抗体は、国際特許出願公開第WO88/01649及び米国特許第4,946,778号及び第5,260,203号において詳細に検討されている。

0076

「ドメイン抗体」とは、重鎖の可変領域または軽鎖の可変領域のみを含む免疫学的に機能性の免疫グロブリンフラグメントである。ドメイン抗体の例としては、ナノボディー(登録商標)が挙げられる。いくつかの例において、2以上のVH領域がペプチド結合子と共有結合し、二価ドメイン抗体を創生する。二価ドメイン抗体の2のVH領域は、同一または別個の抗原を標的とし得る。

0077

「二価抗原結合タンパク質」、「二価抗体」または「二特異性抗体」は、2の抗原結合領域を含む。いくつかの例において、2の結合領域は同一の抗原特異性を有する。二価抗原結合タンパク質及び二価抗体は二特異性であってもよい。

0078

「多重特異性抗原結合タンパク質」または「多重特異性抗体」とは、複数の抗原またはエピトープを標的とする抗原結合タンパク質または抗体である。

0079

「二特異性」、「二重特異性」若しくは「二官能性」抗原結合タンパク質または抗体とは、2の別個の抗原結合部位を有する、それぞれハイブリッド抗原結合タンパク質または抗体である。二特異性抗原結合タンパク質及び抗体は、多重特異性抗原結合タンパク質または多重特異性抗体の一種であり、ハイブリドーマの融合またはFab’フラグメントの結合を始めとする、但しこれらには限定されない、種々の方法によって産生することができる。例えば、Songsivilai及びLachmann、1990、Clin.Exp.Immunol.79:315〜321、Kostelnyら、1992、J.Immunol.148:1547〜1553を参照されたい。二特異性抗原結合タンパク質または抗体の2の結合部位は、2の別個のエピトープに結合することとなり、該エピトープは同一または別個のタンパク質標的上に存在し得る。

0080

用語「競合する」とは、同一のエピトープに対して競合する抗原結合タンパク質(例えば、抗体)の文脈において用いられる場合、抗原結合タンパク質間の競合を意味し、当該抗原結合タンパク質(例えば、抗体若しくはその免疫学的に機能性のフラグメント)が、試験下で、共通の抗原(例えば、GITR若しくはそのフラグメント)に対する基準となる抗原結合タンパク質の特異的結合を妨げるまたは阻害するアッセイによって測定される。例えば、固相直接または間接放射免疫アッセイRIA)、固相直接または間接酵素免疫アッセイEIA)、サンドウィッチ競合アッセイ(例えば、Stahliら、1983、Methodsin Enzymology 9:242〜253を参照のこと。);固相直接ビオチンアビジンEIA(例えば、Kirklandら、1986、J.Immunol.137:3614〜3619を参照のこと。);固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドウィッチアッセイ(例えば、Harlow及びLane、1988、「抗体、実験室便覧」(Antibodies、A Laboratory Manual)、Cold Spring Harbor Pressを参照のこと。);I−125標識を用いる固相直接標識RIA(例えば、Morelら、1988、Molec.Immunol.25:7〜15を参照のこと。);固相直接ビオチン−アビジンEIA(例えば、Cheungら、1990、Virology 176:546〜552を参照のこと。);及び直接標識RIA(例えば、Moldenhauerら、1990、Scand.J.Immunol.32:77〜82を参照のこと。)などの多種の競合結合アッセイを用いることができる。一般的には、かかるアッセイは、固体表面に結合された精製抗原または当該抗原を発現する細胞、非標識被験抗原結合タンパク質及び標識基準抗原結合タンパク質の使用を含む。被験抗原結合タンパク質の存在下で、固体表面または細胞に結合した標識の量を測定することにより、競合的阻害が測定される。通常、被験抗原結合タンパク質を過剰に存在させる。競合アッセイによって識別される抗原結合タンパク質(競合抗原結合タンパク質)としては、基準抗原結合タンパク質と同一のエピトープに結合する抗原結合タンパク質、及び、生じる立体障害のために、基準抗原結合タンパク質が結合したエピトープに十分に近位の隣接するエピトープに結合する抗原結合タンパク質が挙げられる。競合的結合の測定方法に関する更なる詳細は、本明細書中の実施例に示される。例えば、一実施形態において、BiaCoreアッセイによって競合が測定される。通常、競合する抗原結合タンパク質が過剰に存在する場合、該抗原結合タンパク質は基準抗原結合タンパク質の共通の抗原に対する特異的結合を、少なくとも20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%または75%阻害することとなる。いくつかの例において、結合は、少なくとも80%、85%、90%、95%、または97%若しくはそれ以上阻害される。

0081

用語「抗原」とは、(例えば、抗体を始めとする)抗原結合タンパク質などの、選択的な結合剤が結合することができる、更に、当該抗原に結合する能力を有する抗体を産生するために、動物において用いることができる分子または分子の一部をいう。抗原は、別個の抗原結合タンパク質、例えば、抗体と相互作用する能力を有する1または複数のエピトープを有していてもよい。

0082

用語「エピトープ」とは、抗原結合タンパク質(例えば、抗体)が結合する分子の一部である。この用語は、抗体などの抗原結合タンパク質に特異的に結合する能力を有する任意の決定基を包含する。エピトープは、連続的または非連続的(不連続)であることができる(例えば、ポリペプチドにおいて、ポリペプチド配列中で互いに隣接していないが、分子の文脈内においては抗原結合タンパク質が結合するアミノ酸残基)。立体配座エピトープとは、活性なタンパク質の立体配座中には存在するが、変性したタンパク質中には存在しないエピトープである。特定の実施形態において、エピトープは、当該エピトープが、抗原結合タンパク質を産生するために用いられるエピトープに類似する三次元構造を含む、更に、抗原結合タンパク質を産生するために用いられる当該エピトープ中に存在するアミノ酸残基を含まない、またはその一部のみを含むとの点において、擬態性である場合がある。殆どの場合、エピトープはタンパク質上に存在するが、いくつかの例においては、核酸などの他の種類の分子上に存在する場合もある。エピトープ決定基としては、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリルまたはスルホニル基などの、分子の化学的に活性な表面団を挙げることができ、特異的な三次元構造的特徴、及び/または特異的な電荷特性を有する場合がある。一般的に、特定の標的抗原に対する特異性抗原結合タンパク質は、複雑なタンパク質及び/または高分子の混合物中の標的抗原上のエピトープを優先的に認識することとなる。

0083

「アミノ酸」は、本技術分野におけるその通常の意味を包含する。20種の天然に存在するアミノ酸及びそれらの略記は従来の用い方に従う。「免疫学−合成」(Immunology−A Synthesis)、第2版、(E.S.Golub及びD.R.Green編)Sinauer Associates:マサチューセッツサンダーランド(1991)を参照されたく、該文献はいずれの目的に対しても、参照により本明細書に組み込まれる。20種の従来のアミノ酸、[α]−、[α]−二置換アミノ酸、N−アルキルアミノ酸、及び他の非従来型のアミノ酸などの非天然アミノ酸立体異性体(例えば、D−アミノ酸)もまた、ポリペプチドの好適な成分となり得、語句「アミノ酸」に包含される。非従来型のアミノ酸の例としては、4−ヒドロキシプロリン、[γ]−カルボキシグルタメート、[ε]−N,N,N−トリメチルリシン、[ε]−N−アセチルリシン、O−ホスホセリン、N−アセチルセリンN−ホルミルメチオニン、3−メチルヒスチジン、5−ヒドロキシリシン、[σ]−N−メチルアルギニン、並びに他の類似のアミノ酸及びイミノ酸(例えば、4−ヒドロキシプロリン)が挙げられる。本明細書において用いられるポリペプチドの表記法においては、標準的な用い方及び慣習に従って、左側方向がアミノ末端方向であり、右側方向がカルボキシル方向である。

0084

用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、本明細書において同義で用いられ、アミノ酸残基のポリマーをいう。該用語はまた、天然に存在するアミノ酸ポリマーに対してのみならず、1または複数のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の類似物または模倣物であるアミノ酸ポリマーにも適用される。該用語はまた、例えば、糖残基の付加によって糖タンパク質を形成するなどの修飾を受けた、またはリン酸化されたアミノ酸ポリマーも包含し得る。ポリペプチド及びタンパク質は、天然に存在する非組換え細胞によって、または遺伝子操作した、すなわち組換えた細胞によって産生することができ、天然タンパク質のアミノ酸配列を有する分子、あるいは、天然配列の1若しくは複数のアミノ酸からの欠失、該アミノ酸への付加、及び/または該アミノ酸の置換を有する分子を含むことができる。用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、詳細には、抗原結合タンパク質の1若しくは複数のアミノ酸からの欠失、該アミノ酸への付加、及び/または該アミノ酸の置換を有するGITR抗原結合タンパク質、抗体、または配列を包含する。用語「ポリペプチドフラグメント」とは、完全長タンパク質と比較して、アミノ末端の欠失、カルボキシル末端の欠失、及び/または内部の欠失を有するポリペプチドをいう。かかるフラグメントはまた、完全長タンパク質との対比で、修飾アミノ酸を含むこともできる。特定の実施形態において、フラグメントは約から500のアミノ酸長である。例えば、フラグメントは、少なくとも5、6、8、10、14、20、50、70、100、110、150、200、250、300、350、400または450のアミノ酸長であってもよい。有用なポリペプチドフラグメントとしては、結合ドメインを始めとする、抗体の免疫学的に機能性のフラグメントが挙げられる。GITR抗体の場合は、有用なフラグメントとしては、CDR領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、抗体鎖の一部または2のCDRを始めとするその可変領域のみなどが挙げられるが、これらには限定されない。

0085

用語「単離されたタンパク質」とは、主題のタンパク質が、(1)通常当該タンパク質と共に存在する少なくともいくつかの他のタンパク質を含まない、(2)同一の出所由来の、例えば、同一の種由来の他のタンパク質を実質的に含まない、(3)別個の種由来の細胞によって発現される、(4)天然において当該タンパク質に連結する、ポリヌクレオチド、脂質、炭水化物、若しくはその他の物質の少なくとも約50パーセントから分離されている、(5)天然において当該タンパク質に連結することのないポリペプチドと、(共有結合若しくは非共有結合での相互作用によって)作動可能に連結している、または(6)天然に存在しないことを意味する。一般的に、「単離されたタンパク質」は、所与の試料の少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約25%、または少なくとも約50%を構成する。ゲノムDNA、cDNAmRNA若しくは合成に由来する他のRNA、またはそれらの任意の組み合わせが、かかる単離されたタンパク質をコードし得る。単離されたタンパク質は、単離されたタンパク質の治療上の、診断上の、予防上の、研究のまたはその他の使用を妨害する、単離されたタンパク質の天然の環境において存在する、タンパク質若しくはポリペプチドまたはその他の混入物を実質的に含まないことが好ましい。

0086

ポリペプチド(例えば、抗体などの抗原結合タンパク質)の「変異体」は、1または複数のアミノ酸残基が、別のポリペプチド配列に関係するアミノ酸配列中に挿入された、該配列から削除された及び/または該配列中に置換されたアミノ酸配列を含む。変異体は融合タンパク質を包含する。

0087

ポリペプチドの「誘導体」とは、例えば、別な化学成分への抱合によるなどの、挿入、欠失、または置換変異体とは異なる何らかの様式によって化学修飾されたポリペプチド(例えば、抗体などの抗原結合タンパク質)である。

0088

本明細書全体を通して、ポリペプチド、核酸、宿主細胞などの生物学的物質との関係において用いられる用語「天然に存在する」とは、天然に見られる物質をいう。

0089

用語「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、一本鎖及び二本鎖ヌクレオチドポリマーの両方を包含する。ポリヌクレオチドを含むヌクレオチドは、リボヌクレオチド若しくはデオキシリボヌクレオチドまたはいずれかのタイプのヌクレオチドの修飾した形態であることができる。修飾としては、ブロモウリジン及びイノシン誘導体などの塩基の修飾、2’,3’−ジデオキシリボースなどのリボースの修飾、及びチオリン酸エステルジチオリン酸エステルセレノリン酸エステル、ジセレノリン酸エステル、phosphoroanilothioate、phoshoraniladate及びphosphoroamidateなどのヌクレオチド間結合の修飾が挙げられる。

0090

用語「オリゴヌクレオチド」とは、200以下のヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを意味する。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、長さが10から60塩基である。他の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、長さが12、13、14、15、16、17、18、19、または20から40ヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドは、例えば、突然変異遺伝子構築に用いるための一本鎖または二本鎖であることができる。オリゴヌクレオチドは、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドであることができる。オリゴヌクレオチドは、アッセイにおける検知のための、放射標識、蛍光標識、ハプテン性または抗原性標識を始めとする標識を含むことができる。オリゴヌクレオチドは、例えば、PCRプライマクローニングプライマまたはハイブリダイゼーションプローブとして用いることができる。

0091

「単離された核酸分子」とは、天然においては当該単離されたポリヌクレオチドがその中に存在するポリヌクレオチドの全て若しくは一部が同伴していない、または、天然においては当該単離されたポリヌクレオチドが結合していないポリヌクレオチドと結合した、ゲノムのmRNA、cDNA、または合成由来のDNA若しくはRNAあるいはそれらのいくつかの組み合わせを意味する。本開示の目的のために、特定のヌクレオチド配列を「含む核酸分子」とは、インタクトな染色体を包含しないことが理解される必要がある。指定された核酸配列を「含む」単離された核酸分子は、当該指定された配列に加えて、10に及ぶ、または20にすら及ぶ他のタンパク質またはそれらの一部に対するコード配列を含む場合があり、あるいは、列挙した核酸配列のコード領域の発現を制御する、作動可能に結合した制御配列を含む場合があり、及び/またはベクター配列を含む場合がある。

0092

別段に明示されない限りにおいて、本明細書において議論される任意の一本鎖ポリヌクレオチド配列の左側末端は5’末端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左側方向は5’方向と称される。新生RNA転写物の5’から3’への付加の方向は転写方向と称され、5’からRNA転写物の5’末端へのRNA転写物と同様の配列を有するDNA鎖上の配列領域は、「上流配列」と称され、3’からRNA転写物の3’末端へのRNA転写物と同様の配列を有するDNA鎖上の配列領域は、「下流配列」と称される。

0093

用語「制御配列」とは、該制御配列が連結するコード配列の発現及び処理に影響を与えることができるポリヌクレオチド配列をいう。かかる制御配列の性質宿主生物に依存し得る。特定の実施形態において、原核生物に関する制御配列は、プロモータリボソーム結合部位、及び転写終止配列を含み得る。例えば、原核生物に関する制御配列は、1または複数の転写因子に対する認識部位転写エンハンサ配列、及び転写終止配列を含み得る。「制御配列」はリーダー配列及び/または融合パートナー配列を含むことができる。

0094

用語「ベクター」とは、宿主細胞中にタンパク質コード情報移入するために用いられる任意の分子又は実体(例えば、核酸、プラスミドバクテリオファージまたはウィルス)を意味する。

0095

用語「発現ベクター」または「発現構築物」とは、宿主細胞の形質転換に好適であり、核酸配列であって、該配列に作動的に結合した1または複数の異種コード領域の発現を(宿主細胞と協同して)指示及び/または制御する核酸配列を含むベクターをいう。発現構築物としては、転写、翻訳に影響を与えるまたはこれらを制御する配列であって、イントロンが存在する場合には、該配列に作動可能に結合したコード領域のRNAスプライシングに影響を与える配列を挙げることができるが、これらに限定されない。

0096

本明細書において用いられる「作動可能に結合した」とは、該用語が適用される要素が、適宜の条件下で、要素がそれらの本来の機能を行使することを可能にする関係にあることを意味する。例えば、ベクター中の、タンパク質コード配列に「作動可能に結合した」制御配列は、当該制御配列の転写活性に対応した条件下で、タンパク質コード配列の発現が達成されるように、該タンパク質コード配列に連結している。

0097

用語「宿主細胞」とは、核酸配列を用いて形質転換され、それによって対象とする遺伝子を発現する細胞を意味する。該用語は、当該親細胞後代が、形態学または遺伝子構成において初代の親細胞と同一であっても同一でなくとも、対象とする遺伝子が存在する限りにおいて、当該後代を包含する。

0098

用語「同一性」とは、2以上のポリペプチド分子または2以上の核酸分子の配列間の関係であって、当該配列についてアラインメントを行い、比較することによって求められる関係をいう。「パーセント記の同一性」とは、比較する分子中のアミノ酸またはヌクレオチド間の同一の残基のパーセンテージを意味し、比較する分子の中の最小の大きさに基づいて算出される。これらの計算については、配列中のギャップ(もしあれば)は、特定の数学モデルまたはコンピュータプログラム(すなわち、「アルゴリズム」)で対処しなければならない。アラインメントを行った核酸またはポリペプチドの同一性を算出するために用いることができる方法としては、計算分子生物学(Computational Molecular Biology)、(Lesk,A.M.編)、1988、ニューヨーク:Oxford University Press;バイオコンピューティング情報科学及びゲノムプロジェクト(Biocomputing Informatics and Genome Projects)、(Smith,D.W.編),1993、ニューヨーク:Academic Press;配列データのコンピュータ解析、第1部(Computer Analysis of Sequence Data,Part I)(Griffin,A.M.及びGriffin,H.G.編)、1994、ニュージャージー:Humana Press;von Heinje,G.、1987、分子生物学における配列解析(Sequence Analysis in Molecular Biology)、ニューヨーク:Academic Press;配列解析プライマ(Sequence Analysis Primer)、(Gribskov,M.及びDevereux,J.編)、1991、ニューヨーク:M.Stockton Press;並びにCarilloら、1988、SIAM J.Applied Math.48:1073に記載のものが挙げられる。

0099

パーセント記の同一性の算出において、比較する配列を、当該配列間で最大の一致を与える方法でアラインメントを行う。パーセント記の同一性を求めるために用いられるコンピュータプログラムはGCプログラムパッケージであり、これはGAP(Devereuxら、1984、Nucl.Acid Res.12:387;ウィスコシン大学遺伝学コンピュータグループ、ウィスコンシン州マディソン)を含む。パーセント記の同一性を求めることとなる対象である2のポリペプチドまたはポリヌクレオチドについてアラインメントを行うために、コンピュータアルゴリズムGAPを用いる。配列について、それらのそれぞれのアミノ酸またはヌクレオチドの最適な一致(アルゴリズムによって求められる「一致スパン」(“matched span”))となるようにアラインメントを行う。ギャップオープニングペナルティー(3×平均ダイアゴナルとして算出され、但し、「平均ダイアゴナル」とは、用いられる比較マトリクスのダイアゴナルの平均値であり、「ダイアゴナル」とは、特定の比較マトリクスによる、各完全なアミノ酸の一致に帰属されるスコアまたは数である。)及びギャップエクステンションペナルティー(通常、ギャップオープニングペナルティー×1/10)、並びにPAM 250またはBLOSUM 62などの比較マトリクスが、アルゴリズムと協同して用いられる。特定の実施形態において、標準的な比較マトリクス(PAM 250比較マトリクスに関しては、Dayhoffら、1978、Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345〜352、BLOSUM 62比較マトリクスに関しては、Henikoffら、1992、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:10915〜10919を参照のこと。)もまた、アルゴリズムによって用いられる。

0100

APプログラムを用いて、ポリペプチドまたはヌクレオチド配列に関するパーセント記の同一性を求めるために推奨されるパラメータは以下の通りである。
アルゴリズム:Needlemanら、1970、J.Mol.Biol.48:443〜453、
比較マトリクス:BLOSUM 62、Henikoffら、1992、前掲
ギャップペナルティ:12(但し、末端ギャップについてはペナルティなし)、
ギャップ長さペナルティ:4、
類似性閾値:0。

0101

2のアミノ酸についてアラインメントを行うための特定のアラインメントスキームが、当該2の配列の短い領域のみの一致をもたらす場合があり、当該の2の完全長配列間には有意な関係はないにも拘わらず、このアラインメントを行った小さな領域が非常に高い配列同一性を有する場合がある。従って、選択されたアラインメント方法(GAPプログラム)は、それが所望されるならば、標的ポリペプチドの少なくとも50の連続するアミノ酸にわたるアラインメントをもたらすように調節することができる。

0102

本明細書において用いられる「実質的に純粋な」とは、記載される分子の種が、存在する中で支配的な種である、すなわち、同一の混合物中において、当該の種の量が、モル量基準で、他のいずれの個々の種よりも多いことを意味する。特定の実施形態において、実質的に純粋な分子は、対象の種が、存在する全ての高分子種の(モル量基準で)少なくとも50%を構成する組成物である。他の実施形態において、実質的に純粋な組成物は、当該組成物中に存在する全ての高分子種の少なくとも80%、85%、90%。95%、または99%を構成することとなる。他の実施形態において、対象とする種が、当該組成物中において、従来の検知方法によって混入する種を検知することができない、本質的な同質性まで精製され、従って、当該組成物は単一の検知可能な高分子種から構成される。

0103

用語「治療すること」とは、症状の減退鎮静、減少または、患者に対して、傷害病理若しくは疾病をより忍容可能にすること;退行または低下の速度を鈍化させること;退行の終点をより衰弱性でないようにすること;患者の肉体的または精神的健康状態を向上させることなどの、任意の主観的または客観的パラメータを始めとする、傷害、病理若しくは疾病の治療または寛解における成功の任意の指標をいう。症状の治療または寛解は、身体的検査神経性心的検査、及び/または精神医学的評価の結果を始めとする、客観的または主観的パラメータに基づくことができる。例えば、本明細書に示す特定の方法は、例えば、がんの進行または拡大を減少されること、腫瘍の成長を阻害すること、腫瘍の鎮静を生じさせること及び/またはがん若しくは腫瘍に伴う症状を寛解させることによって、がん及び腫瘍を治療することができる。同様に、本明細書に提供される他の方法は、感染症の進行または拡大を減少されること、感染症の程度を低減すること、及び/または感染症に伴う症状を寛解させることによって、感染性の疾患を治療する。

0104

「有効量」とは、一般的に、症状の重篤性及び/若しくは頻度を低減する、症状及び/若しくは根本原因を取り除く、症状の発生及び/若しくはそれらの根本原因を予防する、並びに/またはがんに起因する若しくはがんに伴う損傷を改善または修復するために十分な量である。いくつかの実施形態において、有効量は治療上有効な量または予防上有効な量である。「治療上有効な量」とは、疾患状態(例えば、がん)若しくは症状、特には疾患状態に伴う状態若しくは症状を治療する、さもなければ、疾患状態または、形はどうであれ、疾患に伴う他の任意の望ましからざる症状の進行を防止する、阻害する、遅延させるまたは逆行させるために十分な量である。「予防上有効な量」とは、対象に投与された際に、例えば、がんの発症(若しくは再発)の予防または遅延、あるいはがんまたはがんの症状の発症(若しくは再発)の可能性の低減などの、意図する予防的効果を有する医薬組成物の量である。十分な治療上または予防上の効果は、必ずしも1回分の投与によって生じるものではなく、一連の投与後に初めて生じる場合もある。従って、治療上または予防上有効な量は、1回または複数回の投与で投与することができる。

0105

語句「GITR関連疾患」及び他の類似の語句とは、例えば、本明細書で提供されるアゴニストGITR抗体の使用を通じて、GITR活性を誘発するまたは向上させることによって治療可能な、疾患または当該疾患に伴う症状をいう。

0106

用語「がん」、「腫瘍」、「がん性の」、及び「悪性の」とは、一般的に、制御されない細胞の増殖を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態をいうまたは表わす。がんの例としては、腺がんリンパ腫芽細胞腫黒色腫肉腫及び白血病を始めとするがん腫が挙げられるが、これらに限定されない。かかるがんのより詳細な例としては、黒色腫、肺がん、頭頚部がん、腎細胞ガン大腸がん、結腸直腸がん、扁平上皮細胞がん、小細胞がん、肺非小細胞がん胃腸がん、ホジキン及び非ホジキンリンパ腫膵がん神経膠芽腫神経膠腫子宮頸がん卵巣がん肝がん及び肝細胞がんなどの肝臓がん膀胱がん乳がん子宮内膜がん、(多発性骨髄腫などの)骨髄腫唾液腺がん、腎細胞がん及びウィルムス腫などの腎がん基底細胞がん、前立腺がん陰門ガン甲状腺がん精巣がん、及び食道がんが挙げられる。

0107

「腫瘍」とは、がん細胞が成長及び増殖して形成される組織の塊をいい、これは隣接する正常な組織を侵し、破壊し得る。がん細胞は、悪性腫瘍から離脱して血流中またはリンパ系入り、その結果がん細胞が原発腫瘍から拡がり、他の器官に新たな腫瘍を形成する。

0108

固形腫瘍」とは、通常は嚢胞または液体領域を含まない、異常な増殖または組織の塊をいう。固形腫瘍は良性(がん性ではない)または悪性(がん性)の場合がある。異なる種類の固形腫瘍が、それらを形成する細胞の種類に対して命名される。固形腫瘍の例は、肉腫、がん腫及びリンパ腫である。白血病(血液がん)は一般的に固形腫瘍を形成しない。

0109

「血液がん」とは、骨髄などの造血組織、または免疫系の細胞において最初に起こるがんである。血液がんの例は、白血病、リンパ腫、及び多発性骨髄腫である。

0110

本明細書において用いられる「対象」または「患者」は、任意の哺乳動物であることができる。一般的な実施形態において、対象または患者はヒトである。

0111

本明細書において用いられる「アゴニスト」とは、概括的には、例えば、本明細書において提供されるような抗原結合タンパク質などの、GITRと結合し、GITRシグナル伝達をトリガーすることができる分子をいう。

0112

語句「免疫変調成分」とは、免疫反応を誘発する、向上させるまたは抑制する分子をいう。免疫活性化因子とは、免疫反応を誘発または増幅する分子である。免疫抑制因子とは、免疫反応を低下させる又は抑制する分子である。従って、活性化免疫療法とは、対象の免疫系を誘発するまたは向上させる分子を投与することを伴う療法である。抑制免疫療法とは、対象を、当該対象の免疫系を低下させるまたは抑制する分子を用いて治療する療法である。

0113

II.概要
GITRの活性を変調させるために有用な、様々な選択的結合剤が提供される。これらの薬剤としては、例えば、GITRポリペプチド、特にはヒトGITR(例えば、配列番号1)に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む抗原結合タンパク質が挙げられる。提供される抗原結合タンパク質は、GITRアゴニストであり、従って、GITRシグナル伝達を誘発するまたは向上させることができる。これらのGITRアゴニストとしての活性に鑑み、提供される抗原結合タンパク質は、多様な免疫療法用途において用いることができる。

0114

本明細書に記載の抗原結合タンパク質は、免疫療法に対して、特には免疫賦活剤として、好適となるであろう抗体を識別する広範な選択プロセスを通じて得られた。第1の選択は、ヒト化抗体またはキメラ抗体ではなく、完全ヒト抗体を生起させるための判断であった。対象に投与された際に、抗GITR抗体それ自体に対して抗体が生起されるかも知れない虞−GITR抗体を投与して、対象の免疫反応を上方制御する免疫療法用途において拡大されることが予測される虞、を軽減するために、完全ヒト抗体が選択された。

0115

かかる完全ヒト抗体を得るプロセスを、キセノマウス(登録商標)動物における3の別個の免疫化作戦を実施することによって開始した。これらの作戦は、そこから主要な候補を選択することができる抗体の数及び配列多様性最大化するために、3の異なる免疫化戦略及び3種の異なる系統のマウスを用いた。これらの3の作戦から得られた結果としての初期の抗体を、次に、配列に基づいた生物物理学的な及び機能面でのスクリーニングの多重の繰り返しを通じて評価し、所望の特性を有する一群の親抗体を識別した。続いて、選択した親抗体の1または複数の特徴を更に向上させる目的で、これらの親抗体の遺伝子操作した変異体を作製した。最後に、親抗体及び遺伝子操作した抗体由来の一群の抗体を選択し、更なる分析を行った。

0116

例えば、配列解析に関して、酸化脱アミノ化異性化酸加水分解及び/または凝集、並びに免疫原性に対する傾向などの多数の判定基準に基づいて、初期の抗体より親抗体を選択した。生物物理学的分析としては、発現レベル、凝集の傾向、及び安定性に基づいた抗体の評価が挙げられた。機能面では、GITRに対する親和性、エフェクタT細胞を活性化及び刺激する能力、及び制御性T細胞による抑制を排除する能力などの活性に関して、親抗体を選択した。

0117

次いで、選択した親抗体を、当該抗体を改良するために遺伝子操作した。親抗体及びそれらの遺伝子操作した形態からの最終的な選択もまた、細胞株の安定性、精製属性、製造評価など多くの基準及び所望の機能面の属性にも基づく。

0118

いくつかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、異なるサブクラスのT細胞に対して差示的な結合を示すことから選択される。特に、かかる抗原結合タンパク質は、CD4+CD25−T細胞よりもCD4+CD25+T細胞に対してより強く結合し、CD8+CD25−T細胞よりもCD8+CD25+T細胞に対してより強く結合する。結合におけるこの選択性は、いくつかの他の公知のGITR抗体に対して観測された選択性とは異なる。本明細書において提供されるGITR抗原結合タンパク質に対して観測された差示的な結合が、天然のリガンドであるGITRLに対して見られる差示的な結合に類似することから、この選択性は重要である可能性がある。結合における選択性自体は、他のT細胞のサブセットに対する非特異的結合に伴う望ましくない効果に関する可能性を低減し、GITRLの結合をより近似模倣し得る。

0119

一実施形態において、抗原結合タンパク質はまた、Fc領域がグリコシル化されるようにも選択される。従って、例えば、抗原結合タンパク質は、重鎖がIgG1サブタイプである抗体であってもよい。Fcγ受容体と結合し抗体のクラスタを形成するためには、Fcドメインのグリコシル化が重要である可能性がある。かかるクラスタ化は、特定の抗原結合タンパク質のGITRシグナル伝達を最も効率的に誘発するまたは向上させる能力において重要である可能性がある。

0120

上記のように、GITRアゴニストとしてのそれらの活性に鑑み、提供される抗原結合タンパク質は、多様ながん、免疫障害及び感染症の治療などにおける、対象の免疫反応を誘発するまたは向上させることが望ましい様々な免疫療法において価値を有する。

0121

本明細書に開示の抗原結合タンパク質は種々の更なる効用を有する。抗原結合タンパク質は、例えば、特異的結合アッセイ、GITRの親和性精製、及び他のGITR活性のアゴニストの識別のためのスクリーニングアッセイにおいて有用である。抗原結合タンパク質の他の用途としては、例えば、GITR関連疾患または疾病の診断及びGITRの存在または非存在を判定するためのスクリーニングアッセイが挙げられる。

0122

III.GITR抗原結合タンパク質
本明細書に含まれる実施例は抗体である抗原結合タンパク質について説明するが、本明細書において提供される抗原結合タンパク質は抗体のみに限定されるものではない。一般的に、本明細書において提供される抗原結合タンパク質は、1種のポリペプチドまたは複数種のポリペプチドであって、その中に、本明細書に記載の、1または複数(例えば、1、2、3、4、5若しくは6)の相補性決定領域(CDR)が埋め込まれた及び/または結合したポリペプチドなどのスカフォールドを含む。いくつかの抗原結合タンパク質において、CDRは「フレームワーク領域」内に埋め込まれ、該フレームワーク領域は、CDRの適正な抗原結合特性が獲得されるように、CDRを正しい位置に置く。CDRを埋め込む込むことができるスカフォールドの更なるタイプが更に下記される。

0123

このように、いくつかの抗原結合タンパク質において、CDR配列タンパク質スカフォールドまたは他の生体適合性ポリマー中に埋め込まれる。他の実施形態において、抗原結合タンパク質は抗体であるか、または抗体に由来する。従って、提供される特定の抗原結合の例としては、モノクローナル抗体、二特異性抗体、ミニボディー、ナノボディー(登録商標)などのドメイン抗体、(本明細書において、場合により「抗体模倣物」と称される)合成抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、(場合により「抗体複合体」と称される)抗体融合体、及びそれぞれの一部、すなわちフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの例において、抗原結合タンパク質は、免疫学的に機能性の、完全抗体のフラグメント(例えば、Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv、ドメイン抗体またはミニボディー)である。本明細書において、種々の構造が更に記載及び規定される。

0124

GITRを活性化するそれらの能力があるとすれば、提供される抗原結合タンパク質は、
a.インビトロまたはイン・ビボでのGITRシグナル伝達の誘発または向上、
b.GITRに対する結合に関するGITRLとの交差競合、
c.ヒトCD4細胞中へ内部移行可能であること、
d.制御性T細胞によるエフェクタT細胞活性の抑制の低減、
e.イン・ビトロまたはイン・ビボでの循環制御性T細胞のレベルの減少、
f.イン・ビトロまたはイン・ビボでのエフェクタT細胞の活性化、
g.イン・ビトロまたはイン・ビボでのエフェクタT細胞増殖の誘発または向上、
h.ヒト血清中において少なくとも6日、7日、9日または12日の半減期を有すること、
i.腫瘍の増殖の阻害、及び
j.腫瘍の退行の誘発
の1または複数(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10)の生物学的活性を、任意の組み合わせで発揮することができる。

0125

A.天然に存在する抗体構造を有するGITR抗原結合タンパク質
いくつかの提供される抗原結合タンパク質は、一般的に天然に存在する抗体に伴う構造を有する。これらの抗体の構造単位は、一般的に、それぞれが2の同一のポリペプチド鎖の対からなる、1または複数の4量体を含む。但し、哺乳動物のある種は、単一の重鎖のみを有する抗体を産生することもある。一般的な抗体においては、各ペア、すなわち対は、1の完全長「軽」鎖(特定の実施形態においては約25kDa)及び1の完全長「重」鎖(特定の実施形態においては約50〜70kDa)を含む。それぞれの個々の免疫グロブリン鎖は、いくつかの、それぞれが概略90から110アミノ酸からなり、特徴的な折り畳みパターンを発現する「免疫グロブリンドメイン」から構成される。これらのドメインは、抗体ポリペプチドを構成する基本的な単位である。各連鎖のアミノ末端部分は、一般的に、抗原の認識を担う可変ドメインを含む。本明細書において言及する重鎖由来の可変ドメインは、場合により簡単にVHと称される。同様に、軽鎖由来の可変ドメインはVLと称される。カルボキシ末端部分は連鎖のもう一方の末端よりも進化的により保持され、「定常領域」または「C領域」と称される。ヒト軽鎖は一般的にκ及びλ軽鎖に分類され、これらのそれぞれは1の可変ドメイン及び1の定常ドメインを含む。重鎖は一般的にμ、δ、γ、α、またはε鎖に分類され、これらは当該抗体のアイソタイプを、それぞれIgM、IgD、IgG、IgA、及びIgEと規定する。IgGは、IgG1、IgG2、IgG3、及びIgG4を始めとするいくつかのサブタイプを有するが、これらには限定されない。IgMのサブタイプとしてはIgM、及びIgM2が挙げられる。IgAのサブタイプとしてはIgA1及びIgA2が挙げられる。ヒトにおいては、IgA及びIgDアイソタイプは4の重鎖及び4の軽鎖を含み、IgG及びIgEアイソタイプは2の重鎖及び2の軽鎖を含み、IgMアイソタイプは5の重鎖及び5の軽鎖を含む。重鎖のC領域は一般的に、エフェクタ機能を担うことができる1または複数のドメインを含む。重鎖の定常領域ドメインの数はアイソタイプに依存する。例えば、IgG重鎖はそれぞれ、CH1、CH2及びCH3として知られる3のC領域ドメインを含む。提供される抗体は、任意のこれらのアイソタイプ及びサブタイプを有することができる。特定の実施形態において、GITR抗体はIgG1、IgG2、またはIgG4サブタイプのものである。

0126

完全長軽鎖及び重鎖において、可変領域と定常領域は、約12以上のアミノ酸の「J」領域によって結合され、重鎖も約10以上のアミノ酸の「D」領域を含む。例えば、「基礎免疫学」(Fundamental Immunology)、第2版、第7章(Paul,W.編)1989、ニューヨーク:Raven Press(全ての目的に対して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。)を参照されたい。各軽/重鎖対の可変領域は、一般的に抗原結合部位を形成する。

0127

代表的なGITRモノクローナル抗体のIgG1重鎖定常ドメインの一例は、アミノ酸配列:ASTKGPSVFPLASSSTSGTALGCLVKDYFPPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTEVCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTLHDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*(配列番号442、アスタリスク終止コドンに対応)を有する。

0128

代表的なGITRモノクローナル抗体のλ軽鎖定常ドメインの一例は、アミノ酸配列:QPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFPGAVTVAWKADSSPVKAGVTTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS*(配列番号443、アスタリスクは終止コドンに対応)を有する。

0129

代表的なGITRモノクローナル抗体のκ軽鎖定常ドメインの一例は、アミノ酸配列:TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC*(配列番号444、アスタリスクは終止コドンに対応)を有する。

0130

本明細書において提供される抗体に関して、免疫グロブリン鎖の可変領域は、一般的に、より多くの場合に「相補性決定領域」またはCDRと呼ばれる、3の高度可変領域が結合した、比較的に保持されたフレームワーク領域(FR)を含む、同一の全体としての構造を示す。上述の各重鎖/軽鎖対の2の連鎖由来のCDRは、一般的に、フレームワーク領域によって配列され、GITR上の特定のエピトープに特異的に結合する構造を形成する。N末端からC末端に向けて、天然に存在する軽鎖及び重鎖の可変領域は、両方共に、一般的にこれらの要素の以下の順序:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及びFR4に従う。重鎖由来のCDRは、本明細書において一般的に、CDRH1、CDRH2及びCDRH3と称する。同様に、軽鎖由来のCDRは、一般的に、CDRL1、CDRL2及びCDRL3と称する。番号付けステムは、番号を、これらのドメインのそれぞれにおける位置を占めるアミノ酸に割り当てるように工夫されている。この番号付けシステムは、カバットの免疫学的対象のタンパク質配列(Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest)(1987及び1991年、NIH、メリーランド州ベセスダ)、またはChothia及びLesk、1987、J.Mol.Biol.196:901〜917、Chothiaら、1989、Nature 342:878〜883によって規定される。

0131

実施例に記載したようにして調製された、特定の完全ヒトモノクローナル抗体に関する配列情報を表1にまとめる。この表は、各抗体に対する、6のCDR、重鎖可変ドメイン(VH)、軽鎖可変ドメイン(VL)、完全長重鎖(HC)及び完全長軽鎖(LC)を掲載する。表1は、選択された親抗体、並びにタンパク質工学によって得られた親抗体の遺伝子操作した変異体に関する配列情報を含む。当該配列のアラインメントを図8A、8B、9A、9B、10A、10B、11A及び11Bに示す。

0132

0133

一般的に、提供される抗原結合タンパク質は、表1に掲載の抗体の、1または複数のCDR、1または複数の可変ドメイン、及び/または1または複数の完全長重鎖または軽鎖の配列、並びにかかる配列の変異体または誘導体を含む。

0134

B.GITR抗原結合タンパク質−CDR
例えば、一実施形態において、抗原結合タンパク質は、1または複数のCDRがグラフトした、挿入した及び/または結合したスカフォールドを含む。特定の実施形態において、スカフォールドはポリペプチドである。例えば、CDRは、上述の天然に存在する構造を有する抗体の一部であることができる。更なるスカフォールドの例としては、フィブロネクチンネオカルジノスタチンCBM4−2、リポカリン、タンパク質−Aドメイン(タンパク質Z)、Im9、TPRタンパク質、亜鉛フィンガードメイン、pVIII、GC4、トランスフェリン、及びC型レクチン様ドメインが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において用いることができる更なるスカフォールドが、Gebauer及びSkerra(2009) Curr.Opin.Chem.Biol.、13:245〜255、並びにBinzら(2005) Nat.Biotech. 23:1257〜1268に記載され、それらの文献は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

0135

抗原結合タンパク質は、1、2、3、4、5または6のCDRを有することができる。従って、抗原結合タンパク質は、例えば、表1に掲載のCDR配列より選択された、1の重鎖CDR1(「CDRH1」)、及び/または1の重鎖CDR2(「CDRH2」)、及び/または1の重鎖CDR3(「CDRH3」)、及び/または1の軽鎖CDR1(「CDRL1」)、及び/または1の軽鎖CDR2(「CDRL2」)、及び/または1の軽鎖CDR3(「CDRL3」)を有することができる。

0136

いくつかの抗原結合タンパク質は、それぞれが表1に掲載の同一の抗体由来である、CDRH3とCDRL3との両方を含む。

0137

いくつかの抗原結合タンパク質は、それぞれが、Ab1からAb59の群より選択される任意の単一の抗体の同一の可変軽鎖由来である、CDRL1、CDRL2及びCDRL3を含む。別な実施形態において、抗原結合タンパク質は、それぞれが表1に掲載の同一の抗体由来であるCDRL1、CDRL2及びCDRL3であって、CDRL1、CDRL2及びCDRL3のそれぞれのアミノ酸配列が、当該抗体に対して表1に明記されたものである、CDRL1、CDRL2及びCDRL3を含む。

0138

別な実施形態において、抗原結合タンパク質は、CDRL1、CDRL2及びCDRL3であって、CDRL1、CDRL2及びCDRL3の1または複数の配列が、Ab1からAb59の群より選択される任意の単一の抗体の可変ドメインの対応するCDRL1、CDRL2及びCDRL3と比較して異なり、但し、前記配列の違いは、全体の合計で1、2、3または4を超えないアミノ酸の違いであるとの条件である、CDRL1、CDRL2及びCDRL3を含む。

0139

他の抗原結合タンパク質は、それぞれが、Ab1からAb59の群より選択される任意の単一の抗体の同一の可変重鎖由来であるCDRH1、CDRH2及びCDRH3を含む。別な実施形態において、抗原結合タンパク質は、それぞれが表1に掲載の同一の抗体由来であるCDRH1、CDRH2及びCDRH3であって、CDRH1、CDRH2及びCDRH3のそれぞれのアミノ酸配列が、当該抗体に対して表1に明記されたものである、CDRH1、CDRH2及びCDRH3を含む。

0140

更に別な実施形態において、抗原結合タンパク質は、CDRH1、CDRH2及びCDRH3であって、CDRH1、CDRH2及びCDRH3の1または複数の配列は、Ab1からAb59の群より選択される任意の単一の抗体の可変ドメインの対応するCDRH1、CDRH2及びCDRH3と比較して異なり、但し、前記配列の違いは、全体の合計で1、2、3または4を超えないアミノ酸の違いであるとの条件である、CDRH1、CDRH2及びCDRH3を含む。

0141

更に他の抗原結合タンパク質は、Ab1からAb59の群より選択される任意の単一の抗体の6のCDR全てを含む。更に別な実施形態において、抗原結合タンパク質は、Ab1からAb59の群より選択される任意の単一の抗体に関する6のCDR全てであって、表1に掲載のアミノ酸配列をそれぞれ含む、6のCDR全てを含む。

0142

他の抗原結合タンパク質は、CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2及びCDRH3の1または複数の配列が、Ab1からAb59の群より選択される任意の単一の抗体の対応するCDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2及びCDRH3と比較して異なり、但し、前記配列の違いは、全体の合計で1、2、3、4、5、または6を超えないアミノ酸の違いであるとの条件であること以外は、選択される抗体の6のCDR全てを含む。

0143

C.GITR抗原結合タンパク質−可変ドメイン
Ab1からAb59の群より選択される任意の抗体の軽鎖可変ドメイン(VL)を含む抗原結合タンパク質もまた提供される。別な実施形態において、抗原結合タンパク質は、Ab1からAb59の群より選択される任意の抗体のVLを含み、該VLのアミノ酸配列は表1に指定される通りである。

0144

別な実施形態において、抗原結合タンパク質は、アミノ酸配列が、表1に指定される抗原結合タンパク質Ab1からAb59のいずれか1のVL配列に対して、少なくとも80%、85%、90%、95%、97%または99%同一である変異VL配列を含む。

0145

他の抗原結合タンパク質は、表1に指定される抗原結合タンパク質Ab1からAb59のいずれか1由来のVLのアミノ酸配列と、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10を超えないアミノ酸において異なる変異VL配列を含む。別な態様において、変異VL配列は、1、2、3、4または5を超えないアミノ酸において異なる。

0146

いくつかの抗原結合タンパク質は、Ab1からAb59の群より選択される任意の抗体の重鎖可変ドメイン(VH)を含む。別な実施形態において、抗原結合タンパク質は、表1に指定されるAb1からAb59の群より選択される任意の抗体のVHを含み、該VHのアミノ酸配列は表1に指定される通りである。

0147

別な実施形態において、抗原結合タンパク質は、アミノ酸配列が、抗原結合タンパク質Ab1からAb59のいずれか1のVH配列に対して、少なくとも80%、85%、90%、95%、97%または99%同一である変異VH配列を含む。

0148

他の抗原結合タンパク質は、表1に指定される抗原結合タンパク質Ab1からAb59のいずれか1由来のVHのアミノ酸配列と、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10を超えないアミノ酸において異なる変異VH配列を含む。別な態様において、変異VH配列は、1、2、3、4または5を超えないアミノ酸において異なる。

0149

更に他の抗原結合タンパク質は、それぞれ、Ab1からAb59からなる群より選択される同一の抗体由来のVL及びVHを含む。別な実施形態において、抗原結合タンパク質は、Ab1からAb59からなる群より選択される同一の抗体由来のVL及びVHを含み、該VL及びVHのアミノ酸配列は表1に指定される通りである。

0150

別な態様において、抗原結合タンパク質は、それぞれ、Ab1からAb59の群より選択される同一の抗体由来のVL及びVHを含み、該VL及びVHの一方または両方のアミノ酸配列が、それぞれ、抗原結合タンパク質Ab1からAb59のいずれか1のVLまたはVH配列に対して、少なくとも80%、85%、90%、95%、97%または99%同一である。

0151

いくつかの抗原結合タンパク質は変異VL及び/または変異VHを含み、変異VL及び変異VHの一方または両方が、それぞれ、抗原結合タンパク質Ab1からAb59の群より選択される任意の単一の抗体のVLまたはVH配列と異なり、但し、VHまたはVLにおける配列の違いは、全体の合計で1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10を超えないアミノ酸であるとの条件である。別な実施形態において、違いは、全体の合計で1、2、3、4または5を超えないアミノ酸である。

0152

更に別な実施形態において、抗原結合タンパク質は、Ab1からAb59の群より選択される同一の抗体由来のVH及びVL、但し、VH及び/またはVL配列のN末端より1、2、3または4のアミノ酸が失われているVH及びVLを含む。かかる変化は、例えば、発現または貯蔵の間の開裂に起因して起こり得る。

0153

D.GITR抗原結合タンパク質−完全長配列
表1に指定されるいずれか1の抗体の完全長重鎖のアミノ酸配列を含む完全長重鎖を含む抗原結合タンパク質もまた提供される。

0154

他の抗原結合タンパク質は、表1に指定されるいずれか1の抗体の完全長軽鎖のアミノ酸配列を含む完全長軽鎖を含む。

0155

従って、一実施形態において、抗原結合タンパク質は抗体であり、完全長重鎖及び完全長軽鎖を含み、それぞれは表1に掲載の同一の抗体より得られる。別な実施形態において、抗体は2の同一の軽鎖及び2の同一の重鎖を含み、それぞれは表1に掲載の同一の抗体より得られる。

0156

更に他の抗原結合タンパク質は、表1に示される任意の単一の抗体の変異体であって、当該変異体抗体の完全長軽鎖及び/または完全長重鎖が、表1に掲載の対応する抗体の軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列と、少なくとも80%、85%、90%、95%、97%または99%同一であるアミノ酸配列を有する変異体である。従って、一実施形態において、抗原結合タンパク質は、表1に掲載の抗体の軽鎖のアミノ酸配列と、少なくとも80%、85%、90%、95%、97%または99%同一であるアミノ酸配列を有する完全長軽鎖を含む。別な態様において、抗原結合タンパク質は、表1に掲載の抗体の重鎖のアミノ酸配列と、少なくとも80%、85%、90%、95%、97%または99%同一であるアミノ酸配列を有する完全長重鎖を含む。

0157

表1に掲載の単一の抗体に対して掲載される完全長軽鎖及び完全長重鎖、但し、一方または両方の連鎖の配列が、表1に指定される対応する配列と、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14または15を超えないアミノ酸残基において異なる完全長軽鎖及び完全長重鎖を含む、表1に示される抗体の他の変異体が提供される。

0158

更に別の態様において、表1に掲載のCDR、可変ドメイン及び/または完全長配列を含む抗原結合タンパク質は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、多重特異性抗体、またはの抗体フラグメントである。別な実施形態において、本明細書において提供される単離された抗原結合タンパク質の抗体フラグメントは、表1に掲載の配列を有する抗体に基づく、Fabフラグメント、Fab’フラグメント、F(ab’)2フラグメント、Fvフラグメント、二特異性抗体、または一本鎖抗体分子である。

0159

更なる実施形態において、本明細書において提供される単離された抗原結合タンパク質は、表1に示される配列を有するヒト抗体であり、IgG1型、IgG2型、IgG3型またはIgG4型のヒト抗体である。特定の実施形態において、抗体はIgG1型である。

0160

特定の抗原結合タンパク質は、表1のAb1からAb59の群より選択される任意の単一の抗体に対して指定される、CDR、可変ドメイン及び/または完全長配列を含み、更に、
(a)KDが≦300nM、≦150nM、≦100nM、≦75nM、≦50nM、≦10nM、≦5nM、≦2nM、または≦1nMであるように、ヒトGITRに結合すること、
(b)少なくとも6日、7日、9日、または12日のヒト血清中での半減期を有すること、
(c)配列番号1のヒトGITR及び配列番号2のカニクイザルGITRに結合すること、
(c)KD≦10nMで配列番号1のヒトGITRに結合し、KD≦500nMで配列番号2のカニクイザルGITRに結合すること、
(d)配列番号1のヒトGITR及び配列番号2のカニクイザルGITRに結合するが、配列番号3のマウスGITRには結合しないこと
の特性の1または複数を有することを特徴とする。

0161

いくつかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、例えば、後記する実施例に記載のようにして測定した、少なくとも104/M・秒、少なくとも105/M・秒、または少なくとも106/M・秒のGITRに対する結合速度(ka)を有する。提供される特定の抗原結合タンパク質は、緩慢解離速度、すなわちoff−rateを有する。いくつかの抗原結合タンパク質は、例えば、1×10−2s−1、または1×10−3s−1、または1×10−4s−1、または1×10−5s−1のkd(解離速度)を有する。特定の実施形態において、抗原結合タンパク質は、25pM、50pM、100pM、500pM、1nM、5nM、10nM、25nMまたは50nM未満のKD(平衡結合親和性)を有する。

0162

別な態様において、イン・ビトロまたはイン・ビボ(例えば、ヒト対象に投与された場合)での少なくとも1日の半減期を有する抗原結合タンパク質が提供される。一実施形態において、抗原結合タンパク質は、少なくとも3日の半減期を有する。他の様々な実施形態において、抗原結合タンパク質は、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、15日、20日、25日、30日、40日、50日、または60日以上の半減期を有する。別な実施形態において、抗原結合タンパク質は、未誘導体化または未修飾の抗体に比較して、より長い半減期を有するように誘導体化または修飾される。別な実施形態において、抗原結合タンパク質は、血清半減期を増加させる点変異を含む。かかる変異形態または誘導体化された形態に関する更なる詳細は後に述べる。

0163

E.GITR抗原結合タンパク質−コンセンサス配列
更に別な態様において、本明細書に開示の関係する抗体の群に由来するコンセンサスアミノ酸配列を有するCDRを含む抗原結合タンパク質が提供される。本明細書において「コンセンサス配列」とは、多数の配列の中で共通の保存アミノ酸及び所与の一連のアミノ酸配列の範囲内で変化する可変アミノ酸を有するアミノ酸配列をいう。提供されるCDRコンセンサス配列としては、各CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2及びCDRL3のそれぞれに対応するCDRが挙げられる。

0164

一実施形態において、コンセンサス配列は、表1及び図にまとめたAb1〜8、Ab11〜14及びAb18〜19のCDRに由来する。

0165

従って、一実施形態において、抗原結合タンパク質は、それ自体がCDRH1、CDRH2及びCDRH3を含むVHであって、
CDRH1が配列X1YGMX2(配列番号436)、但し、X1はSまたはN、X2はHまたはYである、を含み、
CDRH2が配列VIWYX1GSNKYYADSVX2G(配列番号437)、但し、X1はE、V、A、P、X2はKまたはRである、を含み、
CDRH3が配列GGX1LX2X3X4YYX5GMDV(配列番号438)、但し、X1はQ、L、E、またはRであり、X2はG、R、またはSであり、X3はK、Y、L、F、またはRであり、X4はYまたはDであり、X5はYまたはSである、を含む、
VHを含む。

0166

別な実施形態において、抗原結合タンパク質は、それ自体がCDRL1、CDRL2及びCDRL3を含むVLであって、
CDRL1が配列RASQX1IRNDLG(配列番号439)、但し、X1はGまたはVである、を含み、
CDRL2が配列X1X2SX3LQS(配列番号440)、但し、X1はAまたはDであり、X2はAまたはTであり、X3はSまたはTである、を含み、
CDRL3が配列X1QX2X3X4YPX5T(配列番号441)、但し、X1はLまたはQであり、X2はHまたはLであり、X3はNまたはHであり、X4はS、NまたはTであり、X5はW、LまたはIである、を含む、
VLを含む。

0167

更に別な実施形態において、抗原結合タンパク質は、VH及びVLであって、各々が上述のコンセンサスCDR配列をそれぞれ有するVH及びVLを含む。

0168

F.競合抗原結合タンパク質
別な実施形態において、GITR(例えば、配列番号1のヒトGITR)への特異的結合に関して、例示した抗体または上述の機能性フラグメントの1と競合する抗原結合タンパク質が提供される。かかる抗原結合タンパク質は、本明細書に記載の抗原結合タンパク質のエピトープと同一のエピトープまたはオーバーラップエピトープに結合してもよい。例示した抗原結合タンパク質と競合する抗原結合タンパク質及びフラグメントは、同様の機能特性を示すことが期待される。例示した抗原結合タンパク質及びフラグメントとしては、表1に含まれる重鎖及び軽鎖、可変領域ドメイン及びCDRを有するものを始めとする、上述のものが挙げられる。従って、特定の例として、提供される抗原結合タンパク質としては、
(a)表1に掲載される同一の抗体に対して掲載されるCDRの6種全て、
(b)表1に掲載される同一の抗体に対して掲載されるVH及びVL、または
(c)表1に掲載される同一の抗体に対して指定される2の軽鎖及び2の重鎖
を有する抗体と競合する抗原結合タンパク質が挙げられる。

0169

ある実施形態において、競合はBIAcoreアッセイによって測定される。

0170

G.モノクローナル抗体
提供される抗原結合タンパク質としては、GITRに結合するモノクローナル抗体が挙げられる。モノクローナル抗体は、任意の本技術分野で公知の技法、例えば、免疫スケジュール完了後の遺伝子導入動物より採取された脾臓細胞不死化することによって作製することができる。脾臓細胞は、任意の本技術分野で公知の技法、例えば、脾臓細胞を骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマを作製することによって不死化することができる。ハイブリドーマを作製する融合手法に用いられる骨髄腫細胞は、抗体を産生せず、高い融合効率及び所望の融合細胞(ハイブリドーマ)のみの増殖を維持する特定の選択的培地中で当該細胞が増殖する能力を失わせる酵素欠損を有することが好ましい。マウス融合に用いるための好適な細胞株の例としては、Sp−20、P3−X63/Ag8、P3−X63−Ag8.653、NS1/1.Ag 4 1、Sp210−Ag14、FO、NSO/U、MPC−11、MPC11−X45−GTG 1.7及びS194/5XXO Bulが挙げられ、ラット融合に用いるための好適な細胞株の例としては、R210.RCY3、Y3−Ag 1.2.3、IR983F及び4B210が挙げられる。細胞融合に有用な他の細胞株は、U−266、GM1500−GRG2、LICR−LON−HMy2及びUC729−6である。

0171

いくつかの例において、ハイブリドーマ細胞株は、GITRタンパク質免疫原を有する動物(例えば、ヒト免疫グロブリン配列を有する遺伝子導入動物)を免疫化すること、免疫化した動物より脾臓細胞を採取すること、採取した脾臓細胞を骨髄腫細胞株に融合し、それによってハイブリドーマ細胞を生起させること、ハイブリドーマ細胞よりハイブリドーマ細胞株を確立すること、及びGITRポリペプチドと結合する抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を識別することによって作製される。かかるハイブリドーマ細胞株、及び該細胞株によって産生される抗GITRモノクローナル抗体は本願の態様である。

0172

ハイブリドーマ細胞株により分泌されるモノクローナル抗体は、本技術分野において公知の任意の技法を用いて精製することができる。ハイブリドーマまたはmAbを更にスクリーニングにかけて、GITR活性を誘発するまたは向上させる能力などの特定の特性を有するmAbを識別してもよい。かかるスクリーニングの例が、後記される実施例に示される。

0173

H.キメラ抗体及びヒト化抗体
上述の配列に基づくキメラ抗体及びヒト化抗体もまた提供される。治療薬として用いるためのモノクローナル抗体を、使用の前に種々の方法で修飾してもよい。一例はキメラ抗体であり、該キメラ抗体は、共有結合して機能性免疫グロブリン軽鎖若しくは重鎖またはそれらの免疫学的に機能性の部分を生成する、別個の抗体由来のタンパク質セグメントから構成される。一般的に、重鎖及び/または軽鎖の部分は、特定の種に由来する、または特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一であるかまたは相同である一方、連鎖の残部は、別の種に由来する、または別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一であるかあるいは相同である。キメラ抗体に関係する方法に関しては、例えば、米国特許第4,816,567号、及びMorrisonら、1985、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851〜6855を参照されたく、これらは参照により本明細書に組み込まれる。CDRグラフト化が、例えば、米国特許第6,180,370号、第5,693,762号、第5,693,761号、第5,585,089号、及び第5,530,101号に記載される。

0174

一般的に、キメラ抗体を作製する目的は、意図する患者種由来のアミノ酸の数が最大化されたキメラ体創出することにある。一例は「CDRグラフト化」抗体であり、該CDRグラフト化抗体においては、当該抗体が、1または複数の、特定の種に由来する、または特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する相同性決定領域(CDR)を含む一方、抗体鎖の残部は、別の種に由来する、または別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一であるかあるいは相同である。ヒトにおいて使用するためには、多くの場合、齧歯動物抗体由来の可変領域または選択したCDRがヒト抗体中にグラフト化され、当該ヒト抗体の天然に存在する可変領域またはCDRを置換する。

0175

キメラ抗体の一つの有用なタイプは「ヒト化」抗体である。一般的に、ヒト化抗体は、最初に非ヒト動物において生起させたモノクローナル抗体より作製される。このモノクローナル抗体中の、一般的には当該抗体の非抗原認識部分由来である、特定のアミノ酸残基が、対応するアイソタイプのヒト抗体中の対応する残基に相同となるように修飾される。ヒト化は、例えば、齧歯動物の可変領域の少なくとも一部をもってヒト抗体の対応する領域に代えることによる、種々の方法を用いて実施することができる(例えば、米国特許第5,585,089号、及び第5,693,762号、Jonesら、1986、Nature 321:522〜525、Riechmannら、1988、Nature 332:323〜27、Verhoeyenら、1988、Science 239:1534〜1536を参照のこと。)。

0176

一態様において、本明細書において提供される抗体の軽鎖及び重鎖可変領域のCDR(表1を参照のこと)が、同一または別個の系統発生学的な種由来の抗体に由来するフレームワーク領域(FR)にグラフト化される。コンセンサスヒトFRを創出するためには、いくつかのヒト重鎖または軽鎖アミノ酸配列由来のFRについてアラインメントを行い、コンセンサスアミノ酸配列を識別してもよい。他の実施形態において、本明細書に開示の重鎖または軽鎖のFRが、別個の重鎖または軽鎖由来のFRによって置換される。一態様において、GITR抗体の重鎖及び軽鎖のFR中の希アミノ酸は置換されない一方、当該FRの残余のアミノ酸は置換される。「希アミノ酸」とは、FR中において、当該特定のアミノ酸が通常存在しない位置に存在する特定のアミノ酸である。あるいは、1の重鎖または軽鎖由来のグラフト化された可変領域を、本明細書に開示の特定の重鎖または軽鎖の定常領域とは異なる定常領域と共に用いてもよい。他の実施形態において、グラフト化可変領域は一本鎖Fv抗体の一部である。

0177

特定の実施形態において、ヒト以外の種由来の定常領域を、ヒト可変領域と共に用いて、ハイブリッド抗体を産生することができる。

0178

完全ヒト抗体
完全ヒトGITR抗体もまた提供される。所与の抗原に対して特異的な完全ヒト抗体を、人間を当該抗原(完全ヒト抗体)に曝露することなく産生する方法が利用可能である。完全ヒト抗体の産生を実行するために提供される一つの具体的な手段は、マウス体液性免疫系の「ヒト化」である。内在性免疫グロブリン(Ig)遺伝子が不活性化されているマウスへのヒトIg遺伝子座の導入が、任意の所望の抗原を用いて免疫化することができる動物である、マウスにおける完全ヒトモノクローナル抗体(mAb)を産生する一手段である。完全ヒト抗体を用いることで、マウスmAbまたはマウス由来のmAbを治療薬としてヒトに投与することによって場合により引き起こされ得る免疫原性反応及びアレルギー性反応を低減することができる。

0179

完全ヒト抗体は、内在性免疫グロブリンの産生がない状態で、あるレパートリのヒト抗体を産生する能力を有する遺伝子導入動物(通常はマウス)を免疫化することによって産生することができる。この目的のための抗原は、一般的には6以上の連続したアミノ酸であり、任意選択でハプテンなどの担体に抱合している。例えば、Jakobovitsら、1993、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2551〜2555、Jakobovitsら、1993、Nature 362:255〜258及びBruggermannら、1993、Year in Immunol.7:33を参照されたい。かかる方法の一例において、マウスにおける、マウス重及び軽免疫グロブリン鎖をコードする内在性マウス免疫グロブリン遺伝子座を無能力化し、ヒト重鎖及び軽鎖タンパク質をコードする遺伝子座を含むヒトゲノムDNAの大きなフラグメントをマウスゲノム中に挿入することによって、遺伝子導入動物が作製される。次いで、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の完全補体未満を有する、部分的に改変された動物が異種交配され、所望の免疫系の改変の全てを有する動物を得る。免疫原が投与されると、これらの遺伝子導入動物は、当該免疫原に対して免疫特異性であるが、可変領域を含む、マウスではなくヒトのアミノ酸配列を有する抗体を産生する。かかる方法の更なる詳細に関しては、例えば、WO96/33735及びWO94/02602を参照されたい。ヒト抗体を産生するための遺伝子導入マウスに関係する更なる方法が、米国特許第5,545,807号、第6,713,610号、第6,673,986号、第6,162,963号、第5,545,807号、第6,300,129号、第6,255,458号、第5,877,397号、第5,874,299号及び第5,545,806号、PCT公開WO91/10741、WO90/04036、並びにEP546073B1及びEP546073A1に記載される。

0180

本明細書において「HuMab」マウスと称する遺伝子導入マウスは、未再配列のヒト重鎖([μ]及び[γ])並びに[κ]軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子のミニ座を、内在性[μ]及び[κ]連鎖遺伝子座を不活性化する標的突然変異体と共に含む(Lonbergら、1994、Nature 368:856〜859)。従って、マウスは、免疫化に応答してマウスIgGまたは[κ]の発現の低下を示し、導入したヒト重鎖及び軽鎖導入遺伝子がクラススィッチ及び体細胞突然変異を起こして、高親和性ヒトIgG[κ]モノクローナル抗体を生起する(Lonbergら、前掲、Lonberg及びHuszar、1995、Intern.Rev.Immunol.13:65〜93、Harding及びLonberg、1995、Ann.N.Y Acad.Sci.764:536〜546)。HuMabマウスの調製は、Taylorら、1992、Nucleic AcidsResearch 20:6287〜6295、Chenら、1993、International Immunology 5:647〜656、Tuaillonら、1994、J.Immunol 152:2912〜2920、Lonbergら、1994、Nature 368:856〜859、Lonberg、1994、Handbook of Exp.Pharmacology 113:49〜101、Taylorら、1994、International Immunology 6:579〜591、Lonberg及びHuszar、1995、Intern.Rev.Immunol.13:65〜93、Harding及びLonberg、1995、Ann.N.Y Acad.Sci.764:536〜546、Fishwildら、1996、Nature Biotechnology 14:845〜851に詳細が記載され、上述の参照文献は、全ての目的に対して、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。更に、米国特許第5,545,806号、第5,569,825号、第5,625,126号、第5,633,425号、第5,789,650号、第5,877,397号、第5,661,016号、第5,814,318号、第5,874,299号、及び第5,770,429号、並びに米国特許第5,545,807号、国際公開第WO93/1227号、第WO92/22646号、及び第WO92/03918号を参照されたく、それらの全ての開示は、全ての目的に対して、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。これらの遺伝子導入マウスにおけるヒト抗体の産生に利用される技術は、WO98/24893、及びMendezら、1997、Nature Genetics 15:146〜156にも開示され、これらは参照により本明細書に組み込まれる。例えば、HCo7及びHCo12マウス系統を用いて、抗GITR抗体を生起させることができる。遺伝子導入マウスを用いたヒト抗体の産生に関する更なる詳細が、後記する実施例に示される。

0181

ハイブリドーマ技術を用いて、所望の特異性を有する抗原特異性ヒトmAbを、のような遺伝子導入マウスから産生させ、選択することができる。かかる抗体を、適宜のベクター及び宿主細胞を用いてクローン化する及び発現させてもよく、または該抗体を培養したハイブリドーマ細胞より採取することができる。

0182

完全ヒト抗体は、(Hoogenboomら、1991、J.Mol.Biol.227:381、及びMarksら、1991、J.Mol.Biol.222:581に開示されるように)ファージ提示ライブラリ由来とすることもできる。ファージ提示技法は、糸状バクテリオファージの表面上への抗体レパートリの提示、及びそれに続くそれらの最適な抗体への結合によるファージの選択によって免疫選択を模倣する。かかる技法の一つがPCT公開第WO99/10494号(参照により本明細書に組み込まれる)に記載される。

0183

表1は、本明細書において提供されるものなどの、多数の完全ヒト抗原結合タンパク質に関する配列情報を含む。

0184

J.二特異性または2官能性抗原結合タンパク質
上述のように、提供される抗原結合タンパク質としては、1若しくは複数のCDRまたは1若しくは複数の可変領域を含む二特異性及び2官能性抗体も挙げられる。いくつかの例における二特異性または2官能性抗体は、2の別個の重/軽鎖対及び2の別個の結合部位を有する人工的なハイブリッド抗体である。二特異性抗体は、ハイブリドーマの融合またはFab’フラグメントの結合を始めとする、但しこれらに限定されない、種々の方法によって産生することができる。例えば、Songsivilai及びLachmann、1990、Clin.Exp.Immunol.79:315〜321、Kostelnyら、1992、J.Immunol.148:1547〜1553を参照されたい。

0185

K.変異体
一実施形態において、例えば、抗原結合タンパク質は開示した抗原結合タンパク質(例えば、表1に掲載の配列を有するもの)の変異体形態である。例えば、いくつかの抗原結合タンパク質は、表1に掲載の、1若しくは複数の重鎖または軽鎖、可変領域またはCDRにおいて、1または複数の保存的アミノ酸置換を有する。

0186

天然に存在するアミノ酸は、共通の側鎖の特性に基づいてクラスに分けられる場合がある。すなわち、
1)疎水性ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile、
2)中性親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln、
3)酸性:Asp、Glu、
4)塩基性:His、Lys、Arg、
5)連鎖の配向に影響する残基:Gly、Pro、及び
6)芳香族:Trp、Tyr、Phe
である。

0187

保存的アミノ酸置換は、これらのクラスの1のメンバーの、同一のクラスの別なメンバーとの交換を含んでもよい。保存的アミノ酸置換は天然に存在しないアミノ酸残基を包含し、該アミノ酸は一般的に、生物学的系における合成によるのではなく、化学的ペプチド合成によって組み込まれる。これらはペプチド疑似体及び他の逆転または逆位の形態のアミノ酸部分を含む。

0188

保存的置換は、これらのクラスの1のメンバーの、別なクラスのメンバーとの交換を含んでもよい。かかる置換された残基は、ヒト抗体と相同である抗体の領域中に導入されてもよく、または当該分子の非相同である領域中に導入されてもよい。

0189

かかる変更を行う場合には、特定の実施形態によれば、アミノ酸の疎水性指標を考慮することができる。タンパク質の疎水性プロファイルは、各アミノ酸に数値(「疎水性指標」)を割り当て、次いでペプチド鎖に沿ってこれらの値を繰り返し平均することによって計算される。各アミノ酸に、その疎水性及び電荷特性に基づいて疎水性指標が割り当てられている。これらは、イソロイシン(+4.5)、バリン(+4.2)、ロイシン(+3.8)、フェニルアラニン(+2.8)、システイン/シスチン(+2.5)、メチオニン(+1.9)、アラニン(+1.8)、グリシン(−0.4)、スレオニン(−0.7)、セリン(−0.8)、トリプトファン(−0.9)、チロシン(−1.3)、プロリン(−1.6)、ヒスチジン(−3.2)、グルタメート(−3.5)、グルタミン(−3.5)、アスパルテート(−3.5)、アスパラギン(−3.5)、リシン(−3.9)、及びアルギニン(−4.5)である。

0190

本技術分野において、タンパク質への相互作用上の生物学的機能の付与における疎水性プロフィルの重要性が判っている(例えば、Kyteら、1982、J.Mol.Biol. 157:105〜131を参照のこと)。特定のアミノ酸を類似の疎水性指標またはスコアを有する他のアミノ酸で置換し、それでも類似の生物学的活性を保持し得ることが知られている。疎水性指標に基づいて変更を行う場合、特定の実施形態において、それらの疎水性指標が±2以内であるアミノ酸の置換が含まれる。いくつかの態様において、±1以内であるものが含まれ、他の態様において、±0.5以内であるものが含まれる。

0191

本技術分野において、類似のアミノ酸の置換は、特に本件の場合のように、該置換によって創出される生物学的に機能性のタンパク質またはペプチドが、免疫学的な実施形態における使用を意図する場合に、親水性に基づくことで効率的に行うことができることも判っている。特定の実施形態において、その近隣のアミノ酸の親水性によって支配されるタンパク質の最大局所平均親水性は、当該タンパク質の免疫原性及び抗原との結合または免疫原性と、すなわち、当該タンパク質の生物学的特性相関性がある。

0192

以下の親水性の値がこれらのアミノ酸残基に割り当てられている。すなわち、アルギニン(+3.0)、リシン(+3.0)、アスパルテート(+3.0±1)、グルタメート(+3.0±1)、セリン(+0.3)、アスパラギン(+0.2)、グルタミン(+0.2)、グリシン(0)、スレオニン(−0.4)、プロリン(−0.5±1)、アラニン(−0.5)、ヒスチジン(−0.5)、システイン(−1.0)、メチオニン(−1.3)、バリン(−1.5)、ロイシン(−1.8)、イソロイシン(−1.8)、チロシン(−2.3)、フェニルアラニン(−2.5)及びトリプトファン(−3.4)である。類似の親水性値に基づいて変更を行う場合、特定の実施形態において、それらの親水性値が±2以内であるアミノ酸の置換が含まれ、他の実施形態において、±1以内であるものが含まれ、更に他の実施形態において、±0.5以内であるものが含まれる。いくつかの例において、一次アミノ酸配列から、親水性に基づいてエピトープを識別することもできる。これらの領域はまた、「エピトープ中核領域」ともいう。

0193

代表的な保存的アミノ酸置換が表2に示される。

0194

0195

当業者は、周知の技法を用いて、本明細書に示す好適なポリペプチドの変異体を特定することが可能となる。当業者は、活性に対して重要ではないと考えられる領域を標的とすることにより、活性を破壊することなく、変更してもよい分子の好適な領域を識別することができる。当業者はまた、類似のポリペプチドの中で、温存される分子の残基及び部分を識別することが可能となる。更なる実施形態において、生物学的活性に対してまたは構造に対して重要であり得る領域でさえも、生物学的活性を破壊することなく、または当該ポリペプチド構造に悪影響を与えることなく、保存的アミノ酸置換に供することができる。

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