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技術 オリゴヌクレオチド−リガンドコンジュゲートおよびそれらの調製方法

出願人 アルニラムファーマスーティカルズインコーポレイテッド
発明者 マノハラン,ムシアナイール,ジャヤプラカシュケイカンダサミィ,パチャムスマツダ,シゲオケリン,アレクサンダーヴィージャヤラマン,ムスサミィラジーフ,カランソタッチルジー
出願日 2014年7月11日 (6年4ヶ月経過) 出願番号 2016-525825
公開日 2016年9月23日 (4年2ヶ月経過) 公開番号 2016-529230
状態 特許登録済
技術分野 他の有機化合物及び無機化合物含有医薬 糖類化合物 化合物または医薬の治療活性 突然変異または遺伝子工学 蛋白脂質酵素含有:その他の医薬 医薬品製剤
主要キーワード 切断環 フシトール 不飽和領域 参照条件 参照文 上清層 レボグルコサン ジギタロース
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2016年9月23日)のものです。
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図面 (14)

課題・解決手段

本発明は、オリゴヌクレオチド(例えば、iRNA剤)のリガンドコンジュゲートおよびそれらの調製方法に関する。これらのリガンドは、主に、単糖由来する。これらのコンジュゲートは、オリゴヌクレオチドのインビボでの送達に有用である。

概要

背景

インビボでの細胞への効率的な送達は、特異的標的化および細胞外環境、特に、血清タンパク質からの実質的な保護を必要とする。特異的標的化を行う一方法は、標的化部分をiRNA剤コンジュゲートすることである。標的化部分は、iRNA剤を所要標的部位に標的化するのに役立つ。標的化部分が送達を向上させ得る一方法は、受容体を介したエンドサイトーシス活性によるものである。この取り込み機構は、膜構造陥入または細胞膜による送達系の融合による、膜によって包まれる領域の内部への、膜受容体に結合されたiRNA剤の移動を含む。このプロセスは、受容体への特異的リガンドの結合の後、細胞表面または膜受容体の活性化によって開始される。ガラクトースマンノース、マンノース−6−リン酸などの糖、ペプチドならびにトランスフェリンアシアロ糖タンパク質ビタミンB12、インスリンおよび上皮成長因子(EGF)などのタンパク質を認識するものを含む、多くの受容体を介したエンドサイトーシス系が公知であり、研究されている。アシアロ糖タンパク質受容体(ASGP−R)は、肝細胞に非常に多く存在する高容量受容体(high capacity receptor)である。ASGP−Rは、N−アセチル−D−ガラクトシルアミン(GalNAc)に対してD−Galより50倍高い親和性を示す。過去の研究により、nM親和性を得るのに多価が必要とされる一方、糖間の間隔も重要であることが示されている。

最近、特定の糖質コンジュゲートが、siRNA送達のためのリポソームの代わりに有益な送達であることが示された。

概要

本発明は、オリゴヌクレオチド(例えば、iRNA剤)のリガンドコンジュゲートおよびそれらの調製方法に関する。これらのリガンドは、主に、単糖由来する。これらのコンジュゲートは、オリゴヌクレオチドのインビボでの送達に有用である。

目的

特異的標的化を行う一方法は、標的化部分をiRNA剤にコンジュゲートすることである

効果

実績

技術文献被引用数
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請求項1

コンジュゲートにおいて、式I:(式中、前記オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドであり;前記生物学的に活性物質が、任意の生物学的に活性な物質であり;前記リンカーが、前記リガンドと前記オリゴヌクレオチドまたは他の生物学的に活性な物質との間の連結基であり;および前記リガンドが、糖に由来し、ここで、(i)前記リガンドが、前記リンカー中の同じかまたは異なる原子に結合されてもよく、かつ(ii)前記コンジュゲートが、1〜12個のリガンドを含有し、少なくとも1個のリンカーが、表1(ここで、DMTr基が、除去され、かつ隣接する酸素原子が、前記オリゴヌクレオチドまたは他の生物学的に活性な物質への前記リンカーの結合部位である)または表1Aから選択され、および/または少なくとも1個のリガンドが、(a)表2または2A中のリガンド、(b)−R2−(R3)k(ここで、R2が、存在しないか、またはR3基のための2つ以上の結合部位を有するスペーサであり、R3が、表3から選択される標的化モノマーであり、かつnが、1〜5(好ましくは、1〜3)であり、各R3が、R2中の同じかまたは異なる原子に結合されてもよく、kが、1〜6である)、(c)前記リガンドが、以下の構造(式中、矢印が、前記オリゴヌクレオチドコンジュゲートへの結合点を示し(すなわち、前記リガンドは、そのカルボニル基を介して結合される);R6が、HまたはAcであり;R7が、−OHまたは−NHR9であり;R8が、AcまたはR9であり、ここで、R7およびR8のうちの少なくとも1つが、窒素含有部分であり;R9が、であり;Q1が、H、C1〜C4アルキル、であり;Q2が、HまたはC1〜C4アルキルであり;Xが、HまたはMeであり;Yが、H、Ac、またはCOCF3であり;およびnが、1〜8(例えば、1〜4)である)のうちの1つを有し、および(d)表4または4A中のリガンドから選択される)で表されることを特徴とするコンジュゲート。

請求項2

前記オリゴヌクレオチドが、(i)前記オリゴヌクレオチドの3’または5’末端、(ii)位置に関係なく前記オリゴヌクレオチド中に存在するヌクレオシドの1つ以上の糖部分、または(iii)位置に関係なく存在する前記ヌクレオシドの1つ以上の塩基部分を介して、前記リンカーに結合されることを特徴とする請求項1に記載のコンジュゲート。

請求項3

オリゴヌクレオチドコンジュゲートにおいて、オリゴヌクレオチド中の少なくとも1個のヌクレオシドが、糖質含有リガンドにコンジュゲートされ、前記コンジュゲートされたヌクレオシドが、式:(式中、5’および3’末端がそれぞれ、前記オリゴヌクレオチドの別のヌクレオシドまたは末端に結合され;R6が核酸塩基であり、かつ任意選択的に、前記核酸塩基に結合された窒素含有部分を有し;R7がリンカーであり、ここで、R7が、R6中の窒素原子に結合され;および各R8が、独立して、請求項1に記載の−R2−R3から選択されるリガンドまたは請求項1に記載の表2、2A、4、もしくは4Aからのリガンドであり、かつ各R8が、前記リンカーR7中の同じかまたは異なる原子に結合されてもよい)で表されることを特徴とするオリゴヌクレオチドコンジュゲート。

請求項4

R6が、ウラシルであって、その5位においてアミド基−C(O)NH−で置換されるウラシルであり、ここで、R7が、前記アミド基の窒素原子を介してR6に結合されることを特徴とする請求項3に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。

請求項5

R6が、シトシンであって、その5位においてアミド基−C(O)NH−で置換されるシトシンであり、ここで、R7が、前記アミド基の窒素原子を介してR6に結合されることを特徴とする請求項3に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。

請求項6

オリゴヌクレオチドコンジュゲートにおいて、オリゴヌクレオチド中の少なくとも1個のヌクレオシドが、その2’位において糖質含有リガンドにコンジュゲートされ、前記コンジュゲートされたヌクレオシドが、式:(式中、5’および3’末端がそれぞれ、前記オリゴヌクレオチドの別のヌクレオシドまたは末端に結合され;R6が核酸塩基であり;R7がリンカーであり;各R8が、独立して、請求項1に記載の−R2−R3から選択されるリガンドまたは請求項1に記載の表2、2A、4、もしくは4Aからのリガンドであり、かつ各R8が、前記リンカーR7中の同じかまたは異なる原子に結合されてもよい)で表されることを特徴とするオリゴヌクレオチドコンジュゲート。

請求項7

前記オリゴヌクレオチドが、ホスフェートホスホロチオエート、またはそれらの組合せを介して前記リンカーに結合されることを特徴とする請求項3〜6のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。

請求項8

コンジュゲートにおいて、式I:(式中、前記オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドであり;前記生物学的に活性な物質が、任意の生物学的に活性な物質であり;前記リンカーが、表1または表1Aから選択され;前記コンジュゲートが、1〜12個のリガンドを含有し;および各リガンドが、1〜6個の標的化モノマーを含む)で表されることを特徴とするコンジュゲート。

請求項9

前記リガンドが肝臓を標的にすることを特徴とする請求項8に記載のコンジュゲート。

請求項10

前記リガンドがASGPRを標的にすることを特徴とする請求項8または9に記載のコンジュゲート。

請求項11

各リガンドが糖含有基を含むことを特徴とする請求項8〜10のいずれか一項に記載のコンジュゲート。

請求項12

コンジュゲートにおいて、式I:(式中、前記オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドであり;前記生物学的に活性な物質が、任意の生物学的に活性な物質であり;前記リンカーが、化学基であって、それを介して前記リガンドが前記オリゴヌクレオチドまたは他の生物学的に活性な物質に結合される化学基であり;前記コンジュゲートが、1〜12個のリガンドを含有し、ここで、前記リガンドが、前記リンカー中の同じかまたは異なる原子に結合されてもよく;および各リガンドが、表2、2A、4、または4Aから選択される)で表されることを特徴とするコンジュゲート。

請求項13

コンジュゲートにおいて、式I:(式中、前記オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドであり;前記生物学的に活性な物質が、任意の生物学的に活性な物質であり;前記リンカーが、化学基であって、それを介して前記リガンドが前記オリゴヌクレオチドまたは他の生物学的に活性な物質に結合される化学基であり;前記コンジュゲートが、1〜12個のリガンドを含有し、ここで、前記リガンドが、前記リンカー中の同じかまたは異なる原子に結合されてもよく;および各リガンドが、式−R2−(R3)kのものであり、式中、R2がスペーサであり、R3が、表3から選択される標的化モノマーであり、およびkが、1〜6であり、各R3が、R2中の窒素原子に結合され、かつR2中の同じかまたは異なる原子に結合されてもよい)で表されることを特徴とするコンジュゲート。

関連出願の相互参照

0001

本出願は、全体が参照により本明細書に援用される、2013年7月11日に出願された米国仮特許出願第61/845,279号明細書の利益を主張するものである。

技術分野

0002

本発明は、オリゴヌクレオチド(例えば、iRNA剤)のリガンドコンジュゲートおよびそれらの調製方法に関する。これらのリガンドは、主に、単糖由来する。これらのコンジュゲートは、オリゴヌクレオチドのインビボでの送達に有用である。

背景技術

0003

インビボでの細胞への効率的な送達は、特異的標的化および細胞外環境、特に、血清タンパク質からの実質的な保護を必要とする。特異的標的化を行う一方法は、標的化部分をiRNA剤にコンジュゲートすることである。標的化部分は、iRNA剤を所要標的部位に標的化するのに役立つ。標的化部分が送達を向上させ得る一方法は、受容体を介したエンドサイトーシス活性によるものである。この取り込み機構は、膜構造陥入または細胞膜による送達系の融合による、膜によって包まれる領域の内部への、膜受容体に結合されたiRNA剤の移動を含む。このプロセスは、受容体への特異的リガンドの結合の後、細胞表面または膜受容体の活性化によって開始される。ガラクトースマンノース、マンノース−6−リン酸などの糖、ペプチドならびにトランスフェリンアシアロ糖タンパク質ビタミンB12、インスリンおよび上皮成長因子(EGF)などのタンパク質を認識するものを含む、多くの受容体を介したエンドサイトーシス系が公知であり、研究されている。アシアロ糖タンパク質受容体(ASGP−R)は、肝細胞に非常に多く存在する高容量受容体(high capacity receptor)である。ASGP−Rは、N−アセチル−D−ガラクトシルアミン(GalNAc)に対してD−Galより50倍高い親和性を示す。過去の研究により、nM親和性を得るのに多価が必要とされる一方、糖間の間隔も重要であることが示されている。

0004

最近、特定の糖質コンジュゲートが、siRNA送達のためのリポソームの代わりに有益な送達であることが示された。

課題を解決するための手段

0005

本発明は、オリゴヌクレオチドまたは他の生物学的に活性な物質の向上した送達、より低い製造コストまたはより少ない製造上の問題、またはより良好な化学安定性などの1つ以上の有利な特性を有するオリゴヌクレオチドまたは他の生物学的に活性な物質のリガンドコンジュゲートに関する。これらのコンジュゲートは、オリゴヌクレオチドおよび他の生物学的に活性な物質の有効な送達を提供する。

0006

一実施形態において、本発明は、式I:

0007

0008

(式中、
オリゴヌクレオチドが、siRNA、マイクロRNA、アンチmiR、アンタゴmir、マイクロRNA模倣体デコイ免疫刺激、G−四量体スプライシング変化、ssRNAアンチセンスアプタマーステムループRNAもしくはDNAまたは任意の二本鎖RNAもしくはDNAの2つの鎖のうちの1つまたは二本鎖のより短い方のRNAもしくはDNA(例えば、siRNA)などのオリゴヌクレオチドであり;
生物学的に活性な物質が、任意の生物学的に活性な物質であり;
リンカーが、リガンドとオリゴヌクレオチドまたは他の生物学的に活性な物質との間の連結基であり、ここで、リンカーが、表1または1A中の連結基から選択されてもよく;および
リガンドが、糖に由来し、ここで、(i)リガンドが、リンカー中の同じかまたは異なる原子に結合されてもよく、かつ(ii)コンジュゲートが、1〜12個のリガンド(好ましくは、1〜5個または1〜3個のリガンド)を含有し、(iii)リガンドが、
(a)表2または2A中のリガンド、
(b)−R2−(R3)k(ここで、
R2が、存在しないか(その場合、k=1)、またはR3基のための2つ以上の結合部位を有するスペーサ(リガンド骨格とも呼ばれる)であり、
R3が、表3から選択される標的化モノマーであり、かつkが、1〜6(好ましくは、1〜5または1〜3)であり、各R3が、R2中の同じかまたは異なる原子に結合されてもよい);および
(c)表4または4A中のリガンド
から選択されてもよい)
のオリゴヌクレオチド(例えば、iRNA剤)または他の生物学的に活性な物質のリガンド(例えば、糖質)コンジュゲートに関する。

0009

コンジュゲートは、表1または1Aまたは実施例からの少なくとも1個のリンカー、表2、2A、4、または4Aからの1個のリガンド、あるいは表3または3Aからの1個の標的化モノマーを含む。例えば、実施例に記載されるヌクレオシドリンカーが、リンカーとして使用され得る。一実施形態において、コンジュゲートは、(i)表1または1Aまたは実施例からの少なくとも1個のリンカー、(ii)表2、2A、4、または4Aからの1個のリガンド、および(iii)表3または3Aからの1個の標的化モノマーを含む。

0010

R2が、アミノ酸−、ポリペプチド−(例えば、ジペプチドまたはトリペプチド)、ヘテロアリール−(例えば、トリアゾール)、または糖含有基であり得る。好ましい一実施形態において、各R3基が、アミドエーテル、またはアミノ基を介してR2に結合される。一実施形態において、R3がアミド基を介して結合される。表2、2A、4、および4A中の各項目は、少なくとも1個の標的化モノマーに結合されたスペーサを示す。スペーサは、窒素原子などのヘテロ原子(スペーサの末端にある)を介して標的化モノマーに、またはアノマー炭素において、(以下に示されるような)標的化モノマーの糖基に結合される。表2、2A、4、および4Aに示される構造中のヘテロ原子結合点は、糖基(リガンドの左側)からリガンドの残りの部分(右側)へと、鎖に沿って移動する場合、第1の窒素原子である。表2A中の2個のリガンドのためのスペーサが、以下の表に示される(矢印は、標的化モノマーR3のための結合点を示し、スペーサの右側は、リンカーに結合される)。好適なスペーサはまた、以下の表5に示される。

0011

0012

オリゴヌクレオチドは、好ましくは、(i)オリゴヌクレオチドの3’または5’末端、(ii)位置に関係なくオリゴヌクレオチド中に存在するヌクレオシドの1つ以上の糖部分、または(iii)位置に関係なく存在するヌクレオシドの1つ以上の塩基部分を介して、リンカーに結合される。

0013

一実施形態において、リガンドは、リンカーを介して二本鎖siRNAの2つの鎖のうちの1つにコンジュゲートされる。

0014

一実施形態において、リガンドは、アシアロ糖タンパク質受容体(ASGPR)を標的にする。別の実施形態において、リガンドは、肝臓実質細胞など、肝臓を標的にする。リガンドは、非修飾または修飾単糖、二糖三糖四糖、またはより高次多糖であり得る。

0015

オリゴヌクレオチドは、切断可能な基(例えば、ホスフェートホスホロチオエート、もしくはアミド)または切断できない基(例えば、エーテル、カルバメート、もしくはC−C(例えば、2つの炭素原子間の結合または−CH2−CH2−))を介してリンカーに結合され得る。本明細書に記載されるように、切断可能なまたは切断できない基は、式Iのオリゴヌクレオチドの中にある。

0016

一実施形態において、−リンカー−リガンドは、L96(実施例に示される)でない。

0017

本明細書に記載されるコンジュゲートの式(式(I)など)において、オリゴヌクレオチドまたは他の生物学的に活性な物質は、脂質ナノ粒子(LNP)(PEG−脂質またはカチオン性脂質など)またはポリマーの成分によって置換され得る。コンジュゲートされたLNP成分または共役ポリマーは、標的部位への生物学的に活性な物質の送達を促進するための送達物質として有用であり得る。
表1 −リンカー基a,b
以下のリンカーが、保護基DMTrとともに示される。コンジュゲートされるとき、DMTr基が除去され、隣接する酸素原子は、オリゴヌクレオチドへの(例えば、オリゴヌクレオチドの切断可能な基への)リンカーの結合部位である。波線は、リガンドの結合点である。Xが、水素脱離基、−OH、または−NH2であり得る。リンカー基が、本発明のコンジュゲートを調製するのに有用な中間化合物に組み込まれるとき、Xが、固相オリゴヌクレオチド合成および脱保護と適合し、または固相オリゴヌクレオチド合成を可能にする固体担体(例えば、

0018

0019

)に結合された反応性ホスホロアミダイト(例えば、

0020

0021

)であり得る。

0022

0023

0024

0025

0026

表1A −リンカー基
表1A中で以下に示されるリンカーは、それに1つ以上のオリゴヌクレオチドが結合された状態で示される。リンカーが、オリゴヌクレオチドを含まない化学的部分であることが、当業者に理解されるであろう。波線は、リガンドの結合点である。Xが、水素、脱離基、−OH、または−NH2であり得る。リンカー基が、本発明のコンジュゲートを調製するのに有用な中間化合物に組み込まれるとき、Xが、固相オリゴヌクレオチド合成および脱保護と適合し、または固相オリゴヌクレオチド合成を可能にする固体担体(例えば、

0027

0028

)に結合された反応性ホスホロアミダイト(例えば、

0029

0030

)であり得る。「オリゴヌクレオチド/ヌクレオチド」という語句は、単一のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを指すことが意図される。

0031

0032

0033

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0049

0050

0051

リガンド
リガンドはまた、以下の2つの一般式

0052

0053

から選択することができ、式中、矢印が、オリゴヌクレオチドコンジュゲートへの結合点を示す(すなわち、リガンドは、そのカルボニル基を介して結合される)。リガンドを導入するのに有用な中間体としては、上に示される化合物が挙げられる。上記の式中、変数は、以下に示される定義を有する。

0054

R6が、HまたはAcであり;
R7が、−OHまたは−NHR9であり;
R8が、AcまたはR9であり、ここで、R7およびR8のうちの少なくとも1つが、窒素含有部分であり;
R9が、

0055

0056

であり;
Q1が、H、C1〜C4アルキル

0057

0058

であり;
Q2が、HまたはC1〜C4アルキルであり;
Xが、HまたはMeであり;
Yが、H、Ac、またはCOCF3であり;および
nが、1〜8(例えば、1〜4)である。

0059

リガンドは、以下の表4または4Aに示される式で表され得る。

0060

0061

0062

0063

表2、2A、3、3A、4、および4Aおよび糖部分に1つ以上の−OA置換基を含む他の式において、本発明の化合物は、示される1つ以上の−OAcの位置に−OH置換基を含有する同一の化合物を含む。一般に、アセチル(Ac)基は、ヒドロキシル部分のための保護基として機能する。したがって、対応するヒドロキシ化合物が、本発明の範囲内にあり、オリゴヌクレオチドまたは他の生物学的に活性な物質とともに最終的なコンジュゲートに使用されることが意図されることが、当業者に理解されるであろう。

0064

さらに、本発明の化合物は、糖部分における任意の−NHAc置換基が、ヒドロキシ基で置換される(例えば、その場合、糖部分の2位における−NHAc基が、2つの−OH基で置換される)ものも含む。一実施形態において、ヒドロキシ基による−NHAc基の置換に加えて、糖部分における任意の−OAc置換基も、ヒドロキシ基で置換される。

0065

一実施形態において、リガンドは、

0066

0067

から選択され、式中、
Aが、リンカーへの結合点であり、リンカーに結合された結合または化学結合基(例えば、アミド、カルバメート、尿素、−C−N−(例えば、−CH2−NH−または−C(Ra)(Rb)−N(Rc)−、ここで、Ra、Rb、およびRcが、独立して、水素、アルキル、およびアリールから選択される)、C=NH、エーテル、チオエーテル、トリアゾール、オキシム、またはヒドラジン)を表すことができ;
Yが、任意の官能基(例えば、二価基として使用されるとき、それは、−CONH−、−NHCO−、またはSであり得、または、例えば、一価基として使用されるとき、それは、−OH、−SH、またはハロゲンであり得る)、−CH2−、保護基、または化学的に不活性なキャップであり;
Qが、OH、または本明細書に記載される糖のC6位に対する任意の修飾であり;および
nが、1〜6である。

0068

さらに別の実施形態において、上記のリガンドまたは標的化モノマー(表2、2A、3、3A、4、および4A中などの)のいずれかの糖部分は、以下の式III

0069

0070

(式中、
R6のそれぞれが、独立して、上に定義されるとおりであり(例えば、HまたはAc);
R7およびR”が、独立して、−Z−R10、非置換および置換ヘテロアリール(例えば、トリアゾールまたはイミダゾール)、−N3、−CN、および置換および非置換アセチレンから選択され;
Zのそれぞれが、独立して、O、NH、またはSであり;
R10のそれぞれが、独立して、H、非置換または置換アルキル、非置換アシル(例えば、−COCH3)、置換アシル(例えば、−COCF3)、−OC(O)OR11、−NHC(O)OR11、−NHC(O)NHR11、またはアミノ酸であり;および
R11のそれぞれが、独立して、Hまたは非置換または置換アルキルであり、
ただし、(i)R6がHであるか、または(ii)R”が、OHまたはNHAcであるとき、R7は、−OHまたは−OAcでない)
の糖部分で置換され得る。

0071

さらに別の実施形態は、式

0072

0073

の中間化合物であり、式中、
リガンドおよびリンカーが、上に定義されるとおりであり、
Xが、

0074

0075

(式中、球体が、固体担体を表す)、

0076

0077

、脱離基、H、−OH、または−NH2である。

0078

これらの中間体は、本発明のオリゴヌクレオチド−リガンドコンジュゲートを調製するのに有用である。

0079

さらに別の実施形態は、式IIIA

0080

0081

の中間化合物であり、式中、
R52が、1〜12個の原子の長さの二価化学基であり;
リンカーが、上に定義されるとおりであり;
R6のそれぞれが、独立して、上に定義されるとおりであり(例えば、HまたはAc);
R7およびR”が、独立して、−Z−R10、非置換および置換ヘテロアリール(例えば、トリアゾールまたはイミダゾール)、−N3、−CN、および置換および非置換アセチレンから選択され;
Zのそれぞれが、独立して、O、NH、またはSであり;
R10のそれぞれが、独立して、H、非置換または置換アルキル、非置換アシル(例えば、−COCH3)、置換アシル(例えば、−COCF3)、−OC(O)OR11、−NHC(O)OR11、−NHC(O)NHR11、またはアミノ酸であり;
R11のそれぞれが、独立して、Hまたは非置換または置換アルキルであり;および
Xが、

0082

0083

(式中、球体が、固体担体を表す)、

0084

0085

、脱離基、H、−OH、または−NH2であり、
ただし、(i)R6がHであるか、または(ii)R”が、OHまたはNHAcであるとき、R7は、−OHまたは−OAcでない。

0086

好ましい一実施形態において、式IIIまたはIIIA中の糖基の3位および4位における置換はそれぞれ、水平方向(equatorial)および軸方向(axial)である。

0087

一実施形態において、式IIIまたはIIIA中の糖は、α立体配置にある。別の実施形態において、糖は、β立体配置にある。

0088

本発明は、式IIIA(式中、Xが、オリゴヌクレオチドまたは本明細書に記載される他の生物学的に活性な物質で置換される)の化合物も含む。

0089

本明細書に記載される同じ結合または結合の組合せは、2つ以上のリガンド/リンカー部分を、オリゴヌクレオチドまたは他の生物学的に活性な物質に結合するのに使用され得る。例えば、一実施形態において、本発明は、式IV

0090

0091

(式中、
リガンドおよびリンカーが、上に定義されるとおりであり;
オリゴヌクレオチド−1およびオリゴヌクレオチド−2が、上記のオリゴヌクレオチドと同じ定義を有し;
生物学的に活性な物質−1および生物学的に活性な物質−2が、上記の生物学的に活性な物質と同じ定義を有し;および
各リガンドが、同じであってもまたは異なっていてもよく、各オリゴヌクレオチドが、同じであってもまたは異なっていてもよい)
のオリゴヌクレオチド(例えば、iRNA剤)または他の生物学的に活性な物質のコンジュゲートに関する。

0092

式IV中、リンカーは、2つの結合を介してオリゴヌクレオチドの2つの部分(オリゴヌクレオチド1および2)を結合する。オリゴヌクレオチドの各部分は、少なくとも1つのヌクレオシド部分を表す。

0093

さらに別の実施形態は、式V:

0094

0095

(式中、
各オリゴヌクレオチド(または生物学的に活性な物質)およびリガンドが、独立して、本明細書に定義されるとおりであり;
各リンカーが、独立して、本明細書に記載されるいずれかのもの(例えば、表1または1A中)であり得、または式

0096

0097

で表され得、式中、R4が、(例えば、オリゴヌクレオチドの切断可能な基を介した)オリゴヌクレオチドの結合部位であり、ヒドロキシプロリンにおけるヒドロキシ基は、さらなる−リンカー−リガンド基の結合部位であり;および
tが、1〜6の範囲(例えば、1、2、3、4、5、または6)である)
のオリゴヌクレオチド(例えば、iRNA剤)または他の生物学的に活性な物質のコンジュゲートである。

0098

好ましい一実施形態において、tが2である。

0099

好ましい一実施形態において、本明細書に記載されるコンジュゲート中のオリゴヌクレオチドは、ホスフェート、ホスホロチオエート、またはそれらの組合せを介してリンカーに結合される。

0100

一実施形態において、コンジュゲートは、式:

0101

0102

(式中、各Rが、独立して、リガンド(本明細書に記載されるものなど)である)で表されるオリゴヌクレオチドコンジュゲートである。好ましい一実施形態において、リガンドRは同じである。

0103

本発明は、オリゴヌクレオチドのリガンドコンジュゲートであって、少なくとも1個のヌクレオシドが、(i)ヌクレオシドの核酸塩基を介して、または(ii)ヌクレオシドの2’位において糖質含有リガンドにコンジュゲートされるリガンドコンジュゲートにも関する。

0104

一実施形態は、オリゴヌクレオチドの糖質コンジュゲートであって、オリゴヌクレオチド中の少なくとも1個のヌクレオシドが、ヌクレオシドの核酸塩基中の窒素原子を介して、糖質含有リガンド(例えば、糖含有リガンド)にコンジュゲートされる糖質コンジュゲートである。本明細書に記載される任意のリガンドが使用され得る。一実施形態において、コンジュゲート中のヌクレオシドは、式VI:

0105

0106

(式中、
式VI中のヌクレオシドの5’および3’末端がそれぞれ、オリゴヌクレオチドの別のヌクレオシドまたは末端に結合され;
R6が、核酸塩基(例えば、ウラシルシトシンアデノシン、またはグアニン)であり、かつ任意選択的に、核酸塩基に結合された窒素含有部分を有し;
R7がリンカーであり、ここで、R7が、R6中の窒素原子(例えば、アミノ基)に結合され;および
各R8が、独立して、リガンドである)
のものである。各R8が、リンカーR7中の同じかまたは異なる原子に結合されてもよい。リガンドR8は、例えば、−R2−R3または表2、2A、4、および4A中のリガンドであり得る。

0107

一実施形態において、R6が、ウラシルであって、その5位においてアミド基−C(O)NH−で置換されるウラシルであり、ここで、R7が、アミド基の窒素原子を介してR6に結合される。

0108

別の実施形態において、R6が、シトシンであって、その5位においてアミド基−C(O)NH−で置換されるシトシンであり、ここで、R7が、アミド基の窒素原子を介してR6に結合される。

0109

別の実施形態は、オリゴヌクレオチドの糖質コンジュゲートであって、オリゴヌクレオチド中の少なくとも1個のヌクレオシドが、その2’位においてリガンド(例えば、糖含有リガンド)にコンジュゲートされる糖質コンジュゲートである。本明細書に記載される任意のリガンドが使用され得る。一実施形態において、コンジュゲート中のヌクレオシドは、式VII:

0110

0111

(式中、
式VII中のヌクレオシドの5’および3’末端がそれぞれ、オリゴヌクレオチドの別のヌクレオシドまたは末端に結合され;
R6が核酸塩基であり;
R7がリンカーであり;
各R8が、独立して、リガンドである)
のものである。各R8が、リンカーR7中の同じかまたは異なる原子に結合されてもよい。好ましい一実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ホスフェート、ホスホロチオエート、またはそれらの組合せを介してリンカーに結合される。例えば、オリゴヌクレオチドは、ホスフェートを介して3’末端および/またはホスホロチオエートを介して5’末端でリンカーに結合されてもよく、または逆もまた同様である。

0112

リガンド部分(例えば、糖質部分)は、標的部位へのオリゴヌクレオチドの送達を促進する。リガンド部分が送達を向上させ得る一方法は、受容体を介したエンドサイトーシス活性によるものである。特定の理論によって制約されるものではないが、この取り込み機構は、膜構造の陥入または細胞膜による送達系の融合による、膜によって包まれる領域の内部への、膜受容体に結合されたオリゴヌクレオチドの移動を含むものと考えられる。このプロセスは、受容体への特異的リガンドの結合の後、細胞表面または膜受容体の活性化によって開始される。受容体を介したエンドサイトーシス系は、ガラクトースなどの糖を認識するものを含む。したがって、リガンド部分は、上述されるものなどの、1つ以上の単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖、または多糖類を含み得る。好ましい一実施形態において、リガンド部分は、ヒトアシアロ糖タンパク質受容体2(ASGPR2)などの、ヒトアシアロ糖タンパク質受容体(ASGPR)によって認識される部分であり得る。このような糖質部分は、例えば、糖(例えば、ガラクトースまたはN−アセチル−D−ガラクトシルアミン)を含み得る。

0113

さらに別の実施形態は、2つ以上のヌクレオチドがそれぞれ−リンカー−リガンド部分を有するオリゴヌクレオチドである。オリゴヌクレオチド中の−リンカー−リガンド部分は、同じであってもまたは異なっていてもよい。一実施形態において、5’末端から1番目、3番目、および5番目のヌクレオチドがそれぞれ、−リンカー−リガンド部分にコンジュゲートされる。別の実施形態において、3’末端から1番目、3番目、および5番目のヌクレオチドがそれぞれ、−リンカー−リガンド部分にコンジュゲートされる。さらに別の実施形態において、オリゴヌクレオチドの3’および5’末端から1番目、3番目、および5番目のヌクレオチドがそれぞれ、−リンカー−リガンド部分にコンジュゲートされる。

0114

さらに別の実施形態は、本発明のiRNA剤のコンジュゲートを調製することによって治療用RNAを製剤化する方法であって、iRNA剤の鎖が治療用RNAを含む方法である。

0115

さらに別の実施形態は、本発明のiRNA剤のコンジュゲートを患者投与することによって、治療用RNAを、それを必要とする患者に送達する方法であって、iRNA剤の鎖が治療用RNAを含む方法である。好ましい投与経路としては、皮下および静脈経路が挙げられる。

図面の簡単な説明

0116

実施例33中の手順にしたがった、対照マウスと比べた、マウスにおけるTTRsiRNAコンジュゲートの投与の48および144時間後のTTRタンパク質レベルを示す棒グラフである。
実施例34中の手順にしたがった、対照マウスと比べた、マウスにおけるAT3 siRNAコンジュゲートの投与後のAT3タンパク質レベルを示す棒グラフである。
実施例62中の手順にしたがった、マウスへのコンジュゲート57727、63189、63192、63190および63191の単回の皮下投与の72時間後のmTTRタンパク質レベルを示す棒グラフである。
実施例62中の手順にしたがった、マウスへのコンジュゲート57727、63189、63192、63190および63191の単回の皮下投与の144時間後のmTTRタンパク質レベルを示す棒グラフである。
実施例42におけるTTR siRNAコンジュゲート56718〜56727、56729および55727の結合親和性(Ki)の棒グラフである。
実施例42におけるTTR siRNAコンジュゲート56727、56729および55727についての様々な濃度での中央蛍光強度MFI)を示すグラフ(結合親和性曲線)である。
実施例42におけるTTR siRNAコンジュゲート56721、56722、56723および55727についての様々な濃度での中央蛍光強度(MFI)を示すグラフである。
実施例42におけるTTR siRNAコンジュゲート56724、56725、56726、56718、56719、56720および55727についての様々な濃度での中央蛍光強度(MFI)を示すグラフである。
実施例44におけるTTR siRNAコンジュゲート56876、66875、56874、54944および56877についての様々な濃度での中央蛍光強度(MFI)を示すグラフである。
実施例44におけるTTR siRNAコンジュゲート66878、56880、56879、54944、56881および56882についての様々な濃度での中央蛍光強度(MFI)を示すグラフである。
実施例45に記載されるような、対照マウスと比べたマウスにおけるTTR siRNAコンジュゲート43527、60126、60138、60128、60127、60316、および60123(15mg/kgおよび5mg/kgの用量で)の投与の48および144時間後のTTRタンパク質レベルを示す棒グラフである。
実施例46に記載されるような、対照マウスと比べたマウスにおけるAT3 siRNAコンジュゲート54944、56881および58137の投与後のAT3タンパク質レベルを示す棒グラフである。
実施例46に記載されるような、対照マウスと比べたマウスにおけるmTTR siRNAコンジュゲート55727、58138および58139の投与後のmTTRタンパク質レベルを示す棒グラフである。
実施例61におけるTTR siRNAコンジュゲート61696、61695、61692、61694、61697、61693、43527および61698についての様々な濃度での中央蛍光強度(MFI)を示すグラフである。

0117

定義
「オリゴヌクレオチド」という用語は、約100ヌクレオチド未満(例えば、約50ヌクレオチド未満の長さを有する化学的に修飾されたまたは非修飾の核酸分子(RNAまたはDNA)を指す。核酸は、例えば、(i)一本鎖DNAまたはRNA、(ii)ヘアピンループを有する二本鎖DNAまたはRNAを含む二本鎖DNAまたはRNA、または(iii)DNA/RNAハイブリッドであり得る。二本鎖RNAの非限定的な例としては、siRNA(低分子干渉RNA)が挙げられる。一本鎖核酸としては、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドリボザイム、マイクロRNA、および三本鎖形成オリゴヌクレオチドが挙げられる。一実施形態において、オリゴヌクレオチドは、約5〜約50ヌクレオチド(約10〜約50ヌクレオチドなど)の範囲の長さを有する。別の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、約15〜約30ヌクレオチドなどの約6〜約30ヌクレオチドの範囲の長さを有する。さらに別の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、約18〜約23ヌクレオチドの範囲の長さを有する。

0118

「GalNAc」という用語は、N−アセチル−ガラクトサミンを指す。

0119

本明細書において使用される際の「固体担体」という用語は、特に、オリゴヌクレオチドの合成が起こる任意の粒子ビーズ、または表面を表す。本明細書に記載される方法の異なる実施形態において使用され得る固体担体は、例えば、無機担体および有機担体から選択され得る。無機担体は、好ましくは、シリカゲルおよび制御多孔質ガラス(controlled pore glass)(CPG)から選択される。有機担体は、好ましくは、高度に架橋されたポリスチレン、Tentagel(ポリエチレングリコール(PEGまたはPOE)がグラフト化される低架橋ポリスチレンマトリックスからなるグラフト化コポリマー)、ポリ酢酸ビニルPVA)、Poros−ポリスチレン/ジビニルベンゼンのコポリマー、アミノポリエチレングリコールおよびセルロースから選択される。本発明に適した好ましい固体担体としては、疎水性であるものが挙げられる。本発明の好ましい実施形態は、ポリスチレン系固体担体を用いる。多くの他の固体担体が、市販されており、本発明に適している。

0120

本明細書において使用される際の「ヒドロキシ保護基」という用語は、合成手順の際の好ましくない反応からヒドロキシル基を保護する不安定な化学的部分を指す。合成手順の後、ヒドロキシ保護基は、選択的に除去され得る。当該技術分野において公知のヒドロキシ保護基は、T.H.Greene and P.G.M.Wuts,Protective Groups in Organic Synthesis,3rd edition,John Wiley&Sons,New York(1999)に一般に記載されている。ヒドロキシル保護基の例としては、以下に限定はされないが、ベンジルオキシカルボニル、4−ニトロベンジルオキシカルボニル、4−ブロモベンジルオキシカルボニル、4−メトキシベンジルオキシカルボニル、メトキシカルボニル、tert−ブトキシカルボニルイソプロポキシカルボニル、ジフェニルメトキシカルボニル、2,2,2−トリクロロエトキシカルボニル、2−(トリメチルシリル)エトキシカルボニル、2−フルフリルオキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、アセチル、ホルミルクロロアセチルトリフルオロアセチルメトキシアセチル、フェノキシアセチル、ベンゾイルメチル、t−ブチル、2,2,2−トリクロロエチル、2−トリメチルシリルエチル、1,1−ジメチル−2−プロペニル、3−メチル−3−ブテニルアリル、ベンジルパラ−メトキシベンジルジフェニルメチルトリフェニルメチルトリチル)、テトラヒドロフリルメトキシメチルメチルチオメチル、ベンジルオキシメチル、2,2,2−トリクロロエトキシメチル、2−(トリメチルシリル)エトキシメチル、メタンスルホニル、パラ−トルエンスルホニル、トリメチルシリル、トリエチルシリル、およびトリイソプロピルシリルが挙げられる。本発明のための好ましいヒドロキシル保護基は、アセチル(Acまたは−−C(O)CH3)、ベンゾイル(Bzまたは−−C(O)C6H5)、およびトリメチルシリル(TMSまたは−−Si(CH3)3)である。

0121

本明細書において使用される際の「アミノ保護基」という用語は、合成手順の際の好ましくない反応からアミノ基を保護する不安定な化学的部分を指す。合成手順の後、本明細書に記載されるアミノ保護基は、選択的に除去され得る。当該技術分野において公知のアミノ保護基は、T.H.Greene and P.G.M.Wuts,Protective Groups in Organic Synthesis,3rd edition,John Wiley&Sons,New York(1999)に一般に記載されている。アミノ保護基の例としては、以下に限定はされないが、アセチル、t−ブトキシカルボニル、9−フルオレニルメトキシカルボニル、およびベンジルオキシカルボニルが挙げられる。

0122

カルボン酸保護基」という用語は、化合物の他の機能的部位に関与する反応が行われながら、カルボン酸官能基ブロックまたは保護するのに用いられるカルボン酸保護基を指す。このようなカルボキシ保護基は、対応するカルボン酸への加水分解方法によるかまたは水素化分解方法による切断の容易さで知られている。カルボン酸エステル保護基の例としては、以下に限定はされないが、メチル、tert−ブチル、ベンジル、4−メトキシベンジル、C2〜C6アルカノイルオキシメチル、2−ヨードエチル、4−ニトロベンジル、ジフェニルメチル(ベンズヒドリル)、フェナシル、4−ハロフェナシル、ジメチルアリル、2,2,2−トリクロロエチル、トリ(C1〜C3アルキル)シリルスクシンイミドメチルおよび類似のエステル形成部分が挙げられる。カルボキシ基エステル保護に加えて、このような基はまた、第三級アミン塩基の存在下で、塩化アセチル塩化プロピオニル、塩化イソブチリルおよび他の酸塩化物とともに形成されるものなどの混合無水物として保護され得る。E.Haslam in Protective Groups in Organic Chemistry(上掲),Chapter 5に記載されるものなどの他の公知のカルボキシ保護基が好適である。エステル形成保護基が好ましい。

0123

上記の定義において、ヒドロキシおよびカルボキシ保護基は、網羅的に定義されていない。このような基の機能は、調製工程中の反応性官能基を保護し、次に、分子の残りの部分を中断せずに、後のある時点で除去されることである。多くの保護基が、当該技術分野で公知であり、本明細書において上で特に言及されていない他の保護基の使用が同様に適用可能である。

0124

好適なペプチド結合試薬としては、以下に限定はされないが、DCC(ジシクロヘキシルカルボジイミド)、DICジイソプロピルカルボジイミド)、ジ−p−トルオイルカルボジイミド、BDP(1−ベンゾトリアゾールジエチルホスフェート−1−シクロヘキシル−3−(2−モルホリニルエチル)カルボジイミド)、EDC(1−(3−ジメチルアミノプロピル−3−エチル−カルボジイミド塩酸塩)、フッ化シアヌル塩化シアヌル、TFFH(テトラメチルフルオロホルムアミジニウムヘキサフルオロホスフェート)、DPPA(アジドリン酸ジフェニル)、BOP(ベンゾトリアゾール−1−イルオキシトリス(ジメチルアミノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート)、HBTU(O−ベンゾトリアゾール−1−イル−N,N,N’,N’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート)、TBTU(O−ベンゾトリアゾール−1−イル−N,N,N’,N’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート)、TSTU(O−(N−スクシンイミジル)−N,N,N’,N’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート)、HATU(N−[(ジメチルアミノ)−1−H−1,2,3−トリアゾロ[4,5,6]−ピリジン−1−イルメチレン]−N−メチルメタンアミニウムヘキサフルオロホスフェートN−オキシド)、BOP−Cl(ビス(2−オキソ−3−オキサゾリジニルホスフィン酸クロリド)、PyBOP((1−H−1,2,3−ベンゾトリアゾール−1−イルオキシ)−トリス(ピロリジノホスホニウムテトラフルオロホスフェート)、BrOP(ブロモトリス(ジメチルアミノ)ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート)、DEPBT(3−(ジエトキシホスホリルオキシ)−1,2,3−ベンゾトリアジン−4(3H)−オン)PyBrOP(ブロモトリス(ピロリジノ)ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート)が挙げられる。EDC、HOAT、BOP−ClおよびPyBrOPが、好ましいペプチド結合試薬である。ペプチド結合試薬の量は、約1.0〜約10.0当量の範囲である。アミド結合形成反応に使用され得る任意選択の試薬としては、約1.0〜約10.0当量の範囲の量の、DMAP(4−ジメチルアミノピリジン)またはHOBT(1−ヒドロキシベンゾトリアゾール)、HOAT(ヒドロキシアザベンゾトリアゾール)、HOSu(ヒドロキシスクシンイミド)、HONB(endo−N−ヒドロキシ−5−ノルボルネン−2,3−ジカルボキサミド)などの活性なエステル試薬が挙げられる。

0125

「ハロ」という用語は、フッ素塩素臭素またはヨウ素のうちのいずれかの基を指す。

0126

「アルキル」という用語は、N、O、またはSで任意選択的に介在され得る、示された数の炭素原子(これらとしては、以下に限定はされないが、プロピル、アリル、またはプロパルギルが挙げられる)を含有する、直鎖状または分枝鎖状であり得る飽和および不飽和の非芳香族炭化水素鎖を指す。例えば、C1〜C10は、基が、その中に1つ以上10個以下の炭素原子を有し得ることを示す。「アルキレン」という用語は、二価のアルキル(すなわち、−R−)を指す。

0127

アルコキシ」という用語は、−O−アルキル基を指す。

0128

「アルキレンジオキソ」という用語は、構造−O−R−O−(式中、Rがアルキレンを表す)の二価の種を指す。

0129

アミノアルキル」という用語は、アミノ基で置換されるアルキルを指す。

0130

メルカプト」という用語は、−SH基を指す。

0131

チオアルコキシ」という用語は、−S−アルキル基を指す。

0132

「アリール」という用語は、各環の0、1、2、3、または4つの原子が置換基で置換され得る、6−炭素単環式または10−炭素二環式芳香環系を指す。アリール基の例としては、フェニルおよびナフチルが挙げられる。

0133

アリールアルキル」および「アラルキル」という用語は、アリールで置換されるアルキルを指す。

0134

アリールアルコキシ」という用語は、アリールで置換されるアルコキシを指す。

0135

本明細書において用いられる際の「シクロアルキル」という用語は、3〜12個の炭素、例えば、3〜8個の炭素、例えば、3〜6個の炭素を有する飽和および部分的に不飽和の環状炭化水素基を含み、シクロアルキル基はさらに、任意選択的に置換され得る。シクロアルキル基としては、以下に限定はされないが、シクロプロピルシクロブチルシクロペンチルシクロペンテニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニルシクロヘプチル、およびシクロオクチルが挙げられる。

0136

「ヘテロアリール」という用語は、単環式の場合1〜3つのヘテロ原子、二環式の場合1〜6つのヘテロ原子、または三環式の場合1〜9つのヘテロ原子を有する芳香族5〜8員単環式、8〜12員二環式、または11〜14員三環式環系を指し、ここで、ヘテロ原子は、O、N、またはSから選択され(例えば、炭素原子および単環式、二環式、または三環式の場合、それぞれ1〜3つ、1〜6つ、または1〜9つの、N、O、またはSのヘテロ原子)、各環の0、1、2、3、または4つの原子が、置換基で置換され得る。ヘテロアリール基の例としては、ピリジルフリルまたはフラニルイミダゾリルベンズイミダゾリルピリミジニルチオフェニルまたはチエニルキノリニルインドリル、およびチアゾリルが挙げられる。

0137

ヘテロアリールアルキル」および「ヘテロアラルキル」という用語は、ヘテロアリールで置換されるアルキルを指す。

0138

「ヘテロアリールアルコキシ」という用語は、ヘテロアリールで置換されるアルコキシを指す。

0139

ヘテロシクリル」という用語は、単環式の場合1〜3つのヘテロ原子、二環式の場合1〜6つのヘテロ原子、または三環式の場合1〜9つのヘテロ原子を有する非芳香族5〜8員単環式、8〜12員二環式、または11〜14員三環式環系を指し、ここで、ヘテロ原子は、O、N、またはSから選択され(例えば、炭素原子および単環式、二環式、または三環式の場合、それぞれ1〜3つ、1〜6つ、または1〜9つの、N、O、またはSのヘテロ原子)、各環の0、1、2または3つの原子が、置換基で置換され得る。ヘテロシクリル基の例としては、トリゾリルテトラゾリルピペラジニルピロリジニルジオキサニル、モルホリニル、およびテトラヒドロフラニルが挙げられる。

0140

オキソ」という用語は、炭素に結合されるとカルボニルを形成し、窒素に結合されるとN−オキシドを形成し、硫黄に結合されるとスルホキシドまたはスルホンを形成する酸素原子を指す。

0141

アシル」という用語は、アルキルカルボニルシクロアルキルカルボニルアリールカルボニル、ヘテロシクリルカルボニル、またはヘテロアリールカルボニル置換基を指し、そのいずれも、1つ以上の置換基でさらに置換され得る。

0142

「DMTr」という用語は、特に規定されない限り、4,4’−ジメトキシトリチルを指す。

0143

「置換」という用語は、ハロ、アルキル、アルケニルアルキニル、アリール、ヘテロシクリル、チオールアルキルチオアリールチオアルキルチオアルキル、アリールチオアルキル、アルキルスルホニルアルキルスルホニルアルキルアリールスルホニルアルキル、アルコキシ、アリールオキシアラルコキシアミノカルボニルアルキルアミノカルボニルアリールアミノカルボニルアルコキシカルボニルアリールオキシカルボニルハロアルキル、アミノ、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アルキルアミノアリールアミノアルキルアミノアルキルアリールアミノアルキルアミノアルキルアミノ、ヒドロキシ、アルコキシアルキルカルボキシアルキルアルコキシカルボニルアルキルアミノカルボニルアルキル、アシル、アラルコキシカルボニル、カルボン酸、スルホン酸スルホニルホスホン酸、アリール、ヘテロアリール、複素環式、および脂肪族を含むがそれらに限定されない規定される置換基のラジカルによる、所与の構造中の1つ以上の水素ラジカルの置換を指す。置換基は、さらに置換され得ることが理解される。

0144

「単糖」という用語は、アロースアルトロースアラビノースクラジノースエリトロース、エリスルロース、フルクトース、D−フシトール、L−フシトール、フコサミンフコース、フクロース、ガラクトサミン、D−ガラクトミニトール、N−アセチル−ガラクトサミン、ガラクトース、グルコサミン、N−アセチル−グルコサミン、グルコサミニトール、グルコース、グルコース−6−リン酸、グロースグリセルアルデヒド、L−グリセロ−D−マンノス−ヘプトースグリセロール、グリセロン、グロース、イドースリキソースマンノサミン、マンノース、マンノース−6−リン酸、プシコースキノボースキノボサミン、ラムニトール、ラムノサミン、ラムノースリボースリブロースセドヘプツロースソルボースタガトースタロース酒石酸トレオースキシロースおよびキシルロースのラジカルを包含する。単糖は、D−またはL−立体配置にあり得る。単糖はさらに、デオキシ糖(水素で置換されたアルコールヒドロキシ基)、アミノ糖(アミノ基で置換されたアルコールヒドロキシ基)、チオ糖(チオールで置換されたアルコールヒドロキシ基、またはC=Sで置換されたC=O、または硫黄で置換された環状形態の環酸素)、セレノ糖、テルロ糖、アザ糖(窒素で置換された環炭素)、イミノ糖(窒素で置換された環酸素)、ホスファノ糖(リンで置換された環酸素)、ホスファ糖(リンで置換された環炭素)、C−置換単糖(炭素で置換された、非末端炭素原子における水素)、不飽和単糖アルジトール(CHOH基で置換されたカルボニル基)、アルドン酸(カルボキシ基で置換されたアルデヒド基)、ケトアルドン酸、ウロン酸アルダル酸などであり得る。アミノ糖としては、アミノ単糖、好ましくは、ガラクトサミン、グルコサミン、マンノサミン、フコサミン、キノボサミン、ノイラミン酸ムラミン酸ラクトースジアミンアコサミン、バシロサミン、ダウノサミン、デソサミンフォロサミン、ガロサミン、カノサミン、カンソサミン(kansosamine)、ミカミノース、ミコサミン、ペロサミン、プノイモサミン、プルプロサミン、ロドサミンが挙げられる。単糖などは、さらに置換され得ることが理解される。

0145

「二糖」、「三糖」および「多糖」という用語は、アベクオース、アクラボース、アミセトース、アミロペクチンアミロースアピオースアルカノース、アスカリロース、アスコルビン酸、ボイビノース、セロビオースセロトリオース、セルロース、カコトリオース、カルコース、キチンコリトースシクロデキストリンシマロースデキストリン、2−デオキシリボース、2−デオキシグルコースジギノースジギタロースジギトキソースエバロース、エベミトロース(evemitrose)、フラクトオリゴ糖ガラクトオリゴ糖ゲンチアノース、ゲンチオビオースグルカン、グルコーゲン、グリコーゲンハマメロース、ヘパリンイヌリンイソレボグルコセノンイソマルトースイソマルトトリオース、イソパノースコジビオース、ラクトース、ラクトサミン、ラクトースジアミン、ラミナラビオース、レボグルコサン、レボグルコセノン、β−マルトースマルトリオース、マンナン−オリゴ糖、マンニノトリオース、メレジトースメリビオース、ムラミン酸、ミカロース、ミシノース、ノイラミン酸、ニゲロースノジリマイシンノビオース、オレアンドロース、パノース、パラトース、プランテオースプリベロース、ラフィノース、ロジノース、ルチノースサルメントース、セドヘプツロース、セドヘプツロサン、ソラトリオース、ソホローススタキオースストレプトーススクロース、α,α−トレハローストレハロサミン、ツラノースチベロースキシロビオースウンベリフェロースなどのラジカルを包含する。さらに、「二糖」、「三糖」および「多糖」などは、さらに置換され得ることが理解される。二糖は、アミノ糖およびそれらの誘導体、特に、C−4’位で誘導体化されたミカミノースまたはC−6’位で誘導体化された4デオキシ−3−アミノ−グルコースも含む。
オリゴヌクレオチド
オリゴヌクレオチドは、siRNA、マイクロRNA、アンチマイクロRNA、マイクロRNA模倣体、アンチmiR、アンタゴmir、dsRNA、ssRNA、アプタマー、免疫刺激、デコイオリゴヌクレオチド、スプライシング変化オリゴヌクレオチド、三本鎖形成オリゴヌクレオチド、G−四量体またはアンチセンスであり得る。一実施形態において、オリゴヌクレオチドは、iRNA剤である。

0146

ある実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、UNA(ロックされていない(unlocked)核酸)ヌクレオチドである1つ以上のモノマーを含む。UNAは、ロックされていない非環状核酸を指し、ここで、糖の結合の少なくとも1つが、除去されており、ロックされていない「糖」残基を形成する。一例において、UNAは、C1’〜C4’の間の結合(すなわち、C1’−C4’炭素の間の炭素−酸素−炭素共有結合)が除去されているモノマーも包含する。別の例において、糖のC2’−C3’結合(すなわち、C2’およびC3’炭素の間の炭素−炭素共有結合)が除去されている(参照により本明細書に援用されるFluiter et al.,Mol.Biosyst.,2009,10,1039を参照)。

0147

「iRNA剤」という用語は、標的遺伝子(例えば、siRNA)、好ましくは、内因性または病原体標的RNAの発現下方制御することができるRNA剤(またはRNA剤へと切断され得る)を指す。理論によって制約されるのを望むものではないが、iRNA剤は、標的mRNA(当該技術分野においてRNAiと呼ばれる)の転写後切断、または転写前または翻訳前機序を含むいくつかの機序のうちの1つ以上によって作用し得る。iRNA剤は、一本鎖を含むことができ、または2本以上の鎖を含むことができ、例えば、iRNA剤は、二本鎖iRNA剤であり得る。iRNA剤が一本鎖である場合、iRNA剤は、1つ以上のリン酸基またはリン酸基の1つ以上の類似体を含む5’修飾を含み得る。好ましい一実施形態において、iRNA剤は二本鎖である。

0148

iRNA剤は、典型的に、標的遺伝子に十分に相同な領域を含み、ヌクレオチドに関して十分な長さを有し、それによって、iRNA剤、またはその断片は、標的遺伝子の下方制御を媒介し得る。iRNA剤は、少なくとも部分的に、ある実施形態において完全に、標的RNAに相補的である領域であるかまたはそれを含む。iRNA剤と標的との間の完全な相補性がある必要はないが、iRNA剤、またはその切断産物が、例えば、標的RNA、例えば、mRNAのRNAi切断によって、配列特異的サイレンシング指令することが可能であるほど一致が十分であるのが好ましい。

0149

iRNA剤中のヌクレオチドは、修飾されてもよく(例えば、1つ以上のヌクレオチドは、2’−Fまたは2’−OCH3基を含み得る)、またはヌクレオチドサロゲートであってもよい。iRNA剤の一本鎖領域は、修飾されてもよく、またはヌクレオシドサロゲートを含んでいてもよく、例えば、非対合領域またはヘアピン構造の領域、例えば、2つの相補的な領域を結合する領域は、修飾またはヌクレオシドサロゲートを有し得る。例えば、エキソヌクレアーゼに対して、iRNA剤の1つ以上の3’末端または5’末端を安定化させる修飾。修飾は、C3(またはC6、C7、C12)アミノリンカーチオールリンカーカルボキシルリンカー、非ヌクレオチドスペーサ(C3、C6、C9、C12、脱塩基、トリエチレングリコールヘキサエチレングリコール)、ホスホロアミダイトとして生じ、別のDMT保護されたヒドロキシル基を有し、RNA合成の際の複数の結合を可能にする特殊なビオチンまたはフルオレセイン試薬を含み得る。修飾は、例えば、リボース糖の2’OH基における修飾の使用、例えば、デオキシリボヌクレオチド、例えば、リボヌクレオチドの代わりにデオキシチミジンの使用、およびリン酸基における修飾、例えば、ホスホロチオエート修飾も含み得る。ある実施形態において、異なる鎖が、異なる修飾を含む。

0150

ある実施形態において、鎖は、iRNA剤が分子の一端または両端で一本鎖または非対合領域を含むように選択されるのが好ましい。二本鎖iRNA剤は、好ましくは、オーバーハング、例えば、1つまたは2つの5’または3’オーバーハング(好ましくは、少なくとも、2〜3個のヌクレオチドの3’オーバーハング)と対合される鎖を有する。好ましいiRNA剤は、各末端で1つまたは好ましくは、2つまたは3つのヌクレオチド長一本鎖オーバーハング、好ましくは、3’オーバーハングを有する。オーバーハングは、一方の鎖が他方より長いことの結果、または同じ長さの2つの鎖が互い違いに交差されることの結果であり得る。

0151

iRNA剤の鎖の間の二本鎖領域の好ましい長さは、6〜30ヌクレオチド長である。好ましい二本鎖領域は、15〜30、最も好ましくは、18、19、20、21、22、および23ヌクレオチド長である。他の好ましい二本鎖領域は、6〜20ヌクレオチド、最も好ましくは、6、7、8、9、10、11および12ヌクレオチド長である。

0152

オリゴヌクレオチドは、それぞれが参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第2009/0239814号明細書、同第2012/0136042号明細書、同第2013/0158824号明細書、または同第2009/0247608号明細書に記載されているものであり得る。

0153

本明細書において使用される際の「一本鎖siRNA化合物」は、単一の分子から構成されるsiRNA化合物である。それは、鎖内対合によって形成される二本鎖領域を含んでいてもよく、例えば、それは、ヘアピンまたはフライパンの柄の構造であるかまたはそれを含み得る。一本鎖siRNA化合物は、標的分子に対してアンチセンスであり得る。

0154

一本鎖siRNA化合物は、RISC入り、標的mRNAのRISCを介した切断に関与することができるのに十分に長くなり得る。一本鎖siRNA化合物は、少なくとも14ヌクレオチド長、他の実施形態において、少なくとも15、20、25、29、35、40、または50ヌクレオチド長である。特定の実施形態において一本鎖siRNA化合物は、200、100、または60ヌクレオチド長未満である。

0155

ヘアピンsiRNA化合物は、17、18、19、29、21、22、23、24、または25ヌクレオチド対以上の二本鎖領域を有する。二本鎖領域は、200、100、または50長以下であり得る。特定の実施形態において、二本鎖領域の範囲は、15〜30、17〜23、19〜23、19〜21ヌクレオチド対の長さである。ヘアピンは、一本鎖オーバーハングまたは末端の非対合領域を有し得る。特定の実施形態において、オーバーハングは、2〜3ヌクレオチド長である。ある実施形態において、オーバーハングは、ヘアピンのセンス側にあり、ある実施形態において、ヘアピンのアンチセンス側にある。

0156

本明細書において使用される際の「二本鎖siRNA化合物」は、鎖間ハイブリダイゼーション二本鎖構造の領域を形成し得る、2つ以上、場合によっては2つの鎖を含むsiRNA化合物である。

0157

二本鎖siRNA化合物のアンチセンス鎖は、14、15、16 17、18、19、25、29、40、または60ヌクレオチド長以上であり得る。それは、200、100、または50ヌクレオチド長以下であり得る。範囲は、17〜25、19〜23、19〜21ヌクレオチド長であり得る。本明細書において使用される際、「アンチセンス鎖」という用語は、標的分子、例えば標的RNAに対して十分に相補的なsiRNA化合物の鎖を意味する。

0158

二本鎖siRNA化合物のセンス鎖は、14、15、16 17、18、19、25、29、40、または60ヌクレオチド長以上であり得る。それは、200、100、または50、ヌクレオチド長以下であり得る。範囲は、17〜25、19〜23、および19〜21ヌクレオチド長であり得る。

0159

二本鎖siRNA化合物の二本鎖部分は、14、15、16 17、18、19、20、21、22、23、24、25、29、40、または60ヌクレオチド対の長さ以上であり得る。それは、200、100、または50、ヌクレオチド対の長さ以下であり得る。範囲は、15〜30、17〜23、19〜23、および19〜21ヌクレオチド対の長さであり得る。

0160

多くの実施形態において、siRNA化合物は、より小さいsiRNA化合物、例えば、siRNA剤を産生するように、内因性分子によって、例えば、Dicerによって切断され得るほど十分に大きい。

0161

センス鎖およびアンチセンス鎖は、二本鎖siRNA化合物が、分子の一端または両端で一本鎖または非対合領域を含むように選択され得る。したがって、二本鎖siRNA化合物は、1〜3個のヌクレオチドのオーバーハング、例えば、1つまたは2つの5’または3’オーバーハング、または3’オーバーハングを含有するように対合されたセンス鎖およびアンチセンス鎖を含有し得る。オーバーハングは、一方の鎖が他方より長いことの結果、または同じ長さの2つの鎖が互い違いに交差されることの結果であり得る。ある実施形態は、少なくとも1つの3’オーバーハングを有する。一実施形態において、siRNA分子の両端は、3’オーバーハングを有する。ある実施形態において、オーバーハングは、2個のヌクレオチドである。

0162

特定の実施形態において、二本鎖領域の長さは、例えば、上述されるssiRNA化合物の範囲内で、15〜30、または18、19、20、21、22、および23ヌクレオチド長である。ssiRNA化合物は、天然のDicerによって長いdsiRNAからプロセシングされた産物と長さおよび構造が類似し得る。ssiRNA化合物の2つの鎖が結合される、例えば、共有結合される実施形態も含まれる。ヘアピン、または所要の二本鎖領域、および3’オーバーハングを提供する他の一本鎖構造も考えられる。

0163

二本鎖siRNA化合物および一本鎖siRNA化合物を含む本明細書に記載されるsiRNA化合物は、標的RNA、例えば、mRNA、例えば、タンパク質をコードする遺伝子の転写産物のサイレンシングを媒介することができる。便宜上、このようなmRNAは、本明細書においてサイレンシングされるmRNAとも呼ばれる。このような遺伝子は、標的遺伝子とも呼ばれる。一般に、サイレンシングされるRNAは、内因性遺伝子または病原体遺伝子である。さらに、mRNA以外のRNA、例えば、tRNA、およびウイルスRNAも標的にされ得る。

0164

本明細書において使用される際、「RNAiを媒介する」という語句は、配列特異的に、標的RNAをサイレンシングする能力を指す。理論によって制約されるのを望むものではないが、サイレンシングは、RNAiの機構またはプロセスおよびガイドRNA、例えば、21〜23個のヌクレオチドのssiRNA化合物を使用するものと考えられる。

0165

一実施形態において、siRNA化合物が、標的RNA、例えば、標的mRNAに対して「十分に相補的」であり、それによって、siRNA化合物は、標的mRNAによってコードされるタンパク質の産生をサイレンシングする。別の実施形態において、siRNA化合物は、標的RNAに対して「正確に相補的」であり、例えば、標的RNAおよびsiRNA化合物は、例えば、正確な相補性の領域においてワトソンクリック塩基対のみから構成されるハイブリッドを形成するようにアニールする。「十分に相補的」な標的RNAは、標的RNAに対して正確に相補的な(例えば、少なくとも10ヌクレオチドの)内部領域を含み得る。さらに、特定の実施形態において、siRNA化合物は、具体的に、単一のヌクレオチドの違いを識別する。この場合、siRNA化合物は、正確な相補性が、単一のヌクレオチドの違いがある(例えば、7ヌクレオチド内の)領域に見られる場合のみ、RNAiを媒介する。
マイクロRNA
マイクロRNA(miRNA)は、植物および動物ゲノム中のDNAから転写されるが、タンパク質へと翻訳されない小さいRNA分子の高度に保存された種類である。プロセシングされるmiRNAは、RNA誘導サイレンシング複合体(RISC)中に組み込まれ、発達細胞増殖アポトーシスおよび分化の主要調節因子として認識されている一本鎖約17〜25ヌクレオチド(nt)RNA分子である。それらは、特定のmRNAの3’−不飽和領域に結合することによって、遺伝子発現の調節に役割を果たすものと考えられる。RISCは、翻訳阻害、転写産物切断、またはその両方によって、遺伝子発現の下方制御を媒介する。RISCは、広範囲真核生物の核における転写サイレンシングにも関与している。

0166

これまでに同定されたmiRNA配列の数は、多数であり、ますます増加しており、その例示的な例が、例えば、“miRBase:microRNA sequences,targets and gene nomenclature”Griffiths−Jones S,Grocock RJ,van Dongen S,Bateman A,Enright AJ.NAR,2006,34,Database Issue,D140−D144;“The microRNA Registry”Griffiths−Jones S.NAR,2004,32,Database Issue,D109−D111;およびさらにhttp://microrna.sanger.ac.uk/sequences/に見られる。
アンチセンスオリゴヌクレオチド
一実施形態において、核酸は、標的ポリヌクレオチドに向けられたアンチセンスオリゴヌクレオチドである。「アンチセンスオリゴヌクレオチド」または単に「アンチセンス」という用語は、標的化ポリヌクレオチド配列に相補的なオリゴヌクレオチドを含むことが意図される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、選択される配列に相補的なDNAまたはRNA、例えば標的遺伝子mRNAの一本鎖である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、相補的なmRNAに結合することによって遺伝子発現を阻害するものと考えられる。標的mRNAへの結合は、それに結合することによって相補的なmRNA鎖の翻訳を防ぐことによって、または標的mRNAの分解をもたらすことによって、遺伝子発現の阻害をもたらし得る。アンチセンスDNAは、特定の、相補的(コードまたは非コード)RNAを標的にするのに使用され得る。結合が起こる場合、このDNA/RNAハイブリッドは、酵素RNaseHによって分解され得る。特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、約10〜約50個のヌクレオチド、より好ましくは、約15〜約30個のヌクレオチドを含有する。この用語は、所望の標的遺伝子に対して正確に相補的でないことがあり得るアンチセンスオリゴヌクレオチドも包含する。したがって、非標的特異的活性がアンチセンスで見られる場合、または標的配列との1つ以上のミスマッチを含むアンチセンス配列が特定の用途に最も好ましい場合が想定される。

0167

アンチセンスオリゴヌクレオチドが、タンパク質合成の有効な標的化阻害剤であることが実証されており、その結果、標的化遺伝子によってタンパク質合成を特異的に阻害するのに使用され得る。タンパク質合成を阻害するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効性は、十分に確立されている。例えば、ポリガラクツロナーゼおよびムスカリン2型アセチルコリン受容体の合成は、そのそれぞれのmRNA配列に向けられたアンチセンスオリゴヌクレオチドによって阻害される(それぞれが参照により援用される米国特許第5,739,119号明細書および米国特許第5,759,829号明細書)。さらに、アンチセンス阻害の例が、核タンパク質サイクリン多剤耐性遺伝子(MDG1)、ICAM−1、E−セレクチン、STK−1、線条体GABAA受容体およびヒトEGFで実証されている(それぞれが参照により援用される、Jaskulski et al.,Science.1988 Jun 10;240(4858):1544−6;Vasanthakumar and Ahmed,Cancer Commun.1989;1(4):225−32;Peris et al.,Brain Res Mol Brain Res.1998 Jun 15;57(2):310−20;米国特許第5,801,154号明細書;米国特許第5,789,573号明細書;米国特許第5,718,709号明細書および米国特許第5,610,288号明細書)。さらに、アンチセンス構築物が、様々な異常な細胞増殖、例えば癌を阻害し、それを治療するのに使用され得ることも記載されている(それぞれが参照により援用される、米国特許第5,747,470号明細書;米国特許第5,591,317号明細書および米国特許第5,783,683号明細書)。

0168

アンチセンスオリゴヌクレオチドを産生する方法が、当該技術分野において公知であり、任意のポリヌクレオチド配列を標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチドを産生するように容易に適合され得る。所与の標的配列に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド配列の選択は、選択される標的配列の分析ならびに二次構造、Tm、結合エネルギー、および相対的安定性の決定に基づく。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、二量体、ヘアピン、または宿主細胞中の標的mRNAへの特異的な結合を減少させるかまたは妨げ得る他の二次構造を形成するそれらの相対的な能力の低さに基づいて選択され得る。mRNAの非常に好ましい標的領域は、AUG翻訳開始コドンにおけるまたはその近くの領域およびmRNAの5’領域に実質的に相補的な配列を含む。これらの二次構造の分析および標的部位の選択判断は、例えば、OLIGOプライマー分析ソフトウェアのv.4(Molecular Biology Insights)および/またはBLASTN 2.0.5アルゴリズムソフトウェア(Altschul et al.,Nucleic AcidsRes.1997,25(17):3389−402)を用いて行われ得る。
アンタゴmir
アンタゴmirは、RNAse保護ならびに向上した組織および細胞取り込みなどの薬理学的特性のための様々な修飾を有するRNA様のオリゴヌクレオチドである。それらは、例えば、糖、ホスホロチオエート骨格および、例えば、3’末端におけるコレステロール部分の完全な2’−O−メチル化によって、通常のRNAと異なる。アンタゴmirは、アンタゴmirおよび内因性miRNAを含む二本鎖を形成し、それによって、miRNAに誘発される遺伝子サイレンシングを防ぐことによって、内因性miRNAを効率的にサイレンシングするのに使用され得る。アンタゴmirを介したmiRNAサイレンシングの例は、全体が参照により本明細書に明示的に援用されるKrutzfeldt et al,Nature,2005,438:685−689に記載されるmiR−122のサイレンシングである。アンタゴmir RNAは、標準的な固相オリゴヌクレオチド合成プロトコルを用いて合成され得る。米国特許出願公開第2007/0123482号明細書および同第2007/0213292号明細書(それぞれが参照により本明細書に援用される)を参照されたい。

0169

アンタゴmirは、オリゴヌクレオチド合成のためのリガンドがコンジュゲートされたモノマーサブユニットおよびモノマーを含み得る。例示的なモノマーが、全体が参照により援用される米国特許出願公開第2005/0107325号明細書に記載されている。アンタゴmirは、全体が参照により援用される国際公開第2004/080406号に記載されるようなZXY構造を有し得る。アンタゴmirは、両親媒性部分と複合体を形成し得る。オリゴヌクレオチド作用物質とともに使用するための例示的な両親媒性部分は、全体が参照により援用される国際公開第2004/080406号に記載されている。
アプタマー
アプタマーは、高い親和性および特異性を有する該当する特定の分子に結合する核酸またはペプチド分子である(それぞれ、全体が参照により援用される、Tuerk and Gold,Science 249:505(1990);Ellington and Szostak,Nature 346:818(1990))。大きいタンパク質から小さい有機分子まで多くの様々な実体に結合するDNAまたはRNAアプタマーの産生が成功している。それぞれ、全体が参照により援用される、Eaton,Curr.Opin.Chem.Biol.1:10−16(1997)、Famulok,Curr.Opin.Struct.Biol.9:324−9(1999)、およびHermann and Patel,Science 287:820−5(2000)を参照されたい。アプタマーは、RNAまたはDNAベースであってもよく、リボスイッチを含み得る。リボスイッチは、小さい標的分子に直接結合することができ、標的の結合が遺伝子の活性に影響を与えるmRNA分子の一部である。したがって、リボスイッチを含有するmRNAが、その標的分子の存在または非存在に応じて、それ自体の活性を調節するのに直接関与する。一般に、アプタマーは、小分子、タンパク質、核酸、ならびにさらには細胞、組織および生物などの様々な分子標的に結合するための反復するインビトロでの選択または同等に、SELEX(試験管進化法(systematic evolution of ligandsby exponential enrichment))によって操作される(engineered)。アプタマーは、合成、組み換え、および精製方法を含む任意の公知の方法によって調製されてもよく、単独で、または同じ標的に特異的な他のアプタマーと組み合わせて使用され得る。さらに、本明細書により詳細に記載されるように、「アプタマー」という用語は、具体的に、2つ以上の公知のアプタマーを所与の標的と比較することから導かれるコンセンサス配列を含有する「二次アプタマー」を含む。
リボザイム
別の実施形態によれば、核酸−脂質粒子は、リボザイムと結合される。リボザイムは、エンドヌクレアーゼ活性を有する特定の触媒ドメインを有するRNA分子錯体である(Kim and Cech,Proc Natl Acad Sci USA.1987 Dec;84(24):8788−92;Forster and Symons,Cell.1987 Apr 24;49(2):211−20)。例えば、多数のリボザイムは、多くの場合、オリゴヌクレオチド基質中のいくつかのリン酸エステルのうちの1つのみを切断する高度な特異性で、リン酸エステル転移反応加速する(Cech et al.,Cell.1981 Dec;27(3 Pt 2):487−96;Michel and Westhof,J Mol Biol.1990 Dec 5;216(3):585−610;Reinhold−Hurek and Shub,Nature.1992 May 14;357(6374):173−6)。この特異性は、化学反応の前に、基質が塩基対形成相互作用によってリボザイムの内部ガイド配列(「IGS」)に結合する必要があることに起因するとされている。

0170

天然の酵素的RNAの少なくとも6つの基本的な種が現在知られている。それぞれが、生理的条件下で、トランスでRNAホスホジエステル結合加水分解触媒することができる(したがって、他のRNA分子を切断することができる)。一般に、酵素的核酸は、まず、標的RNAに結合することによって作用する。このような結合は、標的RNAを切断するように機能する分子の酵素部分に近接して保たれる酵素的核酸の標的結合部分によって起こる。したがって、酵素的核酸は、まず、標的RNAを認識し、次に、相補的な塩基対形成によって標的RNAに結合し、正確な部位に結合されると、標的RNAを切断するように酵素的に作用する。このような標的RNAの戦略的切断は、コードされるタンパク質の合成を指令するその能力を損なうであろう。酵素的核酸は、そのRNA標的に結合し、そのRNA標的を切断した後、別の標的を探すためにそのRNAから放出され、新たな標的との結合および切断を繰り返すことができる。

0171

酵素的核酸分子は、例えば、ハンマーヘッド、ヘアピン、δ型肝炎ウイルスグループIイントロンまたはRNaseP RNA(RNAガイド配列と結合されている)またはアカパンカビ属(Neurospora)VS RNAモチーフで形成され得る。ハンマーヘッドモチーフの具体例が、Rossi et al.Nucleic AcidsRes.1992 Sep 11;20(17):4559−65によって記載されている。ヘアピンモチーフの例が、Hampelet al.(欧州特許出願公開第EP0360257号明細書)、Hampel and Tritz,Biochemistry 1989 Jun 13;28(12):4929−33;Hampel et al.,Nucleic Acids Res.1990 Jan 25;18(2):299−304および米国特許第5,631,359号明細書によって記載されている。δ型肝炎ウイルスモチーフの例が、Perrotta and Been,Biochemistry.1992 Dec 1;31(47):11843−52によって記載され;RNasePモチーフの例が、Guerrier−Takada et al.,Cell.1983 Dec;35(3 Pt 2):849−57によって記載され;アカパンカビ属(Neurospora)VS RNAリボザイムモチーフが、Collins(Saville and Collins,Cell.1990 May 18;61(4):685−96;Saville and Collins,Proc Natl Acad Sci USA.1991 Oct 1;88(19):8826−30;Collins and Olive,Biochemistry.1993 Mar 23;32(11):2795−9)によって記載され;グループIイントロンの例が、米国特許第4,987,071号明細書に記載されている。使用される酵素的核酸分子の重要な特性は、それらが、標的遺伝子DNAまたはRNA領域の1つ以上に相補的な特異的基質結合部位を有すること、およびそれらが、分子にRNA切断活性を与える基質結合部位の内部または周囲にヌクレオチド配列を有することである。したがって、リボザイム構築物は、本明細書に記載される特定のモチーフに限定される必要はない。

0172

任意のポリヌクレオチド配列に標的化されるリボザイムを産生する方法は、当該技術分野において公知である。リボザイムは、それぞれが具体的に参照により本明細書に援用される国際特許出願公開国際公開第93/23569号および国際公開第94/02595号に記載されるように設計され、それらの文献に記載されるように、インビトロおよびインビボで試験されるように合成され得る。

0173

リボザイム活性は、リボザイム結合アームの長さを変更するか、または血清リボヌクレアーゼによるそれらの分解を防止する修飾(例えば、酵素的RNA分子の糖部分に行われ得る様々な化学修飾を記載する、国際特許出願公開国際公開第92/07065号、国際公開第93/15187号、および国際公開第91/03162号;欧州特許出願公開第92110298.4号明細書;米国特許第5,334,711号明細書;および国際特許出願公開国際公開第94/13688号を参照)、細胞におけるそれらの有効性を高める修飾、およびRNA合成時間を短縮し、化学的条件を減少させるためのステムII塩基の除去を有するリボザイムを化学的に合成することによって最適化され得る。
免疫刺激オリゴヌクレオチド
哺乳動物または他の患者であり得る被験体に投与されるとき、免疫応答を誘発することが可能な免疫刺激オリゴヌクレオチド(ISS;一本鎖または二本鎖)を含む、脂質粒子と結合される核酸は、免疫刺激性であり得る。ISSは、例えば、ヘアピン二次構造をもたらす特定のパリンドローム(全体が参照により援用されるYamamoto S.,et al.(1992)J.Immunol.148:4072−4076を参照)、またはCpGモチーフ、ならびに他の公知のISSの特徴(多重ドメインなど、全体が参照により援用される国際公開第96/11266号を参照)を含む。

0174

免疫応答は、自然免疫応答または適応免疫応答であり得る。免疫系は、脊椎動物のさらなる自然免疫系、および獲得適応免疫系に分けられ、後者は、体液性細胞成分にさらに分けられる。特定の実施形態において、免疫応答は、粘膜性であり得る。

0175

特定の実施形態において、免疫刺激核酸は、脂質粒子と組み合わせて投与される場合にのみ免疫刺激性であり、その「遊離形態」で投与される場合、免疫刺激性でない。このようなオリゴヌクレオチドは、免疫刺激性であるとみなされる。

0176

免疫刺激核酸は、免疫応答を誘発するために、標的ポリヌクレオチドに特異的に結合し、標的ポリヌクレオチドの発現を低下させる必要がない場合、非配列特異的であるとみなされる。したがって、特定の免疫刺激核酸は、天然の遺伝子またはmRNAの領域に対応する配列を含み得るが、それでもなお非配列特異的免疫刺激核酸とみなされ得る。

0177

一実施形態において、免疫刺激核酸またはオリゴヌクレオチドは、少なくとも1個のCpGジヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドまたはCpGジヌクレオチドは、メチル化されていなくてもまたはメチル化されていてもよい。別の実施形態において、免疫刺激核酸は、メチル化シトシンを有する少なくとも1個のCpGジヌクレオチドを含む。一実施形態において、核酸は、単一のCpGジヌクレオチドを含み、ここで、前記CpGジヌクレオチド中のシトシンがメチル化される。代替的な実施形態において、核酸は、少なくとも2個のCpGジヌクレオチドを含み、ここで、CpGジヌクレオチド中の少なくとも1個のシトシンがメチル化される。さらなる実施形態において、配列中に存在するCpGジヌクレオチド中の各シトシンがメチル化される。別の実施形態において、核酸は、複数のCpGジヌクレオチドを含み、ここで、前記CpGジヌクレオチドの少なくとも1つが、メチル化シトシンを含む。
リンカー
リンカーは、オリゴヌクレオチドをリガンドに結合するための任意の好適な基であり得る。リンカーの他の例が、それぞれが参照により本明細書に援用される、国際公開第2009/082607号および米国特許出願公開第2009/0239814号明細書、同第2012/0136042号明細書、同第2013/0158824号明細書、または同第2009/0247608号明細書に記載されている。
リンカーへのオリゴヌクレオチドの結合点
オリゴヌクレオチドは、両者を結合するための任意の好適な基を介してリンカーに結合され得る。基は、切断可能であるかまたは切断不可能であり得る。リンカーおよび好適な結合基の例が、本明細書に記載される。結合基の他の例が、それぞれが参照により本明細書に援用される、国際公開第2009/082607号および米国特許出願公開第2009/0239814号明細書、同第2012/0136042号明細書、同第2013/0158824号明細書、または同第2009/0247608号明細書に記載されている。好適な結合基としては、例えば、NR8、C(O)、C(O)NH、SO、SO2、SO2NHまたは以下に限定はされないが、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、アリールアルケニルアリールアルキニル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニルアルキルアリールアルキル、アルキルアリールアルケニル、アルキルアリールアルキニル、アルケニルアリールアルキル、アルケニルアリールアルケニル、アルケニルアリールアルキニル、アルキニルアリールアルキル、アルキニルアリールアルケニル、アルキニルアリールアルキニル、アルキルヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリールアルケニル、アルキルヘテロアリールアルキニル、アルケニルヘテロアリールアルキル、アルケニルヘテロアリールアルケニル、アルケニルヘテロアリールアルキニル、アルキニルヘテロアリールアルキル、アルキニルヘテロアリールアルケニル、アルキニルヘテロアリールアルキニル、アルキルヘテロシクリルアルキル、アルキルヘテロシクリルアルケニル、アルキルヘテロシクリルアルキニル、アルケニルヘテロシクリルアルキル、アルケニルヘテロシクリルアルケニル、アルケニルヘテロシクリルアルキニル、アルキニルヘテロシクリルアルキル、アルキニルヘテロシクリルアルケニル、アルキニルヘテロシクリルアルキニル、アルキルアリール、アルケニルアリール、アルキニルアリール、アルキルヘテロアリール、アルケニルヘテロアリール、アルキニルヘテロアリールなどの、原子の鎖が挙げられ、そのそれぞれが、置換または非置換であってもよく、1つ以上のメチレンが、O、S、S(O)、SO2、N(R8)、C(O)、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、または置換または非置換複素環式によって介在または終端され得、ここで、R8が、水素、アシル、脂肪族または置換脂肪族である。

0178

切断可能な基は、細胞外で十分に安定しているが、標的細胞中に入ると切断されて、基が結合している2つの部分を放出する基である。好ましい実施形態において、切断可能な基は、被験体の血液中、または(例えば、血液または血清中で見られる条件を模倣するかまたは表すように選択され得る)第2の参照条件下より少なくとも10倍以上、好ましくは、少なくとも100倍以上速く、標的細胞または(例えば、細胞内条件を模倣するかまたは表すように選択され得る)第1の参照条件下で切断される。

0179

切断可能な基は、切断因子、例えば、pH、酸化還元電位または分解分子の存在の影響を受けやすい。一般に、切断因子は、血清または血液中より細胞内でより高いレベルまたは活性で、より広くまたはより多く見られる。このような分解因子の例としては、例えば、酸化還元で切断可能な基を還元によって分解することができる、細胞内に存在するメルカプタンなどの酸化もしくは還元酵素または還元剤を含む、特定の基質のために選択されるかまたは基質特異性を有さない酸化還元剤エステラーゼエンドソームまたは酸性環境を生じさせることが可能な薬剤、例えば、5以下のpHを生じさせる薬剤;一般酸として作用することによって酸で切断可能な基を加水分解または分解することができる酵素、ペプチダーゼ(基質特異的であり得る)、およびホスファターゼが挙げられる。

0180

ジスルフィド結合などの切断可能な基は、pHの影響を受けやすいことがある。ヒト血清のpHは、7.4である一方、平均の細胞内pHは、わずかにより低く、約7.1〜7.3の範囲である。エンドソームは、5.5〜6.0の範囲のより酸性のpHを有し、リソソームは、約5.0のさらにより酸性のpHを有する。いくつかのリンカーは、好ましいpHで切断される切断可能な基を有し、それによって、細胞内のリガンドから、または細胞の所望の区画中に、カチオン性脂質を放出する。

0181

コンジュゲートは、特定の酵素によって切断することができる切断可能な基を含み得る。コンジュゲート中に組み込まれる切断可能な基のタイプは、標的にされる細胞に応じて決まる。例えば、肝臓標的化リガンドは、エステル基を含む化学的部分を介してカチオン性脂質に結合され得る。肝細胞は、エステラーゼが豊富であり、したがって、基は、エステラーゼが豊富でない細胞型中より効率的に肝細胞中で切断される。エステラーゼが豊富な他の細胞型としては、腎皮質、および精巣の細胞が挙げられる。

0182

ペプチド結合を含む結合基が、肝細胞および滑膜細胞などの、ペプチダーゼが豊富な細胞型を標的にする場合に使用され得る。

0183

一般に、候補の切断可能な基の好適性は、候補の基を切断する分解因子の能力(または条件)を試験することによって評価され得る。血液中でのまたは他の非標的組織と接触したときの切断に抵抗する能力についても候補の切断可能な基を試験することも望ましい。このように、第1の条件と第2の条件との間の切断に対する相対的感受性を決定することができ、ここで、第1の条件は、標的細胞内での切断を示すように選択され、第2の条件は、他の組織または生体液、例えば、血液または血清中での切断を示すように選択される。評価は、無細胞系で、細胞で、細胞培養で、器官もしくは組織培養で、または動物全体で行われ得る。無細胞条件または培養条件で最初の評価を行い、動物全体でのさらなる評価によって確認することが有用であり得る。好ましい実施形態において、有用な候補の化合物は、血液または血清(または細胞外条件を模倣するように選択されるインビトロでの条件下)と比較して少なくとも2、4、10または100倍速く、細胞内(または細胞内条件を模倣するように選択されるインビトロでの条件下)で切断される。
i.酸化還元で切断可能な基
切断可能な基の1つの種類は、還元または酸化により切断される酸化還元で切断可能な基である。還元で切断可能な基の例は、ジスルフィド連結基(−S−S−)である。候補の切断可能な基が、好適な「還元で切断可能な連結基」であるか、または例えば特定のiRNA部分および特定の標的化剤とともに使用するのに好適であるかを決定するために、本明細書に記載される方法に注目することができる。例えば、候補は、ジチオスレイトール(DTT)、または細胞内、例えば、標的細胞内で観察される切断の速度を模倣する、当該技術分野で公知の試薬を用いた他の還元剤を用いたインキュベーションによって評価され得る。候補はまた、血液または血清条件を模倣するように選択される条件下で評価され得る。好ましい実施形態において、候補の化合物は、血液中で10%以下切断される。好ましい実施形態において、有用な候補の化合物は、血液(または細胞外条件を模倣するように選択されるインビトロでの条件下)と比較して少なくとも2、4、10または100倍速く、細胞内(または細胞内条件を模倣するように選択されるインビトロでの条件下)で分解される。候補の化合物の切断の速度は、細胞内媒体を模倣するように選択され、細胞外媒体を模倣するように選択される条件と比較される条件下で標準的な酵素動力学アッセイを用いて決定され得る。
ii.ホスフェート系の切断可能な基
ホスフェート系の切断可能な基は、リン酸基を分解または加水分解する薬剤によって切断される。細胞内のリン酸基を切断する薬剤の例は、細胞内のホスファターゼなどの酵素である。ホスフェート系の連結基の例は、−O−P(O)(ORk)−O−、−O−P(S)(ORk)−O−、−O−P(S)(SRk)−O−、−S−P(O)(ORk)−O−、−O−P(O)(ORk)−S−、−S−P(O)(ORk)−S−、−O−P(S)(ORk)−S−、−S−P(S)(ORk)−O−、−O−P(O)(Rk)−O−、−O−P(S)(Rk)−O−、−S−P(O)(Rk)−O−、−S−P(S)(Rk)−O−、−S−P(O)(Rk)−S−、−O−P(S)(Rk)−S−である。好ましい実施形態は、−O−P(O)(OH)−O−、−O−P(S)(OH)−O−、−O−P(S)(SH)−O−、−S−P(O)(OH)−O−、−O−P(O)(OH)−S−、−S−P(O)(OH)−S−、−O−P(S)(OH)−S−、−S−P(S)(OH)−O−、−O−P(O)(H)−O−、−O−P(S)(H)−O−、−S−P(O)(H)−O−、−S−P(S)(H)−O−、−S−P(O)(H)−S−、および−O−P(S)(H)−S−である。好ましい実施形態は、−O−P(O)(OH)−O−である。これらの候補は、上述されるものと類似の方法を用いて評価され得る。
iii.酸で切断可能な基
酸で切断可能な基は、酸性条件下で切断される連結基である。好ましい実施形態において、酸で切断可能な基は、約6.5以下(例えば、約6.0、5.5、5.0、またはそれを下回る)のpHを有する酸性環境において、または一般酸として作用し得る酵素などの薬剤によって切断される。細胞内で、エンドソームおよびリソソームなどの特定の低いpHの細胞小器官が、酸で切断可能な連結基のための切断環境を提供することができる。酸で切断可能な基の例としては、以下に限定はされないが、ヒドラゾン、エステル、およびアミノ酸のエステルが挙げられる。酸で切断可能な基は、一般式−C=NN−、C(O)O、または−OC(O)で表され得る。好ましい実施形態は、エステルの酸素に結合される炭素(アルコキシ基)がアリール基、置換アルキル基、またはジメチルペンチルまたはt−ブチルなどの第三級アルキル基である場合である。これらの候補は、上述されるものと類似の方法を用いて評価され得る。
iv.エステル系の基
エステル系の切断可能な基は、細胞内のエステラーゼおよびアミダーゼなどの酵素によって切断される。エステル系の切断可能な基の例としては、以下に限定はされないが、アルキレン、アルケニレンおよびアルキニレン基のエステルが挙げられる。エステルで切断可能な連結基は、一般式−C(O)O−、または−OC(O)−で表される。これらの候補は、上述されるものと類似の方法を用いて評価され得る。
v.ペプチド系の切断基
ペプチド系の切断可能な基は、細胞内のペプチダーゼおよびプロテアーゼなどの酵素によって切断される。ペプチド系の切断可能な基は、アミノ酸の間で形成されて、オリゴペプチド(例えば、ジペプチド、トリペプチドなど)およびポリペプチドを生じるペプチド結合である。ペプチド系の切断可能な基は、アミド基(−C(O)NH−)を含まない。アミド基は、任意のアルキレン、アルケニレンまたはアルキニレンの間に形成され得る。ペプチド結合は、アミノ酸の間で形成されて、ペプチドおよびタンパク質を生じる特殊なタイプのアミド結合である。ペプチド系の切断基は、一般に、アミノ酸の間で形成されて、ペプチドおよびタンパク質を生じるペプチド結合(すなわち、アミド結合)に限定され、アミド官能基全体を含むわけではない。ペプチド系の切断可能な連結基は、一般式−NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)−で表され、式中、RAおよびRBが、2つの隣接するアミノ酸のR基である。これらの候補は、上述されるものと類似の方法を用いて評価され得る。本明細書において使用される際、「糖質」は、酸素、窒素または硫黄原子各炭素原子に結合された、少なくとも6つの炭素原子を有する1つ以上の単糖単位(直鎖状、分枝鎖状または環状であり得る)から構成されるそれ自体糖質である化合物;または酸素、窒素または硫黄原子が各炭素原子に結合された、それぞれが少なくとも6つの炭素原子を有する1つ以上の単糖(直鎖状、分枝鎖状または環状であり得る)から構成される糖質部分をその一部として有する化合物を指す。代表的な糖質としては、糖(単糖、二糖、三糖および約4〜9つの単糖単位を含有するオリゴ糖)、ならびにでんぷん、グリコーゲン、セルロースおよび多糖ガムなどの多糖類が挙げられる。具体的な単糖としては、C5以上(好ましくは、C5〜C8)糖が挙げられ;二糖および三糖としては、2つまたは3つの単糖単位(好ましくは、C5〜C8)を有する糖が挙げられる。
リガンド
リガンドは、本明細書に記載される任意のリガンドであり得る。

0184

他の好適なリガンドは、それぞれが参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第2009/0239814号明細書、同第2012/0136042号明細書、同第2013/0158824号明細書、または同第2009/0247608号明細書に記載されている。
製剤
本明細書に記載されるコンジュゲートは、被験体に投与するために製剤化され得る。説明しやすくするために、この項における製剤、組成物および方法は、主に、非修飾iRNA剤のコンジュゲートに関して説明される。しかしながら、これらの製剤、組成物および方法が、他のオリゴヌクレオチド、例えば、修飾されたiRNA剤のコンジュゲートで実施することができ、このような実施が本発明の範囲内にあることが理解されるであろう。

0185

製剤化されたiRNAコンジュゲートは、様々な状態をとり得る。ある例において、コンジュゲートは、少なくとも部分的に結晶性、均一の結晶性、および/または無水(例えば、80、50、30、20、または10%未満の水)である。別の例において、iRNAコンジュゲートは、水相中、例えば、水を含む溶液中にある。

0186

水相または結晶性コンジュゲートは、例えば、送達ビヒクル、例えば、リポソーム(特に、水相の場合)または粒子(例えば、結晶性組成物に適切であり得るように、微小粒子)中に組み込まれ得る。一般に、iRNAコンジュゲートは、意図される投与方法と適合する方法で製剤化される。iRNAコンジュゲートは、核酸脂質ナノ粒子中に組み込まれ得る。一実施形態において、各ナノ粒子は、コンジュゲート、カチオン性脂質(例えば、約5〜約7などの約4〜約11の範囲のpKaを有するカチオン性脂質)、非カチオン性脂質中性脂質など)、凝集還元剤(ポリエチレングリコール(PEG)またはPEG修飾脂質など)、および任意選択的にステロール(例えば、コレステロール)を含む。

0187

特定の実施形態において、組成物は、以下の方法、すなわち、噴霧乾燥凍結乾燥真空乾燥蒸発流動床乾燥、またはこれらの技術の組合せ;または脂質を用いた超音波処理、凍結乾燥、凝縮および他の自己集合のうちの少なくとも1つによって調製される。

0188

iRNAコンジュゲートは、別の薬剤、例えば、別の治療剤またはiRNAを安定させる薬剤、例えば、iRNAと複合体を形成して、iRNPを形成するタンパク質と組み合わせて製剤化され得る。さらに他の薬剤としては、キレート剤、例えば、EDTA(例えば、Mg2+などの二価カチオンを除去するため)、塩、RNAse阻害剤(例えば、RNAsinなどの広い特異性のRNAse阻害剤)などが挙げられる。

0189

一実施形態において、iRNA組成物は、少なくとも1つの第2の治療剤(例えば、RNAまたはDNA以外の薬剤)を含む。例えば、ウイルス性疾患、例えば、HIVの治療用のiRNA組成物は、公知の抗ウイルス剤(例えば、プロテアーゼ阻害剤または逆転写酵素阻害剤)を含んでいてもよい。別の例において、癌の治療用のiRNA組成物は、化学療法剤をさらに含んでいてもよい。

0190

iRNAコンジュゲートは、細胞中へのiRNA剤の取り込みに影響を与える(例えば、増加させる)薬剤とともに製剤化されてもよい。薬剤は、iRNA剤が投与される前、その後、またはそれと同時に投与され得る。薬剤はまた、iRNA剤に共有結合され得る。薬剤は、例えば、リポ多糖、p38MAPキナーゼ活性化因子、またはNF−κBの活性化因子であり得る。薬剤は、細胞に一過性の影響を与え得る。

0191

一実施形態において、使用される薬剤は、例えば、細胞の細胞骨格破壊することによって、例えば、細胞の微小管マイクロフィラメント、および/または中間体フィラメントを破壊することによって、細胞中へのiRNA剤の取り込みを増加させる。薬剤は、例えば、タキソンビンクリスチンビンブラスチンサイトカラシン、ノコダゾール、ジャスプラキノリド、ラトランクリンA、ファロイジン、スウィンホリドA、インダノシン、またはミオセルビンであり得る。

0192

薬剤はまた、例えば、炎症反応を活性化することによって、細胞中へのiRNAコンジュゲートの取り込みを増加させることができる。このような効果を有し得る例示的な薬剤としては、腫瘍壊死因子α(TNF−α)、インターロイキン−1β、またはγインターフェロンが挙げられる。

0193

本発明は、以下の実施例によってさらに例示され、実施例は、さらなる限定として解釈されるべきではない。本出願全体を通して引用される全ての参照文献、係属中の特許出願および公開特許の内容は、参照により本明細書に明示的に援用される。

0194

略語:TBAHSは、テトラブチルアンモニウム硫酸水素塩であり;DCMは、ジクロロメタンであり;NHSは、N−ヒドロキシスクシンアミドであり;DIEAは、N,N−ジイソプロピルエチルアミンであり;EDCは、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドである。
実施例1:非環状リンカー−1による三本鎖GalNAcモノマーの合成
三本鎖GalNAc部分211a〜dを、以下のスキーム1に示されるように合成する。

0195

0196

i.(S)−1−((S)−2,2−ジメチル−1,3−ジオキソラン−4−イル)エタン−1,2−ジオール201の合成
メタノール(60mL)中の市販の(R)−メチル2−((S)−2,2−ジメチル−1,3−ジオキソラン−4−イル)−2−ヒドロキシアセテート200(1.9g)の撹拌溶液に、固体水素ホウナトリウム(0.4g)を、0〜5℃で加え、添加後、反応混合物を室温に温め、20分間撹拌する。反応混合物を飽和塩アンモニウム希釈し、ジクロロメタンで抽出する。有機層をNa2SO4上で乾燥させ、濃縮して、粗生成物(1.6g)を単離し、それをさらに精製せずに次の工程にそのまま使用する。
ii.(S)−2−((S)−2,2−ジメチル−1,3−ジオキソラン−4−イル)−2−ヒドロキシエチルメタンスルホネート202の合成
ジクロロメタン(60mL)中のアルコール201(1.6g)の溶液に、トリエチルアミン(1.5mL)を加え、混合物を撹拌しながら冷却する。この撹拌溶液に、ジクロロメタン(30mL)中のメタンスルホニルクロリド(1.3g)を滴下して加え、混合物を室温で2時間撹拌し、その後、反応混合物を、飽和NaHCO3溶液(100mL)、続いて塩水(100mL)で洗浄し、有機層を、無水Na2SO4上で乾燥させた後、濃縮する。このように得られた粗生成物を、シリカゲルを用いて精製すると、純粋な生成物が得られた。
iii.203a〜dの合成のための一般的な手順
一般的な手順において、核酸塩基(2当量)を、110℃で無水DMF(100mL)に溶解させ、この撹拌溶液に、固体CsCO3(2g)およびヨウ化ナトリウム(2g)を加え、混合物を激しく撹拌する。この撹拌溶液に、無水DMF(10mL)中のメシレート202(1当量)の溶液を滴下して加える。反応混合物を、110℃でさらに30分間撹拌した後、減圧下で濃縮する。残渣を酢酸エチルに溶解させ、有機層を、飽和NaHCO3(100mL)、塩水(100mL)で洗浄し、乾燥させる(無水Na2SO4)。有機層の濃縮により、粗生成物が得られ、それを、フラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製して、純粋な生成物203a〜dを単離する。
iv.204a〜dの合成
アルコール203a〜dを、トリエチルアミンの存在下で、炭酸ジスクシンイミジル(DSC)で最初に処理して、スクシンイミジルエステルを得て、それを、ピリジンの存在下で、モノフタルイミド保護されたヘキサンジアミンで処理したところ、カラム精製の後、アミン置換された生成物204a〜dが得られる。
v.205a〜dの合成
204a〜d中のアセトニド保護を、報告される条件下で、酢酸で処理することによって除去したところ、205a〜dが得られ、それを次の工程にそのまま使用する。
vi.206a〜dの合成
ピリジン中のDMTrClによるジオール205a〜dの処理により、モノDMT保護されたアルコール206a〜dが得られるであろう。
vii.207a〜dの合成
フタルイミド保護されたアミン206a〜dを、室温で一晩、メタノール(20倍)中のメチルアミンの溶液で処理する。反応混合物の濃縮、続いてカラム精製により、脱保護アミン207a〜dが得られる。
viii.208a〜dの合成
EDCおよびヒューニッヒ塩基を用いた、アミン207a〜dによる一本鎖GalNAc含有カルボン酸の結合により、リガンドがコンジュゲートされたモノマー208a〜dが生じ得る。
ix.209a〜dの合成
同様の結合手順を用いて、アミン207a〜dによる、三本鎖GalNAc含有カルボン酸の結合により、三本鎖GalNAcがコンジュゲートされたモノマー209a〜dが生じ得る。
x.210a〜dおよび211a〜dの合成
CH2Cl2中のヒューニッヒ塩基の存在下における、2−シアノエチル−N,N−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイトを用いた、アルコール208a〜dおよび209a〜dのリン酸化により、対応するアミダイト210a〜dおよび211a〜dが、フラッシュカラム精製後に得られた。
実施例2:非環状リンカー−2を用いた三本鎖GalNAcモノマーの合成
三本鎖GalNAc部分219を、以下のスキーム2に示されるように合成する。

0197

0198

実施例3:非環状リンカー−3を用いた三本鎖GalNAcモノマーの合成
三本鎖GalNAc部分215を、以下のスキーム3に示されるように合成する。

0199

0200

i.222の合成
市販の(R)−グリシドールを、文献に報告されるようにODMTr保護されたエポキシド220に転化した。30分間にわたるマイクロ波照射下での、110℃での1,6−ジメチルアミノヘキサン221(6mmol、2当量)によるエポキシド220(1.12g、3mmol)の処理により、エポキシド開環生成物222が90%の収率で得られた。
ii.224の合成
カルボン酸223とのアミン222の結合により、結合された生成物224が良好な収率で得られた。
iii.225の合成
CH2Cl2中のヒューニッヒ塩基の存在下における2−シアノエチル−N,N−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイトを用いたアルコール224のリン酸化により、フラッシュカラム精製の後、対応するアミダイト225が得られた。
実施例4:三本鎖α−アノマー−コンジュゲート構成単位一般構造
下式で表される三本鎖α−アノマーを調製する。

0201

0202

例えば、R、R’、およびR”が、独立して、C6〜C10アリール、C6〜C10複素環式芳香族、C1〜C20アルキル、または糖(例えば、ガラクトースまたはGalNAc)であり得る。

0203

下式で表される三本鎖α−アノマーも調製する。

0204

0205

例えば、R、R’、およびR”が、独立して、C6〜C10アリール、C6〜C10複素環式芳香族、C1〜C20アルキル、または糖(例えば、ガラクトースまたはGalNAc)であり得る。
実施例5:三本鎖β−アノマー−コンジュゲート構成単位の一般構造
下式で表される三本鎖β−アノマーを調製する。

0206

0207

例えば、R、R’、およびR”が、独立して、C6〜C10アリール、C6〜C10複素環式芳香族、C1〜C20アルキル、または糖(例えば、ガラクトースまたはGalNAc)であり得る。
実施例6:二本鎖α−アノマー−コンジュゲート構成単位の一般構造
下式で表される二本鎖α−アノマーを調製する。

0208

0209

例えば、R、R’、およびR”が、独立して、C6〜C10アリール、C6〜C10複素環式芳香族、C1〜C20アルキル、または糖(例えば、ガラクトースまたはGalNAc)であり得る。
実施例7:モノ−、ビ−およびトリ−コンジュゲート構成単位の合成
モノ−、ビ−およびトリ−コンジュゲート構成単位が、以下に示されるように、アジド中間体から調製され得る。

0210

0211

実施例8:ASGPRリガンドの中間体(スキーム4〜8)の合成
ASGPRリガンドを調製するのに有用な中間体が、以下のスキーム4〜8に示されるように合成され得る。

0212

0213

化合物9の合成:N−アセチルグルコサミン(50g、226mmol)を、アリルアルコールに取り込み、90℃で24時間加熱する。反応混合物を室温に冷まし、アリルアルコールを蒸留によって除去する。残渣をピリジンに溶解させ、塩化ピバロイルと反応させたところ、化合物3が得られる。ピバロイルエステルを、2時間にわたってピリジン中のトリフルオロメタンスルホン酸無水物と反応させ、混合物を、水を加えることによってクエンチする。混合物を、90℃で24時間加熱したところ、生成物4が得られる。エステル基を、ナトリウムメトキシドによる処理によって除去し、化合物5を単離する。ヒドロキシル基をジメトキシプロパンによって保護したところ、生成物6が得られる。次に、それをDMF中の塩化トシルおよびアジ化ナトリウムと反応させたところ、化合物7が得られる。化合物7を、クリック付加環化(Click cylco−addition)およびMCPBAによるエポキシ化に供したところ、化合物9が生成される。

0214

0215

化合物13の合成:エポキシド13を、LiClO4の存在下でアンモニアと反応させたところ、アミノアルコール10が生成される。これを、ペプチド結合条件下で、N−Cbzアミノヘキサン酸と結合させたところ、化合物11が得られる。アセトニド保護の除去およびヒドロキシル基のベンゾイル化により、化合物12が生成される。MeOH中のPd/Cを用いた化合物12の水素化により、アミン13がTFA塩として生成される。

0216

0217

化合物17の合成:ペプチド結合条件下で、アミン13を、トリカルボン酸14と反応させたところ、化合物15が生成される。水素化により、化合物16が得られ、次に、それを、モノベンジルドデカン二酸と反応させたところ、保護された三本鎖中間体17が得られる。

0218

0219

ヒドロキシプロリン中間体20の合成:化合物17を、バルーン圧力下で水素化したところ、カルボン酸18が得られ、次に、それをアミン19と反応させたところ、ペプチド結合条件下で化合物20が生成される。

0220

0221

固体担体21の合成:ヒドロキシプロリン20を、無水コハク酸およびDMAPと反応させたところ、スクシネート誘導体が生成される。このスクシネート誘導体を、ペプチド結合条件を用いて固体担体上に充填したところ、担体21が得られる。
実施例9:三本鎖β−アノマー−コンジュゲート構成単位の合成(スキーム9〜10)

0222

0223

カルボン酸29の合成:化合物22を、DCE中のTMSOTfの存在下で、アルコール23と反応させたところ、カルボキシレート24が生成される。アセテート基を、MeOH中のTEAによって除去したところ、化合物25が得られる。DMTrをO−6位に導入し、ヒドロキシル基をベンゾイル化したところ、化合物26が得られる。酸性条件下でのDMTr基の除去およびMs−Clとの反応により、メシル誘導体が生成される。このメシル誘導体とアジ化ナトリウムとの反応により、C−6アジド誘導体27が得られる。クリック反応およびメチルエステルの脱保護により、カルボン酸29が得られる。

0224

0225

固体担体32の合成:カルボン酸29を、ペプチド結合条件下で三本鎖アミンと反応させたところ、三本鎖誘導体31が生成される。これを水素化し、カルボン酸をヒドロキシプロリンと反応させる。この中間体を無水コハク酸と反応させ、スクシネートを固体担体上に充填したところ、化合物32が得られる。
実施例10:二本鎖α−アノマー−コンジュゲート構成単位の合成(スキーム11〜14)

0226

0227

カルボン酸36の合成:ヒドロキシプロリン誘導体33を、HBTU/DIEAを用いてモノベンジルヘキサン二酸と反応させたところ、カルボキシレート35が生成され、それをさらに水素化したところ、カルボン酸36が得られる。

0228

0229

二本鎖固体担体41の合成:N−Bocグルタミン酸を、HBTU/DIEAを用いてアミン13と反応させたところ、化合物38が得られる。Boc保護基の脱保護およびカルボン酸36とこのアミンとの反応により、ヒドロキシプロリン誘導体39が得られる。TBDMSの除去および無水コハク酸とこのヒドロキシル基との反応により、スクシネート誘導体が生成される。これを固体担体上に充填したところ、二本鎖固体担体41が得られる。

0230

同様に、化合物54が、以下のスキーム13および14に示されるように調製され得る。

0231

0232

0233

実施例11:三本鎖α−アノマー構成単位の合成
三本鎖α−アノマー構成単位55は、以下のスキーム15によって調製され得る。

0234

0235

実施例12:三本鎖α−アノマーsiRNAコンジュゲートの合成:
前述されるコンジュゲート構成単位21(スキーム8を参照)を用いて、公知の手順にしたがって、RNAを、センス鎖の3’末端に結合されたリガンドと合成する。これをアンチセンス鎖とアニールさせる。生成物が以下に示される。

0236

0237

実施例13:三本鎖β−アノマーsiRNAコンジュゲートの合成:
前述されるコンジュゲート構成単位32(スキーム10を参照)を用いて、公知の手順にしたがって、RNAを、センス鎖の3’末端に結合されたリガンドと合成する。これをアンチセンス鎖とアニールさせる。生成物が以下に示される。

0238

0239

実施例14:二本鎖α−アノマーsiRNAコンジュゲートの合成:
前述されるコンジュゲート構成単位41(スキーム12を参照)を用いて、公知の手順にしたがって、RNAを、センス鎖の3’末端に結合されたリガンドと合成する。これをアンチセンス鎖とアニールさせる。

0240

0241

実施例15:オリゴヌクレオチドコンジュゲーションのためのモノ−GalNAc構成単位の合成
モノ−GalNAc構成単位104および105を、スキーム16に示されるように調製する。

0242

0243

102の合成:GalNAc酸100(8.39g、18.71mmol)およびヒドロキシプロリンアミン(10.00g、18.77mmol)を、ジクロロメタン中で合わせた。HBTU(10.68g、28.12mmol)およびDIEA(9.80mL、3当量)を加え、混合物を周囲温度で2時間撹拌した。生成物をTLCで調べ、反応混合物を分液漏斗に移し、水および塩水で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、溶媒を除去した。溶媒としてジクロロメタンおよびMeOHを用いたシリカゲルクロマトグラフィーによって粗生成物を精製したところ、化合物102が淡黄色のふんわりした固体(11.77g、63%)として得られた。1H NMR(400MHz、DMSO)δ7.80(d,J=9.2Hz、1H)、7.69(t,J=5.6Hz、1H)、7.39−7.09(m,9H)、6.86(ddd,J=9.0、5.4、2.1Hz、4H)、5.20(d,J=3.4Hz、1H)、5.03−4.83(m,2H)、4.47(d,J=8.5Hz、1H)、4.41−4.07(m,2H)、4.04−3.95(m,3H)、3.86(dt,J=11.2、8.9Hz、1H)、3.79−3.68(m,6H)、3.68−3.36(m,3H)、3.21−2.88(m,5H)、2.26−2.14(m,2H)、2.09(s,3H)、2.02(t,J=6.7Hz、2H)、1.98(s,3H)、1.87(d,J=7.5Hz、3H)、1.76(s,3H)、1.53−1.29(m,7H)。

0244

104の合成:ヒドロキシプロリン誘導体102(6.00g、6.24mmol)をジクロロメタン(100mL)に溶解させた。DIEA(2.20mL、3当量)およびクロロアミダイト試薬を加えた。反応混合物を30分間撹拌し、TLCで調べた。それを分液漏斗に移し、水および炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、溶離剤としてジクロロメタンおよびMeOHを用いたシリカゲルクロマトグラフィーによって粗生成物を精製したところ、化合物が白色のふんわりした固体として得られた。1H NMR(400MHz、DMSO)δ7.80(d,J=9.2Hz、1H)、7.68(s,1H)、7.42−7.06(m,8H)、7.01−6.73(m,4H)、5.20(d,J=3.3Hz、1H)、4.96(dd,J=11.2、3.3Hz、1H)、4.63(d,J=4.7Hz、1H)、4.47(d,J=8.5Hz、1H)、4.15(s,1H)、4.01(s,3H)、3.86(d,J=11.0Hz、1H)、3.70(d,J=16.5Hz、9H)、3.45(ddd,J=37.0、23.3、16.4Hz、6H)、2.99(dd,J=12.3、6.4Hz、3H)、2.74(dd,J=9.2、5.8Hz、2H)、2.21(s,2H)、2.09(s,3H)、2.05−1.95(m,5H)、1.88(s,3H)、1.76(s,3H)、1.52−1.16(m,11H)、1.16−1.02(m,11H).31P NMR δ=151.78、151.61、151.50、151.30。

0245

105の合成:化合物102(2.10g、2.18mmol)をDCM(20mL)に溶解させた。この混合物に、無水コハク酸(0.441g、4.36mmol)およびDMAP(0.532g、当量)、続いてTEA(1ML)を加えた。反応混合物を室温で一晩撹拌した。そのTLCを調べ、反応混合物を水および塩水で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、粗生成物を、シリカゲルの小さいパッドに通してろ過した。溶媒を除去し、この材料を次の反応に使用した。上記の反応からのスクシネートを無水アセトニトリルに溶解させた。HBTU(1.59g、4.20mmol)およびDIEA(1.10ml)を加え、混合物を5分間回転させた。ポリスチレン固体担体を反応混合物に加え、混合物を周囲温度で一晩振とうした。固体担体をろ過し、洗浄し、無水酢酸/Py混合物を用いてキャッピングした。固体担体を、ジクロロメタン、MeOH/DCMおよびエーテル(27.10g、55umol/g)で再度洗浄した。
実施例16:一本鎖αアノマーsiRNAの合成:
前述されるコンジュゲート構成単位104および105(スキーム16を参照)を用いて、公知の手順にしたがって、RNAを、センス鎖の3’末端に結合されたリガンドと合成する。これをアンチセンス鎖とアニールさせる。生成物が以下に示される。

0246

0247

実施例17:合成後コンジュゲーションのためのトリフルオロアセトアミド誘導体の合成
中間化合物8を、以下のスキーム17に示されるように調製する。

0248

0249

化合物2の合成:Z−アミノカプロン酸(22.2g、82.50mmol)をDMF(250mL)に溶解させ、0℃に冷却した。溶液に、ジイソプロピルエチルアミン(44.4mL、275mmol)、HBTU(40.4g、106.7mmol)、およびHOBT(30.0g、220mmol)を加えた。0℃で20分間にわたってアルゴン下で撹拌した後、4−ヒドロキシ−l−プロリンメチルエステル塩酸塩(20.0g、110mmol)を加え、室温で一晩、アルゴン下で撹拌を続けた。反応混合物を蒸発乾固させた。残渣に、酢酸エチル(250mL)を加えた。有機層を、水、飽和炭酸水素ナトリウム、再び水、および飽和塩化ナトリウムで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させた。粗化合物2(Rf=10%のMeOH/DCM中0.5、24.30g)が得られた。不純物を除去するために、まず2%のメタノール/ジクロロメタン、続いて5%のメタノール/ジクロロメタンで溶離することによって、カラムクロマトグラフィーによって化合物2を精製したところ、21.36g(65%)が得られた。1H NMR(400MHz、DMSO−d6):環におけるアミド結合による観察される回転異性体。δ7.35(m,5H)、5.15(d,OH、D2O交換可能)、4.99(s,2H)、4.27(m,1H)、3.97(m,1H)、3.58(s,1H)3.20−3.47(m,5H)、2.94−3.02(m,2H)、2.10−2.32(m,2H)、1.74−2.01(m,2H)、1.35−1.4(m,4H)、1.22−1.28(m,4H)。

0250

化合物3の合成:化合物2(21.36g、54.43mmol)をTHF(200mL)に溶解させた。反応混合物を、0℃で20分間にわたってアルゴン下で撹拌した。次に、水素化ホウ素リチウム(1.19g、54.43mmol)を、0℃で20分間にわたって溶液に加え、室温で一晩、アルゴン下で撹拌を続けた。反応混合物を0℃に冷却した。過剰な水素化ホウ素リチウムを、5MのNaOH(30mL)でクエンチした。30分間撹拌した後、反応混合物を蒸発乾固させた。残渣に、ジクロロメタン(200mL)を加えた。有機層を、水および飽和塩化ナトリウムで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させた。粗化合物3(Rf=10%のMeOH/DCM中0.4、35.88g)が得られた。不純物を除去するために、3%のメタノール/ジクロロメタン、続いて5%のメタノール/ジクロロメタンで溶離することによってカラムクロマトグラフィーによって化合物3を精製したところ、9.21g(49%)が得られた。1H NMR(400MHz、DMSO−d6):環におけるアミド結合による観察される回転異性体。δ7.35(m,5H)、4.99(s,H)、4.91(d,OH、D2O交換可能)、4.77(t,OH、D2O交換可能)、4.27(m,1H)、3.97(m,1H)、3.20−3.47(m,5H)、2.94−3.02(m,2H)、2.10−2.32(m,2H)、1.74−2.01(m,2H)、1.35−1.4(m,4H)、1.22−1.28(m,4H).13C NMR(100mMHz、DMSO−d6):δ171.4、171.1(回転異性体のために小さい)、156.1、137.3、128.9、128.3、128.2、127.7、125.3、68.2、67.4、65.1、63.4、62.0、57.6、55.1、54.9、53.3、40.1、39.9、39.7、39.5、39.3、39.1、38.9、37.4、36.1、34.2、32.6、29.3、26.1、26.0、24.6、24.1、21.0。

0251

化合物4の合成:化合物3(9.21g、25.27mmol)を、無水ピリジン(80mL)と2回同時蒸発させた。次に、化合物を、一晩、高真空下に置いて乾燥させた。化合物3を高真空から取り出し、無水ピリジン(200mL)に溶解させた。この溶液に、触媒量のジメチルアミノピリジン(0.35g、2.53mmol)を加えた。反応混合物を、0℃で30分間にわたってアルゴン下で撹拌した。次に、DMT−Cl(9.0g、26.53mmol)を0℃で溶液に加えた。混合物を、減圧下、続いてアルゴン下で撹拌し、室温で一晩、アルゴン下で撹拌を続けた。過剰なDMT−Clを、メタノール(15mL)の添加によってクエンチした。反応混合物を蒸発乾固させ、残渣に、ジクロロメタン(200mL)を加えた。有機層を、水、飽和炭酸水素ナトリウム、再び水、および飽和塩化ナトリウムで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させた。粗化合物4(Rf=100%のEtOAc中0.6、14.02g)が得られた。不純物を除去するために、まずヘキサン中50%の酢酸エチル(1%のTEA)、続いて100%の酢酸エチル(1%のTEA)で溶離することによって、カラムクロマトグラフィーによって化合物4を精製したところ、12.36g(73.4%)が白色の発泡体状の固体として得られた。1H NMR(400MHz、DMSO−d6):δ7.17−7.33(m,14H)、4.99(s,2H)、4.91(d,OH、D2O交換可能)、4.37(m,1H)、4.01(m,1H)、3.72(s,6H)3.56(m,1H)3.29(m,1H)、3.14(m,1H)、2.93−3.02(m,4H)、2.18(m,2H)1.74−2.01(m,2H)、1.37−1.41(m,6H)。

0252

化合物5の合成:化合物4(12.36g、18.54mmol)を、10%のメタノール/酢酸エチル(300mL)に溶解させ、アルゴンでパージした。反応混合物に、湿潤活性炭Degussaタイプ(1.3g)に担持された10重量%のパラジウムを加えた。フラスコをアルゴンで再パージした。フラスコを水素で2回パージし、次に、水素を、10秒間にわたって反応混合物に通してバブリングした。反応混合物を、室温で一晩、水素下で撹拌し続けた。反応混合物を、セライトが充填された焼結漏斗上にデカントし、メタノールで2回洗浄した。有機層を蒸発乾固させたところ、化合物5(Rf=.05 10%のMeOH/DCM、9.16g、93%)が白色の固体として得られ、それはさらに精製する必要がなかった。1H NMR(400MHz、DMSO−d6):δ7.15−7.31(m,9H)、6.86(m,4H)4.99(s,1H)、4.37(m,1H)、4.01(m,2H)、3.72(s,6H)3.56(m,1H)3.29(m,1H)、3.14(m,1H)、2.93−3.02(m,2H)、2.45(m,2H)、2.18(m,2H)1.74−2.01(m,2H)、1.37−1.41(m,3H)1.13−1.38(m,4H)。

0253

化合物6の合成:化合物5(9.16g、17.2mmol)をジクロロメタン(200mL)に溶解させた。反応混合物を、10℃で10分間にわたってアルゴン下で撹拌した。反応混合物に、トリエチルアミン(4.80mL、34.4mmol)を滴下して加え、混合物を10℃で20分間にわたってアルゴン下で撹拌し続けた。反応混合物に、トリフルオロ酢酸エチル(3.05mL、25.8mmol)を滴下して加え、混合物を10℃で10分間にわたってアルゴン下で撹拌し続けた。反応混合物を、室温で一晩、アルゴン下で撹拌し続けた。反応混合物を、水および飽和塩化ナトリウムで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させた。粗化合物6(Rf=0.6 10%のMeOH/DCM、10.89g)が得られた。5%のメタノール/ジクロロメタン(1%のTEA)で溶離することによってカラム精製すると、化合物6(8.76g、81%)が黄色の発泡体状の固体として得られた。1H NMR(400MHz、DMSO−d6):δ7.56−7.09(m,9H)、7.01−6.52(m,4H)、5.34−5.04(m,1H)、4.99−4.78(m,1H)、4.48−4.25(m,2H)、3.83−3.67(m,6H)、3.60−3.50(m,1H)、3.49−3.18(m,2H)、3.16−2.91(m,2H)、2.89−2.56(m,2H)、2.54−2.32(m,2H)、2.32−1.69(m,3H)、1.59−1.03(m,4H).19F NMR(400MHz、DMSO−d6):−77.14(s,3F)。

0254

化合物7の合成:化合物6(8.76g、13.93mmol)、ジメチルアミノピリジン(5.10g、41.79mmol)、およびトリエチルアミン(3.90mL、27.86mmol)をジクロロメタン(300mL)に溶解させた。反応混合物を、10分間にわたってアルゴン下で撹拌した。次に、無水コハク酸(2.80g、27.86mmol)を加え、混合物を、室温で一晩、アルゴン下で撹拌し続けた。反応混合物を、わずかに飽和した塩化ナトリウムの溶液で2回洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させた。化合物7(Rf=0.9 10%のMeOH/DCM、10.87g、94%)が白色の固体として得られ、それはさらに精製する必要がなかった。

0255

化合物8の合成:化合物7(2.00g、2.41mmol)をアセトニトリル(100mL)に溶解させた。溶液に、ジイソプロピルエチルアミン(1.68mL、9.64mmol)およびHBTU(1.83g、4.82mmol)を加えた。反応混合物を10分間にわたって振とうした。CPG(27g)をフラスコに加え、混合物を、一晩、振とうし続けた。CPG化合物および反応混合物を、焼結漏斗上にデカントした。反応混合物を、1%のトリエチルアミン/ジクロロメタンで洗浄し、続いて、10%のメタノール/ジクロロメタンで2回洗浄し、1%のトリエチルアミン/ジクロロメタン、および無水ジエチルエーテルでさらに洗浄した。CPG化合物を1時間にわたって真空乾燥させ、次に、漏斗から回収し、2時間にわたって高真空下に置いた。CPG化合物(5.0mg)を脱ブロック(de−blocking)へと送った。残りのCPG化合物に、25%の無水酢酸/ピリジン(100mL)を加え、混合物を一晩振とうした。CPG化合物および反応混合物を焼結漏斗上に入れ、前述されるのと同じように洗浄した。CPG化合物を1時間にわたって真空乾燥させ、漏斗から取り出し、2時間にわたって高真空下に置いた。CPG化合物(7.1mg)を脱ブロックへと送った。分光光度計:キャッピング前.9892Abs(502.0nm)65マイクロモル/g、キャッピング後1.4403(502.0nm)67マイクロモル/g。

0256

化合物9の合成:化合物6(8.89g、14.14mmol)およびジイソプロピルエチルアミン(4.93mL、28.28mmol)を無水ジクロロメタン(60mL)に溶解させた。反応混合物を、5分間にわたってアルゴン下で撹拌した。次に、N,N−ジイソプロピルアミノシアノエチルホスホロアミド酸塩化物(5.63mL、16.26mmol)を反応混合物に加えた。反応混合物を、室温で30分間にわたってアルゴン下で撹拌し続けた。反応の完了がTLCによって観察された。反応混合物をジクロロメタン(100mL)で希釈した。有機層を、水、飽和炭酸水素ナトリウム、再び水、および飽和塩化ナトリウムで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させたところ、粗化合物9(Rf=0.44 5%のMeOH/DCM、11.02g)が得られた。3%のメタノール/ジクロロメタン(1%のTEA)で溶離することによってカラム精製すると、化合物9(6.31g、54%)が黄色の固体として得られた。1H NMR(400MHz、DMSO−d6)δ9.37(s,1H)、7.63(d 1H)、7.42−6.98(m,8H)、6.92−6.77(m,4H)、4.25−3.90(m,2H)、3.78−3.64(m,7H)、3.48(d,3H)、3.29(d,1H)、3.23−2.92(m,4H)、2.86(d,1H)、2.73(t,1H)、2.58(t,1H)、2.53−2.47(m,4H)、2.33−1.87(m,4H)、1.55−0.97(m,12H)。31P(400MHz、DMSO−d6):151.68(d,1P)。
実施例18:合成後コンジュゲーションのためのカルバメートリンカーの合成

0257

0258

4−Z−アミノブタノール13:4−アミノブタン−1−オール(26mL、280mmol)およびCbz−Oスクシネート(104.7g、420mmol)をジクロロメタン(200mL)に溶解させた。反応混合物を、10℃で20分間にわたってアルゴン下で撹拌した。次に、10℃で、アルゴン下で反応混合物を撹拌し続けながら、トリエチルアミン(78mL、560mmol)を溶液に加えた。反応混合物を、室温で一晩、アルゴン下で撹拌し続けた。反応混合物を、水、飽和炭酸水素ナトリウム、再び水、および飽和塩化ナトリウムで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させたところ、粗化合物2(Rf=0.5 10%のMeOH/DCM、71.97g)が白色の固体として得られた。これをさらに精製せずに次の工程に使用した。

0259

DSCで活性化された4−Z−アミノブタノール14:粗化合物13(6.0g)およびDSC(10.33g 40.31mmol)をジクロロメタン(100mL)に溶解させた。反応混合物を、0℃で30分間にわたってアルゴン下で撹拌した。トリエチルアミン(7.88mL、53.74mmol)を滴下して加え、混合物を、0℃で5分間にわたってアルゴン下で撹拌した。反応混合物を、室温で一晩、アルゴン下で撹拌し続けた。反応混合物をジクロロメタン(100mL)で希釈した。有機層を、水、再び水、および飽和塩化ナトリウムで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させたところ、粗化合物14(Rf=0.85 10%のMeOH/DCM、11.14g)が淡褐色の固体として得られた。これをさらに精製せずに次の工程に使用した。

0260

化合物17:化合物16(5.00g、7.48mmol)を、10%のメタノール/酢酸エチル(100mL)に溶解させ、アルゴンでパージした。反応混合物に、湿潤活性炭Degussaタイプ(0.5g)に担持された10重量%のパラジウムを加えた。フラスコをアルゴンで再パージした。フラスコを水素で2回パージし、次に、水素を、10秒間にわたって反応混合物に通してバブリングした。反応混合物を、室温で一晩、水素下で撹拌し続けた。反応混合物を、Celiteが充填された焼結漏斗上にデカントし、メタノールで2回洗浄した。有機層を蒸発乾固させたところ、化合物17(Rf=.03 5%のMeOH/DCM、3.4g、87%)が白色の固体として得られ、それはさらに精製する必要がなかった。1H NMR(400MHz、DMSO−d6)δ7.41−7.14(m,9H)、6.99−6.72(m,4H)、4.96(d,1H)、4.30(s,1H)、4.04−3.58(m,6H)、3.46−3.25(m,1H)、3.21−2.81(m,3H)、2.52−2.46(m,2H)、1.97(d,3H)、1.63−1.42(m,4H)。

0261

化合物18:化合物17(3.2g、5.98mmol)をジクロロメタン(80mL)に溶解させた。反応混合物を、10℃で10分間にわたってアルゴン下で撹拌した。反応混合物に、トリエチルアミン(1.67mL、11.96mmol)を滴下して加え、混合物を10℃で20分間にわたってアルゴン下で撹拌し続けた。反応混合物に、トリフルオロ酢酸エチル(1.06mL、8.97mmol)を滴下して加え、混合物を10℃で10分間にわたってアルゴン下で撹拌し続けた。反応混合物を、室温で一晩、アルゴン下で撹拌し続けた。反応混合物を、水、飽和炭酸水素ナトリウム、再び水、および飽和塩化ナトリウムで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させた。化合物18(Rf=0.45 5%のMeOH/DCM、3.33g、88%)が黄色の発泡体状の固体として得られ、それはさらに精製する必要がなかった。1H NMR(400MHz、DMSO−d6)δ7.46−7.03(m,9H)、6.86(d,4H)、4.93(s,1H)、4.29(s,1H)、4.11−3.63(m,2H)、3.53−2.79(m,5H)、2.53(d,2H)、2.30(d,2H)、1.99(d,3H)、1.76(s,1H)、1.36(t,4H).19F NMR(400MHz、DMSO−d6):−77.11(s,3F)。

0262

化合物19:化合物18(2.0g、3.17mmol)、ジメチルアミノピリジン(1.16g、3.48mmol)、およびトリエチルアミン(0.88mL、6.34mmol)をジクロロメタン(50mL)に溶解させた。反応混合物を、10分間にわたってアルゴン下で撹拌した。次に、無水コハク酸(0.63g、6.34mmol)を加え、混合物を、室温で一晩、アルゴン下で撹拌し続けた。反応混合物を、わずかに飽和した塩化ナトリウムの溶液で2回洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固させた。粗化合物19(Rf=0.9 10%のMeOH/DCM、3.23g)が得られた。5%のメタノール/ジクロロメタン(1%のTEA)で溶離することによってカラム精製すると、化合物12(2.58g、98%)が白色の固体として得られた。1H NMR(400MHz、DMSO−d6):δ9.43(d,1H)、7.45−7.04(m,9H)、7.02−6.71(m,4H)、5.51−4.91(m,2H)、4.16−2.95(m,9H)、2.67(q,4H)、2.58−2.36(m,6H)、2.31−2.02(m,2H)、1.33(d,4H)。

0263

化合物20:化合物19(2.03g、2.40mmol)をアセトニトリル(100mL)に溶解させた。溶液に、ジイソプロピルエチルアミン(1.67mL、9.64mmol)およびHBTU(1.82g、4.82mmol)を加えた。反応混合物を10分間にわたって振とうした。CPG(27g)をフラスコに加え、混合物を、一晩、振とうし続けた。CPG化合物および反応混合物を、焼結漏斗上にデカントした。反応混合物を、1%のトリエチルアミン/ジクロロメタンで洗浄し、続いて、10%のメタノール/ジクロロメタンで2回洗浄し、1%のトリエチルアミン/ジクロロメタン、および無水ジエチルエーテルでさらに洗浄した。CPG化合物を1時間にわたって真空乾燥させ、次に、漏斗から回収し、2時間にわたって高真空下に置いた。CPG化合物(6.7mg)を脱ブロックへと送った。残りのCPG化合物に、25%の無水酢酸/ピリジン(150mL)を加え、混合物を一晩振とうした。CPG化合物および反応混合物を焼結漏斗上に入れ、前述されるのと同じように洗浄した。CPG化合物を1時間にわたって真空乾燥させ、漏斗から取り出し、2時間にわたって高真空下に置いた。CPG化合物(6.9mg)を脱ブロックへと送った。分光光度計:キャッピング前1.8396Abs(502.0nm)90.3マイクロモル/g、キャッピング後1.8798Abs(502.0nm)89.6マイクロモル/g。

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