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課題・解決手段

本発明は、RSV感染呼吸器合胞体ウイルス(RSV)の少なくとも1つの抗原ペプチドもしくは抗原タンパク質、またはその断片、バリアントもしくは誘導体をコードしているコード領域を含んでいる、mRNA配列に関する。さらに、本発明は、RSV感染の呼吸器合胞体ウイルス(RSV)の少なくとも1つの抗原ペプチドもしくは抗原タンパク質、またはその断片、バリアントもしくは誘導体をコードしているコード領域を含んでいる複数のmRNA配列を含んでいる、組成物に関する。本発明は、mRNA配列、または複数のmRNA配列を含んでいる組成物の、薬学的組成物(特にワクチン(例えば、RSV感染 呼吸器合胞体ウイルス(RSV)感染の予防または処置における使用のための))の調製のための使用を開示している。本発明は、mRNA配列を用いたRSVの処置または予防の方法をさらに説明している。

概要

背景

概要

本発明は、RSV感染呼吸器合胞体ウイルス(RSV)の少なくとも1つの抗原ペプチドもしくは抗原タンパク質、またはその断片、バリアントもしくは誘導体をコードしているコード領域を含んでいる、mRNA配列に関する。さらに、本発明は、RSV感染の呼吸器合胞体ウイルス(RSV)の少なくとも1つの抗原ペプチドもしくは抗原タンパク質、またはその断片、バリアントもしくは誘導体をコードしているコード領域を含んでいる複数のmRNA配列を含んでいる、組成物に関する。本発明は、mRNA配列、または複数のmRNA配列を含んでいる組成物の、薬学的組成物(特にワクチン(例えば、RSV感染 呼吸器合胞体ウイルス(RSV)感染の予防または処置における使用のための))の調製のための使用を開示している。本発明は、mRNA配列を用いたRSVの処置または予防の方法をさらに説明している。

目的

したがって、特に乳児老人および免疫障害のある患者における、RSV感染の予防または処置のためのワクチンとしての使用を目的とする

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
1件

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請求項1

呼吸器合胞体ウイルス(RSV)の融合タンパク質F、糖タンパク質G、短い疎水性タンパク質SH、マトリクスタンパク質M、核タンパク質N、ラージポリメラーゼL、M2−1タンパク質、M2−2タンパク質、リンタンパク質P、非構造タンパク質NS1、または非構造タンパク質NS2に由来する少なくとも1つの抗原ペプチドもしくは抗原タンパク質、またはその断片、バリアントもしくは誘導体をコードしているコード領域を含んでおり、上記コード領域のG/C含有量は、野生型mRNAのコード領域のGC含有量と比べて向上されており、好ましくは、上記GC富化されたmRNAの、コードされているアミノ酸配列は、野生型mRNAの、コードされているアミノ酸配列と比べて、変更されていない、mRNA配列

請求項2

上記コード領域は、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)の融合タンパク質F、核タンパク質Nまたは糖タンパク質Gの全長タンパク質をコードしている、請求項1に記載のmRNA配列。

請求項3

上記抗原ペプチドまたは抗原タンパク質は、RSV株ATCCVR−26long由来である、請求項1または2に記載のmRNA配列。

請求項4

a)5’キャップ構造b)ポリ(A)配列、c)および任意に、ポリ(C)配列をさらに含んでいる、請求項1〜3のいずれかに記載のmRNA配列。

請求項5

上記ポリ(A)配列は、約25〜約400のアデノシンヌクレオチドの配列、好ましくは、約50〜約400のアデノシンヌクレオチドの配列、より好ましくは約50〜300のアデノシンヌクレオチドの配列、より一層好ましくは約50〜約250のアデノシンヌクレオチドの配列、最も好ましくは約60〜約250のアデノシンヌクレオチドの配列を含んでいる、請求項4に記載のmRNA配列。

請求項6

少なくとも1つのヒストンステムループをさらに含んでいる、請求項1〜5のいずれかに記載のmRNA配列。

請求項7

上記少なくとも1つのヒストンステム−ループは、以下の式(I)または(II):式(I)(ステム境界エレメントなしのステム−ループ配列):式(II)(ステム境界エレメントありのステム−ループ配列):から選択され、ステム1またはステム2の境界エレメントN1−6は、1〜6、好ましくは2〜6、より好ましくは2〜5、より一層好ましくは3〜5、最も好ましくは4〜5または5のNの連続する配列であり、Nのそれぞれは、他のNから独立して、A、U、T、GおよびCから選択されるヌクレオチド、またはそのヌクレオチド類似物から選択され;ステム1[N0−2GN3−5]は、ステム2のエレメント逆相補的または部分的に逆相補的であり、かつ5〜7のヌクレオチドの間の連続する配列であり;N0−2は、0〜2、好ましくは0〜1、より好ましくは1のNの連続する配列であり、Nのそれぞれは、他のNから独立して、A、U、T、GおよびCから選択されるヌクレオチド、またはそのヌクレオチド類似物から選択され;N3−5は、3〜5、好ましくは4〜5、より好ましくは4のNの連続する配列であり、Nのそれぞれは、他のNから独立して、A、U、T、GおよびCから選択されるヌクレオチド、またはそのヌクレオチド類似物から選択され、Gは、グアノシンまたはその類似物であり、ステム2におけるその相補的シチジンヌクレオチドがグアノシンによって置き換えられている条件のもとに、シチジンまたはその類似物に任意に置き換えられ得;ループ配列[N0−4(U/T)N0−4)]は、ステム1およびステム2のエレメントの間に配置されており、3〜5のヌクレオチド、より好ましくは4のヌクレオチドの連続する配列であり;N0−4のそれぞれは、他のNから独立して、0〜4、好ましくは1〜3、より好ましくは1〜2のNの連続する配列であり、Nのそれぞれは、他のNから独立して、A、U、T、GおよびCから選択されるヌクレオチド、またはそのヌクレオチド類似物から選択され;U/Tは、ウリジン、または任意にチミジンを表しており;ステム2[N3−5CN0−2]は、ステム1のエレメントと逆相補的または部分的に逆相補的であり、5〜7のヌクレオチドの間の連続する配列であり;N3−5は、3〜5、好ましくは4〜5、より好ましくは4のNの連続する配列であり、Nのそれぞれは、他のNから独立して、A、U、T、GおよびCから選択されるヌクレオチド、またはそのヌクレオチド類似物から選択され;N0−2は、0〜2、好ましくは0〜1、より好ましくは1のNの連続する配列であり、Nのそれぞれは、他のNから独立して、A、U、T、GおよびCから選択されるヌクレオチド、またはそのヌクレオチド類似物から選択され;Cは、シチジンまたはその類似物であり、ステム1におけるその相補的なグアノシンヌクレオチドがシチジンに置き換えられている条件のもとに、グアノシンまたはその類似物に任意に置き換えられ得;ステム1およびステム2は、互いに塩基対形成可能であり、塩基対形成がステム1およびステム2の間に生じ得る逆相補性配列を形成しているか、または不完全な塩基対形成がステム1およびステム2の間に生じ得る部分的な逆相補性配列を形成している、請求項6に記載のmRNA配列。

請求項8

上記少なくとも1つのヒストンステム−ループは、以下の式(Ia)または(IIa):式(Ia)(ステム境界エレメントなしのステム−ループ配列)式(IIa)(ステム境界エレメントありのステム−ループ配列)のうちの少なくとも1つのから選択される、請求項7に記載のmRNA配列。

請求項9

3’−UTRエレメントをさらに含んでいる、請求項1〜8のいずれかに記載のmRNA配列。

請求項10

上記少なくとも1つの3’−UTRエレメントは、安定なmRNAをもたらす遺伝子の3’−UTR、またはその相同物、断片もしくはバリアントに由来する核酸配列を含んでいるか、または当該核酸配列からなる、請求項9に記載のmRNA配列。

請求項11

上記3’−UTRエレメントは、アルブミン遺伝子、α−グロビン遺伝子、β−グロビン遺伝子、ヒストンヒドロキシラーゼ遺伝子リポキシゲナーゼ遺伝子、およびコラーゲンアルファ遺伝子からなる群から選択される遺伝子の3’UTR、またはその相同物、断片もしくはバリアントに由来する核酸配列を含んでいる、化合物または当該核酸配列からなる、請求項10に記載のmRNA配列。

請求項12

上記3’−UTRエレメントは、好ましくは配列番号29にしたがう核酸配列の対応するRNA配列を含んでいる、α−グロビン遺伝子の3’−UTR、またはその相同物、断片もしくはバリアントに由来する核酸配列を含んでいるか、または当該核酸配列からなる、請求項11に記載のmRNA配列。

請求項13

好ましくは5’から3’方向に向かって、a.)5’−キャップ構造、好ましくはm7GpppN;b.)好ましくは呼吸器合胞体ウイルス(RSV)の融合タンパク質Fに由来する、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)の少なくとも1つの抗原ペプチドまたは抗原タンパク質をコードしているコード領域c.)好ましくは配列番号29にしたがう核酸配列に対応するRNA配列を含んでいる、アルファグロビン遺伝子に由来する核酸配列を含んでいるか、または当該核酸配列からなる3’−UTRエレメント、その相同物、断片またはバリアントd.)好ましくは64のアデノシンを含んでいる、ポリ(A)配列;e.)好ましくは30のシトシンを含んでいる、ポリ(C)配列;ならびにf.)好ましくは配列番号30にしたがう核酸配列に対応する、mRNA配列を含んでいる、ヒストン−ステム−ループを含んでいる、請求項9〜12のいずれかに記載のmRNA配列。

請求項14

上記mRNA配列は、配列番号31にしたがうRNA配列を含んでいる、請求項13に記載のmRNA配列。

請求項15

上記少なくとも1つの3’−UTRエレメントは、脊椎動物のアルブミン遺伝子の3’−UTRもしくはそのバリアント、好ましくは哺乳類のアルブミン遺伝子の3’−UTRもしくはそのバリアント、より好ましくはヒトのアルブミン遺伝子の3’−UTRもしくはそのバリアント、より一層好ましくはGenBankAccession番号NM_000477.5にしたがうヒトのアルブミン遺伝子の3’−UTRもしくはそのバリアントに由来する核酸配列を含んでいるか、または当該核酸配列からなる、請求項9に記載のmRNA配列。

請求項16

上記3’−UTRエレメントは、配列番号25にしたがう核酸配列、好ましくは対応するRNA配列、その相同物、断片またはバリアントに由来する、請求項15に記載のmRNA配列。

請求項17

TOP遺伝子の5’−UTR、好ましくは対応するRNA配列、またはその相同物、断片もしくはバリアント(好ましくは5’TOPモチーフを欠いている)に由来する核酸配列を含んでいるか、または当該核酸配列からなる5’−UTRエレメントを、さらに含んでいる、請求項1〜16のいずれかに記載のmRNA配列。

請求項18

上記5’−UTRエレメントは、リボソームタンパク質をコードしているTOP遺伝子の5’−UTRに由来する核酸配列、好ましくは対応するRNA配列、またはそれらの相同物、断片もしくはバリアント(好ましくは5’TOPモチーフを欠いている)を含んでいるか、または当該核酸配列からなる、請求項17に記載のmRNA配列。

請求項19

上記5’−UTRエレメントは、リボソーム巨大タンパク質(RPL)をコードしているTOP遺伝子の5’−UTR、またはそれらの相同物、断片もしくはバリアント(好ましくは5’TOPモチーフを欠いている)に由来する核酸配列を含んでいるか、または当該核酸配列からなる、より好ましくは配列番号23にしたがう核酸配列の対応するRNA配列を含んでいるか、または当該RNA配列からなる、請求項18に記載のmRNA配列。

請求項20

好ましくは5’から3’方向に、a.)5’−キャップ構造、好ましくはm7GpppN;b.)TOP遺伝子の5’UTRに由来する核酸配列、その相同物、断片もしくはバリアントを含んでいるか、または当該核酸配列からなる、好ましくは配列番号23にしたがう核酸配列の対応するRNA配列を含んでいるか、または当該RNA配列からなる、5’−UTRエレメント;c.)呼吸器合胞体ウイルス(RSV)の少なくとも1つの抗原ペプチドまたは抗原タンパク質(好ましくは呼吸器合胞体ウイルス(RSV)の融合タンパク質Fに由来する)をコードしているコード領域;d.)安定なmRNAをもたらす遺伝子に由来する核酸配列、その相同物、断片もしくはバリアントを含んでいるか、または当該核酸配列からなる(好ましくは配列番号18にしたがう核酸配列の対応するRNA配列を含んでいるか、または当該RNA配列からなる)、3’UTRエレメント;e.)好ましくは64のアデノシンを含んでいる、ポリ(A)配列;f.)好ましくは30のシトシンを含んでいる、ポリ(C)配列;ならびにg.)好ましくは配列番号30にしたがう核酸配列の対応するRNA配列を含んでいる、ヒストン−ステム−ループを含んでいる、請求項19に記載のmRNA配列。

請求項21

配列番号32または33にしたがうRNA配列を含んでいる、請求項20に記載のmRNA配列。

請求項22

任意に、mRNAの、カチオン性もしくはポリカチオン性の化合物、および/または重合体担体に対する約6:1(w/w)〜約0.25:1(w/w)、より好ましくは約5:1(w/w)〜約0.5:1(w/w)、最も好ましくは約3:1(w/w)〜約2:1(w/w)の範囲から選択される重量比において;または任意に、約0.1〜10の範囲、好ましくは約0.3〜4または0.3〜1の範囲、最も好ましくは約0.5〜1または0.7〜1の範囲、なかでも最も好ましくは約0.3〜0.9または0.5〜0.9の範囲における、mRNAの、カチオン性もしくはポリカチオン性の化合物および/または重合体担体の窒素リン酸塩の比において、カチオン性もしくはポリカチオン性の化合物、または重合体担体と会合しているか、または複合化されている、請求項1〜21に記載のmRNA配列。

請求項23

カチオン性のタンパク質またはペプチド、好ましくはプロタミンと会合しているか、または複合化されている、請求項22に記載のmRNA配列。

請求項24

請求項1〜23のいずれかに記載のそれぞれのmRNA配列のうちの複数または2つ以上を含んでいる、組成物

請求項25

請求項1〜23のいずれかに規定されているmRNA配列または請求項24に規定されている組成物、ならびに任意に薬学的に許容可能な担体を含んでいる、薬学的組成物

請求項26

上記mRNAは、カチオン性もしくはポリカチオン性の化合物および/または重合体担体、好ましくは複数のカチオン性のタンパク質もしくはペプチド、最も好ましくはプロタミンと少なくとも部分的に複合化されている、請求項25に記載の薬学的組成物。

請求項27

複合化されているmRNAの、遊離mRNAに対する比は、約5:1(w/w)〜約1:10(w/w)、より好ましくは約4:1(w/w)〜約1:8(w/w)、より一層好ましくは約3:1(w/w)〜約1:5(w/w)または1:3(w/w)の範囲から選択され、最も好ましくは、複合化されているmRNAの、遊離mRNAに対する比は、1:1(w/w)の比から選択される、請求項26に記載の薬学的組成物。

請求項28

請求項1〜23のいずれかに規定されているmRNA配列、請求項24に規定されている組成物、請求項25〜27のいずれかに規定されている薬学的組成物の構成要素、ならびに任意に上記構成要素の投与および投与量に関する情報を有している技術的な指示書を含んでいる、キットまたはキットの部分。

請求項29

医薬としての使用のための、請求項1〜23のいずれかに規定されているmRNA配列、請求項24に規定されている組成物、請求項25〜27のいずれかに規定されている薬学的組成物、ならびに請求項28に規定されているキットまたはキットの部分。

請求項30

RSV感染処置または予防における使用のための、請求項1〜23のいずれかに規定されているmRNA配列、請求項24に規定されている組成物、請求項25〜27のいずれかに規定されている薬学的組成物、ならびに請求項28に規定されているキットまたはキットの部分。

請求項31

上記処置は、RSVの免疫グロブリン、特にPalivizumabの投与と組み合わせられる、請求項30にしたがう使用のための、mRNA配列、組成物、薬学的組成物、ならびにキットまたはキットの部分。

請求項32

a)請求項1〜23のいずれかに規定されているmRNA配列、請求項24に規定されている組成物、請求項25〜27のいずれかに規定されている薬学的組成物、または請求項28に規定されているキットもしくはキットの部分を準備すること;b)上記mRNA、組成物、薬学的組成物、またはキットもしくはキットの部分を、組織または生体に使用すること、または投与すること;c)任意に、RSV免疫グロブリンを投与することを包含している、RSV感染の処置または予防の方法。

発明の詳細な説明

0001

本発明は、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)の少なくとも1つの抗原ペプチドもしくはタンパク質、またはその断片、バリアントもしくは誘導体をコードしているコード領域を含んでいるmRNA配列に関する。さらに、本発明は、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)の少なくとも1つの抗原ペプチドもしくはタンパク質、またはその断片、バリアントもしくは誘導体をコードしているコード領域を含んでいる複数のmRNA配列を含んでいる組成物に関する。

0002

さらに、本発明はまた、薬学的組成物(特にワクチン(例えばRSV感染の予防または処置における使用のための))の調製のための、mRNA配列、または複数のmRNA配列を含んでいる組成物の使用を開示している。本発明は、mRNAワクチンを用いたRSV感染の処置または予防の方法を、さらに説明している。

0003

RSVの全世界的な医薬の必要性または経済的な影響力は、非常に高い。RSVは、乳児または幼児の間における通院という結果を招く、急性下気道感染(ALRI)の最も重要な原因である。例えば、合衆国では、60%を超える乳児が、最初のRSVの活動期の間にRSVに感染し、ほぼすべてが2〜3までに感染する。5歳未満のおよそ230万人の合衆国の子供(入院患者としての3%、救急診療における25%、および小児診療における73%)は、毎年、RSV疾患の処置を受けている。全世界的に、5歳未満の子供において、RSVは、毎年、推定で3380万人のALRI(すべてのALRIの22%を超える)を引き起こしており、66000〜199000人の死者(99%は発展途上国において発生している)を出している。RSVはまた、老人において呼吸器疾患の多くみられる原因であり、インフルエンザに強く免疫化されている集団におけるインフルエンザと同程度の入院期間をもたらす。RSVは、呼吸飛沫、または感染者もしくは汚染物との密接な接触によって伝播する。温帯気候において、例年の冬季流行がある。乳児は、最初の6か月において重篤なRSV疾患について最も高い危険な状態にあり、入院加療ピークは、2〜3か月齢にある。早期出産および心肺疾患は、重篤なRSV疾患にとっての危険因子である。乳児のRSV感染は、他の呼吸器ウイルスのほとんどに対する免疫よりも速やかに衰えると思われる防御免疫を部分的に引き出す。生年にRSVに感染したほとんどの子供は、一般により低い重篤度において翌年に再感染する。再感染は、しぱしば上気道の症状、ときに下気道または副鼻腔併発をともなって生涯にわたって持続する。RSV細気管支炎推奨される処置は、呼吸器の支持および加湿から主になる。特異的な抗ウイルス療法は推奨されていない。中和モノクローナル抗体Palivizumabは、重篤な感染への最も高い危険な状態にある乳児の予防に使用されるが、一般的な使用には高価でありすぎ、実際的ではない。現在、使用許諾されているRSVワクチンがなく、安全かつ有効なRSVワクチンの開発は、世界的な公衆衛生優先事項である。

0004

1960年代のワクチン治験において、乳児および幼児は、ホルマリン不活性化された全ビリオンのRSV調製物(FIRSV)または同等のパラミクソウイルス調製物(FIPIV)を用いて免疫化されていた。FI−PIVを用いて免疫化され、かつそれから、次のRSVの活動期の間にRSVに自然に感染した対象の5%は、入院させられ;FI−RSVを用いて免疫化され、それからRSVに感染した対象の80%は、入院させられ;2人の子供は死亡した。ワクチン接種に起因するRSVの増進は、RSV感染に対するワクチンの開発に特有の問題点である(Shaw et al. Curr Opin Virol. 2013 Jun;3(3):332-42. doi: 10.1016/j.coviro.2013.05.003. Epub 2013 May 30.)に概括されている)。

0005

したがって、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)感染は、発展途上国において乳児ワクチンの未解決の必要性を最も強く残しており、全世界的に重要な未解決の乳児ワクチンを必要としている。40年を超える試みは、ヒト用に使用許諾されたワクチンをいまだにもたらしていない。

0006

まとめると、パラミクソウイルスのウイルス科に属するRSVは、最も伝染性の高い病原体の1つであり、乳児、老人および免疫障害のある患者における気道感染に大きく寄与している。

0007

上述の通り、現在のところ、ウイルスの表面Fタンパク質に対するヒト化されたモノクローナル抗体は、高い危険性とみなされている乳児(早期出産の乳児および慢性肺疾患にかかっている乳児)に推奨されている、市場における予防的な製品のみである(TheIMpact-RSVStudy Group. 1998. Palivizumab, a Humanized Respiratory Syncytial Virus Monoclonal Antibody, Reduces Hospitalization From Respiratory Syncytial Virus Infection in High-risk Infants. Pediatrics, 102(3), S.531-537., Tablan et al. 2003. Guidelines for preventing health-care--associated pneumonia, 2003: recommendations of CDC and the Healthcare Infection Control Practices Advisory Committee. MMWR. Recommendations and Reports: Morbidity and Mortality Weekly Report. Recommendations and Reports / Centers for Disease Control, 53(RR-3), S.1-36.)。

0008

動物モデルを用いた最近の研究は、RSVFタンパク質を標的とする十分な量の中和抗体が、ウイルス複製を制限し、疾患の重篤度のより小さい経過を導くことを証明した(Singh, S.R. et al., 2007. Immunogenicity and efficacy of recombinant RSV-F vaccine in a mouse model. Vaccine, 25(33), S.6211-6223.、Zhan, X. et al., 2007. Respiratory syncytial virus (RSV) F protein expressed by recombinant Sendai virus elicits B-cell and T-cell responses in cotton rats and confers protection against RSV subtypes A and B. Vaccine, 25(52), S.8782-8793.、Vaughan, K., et al., 2005. DNA immunization against respiratory syncytial virus (RSV) in infant rhesus monkeys. Vaccine, 23(22), S.2928-2942)。

0009

さらに、平衡の保たれている制御性エフェクター細胞機能は、ウイルスの排除および疾患の重篤度の低下に必要とされていることが、示されている(Liu, J. et al., 2010. Epitope-specific regulatory CD4 T cells reduce virus-induced illness while preserving CD8 T-cell effector function at the site of infection. Journal of Virology, 84(20), S.10501-10509)。

0010

上述したヒト化されたモノクローナル抗体にもかかわらず、強い免疫応答を引き出すが、特定の標的の群(乳児、子供、老人、および免疫障害のある患者)における使用について推奨されない、弱毒化された生ワクチンが、開発された。また、B細胞エピトープ担持しているRSVFタンパク質を発現するDNAベクターが、中和抗体の産生を誘導するために使用された。これに関して、国際公開第2008/077527号および国際公開第96/40945号は、ワクチンとしての用途ために、RSV Fタンパク質をコードしているDNA配列を含んでいるベクターを開示している。しかし、ワクチンとしてのDNAの使用は、機能的な遺伝子の妨害およびがんもしくは抗DNA抗体の形成をおそらく導く、ゲノムへの所望されない挿入のために危険であり得る。

0011

したがって、特に乳児、老人および免疫障害のある患者における、RSV感染の予防または処置のためのワクチンとしての使用を目的とする、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)の抗原ペプチドまたは抗原タンパク質をコードしているmRNA配列を提供することが、根本的な発明の目的である。

0012

これらの目的は、添付の特許請求の範囲の主題によって解決される。特に、本発明の根本をなす目的は、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)の少なくとも1つの抗原ペプチドもしくは抗原タンパク質、またはその断片、バリアントもしくは誘導体をコードしているコード領域を含んでいる発明のmRNAによる第1の局面にしたがって解決される。

0013

明確さおよび読みやすさを目的として、以下の科学的な背景の情報および定義づけが示されている。それらによって明らかにされる任意の技術的な特徴点は、本発明の各実施形態およびすべての実施形態の一部であり得る。さらなる定義づけおよび説明は、本開示に鑑みて示され得る。

0014

免疫系:免疫系は、感染から生体を保護し得る。病原体が生体の物理的な障壁を通り抜け、この生体に侵入すると、先天性免疫系は、急速な非特異的応答をもたらす。病原体がこの先天性応答を回避した場合に、脊椎動物は、防御の第2の層である適応免疫系を保有している。ここで、免疫系は、上記病原体の認識を向上させるために、感染の間にその応答を適合させる。この向上された応答は、それから、上記病原体が排除された後に、免疫記憶の形において保持され、適応性の免疫系に遭遇するそれぞれのときにより早く、より強い攻撃を適応免疫系が仕掛けることを可能にする。これによれば、免疫系は、先天性免疫系および適応免疫系を包含している。これらの2つの部分のそれぞれは、いわゆる液性免疫成分および細胞性免疫成分を含んでいる。

0015

免疫応答:免疫応答は、典型的に、特定の抗原に対する適応免疫系の特異的応答(いわゆる特異的免疫応答または適応免疫応答)、または先天性免疫系の非特異的応答(いわゆる非特異的免疫応答または先天的免疫応答)のいずれかであり得る。本発明は、適応免疫系の特異的反応(適応免疫応答)にとっての中心に関する。特に、本発明は、例えばRSV感染のような、ウイルスによる感染に対する適応免疫反応に関する。しかし、この特異的反応は、追加の非特異的反応先天性免疫応答)によって補助され得る。したがって、本発明はまた、有効な適応免疫応答を誘起するための、先天性免疫系および適応免疫系の同時刺激のための化合物に関する。

0016

適応免疫系:適応免疫系は、高度に特化された系統細胞、ならびに病因となる増殖を排除するか、または防ぐ過程によって構成されている。適応免疫応答は、特定の病原体を認識し、かつ記憶する能力および病原体と遭遇するそれぞれのときにより強い攻撃を加える能力を、脊椎動物の免疫系にもたらす。上記系は、体性超変異(高頻度の体性変異の過程)、およびV(D)J組換え(抗原受容体遺伝子部分の不可逆的な遺伝学的組換え)のために、高い適応性を有している。この機序は、少ない数の遺伝子が、個々のリンパ球のそれぞれにおいて後ほど独自に発現される膨大な数の異なる抗原受容体を生成することを可能にする。遺伝子再配列は、各細胞(同じ受容体特異性をコードしている遺伝子を受け継いでいる後代の細胞(子孫)のすべて(長期にわたる特異的免疫にとって重要なメモリB細胞およびメモリT細胞が挙げられる))のDNAにおける不可逆的な変化を導く。免疫ネットワーク理論は、適応免疫系がどのように機能する(すなわちT細胞およびB細胞の受容体の可変領域、ならびに可変領域を有しているT細胞およびB細胞によって作られる分子の間における相互作用に基づいている)かの理論である。

0017

適応免疫応答:適応免疫応答は、抗原特異的であると典型的に理解される。抗原特異性は、特定の抗原、病原体または病原体感染細胞に合わせられている応答の発生を可能にする。合わせられているこれらの応答を行う能力は、「メモリ細胞」によって、身体に維持されている。病原体が2回以上にわたって身体に感染すると、これらの特定メモリ細胞は、病原体を速やかに排除するために使用される。これに関して、適応免疫応答の第1段階は、抗原提示細胞による抗原特異的な免疫応答を誘導可能な、ナイーブな特定のT細胞または異なる免疫細胞活性化である。これは、ナイーブなT細胞が常に通過しているリンパ組織および器官において生じる。抗原提示細胞として機能し得る細胞種は、特に、樹状細胞マクロファージおよびB細胞である。これらの細胞のそれぞれは、免疫応答の誘起において特徴的な機能を有している。樹状細胞は、ファゴサイトーシスおよびマクロピノサイトーシスによって抗原を取り込み、例えば外来性の抗原と、接触することによって刺激されて、成熟樹状細胞にそれらが分化する局所のリンパ組織に移動する。マクロファージは、粒状の抗原(例えば細菌)を摂取し、病原性物質または他の適切な刺激剤によって誘導されて、MHC分子を発現する。B細胞受容体を介した可溶性のタンパク質を結合し、かつ当該タンパク質を内部移行させる、B細胞の固有の能力はまた、T細胞を誘導するために重要であり得る。MHC分子に抗原を提示することは、それらの増殖および武装した(armed)エフェクターT細胞への分化を誘導するT細胞の活性化を導く。エフェクターT細胞の最も重要な機能は、CD8+細胞傷害性T細胞によって感染細胞死滅させること、および細胞媒介性免疫をともに形成するTh1細胞によるマクロファージの活性化、ならびに異なるクラスの抗体を産生し、したがって液性免疫応答を促進するための、Th1細胞およびTh2細胞の両方によるB細胞の活性化である。上記細胞は、抗原を直接に認識し、かつ結合しない代わりに、他の細胞の表面にあるMHC分子に結合されている短いペプチド断片(例えば抗原由来タンパク質抗原の)を認識するT細胞受容体によって抗原を認識する。

0018

細胞性免疫/細胞性免疫応答:細胞性免疫は、典型的に、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞(NK)、抗原特異的な細胞傷害性Tリンパ球の活性化、および抗原に応じた種々のサイトカインの放出に関する。より一般的に、細胞性免疫は、抗体に関しておらず、免疫系の細胞の活性化に関する。細胞性免疫は、例えば、(1)表面に抗原のエピトープを提示している体細胞(例えば、ウイルス感染細胞、細胞内に細菌を有している細胞、腫瘍抗原を提示しているがん細胞)におけるアポトーシスを誘導可能な、抗原特異的な細胞障害性Tリンパ球を活性化すること;(2)マクロファージおよびナチュラルキラー細胞を活性化すること(それらを、病原体を破壊可能にする);ならびに(3)細胞を刺激して適応免疫応答および先天性免疫応答に関与する他の細胞の機能に影響する、種々のサイトカインを分泌することによって、特徴付けられている。

0019

液性免疫/液性免疫応答:液性免疫は、抗体産生、およびそれに付随し得る補助的な過程に、典型的に関する。液性免疫応答は、例えばTh2活性化およびサイトカイン産生胚中心形成およびアイソタイプスイッチング結合性成熟およびメモリ細胞生成によって、典型的に特徴付けられている。液性免疫はまた、抗体のエフェクター機能(病原体および毒素中和、古典的な補体の活性化、ならびにファゴサイトーシスおよび病原体排除のオプソニン促進)を指し得る。

0020

先天性免疫系:先天性免疫系(非特異的免疫系としても知られている)は、他の生体による感染から、非特異的な様式において宿主を防御する細胞および機序を包含している。これは、適応免疫系と異なり、一般的な方法において、先天性系の細胞が病原体を認識し、応答することを意味し、宿主に対する長期の免疫または防御的な免疫を付与しない。先天性免疫系は、例えば、病原体関連分子パターン(PAMP)受容体(例えばトル様受容体TLR))のリガンドもしくは他の補助物質(例えば、リポ多糖、TNF−アルファ、CD40リガンド)、またはサイトカイン、モノカインリンフォカインインターロイキンもしくはケモカインIL−1、IL−2、IL−3、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−8、IL−9、IL−10、IL−12、IL−13、IL−14、IL−15、IL−16、IL−17、IL−18、IL−19、IL−20、IL−21、IL−22、IL−23、IL−24、IL−25、IL−26、IL−27、IL−28、IL−29、IL−30、IL−31、IL−32、IL−33、IFN−アルファ、IFN−ガンマGMCSF、G−CSF、M−CSF、LTベータ、TNF−アルファ、成長因子およびhGH)、ヒトのトル様受容体TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10のリガンド、マウスのトル様受容体TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、TLR12またはTLR13のリガンド、NODライク受容体のリガンド、RIG−1ライク受容体のリガンド、免疫刺激性核酸分子、免疫刺激性のRNA(isRNA)、CpG−DNA、抗菌剤、または抗ウイルス剤によって、活性化され得る。先天的免疫系の応答は、化学因子(サイトカインと呼ばれる、特殊化された化学媒介因子が挙げられる)の産生を介して、感染の部位に免疫細胞を補充すること;補体カスケードの活性化;器官、組織、血液およびリンパに存在する外来性物質の、特殊化された白血球による識別および除去;抗原提示として知られている過程を介した適応免疫系の活性化;および/または感染性物質に対する物理的および化学的な障壁として機能することを、典型的に包含している。

0021

アジュバント剤アジュバント成分:最も広義におけるアジュバント剤またはアジュバント成分は、典型的に、他の作用物質(例えば、薬剤またはワクチン)の有効性を変更(例えば向上)し得る(例えば薬学的または免疫学的な)作用物質または組成物である。通常、上記用語は、本発明に関して、免疫原および/または薬学的に活性な化合物にとっての担体または補助物質として機能する化合物または組成物を指す。上記用語は、広い意味において解釈されるべきであり、問題のアジュバント剤に組み込まれているか、または当該アジュバント剤とともに投与される抗原の免疫原性を向上させ得る広い範囲の物質を指す。本発明に関して、アジュバント剤は、本発明の活性剤の特異的な免疫原性作用を好ましく向上させる。典型的に、「アジュバント剤」または「アジュバント剤成分」は、同じ意味を有しており、相互に使用され得る。アジュバント剤は、免疫増強作用剤抗原送達系またはその組合せに分類され得る。

0022

「アジュバント剤」という用語は、それら自身によって免疫をもたらす作用物質を包含していないと、典型的に理解される。アジュバント剤は、例えば免疫系に対する抗原の提示または非特異的な先天性免疫応答の誘導を促進することによって、抗原特異的な免疫応答を向上させるために、免疫系を非特異的に補助する。さらに、アジュバント剤は、例えば有意なTh2に基づく抗原特異的な応答を、よりTh1に基づく抗原特異的な応答に、またはその逆に変更することによって、例えば抗原特異的な免疫応答を好ましく調節し得る。したがって、アジュバント剤は、サイトカイン発現/分泌、抗原提示、免疫応答の型などを有利に調節し得る。

0023

本発明に関する免疫刺激性RNA(isRNA)は、典型的に、それ自身が先天性免疫応答を誘導可能なRNAであり得る。通常、isRNAは、オープンリーディングフレームを有しておらず、ペプチド抗原または免疫原をもたらさないが、例えばトル様受容体(TLR)または適切な他の受容体のうちの特定の種類に対する結合によって、先天性免疫応答を引き出す。しかし、当然、オープンリーディングフレームを有しており、ペプチド/タンパク質(例えば、抗原機能)をコードしているmRNAは、先天性免疫応答を誘導し得る。

0024

抗原:本発明によれば、「抗原」という用語は、免疫系によって認識され得、適応免疫応答の一部としての抗体または抗原特異的なT細胞の形成によって、抗原特異的な免疫応答を誘起可能であり得る物質を、典型的に指す。抗原は、タンパク質またはペプチドであり得る。これに関連して、適応免疫応答の第1段階は、ナイーブな抗原特異的なT細胞の、抗原提示細胞による活性化である。これは、ナイーブT細胞が常に通過しているリンパ組織または器官において生じる。抗原提示細胞として機能するこれらの細胞種は、樹状細胞、マクロファージ、およびB細胞である。これらの細胞のそれぞれは、誘起する免疫応答において特徴的な機能を有している。組織の樹状細胞は、ファゴサイトーシスおよびマクロピノサイトーシスによって抗原を取り込み、感染によって刺激されて、それらが成熟樹状細胞に分化する局所的なリンパ組織に移動する。マクロファージは、粒状の抗原(例えば細菌)を摂取し、感染性因子によって誘導されて、MHCクラスII分子を発現する。それらの受容体を介して、可溶性タンパク質抗原と結合し、可溶性のタンパク質抗原を内部移行させる、B細胞の固有の能力は、T細胞を誘導するために重要であり得る。MHC分子上に抗原を提示することによって、それらの増殖および武装したエフェクターT細胞への分化を誘導するT細胞の活性化を導く。エフェクターT細胞の最も重要な能力は、CD8+細胞傷害性T細胞による感染細胞の殺傷および細胞媒介性免疫をともに作り上げているTH1細胞によるマクロファージの活性化、ならびに異なるクラスの抗体を産生する(したがって液性免疫を起こさせる)ための、TH2細胞およびTH1細胞の両方によるB細胞の活性化である。T細胞は、直接には抗原を認識せず、抗体と結合しないが、例えば病原体のタンパク質抗原の、短いペプチド断片(他の細胞の表面上にあるMHC分子に対して結合される)を認識するそれらのT細胞受容体によって抗原を認識する。

0025

T細胞は、異なるエフェクター機能を有している2つの主要なクラスに分類される。2つのクラスは、細胞表面タンパク質CD4およびCD8の発現によって識別される。身体の組織によってそれらの構造および発現パターン差異を有しているMHC分子の2つのクラス−MHCクラスI分子およびMHCクラスII分子がある。MHCクラスI分子およびMHCクラスII分子は、それらを認識するT細胞の異なるエフェクター機能を反映している、細胞内における異なる分布を有している。MHCクラスI分子は、それらが特異的に認識する任意の細胞を殺傷するために特殊化されている細胞傷害性T細胞に分化するCD8+T細胞に、例えば病原体(一般的にウイルス)からの、細胞質由来および核由来のペプチドを提示する。ほとんどすべての細胞は、MHCクラスI分子を発現するが、恒常的な発現のレベルは、1つの細胞種から次の細胞種までにおいて異なる。ウイルス由来病原性ペプチドが、MHCクラスI分子によって提示されるだけでなく、自己抗原様の腫瘍抗原もMHCクラスI分子によって提示される。MHCクラスI分子は、細胞質において分解され、小胞体輸送されたペプチドと結合する。感染細胞の表面におけるMHCクラスI:ペプチド複合体を認識するCD8+T細胞は、外来性ペプチドを提示している任意の細胞を殺傷し、したがってウイルスおよび他の病原体に感染している細胞の集団を駆除することに特化されている。MHCクラスII分子を認識するCD4+T細胞(CD4+ヘルパーT細胞)の主要な機能は、免疫系の他のエフェクター細胞を活性化することである。したがって、MHCクラスII分子は、免疫応答に参加する細胞であるBリンパ球、マクロファージおよび樹状細胞の上に通常に見られるが、他の組織細胞上には見られない。マクロファージは、例えば、それらが内部に含んでいる小胞内の病原体を殺傷するために活性化され、B細胞は、外来性の分子に対する免疫グロブリンを分泌するために活性化される。MHCクラスII分子は、エンドソームにおいて分解されたタンパク質に由来するペプチドを結合する。それらは、マクロファージの小胞系に入っている病原体由来のペプチド、または成熟樹状細胞、B細胞の免疫グロブリン受容体によって内部移行された病原体由来のペプチドを捕捉し得る。マクロファージおよび樹状細胞の小胞の内部に蓄積している多数の病原体は、TH1細胞の分化を刺激する傾向にあり、細胞外抗原は、TH2細胞の生成を刺激する傾向にある。TH1細胞は、マクロファージの殺菌特性を活性化させ、食作用性細胞による摂食のために細胞外病原体にオプソニンを作用させることに非常に有効なIgG抗体を生成するためにB細胞を誘導し、TH2細胞は、B細胞を活性化することによって液性応答を開始させて、IgGを分泌させ、微弱オプソニン化させる抗体(例えば、IgG1およびIgG3(マウス);およびIgG2およびIgG4(ヒト);ならびにIgAおよびIgE(マウスおよびヒト))の産生を誘導する。

0026

エピトープ(いわゆる「抗原決定基」):本発明に関してT細胞エピトープまたはそのタンパク質の部分は、約6〜約20またはそれ以上のアミノ酸の長さを好ましく有している断片(例えば、好ましくは約8〜約10アミノ酸(例えば8、9または10(さらに11または12アミノ酸))の長さを有している、MHCクラスI分子によって処理され、提示されるような断片、または好ましくは約13以上のアミノ酸(例えば、13、14、15、16、17、18、19、20またはそれ以上のアミノ酸)の長さを有している、MHCクラスII分子によって処理され、提示されるような断片)を構成し得る。ここで、これらの断片は、アミノ酸配列の任意の部分から選択され得る。これらの断片は、ペプチド断片およびMHC分子からなる複合体の形態においてT細胞によって典型的に認識される。

0027

B細胞エピトープは、典型的に、抗体によって認識され得る(すなわちそれらの未変性の形態にある)、好ましくは5〜15アミノ酸、より好ましくは5〜12アミノ酸、より一層好ましくは6〜9アミノ酸を有している、本明細書に規定されているような(未変性の)タンパク質またはペプチド抗原の外表面に位置している、断片である。

0028

タンパク質またはペプチドのそのようなエピトープは、当該タンパク質またはペプチドの本明細書に述べられているバリアントのいずれかからさらに選択され得る。これに関連して、抗原決定基は、立体配置的または不連続なエピトープであり得る。本明細書に規定されているようなタンパク質またはペプチドの断片(本明細書に規定されているようなタンパク質またはペプチドのアミノ酸配列において不連続であるが、3次元構造において集合しているか、または単一のポリペプチド鎖によって構成されている連続するエピトープもしくは直鎖状のエピトープである)によって構成されている。

0029

ワクチン:ワクチンは、少なくとも1つの抗原または抗原性機能をもたらす予防的または治療的な材料であると、典型的に理解される。抗原または抗原性機能は、身体の適応性免疫系を刺激して、適応免疫応答をもたらし得る。

0030

抗原をもたらすmRNA:本発明に関する抗原をもたらすmRNAは、当該mRNAを備えている細胞または生物によって翻訳され得る少なくとも1つのオープンリーディングフレームを有している、mRNAであり得る。この翻訳の産物は、抗原、好ましくは免疫原として機能し得るペプチドまたはタンパク質である。上記産物はまた、2つ以上の免疫原によって構成されている融合タンパク質(例えば、同じか、または異なるウイルスタンパク質に由来する2つ以上のエピトープ、ペプチドまたはタンパク質)であり得る。ここで、当該エピトープ、ペプチドまたはタンパク質は、リンカー配列によって連結され得る。

0031

二機能性多機能性mRNA:mRNAは、2(バイシストロン性)またはそれ以上(多シストロン性)のオープンリーディングフレーム(ORF)を有し得る。これに関連して、オープンリーディングフレームは、ペプチドまたはタンパク質に翻訳され得る数個ヌクレオチドトリプレットコドン)の配列である。そのようなmRNAの翻訳は、(ORFが同一ではない条件のもとに)2(バイシストロン性)またはそれ以上(多シストロン性)の別個翻訳産物を生じさせる。真核生物における発現にとって、そのようなmRNAは、例えば、内部リボソーム進入部位(IRES)配列を含み得る。

0032

5’キャップ構造:5’キャップ構造は、典型的に、mRNA分子の5’末端に加えられている修飾ヌクレオチド(特にグアニンヌクレオチド)である。好ましくは、5’キャップは、5’−5’−3リン酸結合(m7GpppNとも呼ばれる)を用いて付加される。5’キャップ構造のさらなる例としては、グリセリン逆位デオキシ脱塩基残基(部分)、4’,5’メチレンヌクレオチド、1−(ベータ−D−エリスロフラノシル)ヌクレオチド、4’−チオヌクレオチド、炭素管式ヌクレオチド、1,5−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド、L−ヌクレオチド、アルファ−ヌクレオチド、修飾塩基ヌクレオチド、スレオペントフラノシルヌクレオチド、非環式の3’,4’−セコヌクレオチド、非環式の3,4−ジヒドロブチルヌクレオチド、非環式の3,5ジヒドロキシフェニルヌクレオチド、3’−3’−逆位ヌクレオチド部分、3’−3’−逆位脱塩基ヌクレオチド部分、3’−2’−逆位脱塩基部分、1,4−ブタンジオールホスフェート、3’−ホスホラミダイトヘキシルホスフェート、アミノヘキシルホスフェート、3’−ホスフェート、3’ホスホロチオエートホスホジチオエート、または架橋もしくは非架橋のメチルホスホネート部分が挙げられる。これらの修飾5’キャップ構造は、本発明に関連して、発明のmRNA配列を修飾するために使用され得る。本発明に関連して使用され得るさらなる5’キャップ構造は、CAP1(mGpppNの隣接するヌクレオチドのリボースメチル化)、CAP2(mGpppNから2番目にある下流のヌクレオチドのリボースのメチル化)、CAP3(mGpppNから3番目にある下流のヌクレオチドのリボースのメチル化)、CAP4(mGpppNから4番目にある下流のヌクレオチドのリボースのメチル化)、ARCAアンチリバースキャップアナログ(anti-reverse CAP ananlog)、修飾ARCA(例えば、ホスホチオネート修飾されているARCA)、イノシン、N1−メチルグアノシン、2’−フルオロ−グアノシン、7−デアザ−グアノシン、8−オキソ−グアノシン、2−アミノグアノシン、LNA−グアノシン、および2−アジド−グアノシンである。

0033

タンパク質の断片:本発明に関連するタンパク質の「断片」は、本来(天然)のタンパク質(またはコードされているその核酸分子)のアミノ酸配列と比べて、そのアミノ酸配列(コードされているその核酸分子)について、N末端および/またはC末端トランケートされている、本明細書に規定されているようなタンパク質またはペプチドの配列を典型的に含み得る。したがって、そのようなトランケーションは、アミノ酸レベルまたはそれに対応する核酸レベルのいずれかにおいて生じ得る。したがって、本明細書に規定されているような当該断片に対する配列同一性は、本明細書に規定されているようなタンパク質もしくはペプチドの全体、または当該タンパク質もしくはペプチドの全体の(コードしている)核酸分子を、好ましく指し得る。

0034

本発明に関連するタンパク質またはペプチドの断片は、少なくとも5アミノ酸の長さ、好ましくは少なくとも6アミノ酸(好ましくは少なくとも7アミノ酸、より好ましくは少なくとも8アミノ酸、より一層好ましくは少なくとも9アミノ酸;より一層好ましくは少なくとも10アミノ酸;より一層好ましくは少なくとも11アミノ酸;より一層好ましくは少なくとも12アミノ酸;より一層好ましくは少なくとも13アミノ酸;より一層好ましくは少なくとも14アミノ酸;より一層好ましくは少なくとも15アミノ酸;より一層好ましくは少なくとも16アミノ酸;より一層好ましくは少なくとも17アミノ酸;より一層好ましくは少なくとも18アミノ酸;より一層好ましくは少なくとも19アミノ酸;より一層好ましくは少なくとも20アミノ酸;より一層好ましくは少なくとも25アミノ酸;より一層好ましくは少なくとも30アミノ酸;より一層好ましくは少なくとも35アミノ酸;より一層好ましくは少なくとも50アミノ酸;または最も好ましくは少なくとも100アミノ酸)の長さを有している、本明細書に規定されているような配列をさらに含み得る。例えば、そのような断片は、約6〜約20またはそれ以上のアミノ酸の長さを有し得る(例えば、MHCクラスI分子によって処理され、提示されるような断片(好ましくは約8〜約10アミノ酸(例えば、8、9または10(または6、7、11または12アミノ酸)))、またはMHCクラスII分子によって処理され、提示されるような断片(好ましくは約13以上のアミノ酸(例えば、13、14、15、16、17、18、19、20またはそれ以上のアミノ酸)))。ここで、これらの断片は、アミノ酸配列の任意の部分から選択され得る。これらの断片は、ペプチド断片およびMHC分子からなる複合体の形態においてT細胞によって典型的に認識される(すなわち、当該断片は、それらの本来の形態において典型的に認識されない)。タンパク質またはペプチドの断片は、それらのタンパク質またはペプチドの少なくとも1つのエピトープを含み得る。さらに、タンパク質の、細胞外ドメイン、細胞内ドメインもしくは膜貫通ドメイン、および短縮されているか、もしくはトランケートされている変形物はまた、タンパク質の断片を含んでいると理解され得る。

0035

タンパク質のバリアント:本発明に関して規定されているような、タンパク質またはペプチドの「バリアント」が、1つ以上の変異(例えば、1つ以上の置換されているアミノ酸、1つ以上の挿入されているアミノ酸、および/または1つ以上の欠失されているアミノ酸)において本来の配列と異なるアミノ酸配列を有して、生成され得る。好ましくは、これらの断片および/またはバリアントは、全長の本来のタンパク質と比べて、同じ生物学的な機能または特定の活性(例えば、特異的な抗原性特性)を有している。本発明に関連して規定されているようなタンパク質またはペプチドの「バリアント」は、それらの本来の(すなわち変異されていない生理学的な)配列と比べて、(複数の)保存的なアミノ酸置換を含み得る。特に、これらのアミノ酸配列およびそれらのコードしている核酸配列は、本明細書に規定されているようなバリアントという用語の範囲にある。同じ種類に由来するアミノ酸が互いに交換される置換は、保存的な置換と呼ばれる。特に、脂肪族側鎖、正もしくは負に荷電している側鎖、側鎖もしくはアミノ酸にある芳香族基水素結合に加わり得る側鎖(例えば、ヒドロキシル官能基を有している側鎖)を有しているアミノ酸がある。これは、極性側鎖を有しているアミノ酸が、同じく極性側鎖を有している他のアミノ酸によって置き換えられるか、または例えば、疎水性側鎖によって特徴付けられているアミノ酸が、同じく疎水性側鎖によって特徴付けられている他のアミノ酸によって置換(例えば、スレオニンセリン)によるセリン(スレオニン)またはイソロイシンロイシン)によるロイシン(イソロイシン))されることを意味する。挿入および置換は、三次元構造に変化を生じさせないか、結合領域に影響しないこれらの配列位置において起こり得る。(複数の)挿入または置換による三次元構造に対する変化は、CDスペクトル円偏光二色性スペクトル)(Urry, 1985, Absorption,Circular Dichroism and ORD of Polypeptides, in: Modern Physical Methodsin Biochemistry, Neuberger et al. (ed.), Elsevier, Amsterdam)を用いて容易に決定され得る。

0036

タンパク質またはペプチドの「バリアント」は、当該タンパク質またはおよびの10、20、30、50、75または100アミノ酸の範囲の全体にわたって、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%または99%のアミノ酸同一性を有している。

0037

さらに、核酸分子によってコードされ得る、本明細書に規定されているようなタンパク質またはペプチドのバリアントはまた、コード核酸配列のヌクレオチドが遺伝暗号縮重にしたがって、タンパク質またはペプチドのそれぞれのアミノ酸配列の変化を導くことなく交換されている(すなわち当該アミノ酸配列またはその少なくとも一部が、上述した意味の範囲において本来の配列から、1つ以上の変異において異なり得ない)これらの配列を包含している。

0038

2つの配列(例えば、本明細書に規定されているような複数の核酸配列またはアミノ酸配列(好ましくは本明細書に規定されているような重合性担体の核酸配列によってコードされているアミノ酸配列、またはアミノ酸配列自身))が同一であるパーセンテージを決定するために、上記配列は、後に互いに比較されるために、整列化され得る。したがって、例えば、第1の配列の位置は、第2の配列の対応する位置と比較され得る。第1の配列における位置が、第2の配列における位置にある同じ成分(残基)によって占められている場合、2つの配列は、この位置において同一である。こうではない場合、配列はこの位置において異なる。挿入が、第1の配列と比べて第2の配列に生じている場合、ギャップが第1の配列に挿入されて、さらなる整列化を可能にする。欠失が、第1の配列に比べて第2の配列に生じている場合、ギャップが第1の配列に挿入されて、さらなる整列化を可能にする。それから、2つの配列が同一であることのパーセンテージは、1つの配列のみに占められているこれらの位置を含んでいる位置の総数によって割った同一の位置の数の相関関係である。2つの配列が同一であるパーセンテージは、数学アルゴリズムを用いて決定され得る。好ましくは、使用され得る数学的アルゴリズムの例は、これらに限定されないが、好ましくは、Karlin et al. (1993), PNAS USA, 90:5873-5877またはAltschul et al. (1997), Nucleic AcidsRes., 25:3389-3402のアルゴリズムである。本発明の配列と特定の程度まで同一である配列は、このプログラムによって同定され得る。

0039

タンパク質またはペプチドの誘導体:タンパク質またはペプチドの誘導体は、他の分子(例えば、上記タンパク質またはペプチド)に由来する分子であると典型的に理解される。タンパク質またはペプチドの「誘導体」はまた、本発明に使用されるペプチドまたはタンパク質を含んでいる融合物を包含する。例えば、上記融合物は、標識(例えば、エピトープ(例えば、FLAGエピトープまたはV5エピトープ))を含んでいる。例えば、上記エピトープはFLAGエピトープである。そのようなタグは、例えば融合タンパク質の精製にとって有用である。

0040

モノシストロン性mRNA:モノシストロン性mRNAは、典型的に、1つのオープンリーディングフレームのみをコードしているmRNAであり得る。これに関連してオープンリーディングフレームは、ペプチドまたはタンパク質に翻訳され得る複数のヌクレオチドトリプレット(コドン)の配列である。

0041

核酸:核酸という用語は、任意のDNA分子またはRNA分子を意味し、ポリヌクレオチド同義に使用される。特定のタンパク質および/またはペプチドをコードしている核酸または核酸配列に言及がなされている場合には、当該核酸または核酸配列のそれぞれはまた、適切な宿主(例えばヒト)におけるその発現(例えば、特定のタンパク質またはペプチドをコードしている上記核酸配列の転写および/または翻訳)を可能にする制御配列を含んでいる。

0042

ペプチド:ペプチドは、アミノ酸単量体重合体である。通常、そのような単量体は、ペプチド結合によって連結されている。「ペプチド」という用語は、アミノ酸の重合体鎖の長さを限定しない。本発明のいくつかの実施形態において、ペプチドは、例えば、50未満の単量体ユニットを含んでいる。典型的に50〜600の単量体ユニット、より詳細には50〜300の単量体ユニットを有しているより長いペプチドは、ポリペプチドとも呼ばれる。

0043

薬学的に有効な量:本発明に関連して薬学的に有効な量は、免疫応答を誘導するために十分な量であると典型的に理解される。

0044

タンパク質:タンパク質は、典型的に、三次元的な形態に折りたたまれ、生物学的な機能を促進する1つ以上のペプチドおよび/またはポリペプチドからなる。

0045

ポリ(C)配列:ポリ(C)配列は、典型的に、シトシンヌクレオチド、典型的に約10〜約200のシトシンヌクレオチド、好ましくは約10〜約100のシトシンヌクレオチド、より好ましくは約10〜約70のシトシンヌクレオチド、より一層好ましくは約20〜約50のシトシンヌクレオチドまたはさらには約20〜約30のシトシンヌクレオチドの長い配列である。ポリ(C)配列は、核酸によって構成されているコード領域の3’に好ましく配置され得る。

0046

ポリAテイル:「3’ポリ(A)テイル」とも呼ばれるポリAテイルは、典型的に、約400以下のアデノシンヌクレオチド(例えば、約25〜約400、好ましくは約50〜約400、より好ましくは約50〜約300、より一層好ましくは約50〜約250、最も好ましくは約60〜約250のアデノシンヌクレオチド)の、RNAの3’末端に付加されているアデノシンヌクレオチドの長い配列である。

0047

安定化された核酸:安定化された核酸は、典型的に、インビボ分解(例えば、エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼによる分解)、および/またはエクスビボ分解(例えば、例えば投与されるワクチン溶液の調製の間における、ワクチン投与の前における製造過程による)に対する耐性を向上させる修飾を示す。RNAの安定化は、例えば5’キャップ構造、ポリAテイルまたは他のUTR修飾を付与することによって、実現され得る。RNAの安定化はまた、核酸の骨格修飾またはG/C含有量の変更によって実現され得る。種々の他の方法は、当該分野において知られており、本発明に関連して理解される。

0048

担体/重合性担体:本発明に関連する担体は、典型的に、他の化合物の輸送および/または複合体化を促進する化合物であり得る。そのような担体は、上記他の化合物と複合体を形成し得る。重合性担体は、重合体から形成されている担体である。

0049

カチオン性成分:「カチオン性成分」という用語は、典型的に約1〜9のpH値、好ましくは9以下(例えば、5〜9)、8以下(例えば、5〜8)、7以下(例えば、5〜7)のpH値、最も好ましくは生理学的pH値(例えば、7.3〜7.4)において正に荷電している、帯電分子カチオン)を、典型的に指す。したがって、本発明に係るカチオン性のペプチド、タンパク質または重合体は、生理学的な条件下(特にインビボにおける細胞の生理学的な塩の条件)において正に荷電している。カチオン性のペプチドまたはタンパク質は、他のアミノ酸より多数のカチオン性のアミノ酸(例えば、Arg、His、LysまたはOrn)(例えば、AspまたはGluのようなアニオン性のアミノ酸より多くのカチオン性のアミノ酸)、またはカチオン性のアミノ酸残基によって支配的に形成されているブロックを好ましく含んでいる。「カチオン性」の定義は、「ポリカチオン性」の成分をも指す。

0050

ビヒクル:薬学的組成物またはワクチンの成分を個体に投与することを容易にするために、薬学的組成物内において典型的に使用され得る、作用物質(例えば担体)。

0051

3’非翻訳領域(3’UTR):3’UTRは、典型的に、mRNAの、タンパク質をコードしている領域(すなわちオープンリーディングフレーム)およびポリ(A)配列の間に配置されているmRNAの一部である。mRNAの3’UTRは、アミノ酸配列に翻訳されない。3’UTR配列は、遺伝子発現過程の間に、それぞれのmRNAに転写される遺伝子によって一般的にコードされている。ゲノム配列は、付加的なイントロンを含んでいる未成熟mRNAにまず転写される。未成熟mRNAは、それから成熟過程において成熟mRNAにさらに処理される。この成熟過程は、5’キャッピング、付加的なイントロンを切除するための未成熟mRNAのスプライシング、および3’末端の修飾(例えば、未成熟mRNAの3’末端のポリアデニル化)および付加的なエキソヌクレアーゼ切断もしくはエンドヌクレアーゼ切断などを含んでいる。本発明に関連して、3’UTRは、タンパク質をコードしている領域のストップコドンに対する3’に(好ましくはタンパク質をコードしている領域のストップコドンに対する3’に)配置されており、かつポリ(A)配列の5’側に(好ましくはポリ(A)配列に対するすぐ5’にあるヌクレオチドに)伸びている、成熟mRNAの配列に対応する。「対応する」という用語は、3’UTR配列が、例えば3’UTR配列を規定するために使用されるmRNA配列における、RNA配列、または当該RNA配列に対応するDNA配列であり得ることを意味する。本発明に関連して、「遺伝子の3’UTR」(例えば、「アルブミン遺伝子の3’UTR」)は、この遺伝子に由来する成熟mRNA(すなわち上記遺伝子の転写および未成熟mRNAの成熟によって得られるmRNA)の3’UTRに対応する配列である。「遺伝子の3’UTR」という用語は、3’UTRのDNA配列およびRNA配列を包含している。

0052

5’非翻訳領域(5’UTR):5’UTRは、メッセンジャーRNA(mRNA)の特定の部分であると典型的に理解される。5’UTRは、mRNAのオープンリーディングフレームの5’に配置されている。典型的に、5’UTRは、転写開始部位に始まり、オープンリーディングフレームの開始コドンの1ヌクレオチド前で終わる。5’UTRは、遺伝子発現を制御するためのエレメント制御エレメントとも呼ばれる)を含み得る。当該制御エレメントは、例えば、リボソーム結合部位または5’末端オリゴピリミジントラクトであり得る。5’UTRは、例えば5’キャップの付加によって、転写後に修飾され得る。本発明に関連して、5’UTRは、5’キャップおよび開始コドンの間に配置されている、成熟mRNAの配列に対応する。好ましくは、5’UTRは、5’キャップに対する3’に配置されているヌクレオチド(好ましくは5’キャップに対するすぐ3’に配置されているヌクレオチド)から、タンパク質をコードしている領域の開始コドンに対する5’に配置されているヌクレオチド(好ましくはタンパク質をコードしている開始コドンに対するすぐ5’に配置されているヌクレオチド)まで伸びている配列に対応する。成熟mRNAの5’キャップに対するすぐ3’に配置されているヌクレオチドは、転写開始部位に対応する。「対応する」という用語は、5’UTR配列が、例えば5’UTR配列を規定するために使用されるmRNAにある、RNA配列、または当該RNA配列に対応するDNA配列であり得ることを意味する。本発明に関連して、「遺伝子の5’UTR」(例えば「TOP遺伝子の5’UTR」)という用語は、この遺伝子に由来する成熟mRNA(すなわち遺伝子の転写および未成熟mRNAの成熟によって得られるmRNA)の5’UTRに対応する配列である。「遺伝子の5’UTR」という用語は、5’UTRのDNA配列およびRNA配列を包含している。

0053

5’末端オリゴピリミジントラクト(TOP):5’末端オリゴピリミジントラクト(TOP)は、典型的に、核酸分子の5’末端領域(例えば、あるmRNA分子の5’末端領域)、またはある遺伝子の機能的な全体(例えば転写される領域)の5’末端領域に配置されているピリミジンヌクレオチドストレッチ(stretch)である。上記配列は、転写開始部位に一般的に対応するシチジン始まり、当該配列の後に約3〜30のピリミジンヌクレオチドのストレッチが続く。例えば、TOPは、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30またはそれ以上のヌクレオチドを含み得る。ピリミジンのストレッチ、およびしたがって5’TOPは、TOPの下流に配置されている最初のプリンヌクレオチドに対する5’の1ヌクレオチドで終わる。5’末端オリゴピリミジントラクトを含んでいるメッセンジャーRNAは、TOP mRNAとしばしば呼ばれる。したがって、当該メッセンジャーRNAをもたらす遺伝子は、TOP遺伝子と呼ばれる。TOP配列は、ペプチド伸長因子およびリボソームタンパク質をコードしている遺伝子およびmRNAに見られる。

0054

TOPモチーフ:本発明に関連して、TOPモチーフは、以上に規定されているような5’TOPに対応する核酸配列である。したがって、本発明に関連するTOPモチーフは、好ましくは、3〜30ヌクレオチドの長さを有しているピリミジンヌクレオチドのストレッチである。好ましくは、TOPモチーフは、少なくとも3のピリミジンヌクレオチド、好ましくは少なくとも4のピリミジンヌクレオチド、好ましくは少なくとも5のピリミジンヌクレオチド、より好ましくは少なくとも6のピリミジンヌクレオチド、より好ましくは少なくとも7のピリミジンヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも8のピリミジンヌクレオチドからなる。ここで、ピリミジンヌクレオチドの上記ストレッチは、シトシンヌクレオチドをともなうその5’に好ましく始まる。TOP遺伝子およびTOPmRNAにおいて、TOPモチーフは、好ましくは、転写開始部位をともなうその5’末端に始まり、上記遺伝子またはmRNAにおける最初のプリン残基に対する5’にある1ヌクレオチドで終わる。本発明の意味において、TOPモチーフは、5’UTRを表す配列の5’末端、または5’UTRをコードしている配列の5’末端に好ましく配置されている。したがって、好ましくは、3以上のピリミジンヌクレオチドのストレッチは、当該ストレッチがそれぞれの配列(例えば本発明のmRNA)の5’末端に配置されている場合に、本発明の意味において、いわゆる「TOPモチーフ」、本発明のmRNAの5’UTRエレメント、または本明細書に記載されているようなTOP遺伝子の5’UTRに由来する核酸配列である。言い換えれば、5’UTRまたは5’UTRエレメントの5’末端に配置されておらず、5’UTRまたは5’UTRエレメントの範囲のいずれかにある3以上のピリミジンヌクレオチドのストレッチは、好ましくは、「TOPモチーフ」と呼ばれない。

0055

TOP遺伝子:TOP遺伝子は、5’末端オリゴピリミジントラクトによって典型的に特徴付けられる。さらに、ほとんどのTOP遺伝子は、成長と関連する転写制御によって特徴付けられる。しかし、組織特異的な転写制御をともなうTOP遺伝子がまた、知られている。以上に規定されている通り、TOP遺伝子の5’UTRは、好ましくは5’キャップに対する3’に配置されているヌクレオチドから、開始コドンに対する5’に配置されているヌクレオチドまで伸びている、TOP遺伝子に由来する成熟mRNAの5’UTRの配列に対応する。TOP遺伝子の5’UTRは、任意の開始コドンを典型的に含んでおらず、好ましくは上流のAUG(uAUG)または上流のオープンリーディングフレーム(uORF)がない。これらにおいて、上流のAUGおよび上流のオープンリーディングフレームは、翻訳されるべきオープンリーディングフレームの開始コドン(AUG)の5’に存在するAUGおよびオープンリーディングフレームであると典型的に理解される。TOP遺伝子の5’UTRはむしろ一般的に短い。TOP遺伝子の5’UTRの長さは、20ヌクレオチド〜500ヌクレオチドの間において変化し得、典型的に約200ヌクレオチド未満、好ましくは約150ヌクレオチド未満、より好ましくは約100ヌクレオチド未満である。本発明の意味においてTOP遺伝子の例示的な5’UTRは、特許出願PCT/EP2012/002448WO2013/143700(参照によって本明細書に組み込まれる)の配列番号1〜1363、配列番号1395、配列番号1421および配列番号14221〜1363にしたがう配列、またはその相同物もしくはバリアントにおいて、5位のヌクレオチドから、開始コドン(例えばATG)に対してすぐ5’に配置されているヌクレオチドまで伸びている核酸配列である。これに関連して、TOP遺伝子の特に好ましい断片は、5’TOPモチーフを欠いているTOP遺伝子の5’UTRである。「TOP遺伝子の5’UTR」という用語は、天然に存在するTOP遺伝子の5’UTRを好ましく指す。

0056

核酸配列(特にmRNA)の断片:核酸配列の断片は、当該断片の核酸配列にとっての基準である全長核酸配列におけるヌクレオチドの連続するストレッチに対応する、ヌクレオチドの連続するストレッチからなり、当該全長核酸配列の、少なくとも20%、好ましくは少なくとも30%、より好ましくは少なくとも40%、より好ましくは少なくとも50%、より一層好ましくは少なくとも60%、より一層好ましくは少なくとも70%、より一層好ましくは少なくとも80%、最も好ましくは少なくとも90%を示す。本発明の意味において、好ましくは、当該断片は、全長核酸配列の核酸配列の機能的な断片である。

0057

核酸配列(特にmRNA)のバリアント:核酸配列のバリアントは、核酸配列の基準を形成する核酸配列のバリアントを指す。例えば、バリアントの核酸配列は、当該バリアントが由来する核酸配列と比べて、1つ以上のヌクレオチドの欠失、挿入、付加および/または置換を示し得る。好ましくは、核酸配列のバリアントは、当該バリアントが由来する核酸配列に対して、少なくとも40%、好ましくは少なくとも50%、より好ましくは少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、より一層好ましくは少なくとも80%、より一層好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%同一である。好ましくは、バリアントは機能的なバリアントである。核酸配列の「バリアント」は、当該核酸配列の10、20、30、50、75または100ヌクレオチドのストレッチの全体にわたって、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%または99%のヌクレオチド同一性を有し得る。

0058

核酸配列の相同物:核酸配列の「相同物」という用語は、特定の配列以外の、他の種の配列を指す。核酸配列は、ヒト由来であることが特に好ましく、したがって、相同物はヒトの核酸配列の相同物であることが好ましい。

0059

ジェットインジェクション:本明細書に使用されるとき「ジェットインジェクション」という用語は、針を使用しない注入方法を指し、ここで、少なくとも1つの本発明のmRNA配列および任意にさらなる好適な賦形剤を含んでいる液体が、開口部を押し通され、このようにして哺乳類の皮膚、および注入の設定に依存して皮下組織もしくは筋組織を貫通可能な高圧超微細流体流を生成させる。基本的に、流体流は、流体流が標的組織に押し込まれる皮膚に穴を形成する。好ましくは、ジェットインジェクションは、本発明に係るmRNA配列の皮内注入、皮下注入または筋肉内注入に使用される。好ましい実施形態において、ジェットインジェクションは、本発明のmRNAの皮内注入に使用される。

0060

本発明は、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)の少なくとも1つの抗原ペプチドまたは抗原タンパク質をコードしているコード領域を含んでいるmRNA配列が、抗原特異的な免疫応答を誘導し、したがって呼吸器合胞体ウイルス(RSV)感染を、予防するか、もしくは少なくとも最小化するという、本発明者らの意外な発見に基づく。本発明のmRNA配列が、ウイルス全体からなる不活性化RSVに基づくワクチンと比べて、少なくとも同様の免疫応答を誘導することは、非常に意外であった。より一層意外なことに、RSVの抗原タンパク質をコードしている本発明のmRNA配列は、不活性化RSVに基づくワクチンと対照的に、抗原特異的なCD8+−T細胞を誘導した。さらに、コットンラットのRSV抗原投与モデルにおいて、mRNAをワクチン接種した動物およびにおけるウイルス力価は、不活性化RSVウイルスに基づくワクチンを用いてワクチン接種した動物と比べて、非常に低かった。安全性について、本発明者らは、mRNAに基づくRSVワクチンがワクチンを介した疾患亢進に関する徴候を、ホルマリン不活性化ウイルスに基づくワクチンと比べて、肺病理に関してまったく示さないことを示し得た。さらに、意外にも、本発明のmRNA配列を用いた単独かつ単回のワクチン接種はすでに、投与された(複数の)抗原に対する免疫応答を誘起するために十分であることが、本発明者らによって見出されている。好ましくは皮内注入または筋肉内注入による、本発明のmRNAの単独かつ単回のワクチン接種は、RSVウイルスを用いた抗原投与後の肺におけるウイルス力価の低下に非常に有効であることが、見出されている。

0061

まとめると、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)の少なくとも1つのペプチドまたはタンパク質をコードしているコード領域を含んでいる、本発明のmRNAは、特に乳児、老人および免疫障害のある患者にとって、有効かつ安全なワクチンを提供し得る。

0062

これに関連して、本発明のmRNA配列は、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)の融合タンパク質F、糖タンパク質G、短い疎水性タンパク質SH、マトリクスタンパク質M、核タンパク質N、ラージポリメラーゼ(large polymerase)L、M2−1タンパク質、M2−2タンパク質、リン酸タンパク質P、非構造タンパク質NS1もしくは非構造タンパク質NS2、またはその断片、バリアントもしくは誘導体に由来する少なくとも1つの抗原ペプチドまたは抗原タンパク質をコードしているコード領域を含んでいることが、特に好ましい。

0063

本発明の第1の局面に係る本発明のmRNAのコード領域は、モノ、バイまたはマルチ−シストロン性のmRNA(すなわち1、2またはそれ以上のタンパク質またはペプチドのコード領域を保有しているmRNA)として存在する。モノ、バイまたはマルチ−シストロン性のmRNAにおいて、そのようなコード領域は、例えば本明細書に記載されているような、少なくとも1つの内部リボソーム進入部位(IRES)、またはいくつかのタンパク質もしくはペプチドを含んでいる結果として生じるポリペプチドを誘導するシグナルペプチドによって分離され得る。

0064

本発明の第1の局面によれば、本発明のmRNAは、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)の融合タンパク質F、糖タンパク質G、短い疎水性タンパク質SH、マトリクスタンパク質M、核タンパク質N、ラージポリメーラゼL、M2−1タンパク質、M2−2タンパク質、リン酸タンパク質P、非構造タンパク質NS1もしくは非構造タンパク質NS2、またはその断片、バリアントもしくは誘導体に由来する少なくとも1つの抗原ペプチドまたは抗原タンパク質をコードしているコード領域を含んでいる。本発明の第1の局面の特に好ましい実施形態において、本発明のmRNA配列は、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)の融合タンパク質F、核タンパク質NもしくはM2−1タンパク質、またはその断片、バリアントもしくは誘導体に由来する少なくとも1つの抗原ペプチドまたは抗原タンパク質をコードしているコード領域を含んでいる。

0065

これに関連して、少なくとも1つの抗原ペプチドまたは抗原タンパク質のアミノ酸配列は、任意のRSV単離物の融合タンパク質F、糖タンパク質G、短いタンパク質SH、マトリクスタンパク質M、核タンパク質N、ラージポリメラーゼL、M2−1タンパク質、M2−2タンパク質、リン酸タンパク質P、非構造タンパク質NS1もしくは非構造タンパク質NS2に由来する任意のペプチドまたはタンパク質から、または合成的に改変されたRSVペプチドもしくはRSVタンパク質から、またはその断片、バリアントもしくは誘導体から選択され得る。

0066

特定の実施形態において、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)の融合タンパク質F、糖タンパク質G、短い疎水性タンパク質SH、マトリクスタンパク質M、核タンパク質N、ラージポリメラーゼL、M2−1タンパク質、M2−2タンパク質、リン酸タンパク質P、非構造タンパク質NS1または非構造タンパク質NS2の全長タンパク質は、本発明のmRNAに含まれているコード領域によってコードされている。

0067

これに関連して、融合タンパク質Fおよび核タンパク質Nからの全長タンパク質が特に好ましい。さらに、細胞質尾部の欠失を有しているFタンパク質の変異体が特に好ましい。そのような変異体の例は、Oomens et al. 2006. J. Virol. 80(21):10465-77に係るRSV−Fdel 554−574 longタンパク質である。

0068

特に好ましいさらなる実施形態において、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)の融合タンパク質F、糖タンパク質G、短い疎水性タンパク質SH、マトリクスタンパク質M、核タンパク質N、ラージポリメラーゼL、M2−1タンパク質、M2−2タンパク質、リン酸タンパク質P、非構造タンパク質NS1または非構造タンパク質NS2の少なくとも1つのエピトープを含んでいる断片は、本発明のmRNAに含まれているコード領域によってコードされている。

0069

特に好ましいのは、NCBIアクセション番号AY911262にしたがう、RSV株 long(ATCCVR−26)のアミノ酸配列である。

0070

RSV株ATCCVR−26 longの融合タンパク質F:
配列番号1にしたがうアミノ酸配列:
MELPILKANA ITTILAAVTF CFASSQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIN QELDKYKNAVTELQLLMQST TAANNRARRELPRFMNYTLNNTKKTNVTLS KKRKRRFLGF LLGVGSAIASGIAVSKVLHL EGEVNKIKSA LLSTNKAVVS LSNGVSVLTS KVLDLKNYID KQLLPIVNKQSCRISNIETV IEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTY MLTNSELLSL INDMPITNDQKKLMSNNVQI VRQQSYSIMS IIKEEVLAYV VQLPLYGVID TPCWKLHTSP LCTTNTKEGS NICLTRTDRG WYCDNAGSVSFFPQAETCKV QSNRVFCDTMNSLTLPSEVN LCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSL GAIVSCYGKT KCTASNKNRG IIKTFSNGCD YVSNKGVDTV SVGNTLYYVN KQEGKSLYVK GEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKIN QSLAFIRKSD ELLHHVNAGK STTNIMITTI IIVIIVILLS LIAVGLLLYC KARSTPVTLS KDQLSGINNI AFSN。

0071

RSV株ATCCVR−26 longの糖タンパク質G:
配列番号2にしたがうアミノ酸配列:
MSKNKDQRTA KTLEKTWDTLNHLLFISSGL YKLNLKSIAQ ITLSILAMIISTSLIITAII FIASANHKVTLTTAIIQDATSQIKNTTPTY LTQDPQLGISFSNLSEITSQTTTILASTTP GVKSNLQPTTVKTKNTTTTQ TQPSKPTTKQRQNKPPNKPN NDFHFEVFNF VPCSICSNNP TCWAICKRIP NKKPGKKTTT KPTKKPTFKT TKKDLKPQTT KPKEVPTTKP TEEPTINTTK TNITTTLLTN NTTGNPKLTS QMETFHSTSS EGNLSPSQVS TTSEHPSQPS SPPNTTRQ。

0072

RSV株ATCCVR−26 longの短い疎水性タンパク質HS:
配列番号3にしたがうアミノ酸配列:
MENTSITIEFSSKFWPYFTLIHMITTIISL LIIISIMTAI LNKLCEYNVF HNKTFELPRARVNT。

0073

RSV株ATCCVR−26 longのマトリクスタンパク質M:
配列番号4にしたがうアミノ酸配列:
METYVNKLHE GSTYTAAVQY NVLEKDDDPASLTIWVPMFQSSMPADLLIK ELANVNILVK QISTPKGPSLRVMINSRSAL LAQMPSKFTI CANVSLDERSKLAYDVTTPCEIKACSLTCL KSKNMLTTVK DLTMKTLNPT HDIIALCEFE NIVTSKKVII PTYLRSISVR NKDLNTLENITTTEFKNAITNAKIIPYSGL LLVITVTDNK GAFKYIKPQS QFIVDLGAYL EKESIYYVTT NWKHTATRFAIKPMED

0074

RSV株ATCCVR−26 longの核タンパク質N:
配列番号5にしたがうアミノ酸配列:
MALSKVKLNDTLNKDQLLSSSKYTIQRSTGDSIDTPNYDV QKHINKLCGMLLITEDANHKFTGLIGMLYA MSRLGREDTIKILRDAGYHVKANGVDVTTHRQDINGKEMK FEVLTLASLT TEIQINIEIE SRKSYKKMLKEMGEVAPEYR HDSPDCGMII LCIAALVITKLAAGDRSGLTAVIRRANNVL KNEMKRYKGLLPKDIANSFY EVFEKHPHFI DVFVHFGIAQ SSTRGGSRVEGIFAGLFMNA YGAGQVMLRW GVLAKSVKNI MLGHASVQAE MEQVVEVYEY AQKLGGEAGF YHILNNPKAS LLSLTQFPHF SSVVLGNAAG LGIMGEYRGTPRNQDLYDAA KAYAEQLKEN
GVINYSVLDL TAEELEAIKH QLNPKDNDVE L。

0075

RSV株ATCCVR−26 longのラージポリメラーゼL:
配列番号6にしたがうアミノ酸配列:
MDPIINGNSA NVYLTDSYLK GVISFSECNA LGSYIFNGPY LKNDYTNLISRQNPLIEHMN LKKLNITQSL ISKYHKGEIKLEEPTYFQSL LMTYKSMTSLEQIATTNLLKKIIRRAIEIS DVKVYAILNK LGLKEKDKIK SNNGQDEDNS VITTIIKDDI LSAVKDNQSH LKADKNHSTK QKDTIKTTLL KKLMCSMQHP PSWLIHWFNL YTKLNNILTQ YRSNEVKNHG FILIDNQTLS GFQFILNQYGCIVYHKELKR ITVTTYNQFLTWKDISLSRL NVCLITWISN CLNTLNKSLGLRCGFNNVIL TQLFLYGDCI LKLFHNEGFY IIKEVEGFIMSLILNITEED QFRKRFYNSM LNNITDAANK AQKNLLSRVCHTLLDKTVSDNIINGRWIILLSKFLKLIKLAGDNNLNNLS ELYFLFRIFG HPMVDERQAM DAVKVNCNET KFYLLSSLSM LRGAFIYRII KGFVNNYNRW PTLRNAIVLPLRWLTYYKLN TYPSLLELTERDLIVLSGLR FYREFRLPKK VDLEMIINDK AISPPKNLIW TSFPRNYMPS HIQNYIEHEK LKFSESDKSRRVLEYYLRDN KFNECDLYNC VVNQSYLNNP NHVVSLTGKE RELSVGRMFA MQPGMFRQVQ ILAEKMIAEN ILQFFPESLT RYGDLELQKI LELKAGISNK SNRYNDNYNN YISKCSIITD LSKFNQAFRY ETSCICSDVL DELHGVQSLF SWLHLTIPHV TIICTYRHAP PYIRDHIVDL NNVDEQSGLY RYHMGGIEGW CQKLWTIEAI SLLDLISLKG KFSITALING DNQSIDISKP VRLMEGQTHA QADYLLALNS LKLLYKEYAG IGHKLKGTET YISRDMQFMSKTIQHNGVYYPASIKKVLRV GPWINTILDD FKVSLESIGS LTQELEYRGE SLLCSLIFRN VWLYNQIALQ LKNHALCNNK LYLDILKVLK HLKTFFNLDN IDTALTLYMN LPMLFGGGDPNLLYRSFYRRTPDFLTEAIV HSVFILSYYT NHDLKDKLQDLSDDRLNKFL TCIITFDKNP NAEFVTLMRD PQALGSERQA KITSEINRLA VTEVLSTAPN KIFSKSAQHYTTTEIDLNDI MQNIEPTYPH GLRVVYESLP FYKAEKIVNL ISGTKSITNI LEKTSAIDLT DIDRATEMMR KNITLLIRIL PLDCNRDKRE ILSMENLSIT ELSKYVRERSWSLSNIVGVTSPSIMYTMDIKYTTSTIASG IIIEKYNVNSLTRGERGPTK PWVGSSTQEK KTMPVYNRQV LTKKQRDQID LLAKLDWVYA SIDNKDEFME ELSIGTLGLT YEKAKKLFPQ YLSVNYLHRL TVSSRPCEFPASIPAYRTTN YHFDTSPINR ILTEKYGDED IDIVFQNCIS FGLSLMSVVE QFTNVCPNRI ILIPKLNEIH LMKPPIFTGD VDIHKLKQVI QKQHMFLPDK ISLTQYVELF LSNKTLKSGS HVNSNLILAHKISDYFHNTY ILSTNLAGHW ILIIQLMKDS KGIFEKDWGE GYITDHMFIN LKVFFNAYKT YLLCFHKGYG KAKLECDMNTSDLLCVLELI DSSYWKSMSK VFLEQKVIKY ILSQDASLHR VKGCHSFKLW FLKRLNVAEF TVCPWVVNID YHPTHMKAIL TYIDLVRMGL INIDRIHIKN KHKFNDEFYT SNLFYINYNFSDNTHLLTKH IRIANSELEN NYNKLYHPTP ETLENILANP IKSNDKKTLN DYCIGKNVDS IMLPLLSNKK LVKSSAMIRT NYSKQDLYNL FPTVVIDRII DHSGNTAKSN QLYTTTSHQI SLVHNSTSLYCMLPWHHINR FNFVFSSTGCKISIEYILKD LKIKDPNCIA FIGEGAGNLL LRTVVELHPD IRYIYRSLKD CNDHSLPIEF LRLYNGHINI DYGENLTIPA TDATNNIHWS YLHIKFAEPISLFVCDAELP VTVNWSKIIIEWSKHVRKCKYCSSVNKCTL IVKYHAQDDI DFKLDNITIL KTYVCLGSKL KGSEVYLVLTIGPANIFPVF NVVQNAKLILSRTKNFIMPK KADKESIDAN IKSLIPFLCY PITKKGINTA LSKLKSVVSG DILSYSIAGR NEVFSNKLIN HKHMNILKWF NHVLNFRSTE LNYNHLYMVE STYPYLSELL NSLTTNELKK LIKITGSLLY NFHNE。

0076

RSV株ATCCVR−26 longのM2−1タンパク質:
配列番号7にしたがうアミノ酸配列:
MSRRNPCKFE IRGHCLNGKR CHFSHNYFEW PPHALLVRQNFMLNRILKSMDKSIDTLSEISGAAELDRTE EYALGVVGVLESYIGSINNI TKQSACVAMSKLLTELNSDDIKKLRDNEEL NSPKIRVYNTVISYIESNRK NNKQTIHLLK RLPADVLKKT IKNTLDIHKS ITINNPKELTVSDTNDHAKN NDTT。

0077

RSV株ATCCVR−26 longのM2−2タンパク質:
配列番号8にしたがうアミノ酸配列:
MTMPKIMILP DKYPCSITSI LITSRCRVTM YNRKNTLYFNQNNPNNHMYS PNQTFNEIHW TSQDLIDTIQNFLQHLGVIEDIYTIYILVS。

0078

RSV株ATCCVR−26 longのリン酸タンパク質P:
配列番号9にしたがうアミノ酸配列:
MEKFAPEFHG EDANNRATKFLESIKGKFTSPKDPKKKDSIISVNSIDIEV TKESPITSNS TIINPTNETDDNAGNKPNYQ RKPLVSFKED PIPSDNPFSKLYKETIETFDNNEEESSYSY EEINDQTNDN ITARLDRIDE KLSEILGMLHTLVVASAGPTSARDGIRDAM VGLREEMIEK IRTEALMTND RLEAMARLRN EESEKMAKDT SDEVSLNPTS EKLNNLLEGN DSDNDLSLED F。

0079

RSV株ATCCVR−26 longの非構造タンパク質NS−1:
配列番号10にしたがうアミノ酸配列:
MGSNSLSMIK VRLQNLFDNDEVALLKITCY TDKLIHLTNA LAKAVIHTIKLNGIVFVHVITSSDICPNNN IVVKSNFTTMPVLQNGGYIWEMMELTHCSQ PNGLIDDNCE IKFSKKLSDS TMTNYMNQLS ELLGFDLNP。

0080

RSV株ATCCVR−26 longの非構造タンパク質NS−2:
配列番号11にしたがうアミノ酸配列:
MDTTHNDTTPQRLMITDMRP LSLETTITSL TRDIITHRFIYLINHECIVR KLDERQATFTFLVNYEMKLLHKVGSTKYKK YTEYNTKYGTFPMPIFINHD GFLECIGIKP TKHTPIIYKY DLNP。

0081

本発明に関連して、本明細書に開示されている配列番号1〜11にしたがうアミノ酸配列に加えて、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)の異なる単離物のアミノ酸配列はまた、本発明にしたがって使用され得、本明細書に組み込まれる。呼吸器合胞体ウイルス(RSV)のこれらの単離物は、配列番号1〜11にしたがうアミノ酸配列と、少なくとも70%、より好ましくは少なくとも805、最も好ましくは少なくとも90%の同一性を好ましく示す。

0082

さらにこれに関連して、融合タンパク質F、糖タンパク質G、短い疎水性タンパク質SH、マトリクスタンパク質M、核タンパク質N、ラージポリメラーゼL、M2−1タンパク質、M2−2タンパク質、リン酸タンパク質P、非構造タンパク質NS1、もしくは非構造タンパク質NS2、またはその断片、バリアントもしくは誘導体に由来する少なくとも1つの抗原ペプチドまたは抗原タンパク質をコードしているコード領域は、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)の任意の単離物、またはその断片もしくはバリアントに由来するコード領域を含んでいる核酸配列から選択され得る。

0083

特に好ましいのは、NCBIアクセション番号AY911262にしたがう、RSV株 long(ATCCVR−26)のコード領域の野生型mRNA配列である。

0084

RSV株ATCCVR−26 longの融合タンパク質FをコードしているmRNA:
配列番12にしたがうmRNA配列:
auggaguugccaauccucaaagcaaaugcaauuaccacaauccucgcugcagucacauuuugcuuugcuucuagucaaaacaucacugaagaauuuuaucaaucaacaugcagugcaguuagcaaaggcuaucuuagugcucuaagaacugguugguauacuaguguuauaacuauagaauuaaguaauaucaaggaaaauaaguguaauggaacagaugcuaagguaaaauugauaaaccaagaauuagauaaauauaaaaaugcuguaacagaauugcaguugcucaugcaaagcacaacagcagcaaacaaucgagccagaagagaacuaccaagguuuaugaauuauacacucaacaauaccaaaaaaaccaauguaacauuaagcaagaaaaggaaaagaagauuucuugguuuuuuguuagguguuggaucugcaaucgccaguggcauugcuguaucuaagguccugcacuuagaaggagaagugaacaagaucaaaagugcucuacuauccacaaacaaggccguagucagcuuaucaaauggaguuagugucuuaaccagcaaaguguuagaccucaaaaacuauauagauaaacaauuguuaccuauugugaauaagcaaagcugcagaauaucaaauauagaaacugugauagaguuccaacaaaagaacaacagacuacuagagauuaccagggaauuuaguguuaaugcagguguaacuacaccuguaagcacuuacauguuaacuaauagugaauuauugucauuaaucaaugauaugccuauaacaaaugaucagaaaaaguuaauguccaacaauguucaaauaguuagacagcaaaguuacucuaucauguccauaauaaaagaggaagucuuagcauauguaguacaauuaccacuauauggugugauagauacaccuuguuggaaauuacacacauccccucuauguacaaccaacacaaaagaagggucaaacaucuguuuaacaagaacugacagaggaugguacugugacaaugcaggaucaguaucuuucuucccacaagcugaaacauguaaaguucaaucgaaucgaguauuuugugacacaaugaacaguuuaacauuaccaagugaaguaaaucucugcaauguugacauauucaaucccaaauaugauuguaaaauuaugacuucaaaaacagauguaagcagcuccguuaucacaucucuaggagccauugugucaugcuauggcaaaacuaaauguacagcauccaauaaaaaucguggaaucauaaagacauuuucuaacgggugugauuauguaucaaauaaagggguggacacugugucuguagguaacacauuauauuauguaaauaagcaagaaggcaaaagucucuauguaaaaggugaaccaauaauaaauuucuaugacccauuaguauuccccucugaugaauuugaugcaucaauaucucaagucaaugagaagauuaaccagaguuuagcauuuauucguaaauccgaugaauuauuacaucauguaaaugcugguaaaucaaccacaaauaucaugauaacuacuauaauuauagugauuauaguaauauuguuaucauuaauugcuguuggacugcuccuauacuguaaggccagaagcacaccagucacacuaagcaaggaucaacugagugguauaaauaauauugcauuuaguaacuga。

0085

RSV株ATCCVR−26 longの糖タンパク質GをコードしているmRNA:
配列番号13にしたがうmRNA配列:
auguccaaaaacaaggaccaacgcaccgcuaagacacuagaaaagaccugggacacucucaaucauuuauuauucauaucaucgggcuuauauaaguuaaaucuuaaaucuauagcacaaaucacauuauccauucuggcaaugauaaucucaacuucacuuauaauuacagccaucauauucauagccucggcaaaccacaaagucacacuaacaacugcaaucauacaagaugcaacaagccagaucaagaacacaaccccaacauaccucacucaggauccucagcuuggaaucagcuucuccaaucugucugaaauuacaucacaaaccaccaccauacuagcuucaacaacaccaggagucaagucaaaccugcaacccacaacagucaagacuaaaaacacaacaacaacccaaacacaacccagcaagcccacuacaaaacaacgccaaaacaaaccaccaaacaaacccaauaaugauuuucacuucgaaguguuuaacuuuguacccugcagcauaugcagcaacaauccaaccugcugggcuaucugcaaaagaauaccaaacaaaaaaccaggaaagaaaaccaccaccaagccuacaaaaaaaccaaccuucaagacaaccaaaaaagaucucaaaccucaaaccacuaaaccaaaggaaguacccaccaccaagcccacagaagagccaaccaucaacaccaccaaaacaaacaucacaacuacacugcucaccaacaacaccacaggaaauccaaaacucacaagucaaauggaaaccuuccacucaaccuccuccgaaggcaaucuaagcccuucucaagucuccacaacauccgagcacccaucacaacccucaucuccacccaacacaacacgccaguag。

0086

RSV株ATCCVR−26 longの短い疎水性タンパク質をコードしているmRNA:
配列番号14にしたがうmRNA配列:
auggaaaauacauccauaacaauagaauucucaagcaaauucuggccuuacuuuacacuaauacacaugaucacaacaauaaucucuuugcuaaucauaaucuccaucaugacugcaauacuaaacaaacuuugugaauauaacguauuccauaacaaaaccuuugaguuaccaagagcucgagucaacacauag。

0087

RSV株ATCCVR−26 longのマトリクスタンパク質MをコードしているmRNA:
配列番号15にしたがうmRNA配列:
auggaaacauacgugaacaagcuucacgaaggcuccacauacacagcugcuguucaauacaauguccuagaaaaagacgaugacccugcaucacuuacaauaugggugcccauguuccaaucaucuaugccagcagauuuacuuauaaaagaacuagcuaaugucaacauacuagugaaacaaauauccacacccaagggaccuucacuaagagucaugauaaacucaagaagugcauugcuagcacaaaugcccagcaaauuuaccauaugugcuaauguguccuuggaugaaagaagcaaacuggcauaugauguaaccacacccugugaaaucaaggcauguagucuaacaugccuaaaaucaaaaaauauguuaacuacaguuaaagaucucacuaugaagacacucaaccccacacaugauauuauugcuuuaugugaauuugaaaacauaguaacaucaaaaaaagucauaauaccaacauaccuaagauccaucagugucagaaauaaagaucugaacacacuugaaaauauaacaaccacugaauucaaaaaugccaucacaaaugcaaaaaucaucccuuacucaggauuacuauuagucaucacagugacugacaacaaaggagcauucaaauacauaaagccgcaaagucaauucauaguagaucuuggagcuuaccuagaaaaagaaaguauauauuauguuaccacaaauuggaagcacacagcuacacgauuugcaaucaaacccauggaagauuaa。

0088

RSV株ATCCVR−26 longの核タンパク質NをコードしているmRNA:
配列番号16にしたがうmRNA配列:
auggcucuuagcaaagucaaguugaaugauacacucaacaaagaucaacuucugucaucuagcaaauacaccauccaacggagcacaggagauaguauugauacuccuaauuaugaugugcagaaacacaucaauaaguuauguggcauguuauuaaucacagaagaugcuaaucauaaauucacuggguuaauagguauguuauaugcuaugucuagguuaggaagagaagacaccauaaaaauacucagagaugcgggauaucauguaaaagcaaauggaguagauguaacaacacaucgucaagacaucaaugggaaagaaaugaaauuugaaguguuaacauuggcaagcuuaacaacugaaauucaaaucaacauugagauagaaucuagaaaauccuacaaaaaaaugcuaaaagaaaugggagagguagcuccagaauacaggcaugauucuccugauugugggaugauaauauuauguauagcagcauuaguaauaaccaaauuggcagcaggggauagaucuggucuuacagccgugauuaggagagcuaauaauguccuaaaaaaugaaaugaaacguuacaaaggcuuacuacccaaggauauagccaacagcuucuaugaaguguuugaaaaacauccccacuuuauagauguuuuuguucauuuugguauagcacaaucuuccaccagagguggcaguagaguugaagggauuuuugcaggauuguuuaugaaugccuauggugcagggcaaguaaugcuacgguggggagucuuagcaaaaucaguuaaaaauauuauguuaggacaugcuagugugcaagcagaaauggaacaaguuguugagguuuaugaauaugcccaaaaauuggguggagaagcaggauucuaccauauauugaacaacccaaaagcaucauuauuaucuuugacucaauuuccucacuuuuccaguguaguauuaggcaaugcugcuggccuaggcauaaugggagaguacagagguacaccgaggaaucaagaucuauaugaugcagcaaaggcauaugcugaacaacucaaagaaaauggugugauuaacuacaguguauuagacuugacagcagaagaacuagaggcuaucaaacaucagcuuaauccaaaagauaaugauguagagcuuuga。

0089

RSV株ATCCVR−26 longのラージポリメラーゼLをコードしているmRNA:
配列番号17にしたがうmRNA配列:
auggaucccauuauuaauggaaauucugcuaauguuuaucuaaccgauaguuauuuaaaagguguuaucucuuucucagaguguaaugcuuuaggaaguuacauauucaaugguccuuaucucaaaaaugauuauaccaacuuaauuaguagacaaaauccauuaauagaacacaugaaucuaaagaaacuaaauauaacacaguccuuaauaucuaaguaucauaaaggugaaauaaaauuagaagagccuacuuauuuucagucauuacuuaugacauacaagaguaugaccucguuggaacagauugcuaccacuaauuuacuuaaaaagauaauaagaagagcuauagaaauaagugaugucaaagucuaugcuauauugaauaaacuagggcuuaaagaaaaggacaagauuaaauccaacaauggacaggaugaagacaacucaguuauuacgaccauaaucaaagaugauauacuuucagcuguuaaggauaaucaaucucaucuuaaagcagacaaaaaucacucuacaaaacaaaaagacacaaucaaaacaacacucuugaagaaauuaauguguucaaugcagcauccuccaucaugguuaauacauugguuuaauuuauacacaaaauuaaacaacauauuaacacaguaucgaucaaaugagguuaaaaaccauggguuuauauugauagauaaucaaacucuuaguggauuucaauuuauuuugaaucaauaugguuguauaguuuaucauaaggaacucaaaagaauuacugugacaaccuauaaucaauucuugacauggaaagauauuagccuuaguagauuaaauguuuguuuaauuacauggauuaguaacugcuugaacacauuaaauaaaagcuuaggcuuaagaugcggauucaauaauguuaucuugacacaacuauuccuuuauggugauuguauacuaaagcuauuucacaaugagggguucuacauaauaaaagagguagagggauuuauuaugucucuaauuuuaaauauaacagaagaagaucaauucagaaaacgauuuuauaauaguaugcucaacaacaucacagaugcugcuaauaaagcucagaaaaaucugcuaucaagaguaugucauacauuauuagauaagacaguauccgauaauauaauaaauggcagauggauaauucuauuaaguaaguuccuuaaauuaauuaagcuugcaggugacaauaaccuuaacaaucugagugaacuauauuuuuuguucagaauauuuggacacccaaugguagaugaaagacaagccauggaugcuguuaaaguuaauugcaaugagaccaaauuuuacuuguuaagcaguuugaguauguuaagaggugccuuuauauauagaauuauaaaaggguuuguaaauaauuacaacagauggccuacuuuaagaaaugcuauuguuuuacccuuaagaugguuaacuuacuauaaacuaaacacuuauccuucuuuguuggaacuuacagaaagagauuugauuguguuaucaggacuacguuucuaucgugaguuucgguugccuaaaaaaguggaucuugaaaugauuauaaaugauaaagcuauaucacccccuaaaaauuugauauggacuaguuucccuagaaauuauaugccgucacacauacaaaacuauauagaacaugaaaaauuaaaauuuuccgagagugauaaaucaagaagaguauuagaguauuauuuaagagauaacaaauucaaugaaugugauuuauacaacuguguaguuaaucaaaguuaucucaacaacccuaaucaugugguaucauugacaggcaaagaaagagaacucaguguagguagaauguuugcaaugcaaccgggaauguucagacagguucaaauauuggcagagaaaaugauagcugaaaacauuuuacaauucuuuccugaaagucuuacaagauauggugaucuagaacuacaaaaaauauuagaauugaaagcaggaauaaguaacaaaucaaaucgcuacaaugauaauuacaacaauuacauuaguaagugcucuaucaucacagaucucagcaaauucaaucaagcauuucgauaugaaacgucauguauuuguagugaugugcuggaugaacugcaugguguacaaucucuauuuuccugguuacauuuaacuauuccucaugucacaauaauaugcacauauaggcaugcaccccccuauauaagagaucauauuguagaucuuaacaauguagaugaacaaaguggauuauauagauaucacaugggugguauugaaggguggugucaaaaacuauggaccauagaagcuauaucacuauuggaucuaauaucucucaaagggaaauucucaauuacugcuuuaauuaauggugacaaucaaucaauagauauaagcaaaccagucagacucauggaaggucaaacucaugcucaagcagauuauuugcuagcauuaaauagccuuaaauuacuguauaaagaguaugcaggcauaggucacaaauuaaaaggaacugagacuuauauaucacgagauaugcaauuuaugaguaaaacaauucaacauaacgguguauauuacccugcuaguauaaagaaaguccuaagagugggaccguggauaaacacuauacuugaugauuucaaagugagucuagaaucuauagguaguuugacacaagaauuagaauauagaggugaaagucuauuaugcaguuuaauauuuagaaauguaugguuauauaaucaaauugcucuacaauuaaaaaaucaugcguuauguaacaauaaauuauauuuggacauauuaaagguucugaaacacuuaaaaaccuuuuuuaaucuugauaauauugauacagcauuaacauuguauaugaauuuacccauguuauuuggugguggugaucccaacuuguuauaucgaaguuucuauagaagaacuccugauuuccucacagaggcuauaguucacucuguguucauacuuaguuauuauacaaaccaugacuuaaaagauaaacuucaagauuugucagaugauagauugaauaaguucuuaacaugcauaaucacguuugacaaaaacccuaaugcugaauucguaacauugaugagagauccucaagcuuuagggucugagagacaagcuaaaauuacuagugaaaucaauagacuggcaguuacagagguuuugaguacagcuccaaacaaaauauucuccaaaagugcacaacauuauaccacuacagagauagaucuaaaugauauuaugcaaaauauagaaccuacauauccucacgggcuaagaguuguuuaugaaaguuuacccuuuuauaaagcagagaaaauaguaaaucuuauaucagguacaaaaucuauaacuaacauacuggaaaagacuucugccauagacuuaacagauauugauagagccacugagaugaugaggaaaaacauaacuuugcuuauaaggauacuuccauuggauuguaacagagauaaaagagaaauauugaguauggaaaaccuaaguauuacugaauuaagcaaauauguuagggaaagaucuuggucuuuauccaauauaguugguguuacaucacccaguaucauguauacaauggacaucaaauauacaacaagcacuauagcuaguggcauaauuauagagaaauauaauguuaacaguuuaacacguggugagagaggaccaacuaaaccauggguugguucaucuacacaagagaaaaaaacaaugccaguuuauaauagacaaguuuuaaccaaaaaacaaagagaucaaauagaucuauuagcaaaauuggauuggguguaugcaucuauagauaacaaggaugaauucauggaagaacucagcauaggaacccuuggguuaacauaugaaaaggccaaaaaauuauuuccacaauauuuaagugucaacuauuugcaucgccuuacagucaguaguagaccaugugaauucccugcaucaauaccagcuuauagaacaacaaauuaucacuuugacacuagcccuauuaaucgcauauuaacagaaaaguauggugaugaagauauugacauaguauuccaaaacuguauaagcuuuggccuuagcuuaaugucaguaguagaacaauuuacuaauguauguccuaacagaauuauucucauaccuaagcuuaaugagauacauuugaugaaaccucccauauucacaggugauguugauauucacaaguuaaaacaagugauacaaaaacagcauauguuuuuaccagacaaaauaaguuugacucaauauguggaauuauucuuaaguaacaaaacacucaaaucuggaucucauguuaauucuaauuuaauauuggcacauaaaauaucugacuauuuucauaauacuuacauuuuaaguacuaauuuagcuggacauuggauucuaauuauacaacuuaugaaagauucuaaagguauuuuugaaaaagauuggggagagggauauauaacugaucauauguuuauuaauuugaaaguuuucuucaaugcuuauaagaccuaucucuuguguuuucauaaagguuauggcaaagcaaaacuggagugugauaugaacacuucagaucuucuauguguauuggaauuaauagacaguaguuauuggaagucuaugucuaagguauuuuuagaacaaaaaguuaucaaauacauucuuagccaagaugcaaguuuacauagaguaaaaggaugucauagcuucaaauuaugguuucuuaaacgucuuaauguagcagaauuuacaguuugcccuuggguuguuaacauagauuaucauccaacacauaugaaagcaauauuaacuuauauagaucuuguuagaaugggauugauaaauauagauagaauacacauuaaaaauaaacacaaauucaaugaugaauuuuauacuucuaaucucuuuuacauuaauuauaacuucucagauaauacucaucuauuaacuaaacauauaaggauugcuaauucagaauuagaaaauaauuacaacaaauuauaucauccuacaccagaaacccuagagaauauacuagccaauccgauuaaaaguaaugacaaaaagacacugaacgacuauuguauagguaaaaauguugacucaauaauguuaccauuguuaucuaauaagaagcuuguuaaaucgucugcaaugauuagaaccaauuacagcaaacaagaccuguacaaucuauucccuacgguugugaucgauagaauuauagaucauucagguaauacagccaaauccaaccaacuuuacacuacuacuucccaucaaauaucuuuagugcacaauagcacaucacuuuauugcaugcuuccuuggcaucauauuaauagauucaauuuuguauuuaguucuacagguuguaaaauuaguauagaguauauuuuaaaagaccuuaaaauuaaagauccuaauuguauagcauucauaggugaaggagcagggaauuuauuauugcguacagugguggaacuucauccugacauaagauauauuuacagaagucugaaagauugcaaugaucauaguuuaccuauugaguuuuuaaggcuauacaauggacauaucaacauugauuauggugaaaauuugaccauuccugcuacagaugcaaccaacaacauucauuggucuuauuuacauauaaaguuugcugaaccuaucagucuuuuuguaugugaugccgaauugccuguaacagucaacuggaguaaaauuauaauagaauggagcaagcauguaagaaaaugcaaguacuguuccucaguuaauaaauguacguuaauaguaaaauaucaugcucaagaugauauugauuucaaauuagacaauauaacuauauuaaaaacuuauguaugcuuaggcaguaaguuaaagggaucggagguuuacuuaguccuuacaauagguccugcaaauauauuuccaguauuuaauguaguacaaaaugcuaaauugauacuaucaagaaccaaaaauuucaucaugccuaagaaagcugauaaagagucuauugaugcaaauauuaaaaguuugauacccuuucuuuguuacccuauaacaaaaaaaggaauuaauacugcauugucaaaacuaaagaguguuguuaguggagauauacuaucauauucuauagcuggacggaaugaaguuuucagcaauaaacuuauaaaucauaagcauaugaacaucuuaaagugguucaaucauguuuuaaauuucagaucaacagaacuaaacuauaaccauuuauauaugguagaaucuacauauccuuaccuaagugaauuguuaaacagcuugacaacuaaugaacuuaaaaaacugauuaaaaucacagguagucuguuauacaacuuucauaaugaauaa。

0090

RSV株ATCCVR−26 longのタンパク質M2−1をコードしているmRNA:
配列番号18にしたがうmRNA配列:
Augucacgaaggaauccuugcaaauuugaaauucgaggucauugcuugaaugguaagagaugucauuuuagucauaauuauuuugaauggccaccccaugcacugcucguaagacaaaacuuuauguuaaacagaauacuuaagucuauggauaaaaguauagauaccuuaucagaaauaaguggagcugcagaguuggacagaacagaagaguaugcucuugguguaguuggagugcuagagaguuauauaggaucaauaaauaauauaacuaaacaaucagcauguguugccaugagcaaacuccucacugaacucaauagugaugauaucaaaaaacugagagacaaugaagagcuaaauucacccaagauaagaguguacaauacugucauaucauauauugaaagcaacaggaaaaacaauaaacaaacuauccaucuguuaaaaagauugccagcagacguauugaagaaaaccaucaaaaacacauuggauauccacaagagcauaaccaucaacaacccaaaagaauuaacuguuagugauacaaaugaccaugccaaaaauaaugauacuaccuga。

0091

RSV株ATCCVR−26 longのタンパク質M2−2をコードしているmRNA:
配列番号19にしたがうmRNA配列:
augaccaugccaaaaauaaugauacuaccugacaaauauccuuguaguauaacuuccauacuaauaacaaguagauguagagucacuauguauaaucgaaagaacacacuauauuucaaucaaaacaacccaaauaaccauauguacucaccgaaucaaacauucaaugaaauccauuggaccucacaagacuugauugacacaauucaaaauuuucuacagcaucuagguguuauugaggauauauauacaauauauauauuagugucauaa。

0092

RSV株ATCCVR−26 longのリン酸タンパク質PをコードしているmRNA:
配列番号20にしたがうmRNA配列:
auggaaaaguuugcuccugaauuccauggagaagaugcaaacaacagggcuacuaaauuccuagaaucaauaaagggcaaauucacaucaccuaaagaucccaagaaaaaagauaguaucauaucugucaacucaauagauauagaaguaaccaaagaaagcccuauaacaucaaauucaaccauuauuaacccaacaaaugagacagaugauaaugcagggaacaagcccaauuaucaaagaaaaccucuaguaaguuucaaagaagacccuauaccaagugauaaucccuuuucaaaacuauacaaagaaaccauagagacauuugauaacaaugaagaagaaucuagcuauucauaugaagaaauaaaugaucagacgaacgauaauauaacugcaagauuagauaggauugaugaaaaauuaagugaaauacuaggaaugcuucacacauuaguaguagcaagugcaggaccuacaucugcuagggaugguauaagagaugccaugguugguuuaagagaagaaaugauagaaaaaaucagaacugaagcauuaaugaccaaugacagauuagaagcuauggcaagacucaggaaugaggaaagugaaaagauggcaaaagacacaucagaugaagugucucucaauccaacaucagagaaauugaacaaccuguuggaagggaaugauagugacaaugaucuaucacuugaagauuucuga。

0093

RSV株ATCCVR−26 longの非構造タンパク質NS1をコードしているmRNA:
配列番号21にしたがうmRNA配列:
augggcagcaauucguugaguaugauaaaaguuagauuacaaaauuuguuugacaaugaugaaguagcauuguuaaaaauaacaugcuauacugacaaauuaauacauuuaacuaaugcuuuggcuaaggcagugauacauacaaucaaauugaauggcauuguguuugugcauguuauuacaaguagugauauuugcccuaauaauaauauuguaguaaaauccaauuucacaacaaugccagugcuacaaaauggagguuauauaugggaaaugauggaauuaacacauugcucucaaccuaauggucuaauagaugacaauugugaaauuaaauucuccaaaaaacuaagugauucaacaaugaccaauuauaugaaucaauuaucugaauuacuuggauuugaucuuaauccauaa。

0094

RSV株ATCCVR−26 longの非構造タンパク質NS2をコードしているmRNA:
配列番号22にしたがうmRNA配列:
auggacacaacccacaaugauaccacaccacaaagacugaugaucacagacaugagaccguugucacuugagacuacaauaacaucacuaaccagagacaucauaacacacagauuuauauacuuaauaaaucaugaaugcauagugagaaaacuugaugaaagacaggccacauuuacauuccuggucaacuaugaaaugaaacuauugcacaaaguaggaagcacuaaauauaaaaaauauacugaauacaacacaaaauauggcacuuucccuaugccgauauucaucaaucaugauggguucuuagaaugcauuggcauuaagccuacaaagcauacucccauaauauacaaguaugaucucaauccauag。

0095

本発明に関連して、本明細書に開示されている核酸配列番号に加えて、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)の異なる単離物の核酸配列はまた、本明細書に組み込まれる。呼吸器合胞体ウイルス(RSV)の異なるこれらの単離物は、配列番号12〜22にしたがう核酸配列に対する好ましくは少なくとも50%、60%、70%、より好ましくは少なくとも80%、最も好ましくは少なくとも90%、またはその断片の、同一性を好ましく有している。

0096

好ましい実施形態において、本発明に係るmRNA配列は、レポーター遺伝子またはマーカー遺伝子を含んでいない。好ましくは、本発明に係るmRNA配列は、例えば、ルシフェラーゼ緑色蛍光タンパク質(GFP)およびそのバリアント(例えば、eGFP、RFPまたはBFP);αグロブリンヒポキサンチン−グアニンホスホシボシルトランスフェラーゼ(HGPRT);βガラクトシダーゼガラクトキナーゼアルカリホスファターゼ分泌型胚性アルカリホスファターゼ(SEAP)または耐性遺伝子(例えば、ネオマイシンピューロマイシンハイグロマイシンおよびゼオシンに対する耐性遺伝子)を含んでいない。好ましい実施形態において、本発明に係るmRNA配列は、ルシフェラーゼをコードしていない。他の実施形態において、本発明に係るmRNA配列は、GFPまたはそのバリアントをコードしていない。

0097

さらなる好ましい実施形態において、本発明に係るmRNA配列は、オルソミクソウイルス科に属するウイルスに由来するタンパク質(またはタンパク質の断片)をコードしていない。好ましくは、上記mRNAは、インフルエンザウイルス、好ましくはインフルエンザAウイルスに由来するタンパク質をコードしていない。好ましくは、本発明に係るmRNA配列は、ヘマグルチニン(HA)、ノイラミニダーゼ(NA)、核タンパク質(NP)、M1、M2、NS1、NS2(NEP:核搬出タンパク質)、PA、PB1(polymerasebasic1)、PB1−F2およびPB2からなる群から選択されるインフルエンザAタンパク質をコードしていない。好ましい他の実施形態において、本発明に係るmRNAは、オブアルブミン(OVA)またはその断片をコードしていない。好ましくは、本発明に係るmRNAは、インフルエンザAタンパク質またはオブアルブミンをコードしていない。

0098

さらなる実施形態によって、本発明のmRNAは、少なくとも1つの以下の構造エレメント:5’非翻訳領域エレメント(UTRエレメント)および/または3’UTR、特にTOP遺伝子の5’UTRまたはその断片、相同物もしくはバリアントに由来する核酸配列を含んでいるか、または当該核酸配列からなる5’UTRエレメント、または安定なmRNAをもたらす遺伝子に由来する5’UTRエレメントおよび/または3’UTRエレメントまたはその相同物、断片もしくはバリアント;ヒストンステムループ構造、好ましくはその3’非翻訳領域におけるヒストン−ステムループ;5’キャップ構造;ポリAテイル;またはポリ(C)配列を含んでいる。

0099

本発明の第1の局面の好ましい実施形態において、本発明のmRNAは、少なくとも5’または3’UTRエレメントを含んでいる。これに関連して、UTRエレメントは、天然に存在する任意の遺伝子、または遺伝子の5’もしくは3’UTRの断片、バリアントもしくは相同物に由来する核酸配列を含んでいるか、または当該核酸配列からなる。好ましくは、本発明にしたがって使用される5’または3’UTRは、本発明のmRNA配列のコード領域に対して相同である。天然に存在する遺伝子に由来する5’または3’UTRエレメントが好ましい場合にさえ、合成的に改変されたUTRエレメントが、本発明に関連して使用され得る。本発明の第1の局面の特に好ましい実施形態において、本発明のmRNA配列は、TOP遺伝子の5’UTR、またはTOP遺伝子の5’UTRの断片、相同物もしくはバリアントに由来する核酸配列を含んでいるか、または当該核酸配列からなる少なくとも5’非翻訳領域エレメント(5’UTRエレメント)を含んでいる。

0100

本発明の第1の局面の特に好ましい実施形態において、本発明のmRNAは、TOP遺伝子の5’UTR、またはTOP遺伝子の5’UTRの断片、相同物もしくはバリアントに由来する核酸配列を含んでいるか、または当該核酸配列からなる少なくとも1つの5’非翻訳領域エレメント(5’UTRエレメント)を含んでいる。

0101

5’UTRは、以上に規定されているようなTOPモチーフまたは5’TOPを含んでいないことが、特に好ましい。

0102

いくつかの実施形態において、TOP遺伝子の5’UTRに由来する5’UTRエレメントの核酸配列は、由来する遺伝子またはmRNAの開始コドン(A(U/T)G)の1、2、3、4、5、6、7、8、9または10位上流に配置されているヌクレオチドを有しているその3’末端において終結している。したがって、5’UTRエレメントは、タンパク質コード領域の任意の部分を含んでいない。したがって、本発明のmRNAのタンパク質をコードしている領域のみが、コード領域によってもたらされていることが好ましい。

0103

TOP遺伝子の5’UTRに由来する核酸配列は、真核生物のTOP遺伝子、好ましくは植物または動物のTOP遺伝子、より好ましくは脊索動物のTOP遺伝子、より一層好ましくは脊椎動物のTOP遺伝子、最も好ましくは哺乳類のTOP遺伝子(例えばヒトのTOP遺伝子)に由来する。

0104

例えば、5’UTRエレメントは、特許出願WO2016/143700(その開示が参照によって本明細書に組み込まれる)の配列番号1421および配列番号1422、ならびに特許出願WO2016/143700(その開示が参照によって本明細書に組み込まれる)の配列番号1421および配列番号1422の相同物、そのバリアントからなる群、または好ましくは対応するRNA配列から選択される核酸配列に由来する核酸配列を含んでいるか、または当該核酸配列からなる5’UTRから好ましく選択される。「特許出願WO2016/143700の配列番号1421および配列番号1422」という表現は、特許出願WO2016/143700の配列番号1〜1363、配列番号1395、配列番号1421および配列番号1422にしたがう配列に対して相同な、ホモサピエンス以外の他の種の配列を指す。

0105

好ましい実施形態において、5’UTRエレメントは、特許出願WO2016/143700の配列番号1〜1363、配列番号1395、配列番号1421および配列番号1422、特許出願WO2016/143700の配列番号1〜1363、配列番号1395、配列番号1421および配列番号1422の相同物、そのバリアント、または対応するRNA配列から選択される核酸配列の、5位のヌクレオチド位置(すなわち、配列における5位に配置されているヌクレオチド)から、開始コドン(例えば、配列の3’末端に配置されている)に対するすぐ5’位にあるヌクレオチド(例えば、ATG配列に対するすぐ5’にあるヌクレオチド位置)まで伸びている核酸配列に由来する核酸配列を含んでいるか、または当該核酸配列からなる。5’UTRエレメントは、特許出願WO2016/143700の配列番号1〜1363、配列番号1395、配列番号1421および配列番号1422の相同物、そのバリアント、または対応するRNA配列の、5’TOPに対するすぐ3’にあるヌクレオチド位置から、開始コドン(配列の3’末端に配置されている)に対するすぐ5’にあるヌクレオチド位置(例えば、ATG配列に対するすぐ5’にあるヌクレオチド位置)伸びている核酸配列に由来することが、特に好ましい。

0106

特に好ましい実施形態において、5’UTRエレメントは、リボソームタンパク質をコードしているTOP遺伝子、またはリボソームタンパク質をコードしているTOP遺伝子の5’UTRのバリアントに由来する核酸配列を含んでいるか、または当該核酸配列からなる。例えば、5’UTRエレメントは、特許出願WO2013/143700の配列番号67、170、193、244、259、554、650、675、700、721、913、1016、1063、1120、1138および1284〜1360のいずれかにしたがう核酸配列の5’UTR、対応するRNA配列、または本明細書に記載されているようなその相同物もしくはバリアント(好ましくは5’TOPモチーフを欠いている)に由来する核酸配列を含んでいるか、または当該核酸配列からなる。上述されている通り、5位からATG(配列の3’末端に配置されている)に対するすぐ5’にあるヌクレオチドまで伸びている配列は、上記配列の5’UTRに対応する。

0107

好ましくは、5’UTRエレメントは、リボソーム巨大タンパク質(RLP)をコードしているTOP遺伝子の5’UTR、またはリボソーム巨大タンパク質(RLP)をコードしているTOP遺伝子の5’UTRの相同物もしくはバリアントに由来する核酸配列を含んでいるか、または当該核酸配列からなる。例えば、5’UTRエレメントは、特許出願2013/143700の配列番号67、259、1284〜1318、1344、1346、1348〜1354、1357、1358、1421および1422のいずれかにしたがう核酸配列の5’UTR、対応するRNA配列、本明細書に記載されているようなその相同物、またはバリアント(好ましくは5’TOPを欠いている)に由来する核酸配列を含んでいるか、または当該核酸配列からなる。

0108

特に好ましい実施形態において、5’UTRエレメントは、リボソームタンパク質ラージ32遺伝子(好ましくは脊椎動物のリボソームタンパク質ラージ32(L32)遺伝子、より好ましくはヒトのリボソームタンパク質ラージ32(L32)遺伝子)の5’UTR、またはリボソームタンパク質ラージ32遺伝子(好ましくは脊椎動物のリボソームタンパク質ラージ32(L32)遺伝子、より好ましくは哺乳類のリボソームタンパク質ラージ32(L32)遺伝子、最も好ましくはヒトのリボソームタンパク質ラージ32(L32)遺伝子)の5’UTRのバリアントに由来する核酸配列を含んでいるか、または当該核酸配列からなる。ここで、5’UTRエレメントは、上記遺伝子の5’TOPを含んでいないことが好ましい。

0109

したがって、特に好ましい実施形態において、5’UTRエレメントは、配列番号23にしたがう核酸配列(5’末端オリゴピリジントラクトを欠いているヒトのリボソームタンパク質ラージ32の5’UTR:GGCGCTGCCTACGGAGGTGGCAGCCATCTCCTTCTCGGCATC;特許出願WO2013/143700の配列番号1368にしたがう)または好ましくは対応するRNAに対する、少なくとも約40%、好ましくは少なくとも約50%、好ましくは少なくとも約60%、好ましくは少なくとも約70%、より好ましくは少なくとも約80%、より好ましくは少なくとも約90%、より一層好ましくは少なくとも約95%、より一層好ましくは少なくとも約99%の同一性を有している核酸配列を含んでいるか、もしくは当該核酸配列からなるか、または少なくとも1つの5’UTRエレメントは、少なくとも約40%、好ましくは少なくとも約50%、好ましくは少なくとも約60%、好ましくは少なくとも約70%、より好ましくは少なくとも約80%、より好ましくは少なくとも約90%、より一層好ましくは少なくとも約95%、より一層好ましくは少なくとも約99%の、配列番号23にしたがう核酸配列に対する同一性を有している核酸配列の、断片を含んでいるか、または当該断片からなる。ここで、好ましくは、当該断片は、本明細書に記載されている通りである(すなわち、全長5’UTRの少なくとも20%、好ましくは少なくとも30%、より好ましくは少なくとも40%、より好ましくは少なくとも50%、より一層好ましくは少なくとも60%、より一層好ましくは少なくとも70%、より一層好ましくは少なくとも80%、最も好ましくは少なくとも90%に相当するヌクレオチドの連続するストレッチである)。好ましくは、上記断片は、少なくとも約20またはそれ以上のヌクレオチド、好ましくは少なくとも約30またはそれ以上のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約40またはそれ以上のヌクレオチドの長さを示す。好ましくは、上記断片は、本明細書に記載されているような機能的な断片である。

0110

いくつかの実施形態において、本発明のmRNAは、脊椎動物のTOP遺伝子(例えば、哺乳類(例えばヒト)のTOP遺伝子)の5’UTR、またはその相同物もしくはバリアントに由来する核酸配列を含んでいるか、または当該核酸配列からなる5’UTRエレメントを含んでいる。当該脊椎動物のTOP遺伝子は、RPSA、RPS2、RPS3、RPS3A、RPS4、RPS5、RPS6、RPS7、RPS8、RPS9、RPS10、RPS11、RPS12、RPS13、RPS14、RPS15、RPS15A、RPS16、RPS17、RPS18、RPS19、RPS20、RPS21、RPS23、RPS24、RPS25、RPS26、RPS27、RPS27A、RPS28、RPS29、RPS30、RPL3、RPL4、RPL5、RPL6、RPL7、RPL7A、RPL8、RPL9、RPL10、RPL10A、RPL11、RPL12、RPL13、RPL13A、RPL14、RPL15、RPL17、RPL18、RPL18A、RPL19、RPL21、RPL22、RPL23、RPL23A、RPL24、RPL26、RPL27、RPL27A、RPL28、RPL29、RPL30、RPL31、RPL32、RPL34、RPL35、RPL35A、RPL36、RPL36A、RPL37、RPL37A、RPL38、RPL39、RPL40、RPL41、RPLP0、RPLP1、RPLP2、RPLP3、RPLP0、RPLP1、RPLP2、EEF1A1、EEF1B2、EEF1D、EEF1G、EEF2、EIF3E、EIF3F、EIF3H、EIF2S3、EIF3C、EIF3K、EIF3EIP、EIF4A2、PABPC1、HNRNPA1、TPT1、TUBB1、UBA52、NPM1、ATP5G2、GNB2L1、NME2、UQCRBから選択される。ここで、必要に応じて、5’UTRエレメントは、5’末端オリゴピリミジントラクトの1、2、3、4、5、6、7、8、9または10位下流に配置されているヌクレオチドをともなってその5’末端から始まっている。ここで、必要に応じてさらに、TOP遺伝子の5’UTRに由来する5’UTRエレメントは、それが由来する遺伝子の開始コドン(A(U/T)G)の1、2、3、4、5、6、7、8、9または10位上流に配置されているヌクレオチドとともにその3’末端において終結する。

0111

特に好ましいさらなる実施形態において、5’UTRエレメントは、リボソームタンパク質ラージ32遺伝子(RPL32)、リボソームタンパク質ラージ35遺伝子(RPL35)、リボソームタンパク質ラージ21遺伝子(RPL21)、プロトン輸送するATP合成酵素ミトコンドリアF1複合体αサブユニット心筋(ATPsynthase, H+ transporting, mitochondrial F1 complex, alpha subunit 1, cardiac muscle)(ATP5A1)遺伝子、ヒドロキシステロイド(17−ベータ)脱水素酵素4遺伝子(HSD17B4)、アンドロゲン誘導1遺伝子、チトクロームオキシダーゼサブユニットVIc遺伝子(COX6C)もしくはN−アシルスフィンゴシンアミドヒドロラーゼ(酸セラミダーゼ)1遺伝子(ASAH1)またはそのバリアント、好ましくはまたは脊椎動物のリボソームタンパク質ラージ32遺伝子(RPL32)、脊椎動物のリボソームタンパク質ラージ35遺伝子(RPL35)、脊椎動物のリボソームタンパク質ラージ21遺伝子(RPL21)、脊椎動物のプロトン輸送するATP合成酵素 ミトコンドリアF1複合体αサブユニット 心筋(ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial F1 complex, alpha subunit 1, cardiac muscle)(ATP5A1)遺伝子、脊椎動物のヒドロキシステロイド(17−ベータ)脱水素酵素4遺伝子(HSD17B4)、脊椎動物のアンドロゲン誘導1遺伝子、脊椎動物のチトクロームcオキシダーゼサブユニットVIc遺伝子(COX6C)もしくは脊椎動物のN−アシルスフィンゴシン アミドヒドロラーゼ(酸セラミダーゼ)1遺伝子(ASAH1)そのバリアント、より好ましくは哺乳類のリボソームタンパク質ラージ32遺伝子(RPL32)、哺乳類のリボソームタンパク質ラージ35遺伝子(RPL35)、哺乳類のリボソームタンパク質ラージ21遺伝子(RPL21)、哺乳類のプロトン輸送するATP合成酵素 ミトコンドリアF1複合体αサブユニット 心筋(ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial F1 complex, alpha subunit 1, cardiac muscle)(ATP5A1)遺伝子、哺乳類のヒドロキシステロイド(17−ベータ)脱水素酵素4遺伝子(HSD17B4)、哺乳類のアンドロゲン誘導1遺伝子、哺乳類のチトクロームcオキシダーゼサブユニットVIc遺伝子(COX6C)もしくは哺乳類のN−アシルスフィンゴシン アミドヒドロラーゼ(酸セラミダーゼ)1遺伝子(ASAH1)またはそのバリアント、最も好ましくはヒトのリボソームタンパク質ラージ32遺伝子(RPL32)、ヒトのリボソームタンパク質ラージ35遺伝子(RPL35)、ヒトのリボソームタンパク質ラージ21遺伝子(RPL21)、ヒトのプロトン輸送するATP合成酵素 ミトコンドリアF1複合体αサブユニット 心筋(ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial F1 complex, alpha subunit 1, cardiac muscle)(ATP5A1)遺伝子、ヒトのヒドロキシステロイド(17−ベータ)脱水素酵素4遺伝子(HSD17B4)、ヒトのアンドロゲン誘導1遺伝子、ヒトのチトクロームcオキシダーゼサブユニットVIc遺伝子(COX6C)もしくはヒトのN−アシルスフィンゴシン アミドヒドロラーゼ(酸セラミダーゼ)1遺伝子(ASAH1)またはそのバリアントの5’UTRに由来する核酸配列を含んでいるか、または当該核酸からなる。ここで、好ましくは、5’UTRエレメントは、上記遺伝子の5’TOPを含んでいない。

0112

したがって、特に好ましい実施形態において、5’UTRエレメントは、少なくとも約40%、好ましくは少なくとも約50%、好ましくは少なくとも約60%、好ましくは少なくとも約70%、より好ましくは少なくとも約80%、より好ましくは少なくとも約90%、より一層好ましくは少なくとも約95%、より一層好ましくは少なくとも約99%の、特許出願WO2013/143700の配列番号1368または配列番号1412〜1420にしたがう核酸配列もしくは対応するRNA配列に対する同一性を有している核酸配列を含んでいるか、もしくは当該核酸配列からなるか、または少なくとも1つの5’UTRエレメントは、少なくとも約40%、好ましくは少なくとも約50%、好ましくは少なくとも約60%、好ましくは少なくとも約70%、好ましくは少なくとも約より80%、よりましくは少なくとも約90%、より一層好ましくは少なくとも約95%、より一層好ましくは少なくとも約99%の、特許出願WO2013/143700の配列番号1368もしくは配列番号1412〜1420にしたがう核酸配列に対する同一性を有している核酸配列の、断片を含んでいるか、もしくは当該核酸配列からなる。ここで、上記断片は、上述されている通りである(すなわち、全長5’UTRの少なくとも約20%などに相当するヌクレオチドの連続するストレッチである)。好ましくは、上記断片は、少なくとも約20ヌクレオチドまたはそれ以上、好ましくは少なくとも約30ヌクレオチドまたはそれ以上、より好ましくは少なくとも約40ヌクレオチドまたはそれ以上の長さを示す。好ましくは、上記断片は、本明細書に記載されているような機能的な断片である。

0113

したがって、特に好ましい実施形態において、5’UTRエレメントは、少なくとも約40%、好ましくは少なくとも約50%、好ましくは少なくとも約60%、好ましくは少なくとも約70%、より好ましくは少なくとも約80%、より好ましくは少なくとも約90%、より一層好ましくは少なくとも約95%、より一層好ましくは少なくとも約99%の、配列番号36(5’末端オリゴピリジントラクト:GCGGCTCGGCCATTTTGTCCCAGTCAGTCCGGAGGCTGCGGCTGCAGAAGTACCGCCTGCG-GAGTAACTGCAAAGを欠いている、ATP5A1の5’UTR;特許出願WO2013/143700の配列番号1414に対応する)にしたがう核酸配列もしくは対応するRNA配列に対する同一性を有している核酸配列を含んでいるか、もしくは当該核酸配列からなるか、または少なくとも1つの5’UTRエレメントは、少なくとも約40%、好ましくは少なくとも約50%、好ましくは少なくとも約60%、好ましくは少なくとも約70%、より好ましくは少なくとも約80%、より好ましくは少なくとも約90%、より一層好ましくは少なくとも約95%、より一層好ましくは少なくとも約99%の、配列番号26にしたがう核酸配列もしくはより好ましくは対応するRNA配列に対する同一性を有している核酸配列を含んでいるか、もしくは当該核酸配列からなる。ここで、好ましくは、上記断片は、上述されている通りである(すなわち、全長5’UTRの少なくとも20%などに相当するヌクレオチドの連続するストレッチである)。好ましくは、上記断片は、少なくとも約20ヌクレオチドまたはそれ以上、より好ましくは少なくとも約30ヌクレオチドまたはそれ以上、より好ましくは少なくとも約40ヌクレオチドまたはそれ以上の長さを示す。上記断片は、本明細書に記載されているような機能的な断片である。

0114

さらなる好ましい実施形態において、本発明のmRNAは、脊索動物の遺伝子、好ましくは脊椎動物の遺伝子、より好ましくは哺乳類の遺伝子、最も好ましくはヒトの遺伝子の3’UTR、または脊索動物の遺伝子、好ましくは脊椎動物の遺伝子、より好ましくは哺乳類の遺伝子、最も好ましくはヒトの遺伝子の3’UTRのバリアントに由来する核酸配列を含んでいるか、または当該核酸配列からなる少なくとも1つの3’UTRエレメントをさらに含んでいる。

0115

「3’UTRエレメント」という用語は、3’UTRまたは3’UTRのバリアントに由来する核酸配列を含んでいるか、または当該核酸配列からなる核酸配列を指す。本発明の意味において、3’UTRは、mRNAの3’UTRに相当し得る。したがって、本発明の意味において、3’UTRエレメントは、mRNA、好ましくは人工mRNAの3’UTRであり得るか、または3’UTRエレメントは、mRNAbの3’UTRにとっての転写テンプレートであり得る。したがって、3’UTRエレメントは、mRNAの3’UTR、好ましくは人工mRNA(例えば、遺伝工学的に生成されるベクターコンストラクトの転写によって得られるmRNA)の3’UTRに対応する核酸配列である。好ましくは、3’UTRエレメントは、3’UTRの機能を実現するか、または3’UTRの機能を実現する配列をコードしている。

0116

好ましくは、本発明のmRNA配列は、向上されている半減期を有している(安定したmRNAをもたらす)mRNAに関連する遺伝子に由来し得る3’UTRエレメント(例えば、以下に規定されており、記載されているような3’UTRエレメント)を含んでいる。

0117

特に好ましい実施形態において、3’UTRは、アルブミン遺伝子、αグロビン遺伝子、βグロビン遺伝子、チロシンヒドロキシラーゼ遺伝子、リポキシゲナーゼ遺伝子、およびコラーゲンアルファ遺伝子(例えばコラーゲンアルファ1(I)遺伝子)からなる群から選択される遺伝子に3’UTR、または特許出願WO2013/143700(開示事項は参照によって本明細書に組み込まれる)の配列番号1369〜1390にしたがうアルブミン遺伝子、αグロビン遺伝子、βグロビン遺伝子、チロシンヒドロキシラーゼ遺伝子、リポキシゲナーゼ遺伝子、およびコラーゲンアルファ遺伝子(例えばコラーゲンアルファ1(I)遺伝子)からなる群から選択される遺伝子の3’UTRのバリアントに由来する核酸配列を含んでいるか、または当該核酸配列からなる。特に好ましい実施形態において、3’UTRエレメントは、アルブミン遺伝子、好ましくは脊椎動物のアルブミン遺伝子、より好ましくは哺乳類のアルブミン遺伝子、最も好ましくは配列番号24にしたがうヒトのアルブミンの3’UTRに由来する核酸配列を含んでいるか、または当該核酸配列からなる。ヒトのアルブミンの3’UTR 配列番号24:
CATCACATTT AAAAGCATCT CAGCCTACCA TGAGAATAAG AGAAAGAAAA TGAAGATCAA AAGCTTATTC ATCTGTTTTT CTTTTTCGTTGGTGTAAAGC CAACACCCTG TCTAAAAAAC ATAAATTTCT TTAATCATTTTGCCTCTTTT CTCTGTGCTT CAATTAATAA AAAATGGAAA GAATCT(特許出願WO2013/143700の配列番号1369に対応する)。

0118

これに関連して、本発明のmRNAは、特許出願WO2013/143700の配列番号1369〜1390にしたがう核酸に由来する対応するRNA配列、またはその断片、相同物もしくはバリアントを含んでいる3’UTRエレメントを含んでいることが好ましい。

0119

最も好ましくは、3’UTRエレメントは、配列番号25:
アルブミン7の3’UTR
CATCACATTTAAAAGCATCTCAGCCTACCATGAGAATAAGAGAAAGAAAATGAAGATCAATAGCTTATTCATCTCTTTTTCTTTTTCGTTGGTGTAAAGCCAACACCCTGTCTAAAAAACATAAATTTCTTTAATCATTTTGCCTCTTTTCTCTGTGCTTCAATTAATAAAAAATGGAAAGAACCT(特許出願WO2013/143700の配列番号1376に対応する配列番号25)
にしたがうヒトのアルブミンの断片に由来する核酸配列を含んでいる。

0120

これに関連して、本発明のmRNAの3’UTRエレメントは、配列番号25にしたがう核酸配列の対応するRNAを含んでいるか、または当該RNAからなることが特に好ましい。

0121

特に好ましい他の実施形態において、3’UTRエレメントは、αグロビン、好ましくは脊椎動物のαもしくはβグロビン、より好ましくは哺乳類のαもしくはβグロビン、最も好ましくは配列番号26〜28:
ホモサピエンスヘモグロビン,α1(HBA1)の3’UTR
GCTGGAGCCTCGGTGGCCATGCTTCTTGCCCCTTGGGCCTCCCCCCAGCCCCTCCTCCCCTTCCTGCACCCGTACCCCCGTGGTCTTTGAATAAAGTCTGAGTGGGCGGC(特許出願WO2013/143700の配列番号1370に対応する、配列番号26)
ホモサピエンス ヘモグロビン,α2(HBA2)の3’UTR
GCTGGAGCCTCGGTAGCCGTTCCTCCTGCCCGCTGGGCCTCCCAACGGGCCCTCCTCCCCTCCTTGCACCGGCCCTTCCTGGTCTTTGAATAAAGTCTGAGTGGGCAG(特許出願WO2013/143700の配列番号1371に対応する、配列番号27)
ホモサピエンス ヘモグロビン,β(HHB)の3’UTR
GCTCGCTTTCTTGCTGTCCAATTTCTATTAAAGGTTCCTTTGTTCCCTAAGTCCAACTACTAAACTGGGGGATATTATGAAGGGCCTTGAGCATCTGGATTCTGCCTAATAAAAAACATTTATTTTCATTGC(特許出願WO2013/143700の配列番号1372に対応する、配列番号28)
にしたがうヒトのαもしくはβグロビンに由来する核酸配列を含んでいるか、または当該核酸配列からなる。

0122

例えば、3’UTRエレメントは、好ましくは配列番号29:
αグロビン遺伝子の3’UTRの、中央のα複合体結合部分(本明細書において「muag」とも呼ばれる)
GCCCGATGGGCCTCCCAACGGGCCCTCCTCCCCTCCTTGCACCG(特許出願WO2103/143700の配列番号1393に対応する配列番号29)
にしたがう、αグロビン遺伝子(例えば、ヒトのαグロビン遺伝子)の、中央のα複合体結合部分を含んでいるか、または当該中央のα複合体結合部分からなる。

0123

これに関連して、本発明のmRNAの3’UTRエレメントは、配列番号29にしたがう核酸配列またはその相同物、断片またはバリアントの対応するRNA配列を含んでいるか、または当該RNA配列からなることが特に好ましい。

0124

「[・・・]遺伝子の3’UTRに由来する核酸配列」という用語は、[・・・]遺伝子の3’UTR配列に基づくか、またはその部分(例えば、アルブミン遺伝子、αグロビン遺伝子、βグロビン遺伝子、チロシンヒドロキシラーゼ遺伝子、リポキシゲナーゼ遺伝子、またはコラーゲンアルファ遺伝子(例えばコラーゲンアルファ1(I)遺伝子)、好ましくはアルブミン遺伝子、またはその部分の3’UTR)に基づく核酸配列を好ましく指す。この用語は、全体の3’UTR配列(すなわち遺伝子の全長3’UTR配列)に対応する配列、および遺伝子(例えば、アルブミン遺伝子、αグロビン遺伝子、βグロビン遺伝子、チロシンヒドロキシゲナーゼ遺伝子、リポキシゲナーゼ遺伝子、またはコラーゲンアルファ遺伝子(例えば、コラーゲンアルファ1(I)遺伝子))、好ましくはアルブミン遺伝子の3’UTR配列の断片に対応する配列を包含している。

0125

「[・・・]遺伝子の3’UTRのバリアントに由来する核酸配列」という用語は、遺伝子3’UTR配列のバリアント(例えば、アルブミン遺伝子、αグロビン遺伝子、βグロビン遺伝子、チロシンヒドロキシゲナーゼ遺伝子またはコラーゲンアルファ遺伝子(例えば、コラーゲンアルファ1(I)遺伝子))または上述のようなその断片に基づく核酸配列を指す。この用語は、遺伝子の3’UTRのバリアントの全体配列(すなわち遺伝子の全長のバリアント3’UTR配列)に対応する配列、および遺伝子のバリアント3’UTR配列の断片に対応する配列を包含している。好ましくは、これに関連するバリアントは、全長のバリアント3’UTRの少なくとも20%、好ましくは少なくとも30%、より好ましくは少なくとも40%、より好ましくは少なくとも50%、より一層好ましくは少なくとも60%、より一層好ましくは少なくとも70%、より一層好ましくは少なくとも80%、最も好ましくは少なくとも90%に相当する全長のバリアント3’UTRにおけるヌクレオチドの連続する広がりに対応するヌクレオチドの連続する広がりからなる。本発明の意味において、バリアントのそのような断片は、本明細書に記載のようなバリアントの機能的な断片であることが好ましい。

0126

好ましくは、少なくとも1つの5’UTRエレメントおよび少なくとも1つの3’UTRエレメントは、相乗的に作用して、上述のような本発明のmRNAからのタンパク質産生を向上させる。

0127

特に好ましい実施形態において、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)の少なくとも1つの抗原ペプチドもしくは抗原タンパク質、またはそのバリアントもしくは誘導体をコードしているコード領域を含んでいる本発明のmRNAは、ヒストンステムループ配列/構造を含んでいる。そのようなヒストン ステム−ループ配列は、WO2012/019780(開示事項は参照によって本明細書に組み込まれる)に開示されているようなヒストン ステム−ループ配列から選択される。

0128

本発明の範囲において使用されるために好適なヒストンステム−ループ配列は、以下の式(I)または(II):
式(I)(ステム境界配列なしのステム−ループ配列):

0129

0130

式(II)(ステム境界配列ありのステム−ループ配列):

0131

0132

の少なくとも1つのから選択されることが好ましく、
ステム1またはステム2の境界エレメントN1−6は、1〜6、好ましくは2〜6、より好ましくは2〜5、より一層好ましくは3〜5、最も好ましくは4〜5、または5のNの連続する配列であり、Nのそれぞれは、他のNから独立して、A、U、T、GおよびC、またはそのヌクレオチド類似物から選択されるヌクレオチドから選択され;)
ステム1[N0−2GN3−5]は、ステム2のエレメントと逆相補的または部分的に逆相補的であり、かつ5〜7ヌクレオチドの間の連続する配列であり;
N0−2は、0〜2、好ましくは0〜1、より好ましくは1のNの連続する配列であり、Nのそれぞれは、他のNから独立して、A、U、T、GおよびC、またはそのヌクレオチド類似物から選択されるヌクレオチドから選択され;
N3−5は、3〜5、好ましくは4〜5、より好ましくは4のNの連続する配列であり、Nのそれぞれは、他のNから独立して、A、U、T、GおよびC、またはそのヌクレオチド類似物から選択されるヌクレオチドから選択され;
Gは、グアノシンまたはその類似物であり、ステム2におけるその相補的シチジンヌクレオチドがグアノシンによって置き換えられている条件のもとに、任意にシチジンまたはその類似物に置き換えられ得;
ループ配列[N0−4(U/T)N0−4]は、ステム1およびステム2のエレメントの間に配置されており、3〜5ヌクレオチド、より好ましくは4ヌクレオチドの連続する配列であり;
N0−4のそれぞれは、他のNから独立して、0〜4、好ましくは1〜3、より好ましくは1〜2のNの連続する配列であり、Nのそれぞれは、他のNから独立して、A、U、T、GおよびC、またはそのヌクレオチド類似物から選択されるヌクレオチドから選択され、U/Tは、ウリジンまたは任意にチミジンを表しており;
ステム2[N3−5CN0−2]は、ステム1のエレメントと逆相補的または部分的に逆相補的であり、かつ5〜7ヌクレオチドの間の連続する配列であり;
N3−5は、3〜5、好ましくは4〜5、より好ましくは4のNの連続する配列であり、Nのそれぞれは、他のNから独立して、A、U、T、GおよびC、またはそのヌクレオチド類似物から選択されるヌクレオチドから選択され;
N0−2は、0〜2、好ましくは0〜1、より好ましくは1のNの連続する配列であり、Nのそれぞれは、他のNから独立して、A、U、T、GおよびC、またはそのヌクレオチド類似物から選択されるヌクレオチドから選択され;
Cは、シチジンまたはその類似物であり、ステム1におけるその相補的なグアノシンヌクレオチドがシチジンに置き換えられている条件のもとに、グアノシンまたはその類似物に任意に置き換えられ得;
ステム1およびステム2は、互いに塩基対形成可能であり、例えばヌクレオチドAとU/Tと、またはGとCとのワトソンクリック塩基対形成または非ワトソン−クリック塩基対形成(例えば、ゆらぎ塩基対形成、逆ワトソン−クリック塩基対形成、フーグスティーン塩基対形成、逆フーグスティーン塩基対形成)によって、塩基対形成がステム1およびステム2の間に生じ得る逆相補性配列を形成しているか、またはステム1およびステム2は、互いに塩基対形成可能であり、不完全な塩基対形成がステム1およびステム2の間に、2つのステムにおける1つ以上の塩基が他方のステムの逆相補的な配列において相補的な塩基を有していないことに基づいて、生じ得る部分的な逆相補性配列を形成している。

0133

本発明の第1の局面のさらなる好ましい実施形態によれば、本発明のmRNA配列は、以下の特定の式(Ia)または(IIa):
式(Ia)(ステム境界エレメントなしのステム−ループ配列):

0134

0135

式(IIa)(ステム境界エレメントありのステム−ループ配列):

0136

0137

の少なくとも1つにしたがうヒストンステム−ループ配列の少なくとも1つを含み得る(ここで、N、C、G、TおよびUは以上に規定されている通りである)。

0138

第1の局面のさらなるより好ましい実施形態によれば、本発明のmRNA配列は、以下の特定の式(Ib)または(IIb):
式(Ib)(ステム境界エレメントなしのステム−ループ配列):

0139

0140

式(IIb)(ステム境界エレメントありのステム−ループ配列):

0141

0142

の少なくとも1つにしたがうヒストンステム−ループ配列の少なくとも1つを含み得る(ここで、N、C、G、TおよびUは以上に規定されている通りである)。

0143

特に好ましいヒストンステム−ループ配列は、配列番号30 CAAAGGCTCTTTTCAGAGCCACCAにしたがう配列、またはより好ましくは配列番号30にしたがう核酸配列対応するRNA配列(CAAAGGCUCUUUUCAGAGCCACCA 配列番号37)である。

0144

本発明の第1の局面の特に好ましい実施形態において、本発明のmRNA配列は、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)の少なくとも1つの抗原ペプチドもしくは抗原タンパク質、またはその断片、バリアントもしくは誘導体をコードしているコード領域に加えて、ポリ(A)配列(ポリAテイルとも呼ばれる)を、好ましくは本発明のmRNAの3’末端に、含んでいる。存在する場合、そのようなポリ(A)配列は、約25〜約400のアデノシンヌクレオチドの配列、好ましくは約50〜約400のアデノシンヌクレオチドの配列、より好ましくは約50〜300のアデノシンヌクレオチドの配列、より一層好ましくは約60〜約250のアデノシンヌクレオチドの配列を含んでいる。これに関連して、「約」という用語は、それが付されている(複数の)値の±10%の偏差を指す。このポリ(A)配列は、本発明の第1の局面に係る本発明のmRNAに含まれているコード領域の3’に好ましく配置されている。

0145

さらなる好ましい実施形態において、本発明のmRNAは、少なくとも10のシトシン、好ましくは少なくとも20のシトシン、より好ましくは少なくとも30のシトシンの配列(「ポリ(C)配列」と呼ばれる)によって修飾され得る。より詳細には、mRNAは、典型的に約10〜200のシトシンヌクレオチド、好ましくは約10〜100のシトシンヌクレオチド、より好ましくは約10〜70のシトシンヌクレオチド、より一層好ましくは約20〜50のシトシンヌクレオチドまたは20〜30のシトシンヌクレオチドのポリ(C)配列を含み得る。このポリ(C)配列は、好ましくはコード領域の3’、より好ましくは本発明の第1の局面に係る本発明のmRNAに含まれている付加的なポリ(A)配列の3’に、配置されている。

0146

これに関連して、本発明のmRNA配列は、特定の実施形態において、
a.)5’キャップ構造、好ましくはm7GpppN;
b.)呼吸器合胞体ウイルス(RSV)の、好ましくは呼吸器合胞体ウイルス(RSV)の融合タンパク質Fに由来する、少なくとも1つの抗原ペプチドもしくは抗原タンパク質をコードしているコード領域;
c.)64のアデノシンを好ましく含んでいる。ポリ(A)配列;および
d.)任意に、30のシトシンを好ましく含んでいる、ポリ(C)配列
を含み得る。

0147

本発明の第1の局面の特に好ましい実施形態において、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)の少なくとも1つの抗原ペプチドもしくは抗原タンパク質、またはその断片、バリアントもしくは誘導体をコードしているコード領域を含んでいる本発明のmRNAは、
好ましくは5’から3’方向に、
a.)5’キャップ構造、好ましくはm7GpppN;
b.)狂犬病ウイルスの、好ましくは狂犬病ウイルスの糖タンパク質G(RAV−G)に由来する、少なくとも1つの抗原ペプチドもしくは抗原タンパク質をコードしているコード領域;
c.)好ましくは64のアデノシンを含んでいる、ポリ(A)配列;
d.)任意に、好ましくは30のシトシンを含んでいる、ポリ(C)配列;ならびに
e.)好ましくは配列番号30にしたがう核酸配列の対応するRNA配列を含んでいる、ヒストンステム−ループ
を含んでいる。

0148

本発明の第1の局面の、特に好ましいさらなる実施形態において、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)の少なくとも1つの抗原ペプチドもしくは抗原タンパク質、またはその断片、バリアントもしくは誘導体を含んでいる本発明のmRNAは、
好ましくは5’から3’方向に、
a.)5’キャップ構造、好ましくはm7GpppN;
b.)呼吸器合胞体ウイルス(RSV)の、好ましくは呼吸器合胞体ウイルス(RSV)の融合タンパク質に由来する、少なくとも1つの抗原ペプチドもしくは抗原タンパク質をコードしているコード領域;
c.)任意に、好ましくは配列番号29にしたがう核酸配列の対応するRNA配列を含んでいる、アルファグロビン遺伝子に由来する3’UTRエレメント、その相同物、断片もしくはバリアント;
d.)好ましくは64のアデノシンを含んでいる、ポリ(A)配列;
e.)任意に、好ましくは30のシトシンを含んでいる、ポリ(C)配列;および
f.)好ましくは配列番号30にしたがう核酸配列の対応するRNA配列を含んでいる、ヒストンステム−ループ
を含んでいる。

0149

好ましい他の実施形態において、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)の抗原ペプチドもしくは抗原タンパク質、またはその断片、バリアントもしくは誘導体をコードしているコード領域を含んでいる本発明のmRNAは、
好ましくは5’から3’方向に、
a.)5’キャップ構造、好ましくはm7GpppN;
b.)任意に、TOP遺伝子に由来する、好ましくは配列番号23にしたがう核酸配列の対応するRNA配列に由来する、5’UTRエレメント、またはその断片もしくはバリアント;
c.)呼吸器合胞体ウイルス(RSV)の、好ましくは呼吸器合胞体ウイルス(RSV)の融合タンパク質Fに由来する、少なくとも1つの抗原ペプチドもしくは抗原タンパク質をコードしているコード領域;
d.)任意に、安定なmRNAをもたらす、遺伝子またはその相同物、断片もしくはバリアントに由来する(配列番号25にしたがう核酸配列の対応するRNAに由来する)3’UTRエレメント;
e.)好ましくは64のアデノシンを含んでいる、ポリ(A)配列;
f.)任意に、好ましくは30のシトシンを含んでいる、ポリ(C)配列;ならびに
g.)好ましくは配列番号30にしたがう核酸配列の対応するRNA配列を含んでいる、ヒストンステム−ループ
を含んでいる。

0150

上記コード領域は、配列番号1〜11にしたがうアミノ酸配列、またはその断片、バリアントもしくは誘導体の少なくとも1つを部分的にコードし得る。さらに、本発明のmRNAの上記コード領域は、これらのアミノ酸配列の組合せ、またはその断片、バリアントもしくは誘導体の組合せをコードし得る。これに関連して特に好ましいのは、核タンパク質Nとの融合タンパク質Fの組合せ、ならびに融合タンパク質FおよびM2−1タンパク質の組合せである。

0151

さらに、上記コード領域は、配列番号12〜配列番号22にしたがう配列、またはその断片、相同物もしくはバリアントの少なくとも一部であり得るか、または当該一部を含み得る。さらに、上記mRNAは、これらの配列の少なくとも2つの組合せ、その断片、相同物もしくはバリアント組合せを含み得る。

0152

例えばインビボ分解(例えば、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼによる)に対する、耐性のさらなる向上のために、本発明のmRNAは、例えば修飾核酸の形態において、安定化された核酸配列として提供され得る。したがって、本発明のさらなる実施形態によれば、本発明のmRNAは、好ましくは骨格修飾、糖修飾および/または塩基修飾によって安定化されていること、より好ましくはG/C含有量の変更によって安定化されていることが好ましい。これらの変更のすべては、翻訳されるmRNAの機能(呼吸器合胞体ウイルス(RSV)のペプチドまたはタンパク質に由来する抗原性機能)を妨げることなく、本発明のmRNAに導入され得る。

0153

本発明に関連する骨格修飾は、本発明のmRNAに含まれているヌクレオチドの骨格のリン酸が、化学的に修飾される修飾(例えば、アニオン性のヌクレオチド間結合、N3’→N5’修飾、非架橋酸素原子の、水素化ホウ素による置換、中性のヌクレオチド間結合、複数のヌクレオチドのアミド結合、メチレン(メチルアミノ)結合、ホルムアセタールおよびチオホルムアセタール結合、またはスルホニル基の導入など)であることが好ましい。

0154

本発明に関連する糖修飾は、本発明のmRNAのヌクレオチドの糖の化学修飾(例えば、リボース残基のメチル化など)であることが好ましい。

0155

他の実施形態によれば、本発明のmRNAは、本発明のmRNA(好ましくはそのコード領域)のG(グアノシン)/C(シトシン)含有量を変更することによって、修飾され得、かつ安定化され得る。

0156

本明細書において、好ましくはコード領域の、本発明のmRNAのG/C含有量は、その特定の野生型コード領域(すなわち未修飾のmRNA)のG/C含有量と比べて、特に向上されている。しかし、本発明のmRNAのコードされているアミノ酸配列は、特定の野生型/未修飾のmRNAのコードされているアミノ酸配列と比べて、変更されていないことが好ましい。

0157

本発明のmRNAのG/C含有量の変更は、向上したG(グアノシン)/C(シトシン)含有量を有しているRNA配列が、向上したA(アデノシン)/U(ウラシル)を有しているRNA配列より安定であることに基づいている。コード配列のコドンまたは全RNAは、したがって、それらがG/Cヌクレオチドの向上した量を含んでおり、翻訳されたアミノ酸配列が維持されているように、野生型のコード配列またはmRNAと比べて変更され得る。いくつかのコドンが1つの同じアミノ酸をコードしていることに関して、安定性に有利なコドンのほとんどが、決定され得る(いわゆる代替的なコドンの利用)。好ましくは、本発明に係る本発明のmRNAのコード領域のG/C含有量は、野生型RNAのコードされる領域のG/C含有量と比べて、少なくとも7%、より好ましくは少なくとも15%、特に好ましくは少なくとも20%向上されている。特定の実施形態によれば、本明細書に規定されているようなタンパク質もしくはペプチド、またはその断片もしくはバリアントをコードしている領域、または野生型のmRNA配列もしくはコード配列の全配列における置換可能なコドンの、少なくとも5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、より好ましくは少なくとも70%、より一層好ましくは80%、最も好ましくは少なくとも90%、95%または100%が置換されて、それによって、上記配列のG/C配列を向上させている。これに関連して、特にコードにおける、本発明のmRNAのG/C含有量を最大まで(すなわち置換可能な100%のコドン)、野生型の配列と比べて向上させることが特に好ましい。

0158

本発明のさらなる実施形態によれば、本発明のmRNAは、翻訳のために最適化されている(例えば、所定のアミノ酸のより低頻度tRNAのためのコドンを、それぞれのアミノ酸の、より高頻度に存在するtRNAのためのコドンによって置換することによって翻訳のために最適化されている)。これは、翻訳効率がまた、細胞におけるtRNAの存在における異なる頻度によって決定されるという知見に基づいている。したがって、いわゆる「低頻度のコドン」が、向上された程度において本発明のmRNAに存在する場合、対応する修飾RNAは、より高頻度のtRNAをコードしているコドンが存在する場合と比べて顕著に低い程度において翻訳される。好ましくは、本発明のmRNAのコード領域は、細胞において相対的にまれなtRNAまたは低頻度のtRNAをコードしている、野生型配列の少なくとも1つのコドンが、細胞においてより高頻度または最も高頻度にあり、かつ相対的にまれなtRNAまたは低頻度のtRNAと同じアミノ酸を運ぶtRNAをコードしているコドンに交換されるように、野生型RNAまたはコード配列の対応する領域と比べて変更されている。この変更によって、本発明のmRNAの配列は、より高頻度に存在するtRNAが利用可能であるコドンが挿入されるように変更され得る。言い換えると、本発明によれば、この修飾によって、細胞において相対的にまれなtRNAをコードしている野生型配列のすべてのコドンは、細胞において相対的に高頻度のtRNAをコードしており、かつ相対的にまれなtRNAと同じアミノ酸を運ぶコドンにそれぞれについて交換され得る。さらに、本発明のmRNAのコード領域によってコードされているタンパク質(すなわちコード領域)のアミノ酸配列を変更することなく、本発明のmRNAにおいて向上されている(特に最大化されている)結果として生じるG/C含有量を、「高頻度の」コドンと結び付けることが特に好ましい。この好ましい実施形態は、特に効率的に翻訳され、安定化される(修飾されている)本発明のmRNAの提供を可能にする。

0159

塩基の置換、付加または除去は、よく知られている部位特異的変異生成の手法による核酸分子の調製のためのDNAマトリクスを用いてか、またはオリゴヌクレオチド連結を用いて、好ましく実施される。そのような処理において、本発明に規定されているような本発明の組合せワクチンの少なくとも1つのRNAの調製のために、対応するDNA分子がインビトロ転写され得る。このDNAマトリクスは、調製される少なくとも1つのRNAのための所望されるヌクレオチド配列後ろに続く、インビトロ転写にとって好適なプロモータ(例えば、T7またはS6プロモータ)、およびインビトロ転写のための終結シグナルを好ましくは含んでいる。少なくとも1つの所望のRNAのマトリクスを形成するDNA分子は、発酵性増殖および細菌において複製され得るプラスミドの一部としての続く単離によって調製され得る。本発明にとって好適であると述べられ得るプラスミドは、例えば、プラスミドpT7T(GenBankaccession number U26404; Lai et al., Development 1995, 121: 2349 to 2360)、pGEM(登録商標)(例えば、pGEM(登録商標)−1)(GenBank accession number X65300; from Promega)、およびpSP64(GenBank accession number X65327)(Mezei and Storts, Purification ofPCRProducts, in: Griffin and Griffin (ed.), PCR Technology: Current Innovation,CRCPress, Boca Raton,FL, 2001も参照)。

0160

特に好ましい実施形態において、本発明の第1の局面に係る本発明のmRNA配列は、
好ましくは5’から3’方向に、
a)本明細書に規定されているような5’キャップ構造、好ましくはm7GpppN;
b)呼吸器合胞体ウイルス(RSV)の融合タンパク質F、糖タンパク質G、短い疎水性タンパク質SH、マトリクスタンパク質M、核タンパク質N、ラージポリメラーゼL、M2−1タンパク質、M2−2タンパク質リン酸タンパク質P、非構造タンパク質NS1、または非構造タンパク質NS2に由来する少なくとも1つの抗原ペプチドもしくは抗原タンパク質、またはその断片、バリアントもしくは誘導体をコードしている、好ましくは野生型mRNAのコード領域のG/C含有量と比べて、向上しているか、または最大化されているG/C含有量を有している、コード領域;
c)好ましくは安定なmRNAをもたらす遺伝子、より好ましくは配列番号29にしたがう核酸配列の対応するRNA、またはその相同物、断片もしくはバリアントに由来する、本明細書に規定されているような3’UTRエレメント;
d)好ましくは64のアデノシンからなる、ポリ(A)配列;
e)任意に、好ましくは30のシトシンからなる、ポリ(C)配列;ならびに
f)好ましくは配列番号30にしたがう核酸配列の対応するRNA配列、少なくとも1つのヒストンステム−ループ配列
を含んでいる。

0161

最も好ましくは、その特定の実施形態の、本発明のmRNAは、RSVlongの融合タンパク質Fをコードしている本発明のmRNAの例を用いた、図1(配列番号31)に示されているような配列修飾を含んでいる。

0162

特に好ましいさらなる実施形態において、本発明の第1の局面に係る本発明のmRNA配列は、
好ましくは5’から3’方向に、
a)本明細書に規定されているような5’キャップ構造、好ましくはm7GpppN;
b)本明細書に規定されているような5’UTRエレメント、好ましくはTOP遺伝子の5’UTR(好ましくは配列番号23にしたがう、5’末端オリゴピリミジントラクトを欠いている人のリボソームタンパク質ラージ32の5’UTR)、またはその断片、相同物もしくはバリアントに由来する核酸配列を含んでいるか、または当該核酸配列からなる5’UTRエレメント;
c)呼吸器合胞体ウイルス(RSV)の融合タンパク質F、糖タンパク質G,短い疎水性タンパク質SH、マトリクスタンパク質M、核タンパク質N、ラージポリメラーゼL、M2−1タンパク質、M2−2タンパク質、非構造タンパク質NS1もしくは非構造タンパク質NS2、またはその断片、バリアントもしくは誘導体に由来する少なくとも1つの抗原ペプチドまたは抗原タンパク質をコードしている、好ましくは野生型mRNAのコード領域のG/C含有量と比べて、向上されているか、または最大化されているG/C含有量を有している、コード領域;
d)3’UTRエレメント、好ましくは配列番号24にしたがうヒトのアルブミンの3’UTRもしくは対応するRNA、またはその相同物、断片もしくはバリアント;
e)好ましくは64のアデノシンからなる、ポリ(A)配列;
f)任意に、好ましくは20のシトシンからなる、ポリ(C)配列。
g)少なくとも1つのヒストンステム−ループ、好ましくは配列番号30にしたがう核酸配列の対応するRNA配列
を含んでいる。

0163

最も好ましくは、特定のその実施形態の、本発明のmRNAは、RSVlongの融合タンパク質Fをコードしている本発明のmRNAの例を用いて、図2(配列番号32)に示されているような配列修飾を含んでいる。

0164

より一層好ましい実施形態において、本発明のmRNA配列は、配列番号31および配列番号35にしたがう図1〜5に示されている配列を含んでいるか、または当該配列からなる。

0165

さらなる特定の実施形態において、例えば本発明のmRNAが、2つ以上の抗原ペプチドまたは抗原タンパク質をコードしている場合に、本発明に係るmRNAは、いくつかのオープンリーディングフレームを分離し得る内部リボソーム進入部位(IRES)配列またはIRESモチーフをさらに含み得る。IRES配列は、mRNAがバイシストロン性または多シストロン性のmRNAである場合に、特に有用である。

0166

さらに、本発明のmRNAは、当該分野において知られている任意の方法(固層合成およびインビトロ法(例えばインビトロ転写反応)が挙げられる)を用いて調製され得る。

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