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課題・解決手段

本発明は、アルカリ定性が向上したポリペプチドであって、配列番号1もしくは配列番号2によって特定されるブドウ球菌プロテインA(SpA)のBもしくはCドメインの、又は配列番号3によって特定されるプロテインZの突然変異体を含み、少なくとも15位のグルタミン酸残基が、アスパラギン以外のアミノ酸突然変異しているポリペプチドを開示する。本発明はまた、ポリペプチドの多量体、及び多量体又はポリペプチドを含む分離マトリックスを開示する。

概要

背景

免疫グロブリンは、製造又は開発のいずれかで世界的に最も普及しているバイオ医薬品の代表である。この特定の治療市場に対する高い商業上の需要及びそれ故のその価値のため、製薬会社は、関連コストを管理しながら、それぞれのmAbの製造プロセスの生産性最大限にすることに重点を置いている。

アフィニティークロマトグラフィーは、ほとんどの場合、これらの免疫グロブリン分子、例えばモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体の精製における重要な工程の1つとして使用される。特に興味深いクラスのアフィニティー試薬は、免疫グロブリン分子の不変の部分に特異的に結合することができるタンパク質であり、このような相互作用は、抗体の抗原結合特異性と無関係である。このような試薬は、限定されないが、血清調製物もしくは血漿調製物又は細胞培養由来供給材料などの様々なサンプルから、免疫グロブリンをアフィニティークロマトグラフィーによって回収するために広く使用することができる。このようなタンパク質の一例は、異なる種由来のIgG免疫グロブリンのFc及びFab部分に結合することができるドメインを含有するブドウ球菌プロテインAである。

ブドウ球菌プロテインA(SpA)をベースとする試薬は、親和性及び選択性が高いため、バイオテクノロジーの分野(例えば、抗体の捕捉及び精製、並びに検出又は定量に関するアフィニティークロマトグラフィー)において、広範な用途が見出されている。現在、SpAをベースとするアフィニティー媒体は、おそらく工業用の細胞培養上清を含む様々なサンプルからモノクローナル抗体及びその断片を単離するための最も広く使用されているアフィニティー媒体である。したがって、プロテインA−リガンドを含む様々なマトリックスが、例えば、天然のプロテインA(例えば、Protein ASEPHAROSE商標),GE Healthcare,Uppsala,Sweden)の形態で市販されており、組換えプロテインA(例えば、rProtein A SEPHAROSE(商標),GE Healthcare)から構成されるものもある。より具体的には、市販の組換えプロテインA製品で行われる遺伝子操作は、支持体へのその付着を容易にするためのものである。

これらの用途では、他のアフィニティークロマトグラフィー用途のように、混入物質の確実な除去に総合的な配慮が必要とされる。例えば、このような混入物質は、クロマトグラフィー法において固定相又はマトリックスに吸着される非溶出分子、例えばタンパク質、炭水化物、脂質、細菌及びウイルスを含む望ましくない生体分子又は微生物であり得る。後の使用の前にマトリックスを再生するために、マトリックスからのこのような混入物質の除去は、通常、所望の産物が最初に溶出した後に行われる。このような除去は、通常、混入物質を固定相から溶出することができる薬剤を使用するクリーンインプレイスCIP)として公知の手法を用いる。多くの場合に使用されるこのようなクラスの薬剤の1つは、固定相を通過するアルカリ性溶液である。現在最も広く使用されているクリーニング及び消毒薬剤はNaOHであり、その濃度は混入の程度及び性質に応じて、0.1M〜例えば最大1Mの範囲であり得る。この戦略は、マトリックスを13超のpH値曝露することに関連する。タンパク質性アフィニティーリガンドを含有する多くのアフィニティークロマトグラフィーマトリックスについて、このようなアルカリ性環境は極めて苛酷な条件であるため、関連の高pHに対するリガンドの不安定性を原因とする能力の低下をもたらす。

したがって、広範な研究では、アルカリ性pH値に耐える改善された能力を示す人工タンパク質リガンドの開発に焦点が当てられている。例えば、Gulichら(Susanne Gulich,Martin Linhult,Per−Ake Nygren,Mathias Uhlen,Sophia Hober,Journal of Biotechnology 80(2000),169−178)は、連鎖球菌アルブミン結合性ドメイン(ABD)のアルカリ性環境における安定性を改善するためにタンパク質工学を提案している。Gulichらは、4つのアスパラギン残基すべてがロイシン(1つの残基)、アスパラギン酸(2つの残基)及びリジン(1つの残基)により置換されたABDの突然変異体を作り出した。さらに、Gulichらは、彼らの突然変異体が、天然のタンパク質のものと類似の標的タンパク質結合挙動を示すこと、人工リガンドを含有するアフィニティーカラムが、アルカリ性条件に繰り返し曝露した後に、親の非人工リガンドを使用して調製したカラムよりも高い結合能を示すことを報告している。したがって、そこでは、構造及び機能に対するいかなる重大な影響も及ぼさずに、4つのアスパラギン残基すべてを置換することができると結論されている。

最近の研究は、プロテインA(SpA)を変化させて同様の特性をもたらし得ることを示している。米国特許出願公開第2005/0143566号では、1以上のアスパラギン残基がグルタミン及びアスパラギン酸以外のアミノ酸突然変異すると、突然変異は、最大約13〜14のpH値において、親SpA(例えば、SpAのBドメイン、又はSpAのBドメイン由来の合成構築物であるプロテインZ(米国特許第5,143,844号))と比較して増加した化学安定性を付与することが開示されている。著者らは、これらの突然変異タンパク質をアフィニティーリガンドとして使用すると、その分離媒体は、予想通り、アルカリ性薬剤を使用するクリーニング手順により耐性良好であり得ることを示している。国際公開第2008/039141号、特開2006304633号、欧州特許第1992692号、欧州特許第2202310号、国際公開第2010/110288号、国際公開第2012/086660号及び国際公開第2012/083425号では、アルカリ安定性を高めることを目的とするプロテインAドメインのさらなる突然変異も公表されている。しかしながら、現在利用可能な突然変異は依然として、アルカリ性pHに対して感受性であり、クリーニング中のNaOH濃度は通常、0.1Mに制限されている(これは、完全なクリーニングを達成することが困難であることを意味する)。クリーニングを改善するより高いNaOH濃度は、許容され得ない能力喪失につながる。

したがって、この分野では、アルカリクリーニング手順に関して、さらに改善された安定性を有するタンパク質リガンドを含有する分離マトリックスを得る必要性が依然として存在する。

概要

本発明は、アルカリ安定性が向上したポリペプチドであって、配列番号1もしくは配列番号2によって特定されるブドウ球菌プロテインA(SpA)のBもしくはCドメインの、又は配列番号3によって特定されるプロテインZの突然変異体を含み、少なくとも15位のグルタミン酸残基が、アスパラギン以外のアミノ酸に突然変異しているポリペプチドを開示する。本発明はまた、ポリペプチドの多量体、及び多量体又はポリペプチドを含む分離マトリックスを開示する。

目的

国際公開第2008/039141号、特開2006304633号、欧州特許第1992692号、欧州特許第2202310号、国際公開第2010/110288号、国際公開第2012/086660号及び国際公開第2012/083425号では、アルカリ安定性を高めることを目的とする

効果

実績

技術文献被引用数
1件
牽制数
1件

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請求項1

アルカリ定性が向上したポリペプチドであって、配列番号1もしくは配列番号2によって特定されるブドウ球菌プロテインA(SpA)のBもしくはCドメインの、又は配列番号3によって特定されるプロテインZの突然変異体を含み、少なくとも15位のグルタミン酸残基が、アスパラギン及びグルタミン以外のアミノ酸突然変異している、ポリペプチド。

請求項2

少なくとも15位のグルタミン酸残基が、アスパラギン、プロリン及びシステイン以外のアミノ酸に、例えばリジンに突然変異している、請求項1に記載のポリペプチド。

請求項3

23位のアミノ酸残基が、トレオニン又はアラニンである、請求項1又は請求項2に記載のポリペプチド。

請求項4

3位のアミノ酸残基がアラニンであり、及び/又は6位のアミノ酸残基がアスパラギン酸である、請求項1乃至請求項3のいずれか1項に記載のポリペプチド。

請求項5

3位及び6位のアミノ酸残基の少なくとも1つが、アスパラギンである、請求項1乃至請求項4のいずれか1項に記載のポリペプチド。

請求項6

33位のセリン残基が、アスパラギン、グルタミン、プロリン及びシステイン以外のアミノ酸に、例えばリジンに突然変異しているか、又は33位のアミノ酸残基がセリンである、請求項1乃至請求項5のいずれか1項に記載のポリペプチド。

請求項7

9位のグルタミン残基が、アスパラギン、グルタミン、プロリン及びシステイン以外のアミノ酸に突然変異しているか、又は9位のアミノ酸残基がグルタミンである、請求項1乃至請求項6のいずれか1項に記載のポリペプチド。

請求項8

9位のグルタミン残基がアラニンに突然変異している、請求項1乃至請求項7のいずれか1項に記載のポリペプチド。

請求項9

10位のグルタミン残基が、アスパラギン、グルタミン、プロリン及びシステイン以外のアミノ酸に、例えばアラニンに突然変異しているか、又は10位のアミノ酸残基がグルタミンである、請求項1乃至請求項8のいずれか1項に記載のポリペプチド。

請求項10

32位のグルタミン残基が、アスパラギン、グルタミン、プロリン及びシステイン以外のアミノ酸に、例えばアラニンに突然変異しているか、又は32位のアミノ酸残基がグルタミンである、請求項1乃至請求項9のいずれか1項に記載のポリペプチド。

請求項11

40位のグルタミン残基が、アスパラギン、グルタミン、プロリン及びシステイン以外のアミノ酸に、例えばアラニンもしくはバリンに突然変異しているか、又は40位のアミノ酸残基がグルタミンである、請求項1乃至請求項10のいずれか1項に記載のポリペプチド。

請求項12

55位のグルタミン残基が、アスパラギン、グルタミン、プロリン及びシステイン以外のアミノ酸に、例えばアラニン、セリンもしくはグルタミン酸に突然変異しているか、又は55位のアミノ酸残基がグルタミンである、請求項1乃至請求項11のいずれか1項に記載のポリペプチド。

請求項13

26位のアミノ酸残基がグルタミンであるか、又は26位のグルタミン残基が、アスパラギン、グルタミン、プロリン及びシステイン以外のアミノ酸に突然変異している、請求項1乃至請求項12のいずれか1項に記載のポリペプチド。

請求項14

15位のグルタミン酸残基が、アスパラギン、グルタミン、プロリン及びシステイン以外のアミノ酸に、例えばリジンに突然変異しているか、又は15位のアミノ酸残基がグルタミン酸である、請求項1乃至請求項13のいずれか1項に記載のポリペプチド。

請求項15

47位のグルタミン酸残基が、アスパラギン、グルタミン、プロリン及びシステイン以外のアミノ酸に突然変異しているか、又は47位のアミノ酸残基がグルタミン酸である、請求項1乃至請求項14のいずれか1項に記載のポリペプチド。

請求項16

47位のグルタミン酸残基が、アラニン又はトレオニンに突然変異している、請求項15に記載のポリペプチド。

請求項17

21位のアスパラギン残基が、グルタミン、プロリン及びシステイン以外のアミノ酸に、例えばアスパラギン酸に突然変異しているか、又は21位のアミノ酸残基がアスパラギンである、請求項1乃至請求項16のいずれか1項に記載のポリペプチド。

請求項18

36位のアスパラギン酸残基が、グルタミン、プロリン及びシステイン以外のアミノ酸に突然変異している、請求項1乃至請求項17のいずれか1項に記載のポリペプチド。

請求項19

36位のアスパラギン酸残基が、グルタミン、プロリン及びシステイン以外のアミノ酸に、例えばアラニン又はトレオニンに突然変異しているか、又は36位のアミノ酸残基がアスパラギン酸である、請求項18に記載のポリペプチド。

請求項20

突然変異が、Q9A,E15Kである、請求項1乃至請求項19のいずれか1項に記載のポリペプチド。

請求項21

配列番号6、配列番号8、配列番号9、配列番号10及び配列番号13によって定義される配列からなる群から選択される配列を含むか、又はこれから本質的になる、請求項1乃至請求項20のいずれか1項に記載のポリペプチド。

請求項22

請求項1乃至請求項21のいずれか1項に記載の複数のポリペプチドユニットを含む或いはそれらから本質的になる、多量体

請求項23

ポリペプチドユニットが、最大15アミノ酸を含む要素によって連結されている、請求項22に記載の多量体

請求項24

二量体三量体四量体五量体又は六量体である、請求項22又は請求項23に記載の多量体。

請求項25

システイン残基、複数のリジン残基及び複数のヒスチジン残基からなる群から選択される1つ以上のカップリング要素C末端又はN末端にさらに含む、請求項1乃至請求項24のいずれか1項に記載のポリペプチド又は多量体。

請求項26

請求項1乃至請求項25のいずれか1項に記載のポリペプチド又は多量体をコードする、核酸又はベクター

請求項27

請求項26に記載の核酸又はベクターを含む、発現系。

請求項28

請求項1乃至請求項24のいずれか1項に記載の複数のポリペプチド又は多量体が固体支持体カップリングされている、分離マトリックス

請求項29

ポリペプチド又は多量体が、チオエーテル結合を介して固体支持体にカップリングされている、請求項28に記載の分離マトリックス。

請求項30

固体支持体が多糖である、請求項28又は請求項29に記載の分離マトリックス。

請求項31

免疫グロブリンを単離する方法であって、請求項28乃至請求項30のいずれか1項に記載の分離マトリックスを使用する、方法。

請求項32

a)免疫グロブリンを含む液体サンプルを、請求項28乃至請求項30のいずれか1項に記載の分離マトリックスと接触させる工程、b)洗浄液で分離マトリックスを洗浄する工程、c)溶出液を用いて、分離マトリックスから免疫グロブリンを溶出する工程、及びd)クリーニング液で分離マトリックスをクリーニングする工程を含む、請求項31に記載の方法。

請求項33

クリーニング液がアルカリ性であり、例えば13〜14のpHを有する、請求項32に記載の方法。

請求項34

クリーニング液が0.1〜1.0MNaOH又はKOH、例えば0.5〜1.0MNaOHを含む、請求項32又は請求項33に記載の方法。

請求項35

工程a)〜d)を少なくとも10回、例えば少なくとも50回又は50〜200回繰り返す、請求項32乃至請求項34のいずれか1項に記載の方法。

技術分野

0001

本発明は、アフィニティークロマトグラフィーの分野、より具体的には、免疫グロブリンのアフィニティークロマトグラフィーに有用なプロテインA突然変異免疫グロブリン結合ドメインに関する。本発明はまた、突然変異ドメイン多量体、及び突然変異ドメイン又は多量体を含有する分離マトリックスに関する。

背景技術

0002

免疫グロブリンは、製造又は開発のいずれかで世界的に最も普及しているバイオ医薬品の代表である。この特定の治療市場に対する高い商業上の需要及びそれ故のその価値のため、製薬会社は、関連コストを管理しながら、それぞれのmAbの製造プロセスの生産性最大限にすることに重点を置いている。

0003

アフィニティークロマトグラフィーは、ほとんどの場合、これらの免疫グロブリン分子、例えばモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体の精製における重要な工程の1つとして使用される。特に興味深いクラスのアフィニティー試薬は、免疫グロブリン分子の不変の部分に特異的に結合することができるタンパク質であり、このような相互作用は、抗体の抗原結合特異性と無関係である。このような試薬は、限定されないが、血清調製物もしくは血漿調製物又は細胞培養由来供給材料などの様々なサンプルから、免疫グロブリンをアフィニティークロマトグラフィーによって回収するために広く使用することができる。このようなタンパク質の一例は、異なる種由来のIgG免疫グロブリンのFc及びFab部分に結合することができるドメインを含有するブドウ球菌プロテインAである。

0004

ブドウ球菌プロテインA(SpA)をベースとする試薬は、親和性及び選択性が高いため、バイオテクノロジーの分野(例えば、抗体の捕捉及び精製、並びに検出又は定量に関するアフィニティークロマトグラフィー)において、広範な用途が見出されている。現在、SpAをベースとするアフィニティー媒体は、おそらく工業用の細胞培養上清を含む様々なサンプルからモノクローナル抗体及びその断片を単離するための最も広く使用されているアフィニティー媒体である。したがって、プロテインA−リガンドを含む様々なマトリックスが、例えば、天然のプロテインA(例えば、Protein ASEPHAROSE商標),GE Healthcare,Uppsala,Sweden)の形態で市販されており、組換えプロテインA(例えば、rProtein A SEPHAROSE(商標),GE Healthcare)から構成されるものもある。より具体的には、市販の組換えプロテインA製品で行われる遺伝子操作は、支持体へのその付着を容易にするためのものである。

0005

これらの用途では、他のアフィニティークロマトグラフィー用途のように、混入物質の確実な除去に総合的な配慮が必要とされる。例えば、このような混入物質は、クロマトグラフィー法において固定相又はマトリックスに吸着される非溶出分子、例えばタンパク質、炭水化物、脂質、細菌及びウイルスを含む望ましくない生体分子又は微生物であり得る。後の使用の前にマトリックスを再生するために、マトリックスからのこのような混入物質の除去は、通常、所望の産物が最初に溶出した後に行われる。このような除去は、通常、混入物質を固定相から溶出することができる薬剤を使用するクリーンインプレイスCIP)として公知の手法を用いる。多くの場合に使用されるこのようなクラスの薬剤の1つは、固定相を通過するアルカリ性溶液である。現在最も広く使用されているクリーニング及び消毒薬剤はNaOHであり、その濃度は混入の程度及び性質に応じて、0.1M〜例えば最大1Mの範囲であり得る。この戦略は、マトリックスを13超のpH値曝露することに関連する。タンパク質性アフィニティーリガンドを含有する多くのアフィニティークロマトグラフィーマトリックスについて、このようなアルカリ性環境は極めて苛酷な条件であるため、関連の高pHに対するリガンドの不安定性を原因とする能力の低下をもたらす。

0006

したがって、広範な研究では、アルカリ性pH値に耐える改善された能力を示す人工タンパク質リガンドの開発に焦点が当てられている。例えば、Gulichら(Susanne Gulich,Martin Linhult,Per−Ake Nygren,Mathias Uhlen,Sophia Hober,Journal of Biotechnology 80(2000),169−178)は、連鎖球菌アルブミン結合性ドメイン(ABD)のアルカリ性環境における安定性を改善するためにタンパク質工学を提案している。Gulichらは、4つのアスパラギン残基すべてがロイシン(1つの残基)、アスパラギン酸(2つの残基)及びリジン(1つの残基)により置換されたABDの突然変異体を作り出した。さらに、Gulichらは、彼らの突然変異体が、天然のタンパク質のものと類似の標的タンパク質結合挙動を示すこと、人工リガンドを含有するアフィニティーカラムが、アルカリ性条件に繰り返し曝露した後に、親の非人工リガンドを使用して調製したカラムよりも高い結合能を示すことを報告している。したがって、そこでは、構造及び機能に対するいかなる重大な影響も及ぼさずに、4つのアスパラギン残基すべてを置換することができると結論されている。

0007

最近の研究は、プロテインA(SpA)を変化させて同様の特性をもたらし得ることを示している。米国特許出願公開第2005/0143566号では、1以上のアスパラギン残基がグルタミン及びアスパラギン酸以外のアミノ酸に突然変異すると、突然変異は、最大約13〜14のpH値において、親SpA(例えば、SpAのBドメイン、又はSpAのBドメイン由来の合成構築物であるプロテインZ(米国特許第5,143,844号))と比較して増加した化学安定性を付与することが開示されている。著者らは、これらの突然変異タンパク質をアフィニティーリガンドとして使用すると、その分離媒体は、予想通り、アルカリ性薬剤を使用するクリーニング手順により耐性良好であり得ることを示している。国際公開第2008/039141号、特開2006304633号、欧州特許第1992692号、欧州特許第2202310号、国際公開第2010/110288号、国際公開第2012/086660号及び国際公開第2012/083425号では、アルカリ安定性を高めることを目的とするプロテインAドメインのさらなる突然変異も公表されている。しかしながら、現在利用可能な突然変異は依然として、アルカリ性pHに対して感受性であり、クリーニング中のNaOH濃度は通常、0.1Mに制限されている(これは、完全なクリーニングを達成することが困難であることを意味する)。クリーニングを改善するより高いNaOH濃度は、許容され得ない能力喪失につながる。

0008

したがって、この分野では、アルカリクリーニング手順に関して、さらに改善された安定性を有するタンパク質リガンドを含有する分離マトリックスを得る必要性が依然として存在する。

先行技術

0009

米国特許出願公開第20130046056号

0010

本発明の一態様は、アルカリ安定性が向上したポリペプチドを提供することである。これは、請求項1に記載されているポリペプチドを用いて達成される。

0011

1つの利点は、アルカリ安定性が親ポリペプチドよりも改善されることである。さらなる利点は、免疫グロブリン及び他のFc含有タンパク質に対する高選択的結合である。

0012

本発明の第2の態様は、アルカリ安定性が向上した多量体であって、複数のポリペプチドを含む多量体を提供することである。これは、特許請求の範囲に記載されている多量体を用いて達成される。

0013

本発明の第3の態様は、アルカリ安定性が向上したポリペプチド又は多量体をコードする核酸又はベクターを提供することである。これは、特許請求の範囲に記載されている核酸又はベクターを用いて達成される。

0014

本発明の第4の態様は、アルカリ安定性が向上したポリペプチド又は多量体を発現することができる発現系を提供することである。これは、特許請求の範囲に記載されている発現系を用いて達成される。

0015

本発明の第5の態様は、免疫グロブリン及び他のFc含有タンパク質に選択的に結合することができる分離マトリックスであって、改善されたアルカリ安定性を示すことができる分離マトリックスを提供することである。これは、特許請求の範囲に記載されている分離マトリックスを用いて達成される。

0016

本発明の第6の態様は、免疫グロブリン又は他のFc含有タンパク質を単離する効率的かつ経済的な方法を提供することである。これは、特許請求の範囲に記載されている方法を用いて達成される。

0017

本発明のさらなる適切な実施形態は、従属請求項に記載されている。

0018

定義
用語「抗体」及び「免疫グロブリン」は、本明細書では互換的に使用され、抗体の断片、抗体又は抗体断片を含む融合タンパク質、及び抗体又は抗体断片を含むコンジュゲートを含むと理解される。

0019

用語「Fc結合ポリペプチド」及び「Fc結合タンパク質」はそれぞれ、抗体の結晶化可能部分(Fc)に結合することができるポリペプチド又はタンパク質を意味し、例えば、プロテインA及びプロテインG、又は結合特性が維持されているそれらの任意の断片もしくは融合タンパク質を含む。

図面の簡単な説明

0020

SPRバイオセンサチップカップリングした突然変異及び非突然変異単量体Zvar(配列番号4)ポリペプチド変異体のアルカリ安定性に関する実施例1の結果を示す。

0021

一態様では、本発明は、配列番号1もしくは配列番号2によって特定されるブドウ球菌プロテインA(SpA)のBもしくはCドメインの、又は配列番号3もしくは配列番号4によって特定されるプロテインZの突然変異体を含むか、又はこれらから本質的になるポリペプチドであって、少なくとも15位のグルタミン酸残基が、アスパラギン及びグルタミン以外のアミノ酸に突然変異しているポリペプチドを開示する。配列番号4は、突然変異N3A、N6D、N23Tを有するプロテインZの変異体を表す。これらのドメインにおけるE15の突然変異は、免疫グロブリン結合特性を損なわずに、親ドメイン/ポリペプチドと比較して改善されたアルカリ安定性を付与する。したがって、ポリペプチドは、Fc結合ポリペプチド又は免疫グロブリン結合ポリペプチドとも記載され得る。

0022

配列番号1(SpA Bドメイン)
ADNKFNKEQQ NAFEILHLPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK
配列番号2(SpA Cドメイン)
ADNKFNKEQQ NAFYEILHLP NLTEEQRNGF IQSLKDDPSVSKEILAEAKK LNDAQAPK
配列番号3(プロテインZ)
VDNKFNKEQQ NAFYEILHLP NLNEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK
配列番号4(Zvar)
VDAKFDKEQQ NAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK
特定の実施形態では、少なくとも15位のグルタミン酸残基は、アスパラギン、プロリン及びシステイン以外のアミノ酸に突然変異している。特定の実施形態では、15位のグルタミン酸残基は、リジンに突然変異している。これの予想外の利点は、アルカリ安定性が改善されることである。E15突然変異(例えば、E15K突然変異)は唯一の突然変異であり得るか、又はポリペプチドは、例えば、位置N3、N6、Q9、Q10、H18、N21、N23、N28、G/A29、D36、Q/V40、A/K42、N/E43、L/I44、E47、Q55及びP57の少なくとも1つにおいて、さらなる突然変異も含み得る。これらの位置の1つ以上において、元のアミノ酸残基は、例えば、アスパラギン、プロリン及びシステインではないアミノ酸で置換され得る。元のアミノ酸残基は、例えば、アラニンバリントレオニンセリン、リジン又はアスパラギン酸で置換され得る。

0023

いくつかの実施形態では、23位のアミノ酸残基は、トレオニン又はアラニンである。

0024

特定の実施形態では、3位のアミノ酸残基はアラニンであり、及び/又は6位のアミノ酸残基はアスパラギン酸である。特定の実施形態では、3位及び6位のアミノ酸残基の少なくとも1つは、アスパラギンである。

0025

いくつかの実施形態では、33位のセリン残基は、アスパラギン、グルタミン、プロリン及びシステイン以外のアミノ酸に、例えばリジンに突然変異している。代替的な実施形態では、33位のアミノ酸残基は、セリンである。

0026

特定の実施形態では、9位のグルタミン残基は、アスパラギン、グルタミン、プロリン及びシステイン以外のアミノ酸に、例えばアラニンに突然変異している。9位の突然変異は、アルカリ安定性を改善する効果をそれ自体が有するが、アルカリ安定性は、E15突然変異、例えばE15K突然変異によってさらに改善される。

0027

いくつかの実施形態では、10位のグルタミン残基は、アスパラギン、グルタミン、プロリン及びシステイン以外のアミノ酸に、例えばアラニンに突然変異している。代替的な実施形態では、10位のアミノ酸残基は、グルタミンである。

0028

特定の実施形態では、32位のグルタミン残基は、アスパラギン、グルタミン、プロリン及びシステイン以外のアミノ酸に、例えばアラニンに突然変異している。代替的な実施形態では、32位のアミノ酸残基は、グルタミンである。

0029

いくつかの実施形態では、40位のグルタミン残基は、アスパラギン、グルタミン、プロリン及びシステイン以外のアミノ酸に、例えばアラニン又はバリンに突然変異している。代替的な実施形態では、40位のアミノ酸残基は、グルタミンである。

0030

特定の実施形態では、55位のグルタミン残基は、アスパラギン、グルタミン、プロリン及びシステイン以外のアミノ酸に、例えばアラニン、セリン又はグルタミン酸に突然変異している。代替的な実施形態では、55位のアミノ酸残基は、グルタミンである。

0031

いくつかの実施形態では、26位のアミノ酸残基は、グルタミンである。代替的な実施形態では、26位のグルタミンは、アスパラギン、グルタミン、プロリン及びシステイン以外のアミノ酸に突然変異している。

0032

いくつかの実施形態では、47位のグルタミン酸残基は、アスパラギン、グルタミン、プロリン及びシステイン以外のアミノ酸に、例えばアラニン又はトレオニンに突然変異している。代替的な実施形態では、47位のアミノ酸残基は、グルタミン酸である。

0033

特定の実施形態では、21位のアスパラギン残基は、グルタミン、プロリン及びシステイン以外のアミノ酸に、例えばアスパラギン酸に突然変異している。代替的な実施形態では、21位のアミノ酸残基は、アスパラギンである。

0034

特定の実施形態では、36位のアスパラギン酸残基は、グルタミン、プロリン及びシステイン以外のアミノ酸に突然変異している。特定の実施形態では、36位のアスパラギン酸残基は、アラニン又はトレオニンに突然変異している。代替的な実施形態では、36位のアミノ酸は、アスパラギン酸である。

0035

いくつかの実施形態では、突然変異は、Q9A,E15Kである。この突然変異は、特に高いアルカリ安定性を提供する。特定の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号6、配列番号8、配列番号9及び配列番号10並びにさらに配列番号13からなる群から選択される配列を含む。ポリペプチドは、例えば、配列番号6又は8〜10によって定義され得るが、それはまた、さらなるアミノ酸残基をC末端及び/又はN末端に含み得る。

0036

配列番号6 Zvar(Q9A,E15K)
VDAKFDKEAQ NAFYKILHLPNLTEEQRNAFIQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK
配列番号8
VDAKFDKEAQ NAFYKILHLP NLTEEQRNAF IQSLKTDPSVSKNILAAAKK LNDAQAPK
配列番号9
VDNKFNKEAQ NAFYKILHLP NLTEEQRNAF IQSLKTDPSV SKNILAAAKK LNDAQAPK
配列番号10
VDNKFNKEAQ NAFYKILHLP NLTEEQRAAF IQSLKTDPSV SKNILAAAKK LNDAQAPK
配列番号11 Zvar4
AQ VDAKFDKEQQ NAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEQQ NAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEQQ NAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEQQ NAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPKC
配列番号12 Zvar(Q9A)4
AQ VDAKFDKEAQ NAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ NAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ NAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ NAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPKC
配列番号13 Zvar(Q9A,E15K)4
AQ VDAKFDKEAQ NAFYKILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ NAFYKILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ NAFYKILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ NAFYKILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPKC
第2の態様では、本発明は、上記に開示されるいずれかの実施形態によって定義される複数のポリペプチドユニットを含むか、又はこれらから本質的になる、多量体を開示する。多量体は、例えば、二量体三量体四量体五量体又は六量体であり得る。それは、多量体中のすべてのユニットが同一であるホモ多量体であり得るか、又はそれは、1以上のユニットが他のものと異なるヘテロ多量体であり得る。有利には、多量体中のすべてのユニットは、上記に開示される突然変異を含むことなどによって、アルカリ安定性である。ポリペプチドは、ポリペプチドのC末端とN末端との間のペプチド結合によって、直接連結され得る。或いは、多量体中の2つ以上のユニットは、オリゴマー種又はポリマー種を含む要素、例えば最大15アミノ酸又は30アミノ酸、例えば1〜5、1〜10又は5〜10アミノ酸を含む要素によって、連結され得る。好ましくは、このような連結の性質は、タンパク質ユニットの空間的立体構造不安定化すべきではない。これは、例えば、連結におけるプロリンの存在を回避することによって達成され得る。さらに、連結はまた、好ましくは、アルカリ性環境において、突然変異タンパク質ユニットの特性を損なわない程十分に安定であるべきである。このために、連結がアスパラギンを含有しない場合には、有利である。連結がグルタミンを含有しない場合には、さらに有利であり得る。多量体は、クローニングプロセスに由来するか、又は切断されるシグナル配列由来の残基を構成する複数のアミノ酸残基をN末端にさらに含む。さらなるアミノ酸残基の数は、例えば、15以下、例えば10以下又は5以下であり得る。具体的な例として、多量体は、配列番号13のように、AQ配列をN末端に含み得る。

0037

いくつかの実施形態では、上記の開示されるポリペプチド及び/又は多量体は、システイン残基、複数のリジン残基及び複数のヒスチジン残基からなる群から選択される1つ以上のカップリング要素をC末端又はN末端にさらに含む。カップリング要素は、例えば、C末端の単一のシステインであり得る。カップリング要素は、C末端もしくはN末端に直接連結され得るか、又はそれは、最大15アミノ酸、例えば1〜5、1〜10又は5〜10アミノ酸を含むリンカーを介して連結され得る。このストレッチはまた、好ましくは、アルカリ性環境において、突然変異タンパク質の特性を損なわない程十分に安定であるべきである。このために、ストレッチがアスパラギンを含有しない場合には、有利である。ストレッチがグルタミンを含有しない場合には、さらに有利であり得る。C末端システインを有することの利点は、タンパク質の端点のカップリングが、システインチオールと支持体上の求電子基との反応によって達成され得ることである。これは、結合能に重要なカップリングタンパク質の優れた可動性を提供する。

0038

第3の態様では、本発明は、上記に開示されるいずれかの実施形態のポリペプチド又は多量体をコードする核酸を開示する。したがって、本発明は、ポリペプチド又は多量体をコードする本核酸配列のすべての形態、例えばRNA及びDNAを包含する。本発明は、コード配列に加えて、本発明のポリペプチド又は多量体の発現に必要なシグナル配列を含むベクター、例えばプラスミドを包含する。一実施形態では、ベクターは、本発明の多量体をコードする核酸を含み、各ユニットをコードする別個の核酸は、同種DNA配列又は異種DNA配列を有し得る。

0039

第4の態様では、本発明は、上記に開示される核酸又はベクターを含む発現系を開示する。発現系は、例えば、本ポリペプチド又は多量体を発現するように改変されているグラム陽性又はグラム陰性原核生物宿主細胞系、例えばE.coli種又はBacillus種であり得る。代替的な実施形態では、発現系は、真核生物宿主細胞系、例えば酵母、例えばPichea pastoris又はSaccharomyces cerevisiaeである。

0040

第5の態様では、本発明は、上記に開示されるいずれかの実施形態の複数のポリペプチド又は多量体が固体支持体にカップリングされている分離マトリックスを開示する。このようなマトリックスは、免疫グロブリン又は他のFc含有タンパク質の分離に有用であり、ポリペプチド/多量体の改善されたアルカリ安定性により、マトリックスは、クリーニング中の高アルカリ条件(これは、バイオプロセス分離の状況において、長期の反復使用に必須である)に耐えるであろう。

0041

業者であれば理解するように、発現されたポリペプチド又は多量体を、支持体に固定化する前に適切な程度に精製されなければならない。このような精製方法当技術分野で周知であり、支持体へのタンパク質系リガンドの固定化は、標準的な方法を使用して容易に行われる。適切な方法及び支持体を以下でより詳細に議論する。

0042

本発明のマトリックスの固体支持体は、任意の適切な周知の種類のものであり得る。従来のアフィニティー分離マトリックスは、多くの場合、有機性であり、使用する水性媒体親水性表面が露出する(すなわち、ヒドロキシ(−OH)、カルボキシ(−COOH)、カルボキサミド(−CONH2、おそらくN−置換形態)、アミノ(−NH2、おそらく置換形態)、オリゴ−もしくはポリエチレンオキシ基をその外部表面上に、及び存在する場合にはその内部表面上に露出する)ポリマーをベースとするものである。固体支持体は、適切には、多孔質であり得る。多孔性は、例えば、Gel Filtration Principles and Methods,Pharmacia LKBBiotechnology 1991,pp6−13に記載されている方法にしたがって、逆サイズ排除クロマトグラフィーによって測定されるKav値又はKd値(利用可能な細孔容積と、特定サイズプローブ分子との割合)と表され得る。定義では、Kd値及びKav値は両方とも常に、0〜1の範囲内にある。プローブ分子として分子量(Mw)110kDaのデキストランを用いて測定する場合、Kav値は、有利には、0.6〜0.95、例えば0.7〜0.90又は0.6〜0.8であり得る。この利点は、本発明のポリペプチド/多量体、及びポリペプチド/多量体に結合する免疫グロブリンの両方に適合可能な多数の細孔であって、結合部位への及び結合部位からの免疫グロブリンの大量輸送を提供可能な多数の細孔を支持体が有することである。

0043

ポリペプチド又は多量体は、例えば、リガンドに存在するチオール、アミノ及び/又はカルボキシ基を利用する従来のカップリング技術によって支持体に結合され得る。ビスエポキシドエピクロロヒドリン、CNBr、N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)などは、周知のカップリング試薬である。支持体とポリペプチド/多量体との間に、ポリペプチド/多量体のアベイラビリティを改善し、支持体へのポリペプチド/多量体の化学的カップリングを容易にする分子(スペーサーとして公知である)を導入し得る。或いは、ポリペプチド/多量体は、物理的吸着又は生物特異的な吸着などの非共有結合によって支持体に結合され得る。

0044

いくつかの実施形態では、マトリックスは、支持体にカップリングされた5〜20、例えば5〜15mg/ml、5〜11mg/ml又は6〜11mg/mlのポリペプチド/多量体を含む。カップリングされるポリペプチド/多量体の量は、カップリングプロセスに使用されるポリペプチド/多量体の濃度、使用されるカップリング条件及び/又は使用される支持体の細孔構造によって制御され得る。原則として、マトリックスの絶対的な結合能は、少なくとも、カップリングされたポリペプチド/多量体によって細孔が著しく狭窄されるようになる時点までは、カップリングされるポリペプチド/多量体の量と共に増加する。高いカップリングレベルでは、カップリングされるポリペプチド/多量体1mg当たりの相対結合能は低下し、上記範囲内で最適な費用便益となる。

0045

特定の実施形態では、ポリペプチド又は多量体は、チオエーテル結合を介して支持体にカップリングされる。このようなカップリングを実施する方法は当技術分野で周知であり、標準的な技術及び装置を使用して当業者により容易に実施される。チオエーテル結合は柔軟かつ安定であり、アフィニティークロマトグラフィーにおける使用に一般に適切である。特に、チオエーテル結合が、ポリペプチド又は多量体の末端又は末端付近のシステイン残基を介したものである場合、カップリングされるポリペプチド/多量体の移動度が増強されて、改善された結合能及び結合速度が提供される。いくつかの実施形態では、ポリペプチド/多量体は、上記のようにタンパク質上に存在するC末端のシステインを介してカップリングされる。これにより、システインチオールと、支持体上の求電子基(例えば、エポキシド基ハロヒドリン基など)との効率的なカップリングが可能となり、チオエーテル架橋結合が生じる。

0046

特定の実施形態では、支持体は、多糖などのポリヒドロキシポリマーを含む。多糖の例としては、例えばデキストラン、デンプンセルロースプルラン寒天アガロースなどが挙げられる。多糖は本来的に親水性であり、非特異的な相互作用の程度が低く、高含量の反応性活性化可能な)ヒドロキシル基を提供し、バイオプロセシングで使用されるアルカリ性クリーニング溶液に対して一般に安定である。

0047

いくつかの実施形態では、支持体は、寒天又はアガロースを含む。本発明で使用される支持体は、逆懸濁ゲル化(S Hjerten:Biochim Biophys Acta 79(2),393−398(1964))などの標準的な方法にしたがって容易に調製され得る。或いは、ベースマトリックスは、SEPHAROSE(商標)FF(GE Healthcare)などの市販の製品である。大規模な分離に特に有利な一実施形態では、支持体は、米国特許第6602990号又は米国特許第7396467号(これらは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる)に記載されている方法を使用してその剛性を増加するように適合されているので、マトリックスは、高流速により適切になる。

0048

特定の実施形態では、多糖又はアガロース支持体などの支持体は、例えばヒドロキシアルキルエーテル架橋により架橋されている。このような架橋を生成する架橋剤試薬は、例えばエピクロロヒドリンのようなエピハロヒドリンブタンジオールジグリシジルエーテルのようなジエポキシドアリルハライド又はアリルグリシジルエーテルのようなアリル化試薬であり得る。架橋は、支持体の剛性に有益であり、化学的安定性を改善する。ヒドロキシアルキルエーテル架橋は、アルカリ安定性であり、有意な非特異的吸着を生じない。

0049

或いは、固体支持体は、合成ポリマー、例えばポリビニルアルコールポリヒドロキシアルキルアクリレート、ポリヒドロキシアルキルメタクリレートポリアクリルアミドポリメタクリルアミドなどをベースとする。ジビニル置換ベンゼン及びモノビニル置換ベンゼンをベースとするマトリックスなどの疎水性ポリマーの場合、マトリックスの表面は、上記に定義される親水性基を周囲の水性液体に露出するように親水化されることが多い。このようなポリマーは、標準的な方法にしたがって容易に生産される。例えば、「Styrene based polymer supports developed by suspension polymerization」(R Arshady:Chimica e L’Industria 70(9),70−75(1988))を参照のこと。或いは、SOURCE(商標)(GE Healthcare)などの市販の製品が使用される。別の代替方法では、本発明の固体支持体は、支持体、例えばシリカ酸化ジルコニウムなどを含む。

0050

さらに別の実施形態では、固体支持体は、表面、チップ、毛細管又はフィルター(例えば、膜又はデプスフィルタマトリックス)などの別の形態である。

0051

本発明のマトリックスの形状に関して、一実施形態では、マトリックスは、多孔質モノリスの形態である。代替的な実施形態では、マトリックスは、多孔質又は非多孔質であり得るビーズ形態又は粒子形態である。ビーズ形態又は粒子形態のマトリックスは、充填層として、又は懸濁形態で使用され得る。懸濁形態としては、粒子又はビーズが自由に移動する膨張床及び純粋な懸濁液として公知のものが挙げられる。モノリス、充填層及び膨張床の場合、分離手順は、一般に、濃度勾配を有する従来のクロマトグラフィーに従う。純粋な懸濁液の場合、バッチ式モードが使用される。

0052

第6の態様では、本発明は、免疫グロブリンを単離する方法であって、上記に開示される分離マトリックスを使用する方法を開示する。

0053

特定の実施形態では、本方法は、
a)免疫グロブリンを含む液体サンプルを、上記に開示される分離マトリックスと接触させる工程、
b)洗浄液で分離マトリックスを洗浄する工程、
c)溶出液を用いて、分離マトリックスから免疫グロブリンを溶出する工程、及び
d)クリーニング液で分離マトリックスをクリーニングする工程
を含む。

0054

本方法はまた、工程a)の前に、上記に開示される実施形態のいずれかのアフィニティー分離マトリックスを提供する工程、並びに免疫グロブリン及び1以上の他の物質を含む溶液を液体サンプルとして提供する工程を含み得、工程c)の後に、溶出液を回収する工程、及び場合により溶出液を、例えば陰イオン交換クロマトグラフィーもしくは陽イオン交換クロマトグラフィーマルチモーダルクロマトグラフィー及び/又は疎水性相互作用クロマトグラフィーによるさらなる分離工程に供する工程を含み得る。液体サンプル、洗浄液及び溶出液の適切な組成、並びに分離を実施するための一般的な条件は、アフィニティークロマトグラフィーの技術分野、特にプロテインAクロマトグラフィーの技術分野で周知である。Fc含有タンパク質及び1以上の他の物質を含む液体サンプルは、宿主細胞タンパク質(HCP)、例えばCHO細胞又はE Coliタンパク質を含み得る。便利なことに、CHO細胞及びE Coliタンパク質の内容物は、これらのタンパク質に対するイムノアッセイ、例えばCygnus TechnologiesのCHO HCP又はE Coli HCPELISAキットによって決定され得る。工程b)において、宿主細胞タンパク質又はCHO細胞/E Coliタンパク質を脱着し得る。

0055

溶出は、プロテインA媒体からの溶出に使用される任意の適切な溶液を使用することによって実施され得る。これは、例えば、pH5以下、例えばpH2.5〜5又は3〜5の溶液又は緩衝液であり得る。いくつかの場合では、それは、pH11以上、例えばpH11〜14又はpH11〜13の溶液又は緩衝液であり得る。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液又は溶出緩衝液勾配は、1以上の一官能性カルボン酸二官能性カルボン酸もしくは三官能性カルボン酸又はこのようなカルボン酸の塩を含む。特定の実施形態では、溶出緩衝液又は溶出緩衝液勾配は、酢酸塩クエン酸塩グリシンコハク酸塩リン酸塩及びギ酸塩からなる群から選択される1以上の陰イオン種を含む。

0056

いくつかの実施形態では、クリーニング液は、アルカリ性であり、例えば13〜14のpHを有する。このような溶液は、特に間隔の上限において、マトリックスの効率的なクリーニングを提供する。

0057

特定の実施形態では、クリーニング液は、0.1〜2.0M NaOH又はKOH、例えば0.5〜2.0又は0.5〜1.0M NaOH又はKOHを含む。

0058

いくつかの実施形態では、工程a)〜d)を少なくとも10回、例えば少なくとも50回又は50〜200回繰り返す。

0059

タンパク質の突然変異誘発
アスパラギン置換体をコードするオリゴヌクレオチドを使用してツーステップPCRにより、部位特異的突然変異誘発を行った。鋳型として、Z又はCのいずれかの単一ドメインを含有するプラスミドを使用した。PCR断片をE.coli発現ベクター(pGO)にライゲーションした。DNA配列決定を使用して、挿入された断片の正しい配列を確認した。

0060

突然変異体の多量体を形成するために、C又はZドメインの開始コドンGTA GAC)(アミノ酸VDに対応する)内に位置するAccI部位を使用した。単量体ドメイン用のpGOをAccIで消化し、CIP処理した。各変異体に特異的なAccI粘着末端プライマーを設計し、2つのオーバーラップPCR産物を各鋳型から作製した。PCR産物を精製し、2%アガロースゲル上のPCR産物を比較することによって、濃度を評価した。連結緩衝液中で、等量の対合PCR産物をハイブリダイズさせた(45分で90℃→25℃)。得られた産物は、AccI部位(正しいPCR断片及び/又は消化ベクター)にライゲーションされる可能性が高い断片の約1/4からなる。ライゲーション及び形質転換の後、コロニーをPCRスクリーニングして、所望の突然変異体を含有する構築物を同定した。DNA配列決定によって、陽性クローンを確認した。

0061

構築物の発現及び精製
標準培地中、E.coli K12の発酵により、構築物を細菌のペリプラズム内で発現させた。発酵後、細胞を熱処理して、ペリプラズム内容物を培地中に放出させた。0.2μmの細孔径を有する膜を用いて精密ろ過により、培地中に放出された構築物を回収した。

0062

アフィニティーにより、各構築物(この時点では、ろ過工程からの透過液である)を精製した。この透過液を、固定化IgGを含有するクロマトグラフィー媒体にロードした。ロードした産物をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、pHを低下させることによって溶出した。

0063

溶出プール中性のpHに調整し、ジチオトレイトールの追加により還元した。次いで、サンプルを陰イオン交換体にロードした。洗浄工程後、構築物をNaCl勾配で溶出して、混入物質からそれを分離した。限外ろ過によって、溶出プールを40〜50mg/mlに濃縮した。

0064

LC−MSで精製リガンドを分析して純度を決定し、分子量が(アミノ酸配列に基づいて)予想されたものに対応することを確認した。

0065

表1に記載されている精製単量体リガンドをBiacore CM5センサーチップ(GE Healthcare,Sweden)上に十分な量で固定化して、Biacore機器(GE Healthcare,Sweden)で約1000RUのシグナル強度を得た。固定化表面のIgG結合能を把握するために、1mg/mlのhIgG(上記Gammanorm)をチップ上に流し、シグナル強度を記録した。次いで、表面をクリーンインプレイス(CIP)した(すなわち、500mM NaOHによって室温(22+/−2℃)で10分間洗い流した)。これを96サイクル繰り返し、固定化リガンドのアルカリ安定性を、各サイクル後のIgG結合能(シグナル強度)の相対喪失として把握した。結果は、図1及び表1に示されており、少なくともリガンドZvar(Q9A,E15K)1が、親構造Zvar1と比較して改善されたアルカリ安定性を有し、さらにZvar(Q9A)1リガンドと比較して改善された安定性を有することを示している。

0066

0067

下記方法を使用して、表2の精製四量体リガンド(すべてが、さらなるN末端システインを有する)をアガロースビーズ上に固定化し、能力及び安定性について評価した。

0068

活性化
使用したベースマトリックスは、平均直径85マイクロメートル容積重量)の堅く架橋されたアガロースビーズであり、米国特許第6602990号の方法にしたがって調製し、Gel Filtration Principles and Methods,Pharmacia LKBBiotechnology 1991,pp6−13に記載されている方法にしたがって、分子量(Mw)110kDaのデキストランについて0.70の逆ゲルろ過クロマトグラフィーKav値に相当する細孔径を有する。

0069

100mLフラスコ中で、25mL(g)のドレインしたベースマトリックス、10.0mLの蒸留水及び2.02gのNaOH(s)を、機械的に撹拌しながら25℃で10分間混合した。4.0mLのエピクロロヒドリンを追加し、反応を2時間進行させた。10ゲル堆積容量(GV)の水で活性化ゲルを洗浄した。

0070

カップリング
50ml Falconチューブ中の20mLのリガンド溶液(50mg/mL)に、169mgのNaHCO3、21mgのNa2CO3、175mgのNaCl及び7mgのEDTAを追加した。Falconチューブをローラーテーブル上に5〜10分間置き、次いで、77mgのDTEを追加した。還元を45分間超行った。次いで、Sephadex G−25を充填したPD10カラムで、リガンド溶液を脱塩した。276nmのUV吸収を測定することによって、脱塩溶液中のリガンド含量を決定した。

0071

3〜5GVの{0.1Mリン酸塩/1mMEDTApH8.6}で活性化ゲルを洗浄し、次いで、米国特許第6399750号に記載されている方法にしたがって、リガンドをカップリングした。実験で使用したすべての緩衝液を、窒素ガスによって少なくとも5〜10分間脱気した。リガンド溶液の濃度を変化させることによって、ゲルのリガンド含量を制御することができる。

0072

固定化後、3×GVの蒸留水でゲルを洗浄した。ゲル+1GV{0.1Mリン酸塩/1mMEDTA/10%チオグリセロールpH8.6}を混合し、チューブを振盪台に室温で一晩放置した。次いで、3×GVの{0.1M TRIS/0.15M NaCl pH8.6}及び0.5MHAcで、次いで8〜10×GVの蒸留水で、ゲルを交互に洗浄した。アミノ酸分析のために、ゲルサンプルを外部の試験所送付し、リガンド含量(mg/mlゲル)を総アミノ酸含量から計算した。

0073

2mlの樹脂TRICORN(商標)5100カラムに充填した。

0074

タンパク質
平衡化緩衝液で1mg/mlに希釈したGammanorm 165mg/ml(Octapharma)。

0075

平衡化緩衝液
APリン酸緩衝液20mM+0.15M NaCl、pH7.4(Elsichrom AB)。

0076

吸着緩衝液
APBリン酸緩衝液20mM+0.15M NaCl、pH7.4(Elsichrom AB)。

0077

溶出緩衝液
クエン酸緩衝液0.1M、pH6
クエン酸緩衝液0.1M、pH3。

0078

CIP
0.5M NaOH。

0079

滞留時間2.4分において、AKTAExplorer 10システムを用いて、貫流容量を決定した。安定ベースラインが得られるまで、平衡緩衝液バイパスカラムに流した。自動ゼロ化の前に、これを行った。100%UVシグナルが得られるまで、サンプルをカラムに添加した。次いで、安定ベースラインが得られるまで、平衡緩衝液を添加した。

0080

最大吸光度の85%のUVシグナルが達成されるまで、サンプルをカラムにロードした。次いで、流速0.5ml/分で、最大吸光度の20%のUVシグナルまで、カラムを平衡緩衝液で洗浄した。流速0.5ml/分で、pH6.0から開始してpH3.0で終了する10カラム容量の直線勾配で、タンパク質を溶出した。次いで、流速0.5ml/分の0.1M NaOHでカラムをクリーニングし、平衡緩衝液で再平衡化してから、20%エタノールでクリーニングした。この最終工程は、100%UVシグナルが得られるまでサンプルをバイパスカラムにロードすることにより、サンプル濃度チェックするためのものであった。

0081

10%における貫流容量の計算では、以下の式を使用した。それは、カラム流出液中のIgG濃度が供給液中のIgG濃度の10%になるまでカラムにロードされるIgGの量である。

0082

A100%=100%UVシグナル、
Asub=非結合性IgGサブクラスによる吸光度寄与、
A(V)=所定の添加量における吸光度、
Vc=カラム容量、
Vapp=10%貫流までに添加した量、
Vsys=システムのデッドボリューム
C0=供給液濃度。

0083

10%貫流における動的結合容量(DBC)を計算し、曲線外観を検討した。結合、溶出及びCIPピークに関しても、曲線を検討した。10及び80%貫流について、動的結合容量(DBC)を計算した。

0084

アルカリ性クリーニング溶液に繰り返し曝露する前後に、10%貫流DBC(Qb10)を決定した。各サイクルには、0.5M NaOHをカラムに速度5マイクロリットル/分でポンピングして、1サイクル当たり10分間の曝露時間をもたらすCIP工程が含まれていた。曝露を室温(22±2℃)で行った。表2は、100サイクル後の残存容量(すなわち、(0.5M NaOHに対する1000分間の累積曝露時間)を、絶対数及び初期容量に対する相対数の両方で示す。

実施例

0085

本発明(最良の形態を含む)を開示するために、そしてさらに、当業者が本発明を実施すること(任意のデバイス又はシステムを作製及び使用すること、並びに組み込まれている任意の方法を実施することを含む)ができるように、本明細書では実施例を使用している。本発明の特許可能な範囲は特許請求の範囲によって規定され、当業者が想到する他の例を含み得る。このような他の例は、特許請求の範囲の文言相違しない構成要素を有する場合、又は特許請求の範囲の文言と実質的な相違を有する均等な構成要素を含む場合には、特許請求の範囲の範囲内にあるものである。

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    【課題・解決手段】[課題]本発明は、抗体に標識物質を結合させている標識化抗体を測定に用いる際に、標識化抗体が好適に分散している標識化抗体分散液、およびSPFS用キットを提供することを課題とする。[解決... 詳細

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