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技術 Chi92タンパク質の新たな用途及びChi92タンパク質発現菌株

出願人 フィードリサーチインスティチュートチャイニーズアカデミーオブアグリカルチュアルサイエンシィズ
発明者 チョウ・ヂーガンフォ・フェンミンヤン・ヤーリンシュ・リーホー・スーシュチャン・メイチャオリ・チンユー・チャン
出願日 2014年6月18日 (5年8ヶ月経過) 出願番号 2016-522191
公開日 2016年8月8日 (3年6ヶ月経過) 公開番号 2016-523090
状態 不明
技術分野
  • -
主要キーワード 二重スロット ステップ一 検出解像度 還元糖含有量 時間水浴 エビ殻 甲殻類動物 脱塩反応
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2016年8月8日)のものです。
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図面 (12)

課題・解決手段

本発明はChi92タンパク質の新たな用途及びChi92タンパク質発現菌株を開示する。本発明が提供するピキアパストリス(Pichia pastoris)pPIC9/Chi92は、寄託番号がCGMCC No.7634である。本発明は前記ピキアパストリスpPIC9/Chi92の発酵産物、前記発酵産物のキチナーゼの製造での応用、キチナーゼとしての応用、キチン類基質の分解での応用を更に開示する。本発明はChi92タンパク質のキチナーゼの製造での応用、キチナーゼとしての応用、キチン類基質の分解での応用を更に開示する。

概要

背景

キチン(Chitin)は甲殻素、甲殻質とも言われ、その基本的な構成単位アセチルグルコサミンである。アセチルグルコサミンは直鎖ポリマーであり、その構造はセルロースに類似するが、ただしC2ヒドロキシがN−アセトアミノ置換されている。キチンの主な由来海洋甲殻類動物、例えばエビ、蟹等であり、海洋環境における最も重要な栄養源エネルギーであるとともに、中国の近海域の主な有機汚染源の1つである。キチンは自然界に広く分布されており、世界では含有量がわずかにセルロースに次ぐバイオポリマーであり、1年当たりの生合成量が100億トンにも達する。キチンは分子量が大きく、構造が緊密で、水と一般的な溶剤に溶解しないため、その応用は大幅に制限されているので、生産上には、キチンを水溶性の良いキチンオリゴ糖等のキトオリゴ糖に分解する必要がある。

キチナーゼ(EC.3.2.14)はキチンを特異性加水分解するタンパク質であり、キチンのβ−1,4グリコシド結合を加水分解し、キチンオリゴ糖、例えばGlc(NAG)2、Glc(NAG)3、Glc(NAG)4、Glc(NAG)5、及びGlc(NAG)6を生成し、最終的にN−アセチルグルコサミン(GlcNAc)に分解することができる。

概要

本発明はChi92タンパク質の新たな用途及びChi92タンパク質発現菌株を開示する。本発明が提供するピキアパストリス(Pichia pastoris)pPIC9/Chi92は、寄託番号がCGMCC No.7634である。本発明は前記ピキアパストリスpPIC9/Chi92の発酵産物、前記発酵産物のキチナーゼの製造での応用、キチナーゼとしての応用、キチン類基質の分解での応用を更に開示する。本発明はChi92タンパク質のキチナーゼの製造での応用、キチナーゼとしての応用、キチン類基質の分解での応用を更に開示する。なし

目的

本発明は、Chi92タンパク質の新たな用途及びChi92タンパク質発現菌株を提供する

効果

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請求項1

寄託番号がCGMCCNo.7634であるピキアパストリス(Pichiapastoris)pPIC9/Chi92。

請求項2

Chi92タンパク質は、配列表における配列番号1に示すアミノ酸配列からなるタンパク質(a)、又は配列表における配列番号1に示すアミノ酸配列に1つ又は複数のアミノ酸残基置換及び/又は欠失及び/又は付加するとともにキチナーゼ活性を有する、配列番号1から誘導したタンパク質(b)である請求項1に記載の菌株のChi92タンパク質の生産での応用。

請求項3

請求項1に記載の菌株の発酵産物

請求項4

請求項3に記載の発酵産物のキチナーゼの製造での応用。

請求項5

請求項3に記載の発酵産物のキチナーゼとしての応用。

請求項6

キチン類基質コロイドキチン、β−グルカンカルボキシメチルセルロースキトサンエビ殻粉末、蟹殻粉末、キチン、グリコールキチン、及び熱不活化酵母粉末のうちの少なくとも1種である請求項3に記載の発酵産物のキチン類基質の分解での応用。

請求項7

Chi92タンパク質は、配列表における配列番号1に示すアミノ酸配列からなるタンパク質(a)、又は配列表における配列番号1に示すアミノ酸配列に1つ又は複数のアミノ酸残基で置換及び/又は欠失及び/又は付加するとともにキチナーゼ活性を有する、配列番号1から誘導したタンパク質(b)であるChi92タンパク質のキチナーゼの製造での応用。

請求項8

Chi92タンパク質は、配列表における配列番号1に示すアミノ酸配列からなるタンパク質(a)、又は配列表における配列番号1に示すアミノ酸配列に1つ又は複数のアミノ酸残基で置換及び/又は欠失及び/又は付加するとともにキチナーゼ活性を有する、配列番号1から誘導したタンパク質(b)であるChi92タンパク質のキチナーゼとしての応用。

請求項9

キチン類基質はコロイドキチン、β−グルカン、カルボキシメチルセルロース、キトサン、エビ殻粉末、蟹殻粉末、キチン、グリコールキチン及び熱不活化酵母粉末のうちの少なくとも1種であり、Chi92タンパク質は、配列表における配列番号1に示すアミノ酸配列からなるタンパク質(a)、又は配列表における配列番号1に示すアミノ酸配列に1つ又は複数のアミノ酸残基で置換及び/又は欠失及び/又は付加するとともにキチナーゼ活性を有する、配列番号1から誘導したタンパク質(b)であるChi92タンパク質のキチン類基質の分解での応用。

請求項10

Chi92タンパク質は、配列表における配列番号1に示すアミノ酸配列からなるタンパク質(a)、又は配列表における配列番号1に示すアミノ酸配列に1つ又は複数のアミノ酸残基で置換及び/又は欠失及び/又は付加するとともにキチナーゼ活性を有する、配列番号1から誘導したタンパク質(b)であるChi92タンパク質の飼料添加剤としての応用。

請求項11

Chi92タンパク質は、配列表における配列番号1に示すアミノ酸配列からなるタンパク質(a)、又は配列表における配列番号1に示すアミノ酸配列に1つ又は複数のアミノ酸残基で置換及び/又は欠失及び/又は付加するとともにキチナーゼ活性を有する、配列番号1から誘導したタンパク質(b)であるChi92タンパク質の飼料の調製での応用。

請求項12

活性成分がChi92タンパク質であり、Chi92タンパク質は、配列表における配列番号1に示すアミノ酸配列からなるタンパク質(a)、又は配列表における配列番号1に示すアミノ酸配列に1つ又は複数のアミノ酸残基で置換及び/又は欠失及び/又は付加するとともにキチナーゼ活性を有する、配列番号1から誘導したタンパク質(b)である飼料添加剤。

技術分野

0001

本発明はChi92タンパク質の新たな用途及びChi92タンパク質発現菌株に関する。

背景技術

0002

キチン(Chitin)は甲殻素、甲殻質とも言われ、その基本的な構成単位アセチルグルコサミンである。アセチルグルコサミンは直鎖ポリマーであり、その構造はセルロースに類似するが、ただしC2ヒドロキシがN−アセトアミノ置換されている。キチンの主な由来海洋甲殻類動物、例えばエビ、蟹等であり、海洋環境における最も重要な栄養源エネルギーであるとともに、中国の近海域の主な有機汚染源の1つである。キチンは自然界に広く分布されており、世界では含有量がわずかにセルロースに次ぐバイオポリマーであり、1年当たりの生合成量が100億トンにも達する。キチンは分子量が大きく、構造が緊密で、水と一般的な溶剤に溶解しないため、その応用は大幅に制限されているので、生産上には、キチンを水溶性の良いキチンオリゴ糖等のキトオリゴ糖に分解する必要がある。

0003

キチナーゼ(EC.3.2.14)はキチンを特異性加水分解するタンパク質であり、キチンのβ−1,4グリコシド結合を加水分解し、キチンオリゴ糖、例えばGlc(NAG)2、Glc(NAG)3、Glc(NAG)4、Glc(NAG)5、及びGlc(NAG)6を生成し、最終的にN−アセチルグルコサミン(GlcNAc)に分解することができる。

0004

本発明は、Chi92タンパク質の新たな用途及びChi92タンパク質発現菌株を提供することを目的とする。

0005

本発明が提供するピキアパストリス(Pichia pastoris)pPIC9/Chi92は、既に2013年5月23日に中国微生物菌株寄託管理委員会の一般微生物センタ略称CGMCC、住所京市陽区北辰西路1号院3号)に寄託され、寄託番号がCGMCC No.7634である。

0006

本発明は更にピキアパストリスpPIC9/Chi92のChi92タンパク質の生産での応用を保護する。前記Chi92タンパク質は、配列表における配列番号1に示すアミノ酸配列からなるタンパク質(a)、又は配列表における配列番号1に示すアミノ酸配列に1つ又は複数のアミノ酸残基で置換及び/又は欠失及び/又は付加するとともにキチナーゼ活性を有する、配列番号1から誘導したタンパク質(b)である。前記ピキアパストリスpPIC9/Chi92を応用して前記Chi92タンパク質を生産する方法は、前記菌株をBMMY液体培地接種し、30℃、250−280rpmで48時間発振培養し、培養システムにおけるメタノール濃度が0.5%(体積比)に達するまで、12時間ごとにメタノールを加え、遠心して上澄み液収集することである。前記方法は、前記上澄み液を10kDa膜セル濃縮し、そして透析し、最後に冷凍乾燥させ、乾燥粉末を得るステップを更に含む。

0007

本発明は更に前記ピキアパストリスpPIC9/Chi92の発酵産物を保護する。前記発酵産物の製造方法は、前記菌株をBMMY液体培地に接種し、30℃、250−280rpmで48時間発振培養し、培養システムにおけるメタノール濃度が0.5%(体積比)に達するまで、12時間ごとにメタノールを加え、遠心して上澄み液を収集することである。前記方法は、前記上澄み液を10kDa膜セルで濃縮し、そして透析し、最後に冷凍乾燥し、乾燥粉末を得るステップを更に含む。

0008

本発明は前記発酵産物のキチナーゼの製造での応用を更に保護する。前記応用において、反応の条件は、30℃−45℃(例えば30−40℃又は40−45℃)、pH6−9(例えばpH6−7、pH7−8、pH8−9)である。

0009

本発明は前記発酵産物のキチナーゼとしての応用を更に保護する。前記応用において、反応の条件は、30℃−45℃(例えば30−40℃又は40−45℃)、pH6−9(例えばpH6−7、pH7−8、pH8−9)である。

0010

本発明は前記発酵産物がキチン類基質の分解での応用を更に保護し、前記キチン類基質はコロイドキチン、β−グルカンカルボキシメチルセルロースキトサンエビ殻粉末、蟹殻粉末、キチン、グリコールキチン、及び熱不活化酵母粉末のうちの少なくとも1種である。前記応用において、反応の条件は、30℃−45℃(例えば30−40℃又は40−45℃)、pH6−9(例えばpH6−7、pH7−8、pH8−9)である。前記熱不活化酵母粉末は、具体的には、ピキアパストリスGS115菌体を冷凍乾燥して得られた菌粉末を熱不活化して得られる産物であってもよい。前記熱不活化の条件は、具体的には80℃での30分間の処理であってもよい。

0011

本発明は前記Chi92タンパク質のキチナーゼの製造での応用を更に保護する。前記応用において、反応の条件は、30℃−45℃(例えば30−40℃又は40−45℃)、pH6−9(例えばpH6−7、pH7−8、pH8−9)である。

0012

本発明は前記Chi92タンパク質のキチナーゼとしての応用を更に保護する。前記応用において、反応の条件は、30℃−45℃(例えば30−40℃又は40−45℃)、pH6−9(例えばpH6−7、pH7−8、pH8−9)である。

0013

本発明は前記Chi92タンパク質のキチン類基質の分解での応用を更に保護する。前記キチン類基質はコロイドキチン、β−グルカン、カルボキシメチルセルロース、キトサン、エビ殻粉末、蟹殻粉末、キチン、グリコールキチン及び熱不活化酵母粉末のうちの少なくとも1種である。前記応用において、反応の条件は、30℃−45℃(例えば30−40℃又は40−45℃)、pH6−9(例えばpH6−7、pH7−8、pH8−9)である。前記熱不活化酵母粉末は、具体的には、ピキアパストリスGS115菌体を冷凍乾燥して得られた菌粉末を熱不活化して得られる産物であってもよい。前記熱不活化の条件は、具体的には、80℃での30分間の処理であってもよい。

0014

本発明は前記Chi92タンパク質の飼料添加剤としての応用を更に保護する。前記飼料添加剤は、具体的には、魚類飼料添加剤、例えばテラピア飼料添加剤であってもよい。

0015

本発明は前記Chi92タンパク質の飼料の製造での応用を更に保護する。前記飼料は、具体的には魚類飼料、例えばテラピア飼料であってもよい。

0016

本発明は活性成分が前記Chi92タンパク質である飼料添加剤を更に保護する。前記飼料添加剤は、具体的には魚類飼料添加剤、例えばテラピア飼料添加剤であってもよい。

図面の簡単な説明

0017

図1標準曲線及び標準曲線方程式である。
図2はSDS−PAGE電気泳動図である。
図3薄層クロマトグラフィーの結果である。
図4ESI−MS分析の結果である。
図5最適pHの結果である。
図6はpH安定性の結果である。
図7最適温度の結果である。
図8温度安定性の結果である。
図9基質特異性の結果である。
図10は3種のキチナーゼで酵母細胞壁を分解して還元糖を生成する結果である。
図11はChi92タンパク質で酵母細胞壁を分解して生成した還元糖におけるグルコース含有量の結果である。
図12はChi92タンパク質で酵母細胞壁を分解して得られた産物の走査電子顕微鏡による結果である。

0018

以下の実施例は本発明を理解しやすいためのものであるが、本発明を限定するためのものではない。特に明記しない限り、以下の実施例における試験方法は、いずれも一般的な方法である。特に明記しない限り、以下の実施例に使用する試験材料は、いずれも普通の生化学試薬店から購入できるものである。以下の実施例での定量試験は、いずれも3回の繰り返し試験を設定し、結果として平均値を取る。酵素活性単位の定義について、1時間あたりにコロイドキチンを分解して1μmol/LのGlcNAcを放出することに必要な酵素量を1つの酵素活性単位(1U)に定義する。比活性単位は、1mg当たりの酵素タンパク質に含まれる酵素活性単位(U/mg)に定義する。Chi92タンパク質を配列表の配列番号1に示し、そのコード遺伝子を配列表の配列番号2に示す。

0019

アエロモナスAeromonas sp.)B565は、既に2010年12月03日に中国微生物菌株寄託管理委員会の一般微生物センタ(略称CGMCC、住所:北京市朝陽区北辰西路1号院3号)に寄託され、寄託番号がCGMCC No.4403である。

0020

ピキアパストリス発現ベクターpPIC9:Invitrogen社。ピキアパストリス(Pichia pastoris)GS115:Invitrogen社。キチン:Sigma社、型番C9752。カルボキシメチルセルロース:北京鼎国生物技術会社、型番DH053。大麦β−グルカン:北京BioDee生物会社。キトサン(粉末):sigma社、型番417963。グリコールキチン(粉末):sigma社、型番G7753。N−アセチルグルコサミン:Sigmah社、型番N8759。トリプシン(Trypsin)、α−キモトリプシン(α−Chymotrypsin)、ペプシンはいずれもSigma(USA)から購入されたものである。

0021

MD固体培地は、溶剤が水で、溶質としてYNB13.4g/L、グルコース20g/L、ビオチン4×10−4g/L、寒天粉末20g/Lを含有する。

0022

BMGY液体培地は、溶剤が水で、溶質として酵母抽出物10g/L、ペプトン20g/L、酵母窒素源(YNB)13.4g/L、ビオチン4×10−4g/L、グリセリン10mL/Lを含有する。

0023

BMMY液体培地は、溶剤が水で、溶質として酵母抽出物10g/L、ペプトン20g/L、酵母窒素源(YNB)13.4g/L、ビオチン4×10−4g/L、メタノール5mL/Lを含有する。

0024

実施例1、遺伝子操作菌の構築と寄託
一、組み換えプラスミドの構築
1、アエロモナスB565のゲノムDNAを抽出する。
2、ステップ1で抽出されたゲノムDNAをテンプレートとして、F1とR1からなるプライマー対PCR増幅を行い、PCR増幅産物を得る。
F1:5’−GGAGAATTCGCGGCGCCCGGCAAGCC−3’
R1:5’−GGAGCGGCCGCTTATTTACAACTGGCGGCTCCCACATCCTG−3’。
3、限定的エンドヌクレアーゼEcoRI及びNotIでステップ2のPCR増幅産物を二重酵素消化し、酵素消化産物を回収する。
4、限定的エンドヌクレアーゼEcoRI及びNotIでピキアパストリス発現ベクターpPIC9を二重酵素消化し、約9.3kbベクター骨格を回収する。
5、ステップ3の酵素消化産物とステップ4のベクター骨格を接続し、組み換えプラスミドを得る。配列決定結果により、組み換えプラスミドの構造を以下のように記載する:ピキアパストリス発現ベクターpPIC9のEcoRI及びNotIの酵素消化部位の間に配列表の配列番号2における5’末端からの第70−2595位のヌクレオチドで示す二重鎖DNA分子が挿入されている。

0025

二、組み換え菌の構築
1、ステップ一で構築された組み換えプラスミドをピキアパストリスGS115のコンピテント細胞に導入し、そしてMD固形培地プレートコーティングし、滅菌した爪楊枝で単一のコロニーを取り、番号に従って新たなMD固形培地プレートに接種する。計96個の単クローンを得る。
2、番号に従って単クローンを取り、3mLのBMGY液体培地に接種し、30℃、250−280rpmで2−3日発振培養し、そして4500rpmで5分間遠心し、沈殿(できるだけ上澄みを完全に除去する)を取り、沈殿に1mLのBMMY液体培地を加え、30℃、250−280rpmで48時間発振培養し、遠心して上澄み液を収集する。

0026

三、対照菌の構築
1、組み換えプラスミドの代わりに、ピキアパストリス発現ベクターpPIC9でステップ二の1を行い、30個の単クローンを得る。
2、ステップ二の2と同じである。

0027

四、上澄み液のキチナーゼの酵素活性の検出
1、1%コロイドキチンの製造
4℃で、10gのキチンを取りすりに入れ、40mLのアセトンを加えて10分間研磨し、研磨しながら400mLの冷たい濃HClを徐々に添加し、完全に研磨することにより、ペーストにし、そして、4℃で24時間静置し、その後、グラスウール濾過し、濾液を収集した。濾液を2000mlの50%(体積分率エタノール水溶液装入されているビーカに徐々に添加し、添加しながら激しく撹拌し、そして、静置し、コロイド状キチンを析出した後上澄みを除去し、コロイドキチンを収集し、蒸留水でコロイドキチンをpH7.0まで洗浄し、蒸留水で1000mlまで定容積し、冷蔵しておく。
2、標準曲線の作成
pH7.0、0.1mol/Lのリン酸水素二ナトリウムクエン酸緩衝液でN−アセチルグルコサミンを異なる濃度の溶液に配合し、0.5mLの各溶液(N−アセチルグルコサミンの含有量がそれぞれ5.5μmol、7.1μmol、8.3μmol、10.0μmol、12.5μmol、又は16.7μmolである)をそれぞれ1mLのDNS溶液と混合した後5分間沸騰水浴して呈色させ、そして蒸留水で2.5mLまで補足し、室温に冷却した後540nmでOD値を測定し、標準曲線を作成し、標準曲線及び標準曲線方程式を図1後続の実施例における標準曲線はいずれも本標準曲線と指す)に示す。
3、ステップ二で得られた各上澄み液、ステップ三で得られた各上澄み液のキチナーゼ酵素活性をそれぞれ検出する。
(1)4つの試験管を取り、0.25mLの被測定溶液と0.25mLの1%コロイドキチンをそれぞれ添加し、3つの試験管を40℃で1時間水浴し、残り1つは4℃で置き、対照とする。
(2)ステップ(1)を完成した試験管を取り、各試験管に1mLのDNS溶液を添加し、5分間沸騰水浴し、そして蒸留水で2.5mlまで補足し、遠心して上澄み液を取り、540nmでOD値を測定し、標準曲線方程式と対照して酵素活性を計算する。
ステップ二で得られた96個の単クローンのうち、24個の単クローンで得られた上澄み液のキチナーゼ酵素活性は、順次に7.584、8.873、9.609、16.788、32.251、32.803、33.907、33.907、34.460、35.288、37.497、37.681、37.865、37.957、38.509、38.601、38.693、38.970、39.154、39.890、41.087、41.179、41.731及び66.398U/mlである。キチナーゼ酵素活性の最高の上澄み液の対応する菌株を遺伝子操作菌とし、ピキアパストリスpPIC9/Chi92と命名する。
ステップ三で得られた30個の単クローンのうち、上澄み液のキチナーゼ酵素活性はいずれも0U/mLである。

0028

五、遺伝子操作菌の寄託
ピキアパストリス(Pichia pastoris)pPIC9/Chi92は、既に2013年5月23日に中国微生物菌株寄託管理委員会の一般微生物センタ(略称CGMCC、住所:北京市朝陽区北辰西路1号院3号)に寄託され、寄託番号がCGMCC No.7634である。

0029

実施例2、Chi92タンパク質の調製、精製及び酵素活性測定
一、Chi92タンパク質の調製及び精製
1、ピキアパストリスpPIC9/Chi92を200mLのBMGY液体培地が装入されている1000mL三角フラスコに接種し、30℃、250−280rpmで2日発振培養し、4500rpmで5分間遠心し、沈殿(できるだけ上澄みを完全に除去する)を取り、沈殿に100mLのBMMY液体培地を加え、30℃、250−280rpmで48時間発振培養し、培養システムにおけるメタノール濃度が0.5%(体積比)に達するまで、12時間ごとにメタノールを加え、遠心して上澄み液を収集する。
2、0℃で、ステップ1で得られた上澄み液を10kDa膜セルで濃縮し、そして脱イオン水透析液として透析し、最後に冷凍乾燥し、乾燥粉末を得る。
3、ステップ2で得られた乾燥粉末を取り、脱イオン水に溶解した後SDS−PAGEを行い、図2に示すように、分子量が約92kDaの単一バンドが表示され、予測分子量に近い。目標バンド切り取り、天津生物チップ技術有限会社依頼して二級質量スペクトル分析を行い、分析結果から該目標バンドがChi92タンパク質であることが分かる。

0030

二、Chi92タンパク質のキチナーゼとしての比活性、Km、Vmax
1、ステップ一の2で得られた50mgの乾燥粉末を10mLのpH6.0、0.1mol/Lのリン酸水素二ナトリウム−クエン酸緩衝液に溶解し、被測定溶液を得る。
2、1%コロイドキチンの調製
実施例1のステップ四の1と同じである。
3、1%エビ殻粉末の調製
実施例5のステップ一の4と同じである。
4、1%大麦β−グルカンの調製
実施例5のステップ一の2と同じである。
5、クマシーブリリアンブルー法によりステップ1で得られた被測定溶液におけるタンパク質含有量を検出する。
6、ステップ1で得られた被測定溶液のキチナーゼ酵素活性を検出し、方法は実施例1のステップ四の3と同じである。被測定溶液のキチナーゼの酵素活性は69.423U/mLであり、Chi92タンパク質の比活性が809.207U/mgである。
7、測定したChi92タンパク質の一級反応時間が60分間であり、それぞれ異なる濃度の異なる基質(基質がそれぞれコロイドキチン、エビ殻粉末又は大麦β−グルカンであり、各種の基質の濃度がそれぞれ1%、0.8%、0.7%、0.6%、0.4%、0.3%又は0.1%である)を採用し、その他は実施例1のステップ四の3と同じであり、対応する反応速度を計算して、ミカエリスメンテン式二重逆数法でKm値及びVmaxを求める。二重逆数プロット法(Lineweaver−Burk法)によりミカエリスメンテン式を



書き換えて、v、[S]の逆数を計算し、1/v及び1/[S]で作図し、直線を描画し、Km値及びVmaxを求める。結果を表1に示す。

0031

0032

三、TLC(薄層クロマトグラフィー法)によりChi92タンパク質でコロイドキチンを分解した産物を検出する。
1、ステップ一の2で得られた50mgの乾燥粉末を10mLのpH6.0、0.1mol/Lのリン酸水素二ナトリウム−クエン酸緩衝液に溶解し、被測定溶液を得る。
2、1%コロイドキチンの調製
実施例1のステップ四の1と同じである。
3、ステップ1で得られた500μlの被測定溶液とステップ2で得られた500μlの1%コロイドキチンとを混合して40℃で1時間静置反応し、そして、100℃で10分間沸騰まで加熱し、12000rpmで10分間遠心するとともに上澄みを取り、即ち試験組の反応産物とする。ステップ1で得られた500μlの被測定溶液とステップ2で得られた500μlの1%コロイドキチンを混合した後100℃で10分間沸騰まで加熱し、そして12000rpmで10分間遠心し、上澄みを取り、即ち対照組の反応産物とする。
DGX9053−B−2ブラスト乾燥炉(上海福瑪)、P−1型拡張シリンダ二重スロット)(100mm*200mm)、GF254シリカゲルプレート(100mm*200mm)。拡張剤n−ブタノールイソプロパノール酢酸:水=7:5:2:4(体積比)。呈色試薬は、アニリン4ml、ジフェニルアミン4g、85%リン酸30ml、アセトン200ml。105℃でオーブンにより5分間乾燥させて呈色させる。
結果を図3に示す。Chi92タンパク質でコロイドキチンを分解した産物はキトビオースであり、スポッティング穴1、2、3、4、5、6はそれぞれGlc(NAG)6、Glc(NAG)5、Glc(NAG)4、Glc(NAG)3、Glc(NAG)2及びGlc(NAG)の標準品であり、7は試験組の反応産物であり、8は対照組の反応産物であり、9はGlc(NAG)6、Glc(NAG)5、Glc(NAG)4、Glc(NAG)3、Glc(NAG)2及びGlc(NAG)の標準品の混合物である。結果から、Chi92タンパク質でコロイドキチンを分解した産物はキトビオースであることが分かる。

0033

四、ESI−MSによりキチナーゼChi92でコロイドキチンを分解した産物を検出する
処理方法はステップ三と同じである。
800μlの反応産物と1/3体積陰陽樹脂粒子とを渦巻きで均一に混合し、室温で30分間静置し、脱塩反応産物として上澄み500μlを取る。脱塩反応産物を中科院化学研究所に依頼してESI−MS分析を行い、結果を図4に示す。N−アセチル−D−グルコサミンとキトビオースの理論分子量はそれぞれ221.21と424.4である。ESI−MSの過程において、電気噴霧剤としてクロロホルムを採用するので、糖の構造にCl−イオンが導入され、キチンオリゴ糖におけるOH−と水素結合を形成し、カラムと組み合わせて、ピークパターンを生成することに有利である。このため、図に示すピークパターンはCl−を加えた分子量である。N−アセチル−D−グルコサミンとキトビオースのCl−を加えた分子量はそれぞれ256.21と459.4であり、ピークパターンの結果と一致する。ESI−MS過程において、加えたCl−は2種の形式があり、それぞれ35Cl−と37Cl−であり、理論的には、35Cl−を加えたピーク高さは37Cl−を加えたピーク高さの3倍である。ピークパターンにおいて、255.9と459.2のピークの後の2つの質量電荷比の位置にそれぞれピーク高さがその1/3のピークがあり、このピークパターンがCl−を加えたピークパターンであることを更に証明できる。同図におけるピーク高さから分かるように、キトビオースの濃度が明らかにN−アセチル−D−グルコサミンよりも高い。ESI−MSの検出解像度が約1ngであり、TLC検出解像度が約5ngであるので、TLC方法では濃度が低いN−アセチル−D−グルコサミンが検出されていない。

0034

実施例3、Chi92タンパク質のキチナーゼとしての酵素学性質
実施例2のステップ一の2で得られた乾燥粉末を被測定乾燥粉末(主な成分がChi92タンパク質である)として、本実施例の試験を行う。

0035

一、最適pH
1、1%コロイドキチンの調製
4℃で、10gのキチンを取ってすり鉢に入れ、アセトン40mLを加えて10分間研磨し、研磨しながら冷たい濃HCl 400mLを徐々に添加し、完全に研磨することにより、ペーストにし、そして4℃で24時間置き、その後グラスウールで濾過し、濾液を収集し、濾液を2000mLの50%(体積分率)エタノール水溶液が装入されているビーカに徐々に添加し、添加しながら激しく撹拌し、そして静置し、コロイド状キチンを析出した後上澄みを除去し、コロイドキチンを収集し、緩衝液でコロイドキチンを洗浄し、同じ緩衝液で1000mlに定容積し、冷蔵しておく。
それぞれpH3.0−8.0の0.2mol/Lクエン酸−リン酸水素二ナトリウム緩衝液、pH8.0−9.0の0.2mol/LのTris−HCl緩衝液及びpH9.0−11.0の0.2mol/Lグリシン水酸化ナトリウム緩衝液を採用する。
2、被測定乾燥粉末50mgを10mlの緩衝液(ステップ1と同じ緩衝液)に溶解し、被測定溶液を得る。
3、ステップ2で得られた被測定溶液のキチナーゼ酵素活性を検出し、方法は実施例1のステップ四の3と同じである。
pH8.0のTris−HCl緩衝液を採用する際、Chi92タンパク質の酵素活性が最高で、被測定溶液の酵素活性が67.640U/mlである。他の緩衝液を採用する際の被測定溶液の最高酵素活性に対する相対的酵素活性を計算し、図5に示す。pH6.0−9.0である場合、Chi92タンパク質は80%以上の相対的酵素活性を保持している。

0036

二、pH安定性
1、緩衝液で被測定乾燥粉末(5mgの乾燥粉末につき1mlの緩衝液に溶解する)を溶解し、4℃で2時間静置した後に被測定溶液とする。それぞれpH3.0−8.0の0.2mmol/Lのクエン酸−リン酸水素二ナトリウム緩衝液及びpH9.0−12.0の0.2mol/Lのグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液を採用する。
2、1%コロイドキチンの調製
実施例1のステップ四の1と同じである。
3、ステップ1で得られた被測定溶液のキチナーゼ酵素活性を検出し、方法は実施例1のステップ四の3と同じである。
相対的酵素活性結果を図6に示す。Chi92タンパク質はpH範囲が4.0−9.0の間にいずれも安定的であり、70%以上の酵素活性を保持している。

0037

三、最適温度
1、50mgの被測定乾燥粉末を10mLのpH6.0、0.1mol/Lのリン酸水素二ナトリウム−クエン酸緩衝液に溶解し、被測定溶液を得る。
2、1%コロイドキチンの調製
実施例1のステップ四の1と同じである。
3、ステップ1で得られた被測定溶液のキチナーゼ酵素活性を検出し、方法は実施例1のステップ四の3(差異は異なる反応温度を採用するのみにある)を参照する。
40℃の反応温度を採用する際、Chi92タンパク質の酵素活性が最も高く、被測定溶液の酵素活性が86.861U/mlである。他の反応温度を採用する際の被測定溶液の最高酵素活性に対する相対的酵素活性を計算し、図7に示す。30℃−45℃である場合、Chi92タンパク質は60%以上の相対的酵素活性を保持する。

0038

四、温度安定性
1、50mgの被測定乾燥粉末を10mLのpH6.0、0.1mol/Lのリン酸水素二ナトリウム−クエン酸緩衝液に溶解し、異なる温度(40℃又は50℃)でそれぞれ20、40、60、80、100又は120分間保温した後、被測定溶液とする。
2、1%コロイドキチンの調製
実施例1のステップ四の1と同じである。
3、ステップ1で得られた被測定溶液のキチナーゼ酵素活性を検出し、方法は実施例1のステップ四の3と同じである。
相対的酵素活性の結果を図8に示す。40℃で60分間処理した後、Chi92タンパク質は依然として80%以上の相対的酵素活性を保留し、温度安定性が良い。

0039

実施例4、金属イオン及び化学試薬のChi92タンパク質のキチナーゼとしての酵素活性に対する影響
実施例2のステップ一の2で得られた乾燥粉末を被測定乾燥粉末(主な成分がChi92タンパク質である)として、本実施例の試験を行う。

0040

1、50mgの被測定乾燥粉末を10mLのpH6.0、0.1mol/Lのリン酸水素二ナトリウム−クエン酸緩衝液に溶解し、被測定溶液を得る。
2、1%コロイドキチンの調製
実施例1のステップ四の1と同じである。
3、ステップ2で製造された1%コロイドキチンに化合物を加え、化合物の濃度を1mmol/L又は5mmol/Lにする。それぞれ以下の化合物を採用する:KCl(K+を提供する)、NaCl(Na+を提供する)、CaCl2(Ca2+を提供する)、LiCl(Li+を提供する)、CoCl2(Co2+を提供する)、CrCl3(Cr3+を提供する)、NiCl2(Ni2+を提供する)、CuCl2(Cu2+を提供する)、MgCl2(Mg2+を提供する)、FeCl3(Fe3+を提供する)、MnCl2(Mn2+を提供する)、PbCl(Pb+を提供する)、ZnCl2(Zn2+を提供する)、AgNO3(Ag+を提供する)、EDTA、SDS及びβ−メルカプトエタノール
3、ステップ2で得られた各種の異なるシステムに対し、以下のように検出する:
(1)4つの試験管を取り、それぞれ被測定0.25mLの溶液とステップ2で得られた0.25mLのシステムを添加し、3つの試験管を40℃で1時間水浴し、また、残りの1つを対照として4℃で置く。
(2)ステップ(1)を完成した試験管を取り、各管に1mLのDNS溶液を加え、5分間沸騰水浴し、そして蒸留水で2.5mlに補足し、遠心して上澄み液を取り、540nmでOD値を測定し、標準曲線方程式を対照して酵素活性を計算する。
4、CK組:ステップ1で得られた被測定溶液のキチナーゼ酵素活性を検出し、方法は実施例1のステップ四の3と同じである。
各組の処理における被測定溶液のキチナーゼ酵素活性とCK組の被測定溶液のキチナーゼ酵素活性との比値を相対的酵素活性とし、結果を表2に示す。Mn2+イオンはChi92タンパク質の酵素活性に対して一定の促進作用があり、Cr3+、Cu2+等はChi92タンパク質の酵素活性に対して一定の抑制作用があり、高濃度(5mM)のEDTA(キレート剤)はChi92タンパク質の酵素活性をほとんど完全に抑制するが、低濃度(1mM)である場合、Chi92タンパク質の酵素活性に基本的に影響しない。

0041

0042

実施例5、Chi92タンパク質のキチナーゼとしての基質特異性
一、基質の調製
1、1%コロイドキチンの調製
実施例1のステップ四の1と同じである。
2、1%大麦β−グルカンの調製
1gの大麦β−グルカンを100mlの蒸留水に溶解し、100℃で3分間水浴し、室温まで静置し、5000rpmで5分間遠心し、沈殿を除去し、上澄みの混濁物は1%大麦β−グルカンであり、4℃で保管する。
3、1%カルボキシメチルセルロース
1gのカルボキシメチルセルロースを100mlの蒸留水に徐々に添加し、添加しながら磁気撹拌機で撹拌し、均一な混濁物を得、1%カルボキシメチルセルロースであり、4℃で保管する。
4、エビ殻粉末と蟹殻粉末の調製
エビ殻又は蟹殻を取り、洗浄、乾燥した後粉末に粉砕し、100メッシュで濾過し、粉末を取り、そして、5%のHCl水溶液で2時間粉末を浸漬することによりCa2+を除去し、中性まで水で洗浄し、乾燥させる。そして10%のNaOH水溶液で粉末を浸漬し、2時間沸騰水浴してタンパク質を除去し、中性まで水で洗浄し、乾燥し、得られた粉末はエビ殻粉末又は蟹殻粉末である。

0043

二、Chi92タンパク質のキチナーゼとしての基質(いくらかのβ−1,4−グリコシド結合で接続する多糖)特異性
1、実施例2のステップ一の2で得られた50mgの乾燥粉末を10mLのpH6.0、0.1mol/Lのリン酸水素二ナトリウム−クエン酸緩衝液に溶解し、被測定溶液を得る。
2、ステップ一で調製した各種の基質、キチン、カルボキシメチルセルロース、キトサン、グリコールキチン、又は大麦β−グルカンにより1%コロイドキチンを代替し、方法は実施例1のステップ四の3を参照する。
結果を表3に示す。結果から、Chi92タンパク質が1%コロイドキチン、1%大麦β−グルカン、1%カルボキシメチルセルロースに対して異なる程度の分解能力を有し、カルボキシメチルセルロース粉末、キトサン粉末、エビ殻粉末、キチン粉末、大麦β−グルカン粉末及びグリコールキチン粉末に対して微弱な分解能力が有するが、蟹殻粉末と反応した後還元糖の生成が検出されていないことが分かる。

0044

0045

実施例6、タンパク質酵素及びテラピア腸液のChi92タンパク質キチナーゼの酵素活性に対する影響
実施例2のステップ一の2で得られた乾燥粉末を被測定乾燥粉末(主な成分がChi92タンパク質である)として、本実施例の試験を行う。

0046

1、以下の各種のタンパク質酵素溶液を調製する:トリプシンをpH7.0、0.1mol/LのTris−HCl緩衝液に溶解し、α−キモトリプシンをpH7.0、0.1mol/LのTris−HCl緩衝液に溶解し、ペプシンをpH2.0、0.1mol/LのTris−HCl緩衝液に溶解する。
2、テラピア腸液の調製
スーパーマーケットから購入したテラピアを取り、解剖し、PBS緩衝液(NaCl 8g/L、KCl 0.2g/L、Na2HPO4 1.44g/L、KH2PO4 0.24g/Lで、溶剤が蒸留水で、pHが7.2である)で腸管を洗浄し、洗浄液(PBS緩衝液に溶解する腸管内容物を含有する)を収集し、テラピア腸液である。使用する際、PBS緩衝液によりテラピア腸液を目標濃度(濃度がタンパク質濃度で計算する)に希釈する。
3、50mgの被測定乾燥粉末を10mLのpH6.0、0.1mol/Lのリン酸水素二ナトリウム−クエン酸緩衝液に溶解し、被測定溶液を得る。
4、1%コロイドキチンの調製
実施例1のステップ四の1と同じである。
5、ステップ4で調製された1%コロイドキチンにタンパク質酵素溶液又はテラピア腸液を付加する。
6、酵素活性の検出
(1)12本の試験管を取り、それぞれ0.25mLの被測定溶液とステップ5で得られた0.25mLの溶液(タンパク質酵素又はテラピア腸液でのタンパク質とChi92タンパク質との質量比が1:10である)に入れ、試験管1−3は40℃で0分間水浴し、試験管4は4℃で0分間(対照)置き、試験管5−7は40℃で30分間水浴し、試験管8は4℃で30分間(対照)置き、試験管9−11は40℃で60分間水浴し、試験管12は4℃で60分間(対照)置く。
(2)ステップ(1)を完成した試験管を取り、各管に1mLのDNS溶液を添加し、5分間沸騰水浴し、そして蒸留水により2.5mlまで補足し、遠心して上澄み液を取り、540nmでOD値を測定し、標準曲線方程式を対照して酵素活性を計算する。
7、CK組:ステップ3で得られた被測定溶液のキチナーゼ酵素活性を検出し、方法は実施例1のステップ四の3と同じである。
各組の処理における被測定溶液のキチナーゼ酵素活性とCK組の被測定溶液のキチナーゼ酵素活性との比値を相対的酵素活性とし、結果を図9に示す。ペプシンとトリプシンはChi92タンパク質の酵素活性に基本的に影響せず、α−キモトリプシンとテラピア腸液が60分間作用した後Chi92タンパク質は依然として40%以上の相対的酵素活性を保持していることから、Chi92タンパク質は養殖業での飼料添加剤として、飼料におけるキチン類物質(例えばエビ殻粉末、酵母菌粉末等であり、エビ殻粉末と酵母菌粉末はいずれも魚類飼料での一般的な成分である)を分解して、動物飼料コストを低下できることが明らかである。

実施例

0047

実施例7、Chi92タンパク質のキチナーゼとしての酵母細胞壁を分解する能力
1、実施例2のステップ一の2で得られた50mgの乾燥粉末を10mLのpH6.0、0.1mol/Lのリン酸水素二ナトリウム−クエン酸緩衝液に溶解し、被測定溶液を得る。
2、ChiCD3タンパク質乾燥粉末調製方法:特許「キチナーゼChiCD3及びそのコード遺伝子並びに応用」(中国出願番号が201110092079.1である)における実施例2のステップ一の2の(2)で調製したChiCD3タンパク質液を取り、冷凍乾燥し、ChiCD3タンパク質乾燥粉末を得る。ChiCD3タンパク質乾燥粉末を、10mLのpH6.0、0.1mol/Lのリン酸水素二ナトリウム−クエン酸緩衝液に溶解し、被測定溶液を得る。
3、C6137タンパク質はSigma会社から購入したキチナーゼタンパク質である。C6137タンパク質を10mLのpH6.0、0.1mol/Lのリン酸水素二ナトリウム−クエン酸緩衝液に溶解し、被測定溶液を得る。
4、酵母菌粉末の調製:ピキアパストリスGS115の単一コロニーを20mLのYPD液培地に接種し、30℃、180rpmで48時間発振培養し、そして0.1%(体積比)の接種量で200mLのYPD液体培地が装入されている1Lの三角フラスコに転移し、30℃、180rpmで2d発振培養し、培養システム全体を取り、10℃、12000rpmで10分間遠心し、菌体の沈殿を収集し、PBS緩衝液で2回洗浄し、そして真空冷凍乾燥機で乾燥し、得られた粉末は酵母菌粉末である。酵母菌粉末を80℃でオーブンにより30分間処理した後、熱不活化酵母粉末を得る。1gの酵母菌粉末を100mLの蒸留水に溶解し、1%酵母菌粉末溶液を得る。1gの熱不活化酵母粉末を100mLの蒸留水に溶解し、1%熱不活化酵母粉末溶液を得る。
5、キチナーゼで酵母菌粉末を分解するキチナーゼ活性の測定
それぞれステップ1で調製された被測定溶液、ステップ2で調製された被測定溶液及びステップ3で調製された被測定溶液に対し、以下のように測定する:
(1)12本の試験管を取り、それぞれ0.25mLの被測定溶液と0.25mLの1%熱不活化酵母粉末溶液を添加し、試験管1−3は40℃で0時間水浴し、試験管4は4℃で0時間(対照)置き、試験管5−7は40℃で1.5時間水浴し、試験管8は4℃で1.5時間(対照)置き、試験管9−11は40℃で3時間水浴し、試験管12は4℃で3時間(対照)置く。
(2)ステップ(1)を完成した試験管を取り、各管に1mLのDNS溶液を添加し、5分間沸騰水浴し、そして蒸留水で2.5mlに補足し、遠心して上澄み液を取り、540nmでOD値を測定し、標準曲線方程式を対照して還元糖濃度を得る。
還元糖の含有量濃度を図10に示す。1.5時間と3時間反応した後、Chi92タンパク質組の還元糖含有量は、C6137タンパク質組とChiCD3タンパク質組よりも高くなり、即ちChi92タンパク質は酵母細胞乾燥粉末を分解する能力を有し、且つその能力はC6137タンパク質とChiCD3タンパク質よりも高い。
1%熱不活化酵母粉末溶液の代わりに、1%酵母菌粉末溶液により上記ステップを行い、Chi92タンパク質、C6137タンパク質及びChiCD3タンパク質はいずれも酵母細胞乾燥粉末を分解する能力がない。
6、Chi92タンパク質の熱不活化酵母粉末を分解する能力
(1)18本の試験管を取り、それぞれにステップ1で調製された0.25mLの被測定溶液と0.25mLの1%熱不活化酵母粉末溶液を添加し、試験管1−3と試験管10−12は40℃で0時間水浴し、試験管4−6と試験管13−15は40℃で1.5時間水浴し、試験管7−9と試験管16−18は40℃で3時間水浴する。
(2)ステップ(1)を完成した試験管1−9を取り、各試験管に1mLのDNS溶液を付加し、5分間沸騰水浴し、そして蒸留水で2.5mlに補足し、遠心して上澄み液を取り、540nmでOD値を測定し、標準曲線方程式を対照して還元糖濃度を得る。
(3)ステップ(1)を完成した試験管10−18を取り、10000rpmで10分間遠心し、上澄みを取り、グルコース検出キット(北京利文生物技術有限会社、製品標準番号:YZB/京0748−2009)でグルコース濃度を検出する。
非グルコースの還元糖の濃度=還元糖濃度−グルコース濃度。
結果を図11に示す。1.5時間と3時間反応する際、グルコースの産量はそれぞれ総還元糖産量の約18%と25%である。非グルコースの還元糖の産量はグルコースの産量よりも明らかに高い。
7、Chi92タンパク質のキチナーゼとしての熱不活化酵母粉末を分解した分解産物の調製と特徴
実施例7のステップ1の500μLのChi92タンパク質溶液と500μLの1%熱不活化酵母粉末溶液を取って混合し、40℃の水浴で0時間、1.5時間又は3時間インキュベートし、そして、10分間沸騰水浴し、室温まで冷却した後、10000rpmで10分間遠心し、沈殿を収集し、真空冷凍乾燥機で乾燥して、乾燥粉末を収集し、走査電子顕微鏡の分析を行う。
結果を図12に示し、A、B、Cは、それぞれ水浴で0時間、1.5時間及び3時間インキュベートした後得られた乾燥粉末であり、1と2はそれぞれ3000倍と8000倍拡大したものであり、矢印で示すのは細胞壁出現した小さな穴である。0時間の熱不活化酵母粉末に、少量の細胞表面に孔状が存在する。水浴で1.5時間インキュベートした後、細胞壁の表面の小さな穴の数が増加する。水浴で3時間インキュベートした後、細胞壁の表面の小さな穴の数と深さがいずれも明らかに増加する。
結果から、Chi92タンパク質は養殖業での飼料添加剤として、飼料における酵母菌粉末等(酵母菌粉末が魚類飼料での一般的な成分である)を分解して、動物飼料のコストを低下できることが分かる。

0048

本発明が提供するピキアパストリスpPIC9/Chi92は、Chi92タンパク質を効率的に生産する能力がある。ピキアパストリスpPIC9/Chi92の発酵産物(Chi92タンパク質)は、キチナーゼ活性を有し、その比活性が809.207U/mgであり、コロイドキチンに対してのKm値とVmax値はそれぞれ3.967mg/mLと1610μmol/(mg・h)である。前記発酵産物(Chi92タンパク質)は、キチナーゼとして、以下の利点を有している:最適反応温度が40℃で、且つ30−45℃で60.0%以上の活性を保持している;優れた熱安定性を有し、40℃で60分間処理した後、Chi92タンパク質は依然として80%以上の相対的酵素活性を保持している;最適反応pHが8.0であり、pH6−9の範囲内に酵素活性を80%以上に維持することができる;優れたpH安定性を有し、高い比活性を有している。本発明は現代のキチン産業発展に対して重要な意義を有している。

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