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課題・解決手段

本発明は、ポリペプチド、例えば免疫グロブリン単一可変ドメイン、特にフォンヴィルブランド因子(vWF)に対する免疫グロブリン単一可変ドメインの安定な製剤に関する。本発明は、幅広い温度での長期間の保存時に安定である製剤を提供する。本発明の製剤は、ポリペプチドの高い安定性を確実とし、化学的又は物理的劣化を伴うことなく複数回の凍結解凍サイクルを可能とし、機械的ストレス、例えば振とう、剪断又は撹拌ストレスに関連した安定性を与える。それらは、医薬調製物及び診断用調製物に適し、かつ薬学的に許容される希釈剤適合できる。

概要

背景

概要

本発明は、ポリペプチド、例えば免疫グロブリン単一可変ドメイン、特にフォンヴィルブランド因子(vWF)に対する免疫グロブリン単一可変ドメインの安定な製剤に関する。本発明は、幅広い温度での長期間の保存時に安定である製剤を提供する。本発明の製剤は、ポリペプチドの高い安定性を確実とし、化学的又は物理的劣化を伴うことなく複数回の凍結解凍サイクルを可能とし、機械的ストレス、例えば振とう、剪断又は撹拌ストレスに関連した安定性を与える。それらは、医薬調製物及び診断用調製物に適し、かつ薬学的に許容される希釈剤適合できる。

目的

本発明は、幅広い温度での長期間の保存時に安定である製剤を提供する

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請求項1

フォン・ヴィルブランド因子(vWF)結合剤と、pHが5.0〜7.5の範囲であるクエン酸緩衝液とを含む製剤。

請求項2

前記vWF結合剤が、配列番号20に結合する少なくとも1つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含む、請求項1記載の製剤。

請求項3

前記免疫グロブリン単一可変ドメインが、慣用的な4本鎖抗体由来する重鎖可変ドメイン配列、又は抗体重鎖若しくはナノボディに由来する重鎖可変ドメイン配列(VHH配列を含むがそれに限定されるわけではない)を含む、請求項2記載の製剤。

請求項4

前記vWF結合剤が配列番号1〜19の少なくとも1つを含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の製剤。

請求項5

前記vWF結合剤が、1つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインを含む1本鎖ポリペプチドである、請求項1〜4のいずれか一項記載の製剤。

請求項6

前記vWF結合剤が一価又は多価である、請求項5記載の製剤。

請求項7

前記vWF結合剤が単一特異的又は多重特異的である、請求項5記載の製剤。

請求項8

1つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインは、CDR移植されているか、ヒト化されているか、ラクダ化されているか、脱免疫化されているか、又はファージディスプレイによって選択されている、請求項5記載の製剤。

請求項9

前記vWF結合剤が、配列番号1に対して少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項1〜8のいずれか一項記載の製剤。

請求項10

前記vWF結合剤が、0.1〜80mg/mLの範囲の濃度を有する、請求項1〜9のいずれか一項記載の製剤。

請求項11

前記緩衝液が、5〜200mMの範囲の濃度を有する、請求項1〜10のいずれか一項記載の製剤。

請求項12

賦形剤をさらに含む、請求項1〜11のいずれか一項記載の製剤。

請求項13

前記賦形剤が10〜500mMの範囲の濃度を有する、請求項12記載の製剤。

請求項14

前記賦形剤が、スクロースグリシンマンニトールトレハロース、及びNaClからなるリストから選択される、請求項12又は13記載の製剤。

請求項15

前記スクロースが、1〜15%、好ましくは2〜12%、好ましくは4〜10%の範囲、例えば、4、5、6、7、8又は9%(w/v)の濃度を有する、請求項14記載の製剤。

請求項16

前記緩衝液が、6.0〜7.0、より好ましくは6.5のpHを有する、請求項1〜15のいずれか一項記載の製剤。

請求項17

好ましくは0.001〜0.5%(v/v)、より好ましくは0.01〜0.02%(v/v)の濃度の、Tween−80のような非イオン性洗浄剤をさらに含む、請求項1〜16のいずれか一項記載の製剤。

請求項18

フォンヴィルブランド因子(vWF)結合剤とクエン酸緩衝液とを含む製剤であって、該緩衝液は、6.5±0.5、例えば6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7又は6.8、より具体的には6.5のpHを有し、該製剤は、1〜15%、好ましくは2〜12%、好ましくは4〜10%の範囲、例えば4、5、6、7、8又は9%(w/v)の濃度を有するスクロースをさらに含み、好ましくは0.01%(v/v)の濃度の、Tween−80のような非イオン性洗浄剤をさらに含む、該製剤。

請求項19

290±60mOsm/kgの範囲、より好ましくは290±20mOsm/kgの範囲の浸透圧を有する、請求項1〜18のいずれか一項記載の製剤。

請求項20

(a)約0.1mg/mLから約80mg/mLの濃度のvWF結合剤;(b)約1%から約15%(w/v)の濃度のスクロース、グリシン、マンニトール、トレハロース、又はNaClから選択された賦形剤;(c)約0.001%から0.5%(v/v)の濃度のTween−80;(d)製剤のpHが約6.0〜7.0となるような、約5mMから約200mMの濃度のクエン酸緩衝液を含む製剤であって、製剤中のvWF結合剤は、5℃で少なくとも12か月間保存した後にその安定性の少なくとも約80%を保持する、該製剤。

請求項21

(i)5℃で少なくとも12か月間保存した後に5%未満の高分子量(HMW)種;及び/又は(ii)5℃で少なくとも12か月間保存した後に5%未満の低分子量(LMW)種を有する、請求項1〜20のいずれか一項記載の製剤。

請求項22

vWF結合剤の少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%又はさらには少なくとも99%が、保存前の結合活性と比較して保存後にその結合活性を保持し、該結合活性はELISA及び/又はビアコアによって測定される、請求項1〜20のいずれか記載の製剤。

請求項23

(a)約0.1mg/mLから約80mg/mLの濃度のvWF結合剤;(b)約1%から約15%(w/v)の濃度のスクロース;(c)約0.001%〜0.5%(v/v)の濃度のTween−80;及び(d)製剤のpHが約6.0〜7.0となるような、約5mM〜約200mMの濃度のクエン酸緩衝液を含む、液体製剤又は再構成された凍結乾燥製剤である、請求項1〜22のいずれか記載の製剤。

請求項24

(a)約0.1mg/mLから約80mg/mLの濃度のvWF結合剤;(b)約1%から約15%の濃度のスクロース;(c)約0.001%〜0.5%(v/v)の濃度のTween−80;及び(d)製剤のpHが約6.0〜7.0となるような、約5mM〜約200mMの濃度のクエン酸緩衝液を含む、原末保存製剤であり、少なくとも100リットルの製剤が氷点下条件で保存される、請求項1〜22のいずれか記載の製剤。

請求項25

静脈内注射皮下注射筋肉内注射、又は腹腔内注射から選択された1つ以上などの、非経口投与に適した、請求項1〜23のいずれか一項記載の製剤。

請求項26

液体型、凍結乾燥型、噴霧乾燥型、再構成される凍結乾燥型、又は凍結型である、請求項1〜23のいずれか一項記載の製剤。

請求項27

ヒト又は動物被験体処置法に使用するための、請求項1〜26のいずれか一項記載の製剤。

請求項28

TP又はACSの処置に使用するための、請求項1〜27のいずれか一項記載の製剤。

請求項29

請求項1〜28のいずれか一項記載の製剤の調製法

請求項30

vWF結合剤を含む製剤を調製する方法又はプロセスであって、該方法又はプロセスは、−細胞培養においてvWF結合剤を発現させること;−クロマトグラフィー精製工程及び限外ろ過ダイアフィルトレーション工程の少なくとも1つにvWF結合剤を通過させることによって、vWF結合剤を精製すること;−(i)約1%から約15%の濃度のスクロース;(ii)約0.001%〜0.5%(v/v)の濃度のTween−80;及び(iii)製剤のpHが約6.0〜7.0となるような、約5mMから約200mMの濃度のクエン酸緩衝液を含む製剤中において、vWF結合剤の濃度を約0.1〜80mg/mLへと調整することを含む、該方法又はプロセス。

請求項31

vWF結合剤分子を含有する再構成された製剤を調製する方法であって、該方法は、(i)vWF結合剤、凍結乾燥保護剤界面活性剤、及び緩衝液の混合物を凍結乾燥させて、凍結乾燥させた混合物を形成する工程;及び(ii)希釈液中において凍結乾燥させた混合物を再構成し、これにより製剤を調製する工程からなり、再構成された製剤は、(a)約0.1mg/mLから約80mg/mLの濃度のvWF結合剤;(b)約1%から約15%(w/v)の濃度のスクロース;(c)約0.001%〜0.5%(v/v)の濃度のTween−80;及び(d)製剤のpHが約6.0〜7.0となるような、約5mMから約200mMの濃度のクエン酸緩衝液を含む、該方法。

請求項32

製剤を単位投与剤形調合する工程をさらに含む、請求項29〜31のいずれか記載の方法。

請求項33

請求項1〜24のいずれか一項記載の製剤を調製することを含む、vWF結合剤、好ましくは配列番号1〜19の少なくとも1つを含むポリペプチドを、保存のために安定化させるための方法。

請求項34

請求項1〜24のいずれか一項記載の製剤を調製することを含む、vWF結合剤、好ましくは配列番号1〜19の少なくとも1つを含むポリペプチドを保存するための方法。

請求項35

−請求項1〜24のいずれかの製剤の試料を準備すること;−1つ以上のHMW種又はLMW種の色、透明度、粘度、又は量から選択された製剤パラメーターを評価すること;−該パラメーターが予め選択された基準を満たすかどうかを決定し、それにより製造プロセスを分析することを含む、製造プロセスを分析する方法。

請求項36

バッチ間のばらつきをモニタリング若しくは制御する方法において2つ以上の試料製剤を比較すること、又は試料を標準品と比較することをさらに含む、請求項35の方法。

請求項37

比較に基づいて、該製剤を分類、選択、承認又は棄却、発売又は差し控え医薬品への加工、船舶輸送、様々な場所への移動、製剤化、ラベル貼り梱包することをさらに含む、請求項35の方法。

請求項38

評価された製剤パラメーターに関するデータを含みかつ場合により製剤のバッチについての識別名を含む記録を提供すること;該記録を意思決定者提出すること;場合により、該意思決定者からの伝達を受け取り;場合により、意思決定者からの伝達に基づいて製剤のバッチを発売又は市販するかどうかを決定することをさらに含む、請求項37の方法。

請求項39

請求項1〜24のいずれかの製剤を含有する容器使用説明書とを含む、キット又は製品

請求項40

前記製剤がバイアル又は注射用シリンジ中に存在する、請求項39のキット又は製品。

請求項41

前記製剤が、プレフィルド注射用シリンジ中に存在する、請求項39のキット又は製品。

請求項42

前記シリンジ又はバイアルが、環状オレフィンポリマー又はコポリマーから選択されたガラスプラスチック、又はポリマー材料から構成される、請求項40のキット又は製品。

請求項43

請求項1〜23のいずれか一項記載の製剤を含む、患者、好ましくはヒト患者への非経口投与に適した薬学的単位投与剤形

請求項44

vWF結合剤、好ましくは配列番号1〜19の少なくとも1つを含むポリペプチドの保存のための、請求項1〜24のいずれか一項記載の製剤の使用。

請求項45

保存が、例えば−70℃から+40℃の温度で、例えば−70℃、−20℃、+5℃、+25℃、又は+40℃、好ましくは−70℃から+25℃の温度で、1〜36か月間、例えば1、1.5、3、6、9、12、18、24、30、又は36か月間、好ましくは少なくとも12か月間である、請求項44記載の使用。

請求項46

請求項1〜24のいずれか一項に記載されているか、又は請求項28〜33記載の方法によって得ることのできるvWF結合剤を含む製剤を含む、医薬組成物又は診断用組成物

請求項47

請求項1〜24のいずれかの製剤を含む医薬組成物を被験体投与し、これにより、vWF関連疾患に伴う1つ以上の症状を低減させることを含む、vWF関連疾患を治療又は予防する方法。

請求項48

前記vWF関連疾患がTTPである、請求項47の方法。

技術分野

0001

1.発明の分野
本発明は、ポリペプチド、例えば免疫グロブリン単一可変ドメイン、特にフォンヴィルブランド因子(vWF)に対する免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えば配列番号1〜19、特に配列番号1に記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン、すなわちナノボディALX−0081の安定製剤に関する。

0002

本発明は、幅広い温度での長期間の保存時に安定である製剤を提供する。本発明の製剤は、前記ポリペプチドの高い安定性を確実とし、化学的又は物理的劣化を伴うことなく複数回の凍結解凍サイクルを可能とし、機械的ストレス、例えば振とう、剪断又は撹拌ストレスに関連した安定性を与える。それらは医薬調製物及び診断用調製物に適し、薬学的に許容される希釈剤、例えば食塩水リンガー液、又はグルコースデキストロース溶液適合できる。

0003

本発明はまた、製剤の調製法、並びに、製剤の保存法及び使用法に関する。本発明はさらに、製剤の単位投与剤形キット及び医療使用に関する。

0004

2.発明の背景
免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えばラクダVHHドメイン、ラクダ化VHドメイン、又はヒト化VHHドメインは、急速に増えつつある抗体治療薬クラスの代表である。例えば、vWFに対する免疫グロブリン単一可変ドメインは、国際公開公報第2004/015425号、国際公開公報第2004/062551号、国際公開公報第2006/074947号、国際公開公報第2006/122825号、国際公開公報第2009/115614号及び国際公開公報第2011/067160号に記載されている。

0005

免疫グロブリン単一可変ドメイン(ISVD)などのタンパク質は、典型的には、最初の製造から使用まで、例えば患者への投与までの間に保存かつ輸送されなければならない。輸送、製造、保存、及び運送プロセスは、免疫グロブリン単一可変ドメインに対して多数のストレス、例えば化学的及び物理的ストレスを与える可能性がある。保存中に化学的修飾、例えば、脱アミド化ラセミ化加水分解酸化異性化β脱離、又はジスルフィド交換などが起こる可能性がある。物理的ストレスは、変性及びアンフォールディング凝集粒子状物の形成、沈降、白濁化又は吸着を引き起こす可能性がある。

0006

安定性を増強させ、化学的及び/又は機械的なストレスから活性作用物質を保護し、従って有意な物理的又は化学的劣化を伴うことなく保存及び温度変化を可能とし、長期間安定であり続け、及び/又は患者にとって利便性がある(例えば活性作用物質が高濃度で溶解している)、例えば本明細書において定義されているような免疫グロブリン単一可変ドメインのための製剤を提供する必要性が依然としてある。

0007

3.発明の要約
上記のストレスは、タンパク質治療薬、例えば抗体治療薬の物理化学的完全性に影響を及ぼす可能性があることが知られている。例えば、凝集、脱アミド化及び酸化は、抗体分解の最もよくある原因として記載されている(Cleland et al., 1993, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Systems 10, 307-377)。同時に、免疫グロブリン単一可変ドメインの化学的及び物理的完全性を保持する製剤が提供されることは有益である。化学的及び物理的完全性は、例えば治療剤としての使用のために必要とされ、典型的には生物学的活性にも関連している。本発明者らのタンパク質安定性に関する知識は増えつつあるが、これらの多数のストレスを完全に抑制又は最小限としかつ長い有効期限保証するように製剤化条件を最適化することは依然として大きな課題である。

0008

免疫グロブリン単一可変ドメインの適切な製剤に関することは殆ど知られていない。国際公開公報第2010/077422号は、凍結乾燥保護剤界面活性剤、及び、pH5.0〜7.5のヒスチジン緩衝液及びトリHCl緩衝液から選択された緩衝液を含む、TNFに結合するナノボディの製剤を記載している。

0009

具体的なvWF結合剤、特にvWFに対して高い親和性を有する免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えばALX−0081[国際一般的名称カプラシズマブ(caplacizumab)]は、経皮的冠動脈形成術PCI)を受けている急性冠症候群(ACS)患者のための補助的療法として試験され、また血栓性血小板減少性紫斑病(TTP)の処置として開発されている。第I相臨床試験成功裡に完了し、第II相試験における検査が現在進行中である。これまで、ALX−0081は、D−PBS、200mMのグリシン及び0.02%のTween−80(v/v)中に5mg/mLの活性医薬成分API)を含有するリン酸基剤とした液体製剤として提示されている。

0010

この製剤は効果的であることが判明したが、それはいくつかの点で改善され得る。第一に、現行の濃度ではおそらく複数回の皮下注射を必要とし(皮下注射1回あたりの容量は約1mLに制限されると仮定する)、これにより患者にとっての利便性及び簡便性は低減する。第二に、より高い温度での現行のALX−0081製剤(本明細書において以後、現代のALX−0081とも称する)の保存安定性及び有効期限を改善させることができる。高温での本製剤の安定性は、主に、ポリペプチドに対する化学的修飾によって決まる。化学的修飾は、効力の低下と連関し得る。実用的な有効期限は、製品を−20℃で保存することによって到達することができるが、これは、大半の実践的な目的に対する好ましい選択肢であるとは考えられない。

0011

凍結−乾燥は、対象のタンパク質調製物から水を除去する役目を果たす、タンパク質の保存のための一般的に使用される技術である。凍結−乾燥(freeze-drying)、すなわち凍結乾燥(lyophilization)は、乾燥しようとする材料をまず凍結させ、その後、又は凍結した溶媒を、真空環境において昇華によって除去するプロセスである。賦形剤を予め凍結乾燥させた製剤に含めて、凍結−乾燥プロセス中の安定性を増強、及び/又は保存時の凍結乾燥製品の安定性を向上させることができる(Arakawa et al. Pharm. Res. 8(3):285-291 (1991))。

0012

本発明は、フォンヴィルブランド因子(vWF)結合剤と、pH5.0〜7.5の範囲のクエン酸又はリン酸緩衝液、好ましくはクエン酸緩衝液とを含む製剤に関する。特に、本発明は、該vWF結合剤が、配列番号20に結合する少なくとも1つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含む、本明細書に記載のような製剤に関する。

0013

前記免疫グロブリン単一可変ドメインは、重鎖可変ドメイン配列である免疫グロブリン単一可変ドメイン、より具体的には、慣用的な4本鎖抗体由来する重鎖可変ドメイン配列、又は抗体重鎖又はナノボディ(VHH配列を含むがそれに限定されるわけではない)、好ましくはナノボディに由来する重鎖可変ドメイン配列である、免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか、又は実質的にからなるが、それに限定されるわけではない。

0014

さらに、本発明は、前記vWF結合剤が配列番号1〜19の少なくとも1つを含む、本明細書に記載されているような製剤に関する。さらに、本発明は、該vWF結合剤が、1つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインを含む1本鎖ポリペプチドであり、好ましくは該vWF結合剤が一価又は多価であり、該vWF結合剤が単一特異的又は多重特異的であり、及び/又は、1つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインは、CDR移植されているか、ヒト化されているか、ラクダ化されているか、脱免疫化されているか、及び/又はインビトロで作製されている(例えばファージディスプレイによって選択されている)、本明細書に記載されているような製剤に関する。本発明はまた、該vWF結合剤が、配列番号1に対して少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む、本明細書に記載されているような製剤に関する。本発明はまた、該vWF結合剤が、0.1〜80mg/mLの範囲の濃度を有し、及び/又は該緩衝液が5〜200mMの範囲の濃度を有する、本明細書に記載されているような製剤に関する。

0015

さらに、本発明は、賦形剤をさらに含む、本明細書に記載されているような製剤に関し、好ましくは該賦形剤は、10〜500mMの範囲の濃度を有し、より好ましくは、該賦形剤は、スクロース、グリシン、マンニトールトレハロース、及びNaClからなるリストから選択され、さらにより好ましくは、該スクロースは、1〜15%、好ましくは2〜12%、好ましくは4〜10%の範囲、例えば4、5、6、7、8又は9%(w/v)、最も好ましくは7%の濃度を有する。

0016

本発明はまた、該緩衝液が、クエン酸緩衝液(好ましくは該クエン酸緩衝液は、6.0〜7.0、より好ましくは6.5のpHを有する);及びリン酸緩衝液(好ましくは該リン酸緩衝液は、6.5〜7.5の範囲、好ましくは7.1のpHを有する)から選択される、本明細書に記載されているような製剤に関する。

0017

さらに、本発明は、好ましくは0.001〜0.5%(v/v)、より好ましくは0.01〜0.02%(v/v)の濃度の、Tween−80のような非イオン性洗浄剤をさらに含む、本明細書に記載されているような製剤に関する。

0018

さらに、本発明は、該緩衝液が、6.5±0.5、例えば6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7又は6.8、より具体的には6.5のpHのクエン酸緩衝液であり、該製剤は、1〜15%、好ましくは2〜12%、好ましくは4〜10%、例えば4、5、6、7、8又は9%(w/v)の範囲、最も好ましくは7%の濃度を有するスクロースをさらに含み、好ましくは0.01%(v/v)の濃度の、Tween−80のような非イオン性洗浄剤をさらに含む、本明細書に記載されているような製剤に関する。

0019

また、本発明は、前記製剤が、290±60mOsm/kgの範囲、より好ましくは290±20mOsm/kgの範囲の浸透圧を有する、本明細書に記載されているような製剤に関する。

0020

本発明はさらに、
(a)約0.1mg/mLから約80mg/mLの濃度のvWF結合剤;
(b)約1%から約15%(w/v)の濃度のスクロース、グリシン、マンニトール、トレハロース、又はNaClから選択された賦形剤;
(c)約0.001%から0.5%(v/v)の濃度のTween−80;及び
(d)製剤のpHが約6.0〜7.0となるような約5mMから約200mMの濃度のクエン酸緩衝液、及び、製剤のpHが約6.5〜7.5となるような約10mMから約50mMの濃度のリン酸緩衝液(ただし、製剤中のvWF結合剤は、5℃で少なくとも12か月間又は5℃でさらには24か月間保存した後にその安定性の少なくとも約80%を保持する)から選択された緩衝液
を含む、製剤に関する。

0021

本発明はまた、5℃で少なくとも12か月間若しくは5℃でさらには24か月間保存した後に5%未満の高分子量(HMW)種;及び/又は、5℃で少なくとも12か月間若しくは5℃でさらには24か月間保存した後に5%未満の低分子量(LMW)種を有する製剤に関する。

0022

本発明はさらに、vWF結合剤の少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、又はさらには少なくとも99%が、保存前の結合活性と比較して保存後にその結合活性を保持する製剤に関し、該結合活性はELISA及び/又はビアコアによって測定される。

0023

さらに、本発明は、前記製剤が、液体型、凍結乾燥型、噴霧乾燥型、再構成される凍結乾燥型、又は凍結型である、本明細書に記載されているような製剤に関し、より具体的には本発明は、
(a)約0.1mg/mLから約80mg/mLの濃度のvWF結合剤;
(b)約1%から約15%(w/v)の濃度のスクロース;
(c)約0.001%〜0.5%(v/v)の濃度のTween−80;及び
(d)製剤のpHが約6.0〜7.0となるような、約5mM〜約200mMの濃度のクエン酸緩衝液
を含む、液体製剤又は再構成される凍結乾燥製剤に関する。その後、凍結乾燥製剤は、必要に応じて、凍結乾燥型を適切な希釈剤(例えば水)と混合して、元来の製剤成分を所望の濃度まで再度可溶化することによって再構成させることができる。

0024

本発明はまた、前記製剤が、
(a)約0.1mg/mLから約80mg/mLの濃度のvWF結合剤;
(b)約1%から約15%の濃度のスクロース;
(c)約0.001%〜0.5%(v/v)の濃度のTween−80;及び
(d)製剤のpHが約6.0〜7.0となるような、約5mM〜約200mMの濃度のクエン酸緩衝液
を含む、原末保存製剤であり、少なくとも100リットルの製剤が氷点下条件で保存される、本明細書に記載されているような製剤に関する。

0025

さらに、本発明は、前記製剤が被験体、例えばヒト被験者(例えば、vWF関連疾患を有する患者)への非経口投与に適した、製剤に関する。該製剤を、注射(例えば静脈内、皮下、筋肉内、又は腹腔内)によって被験体に投与することができる。

0026

また、本発明は、ヒト又は動物被験体処置法に使用するための、好ましくはvWF関連疾患、例えば急性冠症候群(ACS)、一過性脳虚血発作不安定性又は安定性狭心症、脳卒中、心筋梗塞、又は血栓性血小板減少性紫斑病(TTP)の処置に使用するための、最も好ましくはTTP又はACSの処置に使用するための、本明細書に記載されているような製剤を提供する。さらに、本発明は、本明細書に記載のような製剤を調製する方法又はプロセスに関する。該方法又はプロセスは、細胞培養液中においてvWF結合剤を発現させ;例えばクロマトグラフィー精製工程、限外濾過ダイアフィルトレーション工程の少なくとも1つにvWF結合剤を通過させることによって、vWF結合剤を精製する工程;本明細書に記載のような凍結乾燥保護剤、界面活性剤、及び緩衝液、例えば、約1%から約15%の濃度のスクロース;約0.001%〜0.5%(w/v)の濃度のTween−80;及び製剤のpHが約6.0〜7.0となるような約5mMから約200mMの濃度のクエン酸緩衝液を含有する製剤中において、vWF結合剤の濃度を例えば約0.1〜80mg/mlへと調整する工程;及び、場合により、該製剤を単位投与剤形で調合する工程を含む。

0027

本発明はまた、vWF結合剤、例えば本明細書に記載のようなALX−0081を含有する再構成される製剤を調製するための方法又はプロセスを特色とする。該方法は、vWF結合剤、凍結乾燥保護剤、界面活性剤及び緩衝液の混合物を凍結乾燥させ、これにより凍結乾燥混合物を形成する工程;及び、凍結乾燥させた混合物を希釈剤中において再構成して、これにより本明細書に記載のような製剤を調製する工程を含む。特に、該製剤は、(a)約0.1〜約80mg/mLの濃度のvWF結合剤、例えばALX−0081;(b)約1%から約15%(w/v)の濃度のスクロース;(c)約0.001%から約0.5%(v/v)の濃度のTween−80;及び(d)該製剤のpHが約6〜7.0となるような、約5〜約200mMの濃度のクエン酸緩衝液を含み;及び、場合により、該製剤を単位投与剤形で調合する工程を含む。

0028

本発明はさらに、本明細書において定義されているような製剤を調製することを含む、保存のためにvWF結合剤、好ましくは配列番号1〜19の少なくとも1つを含むポリペプチドを安定化させるための方法に関する。

0029

さらに、本発明は、本明細書において定義されているような製剤を調製することを含む、vWF結合剤、好ましくは配列番号1〜19の少なくとも1つを含むポリペプチドを保存するための方法に関する。

0030

また、本明細書に記載された又は本明細書に記載の方法によって得ることのできる製剤のいずれかを含む、医薬組成物又は診断用組成物を提供する。

0031

さらに、本発明は、製品又はプロセス、例えば製造プロセスを分析する方法を特色とする。該方法は、vWF結合剤、例えば本明細書に記載のALX−0081の製剤を準備する工程、及び、本明細書に記載のような、1つ以上のHMW種、LMW種の色、透明度、粘度又は量などの製剤パラメーターを評価することを含む。評価は、1つ以上のパラメーターの評価、例えば、該パラメーターが予め選択された基準を満たすかどうかを決定、例えば、予め選択された基準が存在するかどうか、又は予め選択された範囲内に存在するかどうかを決定し、これによりプロセスを分析することを含み得る。例えば、該プロセスの評価は、vWF結合剤の製剤の安定性の測定を含む。ALX−0081製剤の安定性は、例えば、凝集物の形成(これは、例えば、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー(SE−HPLC)によってアッセイされる)によって、本明細書に記載のような色、透明度、又は粘度によって測定することができる。

0032

さらに、前記方法は、バッチ間のばらつきをモニタリング又は制御する方法において2つ以上の試料製剤を比較すること、調製物を標準品と比較すること、比較に基づいて、該製剤を、分類、選択、承認又は棄却、発売又は差し控え医薬品への加工、船舶輸送、様々な場所への移動、製剤化、ラベル貼り、又は梱包することをさらに含み得る。また、該方法はさらに、評価された製剤パラメーターに関するデータを含みかつ場合により製剤のバッチについての識別名を含む記録を提供すること;該記録を意思決定者提出すること;場合により、該意思決定者からの伝達を受け取り;場合により、意思決定者からの伝達に基づいて製剤のバッチを発売又は市販するかどうかを決定することをさらに含み得る。

0033

また、本発明の製剤と例えば医療従事者による使用のための説明書とを含む、キット又は製品を提供する。キット又は製品は、本明細書に記載のような本発明の製剤を含有するバイアル又はシリンジを含み得る。好ましくは、バイアル又はシリンジは、環状オレフィンポリマー又はコポリマーから選択されたガラスプラスチック、又はポリマー材料から構成される。さらに、該製剤はまた、注射器具(例えば注射用シリンジ、例えばプレフィルド注射用シリンジ)中に存在していてもよい、

0034

本発明はさらに、ヒト患者への本発明の製剤の非経口投与(例えば皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、及び皮下)に適した本発明の安定な製剤を含む、薬学的な単位投与剤形を提供する。

0035

さらに、本発明の製剤は、vWF結合剤、好ましくは配列番号1〜19の少なくとも1つを含むポリペプチド、例えば本明細書に記載のALX−0081の保存のために使用することができ、該保存は、例えば−70℃から+40℃の温度で、例えば−70℃、−20℃、+5℃、+25℃、又は+40℃、好ましくは−70℃から+25℃の温度で、1〜36か月間、例えば1、1.5、3、6、9、12、18、24、30、又は36か月間、好ましくは少なくとも12か月間である。

0036

本発明はまた、vWF関連疾患、例えば急性冠症候群(ACS)、一過性脳虚血発作、不安定性又は安定性狭心症、脳卒中、心筋梗塞、又は血栓性血小板減少性紫斑病(TTP)を治療又は予防する方法に関し;該方法は、被験体に、本発明の製剤を含む医薬組成物を投与し、これにより、vWF関連疾患に伴う1つ以上の症状を低減させることを含む。特に、該vWF関連疾患はTTPである。

図面の簡単な説明

0037

ALX−0081のために実施された標準的な65時間の凍結乾燥プログラムの種々の工程を示すフローチャート
−70℃、+5℃及び+25℃で1か月間及び2か月間保存した後のALX−0081のRP−HPLCクロマトグラムの関連部分;mAU:ミリ吸光度単位
37℃で0、4及び8週間インキュベートした後のALX−0081のRP−HPLCクロマトグラムの関連部分の拡大表示。37℃における延長されたインキュベーションの結果として(0、4、8週間)、RP−HPLCのメインピーク分裂が観察される;mAU:ミリ吸光度単位。
凍結解凍(FT)サイクル前(a)並びに−20℃(c)及び−70℃(b)での10回の凍結解凍(FT)サイクル後の、ブランククエン酸緩衝液(bcb)と20mMのクエン酸(pH7.0)中55.9mg/mLのALX−0081のSE−HPLCプロファイルの重ね合わせ(λ=280nm)。ランニング緩衝液で予め希釈された試料についてマイナーなクエン酸ピークが観察された;mAU:ミリ吸光度単位。
+4℃で±1週間保存した後のブランククエン酸緩衝液(bcb)と20mMのクエン酸(pH7.0)中55.9mg/mLのALX−0081のSE−HPLCプロファイルの重ね合わせ(λ=280nm)。ALX−0081は、インタクトな修飾されていないALX−0081に相当する1本のメインピーク(97%)、及び、全表面積の僅か3%を示す小さなプレピークへと分離した。ランニング緩衝液中で予め希釈されたALX−0081について、マイナーなクエン酸ピークが観察された;mAU:ミリ吸光度単位。
+25℃において50mMクエン酸pH6.0、50mMクエン酸pH6.0+0.01%Tween−80(v/v)及び50mMクエン酸pH6.0+0.02%Tween−80(v/v)中において撹拌されたALX−0081試料の散乱強度。「+」は、50mMクエン酸pH6.0中の試料を示し(y=0.0044x+3.5962、R2=0.9549);「o」は、50mMクエン酸pH6.0+0.02%Tween−80(v/v)中の試料を示し(y=0.0002x+1.0447、R2=0.4673);「x」は、50mMクエン酸pH6.0+0.01%Tween−80(v/v)中の試料を示す(y=0.0004x+0.5125、R2=0.6804);(x軸=時間(秒);y軸=散乱強度)。
+25℃において50mMクエン酸pH6.5、50mMクエン酸pH6.5+0.01%Tween−80(v/v)及び50mMクエン酸pH6.5+0.02%Tween−80(v/v)中において撹拌されたALX−0081試料の散乱強度。「+」は、50mMクエン酸pH6.5中の試料を示し(y=0.0041x+4.7667、R2=0.9431);「o」は、50mMクエン酸pH6.5+0.02%Tween−80(v/v)中の試料を示し(y=0.0004x−0.0208、R2=0.9391);「x」は、50mMクエン酸pH6.5+0.01%Tween−80(v/v)中の試料を示す(y=0.0001x−1.8853、R2=0.0376);(x軸=時間(秒);y軸=散乱強度)。
+40℃(a)及び−70℃(b)において1か月間保存した後、D−PBS+200mMグリシン+0.01%Tween−80中5mg/mLのALX−0081のcIEプロファイルの重ね合わせ;(λ=280nm)。AU:吸光度単位。pxlpos:ピクセル単位
ミリQ水を用いて再構成する前(パネルA)及び後(パネルB)の凍結乾燥させたALX−0081製剤(形態3=クエン酸/スクロースpH6.0;形態7=クエン酸/スクロースpH6.5;形態17=D−PBS/グリシン)の写真
ミリQ水を用いて再構成する前(パネルA)及び後(パネルB)の凍結乾燥させたALX−0081製剤(形態3=クエン酸/スクロースpH6.0;形態7=クエン酸/スクロースpH6.5;形態17=D−PBS/グリシン)の写真。
クエン酸/スクロースを基剤とした凍結乾燥ALX−0081製剤の写真。
15、20、25、30、40及び50mMのクエン酸pH6.5を含有する28mg/mLのALX−0081液体製剤を+25℃(パネルA)又は+5℃(パネルB)において4日間保存した後の写真。ブランクのクエン酸緩衝液(50mM)が基準として含まれる。
15、20、25、30、40及び50mMのクエン酸pH6.5を含有する28mg/mLのALX−0081液体製剤を+25℃(パネルA)又は+5℃(パネルB)において4日間保存した後の写真。ブランクのクエン酸緩衝液(50mM)が基準として含まれる。
15mMクエン酸pH6.5と種々の量のスクロース及びTween−80とを含有する、20mg/mLのALX−0081液体製剤を+25℃(パネルA)又は+5℃(パネルB)において4日間保存した後の写真。ブランクのクエン酸緩衝液(50mM)が基準として含まれる。
15mMクエン酸pH6.5と種々の量のスクロース及びTween−80とを含有する、20mg/mLのALX−0081液体製剤を+25℃(パネルA)又は+5℃(パネルB)において4日間保存した後の写真。ブランクのクエン酸緩衝液(50mM)が基準として含まれる。
+5℃で保存した場合の、時間の関数としての、凍結乾燥ALX−0081医薬品中のピログルタメートパーセント予測
+25℃で保存した場合の、時間の関数としての、凍結乾燥ALX−0081医薬品中のピログルタメートのパーセントの予測。

0038

5.発明の詳細な説明
特記しない限り、具体的に詳述されていない全ての方法、工程、技術及び操作を実施することができ、それは当業者には明らかであるように、それ自体公知の方法で実施されている。例えば、本明細書に記載された標準的な便覧及び一般的な背景技術、さらに、そこで引用されている参考文献;並びに、例えば、タンパク質工学技術、例えばアフィニティ成熟、及び、免疫グロブリンなどのタンパク質の特異性及び他の所望の特性を改善するための他の技術を記載した、以下の概説:Presta, Adv. Drug Deliv. Rev. 2006, 58 (5-6): 640-56; Levin and Weiss, Mol. Biosyst. 2006, 2(1): 49-57; Irving et al., J. Immunol. Methods, 2001, 248(1-2), 31-45; Schmitz et al., Placenta, 2000, 21 Suppl. A, S106-12, Gonzales et al., Tumour Biol., 2005, 26(1), 31-43に再度言及する。

0039

今回驚くべきことに、vWF結合剤、特にALX−0081(配列番号1)を、ヒトに特定の投与処方計画で投与することができることが判明した。vWF結合剤、特にALX−0081は、投与終了時直ちに急速に作用を発現して、薬力学的作用を生じ、その効力を約12〜24時間維持することが判明した。さらに、vWF結合剤、特にALX−0081(配列番号1)は、健康な男性の試験志願者において良好な耐容性を示し、かつ安全であることが判明した。これらの結果は、vWF結合剤、特にALX−0081(配列番号1)は、待機的な経皮的冠動脈形成術(また、本明細書において以後、「PCI」)を受けている安定狭心症患者における急性処置に、及び、血栓性血小板減少性紫斑病(また、本明細書において以後、「TTP」)患者の処置に適している。

0040

それにも関わらず、ヒトレシピエントに投与されたvWF結合剤、特にALX−0081(配列番号1)の現行の製剤は、改善可能であった。

0041

本明細書に記載のvWF結合剤、特にALX−0081についての改質発明により、溶解度が上昇し(80mg/mLまで)かつ液体中での保存安定性が有意に向上した(例えば、新規製剤の保存時に、その液体状態で元来の製剤より少ない酸化が起こる)新規なクエン酸/スクロースを基剤とした製剤となった。また、凍結乾燥型では、+40℃で12か月間保存した後又はさらには+40℃で24か月間保存した後でさえも、酸化又はasp異性化は実質的に全く検出できなかった。少量のピログルタメートの残留形成は依然として観察された。クエン酸及びスクロース濃度のさらなる最適化により、凍結乾燥製品の水分含量は減少し、これにより、残留ピログルタメート形成速度は最小限となった。

0042

従って、本発明は、抗vWF結合剤(例えばALX−0081)の安定な液体製剤及び凍結乾燥製剤、並びに、vWF関連疾患を治療又は予防するためのその使用を提供する。

0043

5.1 本発明のポリペプチド(群)
本発明に使用されるvWF結合剤は、典型的には、ヒトフォンヴィルブランド因子(vWF、配列番号20)に結合するタンパク質又はポリペプチドである。好ましくは、vWF結合剤は、少なくとも1つの免疫グロブリン配列、例えば免疫グロブリン単一可変ドメイン(ISVD)を含む又はからなるタンパク質又はポリペプチドである。さらにより好ましくは、本発明のvWF結合剤は、配列番号1〜19、最も好ましくは配列番号1を含む又はからなるタンパク質又はポリペプチドである。vWF結合剤は、PCIを受けているACS患者の補助的療法として、又は血栓性血小板減少性紫斑病(TTP)の処置として使用され得る。「タンパク質」、「ポリペプチド」及び「アミノ酸配列」という用語は、本明細書において同義語として使用される。従って、本発明のアミノ酸配列はvWF結合剤である。

0044

従って、例えば、本発明に使用するための適切なvWF結合剤は、表A−1中の化合物、例えば配列番号1〜19の化合物、又は、表A−1の化合物に対して80%以上、より好ましくは85%以上、最も好ましくは90%、95%、96%、97%、98%、99%以上のアミノ酸配列同一率を有する化合物を含み得る(「配列同一率」については定義の章を参照されたい)。

0045

好ましくは、本発明に使用するためのvWF結合剤は、12A02H1様化合物である。本明細書の目的のための12A02H1様化合物は、12A02H1(すなわち配列番号19)を含む化合物、又は、12A02H01(配列番号19)に対して80%以上、より好ましくは85%以上、最も好ましくは90%、95%、96%、97%、98%、99%以上のアミノ酸配列同一率(本明細書においてさらに定義されているような)を有する化合物である。特に好ましいvWF結合剤はALX−0081(配列番号1)である。

0046

上記の全てのvWF結合剤は、文献から周知である。これは、その製造を含む(特に、例えば国際公開公報第2006/122825号を、しかしまた国際公開公報第2004/062551号も参照されたい)。例えば、ALX−0081は、例えば、国際公開公報第2006/122825号又は国際公開公報第2009/115614号に記載されているように調製される。

0047

特記されない限り、「免疫グロブリン配列」(本明細書においては、重鎖抗体又は慣用的な4本鎖抗体を指すために使用される)という用語は、完全なサイズの抗体、その個々の鎖、並びに、その全ての部分、ドメイン又はフラグメント抗原結合ドメイン又はフラグメント、例えばVHHドメイン又はVH/VLドメインをそれぞれ含むがそれに限定されるわけではない)の両方を含む一般的な用語として使用されている。抗原結合分子又は抗原結合タンパク質という用語は、免疫グロブリン配列と互換的に使用され、これは免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えばナノボディ(登録商標)を含む。

0048

本発明の実施態様は、免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えば軽鎖可変ドメイン配列(例えばVL配列)又は重鎖可変ドメイン配列(例えばVH配列)である免疫グロブリン配列;より具体的には、慣用的な4本鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列、又は抗体重鎖に由来する重鎖可変ドメイン配列(例えばVHH配列)に関する。

0049

「免疫グロブリン単一可変ドメイン」という用語は、抗原結合部位が単一免疫グロブリンドメイン又はその適切なフラグメント上に存在し、単一免疫グロブリンドメイン又はその適切なフラグメントによって形成された分子と定義する。これにより、免疫グロブリン単一可変ドメインは、2つの免疫グロブリンドメイン、特に2つの可変ドメイン相互作用して抗原結合部位を形成する「慣用的な」免疫グロブリン又はそのフラグメントとは異なる。典型的には、慣用的な免疫グロブリンでは、重鎖可変ドメイン(VH)及び軽鎖可変ドメイン(VL)は相互作用して抗原結合部位を形成している。この場合、VH及びVLの両方の相補性決定領域(CDR)が抗原結合部位に寄与し、すなわち、合計で6つのCDRが抗原結合部位の形成に関与する。

0050

対照的に、免疫グロブリン単一可変ドメインの抗原結合部位は、単一のVHドメイン又はVLドメインによって形成される。従って、免疫グロブリン単一可変ドメインの抗原結合部位は、3つ以下のCDR、例えば1、2、又は3つのCDRによって形成される。

0051

従って、「免疫グロブリン単一可変ドメイン」という用語は、抗原結合部位の形成のために少なくとも2つの可変ドメインの相互作用を必要とする、慣用的な免疫グロブリン又はそのフラグメントを含まない。これはまた、免疫グロブリン単一可変ドメインを「含む」又は「含有する」本発明の実施態様についても該当する。本発明の脈絡において、このような実施態様は、慣用的な免疫グロブリン又はそのフラグメントを除外する。従って、免疫グロブリン単一可変ドメインを「含む」又は「含有する」組成物は、例えば、2つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインを含む構築物に関し得る。あるいは、免疫グロブリン単一可変ドメイン以外のさらに他の構成成分、例えば様々な種類の補助物質タンパク質タグ着色剤色素などが存在してもよい。しかし、これらの用語は、抗原結合部位が単一可変ドメインによって形成される慣用的な免疫グロブリンのフラグメントを含む。

0052

本発明によると、本発明のポリペプチド、より具体的には免疫グロブリン配列は、以下の1つ以上からなり得るか又は含み得(ドメイン抗体、又はドメイン抗体として使用するのに適したアミノ酸配列、単一ドメイン抗体、又は単一ドメイン抗体として使用するのに適したアミノ酸配列、「dAb」、又はdAbとして使用するのに適したアミノ酸配列、又はナノボディ(登録商標)(VHH配列、例えばヒト化VHH配列又はラクダ化VH配列を含むがそれに限定されるわけではない))、それは好ましくはナノボディ(登録商標)である。

0053

本発明は、免疫グロブリン単一可変ドメインの適切なフラグメントを包含する。免疫グロブリン単一可変ドメインの「適切なフラグメント」は、天然の免疫グロブリン単一可変ドメインよりも少ないアミノ酸を含有するが、依然として抗原結合活性を示す(よって、通常、本明細書においてさらに記載されているような、少なくとも1つのCDRを形成するアミノ酸残基の少なくともいくつかを含有する)ポリペプチドに関する。このような免疫グロブリン単一可変ドメイン及びフラグメントは、最も好ましくは、免疫グロブリンの折り畳みを含むか、又は、適切な条件下で、免疫グロブリンの折り畳みを形成することができる。より具体的には、免疫グロブリン単一可変ドメイン及びそのフラグメントは、標的抗原に結合することができるようなものである。従って、免疫グロブリン単一可変ドメインは、例えば、軽鎖可変ドメイン配列(例えばVL配列)又はその適切なフラグメント;或いは重鎖可変ドメイン配列(例えばVH配列又はVHH配列)又はその適切なフラグメントを;それが単一の抗原結合単位(すなわち、例えば、別の可変ドメインと例えばVH/VL相互作用を通して相互作用して機能的抗原結合ドメインを形成する必要のある例えば慣用的な抗体及びscFvフラグメントに存在する可変ドメインの場合のように、単一抗原結合ドメインが別の可変ドメインと相互作用して機能的抗原結合単位を形成する必要がないような、免疫グロブリン単一可変ドメインから実質的になる機能的抗原結合単位)を形成することができる限り含むことができる。

0054

本発明の免疫グロブリン配列は、好ましくは、実質的に単離形である。本発明の免疫グロブリン配列はまた、本発明の1つ以上のアミノ酸配列を含み得るか又は実質的にからなり得、場合によりさらに、1つ以上のさらなるアミノ酸配列(全て場合により1つ以上の適切なリンカーを介して連結されている)を含み得る、本発明のタンパク質又はポリペプチド(本明細書において定義されているような)の一部を形成し得る。例えばであって限定するものではないが、本発明の1つ以上のアミノ酸配列は、このようなタンパク質又はポリペプチドにおける結合単位として使用され得、これは、場合により、結合単位としての役目を果たし得る1つ以上のさらなるアミノ酸配列を含有していてもよく、よって、それぞれ本発明の一価、多価又は多重特異的ポリペプチド(全て本明細書に記載されている)を与え得る。このようなタンパク質又はポリペプチドはまた実質的に単離形であり得る。

0055

本発明は、マウスラットウサギロバ、ヒト、及びラクダ免疫グロブリン配列を含む、様々な起源の免疫グロブリン配列に関する。本発明はまた、完全なヒト、ヒト化又はキメラ免疫グロブリン配列を含む。例えば、本発明は、ラクダ免疫グロブリン配列及びヒト化ラクダ免疫グロブリン配列、又はラクダ化ドメイン抗体、例えばWard et al(例えば、国際公開公報第94/04678号及びDavies and Riechmann (1994 and 1996)参照)によって記載のようなラクダ化dAbを含む。さらに、本発明は、例えば多価及び/又は多重特異的構築物を形成している融合免疫グロブリン配列(1つ以上のVHHドメインを含有する多価及び多重特異的ポリペプチド並びにその調製について、Conrath et al., J. Biol. Chem., Vol. 276, 7346-7350, 2001、並びに、例えば国際公開公報第96/34103号及び国際公開公報第99/23221号も言及する)、及び、本発明の免疫グロブリン配列から誘導可能である、タグ又は他の機能的部分、例えば毒素、標識、放射性化学物質などを含む免疫グロブリン配列を含む。サメの免疫グロブリン単一可変ドメインも記載されている(例えば国際公開公報第03/014161号又はStreltsov, 2005に記載されているように「IgNARs」とも呼ばれる)。

0056

特定の実施態様において、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインは、ナノボディ(登録商標)、特にラクダVHHドメイン、ヒト化VHHドメイン、又はラクダ化VHドメインである。当業者は、VHHドメインのヒト化及び/又はVHドメインのラクダ化について十分に知っているだろう。

0057

免疫グロブリン配列、特にナノボディ(登録商標)のアミノ酸配列及び構造は、4つのフレームワーク領域すなわち「FR領域」から構成されると考えられ得るがこれに限定されるわけではなく、これらは当技術分野において及び本明細書において「フレームワーク領域1」すなわち「FR1」;「フレームワーク領域2」すなわち「FR2」;「フレームワーク領域3」すなわち「FR3」;及び、「フレームワーク領域4」すなわち「FR4」とそれぞれ称され;そのフレームワーク領域は、3つの相補性決定領域すなわち「CDR」によって分断され、これらは当技術分野において「相補性決定領域1」すなわち「CDR1」;「相補性決定領域2」すなわち「CDR2」;及び、「相補性決定領域3」すなわち「CDR3」と称される。

0058

ナノボディ(登録商標)におけるアミノ酸残基の総数は、110〜120の領域にあり得、好ましくは112〜115であり、最も好ましくは113である。しかし、ナノボディ(登録商標)の部分、フラグメント、類似体又は誘導体(本明細書においてさらに記載されているような)は、このような部分、フラグメント、類似体又は誘導体が、本明細書に概略を示したさらなる必要条件を満たし、かつまた好ましくは本明細書に記載の目的に適している限り、その長さ及び/又はサイズに関して特に限定されないことに留意されたい。

0059

従って、一般的に、免疫グロブリン単一可変ドメインは、4つのフレームワーク領域(それぞれFR1〜FR4)及び3つの相補性決定領域(それぞれCDR1〜CDR3)からなるか又は実質的にからなる、アミノ酸配列であろう。この脈絡において「実質的にからなる」は、例えば精製又は標識のために使用されるタグなどの追加の配列が存在し得るが、このような追加の配列は、免疫グロブリン単一可変ドメインそれ自体と比較して少なく、免疫グロブリン単一可変ドメインの抗原結合活性には干渉しないことを意味する。

0060

本明細書において使用されるような「免疫グロブリン配列」又は「免疫グロブリン単一可変ドメイン」という用語は、ポリペプチドをコードする核酸配列、及びポリペプチドそれ自体の両方を指す。これ以上の限定された意味は具体的な内容から明らかとなろう。

0061

特に、本発明のアミノ酸配列は、ナノボディ(登録商標)又はその適切なフラグメントであり得る。VHH及びナノボディのさらなる説明のために、Reviews in Molecular Biotechnology 74(2001), 277-302のMuyldermansによる概説記事;並びに、一般的な背景技術として記載されている以下の特許出願:ブリュッセル自由大学の国際公開公報第94/04678号、国際公開公報第95/04079号及び国際公開公報第96/34103号;ユニリーバの国際公開公報第94/25591号、国際公開公報第99/37681号、国際公開公報第00/40968号、国際公開公報第00/43507号、国際公開公報第00/65057号、国際公開公報第01/40310号、国際公開公報第01/44301号、欧州特許第1134231号、及び国際公開公報第02/48193号;Vlaams Instituut voor Biotechnologie (VIB)の国際公開公報第97/49805号、国際公開公報第01/21817号、国際公開公報第03/035694号、国際公開公報第03/054016号、及び国際公開公報第03/055527号;Algonomics N.V.及びAblynx N.V.の国際公開公報第03/050531号;カナダ国立研究機関による国際公開公報第01/90190号;Institute of Antibodiesによる国際公開公報第03/025020号(=欧州特許第1433793号);並びに、Ablynx N.V.による国際公開公報第04/041867号、国際公開公報第04/041862号、国際公開公報第04/041865号、国際公開公報第04/041863号、国際公開公報第04/062551号、国際公開公報第05/044858号、国際公開公報第06/40153号、国際公開公報第06/079372号、国際公開公報第06/122786号、国際公開公報第06/122787号及び国際公開公報第06/122825号、並びに、Ablynx N.V.によるさらに他の公開された特許出願に言及する。また、これらの出願に記載されたさらなる先行技術、特に、国際出願の国際公開公報第06/040153号の41〜43頁に記載された参考文献のリストに言及し、これらのリスト及び参考文献は参照により本明細書に組み入れられる。これらの参考文献に記載されているように、ナノボディ(特にVHH配列及び特にヒト化ナノボディ)は、特に、1つ以上のフレームワーク配列中の1つ以上の「ホールマーク残基」の存在によって特徴付けられ得る。ナノボディのヒト化及び/又はラクダ化、並びに、他の修飾、部分又はフラグメント、誘導体又は「ナノボディ融合物」、多価構築物(リンカー配列のいくつかの非限定的な例を含む)、並びに、ナノボディ及びその調製物の半減期を延長するための様々な修飾をはじめとする、ナノボディのさらなる記載が、例えば国際公開公報第07/104529号に見い出され得る。

0062

本発明によって提供される免疫グロブリン単一可変ドメインは、好ましくは単離形又は実質的には単離形である。本発明の免疫グロブリン配列はまた、1つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインを含み得るか又は実質的にからなり得、かつ場合によりさらに、1つ以上のさらなるアミノ酸配列(全て場合により1つ以上の適切なリンカーを介して連結されている)を含み得る、本発明のタンパク質又はポリペプチドの一部を形成し得る。例えばであって限定するものではないが、1つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインは、このようなタンパク質又はポリペプチドにおける結合単位として使用され得、これは場合により、結合単位としての役目を果たし得る1つ以上のさらなるアミノ酸配列を含んでいてもよく、よって、それぞれ一価、多価、又は多重特異的な本発明のポリペプチド(全て本明細書に記載されている)をもたらし得る。このようなタンパク質又はポリペプチドはまた、単離形又は実質的に単離形であり得る。従って、本発明によると、免疫グロブリン単一可変ドメインは、上記に概略が示されているような、単一ドメインの形で2つ以上の抗原結合単位を含む構築物を含む。例えば、同じ又は異なる抗原特異性を有する2つ(又はそれ以上)の免疫グロブリン単一可変ドメインを連結させて、例えば、二価三価、又は多価の構築物を形成することができる。2つ以上の特異性を有する免疫グロブリン単一可変ドメインを合わせることによって、二重特異的、三重特異的などの構築物を形成することができる。例えば、本発明によるポリペプチドは、標的Aに対する2つの免疫グロブリン単一可変ドメイン、及び標的Bに対する1つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含み得、これによりそれはAに対しては二価、Bに対しては一価となる。当業者が容易に想定することができるこのような構築物及びその修飾は、本発明によって全て包含される。特定の実施態様において、本発明は、同じ標的抗原内の異なるエピトープに対する少なくとも2つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含む、二重パラトープ構築物に関する。

0063

全てのこれらの分子はまた、「本発明のポリペプチド」とも称され、これは、本発明の
免疫グロブリン配列」又は「免疫グロブリン単一可変ドメイン」と同義語である。

0064

さらに、本明細書において使用される「配列」という用語(例えば、「免疫グロブリン配列」、「抗体配列」、「可変ドメイン配列」、「VHH配列」又は「タンパク質配列」のような用語において使用される)は一般的に、内容からより限定された解釈が必要とされない限り、関連アミノ酸配列、並びに、それをコードする核酸配列又はヌクレオチド配列の両方を含むと理解されるべきである。

0065

本発明の1つの非限定的な実施態様によると、本発明の免疫グロブリン配列、ナノボディ(登録商標)又はポリペプチドはグリコシル化されている。本発明の別の非限定的な実施態様によると、本発明の免疫グロブリン配列、ナノボディ(登録商標)又はポリペプチドはグリコシル化されていない。

0066

5.2抗原への「結合」
本発明は、本明細書において定義されているような抗原、例えばフィンヴィルブランド因子に結合することができる及び/又はそれに対して親和性を有する、免疫グロブリン配列に関する。本発明の脈絡において、特定の抗原に「結合する及び/又はそれに対して親和性を有する」は、例えば、抗体及びそのそれぞれの抗原の脈絡において理解されているような当技術分野における通常の意味を有する。

0067

本発明の特定の実施態様において、「に結合する及び/又はそれに対して親和性を有する」という用語は、免疫グロブリン配列が抗原と特異的に相互作用することを意味し、これは該抗原「に対する」免疫グロブリン配列の同義語として使用される。

0068

「特異性」という用語は、特定の免疫グロブリン配列、抗原結合分子、又は抗原結合タンパク質(例えば、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン、ナノボディ(登録商標)又はポリペプチド)が結合することのできる様々な種類の抗原又は抗原決定基の数を指す。抗原結合タンパク質の特異性は、親和性及び/又は結合力に基づいて決定され得る。抗原と抗原結合タンパク質の解離についての平衡定数(KD)によって示される親和性は、抗原決定基と、抗原結合タンパク質上の抗原結合部位との間の結合強度尺度である:KD値が低いほど、抗原決定基と抗原結合分子との間の結合強度は強くなる(あるいは、親和性はまた、親和性定数(KA)として表わすことができ、これは1/KDである)。当業者には明らかであろうように(例えば、本明細書のさらなる開示に基づいて)、親和性は、対象の特異的抗原に依存して、それ自体公知の方法で決定され得る。結合力は、抗原結合分子(例えば、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン、ナノボディ(登録商標)又はポリペプチド)と関連抗原との間の結合強度の尺度である。結合力は、抗原決定基と、抗原結合分子上のその抗原結合部位との間の親和性、及び、抗原結合分子上に存在する関連結合部位の数の両方に関連する。

0069

典型的には、本発明の免疫グロブリン配列(例えば、本発明のアミノ酸配列、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ナノボディ(登録商標)、及び/又はポリペプチド)は、10−5〜10−12モル/リットル以下、好ましくは10−7〜10−12モル/リットル以下、より好ましくは10−8〜10−12モル/リットルの解離定数(KD)で(すなわち、105〜1012リットル/モル以上、好ましくは107〜1012リットル/モル以上、より好ましくは108〜1012リットル/モルの会合定数(KA)で)、その抗原に結合し、及び/又は、102M−1s−1から約107M−1s−1、好ましくは103M−1s−1から107M−1s−1、より好ましくは104M−1s−1から約107M−1s−1、例えば105M−1s−1から107M−1s−1のkon速度で本明細書に定義されているようなその抗原に結合し;及び/又は、1s−1(t1/2=0.69s)から10−6s−1(数日間のt1/2を有するほぼ不可逆的な複合体を与える)、好ましくは10−2s−1から10−6s−1、より好ましくは10−3s−1から10−6s−1、例えば10−4s−1から10−6s−1のkoff速度で本明細書に定義されているようなその抗原に結合する。

0070

10−4Mを超える任意のKD値(又は104M−1より低い任意のKA値)が、一般的に、非特異的結合を示すと考えられる。

0071

好ましくは、本発明の一価免疫グロブリン配列は、500nM未満、好ましくは200nM未満、より好ましくは10nM未満、例えば500pM未満の親和性で所望の抗原に結合する。

0072

抗原又は抗原決定基への抗原結合タンパク質の特異的結合は、例えばスキャッチャード分析及び/又は競合結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイRIA)、酵素イムノアッセイEIA)及びサンドイッチ競合アッセイをはじめとするそれ自体公知の任意の適切な方法、及び当技術分野においてそれ自体公知であるその様々な変法;並びに、本明細書に記載の他の技術で決定され得る。

0073

解離定数(KD)は、当業者には明らかであるように、実際又は見かけの解離定数であり得る。解離定数を決定する方法は当業者には明らかであり、これには例えば、本明細書に記載の技術が挙げられる。これに関して、10−4モル/リットル又は10−3モル/リットル(例えば10−2モル/リットル)を超える解離定数を測定することは不可能であり得ることも明らかである。場合により、これも当業者には明らかであるように、(実際の又は見かけの)解離定数は、[KD=1/KA]の関係性を用いて、(実際又は見かけの)解離定数(KA)に基づいて計算することができる。

0074

親和性は、分子相互作用の強度又は安定性を示す。親和性は、一般的に、KDすなわち解離定数として示され、その単位はモル/リットル(又はM)である。親和性はまた、1/KDに等しい会合定数KAとしても表すことができ、その単位は(モル/リットル)−1(又はM−1)である。本明細書において、2つの分子(例えば本発明のアミノ酸配列、免疫グロブリン配列、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ナノボディ(登録商標)、又はポリペプチドと、その目的標的との)間の相互作用の安定性は、主に、それらの相互作用のKD値で表され;KA=1/KDの関係性を鑑み、そのKD値による分子相互作用の強度の特定を、対応するKA値を算出するのに使用することも可能であることは、当業者にとって明らかであろう。KD値は、DG=RT.ln(KD)(等しくはDG=−RT.ln(KA))(式中、Rは気体定数に等しく、Tは絶対温度に等しく、lnは自然対数を示す)という周知の関係性により結合自由エネルギー(DG)に関連しているので、KD値は熱力学的意味でも分子相互作用の強度を特徴付ける。

0075

有意(例えば特異的)と判断される、本明細書に定義されているようなvWFと本発明の免疫グロブリン配列との結合などの、生物学的相互作用についてのKDは、典型的には、10−10M(0.1nM)〜10−5M(10000nM)の範囲内である。相互作用が強くなればなるほど、そのKDは小さくなる。

0076

KDはまた、koffとして示される複合体の解離速度定数と、konとして示されるその会合速度の比として表すことができる(よって、KD=koff/kon、及びKA=kon/koff)。解離速度koffの単位は、s−1である(sは秒のSI単位表記である)。会合速度konの単位は、M−1s−1である。

0077

本発明の免疫グロブリン配列に関しては、会合速度は102M−1s−1から約107M−1s−1の間で変動し得、二分子間相互作用に関する拡散律速会合速度定数近似し得る。解離速度は、t1/2=ln(2)/koffの関係性から所与の分子相互作用の半減期に関連する。本発明の免疫グロブリン配列の解離速度は、10−6s−1(t1/2が数日間であるほぼ不可逆的な複合体)〜1s−1(t1/2=0.69s)の間で変動し得る。

0078

2つの分子間の分子相互作用の親和性は、それ自体が公知の様々な技術、例えば周知の表面プラズモン共鳴(SPR)バイオセンサー技術(例えば、Ober et al., Intern. Immunology, 13, 1551-1559, 2001を参照)を介して測定することができる(該技術では、1つの分子をバイオセンサーチップ上に固定し、他の分子をフロー条件下で固定された分子上を通過させ、kon、koffの測定値、従ってKD(又はKA)値を得る)。これは、例えば、周知のビアコア機器を使用して実施することができる。

0079

測定プロセスが、例えばバイオセンサー上への1つの分子のコーティングに関連したアーチファクトによって、示唆される分子の固有結合親和性に何らかの影響を及ぼす場合には、測定されたKDは見かけのKDに相当し得ることも、当業者には明らかであろう。また、1つの分子が他の分子に対する1つ以上の認識部位を含有する場合にも、見かけのKDが測定され得る。このような状況においては、測定された親和性が、2つの分子による相互作用の結合力によって影響を受ける場合がある。

0080

親和性を評価するために使用され得る別のアプローチは、Friguet et al. (J. Immunol. Methods, 77, 305-19, 1985)の2段階ELISA(酵素結合免疫吸着アッセイ)手順である。この方法により、溶液相の結合平衡の測定が確立され、プラスチックなどの支持体上への分子のうちの1つの吸着に関連する考えられ得るアーチファクトが回避される。

0081

しかし、KDの正確な測定は極めて多大な労力を要する場合があり、結果として2つの分子の結合強度を評価するために、見かけのKD値を求めることが多い。全ての測定が一貫した方法で行なわれている限り(例えばアッセイ条件を一定に維持して)、見かけのKD測定値は真のKDの近似値として使用することができ、従って、本明細書においてKD及び見かけのKDには等しい重要性又は関連性があるとして扱われるべきであることに留置されたい。

0082

最後に、多くの状況において、経験豊富科学者は、いくつかの基準分子と比較して結合親和性を決定するのが好都合であると判断することができることに留置すべきである。例えば、分子Aと分子Bとの間の結合強度を評価するために、例えば、Bに結合することが知られており、かつELISA又はFACS蛍光活性細胞選別)における容易な検出のために、フルオロフォア又は発色団基、又は他の化学的部分、例えばビオチン、或いは他のフォーマット蛍光検出用のフルオロフォア、吸光検出用発色団ストレプトアビジン媒介性ELISA検出用のビオチン)を用いて適切に標識された、基準分子Cを使用することができる。典型的には、基準分子Cを固定濃度に維持し、Bの所与の濃度又は量に対してAの濃度を変化させる。結果として、Aの非存在下でCについて測定されたシグナルが半分となる、IC50値がAの濃度に対応して得られる。基準分子のKDであるKD ref並びに基準分子の総濃度Crefが既知であれば、以下の式:KD=IC50/(1+Cref/KD ref)からA−B相互作用に関する見かけのKDを得ることができる。Cref<<KD refであれば、KD≒IC50であることに留意されたい。IC50の測定が、比較される結合剤に関して一貫して(例えばCrefを一定にして)実施されるのであれば、IC50によって分子相互作用の強度又は安定性を評価することができ、またこの測定値は、本明細書を通じてKD又は見かけのKDと同等であると判断される。

0083

5.3標的抗原
本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインは、vWFに結合及び/又はそれに対して親和性を有する。本発明の脈絡において、「vWF」は、カニクイザルヒヒブタモルモット、ブタ、マウス、及び/又はヒトのvWF、最も好ましくはヒトvWF、すなわち配列番号20又はGenBank登録番号:NP_000543を含むがそれに限定されるわけではない。

0084

5.4免疫グロブリン配列の具体的な実施態様
本発明は、国際公開公報第2004/015425号、国際公開公報第2004/062551号、国際公開公報第2006/074947号、国際公開公報第2006/122825号、国際公開公報第2009/115614号、又は国際公開公報第2011/067160号(全て本出願人名)に開示されている方法に記載の、又はその方法によって得ることのできる免疫グロブリン単一可変ドメインに関する。本発明はまた、これらのアミノ酸配列の最適化変異体を包含する。一般的には、本発明によるアミノ酸配列の「最適化変異体」は、1つ以上の有益な置換、例えば、i)「ヒト化」の程度、ii)化学的安定性、及び/又はiii)発現レベルを増加させる置換などを含む変異体であり;国際公開公報第2006/122825号の実験部に記載のような例えば効力アッセイによって測定される効力は依然として、野生型12A02(国際公開公報第2006/122825号に定義されている)に対して同等(すなわち10%以下の逸脱)、又はこれもまた国際公開公報第2006/122825号において定義されている変異体12A02H1(配列番号19)に対して同等である。好ましくは、12A02の野生型配列と比較して、本発明のアミノ酸配列は、少なくとも1つのこのような置換、好ましくは少なくとも2つのこのような置換、好ましくは少なくとも3つのヒト化置換、好ましくは少なくとも10個のこのようなヒト化置換を含む。

0085

特定の態様において、本発明のアミノ酸配列は、野生型配列12A02と比較して、合計して1〜15、好ましくは2〜14、例えば9〜13、例えば10、11又は12個のアミノ酸置換を含む。記載されているように、これらの差異は好ましくは少なくとも、1つ、好ましくは少なくとも2つ、例えば3つ、4つ、又は5つ、又は10個のヒト化置換を含み、場合により、1つ以上のさらなる置換(例えば、本明細書に記載されているようなさらなる置換(a)〜(c)のいずれか1つ、又はそのいずれか2つ以上の任意の適切な組合せ)を含み得る。ここでも、本明細書の開示に基づいて、場合により僅かな程度の試行錯誤の後に、当業者は、1つ以上のこのような適切なヒト化置換及び/又はさらなる置換(の適切な組合せ)を選択することができるだろう。

0086

本発明は、本明細書に与えられた具体例のいずれかに、又は上記の参考文献によって定義されているような具体例のいずれかに対して非常に類似しているポリペプチド配列を包含する。非常に類似とは、少なくとも90%、例えば95、97、98、又は99%のアミノ酸同一率を意味する。非常に類似しているポリペプチド配列は、それらが由来している配列と同じ機能を有する、すなわち、それらはvWFに結合する、より具体的にはvWFに結合して、vWFと血小板との間の相互作用を阻害する。

0087

特定の実施態様において、本発明は、配列番号1〜19のいずれか1つ、特に配列番号1に非常に類似した配列に関する。しかし、本明細書に定義されているような製剤における各変異体についての配列の安定性が評価されなければならず、本発明は特に、本明細書において定義されているような製剤において安定である変異体又は非常に類似した配列に言及する。

0088

本発明のポリペプチド配列を作製するための方法は幅広く知られており、例えば、組換え発現又は合成が挙げられる。当業者は、適切な発現技術、例えば適切な組換えベクター及び宿主細胞、例えば細菌宿主細胞又は酵母宿主細胞をよく知っている。当業者はまた、適切な精製技術及びプロトコールもよく知っている。

0089

5.5 本発明の製剤
本発明は、安定であり、好ましくは医薬品の調製を含む薬学的用途に適した、vWFに対するポリペプチド、例えば免疫グロブリン単一可変ドメイン(ISVD)、又は、少なくとも1つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドの製剤を提供する。

0090

vWF結合剤、例えばISVDの製剤は、ISVD、凍結保護剤及び/又は凍結乾燥保護剤の役目を果たし得る化合物、並びに緩衝液を含む。製剤のpHは、一般的には、pH5〜7.5である。実施態様によっては、製剤は液体として保存される。他の実施態様において、製剤は液体として調製され、その後、保存前に例えば凍結乾燥又は噴霧乾燥によって乾燥させる。乾燥させた製剤(すなわち凍結乾燥物)は、乾燥化合物、例えばエアゾール又は粉末として使用することができるか、或いは、例えば水、緩衝液、又は他の適切な液体(希釈剤)を使用してその元来の濃度又は別の濃度へと再構成することができる。

0091

vWF結合剤の精製プロセスは、例えば凍結させた液体としての長期保存に適した、及び/又はその後の凍結乾燥(例えばクエン酸/スクロース製剤を使用して)に適した製剤へとvWF結合剤を転換させることを可能とするように設計される。製剤を、特定の濃度のタンパク質、例えばvWF結合剤と共に凍結乾燥させる。その後、凍結乾燥製剤を、必要に応じて適切な希釈剤(例えば水)を用いて再構成して、元来の製剤成分を再度可溶化して所望の濃度に、一般的には、凍結乾燥前の濃度と比較して同じ又はより高い濃度にすることができる。凍結乾燥させた製剤を再構成して、最初に凍結乾燥させた液体の容量と比較して凍結乾燥物に加える希釈剤の量に依存して、元来の濃度(すなわち凍結乾燥前)とは異なる濃度を有する製剤を作製することができる。vWF結合剤の完全性の1つ以上のパラメーターをアッセイすることによって適切な製剤を同定することができる。アッセイされたパラメーターは、一般的には、サイズ排除HPLC(SE−HPLC)による高分子量(HMW)種の比率又は低分子量(LMW)種の比率である。

0092

従って、本発明は、適切な純度によって特徴付けられ、例えば薬学的目的のために必要とされる適切な濃度の製剤を提供する。製剤は、広範囲の濃度、広範囲の保存条件(例えば温度、例えばストレスのかかった条件、例えば高温(例えば+25℃又はそれ以上)、凍結乾燥、振とう、又は他の形態の物理的ストレス)で安定形である、本明細書に定義されているような、ポリペプチド、例えば免疫グロブリン単一可変ドメイン、又は少なくとも1つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドを提供する。

0093

製剤は、水性担体を含む。水性担体は特に緩衝液である。

0094

しかし、本発明はまた、液体製剤のさらなる加工によって得ることのできる製品、例えば凍結製品、凍結乾燥製品、又は噴霧乾燥製品も包含する。再構成時に、これらの固体製品は、本明細書に記載のような液体製剤となり得る(しかしこれに限定されるわけではない)。それ故、その最も広義な意味において、「製剤」という用語は、液体及び固体の両方の製剤を包含する。しかし、固体製剤は、液体製剤から(例えば、凍結、凍結乾燥又は噴霧乾燥によって)得ることができると理解され、従って、本明細書の液体製剤について明記された特色によって規定される様々な特徴を有する。本発明は、例えば凍結乾燥又は噴霧乾燥前の元来の組成物から誘導された組成物に至る再構成を除外しない。

0095

本発明の製剤は、少なくとも1つのvWF結合剤、特に免疫グロブリン単一可変ドメイン、又は、本明細書において定義されているような少なくとも1つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドを含む。特定の実施態様において、該製剤は、配列番号1〜19、好ましくは配列番号1から選択された1つ以上のポリペプチドを含む。該ポリペプチドはさらに、例えば、構築物の半減期を延長することのできる血清アルブミン結合ペプチド又は結合ドメイン(これは、任意の適切な血清アルブミン結合ペプチド又は結合ドメインであり得る)(血清アルブミン結合ペプチド又は結合ドメインを含まない同構築物と比較して)を組み込むことによって半減期が延長され得、特に、出願人による国際公開公報第2008/068280号(及び特に国際公開公報第2009/127691号及び国際公開公報第2011/095545号、どちらも出願人による)に記載の血清アルブミン結合ペプチド、又は血清アルブミン結合免疫グロブリン単一可変ドメイン(例えば血清アルブミン結合ナノボディ;例えば、Alb−1又はヒト化形のAlb−1、例えばAlb−8、それは例えば国際公開公報第06/122787号に言及されている)であり得る。これもまた本発明によって包含される半減期を延長するための代替的な手段は、例えば、当技術分野において広く知られているPEG化(PEG)、例えば部位特異的又はランダムなPEG化、好ましくは部位特異的PEG化を含む。5000を超える、例えば10,000〜200,000、好ましくは20,000〜100,000の範囲の分子量を有するPEGを使用することができる。半減期延長の任意の態様において、本明細書において定義されるポリペプチドの活性は損なわれない、例えば、半減期の延長されていない同ポリペプチドの活性の少なくとも75%、80%、85%、90%、又は95%を保持すると考えられる。活性は、例えば、標的抗原への結合、及び/又はバイオアッセイにおける効力に関連し得る。当業者はまた、選択された半減期延長技術が、それが免疫原性を高めないか又はさらには低下させないという点で適切であることを確認するだろう。

0096

5.5.1緩衝液
本発明の製剤は、クエン酸又はリン酸緩衝液の少なくとも1つから選択された緩衝液、好ましくはクエン酸緩衝液を含む。特定の実施態様において、クエン酸緩衝液は、クエン酸一水和物及びクエン酸三ナトリウム二水和物、例えば0.2154g/Lのクエン酸一水和物及び5.5805g/Lのクエン酸三ナトリウム二水和物を使用して調製される。非限定的な例において融解温度を測定することによって決定したところ、これらの緩衝液は、他の試験した緩衝液と比較してvWF結合剤の安定性を増強する。

0097

本発明による製剤は、5〜200mM、例えば5、7.5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190又は200mM、好ましくは5〜100mM、より好ましくは7.5〜80mM、さらにより好ましくは10〜50の範囲、例えば10、15、20、25又は30mM、最も好ましくは20mMの濃度のクエン酸緩衝液を含み、各値は、場合により±5mMの範囲を包含すると理解される。本発明による製剤は、5〜200mM、例えば5、7.5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、又は200mM、好ましくは5〜80mM、より好ましくは7.5〜60mM、さらにより好ましくは10〜40の範囲、例えば10、15、20、25、又は30mM、最も好ましくは10mMの濃度のリン酸緩衝液を含み得、各値は、場合により±5mMの範囲を包含すると理解される。より低い濃度の緩衝液は、最終浸透圧に対して作用を及ぼし、従って、添加されなければならない場合がある追加の溶質に対して作用を及ぼすと理解されるだろう。

0098

本発明の製剤のpHは5.0〜7.5の範囲内にあり、各値は、±0.2の範囲を包含すると理解される。本発明の製剤についての好ましいpH値の具体例は、5.0、5.5、5.8、6.0、6.2、6.5、6.7、7.0、7.1、7.2、又は7.5、好ましくは6.0〜7.0、より好ましくは6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、又は6.9、例えば6.5のpHを含む非限定的なリストから選択され得、各値は、場合により±0.2の範囲を包含すると理解される。

0099

意外なことに、クエン酸及びリン酸緩衝液は、例えばヒスチジン及びトリス−HCl緩衝液と重なるpH範囲を有するが、安定性を支える。

0100

最も有利なpHは、製剤に含まれる緩衝液に依存するだろう。従って、本発明は、特に、6.5〜7.5の範囲、好ましくは6.9、7.0、7.1、例えば7.1のpHを有する、リン酸緩衝液を含む製剤に関する。

0101

クエン酸緩衝液を含む製剤は、保存及び使用にとって著しく適切であったことが示された。しかし、従来の知恵とは対照的に、クエン酸緩衝液を含む液体製剤は、約6.0のpHで最も安定であり、一方、クエン酸緩衝液を含む凍結乾燥製剤は、約6.5のpHで最も安定であった。従って、本発明は、6.0〜7.0、より好ましくは6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、又は6.9、例えば6.5のpHを有するクエン酸緩衝液を含む製剤に関し、各値は、場合により±0.2の範囲を包含すると理解される。

0102

5.5.2 濃度
本発明の製剤は、臨床用途に適した濃度(患者に使用する前に希釈するための原液に使用される濃度を含む)の、本明細書に定義されているようなvWF結合剤、特に免疫グロブリン単一可変ドメイン、又は少なくとも1つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドを含む。改善された安定化とは別に、本発明の製剤は、より高濃度のvWF結合剤、例えばISVD又はポリペプチドを可能とする。特に、本発明の製剤は、目視顕微鏡、SE−HPLC、及びDLSによって確認したところ、物理学的に安定であり続け、すなわち、濁度及び/又は小粒子の形成がない。高温での長期間におよぶ保存及び繰り返しの凍結解凍サイクルは、これらの製剤におけるvWF結合剤の物理的安定性に影響を及ぼさないようであった。

0103

本発明の製剤における、活性作用物質、例えばvWF結合剤又は本発明のポリペプチドの典型的な濃度は、0.1〜80mg/mL、好ましくは1〜70mg/mL、5〜60mg/mL、7.5〜50mg/mL、又は10〜40mg/mLの範囲、例えば5、7.5、10、12.5、15、17.5、20、25、30、35、40、45、50又は60mg/mL、好ましくは12.5mg/mL、又は10mg/mLの非限定的な濃度の例を含み、各値は、場合により±20%の範囲を包含すると理解される(例えば、10という数値は、場合により8〜12mg/mLの範囲を包含する)。

0104

5.5.3賦形剤
本発明による製剤はまた場合により、1つ以上の賦形剤を含み得る。本明細書において使用される「賦形剤」という用語は、製剤に有益な物理的特性を与える該化合物のための希釈剤、ビヒクル保存剤、凍結乾燥保護剤、結合剤、又は安定化剤として一般的に使用される不活性物質を指す。当業者は、凍結乾燥保護、安定化、防腐などの、製剤において特定の機能を有し得る、薬学的目的に適した賦形剤をよく知っているだろう。一般的に使用される安定化剤及び保存剤は、当業者には周知である(例えば国際公開公報第2010/077422号参照)。これらの組成物に使用され得る薬学的に許容される担体は、イオン交換体アルミナステアリン酸アルミニウムレシチン血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン緩衝物質、例えばリン酸塩、グリシン、ソルビン酸ソルビン酸カリウム飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩、又は電解質、例えば硫酸プロタミンリン酸水素二ナトリウムリン酸水素カリウム塩化ナトリウム亜鉛塩コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウムポリビニルピロリドンセルロースを基剤とした物質ポリエチレングリコールカルボキシメチルセルロースナトリウムポリアクリレートワックスポリエチレンポリオキシプロピレンブロックポリマー、ポリエチレングリコール、及びラノリンを含むがそれに限定されるわけではない。有利な実施態様において、賦形剤は、NaCl、トレハロース、スクロース、マンニトール、又はグリシンからなるリストから選択された1つ以上であり得る。

0105

本発明を理解すれば、当業者は、製剤に添加すべき賦形剤の適切な濃度を容易に決定することができる。例示的な実施態様において、NaClは、10〜500mMの範囲、例えば25、30、40、50、60、70、100、150、250、又は500mM、好ましくは50〜150mM、例えば75又は140mMの濃度を有し、各値は、場合により±5mMの範囲を包含すると理解され;及び/又は、マンニトールは、1〜10%、好ましくは2〜4%、例えば2、3、又は4%(w/w)の濃度を有し、各値は場合により±0.5%の範囲を包含すると理解され;及び/又は、スクロースは、1〜15%、好ましくは2〜12%、又は4〜10%、例えば4、5、6、7、8、又は9%(w/w)、最も好ましくは7%の濃度を有し、各値は、場合により±0.5%の範囲を包含すると理解され;及び/又は、グリシンは、10〜500mMの範囲、例えば25、30、40、50、60、70、75、100、150、250又は500mM、好ましくは50〜400mM、75〜300mM、100〜250mM、例えば140又は200mMの濃度を有し、各値は場合により±5mMの範囲を包含すると理解され;及び/又はトレハロースは、10〜500mMの範囲、例えば25、30、40、50、60、70、75、100、150、250、又は500mM、好ましくは100〜300mM、150〜280mM、例えば160mM又は260mMの濃度を有し、各値は場合により±5mMの範囲を包含すると理解される。

0106

好ましい実施態様において、本発明の任意の態様による製剤は、ヒト血液に対して等張である。等張液血漿と同じ浸透圧を有し、よって被験体の血漿の浸透圧を変化させることなく被験体に静脈内注入することができる。張度は、浸透圧で表わすことができ、これは、理論的な浸透圧、又は好ましくは実験的に決定された浸透圧であり得る。典型的には、浸透圧は、290±60mOsm/kg、好ましくは290±20mOsm/kgの範囲内である。

0107

従って、賦形剤(存在する場合)の選択において、当業者は緩衝液の濃度及び1つ以上の賦形剤の濃度を考慮し、好ましくは、上記に明記された範囲内の浸透圧を有する製剤に到達するだろう。当業者は、浸透圧を推定する計算をよく知っている(例えば国際公開公報第2010/077422号参照)。必要であれば、当業者はまたさらに、製剤の浸透圧を調整するための化合物を含めることができる。例示的な化合物としては、上記の賦形剤、及び/又はソルビトールメチオニンデキストロースイノシトールアルギニン、若しくはアルギニン塩酸塩の1つ以上が挙げられるがそれらに限定されるわけではない。

0108

スクロースを含む製剤が、例えばポリペプチドの保存及び凍結解凍の最中の物理的安定性を維持するのに特に適していることが示された。従って、本発明は、約5〜9%、より好ましくは6〜8%、さらにより好ましくは7%のスクロースを含む製剤に関し、各値は、場合により±0.5%の範囲を包含すると理解される。

0109

本発明の製剤はまた、凍結解凍の最中に本発明のポリペプチドを保護するのに特に有用である化合物も含み得る。このような化合物はまた、凍結乾燥保護剤としても知られ、これは当業者には周知である。具体例としては、糖、例えばスクロース、ソルビトール又はトレハロース;アミノ酸、例えばグルタメート、特にグルタミン酸一ナトリウム、又はヒスチジン;ベタイン硫酸マグネシウム糖アルコールプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、及びその組合せが挙げられるがそれらに限定されるわけではない。本発明を理解することによって、添加されるこのような化合物の必要量は、液体型及び凍結乾燥を受ける時の製剤の安定性を考慮して当業者によって容易に決定され得る。凍結乾燥に特に適した製剤はさらに、増量剤を含み得る。適切な作用物質は、当業者には広く知られている。スクロースを含む製剤は、vWF結合剤の保存及び凍結解凍の最中の物理的安定性を維持するのに特に適しているだけでなく、凍結乾燥保護剤としても適していたことが示された。

0110

5.5.4洗浄剤
本発明のさらなる実施態様において、本発明の任意の態様による製剤はさらに、洗浄剤又は界面活性剤を含み得る。本発明に使用するのに適切な洗浄剤又は界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、例えばポリソルベート−20、−40、−60、−65、−80、又は−85が挙げられるがそれらに限定されるわけではない。ポリソルベートに対する一般的な商標名としては、Alkest、Canarcel、及びTweenが挙げられる。当業者は、例えば国際公開公報第2010/077422号に列挙されているような、洗浄剤のさらなる非限定的な例を知っている。好ましい実施態様において、洗浄剤は非イオン性洗浄剤である。より具体的には、洗浄剤はポリソルベート−80(本明細書において以後Tween−80とも称される)である。当業者は、本発明の製剤に対する洗浄剤の適切な濃度を容易に決定することができる。典型的には、濃度は、製剤化されたvWF結合剤の凝集を減少させる剪断ストレス、例えば撹拌ストレス条件下で、洗浄剤の有益な効果、例えば安定化作用を維持しつつ、できるだけ低いものであろう。例示的で非限定的な実施態様において、洗浄剤の濃度は、0.001〜0.5%の範囲、例えば0.001%、0.002%、0.003%、0.004%、0.005%、0.01%、0.015%、0.02%、0.025%、0.03%、0.035%、0.04%、0.045%、0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、又は0.5%、好ましくは0.01〜0.05%、より好ましくは0.01〜0.02%、例えば0.01%(v/v)の濃度であり得る。

0111

5.5.5組合せ
本発明の製剤において第5.5.1章〜第5.5.4章に上記された様々な実施態様を、制限なく組み合わせることができる。例えば、上限又は下限として上記に列挙された数値の任意の組合せを使用した数値の範囲が含まれることを意味する。しかし、製剤の好ましい非限定的な例としては、緩衝液がpH約6.5、好ましくは20mMの濃度のクエン酸緩衝液である製剤が挙げられ、該製剤はさらに、好ましくは約7%(w/v)の濃度のスクロースを含み、場合によりさらに、好ましくは0.01%(v/v)の濃度の非イオン性洗浄剤、例えばTween−80を含む。

0112

5.6 さらなる加工
概略が示されているように、上記の製剤のいずれかを、例えば、凍結乾燥、噴霧乾燥、又は凍結、例えばバルク凍結によってさらに加工することができる。得られた加工された製品は、上記に定義されているような、出発液体製剤に由来する特徴を有する。必要であれば、追加の作用物質を、例えば凍結乾燥保護剤などをさらなる加工のために含めることができる。

0113

5.6.1凍結
場合によっては、vWF結合剤を含有する製剤を保存のために凍結させる。従って、該製剤は、このような条件下、例えば凍結解凍(FT)サイクル下で比較的安定であることが望ましい。製剤の適合性を決定する1つの方法は、試料製剤を、少なくとも2回、例えば3回、4回、5回、8回、10回又はそれ以上の凍結(例えば−20℃又は−70℃で)及び解凍(例えば、25℃の水浴中での急速な解凍又は+2℃〜+8℃での緩徐な解凍)サイクルにかけ、元来の製品に対する質量回収率と、FTサイクル後に蓄積したLMW種及び/又はHMW種の存在及び/又は量とを決定し、それを、例えばSE−HPLCによってFT手順前の試料に存在したLMW種又はHMW種の量と比較するというものである。LMW種又はHMW種の増加は、低下した安定性を示す。

0114

5.6.2凍結乾燥
製剤を凍結乾燥後に保存してもよい。それ故、凍結乾燥後の製剤のポリペプチド成分の安定性について製剤を試験することは、製剤の適合性を決定するのに有用である。該方法は、試料製剤を凍結ではなく凍結乾燥し、その元来の容量となるまで再構成し、LMW種及び/又はHMW種の存在について試験することを除いて、凍結について上記したのと類似している。凍結乾燥試料製剤を、凍結乾燥させなかった対応する試料製剤と比較する。対応する試料と比較して凍結乾燥試料中のLMW種又はHMW種の増加は、凍結乾燥試料の低下した安定性を示す。一般的には、凍結乾燥プロトコールは、試料を凍結乾燥器(lyophilizer)又は凍結乾燥器(freeze-dryer)にローディング予備冷却期間、凍結、真空開始、1回目乾燥温度まで上昇、1回目の乾燥、2回目の乾燥温度まで上昇、2回目の乾燥、及び試料に栓をすることを含む。凍結乾燥のプロセスは当技術分野において周知であるが、様々な因子が、試料の凍結乾燥特徴(ガラス転移温度(Tg’)及び崩壊温度(Tc)を含む)を決める。凍結乾燥プロトコールのために選択され得るさらなるパラメーターとしては、真空(例えばミクロン単位)及び冷却器の温度が挙げられる。

0115

適切な温度の上昇速度は、約0.1℃/分〜2℃/分、例えば0.1℃/分〜1.0℃/分、0.1℃/分〜0.5℃/分、0.2℃/分〜0.5℃/分、0.1℃/分、0.2℃/分、0.3℃/分、0.4℃/分、0.5℃/分、0.6℃/分、0.7℃/分、0.8℃/分、0.9℃/分、及び1.0℃/分である。凍結乾燥サイクルにおける凍結中の適切な棚温度は、一般的に、約−55℃〜−5℃、−25℃〜−5℃、−20℃〜−5℃、−15℃〜−5℃、−10℃〜−5℃、−10℃、−11℃、−12℃、−13℃、−14℃、−15℃、−16℃、−17℃、−18℃、−19℃、−20℃、−21℃、−22℃、−23℃、−24℃、又は−25℃である。棚温度は、1回目の乾燥と2回目の乾燥で異なり得、例えば、1回目の乾燥は、2回目の乾燥より低い温度で行なうことができる。非限定的な例において、1回目の乾燥は0℃で又は代替的には+5℃で、2回目の乾燥は+25℃で実施することができる。場合によっては、凍結の最中及び真空開始前アニーリングプロトコールを使用する。このような場合、アニーリング温度を選択しなければならず、温度は一般的に組成物のガラス転移温度より高い。一般的に、アニーリング時間は、約2〜20時間、約3〜19時間、約2〜10時間、約3〜5時間、約3〜4時間、約2時間、約3時間、約5時間、約8時間、約10時間、約12時間、約15時間、又は約19時間である。アニーリング温度は、一般的に、約−35℃〜約−5℃、例えば約−25℃〜約−8℃、約−20℃〜約−10℃、約−25℃、約−20℃、約−15℃、約0℃、又は約−5℃である。場合によっては、アニーリング温度は、一般的に、−35℃〜+5℃、例えば−25℃〜−8℃、−20℃〜−10℃、−25℃、−20℃、−15℃、0℃、+5℃である。

0116

本明細書に記載の製剤の安定性を、−25℃〜+30℃の1回目の乾燥棚温度、及び0℃〜+30℃の2時間〜33時間の2回目の乾燥期間をはじめとする、様々な凍結乾燥パラメーターを使用して試験することができる。2回目の乾燥温度は、活性医薬成分の分解を引き起こすことのない、できるだけ高温であるべきである。

0117

本発明の製剤に使用される賦形剤は、好ましくは、以下のパラメーターの1つ以上を満たすべきである:薬理学的に不活性である;加工の必要条件に適合できる;患者による十分な耐容性が示される;活性物質を損傷しない;可溶性で吸着可能な製品を与える;常温保存可能な製品を与える;及び、商業的に許容される製品を与える。

0118

1つの実施態様において、本発明の製剤は、例えば図1又は表14に概略が示されているように凍結乾燥によって調製される。

0119

クエン酸/スクロースを基剤とした製剤の凍結乾燥は、vWF結合剤の安定性を劇的に向上させることが実証された。特に、クエン酸/スクロースを基剤とした製剤は、液体型で起こる化学的修飾を実質的に防ぐが、少量のピログルタメートの形成は例外である。意外なことに、クエン酸濃度下げ、同時にスクロース濃度を上昇させることにより、化学的安定性は向上し、例えば、ピログルタメート形成は減少する。vWF結合剤は、極限製品温度まで凍結乾燥させた後も頑強であることが実証された。実際に、安定性プロファイルは、様々な凍結乾燥サイクルを使用して調製された物質において同一であった。

0120

一般的に、凍結乾燥サイクルは、10時間から100時間、例えば20時間から80時間、30時間から70時間、40時間から60時間、45時間から50時間、50時間から66時間行なうことができる。

0121

非限定的な例において、20mMクエン酸、7%スクロース、0.01%Tween−80、pH6.5中12.5mg/mLのタンパク質濃度のvWF結合剤の製剤をバルクで製剤化しかつ凍結乾燥させた。

0122

本発明の製剤の保存のための温度範囲の非限定的な例は、約−20℃〜約+50℃、例えば約−15℃〜約+40℃、約−15℃〜約+30℃、約−15℃〜約+20℃、約+5℃〜約+25℃、約+5℃〜約+20℃、約+5℃〜約+15℃、約+2℃〜約+12℃、約+2℃〜約+10℃、約+2℃〜約+8℃、約+2℃〜約+6℃、又は約+2℃、+3℃、+4℃、+5℃、+6℃、+7℃、+8℃、+10℃、+15℃、+25℃、+30℃、又は+40℃である。保存温度にも関わらず、特定の場合において、試料は、保存中に一過性に起こり得る温度変化、及びこのような組成物について予想され得る輸送条件の下で安定である。

0123

本明細書に定義される本発明の製剤を用いて研究することによって、活性物質の十分な保持及び迅速な溶解に適した粒径を示す、結果として生じる乾燥粉末を得ることが可能であることが確立された。本発明による乾燥製剤は、加工、最終仕上げ、保存、及び施薬を通じて安定かつ均一であり続ける粒子を含む。該製剤は常温保存可能かつさらさらして流動性であり、その最終容器分注されても問題を全く呈さず、患者による投与が簡単である。

0124

5.6.3噴霧乾燥
場合によっては、製剤を噴霧乾燥させ、その後、保存する。噴霧乾燥は、当技術分野において公知の方法を使用して実施され、またこれを改変して、液体又は凍結噴霧乾燥(例えば、Niro Inc. (Madison, WI)、Upperton Particle Technologies (Nottingham, England)、又は米国特許公開公報第2003/0072718号及び第2003/0082276号、又はBuchi (Brinkman Instruments Inc., Westbury, NY)の方法などの方法を使用して)を使用することができる。

0125

5.6.4希釈剤
本明細書に記載の凍結乾燥製剤は、必要に応じて、凍結乾燥型を適切な希釈剤と混合して、元来の製剤成分を所望の濃度まで再度可溶化することによって再構成され得る。本明細書において使用される「希釈剤」という用語は、本明細書に記載のような適切な濃度に変化又は到達するための、薬学的に許容される(ヒトへの投与に対して安全かつ無毒性である)溶媒を指す。例示的な希釈剤としては、滅菌水(例えば注射用水、ミリQ水)、食塩水、ブドウ糖、デキストロース、リンガー液、及び水性緩衝溶液が挙げられるがそれらに限定されるわけではない。

0126

5.7医薬組成物
本発明の製剤は、好ましくは、動物又はヒトの生体治療法に使用するのに適している。従って、本発明は、本発明の任意の態様に記載の又は本発明の任意の方法若しくはプロセスによって得ることのできるポリペプチド製剤を含む、医薬組成物又は診断用組成物に関する。

0127

本発明の製剤は、好ましくは、医薬製剤である。特に、該製剤は、ヒトへの非経口投与、例えば皮下、静脈内、筋肉内、皮内、又は腹腔内投与、好ましくは静脈内又は皮下投与に適している。投与は、液体製剤を投与するあらゆる方法、特に注射を包含する。例えば埋め込み可能な器具微量注入ポンプ(場合により埋め込み可能)、及び/又は(埋め込み可能な)持続放出製剤、例えば沈着物ゲル生分解性ポリマー製剤を介した他の形態の全身投与も本発明の範囲内である。医薬組成物は、製造中及び保存中に無菌かつ安定である。なぜなら、vWF結合剤の誘導体/分解産物は臨床の場では望ましくないからである。該組成物はまた高純度であり、例えば、細菌の産生物、例えばLPSの存在が排除される。該製剤を、任意の適切な手段、例えば滅菌ろ過放射線照射、及びその組合せなどによって滅菌することができる。好ましくは、医薬組成物を、非経口投与(特に静脈内、動脈内、又は経皮)に適応させる。静脈内投与が特に重要であると考えられる。好ましくは、vWF結合剤は、非経口剤形、最も好ましくは静脈内剤形及び皮下剤形である。

0128

医薬製剤として適切であるために、本発明の製剤は、典型的には、適切な容量比の本発明のポリペプチド(すなわち活性作用物質)を含む。例えば、皮下注射のための活性作用物質の濃度は、静脈内注射用の製剤と比較して、より少ない容量で必要な薬学的用量を投与できるように、より高濃度であり得る。しかし、実施態様によっては、活性作用物質の濃度は、皮下又は静脈内注射と同一であり、本明細書に定義されているような例示的な範囲内であり得る。

0129

実施態様によっては、本発明の製剤は、追加の作用物質、例えば追加の活性作用物質、賦形剤、安定化剤、保存剤、例えば抗菌剤などを含み得る。

0130

本発明の製剤は、好ましくは、それを必要とする患者に適用される投与量である。それにも関わらず、特定の投与形態及び投与量は、患者の個別事項、特に年令、体重、生活習慣活動レベル、及び全身病状を必要に応じて考慮に入れながら、担当医師によって選択され得る。より具体的には、ALX−0081は、24時間の投与間隔で静脈内又は皮下に投与される。さらにより好ましくは、ALX−0081は、例えばRIPA、すなわちリストセチン誘導血小板凝集(Favaloro EJ. Clin Haematol 2001; 14: 299-319)及び/又はリストセチンコファクター血小板凝集アッセイ(Howard MA, Firkin BG. Ristocetin - a new tool in the investigation of platelet aggregation. Thrombosis et Diathesis Haemorrhagica 1971; 26: 362-9)によって測定される凝集活性を考慮して、24時間投与間隔で静脈内又は皮下に投与される。例えば、凝集活性がその後の6時間の間に、RIPAによって測定したところ10%以下に留まっている又はRICOによって測定したところ20%以下に留まっていると推定される場合には(臨床的に関連した阻害)、さらなる用量を投与しない。

0131

しかし、一般的にvWF結合剤の用量は、様々な因子、例えば活性成分の有効性及び作用持続時間、温血種、並びに/又は温血動物性別年齢、体重及び個々の状態に依存し得る。

0132

通常、用量は、1回量のvWF結合剤が、例えば、インビトロの結果に基づいて、又はカニクイザルにおける亜慢性毒性を試験する用量漸増試験の結果に基づいて推定されるようなものである。このような前臨床データセットに基づいて、vWF結合剤についての開始用量及びその後の漸増用量を決定することができる。例えば、用量は、0.5〜50mg、特に1〜30mgであり、体重が約75(+/−30)kgである温血動物に投与される(しかし、同様にこの標準とは異なっていてもよい)。所望であれば、この用量はまた、いくつかの、場合により均等な分割用量で摂取してもよい(「mg」は処置しようとする哺乳動物(ヒトを含む)1体あたりの薬物のmgを意味する)。

0133

上記の用量(1回量として投与されるか(これは1つの実施態様である)又は何回かの分割用量で投与されるかのいずれかである)は、例えば6時間毎に1回、12時間毎に1回、又は1日1回、上記のように繰り返され得る。換言すれば、医薬組成物は、連続6時間の療法からより長期の間隔をあけた投与療法までの処方計画で投与されてもよい。

0134

好ましくは、vWF結合剤は、本明細書においてALX−0081について示唆されているようにPCIを必要とする患者における補助的処置に使用されるのと同じ桁の用量で投与される。例えば、好ましい12A02H1を含有するvWF結合剤、例えばALX−0081及びその機能的変異体について、約0.5〜約40mg、好ましくは約1〜約35mg、又は約2〜約30mg、さらにより好ましくは約3〜約25mg、又は約4〜約20mg、又は約5〜約17.5mg、又はさらには約6〜約16mg、又は約7.5〜約15mg、又はさらには約10〜約14mgの範囲、より好ましくは約10、約12.5又は約13.8mgのvWF結合剤の用量が、ヒト患者における急性処置に使用され得る。

0135

1回量単位剤形の製剤は、好ましくは、約0.5〜約40mg、好ましくは約1〜約35mg、又は約2〜約30mg、さらにより好ましくは約3〜約25mg、又は約4〜約20mg、又は約5〜約17.5mg、又はさらには約6〜約16mg、又は約7.5〜約15mg、又はさらには約10〜約14mg、より好ましくは約10、約12.5、又は約13.8mgの活性成分を含み、1回量単位剤形ではない製剤は、好ましくは、約0.5〜約40mg、好ましくは約1〜約35mg、又は約2〜約30mg、さらにより好ましくは約3〜約25mg、又は約4〜約20mg、又は約5〜約17.5mg、又はさらには約6〜約16mg、又は約7.5〜約15mg、又はさらには約10〜約14mg、より好ましくは約10、約12.5、又は約13.8mgの活性成分を含む。

0136

非経口投与用の医薬調製物は、例えば、アンプルなどの単位投与剤形のものである。それらは、それ自体が公知の方法で、例えば、慣用的な混合、溶解、又は凍結乾燥プロセスによって調製される。

0137

非経口製剤は、PCIの部位などで様々な点で、動脈内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内、皮内、皮下、又は好ましくは静脈内で効果的である、特に注射液である。このような液体は、好ましくは、使用前に、例えば、活性成分を単独で又は薬学的に許容される担体と一緒に含む凍結乾燥させた調製物又は濃縮物から調製することのできる、等張水溶液又は懸濁液である。医薬調製物は滅菌されていてもよく、並びに/又は、例えば保存剤、安定化剤、湿潤剤、及び/又は乳化剤可溶化剤、浸透圧を調節するための塩、及び/又は緩衝液などの補助剤を含んでいてもよい。

0138

経皮適用に適した製剤は、有効量の活性成分を担体と共に含む。有利な担体としては、宿主の皮膚を通過するのを助ける吸収可能な薬理学的に許容される溶媒が挙げられる。特徴的には、経皮デバイス(device)は、裏当て部分(backing member)と、場合により担体と共に化合物を含有するレザバーと、場合により予め定められた制御速度で長期間にわたって活性成分を宿主の皮膚へ送達する速度制御バリアーと、該デバイスを皮膚に固定するための手段とを含む包帯の形態である。

0139

以下の表は、本発明のクエン酸緩衝液及びリン酸緩衝液を基剤とした製剤のいくつかの非限定的な例を提供する。全ての製剤を、所望であれば適切な賦形剤を添加することによって290±60mOsm/kgの浸透圧へと調整することができる。製剤は、本発明のポリペプチドのいずれか1つ以上、例えば配列番号1〜19、特に配列番号1を含むことができる。

0140

0141

この表中の緩衝液の濃度は、場合により±5mMを包含することが理解される。pH値は、場合により±0.2を包含することが理解される。上記の各々の緩衝液は、例えば25、30、40、50、60、70、100、150、250、又は500mMの濃度の例えばNaCl;例えば2、3又は4%(w/v)の濃度のマンニトール;例えば25、30、40、50、60、70、100、150、250、又は500mMの濃度のグリシン;例えば25、30、40、50、60、70、100、150、250、又は500mM^の濃度のトレハロース、及び例えば4、5、6、7、8、又は9%(w/v)の濃度のスクロース、及び/又は0.001%、0.002%、0.003%、0.004%、0.005%、0.01%、0.015%、0.02%、0.025%、0.03%、0.035%、0.04%、0.045%、0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、又は0.5%(v/v)の濃度の界面活性剤、例えばTween−80から選択された1つ以上の賦形剤と組み合わせることができる。

0142

5.8 本発明の効果
本発明は、vWF結合剤、例えば本明細書に定義されているような免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えば配列番号1〜19、特に配列番号1の安定な製剤を提供する。「安定な」は、一般的に、免疫グロブリン単一可変ドメインが、長期間、例えば1か月〜36か月間保存した時に、たとえ、1つ以上の化学的若しくは物理的ストレス、例えば高温(+25℃であるかそれ以上)、又は物理的ストレス、例えば振とう若しくは撹拌に曝されたとしても、有意な物理的又は化学的変化を被らないことを意味する。より特定すると、「安定な」は、(定義されているような)条件下で(定義されているような)長期間かけて保存した場合に、本発明のポリペプチドの1つ以上の分解産物、例えば低分子量(LMW)誘導体(フラグメント);及び/又は、化学的誘導体若しくは改変体、例えばピログルタメート変異体;及び/又は、例えば凝集によって形成された高分子量(HMW)誘導体(オリゴマー又はポリマー)の(定義されているような)形成がほんの僅かであることを意味する。

0143

当業者は、タンパク質サイズを評価するための技術、例えばサイズ排除クロマトグラフィー−HPLC、又は化学的誘導体の形成を評価するための技術、例えば逆相HPLCをよく知っている。当業者はまた、このような分析を実施するための一般的に使用される装置及びソフトウェアツールもよく知っている。例えば、当業者は、例えば相対的ピーク面積の点からクロマトグラフィーの実行を分析するための一般的に使用されるソフトウェアを知っている。例としては、ChemStationソフトウェアの具備されたAgilent 1200 HPLCシステム(Agilent Technologies, Palo Alto, USA, Rev B)又はChromeleonソフトウェアの具備されたDionex Ultimate 3000 HPLCシステム(Dionex Corporation, Sunnyvale, CA, USA, V6.8)が挙げられる。

0144

タンパク質、例えば免疫グロブリン単一可変ドメインの安定性を評価するために使用することのできる一般的な技術としては、静的光散乱タンジェンシャルフローろ過、フーリエ変換赤外分光法円二色性尿素誘起タンパク質アンフォールディング、内因性トリプトファン蛍光、及び/又は1−アニリン−8−ナフタレンスルホン酸タンパク質結合が挙げられる。さらに、本発明の製剤は、保存の経過中、及び/又は本明細書に定義されているような1つ以上のストレスの影響下で殆ど又は全く効力/生物学的活性の減少を示さない。生物学的活性及び/又は効力は、例えば国際公開公報第2006/122825号に記載のように決定することができる。

0145

5.8.1 熱的安定性
本発明の製剤は、vWF結合剤、例えば本明細書に定義されているような免疫グロブリン単一可変ドメインの高熱安定性をもたらすことによって特徴付けられる。熱安定性は、例えば、融解温度(Tm)を決定することによって評価することができる。融解温度を決定するために適切な技術は公知であり、これには例えば本明細書に記載のような例えばサーマルシフトアッセイ(TSA)が挙げられる。より具体的には、本発明の製剤は、他の製剤と比較して、TSAによって決定されるような免疫グロブリン単一可変ドメインのTmの上昇をもたらす。この効果は、実験章の表1に例示されている。

0146

実験章から確認することができるように、高い熱的安定性、すなわち高いTmは、保存に対する安定性の指標として捉えることができる。

0147

本発明によると、本発明の製剤は、幅広い範囲のpH値におよび、例えばクエン酸緩衝液では6.0〜7.0、及びリン酸緩衝液では6.5〜7.5におよびTmに対してプラスの影響を及ぼす。Tmに対する最も有益な効果は、pH6〜7、特にpH6.5±0.2のクエン酸緩衝液、及びpH6.5〜7.5、特にpH7.1±0.2のリン酸緩衝液について観察され得る。

0148

賦形剤の添加は、Tmに対してさらなる正又は負の効果を及ぼし得る(表1)。例えば、トレハロースは、(特定の緩衝液の脈絡において)例えば150mM〜300mMの間でTmを上昇させることができる。また、マンニトール又はスクロースも、Tmに対して明確に正の効果を及ぼした。これらの賦形剤は、本発明の特定の実施態様において、例えば増量剤又は凍結乾燥保護剤が有益である製剤において用途を見出し得る。これらの例示的な実施態様は、単独で又はマンニトール若しくはスクロースと組み合わせて、さらに公知の凍結乾燥保護剤又は増量剤の使用を排除しない。

0149

本明細書の実験章によって証明されているように、TSAによって決定されるようなTmは、vWF結合剤、例えば本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインの安定性の価値ある指標としての役目を果たす。

0150

5.8.2機械的ストレスに対する安定性
本発明の製剤は、撹拌、振とう又は剪断ストレスなどの機械的ストレスに対する高い安定性によって特徴付けられる。機械的ストレス下での安定性を評価するための可能なアッセイは、分光蛍光光度計での500nmの散乱シグナルのモニタリング又は例えば340nmでのUV分光光度法を介してである。散乱又はUV吸収度の増加は、凝集体の形成を反映する。凝集体が形成されると(HMW)、経時的な増加は線形曲線を描き、その勾配(散乱強度/時間、又は吸光度単位/秒)を決定することができる。好ましくは、本発明の製剤は、0.0006未満、例えば0.0005未満、例えば0〜0.0004の勾配によって特徴付けられる(図4A及びB参照)。

0151

クエン酸緩衝液を含む製剤が特に好ましく、例えば上記に定義されているような撹拌後のタンパク質回収率に対して正の効果を及ぼす。例えば、質量回収率は、少なくとも90%、95%、98%、又は100%である。タンパク質回収率は、例えば撹拌によって試料にストレスをかける前のタンパク質総含量と比較して決定される。リン酸緩衝液を含む製剤により、上記に定義されているような撹拌後に少なくとも75%、80%、85%、又はさらにはそれ以上の回収率がもたらされる。

0152

5mg/mLという例示的であって非限定的な濃度においては、本発明の製剤は、Tweenの非存在下における撹拌に応答して可逆的な凝集体を形成するだけである。従って、本発明の製剤は、機械的なストレス下で不可逆的な凝集体の形成を防ぐ。従って、本発明のさらなる実施態様において、本発明の製剤は、例えば上記に定義されているような濃度の、例えば0.01%〜0.02%(v/v)の濃度の、上記に定義されているような非イオン性洗浄剤、例えばTween−80を含み得る。洗浄剤の添加はさらに、製剤の物理的安定性を向上させることができる。例えば、5mg/mLという非限定的な例示的な濃度において、洗浄剤の添加は、例えば分光蛍光光度計での500nmの散乱シグナルのモニタリング又はUV分光光度法(340nm)によって決定されるような(可逆的及び不可逆的な)凝集体の形成を防ぐことができる(図4A及びB)。

0153

本発明の製剤の物理的安定性を、SE−HPLCによっても実証することができる。本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインの種々の非限定的な製剤は、オリゴマー(HMW)又は分解産物(LMW)を形成することなく、機械的ストレス、例えば撹拌ストレスに耐えることができる。本発明の製剤は、SE−HPLC分析によって1.5時間撹拌した後に決定されるように、分解又はオリゴマー化を伴うことなく安定であり続ける。

0154

どの製剤においても、オリゴマー化又は分解(例えばRP−HPLC(分解のみ)又はSE−HPLCプロファイルによって決定されるような)は全く検出されない。従って、本発明の好ましい実施態様によると、該製剤はクエン酸緩衝液を含み、例えば上記されているような条件下で、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、又はさらには約100%の回収率を示し、回収率は、例えば、ストレスをかけていない試料と比較して、RP−HPLC又はSE−HPLCによって決定される。有利には、クエン酸緩衝液の脈絡における賦形剤はスクロースであり得、上記に定義されているような回収率は少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、又はさらには約100%である。

0155

5.8.3液体製剤の安定性試験
5.8.3.1 保存安定性
本発明の液体製剤は、例えば−70℃、−20℃、+5℃、+25℃、又は+40℃の温度で、例えば1〜36か月間、例えば1、1.5、3、6、9、12、18、24、30、又は36か月間保存した場合に良好な安定性を与える。最も有益な結果は、表5に例示されているようなクエン酸緩衝液を基剤とした製剤を用いて得ることができる。

0156

当業者は、+25℃での、より特定すると+40℃での保存は、ストレスのかかった保存条件を示すことをさらに認識しているだろう。このような条件は、不安定性のあらゆる兆候、例えば化学的又は物理的不安定性を増加及び加速すると予想される。従って、例えば+25℃又は+40℃における比較的短期間の保存は、穏やかな条件下(例えば+5℃又は凍結)での長期間の保存安定性についての良い指標を与える。

0157

5.8.3.2タンパク質回収率の観点からの保存安定性
例えば、本発明の製剤は、−70℃〜+40℃の温度で保存した後に少なくとも95%、例えば少なくとも96、97、98、99、又はさらには約100%のタンパク質回収率を与える。タンパク質回収率は、−70℃に保たれた基準試料と比較して、表5に例示されているように、タンパク質を定量する任意の公知の手段によって、例えばRP−HPLC又はSE−HPLCによって決定することができる。これらの結果は、例えば、指定された温度で1か月間、1.5か月間、3か月間、6か月間、9カ月間、12か月間、18か月間、24か月間、30か月間、又はさらには36カ月間の保存後に、観察することができる。

0158

5.8.3.3化学的誘導体/分解産物の観点からの保存安定性
さらに、本発明の製剤は、例えばRP−HPLCによって決定されるようなピークサイズの化学的誘導体、例えばピログルタメート変異体の産生を5.0%未満という最小限とする(表5参照)。このタイプの分析においては、所与のピークの面積を、クロマトグラムの総面積と比較し、相対的面積を各ピークに割り当てる。当業者は、クロマトグラムを分析するための適切な分析手段、例えば適切なソフトウェアを知っている(具体的で非限定的な例としては、ChemStationソフトウェアの具備されたAgilent 1200 HPLCシステム(Agilent Technologies, Palo Alto, USA, Rev B)又はChromeleon ソフトウェアの具備されたDionex Ultimate 3000 HPLCシステム(Dionex Corporation, Sunnyvale, CA, USA, V6.8)が挙げられる)。従って、好ましくは、ピログルタメート変異体は、−70℃〜+40℃、例えば+40℃の温度で保存した時に、例えば上記に定義されているような期間、例えば1か月間保存した後に、RP−HPLCによって決定されるような、5%未満、好ましくは4.6%未満、例えば4.5%未満、4.3%未満、4.2%未満、4.0%未満、又はさらには3.8%未満のピーク面積を与える。

0159

本発明の製剤はまた、−70℃〜+40℃の温度での上記に定義されているような保存期間にわたる、例えば1か月間にわたる、酸化、例えば酸化産物(例えばRP−HPLCによって決定される)の形成を最小限とする(表5参照)。従って、本発明の製剤により、−70℃〜+40℃の温度、例えば+40℃での保存時に、例えば、上記に定義されているような期間、例えば1か月間におよぶ保存後に、3%未満、好ましくは2.7%未満、好ましくは2.5%未満、例えば2.3%未満、2.2%未満、例えば2.0%未満、又はさらには例えば1.7%又は1.5%未満のピーク面積を有する酸化変異体(例えばRP−HPLCによって決定される)が得られる。

0160

5.8.3.4オリゴマー化の観点からの保存安定性
本発明の製剤はまた、−70℃〜+40℃の保存温度で上記に定義されているような保存期間、例えば1か月間の後に、明瞭な可溶性のオリゴマー物質は全く形成されないか(例えばSE−HPLCによって定義される);又は、−70℃〜+40℃の保存温度で、例えば+40℃で上記に定義されているような保存期間、例えば1か月間の後に、1%未満、好ましくは0.5%未満、例えば0.3%の可溶性オリゴマー物質が形成される(例えばSE−HPLCによって定義される)ような、保存安定性を与える。

0161

本発明はまた、−70℃又は+40℃で、上記に定義されているような保存期間、例えば1か月間の保存後に、依然として0.15以下、好ましくは0.1以下である、吸光度値[(100×A340)/(A280−A340)]によって決定されるような凝集係数を与える効果を有する。

0162

5.8.3.5 主産物の回収率に反映されるような保存安定性
本発明の製剤は、例えばRP−HPLC(表5参照)によって決定されるような主産物のピーク面積が、−70℃〜+40℃で上記に示された保存期間後、例えば1か月後に、約90%であるか;又は、例えばRP−HPLC(表5参照)によって決定されるような主産物のピークが、少なくとも85%以上、例えば86%、87%、又は88%であるような効果を有する。より好ましくは、メインピークは、−70℃〜+40℃、例えば+40℃での上記に示された保存期間後、例えば1か月後に、90%、92%又は95%、例えば少なくとも97%、より好ましくは100%であるか;或いは、例えばSE−HPLCによって決定されるような主産物のピークが、−70℃〜+40℃、例えば+40℃での上記に示された保存期間後、例えば1か月後に、少なくとも85%、少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、例えば少なくとも98%又はさらには約100%である。

0163

本発明による製剤はまた、−70℃〜+25℃で1〜3か月間、例えば20mg/mL以下の濃度で保存した後に、RP−HPLCによって決定されるようなメインピーク面積が、保存前の製剤と比較して未変化のままであり、かつ、全ピークの少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%を示すという効果を有し、基準試料は、例えば95%のメインピークを有する。+40℃で1か月間保存すると、本発明の製剤は、少なくとも80%、85%、又は90%;2か月間の保存後には少なくとも80%又は85%、3か月間の保存後には少なくとも75%又は80%のRP−HPLCによって決定されるメインピークを保持する。

0164

さらに、cIEFによって決定されるように、本発明の製剤は、−70℃〜+40℃の温度で1〜3か月間、例えば20mg/mL以下の濃度で保存した後、基準試料(保存されていない製剤、メインピークは少なくとも98%である)と同等な主産物の回収率をもたらす効果を有し、例えばメインピークは少なくとも85%以上、例えば86%、87%、又は88%である。より好ましくは、メインピークは、−70℃〜+40℃での保存後に、90%、92%、又は95%、例えば少なくとも97%、より好ましくは100%である。

0165

5.8.3.6凍結解凍条件下の安定性
経時的に一定に保たれているか(例えば+5℃で保存)又は1回のFTサイクル(例えば−20℃又は−70℃で保存)を含む保存条件下において製剤の安定性を与えることとは別に、本発明のさらなる効果は、反復FTサイクル条件下での安定性である。凍結状態から液体状態への転移及びその逆は、免疫グロブリン単一可変ドメインに対して特にストレスの多い条件を課す

0166

本発明の製剤はまた、FT条件下で良好な安定性を与える効果も有する。例えば、本発明の製剤は、−70℃と室温(例えば+25℃)との間の、又は−20℃と室温との間の例えば10回のFTサイクルにかけることができる。該製剤に含まれる免疫グロブリン単一可変ドメインは、例えばRP−HPLC又はSE−HPLCによって確認されるように、有意な劣化を伴うことなく、これらの条件に耐えるだろう。本発明の製剤の種々の非限定的な実施態様に対する反復FTサイクルの作用を評価し、全ての場合において、vWF結合剤、例えば免疫グロブリン単一可変ドメインの化学的及び物理的完全性が保存されたことが判明した。全回収率は95〜100%の範囲内、好ましくは少なくとも95、98又は99%であった。種々のピークの相対的な比率は、1回だけのFTサイクルにかけられた対照と比較して未変化のままであった。

0167

より具体的には、5mg/mL〜20mg/mLの濃度において、10回のFTサイクルにより回収率を得た(RP−HPLC又はSE−HPLCのいずれかによって決定されるような、例えばポリペプチドのピーク総面積、すなわちAUに基づいて決定され、これは少なくとも90%、95%、98%、又は100%である;特定の実施態様において、RP−HPLC又はSE−HPLCプロファイルは、基準試料と比較して未変化であった(1回のFTサイクル))。

0168

5.8.3.7効力の観点からの安定性
当業者は、vWF結合剤、特に免疫グロブリン単一可変ドメイン、より具体的には配列番号1〜19のいずれか1つ、例えば配列番号1に記載のポリペプチドの効力を決定するための様々な方法を知っている(例えば、国際公開公報第2006/122825号の実験章、例えば実施例3〜6、18、及び19、又は国際公開公報第2009/115614号の実験章を参照)。

0169

1つの実施態様において、本発明のポリペプチドの効力を、慣用的なアッセイ、例えばELISA、ビアコア、RIA、FACSなどによって、その抗原に対する結合によって決定することができる。

0170

vWF結合剤の効力は、ストレスのかかった条件下で、すなわち+40℃で4週間の保存下で試験されたように、本発明の製剤において依然として許容された。

0171

5.8.3.8適合性の観点からの安定性
本発明の製剤はまた、一連の様々な希釈剤と適合性である。例えば、該製剤は、免疫グロブリン単一可変ドメインの化学的及び物理的安定性に影響を及ぼすことなく、このような希釈剤と混合/希釈することができる。

0172

従って、本発明の製剤はまた、本明細書において定義されるような幅広い濃度におよび安定性を与える。

0173

5.8.3.9 安定化効果の要約
本発明の製剤は、−70℃〜+25℃の温度で長期間の保存後でさえ、例えば上記に定義されているような期間の後でさえ、本発明のポリペプチドの化学的及び物理的完全性を維持する効果を有する。

0174

−70℃で1か月間の本明細書に定義されているような免疫グロブリン単一可変ドメイン、特にALX−0081の保存は、どの本発明の製剤についても、特に実験章において試験された非限定的な緩衝液の例についても、その物理化学的特徴に影響を及ぼさなかった。保存は、RP−HPLC、SE−HPLC又はcIEFプロファイルに対して有意な作用を及ぼさなかった。

0175

5.8.4凍結乾燥製剤の安定性試験
さらに、本発明は、特に凍結乾燥にとって有用である、vWF結合剤、例えば本明細書において定義されているような免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えば配列番号1〜19、好ましくは配列番号1の安定な製剤を提供する。本発明の製剤には、凍結乾燥後に改善された溶解度及び改善された保存安定性がもたらされた。

0176

5.8.4.1 保存安定性
本発明の製剤は、凍結乾燥後に、例えば−70℃、−20℃、+5℃、+25℃、又は+40℃の温度で、例えば1〜36か月間、例えば1、1.5、3、6、9、12、18、24、30又は36か月間保存した場合に、良好な安定性を与えることができる。最も有益な結果は、クエン酸緩衝液を基剤とした製剤、例えば実験章に例示されているような製剤3及び7を用いて得ることができる(例えば、良好なケーキ形成、及び眼に見え崩壊の兆候なし、図6)。当業者は、以下の考察において、好ましい数値は、例えば表8に例示されているようなクエン酸緩衝液の組成物を反映することを認識することができる。

0177

当業者はまた、+25℃での、より特定すると+40℃での保存は、ストレスのかかった保存条件を示すことを認識しているだろう。このような条件は、不安定性、例えば化学的又は物理的不安定性のあらゆる兆候を増加及び加速すると予想される。従って、例えば+25℃又は+40℃における比較的短期間の保存は、より穏やかな条件下(例えば+5℃又は凍結)でのより長期間の保存安定性に関する良好な指標を与える。

0178

5.8.4.2タンパク質回収率の観点からの保存安定性
例えば、本発明の製剤は、凍結乾燥後に、−70℃〜+40℃の温度で保存した後に、少なくとも95%、例えば少なくとも96、97、98、99、又はさらには約100%のタンパク質回収率を与える。タンパク質回収率は、タンパク質を定量する任意の公知の手段によって、例えば含量、RP−HPLR、又はSE−HPLCによって決定することができる。これらの結果は、例えば、示された温度で1〜36か月間、例えば1、1.5、3、6、9、12、18、24、30、又は36か月間保存した後に観察することができる。

0179

5.8.4.3化学的誘導体/分解産物の観点からの保存安定性
さらに、本発明の製剤は、例えばSE−HPLCによって確認されているように、凍結乾燥後に化学的誘導体の産生を防止及び最小限とし得る。

0180

5.8.4.4オリゴマー化の観点からの保存安定性
本発明の製剤はまた、凍結乾燥後に保存安定性を与えることができ、よって、−70℃〜+40℃の保存温度で、上記に定義されているような保存期間、例えば1か月間の後に明瞭な可溶性のオリゴマー物質は全く形成されないか(例えばSE−HPLCによって定義される);或いは、−70℃〜+40℃、例えば+40℃の保存温度で、上記に定義されているような保存期間、例えば1〜36か月間、例えば1、1.5、3、6、9、12、18、24、30、又は36か月間の保存後に1%未満、好ましくは0.5%未満、例えば0.3%の可溶性オリゴマー物質が形成される(例えばSE−HPLCによって定義される)。

0181

5.8.4.5 主産物の回収率において反映されるような保存安定性
本発明の製剤はまた、凍結乾燥後に、例えばSE−HPLC(表18及び表27〜29参照)によって決定されるような、主産物のピークは、−70℃〜+40℃で上記に示されているような保存期間後、例えば1、3、6、9、12、18、又は24か月間の保存後に約100%であるか;或いは、例えばSE−HPLC(表18及び表27〜29参照)によって決定されるような、主産物のピークは、少なくとも85%以上、例えば86%、87%、又は88%であるという効果を有し得る。より好ましくは、メインピークは、−70℃〜+40℃、例えば+25℃での上記に示されているような保存期間後、例えば1、3、6、9、12、18、又は24か月間の後に、90%、92%、又は95%、例えば少なくとも97%、より好ましくは100%であるか;或いは、例えばSE−HPLCによって決定されるような、主産物のピークは、−70℃〜+40℃で、例えば+40℃で、上記に示されているような保存期間後、例えば1、3、6、9、12、18、又は24か月間の保存後に、少なくとも85%、少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、例えば少なくとも98%、又はさらには約100%である。

0182

本発明による製剤はまた、凍結乾燥後、例えば−70℃〜+40℃で12.5mg/mLの濃度で1〜12か月間保存した後の、RP−HPLCによって決定されるようなメインピークは、保存前の製剤と比較して未変化のままであり、かつ、全ピークの少なくとも90%、より好ましくは少なくとも93%を示すという作用を有し、基準試料は、例えば93%のメインピークを有する(表15参照)。凍結乾燥後に+40℃で12か月間まで保存した場合に、本発明の製剤は、RP−HPLCによって決定されるように少なくとも91%、92%又は93%のメインピークを保持する。

0183

さらに、cIEF(表27〜29参照)によって決定されるように、本発明の製剤は、凍結乾燥後、−70℃〜+40℃の温度で例えば12.7mg/mLの濃度で1〜24か月間保存した後に、基準試料(保存されていない製剤、メインピークは少なくとも96%である)に匹敵する、主産物の回収率を与えるという効果を有し、例えばメインピークは少なくとも85%以上、例えば86%、87%、又は88%である。より好ましくは、メインピークは、−70℃〜+40℃での保存後に、90%、92%、93%、94%、95%、又は96%、例えば少なくとも97%、より好ましくは100%である。

0184

5.8.4.6凍結解凍条件下での安定性
本発明の製剤はまた、FT条件下での凍結乾燥後に良好な安定性を与えるという効果も有する。例えば、本発明の製剤を、例えば、−20℃と室温(例えば+25℃)との間の5回のFTサイクルにかけることができる。該製剤に含まれる免疫グロブリン単一可変ドメインは、例えばRP−HPLC又はSE−HPLCによって確認されているように、有意な劣化を伴うことなく、これらの条件に耐えるだろう。全ての場合において、vWF結合剤、例えば免疫グロブリン単一可変ドメインの化学的及び物理的完全性が保存されている。全回収率は、−70℃で保存された液体対照試料と比較して、95〜100%の範囲内、好ましくは95、98又は99%であった。

0185

より具体的には、16mg/mLの濃度で、5回のFTサイクルにより、RP−HPLC又はSE−HPLCのいずれかによって決定されているように、少なくとも90%、95%、98%、99%又は100%であるポリペプチドの回収率(例えば総面積、すなわちAUに基づいて決定される)が得られ;特定の実施態様において、RP−HPLC又はSE−HPLCプロファイルは、基準試料(−70℃で保存された液体対照試料)と比較して未変化であった(表12参照)。

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