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課題・解決手段

本発明は、親水性スルファサラジン及びヒアルロン酸を含む眼科炎症疾患治療用組成物及びその製造方法に関する。また、本発明は、親水性スルファサラジン及びヒアルロン酸の治療学的有効量を個体に投与する段階を含む、眼科炎症疾患の治療方法に関する。

概要

背景

目は、生活に必要な大部分の情報を受け入れる重要な感覚器官である。目は、外膜中膜内膜及び屈折媒質で構成されるが、外膜は、黒い瞳を覆っている前表面である角膜または結膜とその後につながった強膜からなり、中膜は、虹彩毛様体、そして脈絡膜で構成され、内膜は網膜から成る。水晶体硝子体及び眼房水は屈折媒質に該当する。目の機能的障害または喪失は生活の質を低下させる大きい要因の一つであり、老化、疾患及び視力に良くない影響を与え得るその他の要因のため、目の健康を維持することが重要になっている。

眼球炎症疾患は、充血浮腫、感染、刺激または外傷と関連した疾患を意味する。眼球の構造中、前眼部または外眼部は眼球の前部分及び近接組織を含んでいて、環境に持続的に露出されるため、特に炎症疾患の発生する可能性が高い。

外眼部及び前眼部の炎症性疾患は、角膜炎結膜炎角結膜炎眼球乾燥症候群眼瞼炎強膜炎上強膜炎虹彩炎虹彩毛様体炎、ぶどう膜炎、または手術後の炎症を含む。この中で角結膜炎は、細菌、ウイルスアレルギー、または環境的要因により角膜と結膜に発生する炎症疾患として、最も一般的に発病する眼疾患であり、普通はよく治るが場合によっては致命的であるため、組織損傷による失明をもたらすこともある。このような眼球炎症性疾患の治療方法として現在は、抗ヒスタミン剤グルココルチコイドなどのステロイド剤またはアレルギー予防遮断剤などを使用している。

しかし、眼球炎症疾患を治療するための抗生剤の使用は、感染した細菌に対する殺菌力はあるが、角膜内炎症細胞に対する活性抑制と減少に対する効果は期待しにくいという問題がある。また、ステロイド性抗炎症薬物の場合、長期間使用時、または長期間使用後の使用中断時に、急性副腎機能不全により全身衰弱感、発熱筋肉痛関節痛及び食欲減退などの症状が現れ、細菌、ウイルスなどに対する感染の危険性が増加し、体重が増えて体型が変わり、不眠症を伴いやすいという問題がある。特に、グルココルチコイドの点眼剤または軟膏は、患者の恣意的な判断により長期的に使用する場合、眼圧上昇による緑内障白内障または細菌性感染などの副作用を誘発しやすい。

よって、過去数年間で、眼球炎症疾患の治療及び予防に関する技術が大幅に進歩したが、相変らず眼球炎症疾患を予防及び治療する向上した方法及び組成物が求められている状況である。

本発明においては、眼球炎症疾患の治療のために使用される抗生剤、またはステロイド性抗炎症点眼剤の問題点である角膜上皮細胞の損傷回復力弱化の問題を改善するため、細胞再生が重要な角膜上皮の損傷回復に対する治療剤としてスルファサラジンヒアルロン酸複合点眼剤を開発した。

これと関連し、韓国登録特許第0490286号は、スルファサラジンまたはその水溶性塩活性成分とする、緑内障による網膜の虚血糖尿病性網膜症による網膜損傷、ぶどう膜炎による網膜神経退化などを治療することができる網膜損傷治療用目薬組成物を提供している。

また、韓国登録特許第0894042号は、スルファサラジン−ヒアルロン酸混合物を用いて後発性白内障を抑制することができる組成物を提供している。

しかし、前記特許文献を含めた先行文献のどこにも、親水性スルファサラジン及びヒアルロン酸複合剤眼科炎症疾患、特に外眼部及び前眼部の炎症性疾患の治療に適用する技術が知らされていない。

概要

本発明は、親水性スルファサラジン及びヒアルロン酸を含む眼科炎症疾患治療用組成物及びその製造方法に関する。また、本発明は、親水性スルファサラジン及びヒアルロン酸の治療学的有効量を個体に投与する段階を含む、眼科炎症疾患の治療方法に関する。

目的

本発明の一つの目的は、親水性スルファサラジン及びヒアルロン酸を含む、眼科炎症疾患治療用点眼剤組成物を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

請求項2

前記親水性スルファサラジンは、PEG化(PEGylation)されたスルファサラジンを含むことを特徴とする、請求項1に記載の組成物

請求項3

前記親水性スルファサラジンの濃度が0.005〜0.1%(w/v)であることを特徴とする、請求項1に記載の組成物。

請求項4

前記ヒアルロン酸の濃度が0.01〜0.5%(w/v)であることを特徴とする、請求項1に記載の組成物。

請求項5

水溶液を含む担体をさらに含むことを特徴とする、請求項1に記載の組成物。

請求項6

前記水溶液を含む担体は、蒸溜水リン酸緩衝液平衡塩溶液及び生理食塩水から成る群から選択された1種以上の薬学的に許容される担体であることを特徴とする、請求項5に記載の組成物。

請求項7

塩酸塩化ナトリウム及び塩化カリウムから成る群から選択された1種以上の薬学的に許容される塩をさらに含むことを特徴とする、請求項1に記載の組成物。

請求項8

前記眼科炎症疾患は、外眼部及び前眼部の炎症疾患を含むことを特徴とする、請求項1に記載の組成物。

請求項9

前記眼科炎症疾患は、角膜炎結膜炎角結膜炎、眼科乾燥症候群眼瞼炎強膜炎上強膜炎虹彩炎虹彩毛様体炎、ぶどう膜炎、または手術後の炎症を含むことを特徴とする、請求項8に記載の組成物。

請求項10

前記眼科炎症疾患は、乾燥性角結膜炎またはこれと関連した眼炎症涙液不足による眼炎症、または眼球乾燥症と関連した角結膜上皮障害を含む眼球乾燥関連炎症疾患;外部損傷により発生する角結膜炎、アレルギー性角結膜炎、浮腫と血管を伴う充血がある急慢性非感染性結膜炎、前眼部の非感染性炎症疾患、または眼科手術後の角結膜炎を含む非感染性角結膜炎;またはウイルス性角結膜炎、細菌性角結膜炎、真菌性角結膜炎、クラミジア性角結膜炎、リケッチア角結膜炎、または寄生虫性角結膜炎を含む感染性角結膜炎であることを特徴とする、請求項8に記載の組成物。

請求項11

(a)スルファサラジンを親水化させる段階;及び(b)前記親水化されたスルファサラジンにヒアルロン酸を添加及び混合する段階を含む、請求項1の眼科炎症疾患治療用点眼剤組成物の製造方法。

請求項12

前記(a)段階は、スルファサラジンをPEG化(PEGylation)させる段階を含むことを特徴とする、請求項11に記載の方法。

請求項13

前記スルファサラジンをPEG化させる段階は、スルファサラジンをポリエチレングリコールを含む平衡塩溶液に添加する段階を含むことを特徴とする、請求項12に記載の方法。

請求項14

前記(a)段階は、親水化されたスルファサラジンの濃度が0.005〜0.1%(w/v)となるように調節する段階を含むことを特徴とする、請求項11に記載の方法。

請求項15

前記(b)段階は、ヒアルロン酸の濃度が0.01〜0.5%(w/v)となるように調節する段階を含むことを特徴とする、請求項11に記載の方法。

請求項16

親水性スルファサラジン及びヒアルロン酸の治療学的有効量を個体に投与する段階を含む、眼科炎症疾患の治療方法

技術分野

0001

本発明は、親水性スルファサラジン及びヒアルロン酸を含む眼科炎症疾患治療用組成物及びその製造方法に関する。また、本発明は、親水性スルファサラジン及びヒアルロン酸の治療学的有効量を個体に投与する段階を含む、眼科炎症疾患の治療方法に関する。

背景技術

0002

目は、生活に必要な大部分の情報を受け入れる重要な感覚器官である。目は、外膜中膜内膜及び屈折媒質で構成されるが、外膜は、黒い瞳を覆っている前表面である角膜または結膜とその後につながった強膜からなり、中膜は、虹彩毛様体、そして脈絡膜で構成され、内膜は網膜から成る。水晶体硝子体及び眼房水は屈折媒質に該当する。目の機能的障害または喪失は生活の質を低下させる大きい要因の一つであり、老化、疾患及び視力に良くない影響を与え得るその他の要因のため、目の健康を維持することが重要になっている。

0003

眼球炎症疾患は、充血浮腫、感染、刺激または外傷と関連した疾患を意味する。眼球の構造中、前眼部または外眼部は眼球の前部分及び近接組織を含んでいて、環境に持続的に露出されるため、特に炎症疾患の発生する可能性が高い。

0004

外眼部及び前眼部の炎症性疾患は、角膜炎結膜炎角結膜炎眼球乾燥症候群眼瞼炎強膜炎上強膜炎虹彩炎虹彩毛様体炎、ぶどう膜炎、または手術後の炎症を含む。この中で角結膜炎は、細菌、ウイルスアレルギー、または環境的要因により角膜と結膜に発生する炎症疾患として、最も一般的に発病する眼疾患であり、普通はよく治るが場合によっては致命的であるため、組織損傷による失明をもたらすこともある。このような眼球炎症性疾患の治療方法として現在は、抗ヒスタミン剤グルココルチコイドなどのステロイド剤またはアレルギー予防遮断剤などを使用している。

0005

しかし、眼球炎症疾患を治療するための抗生剤の使用は、感染した細菌に対する殺菌力はあるが、角膜内炎症細胞に対する活性抑制と減少に対する効果は期待しにくいという問題がある。また、ステロイド性抗炎症薬物の場合、長期間使用時、または長期間使用後の使用中断時に、急性副腎機能不全により全身衰弱感、発熱筋肉痛関節痛及び食欲減退などの症状が現れ、細菌、ウイルスなどに対する感染の危険性が増加し、体重が増えて体型が変わり、不眠症を伴いやすいという問題がある。特に、グルココルチコイドの点眼剤または軟膏は、患者の恣意的な判断により長期的に使用する場合、眼圧上昇による緑内障白内障または細菌性感染などの副作用を誘発しやすい。

0006

よって、過去数年間で、眼球炎症疾患の治療及び予防に関する技術が大幅に進歩したが、相変らず眼球炎症疾患を予防及び治療する向上した方法及び組成物が求められている状況である。

0007

本発明においては、眼球炎症疾患の治療のために使用される抗生剤、またはステロイド性抗炎症点眼剤の問題点である角膜上皮細胞の損傷回復力弱化の問題を改善するため、細胞再生が重要な角膜上皮の損傷回復に対する治療剤としてスルファサラジン−ヒアルロン酸複合点眼剤を開発した。

0008

これと関連し、韓国登録特許第0490286号は、スルファサラジンまたはその水溶性塩活性成分とする、緑内障による網膜の虚血糖尿病性網膜症による網膜損傷、ぶどう膜炎による網膜神経退化などを治療することができる網膜損傷治療用目薬組成物を提供している。

0009

また、韓国登録特許第0894042号は、スルファサラジン−ヒアルロン酸混合物を用いて後発性白内障を抑制することができる組成物を提供している。

0010

しかし、前記特許文献を含めた先行文献のどこにも、親水性スルファサラジン及びヒアルロン酸複合剤を眼科炎症疾患、特に外眼部及び前眼部の炎症性疾患の治療に適用する技術が知らされていない。

発明が解決しようとする課題

0011

本発明者らは、角膜炎症動物モデルを用いて親水性スルファサラジン及びヒアルロン酸複合点眼剤の炎症抑制、角膜浮腫抑制効果及び眼球乾燥治療効果を確認して本発明を完成した。

課題を解決するための手段

0012

本発明の一つの目的は、親水性スルファサラジン及びヒアルロン酸を含む、眼科炎症疾患治療用点眼剤組成物を提供することである。

0013

また、本発明は、親水性スルファサラジン及びヒアルロン酸の治療学的有効量を個体に投与する段階を含む、眼科炎症疾患の治療方法を提供することである。

0014

本発明のまた一つの目的は、前記親水性スルファサラジン及びヒアルロン酸を含む、眼科炎症疾患の治療用点眼剤組成物の製造方法を提供することである。

発明の効果

0015

本発明の親水性スルファサラジン及びヒアルロン酸複合点眼剤は、眼科炎症疾患治療剤として、従来の抗生剤またはステロイド性薬物を基盤とした治療剤による副作用の発生を低める非ステロイド性治療剤として安全に使用することができる。

図面の簡単な説明

0016

図1は、親水性スルファサラジン及びヒアルロン酸複合点眼剤の製造過程を示す模式図である。
図2は、角膜上皮細胞に対するスルファサラジンの濃度別ヒアルロン酸複合点眼剤の細胞毒性を示すグラフである。
図3は、ヒアルロン酸(HA0.1%)、可溶化したスルファサラジン(Sulfasalazine0.01%)、または可溶化したスルファサラジン−ヒアルロン酸複合点眼剤(Sulfa−HA0.01%)を角膜炎症動物モデルにそれぞれ投与した後の組織写真マクロファージマーカーであるF4/80抗原に対する組織染色写真とを示す。
図4は、ヒアルロン酸(HA0.1%)、可溶化したスルファサラジン(Sulfasalazine0.1mg/ml)、または可溶化したスルファサラジンの濃度別(0.1mg/mlまたは0.5mg/ml)ヒアルロン酸複合点眼剤を角膜炎症動物モデルにそれぞれ投与した後の角膜浮腫に対する治療効果を示すグラフである。
図5は、ヒアルロン酸(HA0.1%)、可溶化したスルファサラジン(Sulfasalazine0.1mg/ml)、または可溶化したスルファサラジンの濃度別(0.1mg/mlまたは0.5mg/ml)ヒアルロン酸複合点眼剤を角膜炎症動物モデルにそれぞれ投与した後の角膜炎症細胞減少効果を示すグラフである。
図6は、ヒアルロン酸(HA0.1%)、シクロスポリン(Cyclosporine0.05%)、そして可溶化したスルファサラジン−ヒアルロン酸複合点眼剤(Sulfa−HA0.01%)を乾燥性角結膜炎症(Keratoconjunctivitis sicca)動物モデルにそれぞれ投与した後の角膜損傷(黄色に染色された領域)を2%フルオレセイン染色薬で染色した写真である。
図7は、ヒアルロン酸(HA0.1%)、シクロスポリン(Cyclosporine0.05%)、そして可溶化したスルファサラジン−ヒアルロン酸複合点眼剤(Sulfa−HA0.01%)を乾燥性角結膜炎症(Keratoconjunctivitis sicca)動物モデルにそれぞれ投与した後の角膜損傷に対する薬物の効果を数値で示すグラフである。
図8は、ヒアルロン酸(HA0.1%)、シクロスポリン(Cyclosporine0.05%)、そして可溶化したスルファサラジン−ヒアルロン酸複合点眼剤(Sulfa−HA0.01%)を乾燥性角結膜炎症(Keratoconjunctivitis sicca)動物モデルにそれぞれ投与した後の角膜を冷凍切削(cryosection)し、角膜内の炎症細胞を観察するためにヘマトキシリンエオジンで染色した写真である。
図9は、ヒアルロン酸(HA0.1%)、シクロスポリン(Cyclosporine0.05%)、そして可溶化したスルファサラジン−ヒアルロン酸複合点眼剤(Sulfa−HA0.01%)を乾燥性角結膜炎症(Keratoconjunctivitis sicca)動物モデルにそれぞれ投与した後の角膜損傷に対する薬物の効果を数値で示すグラフである。

0017

一つの様態として、本発明は、親水性スルファサラジン及びヒアルロン酸を含む、眼科炎症疾患治療用点眼剤組成物に関する。

0018

また一つの様態として、本発明は、親水性スルファサラジン及びヒアルロン酸の治療学的有効量を個体に投与する段階を含む、眼科炎症疾患治療方法に関する。

0019

本発明において、スルファサラジン(Sulfasalazine)は、スルファピリジン(Sulfapyridine)と5‐アミノサリチル酸(5−aminosalicylic acid、5−ASA)がアゾ結合(azo bond)して形成された化合物を称する。

0020

前記スルファサラジンは、水溶液に対して難溶性のため、薬剤として使用するためには親水性スルファサラジンに可溶化する必要がある。このような親水性スルファサラジンは、スルファサラジンに塩酸塩化ナトリウム、または塩化カリウムなどを添加して酸付加塩またはアルカリ付加塩の形態で得ることができ、より好ましくは、スルファサラジンをPEG化(PEGylation)して得ることができる。

0021

好ましくは、本発明の親水性スルファサラジンは、PEG化されたスルファサラジンを含むことができる。前記PEG化されたスルファサラジンは、スルファサラジンをポリエチレングリコールを含む平衡塩溶液に添加して得ることができる。このような平衡塩溶液は、多様な分子量及び濃度のポリエチレングリコールを含むことができるが、例えば、300〜500、好ましくは380〜420の重量平均分子量を有するポリエチレングリコールを0.1%〜5%(v/v)、好ましくは、1%(v/v)以上の濃度で含むことができる。

0022

本発明において、前記親水性スルファサラジンの濃度は、0.005〜0.1%(w/v)、好ましくは、0.01〜0.05%(w/v)であり得る。前記範囲未満の場合、角結膜炎治療に対する有効な薬効を具現しにくいことがあり、前記濃度範囲超過する場合、角膜上皮細胞に対する毒性が現れることがあるためである。

0023

一方、本発明において、ヒアルロン酸(hyaluronic acid)は、結合組織内の細胞間質に広く分布されて生理条件下で粘着性及び弾力性溶液を形成することにより、虹彩、網膜などの組織、血管内皮細胞上皮細胞などを機械的に保護して緩衝役割を提供するものと知られている、細胞外マトリックスの主要成分である。

0024

本発明において、前記ヒアルロン酸は、物性、形態、大きさなどに制限はなく、無菌処理されたものが好ましいが、より好ましくは、1.0x106〜4.0x106g/モルの重量平均分子量を有するヒアルロン酸を使用することができる。

0025

また、前記ヒアルロン酸は、薬剤学的許容可能な塩の形態で使用されてもよく、前記薬剤学的に許容可能な塩は、ナトリウム塩カリウム塩カルシウム塩などを含み、好ましくはナトリウム塩を含む。

0026

好ましくは、本発明においては、前記ヒアルロン酸の濃度が0.01〜0.5%(w/v)、より好ましくは0.05〜0.2%(w/v)であることが好ましい。前記範囲未満で使用される場合、粘弾性が非常に低くて湿潤及び潤滑作用不適切な問題が発生することがあり、前記範囲を超過する場合、過多な高粘弾性により侵透性に不適切な問題が発生して点眼剤としての適合した流動性を確保しにくいという問題がある。

0027

本発明者らは、韓国登録特許0894042号において、スルファサラジン−ヒアルロン酸混合物を用いて後発性白内障を抑制することができる組成物を提供したことがある。前記先行技術においては、後発性白内障手術時にスルファサラジン−ヒアルロン酸混合物を注入して眼球内ボリュームを維持させなければならないため、2.0%(w/v)の高濃度のヒアルロン酸が混合された高粘弾性組成物で製造する必要があった。

0028

これに反して、本発明においては、スルファサラジン−ヒアルロン酸混合物が眼科炎症疾患の治療に効能を持つことを新たに発見し、眼科炎症疾患治療のための点眼剤組成物として提供するためにヒアルロン酸の濃度を0.01〜0.5%(w/v)に低めてヒアルロン酸が完全に溶解された組成物に製剤化した特徴がある。

0029

本発明において、親水性スルファサラジン及びヒアルロン酸混合物は、眼科炎症疾患の治療、改善及び/または緩和のために使用され得る。

0030

本発明の点眼剤は、薬学的に許容可能な添加剤をさらに含むことができる。前記薬学的に許容可能な添加剤とは、生物体を大きく刺激せず、投与有効成分の生物学的活性及び特性を阻害しない担体または希薄剤を言う。前記薬学的に許容可能な添加剤の例としては、等張化剤緩衝剤、安定剤、pH調節剤などがある。

0031

本発明による点眼剤は、液剤剤形であることが好ましいため、水溶液を含む担体をさらに含むことができる。

0032

前記水溶液を含む担体は、蒸溜水リン酸緩衝液(Phosphate Buffered Saline)、平衡塩溶液(Balanced Salt Solution)及び生理食塩水(Saline)から成る群から選択された1種以上の薬学的に許容される担体を含むことができる。このとき、使用される担体の含量は、製造しようとする点眼液の総用量に必要な量に合わせて使用量を調節することができる。

0033

また、本発明の点眼剤は、薬学的に許容される塩をさらに含むことができる。前記薬学的に許容される塩の具体的な例としては、塩酸、塩化ナトリウム、塩化カリウムまたはこれらの混合物を例示することができる。

0034

本発明において、用語、「投与」は、ある適切な方法で患者に本発明の成分を導入することを意味し、本発明の投与経路は、眼球に局所的に投与することである。本明細書において「治療」とは、発病症状を示す客体に使用されるとき、疾病の進行を中断、遅延または改善させることを意味する。本発明の治療方法は、前記親水性スルファサラジン及びヒアルロン酸を治療学的有効量で投与することを含む。適合した1日の総使用量は、正しい医学判断範囲内で処置医により決定されることは当業者に自明なことである。特定患者に対する具体的な治療学的有効量は、達成しようとする反応の種類と程度、患者の年齢、体重、一般健康状態性別及び食餌、投与時間、治療期間、共に使用される薬物を含めた多様な因子医薬分野でよく知られた類似因子に従って異なるように適用することができる。

0035

本発明において、眼科炎症疾患は、眼球に関連した炎症疾患をすべて含むことができる。前記炎症とは、眼球の充血、浮腫、感染、刺激または外傷と関連した症状を意味することができる。

0036

一例において、本発明の眼科炎症疾患は、外眼部及び前眼部の炎症性疾患を含むことができる。

0037

例えば、前記外眼部及び前眼部の炎症性疾患は、角膜炎、結膜炎、角結膜炎、眼球乾燥症候群、眼瞼炎、強膜炎、上強膜炎、虹彩炎、虹彩毛様体炎、ぶどう膜炎、または手術後の炎症を含むことができる。

0038

他の一例において、本発明の眼科炎症疾患は、角膜、結膜または角結膜に関連した炎症疾患を含むことができ、例えば、次のような疾患を例示することができる:
1)眼球乾燥関連炎症疾患:乾燥性角結膜炎またはこれと関連した眼炎症涙液生成が抑制された患者において涙液不足による眼炎症、または眼球乾燥症と関連した角結膜上皮障害
2)非感染性角結膜炎:外部損傷により発生する角結膜炎(例えば、直接角膜に損傷を被った場合、酸または塩による損傷による場合、火傷による損傷による場合、またはコンタクトレンズ着用による場合など)、アレルギー性角結膜炎(例えば、枯草熱性結膜炎、春季角結膜炎アトピー性角結膜炎フリクテン性角結膜炎、接触性眼瞼炎による結膜炎など)、ひどい浮腫と血管を伴う充血がある急慢性非感染性結膜炎、前眼部の非感染性炎症疾患(例えば、全ぶどう膜炎、上強膜炎、強膜炎)、または眼科手術(例えば、斜視切開術、白内障、緑内障手術)後の角結膜炎、または
3)感染性角結膜炎:ウイルス性角結膜炎、細菌性角結膜炎、真菌性角結膜炎、クラミジア性角結膜炎、リケッチア角結膜炎、または寄生虫性角結膜炎。

0039

また一つの様態として、本発明は、前記親水性スルファサラジン及びヒアルロン酸を含む角結膜炎治療用点眼剤組成物の製造方法に関する。

0040

好ましい様態として、本発明は、
(a)スルファサラジンを親水化させる段階;及び
(b)前記親水化されたスルファサラジンにヒアルロン酸を添加及び混合する段階を含む、角結膜炎治療用点眼剤組成物の製造方法に関するものである。

0041

前記(a)段階は、スルファサラジンを親水化させる段階であり、難溶性化合物を可溶化させるために通常に使用されるものとして知られた方法及び装置を特に制限なく使用することができるが、好ましくは、スルファサラジンをPEG化(PEGylation)させる段階を含んでもよい。

0042

具体的に、スルファサラジンをPEG化させる段階は、スルファサラジンをポリエチレングリコールを含む平衡塩溶液に添加する段階を含むことができる。前記平衡塩溶液に含まれるポリエチレングリコールは、スルファサラジンをPEG化して親水化させることができる。このように、スルファサラジンをPEG化して親水化させると、化学的構造の変更なく水溶性液体として使用することができ、点眼剤として容易に製作することができる。前記スルファサラジン及びポリエチレングリコールに関する具体的な内容は上述した内容のとおりである。

0043

好ましくは、前記(a)段階は、親水化されたスルファサラジンの濃度が0.005〜0.1%(w/v)となるように調節する段階を含むことができる。

0044

前記(b)段階は、前記親水化されたスルファサラジンにヒアルロン酸を添加及び混合する段階であり、親水化されたスルファサラジンが含まれた平衡塩溶液に適切な量のヒアルロン酸を添加して濃度を調節することができ、前記ヒアルロン酸の物性、形態、大きさなどには制限がなく、無菌処理されたものが好ましい。

0045

好ましくは、前記(b)段階は、ヒアルロン酸の濃度が0.01から0.5%(w/v)となるように調節する段階を含むことができる。

0046

また、親水化されたスルファサラジンにヒアルロン酸を混合する段階は、親水化されたスルファサラジン及びヒアルロン酸を20〜35℃で6時間〜24時間混合することが好ましい。前記混合時の温度範囲未満の場合には、点眼剤の成分が均質に混合されないこともあり、前記温度範囲超過の場合には、製剤の安定的な調剤が容易でないため好ましくない。また、前記混合時間範囲未満の場合には、点眼剤の成分が均質に混合しないこともあり、前記時間を超過する場合には、ヒアルロン酸の粘度に変化が生ずることがある。

0047

一方、前記角結膜炎治療用点眼剤組成物の製造方法においては、薬学的に許容される添加剤、担体または塩を添加する段階をさらに含むことができる。このような薬剤学的に許容される担体または塩は、前記角結膜炎治療用点眼剤組成物の製造する過程で特に制限なく添加することができるが、前記親水化されたスルファサラジン及びヒアルロン酸が完全に混合された後に添加することが好ましい。

0048

以下、本発明を実施例により詳しく説明する。但し、下記実施例は、本発明を例示するのみであり、本発明が下記実施例により限定されるものではない。

0049

実施例1.スルファサラジン−ヒアルロン酸複合点眼剤の製造
スルファサラジン(SigmaAldrich社)を30%(w/v)のポリエチレングリコール(分子量400、Sigma Aldrich社)が混合された平衡塩溶液(pH7.4)10mlに5mg/mlの濃度で加えた後、攪拌機で6時間混合してPEG化(Pegylation)して可溶化し、可溶化されたスルファサラジンを製造した。
次に、10mlの平衡塩溶液に0.1%(w/v)のヒアルロン酸パウダー(Sigma Aldrich社)を混合し、スルファサラジンが0.05%(0.5mg/ml)の濃度となるように前記PEG化されたスルファサラジンを含んだ溶液をヒアルロン酸と混合した。スルファサラジンの濃度は、PEG化段階で調節した。すべての溶液が均質化されるように常温で6時間攪拌した。均質化されて透明で澄んだ溶液になると、点眼剤として使用した(図1)。

0050

実施例2.スルファサラジン−ヒアルロン酸複合点眼剤の濃度別角膜上皮細胞毒性確認
角膜上皮細胞に対する細胞毒性を観察するために、人の角膜上皮細胞株(Human corneal epithelial cell line、HCET)を培養し、培養された細胞に対する毒性は、CCKassay(Cell Counting Kit−8、Dojindo molecular technologies、INC)を用いて確認した。
より詳細に、本発明において使用された角膜上皮細胞は、シミアンウイルス40(Simian Virus40)を感染させて作った細胞であるHCET細胞を使用した。本細胞は、日本大阪大医科部のKaoru Araki−Sasaki教授から分譲を受けた。角膜上皮細胞は、5%FBS(Fetal bovine serum)、5mg/mlインシュリン、0.1mg/mlコレラトキシン、10ng/mlhEGF(human epidermal growth factor)及び0.5%DMSO(dimethyl sulfoxide)を添加した細胞培養液MEM:Ham F12=1:1)を使用して5%CO2が維持できる37℃の恒温恒湿器で培養した。本実施例において、角膜上皮細胞(HCET)は6−ウェルプレートに各ウェル当たり2x104(cells/well)で培養した。
上の条件で培養されたHCET細胞の培養24時間後に、スルファサラジン−ヒアルロン酸複合点眼剤をスルファサラジン濃度だけ異なるようにして(0.005〜5.0mg/ml)血清がない培養液に培養液対点眼剤を5:1で処理した。対照群は血清が含まれない培養液を使用した。薬物処理12時間後にCCK assayをして細胞毒性を確認した。
その結果、スルファサラジンヒアルロン酸複合点眼剤は、スルファサラジンの濃度を5mg/ml(0.5%、w/v)まで上げたとき、70%以上の細胞生存率を示した。(図2

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実施例3.スルファサラジン−ヒアルロン酸複合点眼剤の角結膜炎症抑制効果
動物は、ラット(Sprague dawley、300g、male)を使用し、NaOHを用いた化学薬物による角膜損傷モデル(alkali burn)を用いた。3mm paper diskに0.1MのNaOH溶液(50ul)を浸し、角膜を30秒間覆って角膜損傷を誘導した。角膜で、炎症反応は、ヘマトキシリンエオジン染色とF4/80抗原に対する免疫染色を行い確認した。角膜浮腫に対する分析は、角膜上皮細胞層(corneal epithelium)と角膜基質層(corneal stroma)との比で分析した。
角膜損傷後、実施例1において製造して可溶化したスルファサラジン、及びスルファサラジン−ヒアルロン酸点眼剤をそれぞれ一日に二度投与した。対照群はヒアルロン酸0.1%を投与した。
角膜損傷後、3日後に眼球を摘出してパラフィンブロックを作って組織切片を作った後、ヘマトキシリンエオジン染色とマクロファージマーカーであるF4/80抗原で免疫染色を行い観察した結果、対照群(control)においては、角膜の浮腫と炎症細胞の角膜浸透が観察されたが、スルファサラジン−ヒアルロン酸複合点眼剤を投与した群においては浮腫及び炎症細胞の数が減っていた。また、スルファサラジン−ヒアルロン酸複合点眼剤は、ヒアルロン酸と混合されなかった同じ濃度のスルファサラジン溶液より炎症抑制及び浮腫抑制効果に優れていた。(図3
定量的な結果を見ると、正常の角膜上皮細胞(corneal epithelium)と基質層(stroma)との比は4.6±1であったが、角膜炎症誘導後には10±2.5に増加した。スルファサラジン−ヒアルロン酸複合点眼剤を投与した実験群の場合、0.05mg/ml(0.005%)投与群においては7.6±1.8が、0.1mg/ml(0.01%)投与群においては5.6±1.4が観察され、角膜浮腫が抑制されたことを確認することができた。また、0.1mg/ml(0.01%)のスルファサラジン溶液を投与した実験群においては7.1±2.1が観察され、結果的にスルファサラジン−ヒアルロン酸複合点眼剤がヒアルロン酸と混合されなかった同じ濃度のスルファサラジン溶液より角膜浮腫抑制効果に優れていた。(図4
炎症細胞に対する分析は、角膜に存在するマクロファージ(F4/80 positive cells)の数で実施し、結果は、角膜炎症誘導後には31.5±4.9個が観察され、ヒアルロン酸がないスルファサラジン溶液(0.1mg/ml(0.01%))を投与した群においては21.3±5.5個が、スルファサラジン−ヒアルロン酸複合点眼剤投与群の場合、0.1mg/ml(0.01%)投与群において16.2±3.3個のマクロファージが観察された。(図5

実施例

0052

実施例4.スルファサラジン−ヒアルロン酸複合点眼剤の乾燥性角結膜炎において炎症抑制効果
乾燥性角結膜炎(Keratoconjunctivitis sicca)に対する実験のために乾性眼(dry eye)動物モデルを製作した。動物はラット(sd rat)を使用し、乾燥性角結膜炎の誘導は、1%の硫酸アトロピン(1%atropine Sulfate)と0.1%の塩化ベンザルコニウム(0.1%benzalkonium chloride)とを一日に二度ずつ2週間点眼して誘導した。
スルファサラジン−ヒアルロン酸複合剤(0.1mg/ml)の投与は、1%のアトロピン(1%atropine Sulfate)と0.1%の塩化ベンザルコニウム(0.1%benzalkonium chloride)との投与一週間後から、一週間一日に二度点眼投与した。比較薬物として0.1%のヒアルロン酸と0.05%のシクロスポリン点眼剤とを使用した。
乾燥性角結膜炎動物モデルにおいて、角膜上皮損傷の確認は、2%のフルオルセイン溶液で角膜上皮が損傷された部位を染色して確認し(図6)、角膜の炎症は、角膜を冷凍切削(cryosection)してヘマトキシリンとエオジン染色を実施して確認した。(図8
乾燥性角結膜炎(乾性眼)が誘導された角膜において、乾燥による角膜上皮細胞の状態をフルオレセイン染色を行い、乾燥による角膜上皮細胞の損傷があることを確認した(図6)。フルオレセイン染色薬は、健康な正常角膜上皮細胞は染色されず、損傷されたり、角膜上皮がない角膜部位が染色される特徴を有している(黄色に染色された領域)。フルオレセイン染色の後、染色された面積は全体角膜面積に対して%で示した。対照群(control、薬物非処理群)においては、76±6.5%と角膜表面の大部分が染色されたが、ヒアルロン酸(0.1%)54±7.4%、シクロスポリン(0.05%)29±4.2%、スルファサラジン−ヒアルロン酸複合剤(0.01%)においては、37±5.7%に角膜表面の蛍光染色が著しく減ったことを確認することができた(図6、7)。これにより、製造されたスルファサラジン−ヒアルロン酸複合剤(0.01%)が角膜上皮細胞の損傷を抑制し、保護効果があるものと観察された。
乾燥性角結膜炎(乾性眼)において、角膜内の炎症細胞を確認するためにヘマトキシリン−エオジン染色を行った結果、乾性眼の角膜で丸くて多核(polynuclear)を有した細胞(polynucleocytes)が観察された(図8)。乾燥性角結膜炎モデルにおいて、炎症細胞の角膜侵入抑制効果は、対照群(control、薬物非処理群)に対して比率で示した。炎症抑制効果は、ヒアルロン酸(0.1%)0.76±0.1、シクロスポリン(0.05%)0.35±0.07、スルファサラジン−ヒアルロン酸複合剤(0.01%)においては、0.48±0.09が観察された(図9)。上の動物実験結果でスルファサラジン−ヒアルロン酸複合剤(0.01%)が乾燥性角結膜炎に対して炎症抑制効果があることを確認した。
上の実施例の結果は、スルファサラジン−ヒアルロン酸複合点眼剤は角膜炎症の緩和に効果があり、スルファサラジン単独投与より効果が大きいということを意味する。
上の結果に照らして見ると、本発明のスルファサラジン−ヒアルロン酸複合点眼剤は、眼球、特に前眼部または外眼部の炎症治療に効果的に使用され得る。

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