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課題・解決手段

本発明は、概して、癌治療に使用される組換えキメラ融合タンパク質の作製の分野に関し、詳細には、抗EGFRl−TGFβRII、抗EGFR1−PD1、及び抗CTLA4−PD1の融合分子、並びに融合分子の作製方法に関し、この方法は、組換えキメラ融合タンパク質の生産コストを削減し、且つ組換えキメラ融合タンパク質の同質性を高める。

概要

背景

関連技術
医学研究の様々な進展にもかかわらず、癌は、米国では依然として第2の死因である。従来の臨床ケア方式、例えば、外科切除放射線療法、及び化学療法は、特に充実性腫瘍では失敗率が相当高い。失敗は、初発腫瘍が反応しないため、又は発生部位での再増殖又は転位による再発のために起きる。癌は、依然として医学の研究開発の中心的な焦点である。

癌の免疫療法は、一世紀を超えて研究されているが、様々な抗体ベース製品が多様な形態の癌の患者の管理に導入されるようになったのは僅かこの10年である。現在、免疫療法は、臨床研究の最も活発な分野の1つであり、癌に対する様々な抗体療法の製品が既に承認されている。

治療薬としての特定の抗体の使用は、非標的療法、例えば、薬物の経口投与若しくは静脈内投与による全身化学療法又は放射線療法よりも優れている。2種類の抗体ベースの治療法が存在する。よく見られる種類では、腫瘍抗原(即ち、腫瘍及び癌細胞上で発現するが、正常組織では発現しないタンパク質)が同定され、腫瘍抗原に対する抗体、好ましくはモノクローナル抗体(mAb)が開発されている。このため、任意の治療薬、例えば、化学療法薬放射性核種修飾毒素などをこの抗体にコンジュゲートさせて、腫瘍に対する治療薬による標的療法を達成することができる。他の種類の抗体ベースの治療法では、それ自体が標的とする腫瘍/癌細胞に対して治療特性を有する抗体を供給する。この第2の形式の抗体ベースの治療法のさらなる利点は、別の治療薬を治療抗体にさらにコンジュゲートさせてより効果的な処置を達成することができる。任意の抗体依存性療法、特にモノクローナル抗体(mAb)を使用する治療法の大きな利点は、正常組織の治療薬による副作用を十分に回避して、用量を増やした治療薬を腫瘍に送達できることである。

癌治療用のいくつかの抗体の同定にもかかわらず、免疫寛容を克服し、且つT細胞応答活性化させる新規のより効果的な治療を依然として見出す必要がある。さらに、たとえ分子操作がこのような抗体ベースの治療法の可能性を改善したとしても、作製される組換え産物持続性についての問題が依然として残る。

概要

本発明は、概して、癌治療に使用される組換えキメラ融合タンパク質の作製の分野に関し、詳細には、抗EGFRl−TGFβRII、抗EGFR1−PD1、及び抗CTLA4−PD1の融合分子、並びに融合分子の作製方法に関し、この方法は、組換えキメラ融合タンパク質の生産コストを削減し、且つ組換えキメラ融合タンパク質の同質性を高める。

目的

本発明は、均質な組換え融合免疫調節分子、より具体的には免疫調節タンパク質に連結された標的抗体を含む組換えキメラポリペプチドを作製するための新規且つ安定した合成法を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
2件

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請求項1

治療効果のある融合タンパク質を調製する方法であって、前記融合タンパク質が、腫瘍標的部分及び少なくとも1つの免疫調節分子を含み、前記腫瘍標的部分が、CTLA−4又はEGFR1に結合する抗体であり、且つ前記融合タンパク質が次のステップ:前記融合タンパク質をコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を調製するステップであって、前記抗体の前記コドン最適化ヌクレオチド配列が、前記抗体の重鎖C末端におけるリジン発現のためのヌクレオチド欠失している、ステップ;一過性の又は安定した発現が可能な宿主細胞で前記融合タンパク質の前記最適化配列をクローニングするステップ;前記宿主細胞を増殖させ且つ前記宿主細胞による前記融合タンパク質の発現を可能にするのに適した条件下で、前記宿主細胞を培地で増殖させるステップ;及び任意選択的にさらなる精製のために、分泌された融合タンパク質を収集するステップによって調製される、方法。

請求項2

前記免疫調節分子が、癌細胞免疫寛容を弱める、請求項1に記載の方法。

請求項3

前記免疫調節分子が、前記融合タンパク質の二重特異的結合を可能にするのに十分な長さのアミノ酸配列によって前記抗体に連結されている、請求項1に記載の方法。

請求項4

前記免疫調節分子が、直接又はリンカーを介して、前記抗体の重鎖、前記抗体の軽鎖、若しくは両鎖に連結される、請求項1に記載の方法。

請求項5

前記免疫調節分子が、直接又はリンカーを介して、前記抗体の重鎖のN若しくはC末端、前記抗体の軽鎖のN若しくはC末端、又は両鎖のN及びC末端の両方に連結される、請求項1に記載の方法。

請求項6

前記免疫調節分子が、(i)形質転換成長因子β(TGF−β)及び/又は(ii)プログラム死−1リガンド1(PD−L1)に結合する、請求項1に記載の方法。

請求項7

前記抗体がEGFR1に結合し、且つ前記免疫調節部分が形質転換成長因子β(TGF−β)に結合する、請求項1に記載の方法。

請求項8

前記コドン最適化ヌクレオチド配列が配列番号1、2、4、及び7を含む、請求項7に記載の方法。

請求項9

前記抗体がEGFR1に結合し、且つ前記免疫調節部分がPD−1Lに結合する、請求項1に記載の方法。

請求項10

前記コドン最適化ヌクレオチド配列が配列番号1、2、3、及び4を含む、請求項9に記載の方法。

請求項11

前記抗体がCTLA4に結合し、且つ前記免疫調節部分がPD−1Lに結合する、請求項1に記載の方法。

請求項12

前記コドン最適化ヌクレオチド配列が配列番号5、6、3、及び4を含む、請求項11に記載の方法。

請求項13

均質な治療効果のある融合タンパク質を含む調製物であって、前記融合タンパク質が、腫瘍標的部分及び少なくとも1つの免疫調節分子を含み、前記腫瘍標的部分が、CTLA−4又はEGFR1に結合する抗体であり、且つ前記融合タンパク質が次のステップ:前記融合タンパク質をコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を調製するステップであって、前記抗体のコドン最適化配列が、前記抗体の重鎖のC末端におけるリジンの発現のためのヌクレオチドを欠失している、ステップ;一過性の又は安定した発現が可能な宿主細胞で前記融合タンパク質の前記コドン最適化配列をクローニングするステップ;前記宿主細胞を増殖させ且つ前記宿主細胞による前記融合タンパク質の発現を可能にするのに適した条件下で、前記宿主細胞を培地で増殖させるステップ;及び任意の精製のために分泌された融合タンパク質を収集するステップによって調製される、調製物。

請求項14

キメラ融合タンパク質をコードする核酸配列であって、前記キメラ融合タンパク質が、癌細胞に対して親和性を有する少なくとも1つの標的部分、及び前記癌細胞の免疫寛容を弱める少なくとも1つの免疫調節部分を含み、前記標的部分が抗体であり、且つ前記抗体の核酸配列が、前記抗体の重鎖のC末端におけるリジンの発現のためのヌクレオチドを欠失している、核酸配列。

請求項15

前記抗体の前記重鎖をコードする前記核酸配列が、配列番号1又は配列番号5から選択される、請求項14に記載の核酸配列。

請求項16

前記キメラ融合タンパク質の核酸配列が配列番号1、2、4、及び7を含む、請求項14に記載の核酸配列。

請求項17

前記キメラ融合タンパク質の核酸配列が配列番号1、2、3、及び4を含む、請求項14に記載の核酸配列。

請求項18

前記キメラ融合タンパク質の核酸配列が配列番号5、6、3、及び4を含む、請求項14に記載の核酸配列。

請求項19

ヒト対象における癌の処置のために最適化された遺伝子を含むベクターであって、前記最適化された遺伝子が、CG配列が増加するように修飾されており、前記ベクターが、少なくとも1つの標的部分をコードするヌクレオチド配列、少なくとも1つの免疫調節部分、及び連結部分を含み、前記最適化ヌクレオチド配列が、配列番号1〜7から選択される、ベクター。

請求項20

前記ヌクレオチド配列が配列番号1、2、4、及び7を含む、請求項19に記載のベクター。

請求項21

前記ヌクレオチド配列が配列番号1、2、3、及び4を含む、請求項19に記載のベクター。

請求項22

前記ヌクレオチド配列が配列番号5、6、3、及び4を含む、請求項19に記載のベクター。

請求項23

対象における癌を処置する方法であって:a)治療効果のある融合タンパク質を調製するステップであって、前記融合タンパク質が、腫瘍標的部分及び少なくとも1つの免疫調節分子を含み、前記腫瘍標的部分が、CTLA−4又はEGFR1に結合する抗体であり、且つ前記融合タンパク質が次のステップ:i)前記融合タンパク質をコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を調製するステップであって、前記抗体の前記コドン最適化ヌクレオチド配列が、前記抗体の重鎖のC末端におけるリジンの発現のためのヌクレオチドを欠失している、ステップ;ii)一過性の又は安定した発現が可能な宿主細胞で前記融合タンパク質の前記最適化配列をクローニングするステップ;iii)前記宿主細胞を増殖させ且つ前記宿主細胞による前記融合タンパク質の発現を可能にするのに適した条件下で、前記宿主細胞を培地で増殖させるステップ;及びiv)任意選択の精製のために分泌された融合タンパク質を収集するステップによって調製される、ステップと;b)治療効果のある量の前記融合タンパク質を前記対象に投与するステップとを含む、方法。

請求項24

前記融合タンパク質が、配列番号15及び9のアミノ酸配列を含む、請求項23に記載の方法。

請求項25

前記融合タンパク質が、配列番号8及び16のアミノ酸配列を含む、請求項23に記載の方法。

請求項26

前記融合タンパク質が、配列番号17及び9のアミノ酸配列を含む、請求項23に記載の方法。

請求項27

前記融合タンパク質が、配列番号8及び18のアミノ酸配列を含む、請求項23に記載の方法。

請求項28

前記融合タンパク質が、配列番号27及び9のアミノ酸配列を含む、請求項23に記載の方法。

請求項29

前記融合タンパク質が、配列番号8及び28のアミノ酸配列を含む、請求項23に記載の方法。

請求項30

前記融合タンパク質が、配列番号29及び9のアミノ酸配列を含む、請求項23に記載の方法。

請求項31

前記融合タンパク質が、配列番号8及び30のアミノ酸配列を含む、請求項23に記載の方法。

請求項32

前記融合タンパク質が、配列番号31及び28のアミノ酸配列を含む、請求項23に記載の方法。

請求項33

前記融合タンパク質が、配列番号31及び30のアミノ酸配列を含む、請求項23に記載の方法。

請求項34

前記融合タンパク質が、配列番号29及び28のアミノ酸配列を含む、請求項23に記載の方法。

請求項35

前記融合タンパク質が、配列番号29及び30のアミノ酸配列を含む、請求項23に記載の方法。

請求項36

前記融合タンパク質が、配列番号32及び14のアミノ酸配列を含む、請求項23に記載の方法。

請求項37

前記融合タンパク質が、配列番号13及び33のアミノ酸配列を含む、請求項23に記載の方法。

請求項38

前記融合タンパク質が、配列番号34及び14のアミノ酸配列を含む、請求項23に記載の方法。

請求項39

前記融合タンパク質が、配列番号13及び35のアミノ酸配列を含む、請求項23に記載の方法。

請求項40

前記融合タンパク質が、配列番号32及び33のアミノ酸配列を含む、請求項23に記載の方法。

請求項41

前記融合タンパク質が、配列番号32及び35のアミノ酸配列を含む、請求項23に記載の方法。

請求項42

前記融合タンパク質が、配列番号34及び33のアミノ酸配列を含む、請求項23に記載の方法。

請求項43

前記融合タンパク質が、配列番号34及び35のアミノ酸配列を含む、請求項23に記載の方法。

技術分野

0001

関連出願の相互参照
本出願は、あらゆる目的のために参照によりその開示内容が本明細書に組み入れられる2013年3月12日出願の米国仮特許出願第61/777,016号の優先権を主張するものである。

0002

発明の背景
技術分野
本発明は、概して、癌治療に使用される組換えキメラ融合タンパク質の作製の分野に関し、詳細には、抗EGFRl−TGFβRII、抗EGFR1−PD1、及び抗CTLA4−PD1の融合分子、並びにこれらの作製方法に関し、この方法は、組換えキメラ融合タンパク質の生産コストを削減し、且つ組換えキメラ融合タンパク質の同質性を高める。

背景技術

0003

関連技術
医学研究の様々な進展にもかかわらず、癌は、米国では依然として第2の死因である。従来の臨床ケア方式、例えば、外科切除放射線療法、及び化学療法は、特に充実性腫瘍では失敗率が相当高い。失敗は、初発腫瘍が反応しないため、又は発生部位での再増殖又は転位による再発のために起きる。癌は、依然として医学の研究開発の中心的な焦点である。

0004

癌の免疫療法は、一世紀を超えて研究されているが、様々な抗体ベース製品が多様な形態の癌の患者の管理に導入されるようになったのは僅かこの10年である。現在、免疫療法は、臨床研究の最も活発な分野の1つであり、癌に対する様々な抗体療法の製品が既に承認されている。

0005

治療薬としての特定の抗体の使用は、非標的療法、例えば、薬物の経口投与若しくは静脈内投与による全身化学療法又は放射線療法よりも優れている。2種類の抗体ベースの治療法が存在する。よく見られる種類では、腫瘍抗原(即ち、腫瘍及び癌細胞上で発現するが、正常組織では発現しないタンパク質)が同定され、腫瘍抗原に対する抗体、好ましくはモノクローナル抗体(mAb)が開発されている。このため、任意の治療薬、例えば、化学療法薬放射性核種修飾毒素などをこの抗体にコンジュゲートさせて、腫瘍に対する治療薬による標的療法を達成することができる。他の種類の抗体ベースの治療法では、それ自体が標的とする腫瘍/癌細胞に対して治療特性を有する抗体を供給する。この第2の形式の抗体ベースの治療法のさらなる利点は、別の治療薬を治療抗体にさらにコンジュゲートさせてより効果的な処置を達成することができる。任意の抗体依存性療法、特にモノクローナル抗体(mAb)を使用する治療法の大きな利点は、正常組織の治療薬による副作用を十分に回避して、用量を増やした治療薬を腫瘍に送達できることである。

0006

癌治療用のいくつかの抗体の同定にもかかわらず、免疫寛容を克服し、且つT細胞応答活性化させる新規のより効果的な治療を依然として見出す必要がある。さらに、たとえ分子操作がこのような抗体ベースの治療法の可能性を改善したとしても、作製される組換え産物持続性についての問題が依然として残る。

課題を解決するための手段

0007

本発明は、均質な組換え融合免疫調節分子、より具体的には免疫調節タンパク質に連結された標的抗体を含む組換えキメラポリペプチドを作製するための新規且つ安定した合成法を提供する。

0008

癌に対する免疫応答を媒介するために、T細胞の活性化及び同時刺激の両方が重要である。T細胞の同時刺激は、CD28の、抗原提示細胞APC)上のB7ファミリーのそのリガンドへの結合によって主に媒介される。しかしながら、活性化後、T細胞は、細胞傷害性Tリンパ球抗原4(CTLA−4)と呼ばれる分子を発現し、CTLA−4は、CD28よりも遥かに高い親和性でB7リガンドに結合し、このような結合がT細胞の活性を下方調節する。従って、CTLA−4受容体に結合する抗体を含めることにより、B7ファミリーのリガンドとの相互作用遮断し、抗腫瘍応答が増強されるであろう。

0009

プログラム死リガンド1(PDL1)は、上記のB7のリガンドの1つであり、(i)T細胞上のその受容体PD1(CD279)に結合して腫瘍反応性T細胞を寛容化すること;(ii)腫瘍細胞から発現されるPDL1によるPD−1シグナル伝達によって、FasL媒介性溶解及びCD8+T細胞に対する耐性を腫瘍細胞に付与すること;及び(iii)誘導される制御性T細胞の発生及び維持を促進することによって、抗腫瘍免疫阻害する。従って、PDL1は、天然の抗腫瘍免疫、及び宿主細胞性抗腫瘍免疫の活性化を必要とする癌免疫療法に対する主な障害である。この概念は、PDL1とPD1との相互作用を遮断する抗体がT細胞の活性化を改善して腫瘍の進行を遅延させることを実証する研究によって裏付けられている。PDL1又はPD1に対する抗体は、癌患者小集団において治療効果を示したが、患者の大部分は、抗体処置による恩恵を受けない。従って、癌患者におけるPD−L1性免疫抑制を最小限にする、新たな普遍的に適用可能な処置を可能にし、且つ現在利用可能なmAbよりもPD−1又はPD−L1に対してより効果的であるPD−L1機能を調節するための機構が必要とされている。

0010

多くの上皮癌、例えば、結腸癌、頭部及び頸部の癌、乳癌卵巣癌非小細胞肺癌(NSCL)、及び膵臓癌の特徴は、癌細胞の表面上の異常に高いレベル上皮成長因子受容体(EGFR)である。上皮成長因子受容体のファミリー(EGFR;HER1、HER2/neu、HER3、及びHER4)は、様々なリガンドの結合に応答して生体生理学的シグナル伝達反応のカスケードトリガする内因性チロシンキナーゼ活性を有する細胞膜受容体を含む。これらの受容体は、増殖の増加の誘導、アポトーシスの減少、並びに腫瘍細胞の移動性及び血管形成の促進など、様々なヒト腫瘍における悪性細胞挙動に重要な役割を果たす。従って、本発明は、EGFRファミリーのメンバーを標的とする抗体を含む。

0011

本発明は、癌細胞の免疫寛容を弱めて、T細胞の活性を維持し、腫瘍に対する免疫系の応答を抑制することが知られている制御性Tの動員を抑制することによって癌細胞の増殖を低減する方法をさらに提供する。従って、本発明のポリヌクレオチド配列によって産生されるキメラポリペプチドは、発現される融合ポリペプチド又はキメラポリペプチドにより癌治療に有用である。

0012

一態様では、本発明は、癌細胞を標的とする少なくとも1つの標的部分及び癌細胞の免疫寛容を弱める少なくとも1つの免疫調節部分を含むキメラポリペプチドを提供し、この標的部分と免疫調節部分は、これらの両方の部分がそれぞれの標的にうまく結合できるように十分な長さのアミノ酸残基アミノ酸スペーサーによって連結されている。あるいは、標的部分と、癌細胞の免疫寛容を弱める免疫調節部分とを、互いに直接結合しても良い。本発明のキメラ/融合ポリペプチドは、癌細胞受容体への結合、及び癌細胞が免疫応答を回避する能力の低減に有用である。

0013

好ましくは、標的部分は、CTLA−4又はEGFR1に対する結合親和性を有する抗体であり、この抗体は、発現される抗体の重鎖C末端リジンの発現のためのヌクレオチド欠失したポリヌクレオチド配列から転写される。転写中に抗体の重鎖のC末端のリジンが排除されることにより、最終産物が高い同質性を有し、これによりさらなる精製の必要性が低減され、且つそのコストを削減できることが分かった。

0014

CHO細胞におけるIgG分子の転写及び翻訳のプロセスの最中に、重鎖のC末端のリジン(K)が発現されることが知られている。市販の製品では、このような発現されるリジンは純度を高めるために除去しなければならない。図1に示されているように、作製された産物では異種性が高い。これは、発現される抗体が細胞内でなお利用可能である限り、CHO細胞が、C末端のリジンを切断する内因性酵素カルボキシペプチダーゼB(CPB)を有するために生じる。しかしながら、この酵素は、抗体が培地分泌されるとリジンを切断しなくなる。従って、この内因性CPBの切断効率は、細胞内での利用可能性に基づいている。従って、抗体の一部はリジンと共に分泌され、他はリジンと共に分泌されず、このような組み合わせは、分泌される産物に著しい異種性をもたらし、一部の抗体はC末端のリジンを有し、他の抗体はC末端のリジンを有していない。組換え産物は治療用途に使用されるため、精製して同質性にする必要がある。従って、従来技術の組換え産物は、追加の精製ステップを必要とし、このステップでは、組換え産物は、最初に酵素CPBで処置され、追加のステップで再び精製されて、最終産物から全てのリジン及び酵素CPBが除去される。これらの追加のステップは、製造プロセスのコストを著しく増大させる。

0015

本発明は、発現される抗体の重鎖のC末端のリジンの発現のためのヌクレオチドを欠失しているポリヌクレオチド配列から発現タンパク質を転写することによって組換え抗CTLA−4抗体及び抗EGFR1抗体を合成する従来の方法の欠点を回避する。

0016

本発明は、癌細胞の免疫寛容を弱める又は転じる融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの発現によるキメラ/融合タンパク質の調製に基づいている。癌細胞は、腫瘍微小環境における特定の免疫抑制機構による腫瘍標的抗体又は化学治療剤による除去を回避することができ、このような癌細胞の能力は、免疫寛容として認識されている。このような免疫抑制機構は、免疫抑制サイトカイン(例えば、形質転換成長因子β(TGF−β))及び制御性T細胞及び/又は免疫抑制骨髄樹状細胞(DC)を含む。腫瘍性免疫寛容を弱めることにより、本発明は、任意選択で別の既存の癌治療と併用される、癌治療に有効な組成物及び方法を提供する。本発明は、腫瘍性免疫寛容を弱めて、耐性癌細胞又は播種性癌細胞に対するT細胞媒介性の適応抗腫瘍(adaptive antitumor)を活性化及び梃入れすることによって化学療法の抗腫瘍効果を増強する戦略を提供する。

0017

別の態様では、本発明は、少なくとも1つの免疫調節部分に融合した少なくとも1つの標的部分を含む分子を提供する。この標的部分は、標的分子に特異的に結合し、免疫調節部分は、次の分子:(i)形質転換成長因子β(TGF−β)及び又は(ii)プログラム死−1リガンド1(PD−L1)の1つに特異的に結合する。

0018

さらなる一態様では、標的部分は、重鎖及び軽鎖の両方を含む抗体を含み、この抗体は、腫瘍細胞の成分、腫瘍抗原、腫瘍血管系、腫瘍微小環境、又は腫瘍浸潤免疫細胞に特異的に結合する。特に、重鎖及び/又は軽鎖は、同じ種類の免疫調節部分又は別個の異なる免疫調節部分に個々に連結することができる。さらに、抗体標的部分の重鎖又は軽鎖は、免疫調節部分に連結することができ、この免疫調節部分は、第2の免疫調節部分にさらに連結することができ、この2つの免疫調節部分の間にはリンカーが存在する。

0019

なおさらなる一態様では、腫瘍標的部分及び形質転換成長因子β(TGF−β)に結合する分子を含む免疫調節部分を含むキメラポリペプチドが提供され、この腫瘍標的部分は、EGFR1に結合する抗体であり、この抗体は、完全な抗体、重鎖、又は軽鎖であり得る。

0020

腫瘍標的部分は、癌細胞を標的とするモノクローナル抗体を含むことができ、このようなモノクローナル抗体としては、限定されるものではないが、セツキシマブトラスツズマブ、リツブキシマブ(ritubximab)、イピリムマブトレリムマブ、ムロモナブ−CD3、アブシキシマブダクリズマブバシリキシマブパリビズマブインフリキシマブゲムツズマブオゾガマイシンアレムツズマブイブツモブチウキセタンアダリムマブオマリズマブトシツモマブ、I−131トシツモマブ、エファリズマブベバシズマブ、パリツムマブ、ペルツズマブナタリズマブエタネルセプト、IGN101(Aphton)、ボロシキシマブ(Biogen Idec及びPDL BioPharm)、抗CD80 mAb(Biogen Idec)、抗CD23 mAb(Biogen Idel)、CAT−3888(Cambridge Antibody Technology)、CDP−791(Imclone)、エラプツズマブ(eraptuzumab)(Immunomedics)、MDX−010(Medarex及びBMS)、MDX−060(Medarex)、MDX−070(Medarex)、マツズマブ(Merck)、CP−675、206(Pfizer)、CAL(Roche)、SGN−30(Seattle Genetics)、ザノリムマブ(Serono及びGenmab)、アデカツムマブ(Sereno)、オレゴボマブ(United Therapeutics)、ミモツズマブ(YM Bioscience)、ABT−874(Abbott Laboratories)、デノスマブ(Amgen)、AM108(Amgen)、AMG714(Amgen)、フォントリズマブ(Biogen Idec及びPDL BioPharm)、ダクリズマブ(Biogent Idec及びPDL BioPharm)、ゴリムマブ(Centocor及びSchering-Plough)、CNTO1275(Centocor)、オクレリズマブ(Genetech及びRoche)、HuMax−CD20(Genmab)、ベリムマブ(HGS及びGSK)、エプラツズマブ(Immunomedics)、MLN1202(Millennium Pharmaceuticals)、ビジリズマブ(PDL BioPharm)、トシリズマブ(Roche)、オクレリズマブ(Roche)、セルトリズマブペゴル(UCB、以前はCelltech)、エクリズマブ(Alexion Pharmaceuticals)、ペキセリズマブ(Alexion Pharmaceuticals及びProcter & Gamble)、アブシキシマブ(Centocor)、ラニジムマブ(ranibizimumab)(Genetech)、メポリズマブ(GSK)、TNX−355(Tanox)、又はMYO−029(Wyeth)が挙げられる。

0021

好ましい一実施形態では、腫瘍標的部分は、本発明の方法によって作製されるCTLA−4又はEGFR1に結合するモノクローナル抗体であり、この方法は、次のステップ:
a.融合タンパク質をコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を調製するステップであって、この抗体のコドン最適化配列が、この抗体の重鎖のC末端におけるリジンの発現のためのヌクレオチドを欠失している、ステップ;
b.一過性の又は安定した発現が可能な宿主細胞で前記融合タンパク質の最適化配列をクローニングするステップ;
c.宿主細胞を増殖させ、且つ、宿主細胞による融合タンパク質の発現を可能にするのに適した条件下で宿主細胞を培地で増殖させるステップ;及び
d.分泌された融合タンパク質を収集するステップ
を含む。

0022

なお別の態様では、免疫調節部分は、TGF−βに結合し、且つその機能を阻害する分子を含む。特に、免疫調節部分は、形質転換成長因子β受容体TGF−βRII、TGF−βRIIb、TGF−βRIIIの細胞外リガンド結合ドメインを含む。別の態様では、免疫調節部分は、TGF−βRIIの細胞外リガンド結合ドメイン(ECD)を含む。

0023

なおさらなる一態様では、標的部分は、HER2/neu、EGFRl、CD20、又は細胞障害性Tリンパ球抗原−4(CTLA−4)に特異的に結合する抗体を含み、免疫調節部分は、TGF−βIIの細胞外リガンド結合ドメインを含む。

0024

なお別の態様では、免疫調節部分は、プログラム死−1リガンド1(PD−L1)に特異的に結合してその活性を阻害する分子を含む。

0025

さらなる態様では、標的部分は、HER2/neu、EGFRl、CD20、細胞障害性Tリンパ球抗原−4(CTLA−4)、CD25(1L−2a受容体IL−2aR)、又はCD4に特異的に結合する抗体、抗体断片、又はポリペプチドを含み、免疫調節部分は、プログラム死−1(PD−1)の細胞外リガンド結合ドメイン又は外部ドメインを含む。

0026

なおさらなる一態様では、標的部分は、EGFR1及びCTLA−4に特異的に結合する抗体を含み、免疫調節部分は、形質転換成長因子−β(TGF−β)と相互作用する配列を含む。

0027

一態様では、本発明は、ヒト対象における癌治療のための、少なくとも1つの標的部分及び少なくとも1つの免疫調節部分を含む融合ポリペプチドをコードする最適化遺伝子を提供し、この遺伝子は、ヒト対象及び/又は細胞における発現を増加させるように最適化されている。

0028

別の態様では、本発明は、ヒト対象における癌治療のための最適化遺伝子を含むベクターを提供し、この最適化遺伝子は、CG配列を増加させるように修飾されている。好ましくは、ベクターは、少なくとも1つの標的部分、少なくとも1つの免疫調節部分、及び連結部分をコードするヌクレオチド配列を含み、最適化ヌクレオチド配列は、図2に示されている配列番号1〜7から選択される。

0029

なお別の態様では、本発明は、対象の癌を治療する方法を提供し、この方法は:
少なくとも1つの標的部分、少なくとも1つの免疫調節部分、及びこの標的部分と免疫調節部分との間に位置する連結部分をコードするヌクレオチド配列を含む少なくとも1つの組換えベクターを作製するステップであって、このヌクレオチド配列が配列番号1〜7から選択される、ステップ;及び
治療有効量のコードされた融合タンパク質を対象で産生するレベルで前記ヌクレオチド配列が発現されるような条件下で組換えベクターを対象に投与するステップを含む。

0030

なお別の態様では、本発明は、本発明の融合タンパク質ペプチドをコードするポリヌクレオチド配列で形質転換された組換え宿主細胞を提供し、このポリヌクレオチド配列は、配列番号1〜7から選択される。

0031

なおさらなる態様では、本発明は、本発明のキメラ融合タンパク質を調製するプロセスも企図し、このプロセスは次のステップ:
キメラ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列で宿主細胞をトランスフェクトして形質転換宿主細胞を作製するステップであって、このポリヌクレオチド配列が、少なくとも1つの標的部分及び少なくとも1つの免疫調節部分をコードし、このポリヌクレオチド配列が、配列番号1〜7から選択される配列の組み合わせを含む、ステップ;及び
キメラ融合タンパク質の発現に十分な生物学的条件下で形質転換宿主細胞を維持するステップ
を含む。

0032

別の態様では、本発明は、癌治療用の薬剤の使用におけるキメラ融合タンパク質の使用に関し、このキメラ融合タンパク質は、図3図4、及び図5にそれぞれ示されている、抗EGFR1リンカーPD1(配列番号8、9、10、及び10);抗EGFR1−リンカー−TGFβRII(配列番号8、9、10、及び12);抗CTLA−4−リンカー−PD1(配列番号13、14、10、及び11)を含む。好ましくは、融合タンパク質は、宿主細胞で発現され、このような発現されるタンパク質は、癌の影響を軽減するための治療量で、これを必要とする対象に投与される。

0033

なおさらなる一態様では、本発明は、腫瘍性疾患を処置する方法を提供する。この方法は、本発明の1つ以上の融合タンパク質を、これを必要する対象に投与することを含み、様々な態様では、対象に、別の抗癌治療と併用して本発明の1つ以上の融合タンパク質が投与される。一態様では、抗癌治療は、化学療法分子、抗体、小分子キナーゼ阻害剤ホルモン剤、又は細胞傷害剤を含む。抗癌治療は、電離放射線紫外線放射冷凍アブレーション熱アブレーション、又は高周波アブレーションも含み得る。

0034

好ましい一実施形態では、治療効果のある抗体−ペプチド融合タンパク質が、癌細胞の免疫寛容を弱める1つ以上の免疫調節部分に融合した標的抗体である。一態様では、免疫調節部分は、分子の二重特異的結合を可能にする十分な長さのアミノ酸スペーサーによって連結することができる。免疫調節部分は、抗体の重鎖のN末端若しくはC末端又は軽鎖のN末端若しくはC末端のいずれかに結合することができる。

0035

本発明の方法は、治療効果のある抗体−ペプチド誘導タンパク質をコードするヌクレオチド配列を提供し、この発現は、一過性細胞系又は安定細胞系で行うことができる。一過性発現は、コードされる融合タンパク質を哺乳動物宿主細胞に導入するベクターで宿主細胞をトランスフェクト又は形質転換することによって達成される。

0036

融合ペプチドが発現されたら、好ましくは、これらの融合ペプチドを、標的部分及び免疫調節部分の両方に結合する能力を有する二重特異性であるかをチェックするために精製してインビトロ試験する。このような試験には、インビトロ試験、例えば、二機能性標的結合(bi-functional target binding)又は免疫細胞刺激を確認するELISA又はNK/T細胞結合アッセイが含まれ得る。

0037

特に、特定の融合ペプチドが所望の二重特性を実証したら、このような融合ペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、大量の発現及び精製のために安定細胞系へのサブクローニング用に選択される。このような安定細胞系は、既に開示され、例えば、限定されるものではないが、HEK923、CHO、又はNSOを含む哺乳動物細胞系である。

0038

別の態様では、本発明は、PDL1のPD1への結合を阻害し、且つ/又は低減して、腫瘍細胞に対する免疫応答を増大させる方法を提供し、この方法は次のステップ:
a.PD1及び抗EGFR1又は抗CTLA−4抗体を含むキメラポリペプチドを用意するステップ;及び
b.腫瘍細胞をキメラポリペプチドに接触させるステップであって、このキメラポリペプチドが少なくとも腫瘍細胞のPDL1に結合する、ステップ
を含む。

0039

なお別の態様では、本発明は、治療効果のある抗体−ペプチド融合タンパク質を調製する方法を提供し、この方法は次のステップ:
a.前記融合タンパク質のコドン最適化配列を調製するステップであって、抗EGFR1抗体及び抗CTLA−4抗体のコドン最適化配列が、この抗体の重鎖のC末端のリジンの発現のためのヌクレオチドを欠失している、ステップ;
b.一過性の又は連続的な発現が可能な宿主細胞で前記融合タンパク質の最適化配列をクローニングするステップ;
c.宿主細胞を増殖させ、且つ、宿主細胞による融合タンパク質の発現を可能にするのに適した条件下で宿主細胞を培地で増殖させるステップ;及び
d.分泌された融合タンパク質を収集するステップ
を含む。

0040

なおさらなる一態様では、本発明は、キメラ融合タンパク質をコードする核酸配列を提供し、このキメラ融合タンパク質は、癌細胞に対して親和性を有する少なくとも1つの標的部分、及び癌細胞の免疫寛容を弱める少なくとも1つの免疫調節部分を含み、標的部分が抗体であり、標的部分の核酸配列が、抗体の重鎖のC末端におけるリジンの発現のためのヌクレオチドを欠失している。抗体の重鎖をコードする核酸配列は、好ましくは、配列番号1又は配列番号5を含む。キメラ融合タンパク質をコードする核酸配列は、好ましくは、配列番号1、2、4、及び7;配列番号1、2、3、及び4;並びに配列番号5、6、3、及び4からなる群から選択される配列を含む。

0041

なお別の態様では、本発明は、対象の癌を治療する方法を提供し、この方法は次のステップ:
a)治療効果のある融合タンパク質を調製するステップであって、この融合タンパク質が、腫瘍標的部分及び少なくとも1つの免疫調節分子を含み、この腫瘍標的部分が、CTLA−4又はEGFR1に結合する抗体であり、且つこの融合タンパク質が次のステップ:
[0044]融合タンパク質をコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を調製するステップであって、抗体のコドン最適化ヌクレオチド配列が、抗体の重鎖のC末端のリジンの発現のためのヌクレオチドを欠失している、ステップ;
a)ii)一過性の又は連続的な発現が可能な宿主細胞で前記融合タンパク質の最適化配列をクローニングするステップ;
b)iii)宿主細胞を増殖させ、且つ、宿主細胞による融合タンパク質の発現を可能にするのに適した条件下で宿主細胞を培地で増殖させるステップ;及び
c)iv)分泌された融合タンパク質を収集するステップ
によって調製される、ステップと;
b.b)治療効果のある量の分泌された融合タンパク質を対象に投与するステップと
を含む。

0042

この融合タンパク質は、配列番号15及び9;配列番号8及び16;配列番号17及び9;配列番号8及び18;配列番号27及び9;配列番号8及び28;配列番号29及び9;配列番号8及び30;配列番号31及び28;配列番号31及び30;配列番号29及び28;配列番号29及び30;配列番号32及び14;配列番号13及び33;配列番号34及び14;配列番号13及び35;配列番号32及び33;配列番号32及び35;配列番号34及び33、並びに配列番号34及び35からなるアミノ酸配列の群から選択される。

0043

別の態様では、本発明は、腫瘍性疾患を治療する方法を提供し、この方法は、配列番号1、2、4、及び7;配列番号1、2、3、及び4;並びに配列番号5、6、3、及び4からなる群から選択される少なくとも1つのポリヌクレオチド配列によってコードされる1つ以上の融合タンパク質を、これを必要とする対象に投与するステップを含む。特に、上記定義されたポリヌクレオチド配列を使用することにより、抗EGFR1リンカーPD1(配列番号8、9、10、及び11);抗EGFR1−リンカー−TGFβRII(配列番号8、9、10、及び12);並びに抗CTLA−4−リンカー−PD1(配列番号13、14、10、及び11)を含む組み合わせの融合タンパク質を発現させることができる。

0044

本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明、図面、及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。

図面の簡単な説明

0045

図1は、重鎖におけるリジンの置換の様々な可能性を示しており、このような異種性により精製を行う必要がある。
図2は、抗EGFR1重鎖(配列番号1);抗EGFR1軽鎖(配列番号2);PD1(配列番号3);リンカー(配列番号4);抗CTLA−4重鎖(配列番号5);抗CTLA−4軽鎖(配列番号6);及びTGFβRII(配列番号7)を含む本発明の抗体−ペプチド融合タンパク質の発現に使用される最適化コドンヌクレオチド配列を示している。
図2は、抗EGFR1重鎖(配列番号1);抗EGFR1軽鎖(配列番号2);PD1(配列番号3);リンカー(配列番号4);抗CTLA−4重鎖(配列番号5);抗CTLA−4軽鎖(配列番号6);及びTGFβRII(配列番号7)を含む本発明の抗体−ペプチド融合タンパク質の発現に使用される最適化コドンヌクレオチド配列を示している。
図2は、抗EGFR1重鎖(配列番号1);抗EGFR1軽鎖(配列番号2);PD1(配列番号3);リンカー(配列番号4);抗CTLA−4重鎖(配列番号5);抗CTLA−4軽鎖(配列番号6);及びTGFβRII(配列番号7)を含む本発明の抗体−ペプチド融合タンパク質の発現に使用される最適化コドンヌクレオチド配列を示している。
図3は、抗EGFR1リンカーPD1構築物(配列番号8、9、10、及び11)のアミノ酸残基を示している。
図4は、抗EGFR1−リンカー−TGFβRII構築物(配列番号8、9、10、及び12)のアミノ酸残基を示している。
図5は、抗CTLA−4−リンカー−PD1(配列番号13、14、10、及び11)のアミノ酸残基を示している。
図6は、FMab5、FMab6、FMab7、及びFMab8に対する抗EGFR1抗体におけるPD1分子の置換の様々な可能性を示している。
図7は、抗EGFR1 HC−PD1+抗EGFR1 LCのアミノ酸配列を示し、PD1分子は、リンカーによって離隔された重鎖のC末端に連結され、配列番号15及び9を含む。
図8は、抗EGFR1 HC+抗EGFR1 LC−PD1のアミノ酸配列を示し、PD1分子は、リンカーによって離隔された軽鎖のC末端に連結され、配列番号8及び16を含む。
図9は、抗EGFR1 HC+抗EGFR1 LC−PD1のアミノ酸配列を示し、PD1分子は、リンカーによって離隔された重鎖のN末端に連結され、配列番号17及び9を含む。
図10は、抗EGFR1 HC+PD1−抗EGFR1 LCのアミノ酸配列を示し、PD1分子は、リンカーによって離隔された軽鎖のN末端に連結され、配列番号8及び18を含む。
図11は、配列番号1、2、及び3で示されている、cDNAを用いて作製された発現構築物を示している。
図12は、抗EGFR1抗体、FMab1、FMab2、FMab3、FMab4、FMab9、FMab10、FMab1l、及びFMab12におけるTGFβRII分子の置換の様々な可能性を示している。
図13は、抗EGFRl HC−TGFβRII+抗EGFRl LCのアミノ酸配列を示し、TGFβRII分子は、リンカーによって離隔された重鎖のC末端に連結され、配列番号27及び9を含む。
図14は、抗EGFRl HC+抗EGFRl LC−TGFβRIIのアミノ酸配列を示し、TGFβRII分子は、リンカーによって離隔された軽鎖のC末端に連結され、配列番号8及び28を含む。
図15は、TGFβRII−抗EGFRl HC+抗EGFRl LCのアミノ酸配列を示し、TGFβRII分子は、リンカーによって離隔された重鎖のN末端に連結され、配列番号29及び9を含む。
図16は、抗EGFRl HC+TGFβRII−抗EGFRl LCのアミノ酸配列を示し、TGFβRII分子は、リンカーによって離隔された軽鎖のN末端に連結され、配列番号8及び30を含む。
図17は、抗EGFRl HC−TGFβRII+抗EGFRl LC−TGFβRIIのアミノ酸配列を示し、TGFβRII分子は、リンカーによって離隔された重鎖及び軽鎖のC末端に連結され、配列番号31及び28を含む。
図18は、抗EGFRl HC−TGFβRII+TGFβRII−抗EGFRl LCのアミノ酸配列を示し、TGFβRII分子は、リンカーによって離隔された重鎖のC末端及び軽鎖のN末端に連結され、配列番号31及び30を含む。
図19は、TGFβRII−抗EGFRl HC+抗EGFRl LC−TGFβRIIのアミノ酸配列を示し、TGFβRII分子は、リンカーによって離隔された重鎖のN末端及び軽鎖のC末端に連結され、配列番号29及び28を含む。
図20は、TGFβRII−抗EGFRl HC+TGFβRII−抗EGFRl LCのアミノ酸配列を示し、TGFβRII分子は、リンカーによって離隔された重鎖のN末端及び軽鎖のN末端に連結され、配列番号29及び30を含む。
図21は、配列番号1、2、及び7で示されている、cDNAを用いて作製された発現構築物を示している。
図22は、12%還元SDS−PAGEで分析されたプロテインA精製サンプルを示している。
図23は、6%非還元SDS−PAGEで分析されたプロテインA精製サンプルを示している。
図24は、抗CTLA4抗体におけるPD1分子の置換の様々な可能性を示している。
図25は、抗CTLA4 HC−PD1+抗CTLA4 LCのアミノ酸配列を示し、PD1分子は、リンカーによって離隔された重鎖のC末端に連結され、配列番号32及び14を含む。
図26は、抗CTLA4 HC+抗CTLA4 LC−PD1のアミノ酸配列を示し、PD1分子は、リンカーによって離隔された軽鎖のC末端に連結され、配列番号13及び33を含む。
図27は、PD1−抗CTLA4 HC+抗CTLA4 LCのアミノ酸配列を示し、PD1分子は、リンカーによって離隔された重鎖のN末端に連結され、配列番号34及び14を含む。
図28は、抗CTLA4 HC+PD1−抗CTLA4 LCのアミノ酸配列を示し、PD1分子は、リンカーによって離隔された軽鎖のN末端に連結され、配列番号13及び35を含む。
図29は、抗CTLA4 HC−PD1+抗CTLA4 LC−PD1のアミノ酸配列を示し、PD1分子は、リンカーによって離隔された重鎖及び軽鎖のC末端に連結され、配列番号32及び33を含む。
図30は、抗CTLA4 HC−PD1+PD1−抗CTLA4 LCのアミノ酸配列を示し、PD1分子は、リンカーによって離隔された重鎖のC末端及び軽鎖のN末端に連結され、配列番号32及び35を含む。
図31は、PD1−抗CTLA4 HC+抗CTLA4 LC−PD1のアミノ酸配列を示し、PD1分子は、リンカーによって離隔された重鎖のN末端及び軽鎖のC末端に連結され、配列番号34及び33を含む。
図32は、PD1−抗CTLA4 HC+PD1−抗CTLA4 LCのアミノ酸配列を示し、PD1分子は、リンカーによって離隔された重鎖のN末端及び軽鎖のN末端に連結され、配列番号34及び35を含む。
図33は、配列番号3、5、及び6で示されている、cDNAを用いて作製された発現構築物を示している。
図34は、EGFR1標的結合ELISAを示している。抗EGFR1 HC−TGFβRII+抗EGFR1 LC融合Mabが、その固定標的EGFR1に結合する。
図35は、TGFβ標的結合ELISAを示している。抗EGFR1 HC−TGFβRII+抗EGFR1 LC融合Mabが、その標的TGFβに結合する。
図36は、二機能性ELISA(Bifunctional ELISA)を示している。抗EGFR1 HC−TGFβRII+抗EGFR1 LC融合Mabが、その標的EGFR1及びTGFβの両方に同時に結合する。
図37は、抗EGFR1 HC−TGFβRII+抗EGFR1 LC融合MabのEGFR1発現A431細胞の結合のフローサイトメトリー分析を示している。
図38は、EGFR1発現A−431細胞に対するADCCを示している。抗EGFR1 HC−TGFβRII+抗EGFR1 LC融合Mabが、EGFR1発現A−431細胞に対するADCCを媒介し、その効果は用量依存性である。
図39は、増殖アッセイの阻害を示している。抗EGFR1 HC−TGFβRII+抗EGFR1 LC融合Mabが、EGFR1発現A−431細胞の増殖を阻害する。
図40は、EGFR1標的結合ELISAを示している。抗EGFR1 HC+抗EGFR1 LC−TGFβRII融合Mabが、その固定標的EGFR1に結合する。
図41は、TGFβ標的結合ELISAを示している。抗EGFR1 HC+抗EGFR1 LC−TGFβRII融合Mabが、その標的TGFβに結合する。
図42は、二機能性ELISAを示している。抗EGFR1 HC+抗EGFR1 LC−TGFβRII融合Mabが、その標的EGFR1及びTGFβの両方に同時に結合する。
図43は、増殖アッセイの阻害を示している。抗EGFR1 HC+抗EGFR1 LC−TGFβRII融合Mabが、EGFR1発現A−431細胞の増殖を阻害する。
図44は、EGFR1標的結合ELISAを示している。TGFβRII−抗EGFR1 HC+抗EGFR1 LC融合Mabが、その固定標的EGFR1に結合する。
図45は、TGFβ標的結合ELISAを示している。TGFβRII−抗EGFR1 HC+抗EGFR1 LC融合Mabが、その標的TGFβに結合する。
図46は、二機能性ELISAを示している。TGFβRII−抗EGFR1 HC+抗EGFR1 LC融合Mabが、その標的EGFR1及びTGFβの両方に同時に結合する。
図47は、増殖アッセイの阻害を示している。TGFβRII−抗EGFR1 HC+抗EGFR1 LC融合Mabが、EGFR1発現A−431細胞の増殖を阻害する。
図48は、EGFR1標的結合ELISAを示している。抗EGFR1 HC+TGFβRII−抗EGFR1 LC融合Mabが、その固定標的EGFR1に結合する。
図49は、TGFβ標的結合ELISAを示している。抗EGFR1 HC+TGFβRII−抗EGFR1 LC融合Mabが、その標的TGFβに結合する。
図50は、二機能性ELISAを示している。抗EGFR1 HC+TGFβRII−抗EGFR1 LC融合Mabが、その標的EGFR1及びTGFβの両方に同時に結合する。
図51は、抗EGFR1 HC+TGFβRII−抗EGFR1 LC融合MabのEGFR1発現A431細胞の結合のフローサイトメトリー分析を示している。
図52は、EGFR1標的結合ELISAを示している。抗EGFR1 HC−TGFβRII+TGFβRII−抗EGFR1 LC融合Mabが、その固定標的EGFR1に結合する。
図53は、TGFβ標的結合ELISAを示している。抗EGFR1 HC−TGFβRII+TGFβRII−抗EGFR1 LC融合Mabが、その標的TGFβに結合する。
図54は、二機能性ELISAを示している。抗EGFR1 HC−TGFβRII+TGFβRII−抗EGFR1 LC融合Mabが、その標的EGFR1及びTGFβの両方に同時に結合する。
図55は、EGFR1標的結合ELISAを示している。TGFβRII−抗EGFR1 HC+TGFβRII−抗EGFR1 LC融合Mabが、その固定標的EGFR1に結合する。
図56は、TGFβ標的結合ELISAを示している。TGFβRII−抗EGFR1 HC+TGFβRII−抗EGFR1 LC融合Mabが、その標的TGFβに結合する。
図57は、二機能性ELISAを示している。TGFβRII−抗EGFR1 HC+TGFβRII−抗EGFR1 LC融合Mabが、その標的EGFR1及びTGFβの両方に同時に結合する。
図58は、二機能性ELISAを示している。抗CTLA4 HC−PD1+抗CTLA4 LC融合Mabが、その標的CTLA4及びPDL1の両方に同時に結合する。
図59は、二機能性ELISAを示している。抗CTLA4 HC+抗CTLA4 LC−PD1融合Mabが、その標的CTLA4及びPDL1の両方に同時に結合する。
図60は、二機能性ELISAを示している。PD1−抗CTLA4 HC+抗CTLA4 LC融合Mabが、その標的CTLA4及びPDL1の両方に同時に結合する。
図61は、二機能性ELISAを示している。抗CTLA4 HC−PD1+PD1−抗CTLA4 LC−PD1、抗CTLA4 HC−PD1+抗CTLA4 LC−PD1、及び抗CTLA4 HC−PD1+PD1−抗CTLA4 LC融合Mabが、それらの標的CTLA4及びPDL1の両方に同時に結合する。
図62は、二機能性ELISAを示している。PD1−抗CTLA4 HC+抗CTLA4 LC−PD1及びPD1−抗CTLA4 HC+PD1−抗CTLA4 LC融合Mabが、それらの標的CTLA4及びPDL1の両方に同時に結合する。
図63は、二機能性ELISAを示している。抗EGFR1 HC−PD1+抗EGFR1 LC融合Mabが、その標的EGFR及びPDL1の両方に同時に結合する。
図64は、二機能性ELISAを示している。抗EGFR1 HC+抗EGFR1 LC−PD1融合Mabが、その標的EGFR及びPDL1の両方に同時に結合する。

0046

発明の詳細な説明
本発明の様々な実施形態の説明を容易にし、且つ本発明の実施及び使用に用いられる様々な要素及び構成物を理解しやすくするために、本発明の説明で使用される以下の語は次の意味を有する。

0047

本明細書で使用される「ポリペプチド」、「タンパク質」、及び「ペプチド」という語は、長さ又は翻訳後修飾(例えば、グリコシル化リン酸化、脂質化、ミリスチル化ユビキチン化など)にかかわらず、アミド結合によって共有結合された少なくとも2つのアミノ酸の配列ポリマーを示すために互換的に使用される。Dアミノ酸及びLアミノ酸、並びにDアミノ酸とLアミノ酸の混合物も含まれる。

0048

キメラポリペプチドは、天然ではアミノ酸配列において通常は一緒に確認されない2つ以上の部分を有するアミノ酸配列を指す。

0049

本明細書で使用される「スペーサー/リンカー」という語は、2つの単量体タンパク質単位を結合してキメラ分子を形成し、なおかつ所望の受容体への一部の結合を可能にする分子を指す。スペーサー/リンカーの特定の例として、アミノ酸スペーサーを挙げることができ、3つのアミノ酸配列は、本質的に任意の長さ、例えば、僅か5又は200以上ものアミノ酸残基、好ましくは約5〜30のアミノ酸残基とすることができる。

0050

本明細書で使用される「治療」という語は、病理兆候を示す患者に、その兆候を軽減又は排除することを目的として施される処置を意味する。

0051

本明細書で使用される「治療有効量」という語は、キメラタンパク質が投与される対象に十分な有益な効果を与えるキメラタンパク質の量を意味する。

0052

修飾の別の例は、キメラポリペプチドに対して別の機能性を付与する異種ドメインの追加である。異種ドメインは、追加の機能を付与するのであれば、任意の小さい生物分子若しくは無機分子、又は巨大分子とすることができる。別の機能を付与する異種ドメインの特定の例として、標的(例えば、受容体リガンド、抗体など)、免疫増強機能(例えば、免疫グロブリンアジュバント)を付与し、且つ精製、単離、又は検出(例えば、myc、T7タグ、ポリヒスチジンアビジンビオチンレクチンなど)を可能にするアミノ酸配列が挙げられる。

0053

本明細書に例示されるように、ポリペプチド配列は、修飾キメラポリペプチドが非修飾キメラポリペプチドと同じ活性又は機能を実質的に有するのであれば、キメラポリペプチドを構成する一方又は両方のポリペプチド配列のアミノ酸配列の置換、変異、又は誘導体化を含み得る。

0054

本明細書で使用される「実質的に同じ活性又は機能」という語は、そのように修飾されたキメラポリペプチドについて使用される場合は、本明細書に記載される又は当技術分野で公知の非修飾ポリペプチドに関連した殆どの活性、全ての活性、又はより多くの活性をポリペプチドが維持することを意味する。

0055

本明細書に含まれる「活性」又は「機能的」である修飾キメラポリペプチドは、ルーチンの機能的アッセイによって見出すことができる。例えば、抗体結合アッセイ又は補助受容体結合アッセイを使用することにより、修飾キメラポリペプチドが活性を有するか否かを容易に決定することができる。修飾キメラポリペプチドは、非修飾キメラポリペプチドに関連した活性又は機能を維持するため、修飾キメラポリペプチドは、通常は、非修飾ポリペプチドのアミノ酸配列と「実質的に同一」又は「実質的に同種の」アミノ酸配列を有する。

0056

本明細書で使用される「実質的に同一」又は「実質的に同種の」という語は、ポリペプチド配列について使用される場合は、ポリペプチド配列が基準配列と少なくとも50%同一であることを意味する。修飾ポリペプチド及び実質的に同一のポリペプチドは、典型的には、基準ポリペプチドに対して少なくとも70%、あるいは85%、より高い可能性としては90%、最も高い可能性としては95%の相同性を有する。

0057

本明細書に説明されるように、実質的に同一又は相同のポリペプチドは、キメラポリペプチドの機能を破壊しないアミノ酸配列の位置(例えば、本明細書に説明される機能アッセイによって決定される)における付加、切断、内部欠失若しくは挿入、保存的及び非保存的置換、又は他の修飾を含む。置換の特定の例は、1つ以上のアミノ酸が、別の化学的又は生物学的に同様の残基によって置換される場合である。本明細書で使用される「保存的な置換」という語は、1つの残基の化学的又は生物学的に同様の残基での置換を指す。保存的な置換の例としては、疎水性残基、例えば、イソロイシンバリンロイシン、又はメチオニンの別の疎水性残基での置換、極性残基の別の極性残基での置換、例えば、アルギニンのリジンでの置換、グルタミン酸アスパラギン酸での置換、又はグルタミンアスパラギンでの置換などが挙げられる。当業者であれば、実質的に活性を変更することなく、他の化学的に類似した残基で修飾又は置換することができる多数のアミノ酸は分かるであろう。

0058

修飾ポリペプチドは、1つ以上のアミノ酸がその中に化学的に変化又は誘導体化された側鎖を有する「化学誘導体」をさらに含む。このような誘導体化ポリペプチドとしては、例えば、遊離アミノ基がアミン塩酸塩、p−トルエンスルホニル基、カロベンズオキシ基(carobenzoxy group)を形成するアミノ酸;遊離カルボキシ基が塩、メチル及びエチルエステルを形成するアミノ酸;遊離ヒドロキシル基が、O−アシル又はO−アルキル誘導体を形成するアミノ酸、並びに自然発生アミノ酸誘導体、例えば、プロリンの誘導体、4−ヒドロキシプロリン、リジンの誘導体、5−ヒドロキシリジンセリンの誘導体、ホモセリン、及びリジンの誘導体、オルニチンなどが含まれる。また、共有結合、例えば、環化ポリペプチドを形成する2つのシステイン残基間に形成するジスルフィド結合を変更することができるD−アミノ酸及びアミノ酸誘導体も含まれる。

0059

本明細書で使用される「単離された」又は「実質的に純粋な」という語は、本発明のキメラポリペプチド、その配列断片、及びポリヌクレオチドの修飾因子として使用される場合は、これらが人間の介入によって産生され、それらの天然のインビボ細胞環境で分離されたことを意味する。一般に、このように分離されたポリペプチド及びポリヌクレオチドは、これらが自然に結合する他のタンパク質、核酸、脂質、炭水化物、又は他の物質を実質的に含まない。

0060

本発明のポリペプチドは、当業者に周知の標準的な技術によって作製することができる。このような技術としては、限定されるものではないが、そのポリペプチドを含むことが知られている組織からの単離及び精製、並びに形質転換細胞を用いた、このようなポリペプチドをコードするクローンDNAからの発現が挙げられる。キメラポリペプチドは、宿主細胞、例えば、細菌、酵母、又は哺乳動物細胞でポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現させ、そして典型的な生化学的方法(例えば、免疫親和性精製、ゲル精製、発現スクリーニングなど)を用いた精製によって、この発現キメラポリペプチドを精製することによって得ることができる。他の周知の方法は、Deutscher et al., 1990に記載されている。あるいは、キメラポリペプチドは、化学的に合成することができる。純度は、任意の適切な方法、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法、及び続くゲルの染色(例えば、銀染色)又はHPLC分析によって測定することができる。

0061

本発明は、キメラポリペプチド、その断片、及び相補配列をコードするポリヌクレオチド配列をさらに提供する。本明細書で使用される「核酸」、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、及び「プライマー」という語は、二本鎖又は一本鎖、線状又は環状のデオキシリボ核酸(DNA)又はリボ核(RNA)を指すために互換的に使用される。RNAは、スプライシングされていない又はスプライシングされたmRNArRNAtRNA、又はアンチセンスRNAiであり得る。DNAは、相補DNA(cDNA)、ゲノムDNA、又はアンチセンスであり得る。特に、本発明のキメラポリペプチドをコードするように機能し得るヌクレオチド類似体及び誘導体、例えば、ヌクレアーゼ分解に耐性のあるものが含まれる。ヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドは、本明細書に記載される本発明の核酸ワクチンに特に有用である。

0062

「単離された」又は「実質的に純粋な」ポリヌクレオチドは、核酸が、起源とする生物の自然発生のゲノムに直接的に隣接した5’末端又は3’末端のいずれかを備えたコード配列と直接的に隣接していないことを意味する。従って、この語は、例えば、組換えDNA(例えば、PCRによって生じるcDNA、又はクローニング中に生じる制限エンドヌクレアーゼ処置によって生じるゲノムDNA断片)、並びにベクターに組み込まれた組換えDNA、自己複製プラスミド若しくはウイルス、又は原核生物若しくは真核生物のゲノムDNAを含む。

0063

本発明のポリヌクレオチド配列は、当技術分野で公知の標準的な技術(例えば、分子クローニング化学合成)を用いて得ることができ、純度は、ポリアクリルアミド若しくはアガロースゲル電気泳動法、及び配列解析などによって決定することができる。ポリヌクレオチドはまた、当技術分野で周知のハイブリダイゼーション又はコンピュータベースの技術を用いて単離することもできる。このような技術としては、限定されるものではないが:(1)相同なヌクレオチド配列を検出するためのゲノムDNA又はcDNAライブリーのプローブとのハイブリダイゼーション;(2)DNA配列によって発現されるポリペプチドの抗体スクリーニング(例えば、発現ライブラリーを用いる);(3)目的の核酸配列にアニーリングすることができるプライマーを用いたゲノムDNA又はcDNAのポリメラーゼ連鎖反応(PCR);(4)関連した配列についての配列データベースコンピューター検索;(5)核酸サブトラクションライブラリーディファレンシャルスクリーニングが挙げられる。

0064

本発明はまた、実質的に相同なポリヌクレオチドも含む。本明細書で使用される「相同」という語は、核酸分子について使用される場合は、2つのヌクレオチド配列間の類似性を指す。両方の分子のヌクレオチド位置が同一のヌクレオチドによって占められている場合は、これらの分子は、その位置で相同である。「実質的に相同な」核酸配列は、少なくとも50%相同、より高い可能性としては少なくとも75%相同、最も高い可能性としては90%以上相同である。実質的に相同な本発明のキメラポリペプチドと同様に、キメラポリペプチドをコードする本発明のポリヌクレオチドに実質的に相同なポリヌクレオチドは、相同である配列に関連した活性又は機能の殆ど又は全てを維持するポリペプチドをコードする。ポリヌクレオチドの場合、配列間の比較の長さは、通常は、少なくとも30ヌクレオチド、あるいは少なくとも50ヌクレオチド、より高い可能性としては少なくとも75ヌクレオチド、最も高い可能性としては110ヌクレオチド以上である。ポリヌクレオチド配列のギャップ及びミスマッチオリゴヌクレオチドの原因となる相同配列を見つけ出すためのアルゴリズムは当技術分野で公知であり、例えば、BLAST(Altschul, 1990を参照)がある。

0065

本発明のポリヌクレオチドは、必要に応じて:とするか、若しくは細胞膜を通過するのに適した担体(例えば、ポリヌクレオチド−リポソーム複合体若しくはコロイド分散系)に含める、ベクター(例えば、レトロウイルスベクター、及びアデノウイルスベクターなど)に含める、又はビーズ若しくは他の異種ドメイン(例えば、抗体、リガンド、ビオチン、ストレプトアビジン、及びレクチンなど)を挿入するために連結する、又は本明細書に開示される若しくは当技術分野で公知の他の適切な組成物とすることができる。従って、ポリヌクレオチド送達のウイルス手段又は非ウイルス手段を達成することができ、これらの手段が想定される。本発明のポリヌクレオチドは、別の機能性、例えば、本明細書に説明される様々な異種ドメインを有するポリペプチドをコードする、このポリヌクレオチドに連結された追加の核酸配列も含み得る。

0066

本発明のポリヌクレオチドは、例えば、医薬製剤中での安定性を高めるためにヌクレアーゼに耐性を有するように修飾することもできる。記載されるポリヌクレオチドは、特に、本明細書に開示される又は当技術分野で公知の発現系にこのようなポリヌクレオチドが含められる場合に、本発明のキメラポリペプチドをコードするのに有用である。従って、発現ベクターを含むポリヌクレオチドも含まれる。

0067

細胞での増殖又は発現の場合は、本明細書に記載されるポリヌクレオチドをベクターに挿入することができる。「ベクター」という語は、核酸の挿入又は取込によって操作することができるプラスミド、ウイルス、又は当技術分野で公知の他のビヒクルを指す。このようなベクターは、遺伝子操作に使用することができる(即ち、クローニング「ベクター」)、又は挿入されたポリヌクレオチドを転写若しくは翻訳するために使用することができる(即ち、「発現ベクター」)。ベクターは、通常は、細胞での増殖のための複製起源及びプロモーターを少なくとも含む。発現ベクター内に存在するプロモーターを含む制御要素は、適切な転写及び翻訳を促進するために含められる(例えば、イントロンのスプライシングシグナル、mRNAのインフレーム翻訳及び停止コドンを可能にする遺伝子の正しい読み枠の維持)。本明細書に記載されるポリヌクレオチドのインビボ又はインビトロでの発現は、核酸に機能的に連結されたプロモーターによって実現することができる。

0068

「プロモーター」は、プロモーターが機能的に連結された核酸の転写を誘導するのに十分な最小の核酸配列を指す(Bitter 1987を参照)。プロモーターは、構成的に転写を誘導することができる、組織特異的とすることができる、又は誘導性若しくは抑制性の転写を実現することができ、このような要素は、通常は、そのように制御される遺伝子の5’領域若しくは3’領域に位置する。

0069

本明細書で使用される「機能的に連結された」という語は、選択されたポリヌクレオチド(例えば、キメラポリペプチドをコードする)及び調節配列が、適切な分子(例えば、転写活性化タンパク質)が調節配列に結合されると転写を可能にするように結合されていることを意味する。典型的には、プロモーターは、ポリヌクレオチドの5’末端に位置し、プロモーターがポリヌクレオチドの発現を調節することを可能にするように転写開始部位近接することができる。

0070

細菌系でクローニングする場合は、構成的プロモーター、例えば、T7など、及び誘導プロモーター、例えば、バクテリオファージλ、plac、ptrp、ptacなどのpLを使用することができる。哺乳動物細胞系でクローニングする場合は、構成的プロモーター、例えば、SV40及びRSVなど、又は哺乳動物細胞のゲノムに由来する誘導プロモーター(例えば、メタロチオネインプロモーター)若しくは哺乳動物ウイルスに由来する誘導プロモーター(例えば、マウス乳癌ウイルス長い末端反復配列、アデノウイルス後期プロモーター)を使用することができる。組換えDNA又は合成技術によって作製されるプロモーターを使用して、本発明の核酸配列の転写を可能にすることもできる。

0071

組換えウイルス又はウイルス要素を利用して発現を誘導する哺乳動物発現系を操作することができる。例えば、アデノウイルス発現ベクターを使用する場合は、核酸配列を、アデノウイルス転写/翻訳制御複合体、例えば、後期プロモーター及び三部リーダー配列(tripartite leader sequence)に結合することができる。あるいは、ワクチンウイルス7.5Kプロモーターを使用することができる(Mackett 1982;Mackett 1984;Panicali 1982を参照)。

0072

酵母での発現の場合は、構成的プロモーター又は誘導プロモーターを含む多数のベクターを使用することができる(Ausubel 1988;Grant 1987;Glover 1986;Bitter 1987;及びStrathem 1982を参照)。ポリヌクレオチドを、(例えば、市販されているインビトロ転写/翻訳キットを用いて)インビトロでの発現のために発現ベクターに挿入しても良いし、又はインビボの適した細胞、臓器、組織、又は生物への適切な核酸の導入によって原核生物又は真核生物での発現を促進するプロモーター配列を含む発現ベクターに挿入しても良い。

0073

本明細書で使用される「導入遺伝子」は、技術によって宿主細胞に導入されるポリヌクレオチドの任意の断片であり、その細胞から発生する生物の一部となる。導入遺伝子は、1つ以上のプロモーター及びその他のDNA、例えば、全てが選択されたDNAに機能的に連結される、選択されたDNAの発現に必要なイントロンを含むことができ、且つエンハンサー配列を含み得る。導入遺伝子は、トランスジェニック生物に対して部分的若しくは完全に異種(即ち、外来性)であるポリヌクレオチドを含んでも良いし、又はこの生物の内在性遺伝子と同種の遺伝子であっても良い。導入遺伝子は、宿主細胞のゲノムに組み込んでも良いし、又は自己複製プラスミドとして維持しても良い。

0074

本明細書で使用される「宿主細胞」は、増殖される、転写される、又は発現されるポリペプチドをコードすることができるポリヌクレオチドが導入される細胞である。この語は、導入される宿主細胞のあらゆる子孫も含む。全ての子孫は、複製中に生じる突然変異によって親細胞と同一ではないこともあることを理解されたい。宿主細胞は、限定されるものではないが、細菌、酵母、昆虫細胞、及び哺乳動物細胞を含む。例えば、組換えバクテリオファージポリヌクレオチド、プラスミド核酸、又はコスミド核酸発現ベクターで形質転換された細菌;組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母;組換えウイルス発現ベクター(例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV;タバコモザイクウイルス、TMV)に感染した、若しくは組換えプラスミド発現ベクター(例えば、Tiプラスミド)で形質転換された植物細胞系、組換えウイルス発現ベクター(例えば、バキュロウイルス)に感染した昆虫細胞系、又は組換えウイルス発現ベクター(例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、ワクチンウイルス)に感染した動物細胞系、又は安定発現のために操作された形質転換動物細胞系。

0075

本明細書で使用される「形質転換」という語は、細胞にとって外来性のポリヌクレオチド(例えば、導入遺伝子)の組み込みの後での細胞における遺伝子の変化を意味する。従って、「形質転換細胞」は、組換え技術によってポリヌクレオチドが導入された細胞又はその子孫である。宿主細胞の形質転換は、当業者に公知の従来技術によって行うことができる。宿主細胞が真核細胞である場合は、DNA形質転換の方法として、例えば、リン酸カルシウムマイクロインジェクションエレクトロポレーションリポソーム、及びウイルスベクターが挙げられる。真核細胞もまた、本発明のポリヌクレオチド配列又はその断片、及び本明細書に記載される又は当技術分野で公知の、選択マーカーをコードする第2のDNA分子で形質転換することもできる。別の方法では、真核生物ウイルスベクター、例えば、シミアンウイルス40(SV40)又はウシパピローマウイルスを使用して真核細胞を一過性に感染させる又は形質転換して、タンパク質を発現させる(Gluzman 1982を参照)。宿主が原核細胞(例えば、大腸菌(E. coli))である場合は、DNAを取り込むことができるコンピテント細胞を、指数増殖期の後に採取され、続いて当技術分野で周知の手順を用いるCaCl2法によって処置された細胞から調製することができる。原核生物の形質転換もまた、宿主細胞の原形質融合によって行うことができる。

0076

本発明のキメラポリペプチド、ポリヌクレオチド、及びこのポリヌクレオチドを含む発現ベクターを、標準的な技術を用いてリポソーム内封入して、細胞又は生物全体に導入することができる。ポリヌクレオチドの送達にはカチオン性リポソームが好ましい。インビトロ又はインビボでのタンパク質及びポリヌクレオチドを含む様々な組成物の導入でのリポソームの使用は当業者に公知である。

0077

リポソームは、対応する細胞受容体が見つかるように、リガンド、例えば、ポリペプチドのリポソーム調製物への添加によって目的の細胞型又は組織を標的とすることができる。モノクローナル抗体も標的化に使用することができる。多様な細胞表面タンパク質に特異的な多くのこのような抗体は、当業者に公知であり、且つ利用可能である。選択されたリガンドは、予め形成されたリポソームの脂質アンカーに共有結合するか、又はリポソーム調製中に取り込まれる(Lee 1994及びLee 1995を参照)。

0078

本発明のキメラポリペプチド又はポリヌクレオチドをヒトに投与するために、本発明は、開示されるキメラポリペプチド又はポリヌクレオチドを含む医薬製剤も提供する。従って、対象に投与される組成物は、「薬学的に許容され得る」又は「生理学的に許容され得る」製剤に含められる。

0079

本明細書で使用される「薬学的に許容され得る」及び「生理学的に許容され得る」という語は、好ましくは過度の有害な副作用(例えば、悪心頭痛など)を引き起こすことなく、対象に投与することができる担体、希釈剤、及び賦形剤などを指す。投与されるこのような調製物は、滅菌水溶液又は非水溶液、懸濁液、及びエマルションを含む。非水性溶媒の例としては、プロピレングリコールポリエチレングリコール植物油、例えば、オリーブ油、及び注射可能な有機エステル、例えば、オレイン酸エチルが挙げられる。水性担体としては、生理食塩水及び緩衝媒質を含め、水、アルコール水溶液、エマルション、又は懸濁液が挙げられる。ビヒクルとしては、塩化ナトリウム液、リンガーデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸リンガー液、又は固定油が挙げられる。静脈内ビヒクルとしては、流体及び栄養補給物、並びに電解質補給物(例えば、リンガーデキストロースをベースとするもの)などが挙げられる。防腐剤及び他の添加物、例えば、抗菌剤抗酸化物質キレート剤、及び不活性ガスなども含めることができる。当技術分野で周知の対象に投与するのに適した様々な医薬製剤は、本発明の方法に利用可能である(例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990);及びThe Merck Index, 12th ed., Merck Publishing Group, Whitehouse, NJ (1996))。

0080

投与される組成物の作用又は制御された送達の期間の調節は、この組成物を粒子又はポリマー物質、例えば、ポリエステルポリアミン酸ヒドロゲルポリビニルピロリドンエチレン酢酸ビニルメチルセルロースカルボキシメチルセルロース硫酸プロタミン、又はラクチドグリコリドコポリマーポリラクチド/グリコリドコポリマー、又はエチレン酢酸ビニルコポリマーに含めることによって達成することができる。組成物の放出速度は、このような巨大分子の濃度又は組成を変更することによって制御することができる。コロイド分散系としては、巨大分子複合体、ナノカプセルミクロスフェア、ビーズ、並びに水中油型エマルションミセル、混合物ミセル、及びリポソームを含む脂質系が挙げられる。

0081

本発明の方法によって投与される組成物は、注射による非経口投与によって、時間をかけた漸進的潅流によって、又はボーラス投与によって、又は微細加工植え込み装置によって投与することができる。本組成物は、吸入、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、腔内(例えば、又は肛門)、経皮的、局所的、又は血管内に投与することができる。本組成物は、複数回投与で投与することができる。有効量は、当業者が容易に決定することができる。

0082

特段の記載がない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本発明が属する分野の一般的な技術者が一般に理解する意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様又は同等の方法及び材料を本発明の実施又は試験に使用することができるが、適切な方法及び材料が以下に説明される。本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。本発明は、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定しない以下の実施例にさらに記載される。

0083

1.癌の標的用の抗EGFR1−PD1融合タンパク質構築物
抗EGFR(セツキシマブ)は、頭部及び頸部の扁平上皮癌(放射線療法で局在的又は局所的に進行し、白金を用いた治療法の後に転移した)及びEGFR発現転移性大腸癌オキサリプラチン及びイリノテカンの両方を用いた化学療法で失敗した後の患者、又はイリノテカンを用いた化学療法に対して不耐性の患者での単剤療法)に対して承認された。K−RAS突然変異を有する大腸癌(CRC)患者には利用できない。

0084

様々な試験では、mCRC患者の約55〜60%が、ファーストライン設定(first line setting)においてセツキシマブに応答するが、この応答も一過性である(1.5〜2か月の無進行生存(PFS)利点)(EPAR)。相当数の患者が、セツキシマブに応答しない、又は治療法に対して耐性を有するようになる。頭部及び頸部の再発転移性癌では、35%の患者しかセツキシマブに応答せず、化学療法では僅か2〜3か月の全生存(OS)及び(PFS)利点である。

0085

明らかに、これらの両方の指標においてセツキシマブ療法の効果を改善するための、殆ど満たされていない要望が存在する。さらに、EGFRは、胃癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、及び膵臓癌でも発現する。しかしながら、セツキシマブは、標準治療において、これらの指標において有意な利点を一切証明することができなかった。従って、本発明は、セツキシマブを免疫調節療法と組み合わせることによって改善を提供する。

0086

プログラム死−1(PD−1)は、活性化後にT細胞で発現される抑制性受容体である。PD−1は、APC上でそのリガンドPD−L1に結合するとT細胞の活性を下方制御することが示されている。多くの腫瘍は、PD−L1を構成的に発現し、その過剰発現は、低下した腫瘍免疫、より侵攻性の疾患、及び生存の低下に関連している(Thompson 2004を参照)。これまでに、PD−L1の発現は、腎細胞癌(RCC)、卵巣癌、及び黒色腫の患者の予後不良に関連することが実証されている。卵巣癌、肺癌、及び乳癌、腎細胞癌、頭部及び頸部の扁平上皮癌、食道癌グリア芽腫胸腺腫、結腸癌、膵臓癌、及び黒色腫の患者から新たに単離された腫瘍サンプル免疫組織化学的分析により、大部分がB7−H1を発現することが分かった(Flies 2011;Nomi 2007を参照)。いくつかの前臨床試験により、PD1とPDL1との相互作用を阻害することによる腫瘍拒絶の増大が実証された。近年、抗PD1及びPD−L1を用いる治療法により、黒色腫及び他の充実性腫瘍におけるかなりの活性が実証され、これらの利用が、最も有望な抗癌療法の1つであることが確認された。

0087

セツキシマブを用いる治療法は、免疫調節と組み合わせることによって、免疫抑制環境の排除又は耐性の発生の遅延を改善することができる。さらに、下流経路での突然変異によってセツキシマブに対する耐性ができた患者はなお、本発明の融合タンパク質がEGFR受容体に結合して、腫瘍によって発現されるPD−L1の効果をなくすため、抗EGFRl−PD−1から恩恵を受けることができ、T細胞が抗腫瘍応答をマウントすることが可能となる。従って、本発明の融合タンパク質は、腫瘍細胞の表面上のEGFR及びPD−L1の両方に結合することができる。

0088

本発明の抗EGFRl−PD1融合タンパク質構築物は、大腸癌、頭部及び頸部の扁平上皮癌、非小細胞肺癌、胃癌、及び膵臓癌に使用することができる。

0089

分子の設計及び選択:
本発明の抗体融合分子は、勝負治療特性を有する。この分子は、抗EGFR1(セツキシマブ)の完全な活性を維持すると同時に、腫瘍環境ではPD−L1受容体結合活性も有する。本明細書で癌治療のために開発された抗EGFRl−PD1融合タンパク質の新たな分子は、上述の理由から、重鎖のC末端のアミノ酸リジン「K」が欠失している。この融合タンパク質の設計の主な目的は、機能が損なわれることなく抗EGFR1分子を無傷のまま維持し、且つ抗EGFR1抗体の様々な位置へのPD1分子の融合を可能にすることである。即ち、HC C末端、LC C末端、HCN末端、及び/又はLC N末端への融合、並びに図6に示されているように両方の鎖への二重融合である。

0090

以下の構築物が設計された。

0091

0092

CHO細胞での上記の融合構築物の発現:
抗EGFR1−PD1の個々のドメインのコドン最適化ヌクレオチド配列をCHO細胞での発現のために最適化した。このような最適化配列(配列番号1、2、3、及び4)を、表2に記載されているプライマーを用いて哺乳動物発現ベクターで構築した。

0093

0094

上の表に示されているcDNAプライマーセットを用いて、構築物を図11に示されているように構築した。

0095

2.癌治療のための抗EGFR1−TGFβRII融合タンパク質
高レベルのTGFβが、黒色腫、並びに乳癌、結腸癌、食道癌、胃癌、肝癌、肺癌、膵臓癌、及び前立腺癌、さらには血液悪性腫瘍を含む多くの種類の腫瘍によって産生される(Teicher 2001;Dong 2006を参照)。TGFβは、IL−2の遮断及びT−regsの産生を含む他の機構によりT細胞及びNK細胞に対して免疫抑制性であることが知られている。いくつかの証拠となる情報は、TGFβの活性を無効にすることにより、T細胞の抗腫瘍効果を増強できることを示唆している(Wrzesinski 2007)。さらに、TGFβは、上皮を介して間葉に広がる腫瘍の成長を助長し、血管形成を促進することができる。TGFβの発現はまた、患者の予後不良及び早期再発にも関連している。しかしながら、免疫応答の調節におけるTGFβの多面効果を考慮すると、TGFβ活性の全体的な阻害により、広範な抗炎症活性が生じ得ることが示されている。従って、腫瘍近傍におけるTGFβの局所的な減少は、免疫抑制環境を調節する別の方法であり得る。本発明の抗EGFR1−TGFβRII融合タンパク質は、腫瘍細胞上のEGFRに結合してTGFβを腫瘍の周りに固定し、腫瘍細胞に対する免疫応答を増強する。

0096

分子の設計及び選択:
この目的は、勝負治療特性を有する抗体融合分子を設計することである。この分子は、抗EGFR1(セツキシマブ)の完全な活性を維持するべきである一方、腫瘍環境ではTGFβ結合活性を有するべきである。抗EGFR1IgG分子のアミノ酸配列は、リジンが重鎖のC末端で発現しなかったことを除いて維持された。単一融合及び二重融合の両方並びに発現レベルが表3に示され、TGFβRIIは抗EGFR1に融合した。

0097

0098

CHO細胞での上記の融合構築物の発現:
抗EGFR1−TGFβRIIの個々のドメインのコドン最適化ヌクレオチド配列をCHO細胞での発現のために最適化した。このような配列(配列番号1、2、4、及び7)を哺乳動物発現ベクターで構築した。発現構築物は図21に示されている。

0099

所望の細胞系を得るための上記のベクターの組み合わせのトランスフェクション
上記の作製された発現構築物を、表4に示されている以下の組み合わせでCHO細胞にトランスフェクトして、図21に示されている構築物を用いて以下の融合タンパク質を産生させた。

0100

0101

プロテインAカラムを用いる融合Mab上清の精製:
組換えタンパク質を産生するCHO細胞の培養上清を用いる融合モノクローナル抗体(MAb)。

0102

手順:
手順は、C10/10又はXK26カラム及びMab Select Xtra親和性樹脂を用いるIgGの小規模精製プロセスを詳細に説明する。このプロトコルによって調製されるサンプルは様々な分析に使用することができる。

0103

工程:
滅菌条件下でモノクローナル抗体又は融合モノクローナル抗体を産生する組換え細胞系から分泌される培養上清を力価及び内毒素について試験した;
Mab Select XtraプロテインA樹脂を用いる親和性クロマトグラフィーを、結合緩衝液洗浄して平衡化した;
上清のpHを0.5Mリン酸塩を用いてカラムと同じpHに調整した;
上清を、最大の結合を達成するために0.5ml/分の流速でカラムに通し、カラムに結合させた;
全ての融合MabがFc領域を介して結合し、通された残りの不純物は、流れるときに通過する;
カラムを平衡緩衝液で洗浄した;
結合した融合Mabを、0.1Mグリシン、pH3.0で溶出させた;
溶出したタンパク質を調整して中性pH又は安定な製剤のpHに戻した;
精製されたタンパク質を、安定性によって−20℃又は2〜8℃で保存した。

0104

SDS PAGEを用いるプロテインA精製融合Mabの分析:
得られたトランスフェクト上清を、プロテインA親和性カラムを用いて精製した。後に、これらを還元及び非還元SDS-PAGEで分析して、図22に示されているように分子の完全性を調べ、プロテインA精製サンプルでは12%還元SDS-PAGEで分析した。予想通り、全ての融合パートナーは、SDS-PAGEに予想パターンを示している。LC融合とHCは、近くを泳動しているが、バンドは分離している。この高い移動性は、8N−グリコシル化部位によるものであり得る(LC上でTGBRII 3*2=6+2)。

0105

図23は、6%非還元SDS-PAGEで分析されたプロテインA精製サンプルの結果を示し、アミノ酸組成物は同じであるが、移動性が異なっている。これは、分子内でのTGFβRIIの位置及びアクセスに基づいたグリコシル化パターン変動レベルによるものであり得る。

0106

3.癌標的のための抗CTLA4−PD1融合タンパク質構築物
卵巣癌、肺癌、及び乳癌、腎細胞癌、頭部及び頸部の扁平上皮癌、食道癌、グリア芽腫、胸腺腫、結腸癌、膵臓癌、及び黒色腫の患者から新たに単離された腫瘍サンプルの免疫組織化学的分析により、大部分がB7−H1を発現することが分かった(Flies 2011;Nomi 2007を参照)。いくつかの前臨床試験により、PD1とPDL1との相互作用を阻害することによる腫瘍拒絶の増大が実証された。近年、抗PD1及びPD−L1を用いる治療法により、黒色腫及び他の充実性腫瘍におけるかなりの活性が実証され、これらの利用が、最も有望な抗癌療法の1つであることが確認された。

0107

抗CTLA4は、T細胞の同時刺激を可能にし得るが、PD−L1とPD−1との相互作用によってなお抑制され得る。これは、少数の患者しか抗CTLA4抗体に対する応答を有していない理由の1つであり得る。抗CTLA4及びPD1の両方の融合抗体は、抗CTLA4がT細胞の同時刺激を可能にし、PD1が腫瘍細胞上のPD−L1に結合して腫瘍微小環境におけるT細胞の免疫抑制を無効にするため、いずれか一方の作用物質単独よりも効果的である。これは、抗CTLA4の単独使用が免疫の破綻的な有害事象をもたらすため、抗CTLA4よりも安全でさえあり得る。

0108

分子の設計及び選択:
この目的は、勝負治療特性を有する抗体融合分子を設計することである。この分子は、抗CTLA4(イピリムマブ)の完全な活性を維持するべきである一方、腫瘍環境ではPD L1受容体結合活性を有するべきである。重鎖のC末端のリジンの除去を除いて、抗CTLA4IgG分子の完全なアミノ酸配列を使用した。15個のアミノ酸のリンカーが、PD1と抗CTLA4との間に位置していた。表5に示されている以下の構築物の組み合わせは、図24に示されているように設計した。上記の融合タンパク質構築物の詳細は以下の通りである。

0109

0110

CHO細胞での上記の融合構築物の発現:
抗CTLA4−PD1の個々のドメインの完全なヌクレオチド配列をCHO細胞での発現のためにコドン最適化した(配列番号3、4、5、及び6)。cDNAを合成した。構築物を哺乳動物発現ベクターで構築した。図33に示される構築物を用いた抗CTLA4−PD1融合タンパク質の発現。

0111

図33に示されている開発された発現構築物を、以下の組み合わせ(表6)でCHO細胞にトランスフェクトして以下の融合タンパク質を産生させた。各構築物に対して得られた力価が最後の列に示されている。

0112

0113

融合タンパク質の精製及び特徴付け
手順は、C10/10又はXK26カラム及びMab Select Xtra親和性樹脂を用いるIgGの小規模精製プロセスの使用を説明する。このプロトコルによって調製されるサンプルは様々な分析に使用することができる。

0114

工程:
滅菌条件下でモノクローナル抗体又は融合モノクローナル抗体を産生する組換え細胞系から分泌される培養上清を力価及び内毒素について試験した;
Mab Select XtraプロテインA樹脂を用いる親和性クロマトグラフィーを、結合緩衝液で洗浄して平衡化した;
上清のpHを0.5Mリン酸塩を用いてカラムと同じpHに調整した;
上清を、最大の結合を達成するために0.5ml/分の流速でカラムに通し、カラムに結合させた;
全ての融合MabはFc領域を介して結合し、通された残りの不純物は、流れるときに通過する;
カラムを平衡緩衝液で洗浄した;
結合した融合Mabを、0.1Mグリシン、pH3.0で溶出させた;
溶出したタンパク質を調整して中性pH又は安定な製剤のpHに戻した;そして
精製されたタンパク質を、安定性によって−20℃又は2〜8℃で保存する。

0115

4.抗EGFR1 HC−TGFβRII+抗EGFR1 LC(Fmab1)
結合ELISA手順:
融合Mabを、3つの異なるELISA:(1)EGFR1標的結合ELISA、(2)TGFβ標的結合ELISA、及び(3)二機能性ELISAにおいて、その標的に結合する能力について試験した。

0116

標的結合ELISAでは、標的(rhEGFR−Fcキメラ又はTGFβ)をNUNCmaxisorbプレートで、4℃で一晩コーティングした。このプレートを洗浄し、次いでスーパーブロック(superblock)で、室温で2時間ブロックした。異なる希釈度の融合Mab又は陰性対照抗体をプレートに添加した。プレートを室温で1時間インキュベートした。融合Mabの結合を、ビオチン化抗ヒトIgGF(ab)2二次抗体の添加、これに続くペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジンとの室温での1時間のインキュベートによって検出した。TMB基質溶液を添加し、反応を1N H2SO4で停止させた。吸光度をBioTek Synergy H4 Hybridリーダーで、450nmで測定した。

0117

二機能性ELISAでは、rhEGFR−FcキメラをNUNCmaxisorbプレートで、4℃で一晩コーティングした。このプレートを洗浄し、次いでスーパーブロックで、室温で2時間ブロックした。異なる希釈の融合Mab又は陰性対照抗体をプレートに添加した。プレートを室温で1時間インキュベートした。洗浄後、TGFβを添加し、プレートを室温で1時間インキュベートした。プレートを洗浄し、抗TGFβ−ビオチンを添加し、プレートを室温で1時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ストレプトアビジン−HRPを添加し、プレートを室温で1時間インキュベートした。洗浄後、TMB基質溶液を添加し、反応を1N H2SO4で停止させた。吸光度をBioTek Synergy H4 Hybridリーダーで、450nmで測定した。

0118

結果:
抗EGFR1 HC−TGFβRII+抗EGFR1 LC融合Mabの標的EGFR1(図34)及びTGFβ(図35)の両方に対する結合は、抗EGFR1−TGFβRIIと同等であった。抗EGFR1 HC−TGFβRII+抗EGFR1 LC融合Mabもまた、二機能性ELISAで試験して、Mabの抗EGFR1ドメイン及びTGFβRIIドメインがそれぞれの標的に互いに干渉することなく結合できるか否かを決定した。図36から分かるように、抗EGFR1HC−TGFβRII+抗EGFR1 LC融合Mabがその両方の標的に結合し、融合Mabの構造により、いずれかの標的への結合において干渉が全く存在しないことを示唆している。

0119

EGFR1を発現する細胞への結合:
手順:
A−431細胞を、70〜80%のコンフルエンスに達するまでフラスコで増殖させた。これらの細胞をトリプシン処理して回収した。これらの細胞を、異なる希釈度の抗EGFR1 HC−TGFβRII+抗EGFR1 LC融合Mab又は対照Igで、2〜8℃で30分間染色した。これらの細胞を洗浄し、抗ヒトIgG−FITCコンジュゲートと共に2〜8℃で30分間インキュベートした。洗浄後、これらの細胞をフローサイトメーターで分析した。FSCSSプロフィールに基づいて生細胞ゲートをかけた。ゲートがかけられた集団の全MFIを記録した。

0120

結果:
抗EGFR1 HC−TGFβRII+抗EGFR1 LC融合体はA−431細胞を発現するEGFRに用量依存的に結合する(図37)。抗EGFR1 HC−TGFβRII+抗EGFR1 LCの結合は、抗EGFR1−TGFβRIIの結合と同等である。

0121

抗体依存性細胞傷害活性
手順:
A−431細胞を、70〜80%のコンフルエンスに達するまでフラスコで増殖させた。これらの細胞をトリプシン処理して回収し、そして96ウェルプレート播種した。これらの細胞を、異なる希釈度の抗EGFR1 HC−TGFβRII+抗EGFR1 LC融合Mab又は対照Igで、2〜8℃で30分間標識した。標識した細胞を、新たに単離されたヒトPBMCと37℃、5%CO2で24時間共インキュベートした。Cyto-Tox-Glo細胞傷害性アッセイキットを用いて細胞傷害性を測定した。

0122

結果:
抗EGFR1 HC−TGFβRII+抗EGFR1 LC融合体は、ヒトPBMCエフェクター細胞によるEGFR発現A−431細胞のADCCを媒介する。ADCCは用量依存性である(図38)。これらの結果は、融合MabのFc部分が無傷で機能性であることを示唆している。

0123

増殖の抑制
手順:
A−431細胞を、70〜80%のコンフルエンスに達するまでフラスコで増殖させた。これらの細胞をトリプシン処理して回収し、そして96ウェルプレートに播種した。異なる希釈度の抗EGFR1 HC−TGFβRII+抗EGFR1 LC融合Mab又は対照Igをこれらの細胞に添加した。プレートを37℃、5%CO2で3日間インキュベートした。3日目に、細胞増殖をAlamarBlue法によって測定した。

0124

結果:
抗EGFR抗体、例えば、セツキシマブは、EGFR1発現細胞の増殖を抑制することが知られている。図39に示されているように、抗EGFR1 HC−TGFβRII+抗EGFR1 LC融合Mabの抗EGFR部分は無傷であり、抗増殖活性を有する。

0125

5.抗EGFR1 HC+抗EGFR1 LC−TGFβRII(Fmab2)
結合ELISA:手順:
抗EGFR1 HC+抗EGFR1 LC−TGFβRII融合Mabを、3つの異なるELISA:(1)EGFR1標的結合ELISA、(2)TGFβ標的結合ELISA、及び(3)二機能性ELISAにおいて、その標的に結合する能力について試験した。

0126

標的結合ELISAでは、標的(rhEGFR−Fcキメラ又はTGFβ)をNUNCmaxisorbプレートで、4℃で一晩コーティングした。このプレートを洗浄し、次いでスーパーブロックで、室温で2時間ブロックした。異なる希釈度の融合Mab又は陰性対照抗体をプレートに添加した。プレートを室温で1時間インキュベートした。融合Mabの結合を、ビオチン化抗ヒトIgGF(ab)2二次抗体の添加、これに続くペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジンとの室温での1時間のインキュベートによって検出した。TMB基質溶液を添加し、反応を1N H2SO4で停止させた。吸光度をBioTek Synergy H4 Hybridリーダーで、450nmで測定した。

0127

二機能性ELISAでは、rhEGFR−FcキメラをNUNCmaxisorbプレートで、4℃で一晩コーティングした。このプレートを洗浄し、次いでスーパーブロックで、室温で2時間ブロックした。異なる希釈の融合Mab又は陰性対照抗体をプレートに添加した。プレートを室温で1時間インキュベートした。洗浄後、TGFβを添加し、プレートを室温で、1時間インキュベートする。プレートを洗浄し、抗TGFβ−ビオチンを添加し、プレートを室温で1時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ストレプトアビジン−HRPを添加し、プレートを室温で1時間インキュベートした。洗浄後、TMB基質溶液を添加し、反応を1N H2SO4で停止させた。吸光度をBioTek Synergy H4 Hybridリーダーで、450nmで測定した。

0128

結果:
抗EGFR1 HC+抗EGFR1 LC−TGFβRII融合Mabの標的EGFR1(図40)及びTGFβ(図41)の両方に対する結合は、抗EGFR1−TGFβRIIと同等であった。抗EGFR1 HC+抗EGFR1 LC−TGFβRII融合Mabもまた、二機能性ELISAで試験して、Mabの抗EGFR1ドメイン及びTGFβRIIドメインがそれぞれの標的に互いに干渉することなく結合できるか否かを決定した。図42から分かるように、抗EGFR1HC+抗EGFR1 LC−TGFβRII融合Mabがその両方の標的に結合し、融合Mabの構造により、いずれかの標的への結合において干渉が全く存在しないことを示唆している。

0129

増殖の抑制
手順:
A−431細胞を、70〜80%のコンフルエンスに達するまでフラスコで増殖させた。これらの細胞をトリプシン処理して回収し、そして96ウェルプレートに播種した。異なる希釈度の抗EGFR1 HC+抗EGFR1 LC−TGFβRII融合Mab又は対照Igをこれらの細胞に添加した。プレートを37℃、5%CO2で3日間インキュベートした。3日目に、細胞増殖をAlamarBlue法によって測定した。

0130

結果:
抗EGFR抗体、例えば、セツキシマブは、EGFR1発現細胞の増殖を抑制することが知られている。図43に示されているように、抗EGFR1 HC+抗EGFR1 LC−TGFβRII融合Mabの抗EGFR部分は無傷であり、抗増殖活性を有する。

0131

6.TGFβRII抗EGFR1 HC+抗EGFR1 LC(Fmab3)
結合ELISA:手順:
融合Mabを、3つの異なるELISA:(1)EGFR1標的結合ELISA、(2)TGFβ標的結合ELISA、及び(3)二機能性ELISA(Bifunctional ELISA)において、その標的に結合する能力について試験した。

0132

標的結合ELISAでは、標的(rhEGFR−Fcキメラ又はTGFβ)をNUNCmaxisorbプレートで、4℃で一晩コーティングした。このプレートを洗浄し、次いでスーパーブロックで、室温で2時間ブロックした。異なる希釈度の融合Mab又は陰性対照抗体をプレートに添加した。プレートを室温で1時間インキュベートした。融合Mabの結合を、ビオチン化抗ヒトIgGF(ab)2二次抗体の添加、これに続くペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジンとの室温での1時間のインキュベートによって検出した。TMB基質溶液を添加し、反応を1N H2SO4で停止させた。吸光度をBioTek Synergy H4 Hybridリーダーで、450nmで測定した。

0133

二機能性ELISAでは、rhEGFR−FcキメラをNUNCmaxisorbプレートで、4℃で一晩コーティングした。このプレートを洗浄し、次いでスーパーブロックで、室温で2時間ブロックした。異なる希釈の融合Mab又は陰性対照抗体をプレートに添加した。プレートを室温で1時間インキュベートした。洗浄後、TGFβを添加し、プレートを室温で1時間インキュベートした。プレートを洗浄し、抗TGFβ−ビオチンを添加し、プレートを室温で1時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ストレプトアビジン−HRPを添加し、プレートを室温で1時間インキュベートした。洗浄後、TMB基質溶液を添加し、反応を1N H2SO4で停止させた。吸光度をBioTek Synergy H4 Hybridリーダーで、450nmで測定した。

0134

結果:
TGFβRII−抗EGFR1 HC+抗EGFR1 LC融合Mabの標的EGFR1(図44)及びTGFβ(図45)の両方に対する結合は、抗EGFR1−TGFβRIIと同等であった。TGFβRII−抗EGFR1 HC+抗EGFR1 LC融合Mabもまた、二機能性ELISAで試験して、Mabの抗EGFR1ドメイン及びTGFβRIIドメインがそれぞれの標的に互いに干渉することなく結合できるか否かを決定した。図46から分かるように、TGFβRII−抗EGFR1 HC+抗EGFR1 LC融合Mabの結合は、抗EGFR1−TGFβRIIと比較すると減少し、融合Mabの構造により、いずれかの標的への結合においてある程度の干渉が存在することを示唆している。

0135

EGFR1を発現する細胞への結合:
手順:
A−431細胞を、70〜80%のコンフルエンスに達するまでフラスコで増殖させた。これらの細胞をトリプシン処理して回収した。これらの細胞を、異なる希釈度のTGFβRII−抗EGFR1 HC+抗EGFR1 LC融合Mab又は対照Igで、2〜8℃で30分間染色した。これらの細胞を洗浄し、抗ヒトIgG−FITCコンジュゲートと共に2〜8℃で30分間インキュベートした。洗浄後、これらの細胞をフローサイトメーターで分析した。FSC対SSCプロフィールに基づいて生細胞にゲートをかけた。ゲートがかけられた集団についての全MFIを記録した。

0136

結果:
TGFβRII−抗EGFR1 HC+抗EGFR1 LC融合体はA−431細胞を発現するEGFRに用量依存的に結合する。TGFβRII−抗EGFR1 HC+抗EGFR1 LCの結合は、抗EGFR1−TGFβRIIの結合と同等である。

0137

増殖の抑制
手順:
A−431細胞を、70〜80%のコンフルエンスに達するまでフラスコで増殖させた。これらの細胞をトリプシン処理して回収し、そして96ウェルプレートに播種した。異なる希釈度のTGFβRII−抗EGFR1 HC+抗EGFR1 LC融合Mab又は対照Igをこれらの細胞に添加した。プレートを37℃、5%CO2で3日間インキュベートした。3日目に、細胞増殖をAlamarBlue法によって測定した。

0138

結果:
抗EGFR抗体、例えば、セツキシマブは、EGFR1発現細胞の増殖を抑制することが知られている。図47に示されているように、TGFβRII−抗EGFR1 HC+抗EGFR1 LC融合Mabの抗EGFR部分は無傷であり、抗増殖活性を有する。

0139

7.抗EGFR1 HC+TGFβRII−抗EGFR1 LC(Fmab4)
結合ELISA:手順:
融合Mabを、3つの異なるELISA:(1)EGFR1標的結合ELISA、(2)TGFβ標的結合ELISA、及び(3)二機能性ELISAにおいて、その標的に結合する能力について試験した。

0140

標的結合ELISAでは、標的(rhEGFR−Fcキメラ又はTGFβ)をNUNCmaxisorbプレートで、4℃で一晩コーティングした。このプレートを洗浄し、次いでスーパーブロックで、室温で2時間ブロックした。異なる希釈度の融合Mab又は陰性対照抗体をプレートに添加した。プレートを室温で1時間インキュベートした。融合Mabの結合を、ビオチン化抗ヒトIgGF(ab)2二次抗体の添加、これに続くペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジンとの室温での1時間のインキュベートによって検出した。TMB基質溶液を添加し、反応を1N H2SO4で停止させた。吸光度をBioTek Synergy H4 hybridリーダーで、450nmで測定した。

0141

二機能性ELISAでは、rhEGFR−FcキメラをNUNCmaxisorbプレートで、4℃で一晩コーティングした。このプレートを洗浄し、次いでスーパーブロックで、室温で2時間ブロックした。異なる希釈の融合Mab又は陰性対照抗体をプレートに添加した。プレートを室温で1時間インキュベートした。洗浄後、TGFβを添加し、プレートを室温で1時間インキュベートした。プレートを洗浄し、抗TGFβ−ビオチンを添加し、プレートを室温で1時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ストレプトアビジン−HRPを添加し、プレートを室温で1時間インキュベートした。洗浄後、TMB基質溶液を添加し、反応を1N H2SO4で停止させた。吸光度をBioTek Synergy H4 Hybridリーダーで、450nmで測定した。

0142

結果:
抗EGFR1 HC+TGFβRII−抗EGFR1 LC融合Mabの標的EGFR1(図48)及びTGFβ(図49)の両方に対する結合は、抗EGFR1−TGFβRIIと同等であった。抗EGFR1 HC+TGFβRII−抗EGFR1 LC融合Mabもまた、二機能性ELISAで試験して、Mabの抗EGFR1ドメイン及びTGFβRIIドメインがそれぞれの標的に互いに干渉することなく結合できるか否かを決定した。図50から分かるように、抗EGFR1 HC+TGFβRII−抗EGFR1 LC融合Mabの結合は、抗EGFR1−TGFβRIIと比較すると減少し、融合Mabの構造により、いずれかの標的への結合においてある程度の干渉が存在することを示唆している。

0143

EGFR1を発現する細胞への結合:
手順:
A−431細胞を、70〜80%のコンフルエンスに達するまでフラスコで増殖させた。これらの細胞をトリプシン処理して回収した。これらの細胞を、異なる希釈度の抗EGFR1 HC+TGFβRII−抗EGFR1 LC融合Mab又は対照Igで、2〜8℃で30分間染色した。これらの細胞を洗浄し、抗ヒトIgG−FITCコンジュゲートと共に2〜8℃で30分間インキュベートした。洗浄後、これらの細胞をフローサイトメトリーで分析した。FSC対SSCプロフィールに基づいて生細胞にゲートをかけた。ゲートがかけられた集団についての全MFIを記録した。

0144

結果:
抗EGFR1 HC+TGFβRII−抗EGFR1 LC融合体はA−431細胞を発現するEGFRに用量依存的に結合する(図51)。抗EGFR1 HC+TGFβRII−抗EGFR1 LCの結合は、抗EGFR1−TGFβRIIの結合と比較すると減少している。

0145

8.抗EGFR1 HC−TGFβRII+TGFβRII−抗EGFR1 LC(Fmab10)
結合ELISA:手順:
融合Mabを、3つの異なるELISA:(1)EGFR1標的結合ELISA、(2)TGFβ標的結合ELISA、及び(3)二機能性ELISAにおいて、その標的に結合する能力について試験した。

0146

標的結合ELISAでは、標的(rhEGFR−Fcキメラ又はTGFβ)をNUNCmaxisorbプレートで、4℃で一晩コーティングした。このプレートを洗浄し、次いでスーパーブロックで、室温で2時間ブロックした。異なる希釈度の融合Mab又は陰性対照抗体をプレートに添加した。プレートを室温で1時間インキュベートした。融合Mabの結合を、ビオチン化抗ヒトIgGF(ab)2二次抗体の添加、これに続くペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジンとの室温での1時間のインキュベートによって検出した。TMB基質溶液を添加し、反応を1N H2SO4で停止させた。吸光度をBioTek Synergy H4 Hybridリーダーで、450nmで測定した。

0147

二機能性ELISAでは、rhEGFR−FcキメラをNUNCmaxisorbプレートで、4℃で一晩コーティングした。このプレートを洗浄し、次いでスーパーブロックで、室温で2時間ブロックした。異なる希釈の融合Mab又は陰性対照抗体をプレートに添加した。プレートを室温で1時間インキュベートした。洗浄後、TGFβを添加し、プレートを室温で1時間インキュベートした。プレートを洗浄し、抗TGFβ−ビオチンを添加し、プレートを室温で1時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ストレプトアビジン−HRPを添加し、プレートを室温で1時間インキュベートした。洗浄後、TMB基質溶液を添加し、反応を1N H2SO4で停止させた。吸光度をBioTek Synergy H4 hybridリーダーで、450nmで測定した。

0148

結果:
抗EGFR1 HC−TGFβRII+TGFβRII−抗EGFR1 LC融合Mabの標的EGFR1に対する結合は、抗EGFR1−TGFβRIIの結合と比較すると僅かに減少したが(図52)、TGFβに対しては増加した(図53)。抗EGFR1−TGFβRII+TGFβRII−抗EGFR1 LC融合Mabもまた、二機能性ELISAで試験して、Mabの抗EGFR1ドメイン及びTGFβRIIドメインがそれぞれの標的に互いに干渉することなく結合できるか否かを決定した。図54から分かるように、抗EGFR1 HC−TGFβRII+TGFβRII−抗EGFR1 LC融合Mabの結合は、抗EGFR1−TGFβRIIと同等であり、融合Mabの構造により、いずれかの標的への結合において干渉が全く存在しないことを示唆している。

0149

9.TGFβRII−抗EGFR1 HC+TGFβRII−抗EGFR1 LC(Fmab12)
結合ELISA:手順:
融合Mabを、3つの異なるELISA:(1)EGFR1標的結合ELISA、(2)TGFβ標的結合ELISA、及び(3)二機能性ELISAにおいて、その標的に結合する能力について試験した。

0150

標的結合ELISAでは、標的(rhEGFR−Fcキメラ又はTGFβ)をNUNCmaxisorbプレートで、4℃で一晩コーティングした。このプレートを洗浄し、次いでスーパーブロックで、室温で2時間ブロックした。異なる希釈度の融合Mab又は陰性対照抗体をプレートに添加した。プレートを室温で1時間インキュベートした。融合Mabの結合を、ビオチン化抗ヒトIgGF(ab)2二次抗体の添加、これに続くペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジンとの室温での1時間のインキュベートによって検出した。TMB基質溶液を添加し、反応を1N H2SO4で停止させた。吸光度をBioTek Synergy H4 Hybridリーダーで、450nmで測定した。

0151

二機能性ELISAでは、rhEGFR−FcキメラをNUNCmaxisorbプレートで、4℃で一晩コーティングした。このプレートを洗浄し、次いでスーパーブロックで、室温で2時間ブロックした。異なる希釈の融合Mab又は陰性対照抗体をプレートに添加した。プレートを室温で1時間インキュベートした。洗浄後、TGFβを添加し、プレートを室温で1時間インキュベートした。プレートを洗浄し、抗TGFβ−ビオチンを添加し、プレートを室温で1時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ストレプトアビジン−HRPを添加し、プレートを室温で1時間インキュベートした。洗浄後、TMB基質溶液を添加し、反応を1N H2SO4で停止させた。吸光度をBioTek Synergy H4 Hybridリーダーで、450nmで測定した。

0152

結果:
TGFβRII−抗EGFR1 HC+TGFβRII−抗EGFR1 LC融合Mabの標的EGFR1に対する結合は、抗EGFR1−TGFβRIIの結合と比較すると僅かに減少したが(図53)、TGFβに対しては増加した(図56)。TGFβRII−抗EGFR1 HC+TGFβRII−抗EGFR1 LC融合Mabもまた、二機能性ELISAで試験して、Mabの抗EGFR1ドメイン及びTGFβRIIドメインがそれぞれの標的に互いに干渉することなく結合できるか否かを決定した。図57から分かるように、TGFβRII−抗EGFR1 HC+TGFβRII−抗EGFR1 LC融合Mabの結合は、抗EGFR1−TGFβRIIと比較すると減少し、融合Mabの構造により、いずれかの標的への結合において干渉が存在することを示唆している。

実施例

0153

参考文献
本明細書に列挙する全ての参考文献は、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み入れられる。
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    【課題・解決手段】細胞における相同組換え修復活性の測定方法は、部位特異的ヌクレアーゼにより、細胞内の標的ゲノムDNA領域の二本鎖を特定部位で切断すること、細胞にタグ配列を含むドナーベクターを導入し、相... 詳細

  • 長瀬産業株式会社の「 エルゴチオネインの製造方法」が 公開されました。( 2020/12/17)

    【課題・解決手段】安価かつ大量にエルゴチオネインを製造する方法および該方法に使用する細菌を提供する。エルゴチオネインもしくはその関連物質、またはこれらの混合物の製造方法であって、エルゴチオネイン生産能... 詳細

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