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図面 (6)

課題・解決手段

本発明は、新規のEGFR変異体、EGFRvVI、及び新規のEGFR変異体を検出するための方法を特徴とする。新規のEGFR変異体は、いくつかのがんにおいて、優先的に発現する。EGFRvVIを検出するための方法は、対象の診断予後診断、及び治療評価を支援し得る。

概要

背景

成長因子及びそれらの受容体は、細胞分裂、増殖及び分化の調節において、重要な役割を果たす。結果として多くの成長因子受容体は、がんにおいて突然変異し、または異常に発現し、成長因子経路脱調整を引き起こし、そしてがんの特徴である非制御の増殖をもたらす。

上皮成長因子受容体(EGFR)は、とりわけがんにおいて頻繁に突然変異し、異常に発現し、または誤った調整をする成長因子受容体である。多形性膠芽腫(GBM)等の特定のがんでは、50%までの患者は、EGFRvIII等の腫瘍特異的なEGFR変異体を示す。さらにEGFRの突然変異及び増幅は、近年、がん遺伝子、並びにヒトの固形腫瘍及び上皮腫瘍の進行に関係があるとされ、またより短い生存時間生存率相関するとされてきた。したがってEGFRは、がんの診断及び予後診断のための有益なバイオマーカーをとして現れた。

重要なことに、EGFRは、治療の開発に伴い、EGFRシグナル変換を取り除くことに向けた抗がん治療の標的にもされてきた。現在、リガンド仲介されるEGFR活性化を妨げる抗体、及びEGFRキナーゼ活性阻害する小分子の二つの治療分類が存在する。しかしながら臨床データは、全ての患者がかかる治療に応答するわけでなないことを明らかにし、それは、多様なEGFR変異体の腫瘍特異的発現の結果であり得る。EGFRvIII変異体は、N−末端リガンド結合ドメインの一部を欠く。結果として、EGFRvIIIを発現する腫瘍を伴うGBM患者は、N−末端リガンド結合ドメインを特異的に標的にする治療に対し、非応答性であることが見出されている。特定のEGFR変異体の検出は、特定のEGFR標的化治療に対する患者の応答性予測するための実用性を示した。

したがって多様ながんに関連するEGFR変異体の同定は、がんの改良された診断、予後診断、階層化及び/または治療指針を提供するのに有用である。

概要

本発明は、新規のEGFR変異体、EGFRvVI、及び新規のEGFR変異体を検出するための方法を特徴とする。新規のEGFR変異体は、いくつかのがんにおいて、優先的に発現する。EGFRvVIを検出するための方法は、対象の診断、予後診断、及び治療評価を支援し得る。

目的

したがって多様ながんに関連するEGFR変異体の同定は、がんの改良された診断、予後診断、階層化及び/または治療指針を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

野生型GFRエクソン3において始まり、そしてエクソン7において終わるインフレーム欠失を含んで成る、単離上皮成長因子受容体(EGFR)タンパク質

請求項2

アミノ酸90〜221が欠失している、請求項1に記載された単離上皮成長因子受容体(EGFR)タンパク質。

請求項3

前記EGFRタンパク質が、配列番号:5のアミノ酸配列を含んで成る、請求項1に記載された単離上皮成長因子受容体(EGFR)タンパク質。

請求項4

アミノ酸90〜221をコードするヌクレオチドが欠失している、上皮成長因子受容体(EGFR)をコードする単離ポリヌクレオチド

請求項5

ポリヌクレオチドが、配列番号3または4のヌクレオチド配列を含んで成る、上皮成長因子受容体(EGFR)をコードする単離ポリヌクレオチド。

請求項6

請求項1〜3のいずれか1項に記載されたEGFRタンパク質と結合する抗体。

請求項7

請求項1〜5のいずれか1項に記載されたEGFRタンパク質またはポリヌクレオチドの存在について生体試料分析することを含んで成り、当該EGFRタンパク質またはポリヌクレオチドの存在が、がんの存在、またはがんの発達への対象のより高い素因を示す、対象におけるがんを診断するための方法。

請求項8

前記がんが、神経系のがん、または上皮がんである、請求項7に記載された方法。

請求項9

前記神経系のがんが、膠芽腫または多形性膠芽腫である、請求項8に記載された方法。

請求項10

前記上皮がんが、結腸がん、肺がん前立腺がん乳がんまたは他の固形腫瘍がんである、請求項8に記載された方法。

請求項11

治療計画への対象の応答性を評価するための方法であって、対象に由来する生体試料を提供する工程、及び請求項1〜5のいずれか1項に記載されたEGFRタンパク質またはポリヌクレオチドの存在、不存在、または発現のレベルを決定する工程、を含んで成り、当該EGFRタンパク質またはポリヌクレオチドの存在、不存在、または発現のレベルが、当該治療計画への対象の応答性を示す、当該方法。

請求項12

前記治療計画が、EGFR阻害剤を含んで成る、請求項11に記載された方法。

請求項13

治療計画を推奨するための方法であって、対象に由来する生体試料を提供する工程、請求項1〜5のいずれか1項に記載されたEGFRタンパク質またはポリヌクレオチドの存在を決定する工程、を含んで成り、当該EGFRタンパク質またはポリヌクレオチドの存在が、EGFR阻害剤を含んで成る治療計画を除外する、当該方法。

請求項14

前記EGFR阻害剤が、EGFR発現または活性化を阻害する小分子RNAi剤、抗体、または薬物である、請求項12または13に記載された方法。

請求項15

EGFRタンパク質に特異的に結合する化学物質を対象に投与することを含んで成る、請求項1〜3のいずれか1項に記載されたEGFRタンパク質を発現するがん細胞を標的にするための方法。

請求項16

前記化学物質が抗体である、請求項15に記載された方法。

請求項17

前記抗体が、治療剤共有結合している、請求項15または16に記載された方法。

請求項18

前記治療剤が、化学療法剤抗がん剤毒素ラジオアイソトープ、またはナノ粒子である、請求項17に記載された方法。

請求項19

請求項1〜3のいずれか1項に記載されたEGFRの阻害剤を対象に投与することを含んで成る、がん、またはその兆候治療するための方法。

請求項20

前記阻害剤が、請求項1〜3のいずれか1項に記載されたEGFRの発現または活性化を阻害する小分子、RNAi剤、抗体、または薬物である、請求項19に記載された方法。

技術分野

0001

関連出願
本願は、2013年2月15日に出願された米国特許仮出願第61/765,537号に対し、優先権の利益を主張し、その内容は、参照によりその全内容において本明細書に組み込まれている。

0002

本発明は、一般に新規のEGFR変異体、新規のEGFR変異体を検出するための方法、及びがん診断及び治療するための方法に関する。

背景技術

0003

成長因子及びそれらの受容体は、細胞分裂、増殖及び分化の調節において、重要な役割を果たす。結果として多くの成長因子受容体は、がんにおいて突然変異し、または異常に発現し、成長因子経路脱調整を引き起こし、そしてがんの特徴である非制御の増殖をもたらす。

0004

上皮成長因子受容体(EGFR)は、とりわけがんにおいて頻繁に突然変異し、異常に発現し、または誤った調整をする成長因子受容体である。多形性膠芽腫(GBM)等の特定のがんでは、50%までの患者は、EGFRvIII等の腫瘍特異的なEGFR変異体を示す。さらにEGFRの突然変異及び増幅は、近年、がん遺伝子、並びにヒトの固形腫瘍及び上皮腫瘍の進行に関係があるとされ、またより短い生存時間生存率相関するとされてきた。したがってEGFRは、がんの診断及び予後診断のための有益なバイオマーカーをとして現れた。

0005

重要なことに、EGFRは、治療の開発に伴い、EGFRシグナル変換を取り除くことに向けた抗がん治療の標的にもされてきた。現在、リガンド仲介されるEGFR活性化を妨げる抗体、及びEGFRキナーゼ活性阻害する小分子の二つの治療分類が存在する。しかしながら臨床データは、全ての患者がかかる治療に応答するわけでなないことを明らかにし、それは、多様なEGFR変異体の腫瘍特異的発現の結果であり得る。EGFRvIII変異体は、N−末端リガンド結合ドメインの一部を欠く。結果として、EGFRvIIIを発現する腫瘍を伴うGBM患者は、N−末端リガンド結合ドメインを特異的に標的にする治療に対し、非応答性であることが見出されている。特定のEGFR変異体の検出は、特定のEGFR標的化治療に対する患者の応答性予測するための実用性を示した。

0006

したがって多様ながんに関連するEGFR変異体の同定は、がんの改良された診断、予後診断、階層化及び/または治療指針を提供するのに有用である。

発明が解決しようとする課題

0007

発明の概要
本発明は、膠芽腫患者において同定された新規のEGFR変異体の発見に基づく。本発明は、がんのより正確な診断及びがんの素因についてのがんバイオマーカー、並びにがんを治療するための治療計画を導くバイオマーカーの必要性に向けられる。一般に本発明は、本明細書においてEGFRvVIと称される新規のEGFR変異体を特徴とする。さらに本発明は、がんの診断、予後診断、及び/または治療指針のためのEGFR変異体の検出に関する。

課題を解決するための手段

0008

本発明は、野生型EGFRのエクソン3において始まり、そしてエクソン7において終わるインフレーム欠失を含んで成る単離された上皮成長因子受容体(EGFR)タンパク質を提供する。一つの観点では、アミノ酸90〜221は、欠失していた。一つの観点では、EGFRタンパク質は、配列番号5のアミノ酸配列を含んで成る。

0009

さらに本発明は、上皮成長因子受容体(EGFR)をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供し、ここでアミノ酸90〜221をコードするヌクレオチドは、欠失している。一つの観点では、ポリヌクレオチドは、配列番号3または4のヌクレオチドを含んで成る。

0010

さらに本発明は、本発明のEGFRタンパク質に結合する抗体を提供する。好適には抗体は、野生型EGFRよりも本発明のEGFR変異体に対して大きな親和性を有する。より好適には、抗体は、本発明のEGFR変異体に結合し、且つ野生型EGFRに結合しない。

0011

さらに本発明は、本発明のEGFRタンパク質またはポリヌクレオチドの存在について生体試料分析することを含んで成る、対象におけるがんを診断するための方法を提供し、ここでEGFRタンパク質またはポリヌクレオチドの存在は、がんの存在、またはがんを発達させる対象のより高い素因を示す。がんは、神経系のがん、または上皮がんである。いくつかの好適な態様では、神経系のがんは、膠芽腫または多形性膠芽腫である。上皮がんは、結腸がん、肺がん前立腺がん乳がんまたは他の固形腫瘍がんである。

0012

さらに本発明は、対象由来の生体試料を提供し、そして本発明のEGFRタンパク質またはポリヌクレオチドの存在、不存在、または発現のレベルを決定することを含んで成る治療計画に対する対象の応答性を評価するための方法を提供し、ここでEGFRタンパク質またはポリヌクレオチドの存在、不存在、または発現のレベルは、治療計画に対する対象の応答性を示し、ここで治療計画は、EGFR阻害剤を含んで成る。

0013

さらに本発明は、対象由来の生体試料を提供し、本発明のEGFRタンパク質またはポリヌクレオチドの存在を決定することを含んで成る治療計画を推奨するための方法を提供し、ここでEGFRタンパク質またはポリヌクレオチドの存在は、EGFR阻害剤を含んで成る治療計画を排除する。

0014

本明細書において発表される任意の方法では、EGFR阻害剤は、小分子、抗体、ヌクレオチド、RNA干渉剤であり得る。EGFR阻害剤は、EGFR活性またはmRNAまたはタンパク質発現を阻害し、または減少させる。EGFR阻害剤の例は、これらに限定されないが、ゲフィチニブ(IRESSA商標)、エルロチニブ(TARCEVA商標)、セツキシマブERITUX商標)、ラパチニブ(TYKERB商標)、パニツムマブVECTIBIX商標)、バンデタニブCAPRELSA商標)を含める。EGFR阻害剤の他の例は、リンドペピムト(Rindopepimut)(CDX−110、Celldex Therapeutics)等のEGFR欠失を標的とするがんワクチンを含める。本発明により使用され得る他の阻害剤は、PARP1阻害剤である。

0015

EGFR変異体の存在を決定するために本明細書において発表される方法では、EGFR変異体のRNA、DNAまたはcDNA配列は、例えば核酸増幅または定量的なリアルタイムPCRにより検出される。EGFR変異体の増幅産物またはレベルは、EGFRvVIを発現しない、または野生型EGFRを発現する対象から由来する参照試料と比較され得る。参照試料は、癌を有しない対象から由来し得る。他の態様では、参照試料は、早い時点、例えば治療計画の開始前、または癌の診断前での同一の対象から由来し得る。特定の対象に関するEGFRvVIのレベルにおける変化または存在は、治療の選定または治療効果の評価を支援し得る。

0016

さらに本発明は、EGFRvVI変異体と結合し、またはEGFRvVI変異体を認識する化学物質を、それを必要とする対象に投与することを含んで成る、がんを標的にするための方法を提供する。好適には化学物質は、EGFRvVI変異体と結合し、またはEGFRvVI変異体を認識するが、野生型EGFRには結合せず、または野生型EGFRを認識しない。したがって化学物質は、がん細胞を特異的に認識する。いくつかの観点では、化学物質は、治療剤共有結合的に連結し得る。例えば治療用の化学物質は、化学療法剤毒素ラジオアイソトープ、またはナノ粒子であり得る。

0017

本発明は、EGFRvVI変異体の阻害剤を、それを必要とする対象に投与することを含んで成る、がんまたはがんの兆候を治療するための方法をさらに提供する。EGFRvVI阻害剤は、例えば小分子、抗体、またはRNA干渉剤である。好適にはEGFRvVI阻害剤は、EGFR活性またはmRNAまたはタンパク質の発現を阻害し、または減少させる。

0018

本発明の多様な観点及び態様は、ここに詳細に説明されるだろう。詳細な修飾は、本発明の範囲から逸脱せずに成され得ることが理解されるだろう。さらに文脈により他に要求されない限り、単数形の用語は複数を含め、且つ複数形の用語は単数を含めるものとする。

0019

特定された全ての特許、特許出願、及び刊行物は、例えば、本発明との関連で使用され得るかかる刊行物において発表される方法論を説明及び開示する目的のために、参照により、本明細書中に明確に組み込まれている。本願の出願日より前のこれらの刊行物は、それらの開示のためだけに提供される。これに関連して、かかる開示が先行するために、先行発明の長所、または任意の他の理由により、本発明者等に権利が付与されない承認として解釈されるべきことは何もない。これらの文書の内容についての日付または説明に関わる全ての陳述は、本出願人に入手可能な情報に基づき、且つこれらの文書の日付または内容の正確性について任意の承認を構成しない。

図面の簡単な説明

0020

図1は、一人の患者(患者001)から由来する4mLの脳脊髄液CSF試料から抽出したRNA試料の電気泳動図を示す。18S及び28SrRNAピークは、RNAインテグリティナンバーRIN)を作り出すために標識化され、そして使用される。
図2は、QPCRアッセイにおいてテンプレートが使用されることがなかった場合の、EGFRアッセイにおける典型的なコントロール試料の電気泳動図を示す。検出される産物はない。
図3は、EGFRQPCRアッセイにおける、患者001から由来するCSF試料から抽出したRNAの電気泳動図を示す。増幅産物は、397bpで検出される。
図4は、配列化されたEGFRヌクレオチド配列(部分的な配列が示されている)のエクソン3〜7での欠失の概略図を示す。(A)灰色の四角は、欠失を導くエクソン3及び7中で切断点を構成する相同領域を指定する。(B)本概略図は、EGFR中の選定エクソン:エクソン1(イタリック体);エクソン2(太字体);エクソン3の一部(下線部);エクソン7の一部(太い下線部);及びエクソン8(太いイタリック体)を表す。
図5は、全長EGFRアミノ酸配列の文脈において、EGFR変異体であるEGFRvIII及びEGFRvVIの概略図を示す。灰色の四角は、患者001において検出、且つ同定されたEGFRvVI中で欠失する領域を指定する。下線部の配列は、EGFRvIII中で欠失する領域を指定する。

0021

発明の詳細な説明
本発明は、上皮成長因子受容体(EGFR)の新規の変異体の発見に基づく。EGFRの突然変異及び過剰発現は、肺がん、いくつかの上皮がん、及び多形性膠芽腫を含める多くのがんに関連していることが公知である。一般にがんにおいて見出されるEGFRvIII変異体等のEGFR突然変異は、EGFRの構造的な活性化を引き起こし、がんの顕著な特徴である非制御の細胞分裂を引き起こし得る下流のシグナル伝達をもたらす。結果として、EGFRの突然変異型の存在は、がんの存在、またはがんのより高い素因を示し得る。さらに近年の治療法は、EGFRを標的にするように、特にEGFR活性を阻害するように設計されてきた。特定のEGFR突然変異を伴うがん患者は、しばしば突然変異したドメインまたは領域の結合または阻害を介して作用するそれらの治療法に非応答性である。したがってEGFR突然変異体は、対象ががん、またはがんの高い素因を有するか否かを診断するために、並びにがん患者の特定の治療計画への応答性を決定するために、または治療計画の有効性を決定するために有用である。

0022

EGFR及びがん
上皮成長因子受容体(EGFR)は、細胞表面上に存在するErbB(HER及びヒト上皮成長因子受容体としても公知である)シグナル伝達経路における四つの受容体のうちの一つである。さらにEGFRは、ErbB−1及びHER1としても公知である。HERファミリーの他のメンバーは、ErbB−2(HER2/c−neu)、ErbB−3(HER3)、及びErbB−4(HER4)を含める。

0023

EGFRは、c−erbB1プロト−がん遺伝子によりコードされ、且つ170kDAの分子量を有する。野生型(WT)EGFR核酸は、以下のヒトmRNA配列
GTCGGCAGCCCCCGGCGCAGCGCGGCCGCAGCAGCCTCCTCCCCCCGCACGGTGTGAGCGCCCGCCGCGGCCGAGGCGGCCGGAGTCCCGAGCTAGCCCCGGCGGCCGCCGCCGCCCAGACCGGACGACAGGCCACCTCGTCGGCGTCCGCCCGAGTCCCCGCCTCGCCGCCAACGCCACAACCACCGCGCACGGCCCCCTGACTCCGTCCAGTATTGATCGGGAGAGCCGGAGCGAGCTCTTCGGGGAGCAGCGATGCGACCCTCCGGGACGGCCGGGGCAGCGCTCCTGGCGCTGCTGGCTGCGCTCTGCCCGGCGAGTCGGGCTCTGGAGGAAAAGAAAGTTTGCCAAGGCACGAGTAACAAGCTCACGCAGTTGGGCACTTTTGAAGATCATTTTCTCAGCCTCCAGAGGATGTTCAATAACTGTGAGGTGGTCCTTGGGAATTTGGAAATTACCTATGTGCAGAGGAATTATGATCTTTCCTTCTTAAAGACCATCCAGGAGGTGGCTGGTTATGTCCTCATTGCCCTCAACACAGTGGAGCGAATTCCTTTGGAAAACCTGCAGATCATCAGAGGAAATATGTACTACGAAAATTCCTATGCCTTAGCAGTCTTATCTAACTATGATGCAAATAAAACCGGACTGAAGGAGCTGCCCATGAGAAATTTACAGGGACAAAAGTGTGATCCAAGCTGTCCCAATGGGAGCTGCTGGGGTGCAGGAGAGGAGAACTGCCAGAAACTGACCAAAATCATCTGTGCCCAGCAGTGCTCCGGGCGCTGCCGTGGCAAGTCCCCCAGTGACTGCTGCCACAACCAGTGTGCTGCAGGCTGCACAGGCCCCCGGGAGAGCGACTGCCTGGTCTGCCGCAAATTCCGAGACGAAGCCACGTGCAAGGACACCTGCCCCCCACTCATGCTCTACAACCCCACCACGTACCAGATGGATGTGAACCCCGAGGGCAAATACAGCTTTGGTGCCACCTGCGTGAAGAAGTGTCCCCGTAATTATGTGGTGACAGATCACGGCTCGTGCGTCCGAGCCTGTGGGGCCGACAGCTATGAGATGGAGGAAGACGGCGTCCGCAAGTGTAAGAAGTGCGAAGGGCCTTGCCGCAAAGTGTGTAACGGAATAGGTATTGGTGAATTTAAAGACTCACTCTCCATAAATGCTACGAATATTAAACACTTCAAAAACTGCACCTCCATCAGTGGCGATCTCCACATCCTGCCGGTGGCATTTAGGGGTGACTCCTTCACACATACTCCTCCTCTGGATCCACAGGAACTGGATATTCTGAAAACCGTAAAGGAAATCACAGGGTTTTTGCTGATTCAGGCTTGGCCTGAAAACAGGACGGACCTCCATGCCTTTGAGAACCTAGAAATCATACGCGGCAGGACCAAGCAACATGGTCAGTTTTCTCTTGCAGTCGTCAGCCTGAACATAACATCCTTGGGATTACGCTCCCTCAAGGAGATAAGTGATGGAGATGTGATAATTTCAGGAAACAAAAATTTGTGCTATGCAAATACAATAAACTGGAAAAAACTGTTTGGGACCTCCGGTCAGAAAACCAAAATTATAAGCAACAGAGGTGAAAACAGCTGCAAGGCCACAGGCCAGGTCTGCCATGCCTTGTGCTCCCCCGAGGGCTGCTGGGGCCCGGAGCCCAGGGACTGCGTCTCTTGCCGGAATGTCAGCCGAGGCAGGGAATGCGTGGACAAGTGCAACCTTCTGGAGGGTGAGCCAAGGGAGTTTGTGGAGAACTCTGAGTGCATACAGTGCCACCCAGAGTGCCTGCCTCAGGCCATGAACATCACCTGCACAGGACGGGGACCAGACAACTGTATCCAGTGTGCCCACTACATTGACGGCCCCCACTGCGTCAAGACCTGCCCGGCAGGAGTCATGGGAGAAAACAACACCCTGGTCTGGAAGTACGCAGACGCCGGCCATGTGTGCCACCTGTGCCATCCAAACTGCACCTACGGATGCACTGGGCCAGGTCTTGAAGGCTGTCCAACGAATGGGCCTAAGATCCCGTCCATCGCCACTGGGATGGTGGGGGCCCTCCTCTTGCTGCTGGTGGTGGCCCTGGGGATCGGCCTCTTCATGCGAAGGCGCCACATCGTTCGGAAGCGCACGCTGCGGAGGCTGCTGCAGGAGAGGGAGCTTGTGGAGCCTCTTACACCCAGTGGAGAAGCTCCCAACCAAGCTCTCTTGAGGATCTTGAAGGAAACTGAATTCAAAAAGATCAAAGTGCTGGGCTCCGGTGCGTTCGGCACGGTGTATAAGGGACTCTGGATCCCAGAAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAGGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCGAAAGCCAACAAGGAAATCCTCGATGAAGCCTACGTGATGGCCAGCGTGGACAACCCCCACGTGTGCCGCCTGCTGGGCATCTGCCTCACCTCCACCGTGCAGCTCATCACGCAGCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCTGGACTATGTCCGGGAACACAAAGACAATATTGGCTCCCAGTACCTGCTCAACTGGTGTGTGCAGATCGCAAAGGGCATGAACTACTTGGAGGACCGTCGCTTGGTGCACCGCGACCTGGCAGCCAGGAACGTACTGGTGAAAACACCGCAGCATGTCAAGATCACAGATTTTGGGCTGGCCAAACTGCTGGGTGCGGAAGAGAAAGAATACCATGCAGAAGGAGGCAAAGTGCCTATCAAGTGGATGGCATTGGAATCAATTTTACACAGAATCTATACCCACCAGAGTGATGTCTGGAGCTACGGGGTGACCGTTTGGGAGTTGATGACCTTTGGATCCAAGCCATATGACGGAATCCCTGCCAGCGAGATCTCCTCCATCCTGGAGAAAGGAGAACGCCTCCCTCAGCCACCCATATGTACCATCGATGTCTACATGATCATGGTCAAGTGCTGGATGATAGACGCAGATAGTCGCCCAAAGTTCCGTGAGTTGATCATCGAATTCTCCAAAATGGCCCGAGACCCCCAGCGCTACCTTGTCATTCAGGGGGATGAAAGAATGCATTTGCCAAGTCCTACAGACTCCAACTTCTACCGTGCCCTGATGGATGAAGAAGACATGGACGACGTGGTGGATGCCGACGAGTACCTCATCCCACAGCAGGGCTTCTTCAGCAGCCCCTCCACGTCACGGACTCCCCTCCTGAGCTCTCTGAGTGCAACCAGCAACAATTCCACCGTGGCTTGCATTGATAGAAATGGGCTGCAAAGCTGTCCCATCAAGGAAGACAGCTTCTTGCAGCGATACAGCTCAGACCCCACAGGCGCCTTGACTGAGGACAGCATAGACGACACCTTCCTCCCAGTGCCTGGTGAGTGGCTTGTCTGGAAACAGTCCTGCTCCTCAACCTCCTCGACCCACTCAGCAGCAGCCAGTCTCCAGTGTCCAAGCCAGGTGCTCCCTCCAGCATCTCCAGAGGGGGAAACAGTGGCAGATTTGCAGACACAGTGAAGGGCGTAAGGAGCAGATAAACACATGACCGAGCCTGCACAAGCTCTTTGTTGTGTCTGGTTGTTTGCTGTACCTCTGTTGTAAGAATGAATCTGCAAAATTTCTAGCTTATGAAGCAAATCACGGACATACACATCTGTATGTGTGAGTGTTCATGATGTGTGTACATCTGTGTATGTGTGTGTGTGTATGTGTGTGTTTGTGACAGATTTGATCCCTGTTCTCTCTGCTGGCTCTATCTTGACCTGTGAAACGTATATTTAACTAATTAAATATTAGTTAATATTAATAAATTTTAAGCTTTATCCAGAAAAAAAAAAAAAAAA
によりコードされ得る(GenBank受け入れ番号BC094761.1)(配列番号:1)。

0024

野生型EGFRタンパク質は、以下のヒトアミノ酸配列:
MRPSGTAGAALLALLAALCPASALEEKKVCQGTSNKLTQLGTFEDHFLLQMFNNCEVVLGNLEITYVQRNYDLSFLKTIQEVAGYVLIALNTVERIPLNLQIIRGNMYYENSYALAVLSNYDANKTGLKELPMRNLQGQKCDPSCPNGSCWGAGEENCQKLTKIICAQCSGRCRGKSPSDCCHNQCAAGCTGPRESDCLVCRKFRDEATCKDTCPPLMLYNPTTYQMDVNPEGKYSFGATCVKKCPRNYVVTDHGSCVRACGADSYEMEEDGVRCKKCEGPCRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFMRRRHIVRKRTLRRLLQERELVEPLTPSGEAPNQALLRILKETEFKKIKVLGSGAFGTVYKGLWIPEGEKVKIPVAIKELREATSPKANKEILDEAYVMASVDNPHVCRLLGICLTSTVQLITQLMPFGCLLDYVREHKDNIGSQYLLNWCVQIAKGMNYLEDRRLVHRDLAARNVLVKTPQHVKITDFGLAKLLGAEEKEYHAEGGKVPIKWMALESILHRIYTHQSDVWSYGVTVWELMTFSKPYDGIPASEISSILEKGERLPQPPICTIDVYMIMVKCWMIDADSRPKFRELIIEFSKMARDPQRYLVIQGDERMHLPSPTDSNFYRALMDEEDMDDVVDADEYLIPQQGFFSSSTSRTPLLSSLSATSNNSTVACIDRNGLQSCPIKEDSFLQRYSSDPTGALTDSIDDTFLPVPGEWLVWKQSCSSTSSTHSAAASLQCPSQVLPPASPEGETVADLQTQ
によりコードされ得る(GenBank受け入れ番号AAH94761.1)(配列番号:2)。

0025

多様なEGFR変異体をコードする多数の前駆体アイソフォーム及び選択的にスプライスされた転写変異体は、同定されている。EGFRの多数の前駆体アイソフォームの核酸及びポリペプチド配列は、例えばアイソフォームA(GenBank受け入れ番号NM_005228.3及びNP_005219.2)、アイソフォームB(NM_201282.1及びNP_958439.1)、アイソフォームC(NM_201283.1及びNP_958440.1)及びアイソフォームD(NM_201284.1及びNP_958441.1)等のように、当業界において公知である。本発明は、エクソン3内部に始まり、エクソン7内部までに欠失を有することにより、エクソン3の一部、エクソン4〜6の全て、及びエクソン7の一部を欠失するEGFR変異体を特徴とする。欠失は、好適には野生型EGFRのアミノ酸90〜221の欠失である。

0026

EGFR及び他のHER受容体は、受容体チロシンキナーゼであり、且つその特異的なリガンドの結合を介して活性化される。EGFRリガンドは、当業界において公知であり、且つEGF(上皮成長因子)、TGF−α(形質転換成長因子α)、HB−EGF(ヘパリン−結合EGF−様成長因子)、アンフィレグリン(amphiregulin)(AR)、ベタセルリン(betacellulin)(BTC)、エピジェン(epigen)及びエピレグリン(epiregulin)(EPR)等の成長因子を含める。そのリガンドの一つの結合において、EGFRは活性化され、他のEGFR単量体とのホモ二量体を形成する。いくつかの例では、さらにEGFRは、ErbB受容体ファミリーの他のメンバーと対になり、活性ヘテロ二量体を形成し得る。EGFR二量化は、その内因性細胞内タンパク質チロシンキナーゼ活性刺激し、EGFRのC−末端ドメイン中のいくつかのチロシン(Y)残基の自己リン酸化をもたらす。リン酸化され得るチロシンは、Y992、Y1045、Y1069、Y1148及びY1173を含める。チロシン自己リン酸化は、蛍光体−チロシン−結合SH2ドメインを介する、EGFRのリン酸化チロシンと関連するいくつかの他のタンパク質により、下流のシグナル伝達を活性化する。かかる下流のシグナル伝達は、いくつかのシグナル伝達カスケード、主にMAPK、Akt及びJNK経路を活性化し得る。これらのシグナル伝達カスケードは、DNA合成細胞増殖及び細胞成長、並びに細胞移動及び接着等の細胞表現型の調節において、本質的な役割を果たすことが公知である。

0027

EGFR及びHERシグナル伝達経路の他の構成要素は、複合体中で、且つしっかりと調整された方法で相互作用し、細胞成長を調整する。HERファミリーメンバー、例えばEGFRの量または活性の変更は、がん細胞の増殖、移動、及び生き残りを導く不適切な細胞成長の原因となり、またはかかる不適切な細胞成長を支持し得る。シグナル伝達経路が、それぞれのステップ成長シグナルを増幅させるカスケードとして働くせいで、EGFRの量または活性における小さな変化は、細胞成長及び転移、(例えば細胞移動)を促進することにより、並びにアポトーシスプログラム細胞死)を阻害することにより、がんの発達、または進行を有意に推進し得る。

0028

EGFRの突然変異及び過剰発現は、悪性腫瘍の増殖における重要な因子として暗示され、また特定のがんについての乏しい予後診断のマーカーとして利用されてきた。EGFRは、多形性膠芽腫(GBM)において、増幅及び再配列され、そして腫瘍形成的に働き、成長を刺激し、そしてがん細胞を広げることを同定された最初の細胞表面糖タンパク質であった。さらにEGFRは、がん遺伝子、並びに膠芽腫、星状細胞腫髄膜腫、頭頸部扁平上皮がん黒色腫子宮頸がん腎細胞がん、肺がん、前立腺がん、膀胱がん大腸がん膵がん及び乳がん等の他のがんの進行において、重要な役割を果たすことが示されている。

0029

新規のEGFR変異体の同定
さらに本明細書においてEGFRの突然変異体と呼ばれる多くの多様な変異体が同定され、また多くのこれらのEGFR変異体は、特定のがんの開始または進行に関与してきた。EGFRの突然変異は、一般にNまたはC末端における小さな欠失である。mRNA中のエクソン2〜7に対応するインフレーム欠失であるEGFRvIIIは、現在、最も一般的なEGFR変異体として公知であり、また多形性膠芽腫(GBM)において最初に同定された。

0030

当業界において公知であるEGFR変異体は、EGFRvI(N−末端切断)、EGFRvII(エクソン14〜15の欠失)、EGFRvIII(エクソン2〜7の欠失)、EGFRvIII/Δ12〜13(エクソン2〜7及びエクソン12〜13の欠失)、EGFRvIV(エクソン25〜27の欠失)、EGFRvV(C−末端切断)、EGFR.TDM/2〜7(エクソン2〜7の縦列重複)、EGFR.TDM/18−25(エクソン18〜25の縦列重複)及びEGFR.TDM/18−26(エクソン18〜26の縦列重複)を含める。

0031

本発明は、本明細書においてEGFRvVIと呼ばれる新規のEGFR変異体を特徴とする。新規のEGFR変異体は、実施例1において発表されるように同定された。EGFRvVIは、エクソン7の一部を通るエクソン3の一部に対応するインフレーム欠失を含む。特に欠失は、エクソン3の内部で始まり、且つエクソン7の内部で終わる。好適には欠失は、エクソン3中の3分の1で始まり、且つエクソン7中の途中で終わる。欠失を引き起こすエクソン3及びエクソン7の内部で切断点を構成する相同領域は、図4に描かれている。好適には欠失は、野生型EGFR(例えば配列番号:2)のアミノ酸90〜221から由来し、且つ図5に示すような959アミノ酸長(例えば配列番号:5)であるEGFR変異体をもたらす。好適には欠失は、10730塩基対(bp)長である。いくつかの観点では、変異体は、野生型EGFRの90位でのアミノ酸のN−末端配列、または221位でのアミノ酸のC−末端配列から欠失した1、2、3、4、5、10、15または20個の追加のアミノ酸を有し得る。反対に、追加のアミノ酸が、野生型EGFRの対応位置でのアミノ酸と全く一致している変異体は、90位でのアミノ酸のC−末端、または221位でのアミノ酸のN−末端に、1、2、3、4、5、10、15または20個の追加のアミノ酸を有し得る。本明細書において発表される欠失は、任意のEGFRのスプライス変異体またはアイソフォームにおいて存在し得る。

0032

一つの観点では、EGFR変異体は、EGFR変異体のヌクレオチド配列、例えば配列番号:1と60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%を超えて同一性であるヌクレオチド配列を含んで成る。他の観点では、EGFR変異体は、EGFR変異体のアミノ酸配列、例えば配列番号:5と60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%を超えて同一性であるアミノ酸配列を含んで成る。

0033

二つ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸配列の文脈における用語“%同一性”とは、最大の一致について以下の配列比較アルゴリズムの一つを使用して、または目視検査により測定されるように比較し、そして位置合わせした場合に同一である、或いは同一である特定のパーセンテージアミノ酸残基またはヌクレオチドを有する、二つ以上の配列またはサブ配列に言及する。例えば、%同一性は、比較される配列のコード領域の全長に関連する。

0034

列比較に関し、典型的に一つの配列は、比較される試験配列に対する参照配列としての役割を果たす。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験及び参照配列は、コンピューター中に入力され、必要に応じてサブ配列座標が指定され、そして配列アルゴリズムプログラムパラメーターが指定される。その後に配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメーターに基づき、参照配列に対する試験配列(単数・複数)のパーセント配列同一性を計算する。パーセント同一性は、BLAST及びPSI−BLAST等のサーチアルゴリズムを使用して決定され得る(Altschul等、1990、J Mol Biol 215:3、403〜410;Altschul等、1997、Nucleic AcidsRes 25:17、3389〜402)。

0035

本発明は、以下に示すヌクレオチド配列を含んで成る、新規のEGFR変異体であるEGFRvVIを特徴とする。下線を引いた配列は、エクソン3及び7の内部の切断点を構成する相同領域を示す。
GTCCGGGCAGCCCCCGGCGCAGCGCGGCCGCAGCAGCCTCCTCCCCCCGCACGGTGTGAGCGCCCGCCGCGGCCGAGGCGGCCGGAGTCCCGAGCTAGCCCCGGCGGCCGCCGCCGCCCAGACCGGACGACAGGCCACCTCGTCGGCGTCCGCCCGAGTCCCCGCCTCGCCGCCAACGCCACAACCACCGCGCACGGCCCCCTGACTCCGTCCAGTATTGATCGGGAGAGCCGGAGCGAGCTCTTCGGGGAGCAGCGATGCGACCCTCCGGGACGGCCGGGGCAGCGCTCCTGGCGCTGCTGGCTGCGCTCTGCCCGGCGAGTCGGGCTCTGGAGGAAAAGAAAGTTTGCCAAGGCACGAGTAACAAGCTCACGCAGTTGGGCACTTTTGAAGATCATTTTCTCAGCCTCCAGAGGATGTTCAATAACTGTGAGGTGGTCCTTGGGAATTTGGAAATTACCTATGTGCAGAGGAATTATGATCTTTCCTTCTTAAAGACCATCCAGGAGGTGGCTGGTTATGTCCTCATGCTCTACAACCCCACCACGTACCAGATGGATGTGAACCCCGAGGGCAAATACACCTTTGGTGCCACCTGCGTGAAGAAGTGTCCCCGTAATTATGTGGTGACAGATCACGGCTCGTGCGTCCGAGCCTGTGGGGCCGACAGCTATGAGATGGAGGAAGACGGCGTCCGCAAGTGTAAGAAGTGCGAAGGGCCTTGCCGCAAAGTGTGTAACGGAATAGGTATTGGTGAATTTAAAGACTCACTCTCCATAAATGCTACGAATATTAAACACTTCAAAAACTGCACCTCCATCAGTGGCGATCTCCACATCCTGCCGGTGGCATTTAGGGGTGACTCCTTCACACATACTCCTCCTCTGGATCCACAGGAACTGGATATTCTGAAAACCGTAAAGGAAATCACAGGGTTTTTGCTGATTCAGGCTTGGCCTGAAAACAGGACGGACCTCCATGCCTTTGAGAACCTAGAAATCATACGCGGCAGGACCAAGCAACATGGTCAGTTTTCTCTTGCAGTCGTCAGCCTGAACATAACATCCTTGGGATTACGCTCCCTCAAGGAGATAAGTGATGGAGATGTGATAATTTCAGGAAACAAAAATTTGTGCTATGCAAATACAATAAACTGGAAAAAACTGTTTGGGACCTCCGGTCAGAAAACCAAAATTATAAGCAACAGAGGTGAAAACAGCTGCAAGGCCACAGGCCAGGTCTGCCATGCCTTGTGCTCCCCCGAGGGCTGCTGGGGCCCGGAGCCCAGGGACTGCGTCTCTTGCCGGAATGTCAGCCGAGGCAGGGAATGCGTGGACAAGTGCAACCTTCTGGAGGGTGAGCCAAGGGAGTTTGTGGAGAACTCTGAGTGCATACAGTGCCACCCAGAGTGCCTGCCTCAGGCCATGAACATCACCTGCACAGGACGGGGACCAGACAACTGTATCCAGTGTGCCCACTACATTGACGGCCCCCACTGCGTCAAGACCTGCCCGGCAGGAGTCATGGGAGAAAACAACACCCTGGTCTGGAAGTACGCAGACGCCGGCCATGTGTGCCACCTGTGCCATCCAAACTGCACCTACGGATGCACTGGGCCAGGTCTTGAAGGCTGTCCAACGAATGGGCCTAAGATCCCGTCCATCGCCACTGGGATGGTGGGGGCCCTCCTCTTGCTGCTGGTGGTGGCCCTGGGGATCGGCCTCTTCATGCGAAGGCGCCACATCGTTCGGAAGCGCACGCTGCGGAGGCTGCTGCAGGAGAGGGAGCTTGTGGAGCCTCTTACACCCAGTGGAGAAGCTCCCAACCAAGCTCTCTTGAGGATCTTGAAGGAAACTGAATTCAAAAAGATCAAAGTGCTGGGCTCCGGTGCGTTCGGCACGGTGTATAAGGGACTCTGGATCCCAGAAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAGGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCGAAAGCCAACAAGGAAATCCTCGATGAAGCCTACGTGATGGCCAGCGTGGACAACCCCCACGTGTGCCGCCTGCTGGGCATCTGCCTCACCTCCACCGTGCAGCTCATCACGCAGCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCTGGACTATGTCCGGGAACACAAAGACAATATTGGCTCCCAGTACCTGCTCAACTGGTGTGTGCAGATCGCAAAGGGCATGAACTACTTGGAGGACCGTCGCTTGGTGCACCGCGACCTGGCAGCCAGGAACGTACTGGTGAAAACACCGCAGCATGTCAAGATCACAGATTTTGGGCTGGCCAAACTGCTGGGTGCGGAAGAGAAAGAATACCATGCAGAAGGAGGCAAAGTGCCTATCAAGTGGATGGCATTGGAATCAATTTTACACAGAATCTATACCCACCAGAGTGATGTCTGGAGCTACGGGGTGACCGTTTGGGAGTTGATGACCTTTGGATCCAAGCCATATGACGGAATCCCTGCCAGCGAGATCTCCTCCATCCTGGAGAAAGGAGAACGCCTCCCTCAGCCACCCATATGTACCATCGATGTCTACATGATCATGGTCAAGTGCTGGATGATAGACGCAGATAGTCGCCCAAAGTTCCGTGAGTTGATCATCGAATTCTCCAAAATGGCCCGAGACCCCCAGCGCTACCTTGTCATTCAGGGGGATGAAAGAATGCATTTGCCAAGTCCTACAGACTCCAACTTCTACCGTGCCCTGATGGATGAAGAAGACATGGACGACGTGGTGGATGCCGACGAGTACCTCATCCCACAGCAGGGCTTCTTCAGCAGCCCCTCCACGTCACGGACTCCCCTCCTGAGCTCTCTGAGTGCAACCAGCAACAATTCCACCGTGGCTTGCATTGATAGAAATGGGCTGCAAAGCTGTCCCATCAAGGAAGACAGCTTCTTGCAGCGATACAGCTCAGACCCCACAGGCGCCTTGACTGAGGACAGCATAGACGACACCTTCCTCCCAGTGCCTGGTGAGTGGCTTGTCTGGAAACAGTCCTGCTCCTCAACCTCCTCGACCCACTCAGCAGCAGCCAGTCTCCAGTGTCCAAGCCAGGTGCTCCCTCCAGCATCTCCAGAGGGGGAAACAGTGGCAGATTTGCAGACACAGTGAAGGGCGTAAGGAGCAGATAAACACATGACCGAGCCTGCACAAGCTCTTTGTTGTGTCTGGTTGTTTGCTGTACCTCTGTTGTAAGAATGAATCTGCAAAATTTCTAGCTTATGAAGCAAATCACGGACATACACATCTGTATGTGTGAGTGTTCATGATGTGTGTACATCTGTGTATGTGTGTGTGTGTATGTGTGTGTTTGTGACAGATTTGATCCCTGTTCTCTCTGCTGGCTCTATCTTGACCTGTGAAACGTATATTTAACTAATTAAATATTAGTTAATATTAATAAATTTTAAGCTTTATCCAGAAAAAAAAAAAAAAAA(配列番号:3)。

0036

本発明は、以下のようにEGFRvVIの一部分、特にエクソン1、2、3、7及び8を含むヌクレオチド配列を含んで成る、新規のEGFR変異体であるEGFRvVIを特徴とし、ここで下線を引いた配列は、エクソン3〜7の内部で切断点を構成する相同領域を示す:
GCTGGCTGCGCTCTGCCCGGCGAGTCGGGCTCTGGAGGAAAAGAAAGTTTGCCAAGGCACGAGTAACAAGCTCACGCAGTTGGGCACTTTTGAAGATCATTTTCTCAGCCTCCAGAGGATGTTCAATAACTGTGAGGTGGTCCTTGGGAATTTGGAAATTACCTATGTGCAGAGGAATTATGATCTTTCCTTCTTAAAGACCATCCAGGAGGTGGCTGGTTATGTCCTCATGCTCTACAACCCCACCACGTACCAGATGGATGTGAACCCCGAGGGCAAATACACCTTTGGTGCCACCTGCGTGAAGAAGTGTCCCCGTAATTATGTGGTGACAGATCACGGCTCGTGCGTCCGAGCCTGTGGGGCCGACAGCTATGAGATGGAGGAA(配列番号:4)。

0037

本発明は、以下のアミノ酸配列を伴う、新規のEGFR変異体であるEGFRvVIを特徴とする:
MRPSGTAGAALLALLAALCPASRALEEKKVCQGTSNKLTQLGTFEDHFLSLQRMFNNCEVVLGNLEITYVQRNYDLSFLKTIQEVAGYVLMLYNPTTYQMDVNPEGKYSFGATCVKKCPRNYVVTDHGSCVRACGADSYEMEEDGVRKCKKCEGPCRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFMRRRHIVRKRTLRRLLQERELVEPLTPSGEAPNQALLRILKETEFKKIKVLGSGAFGTVYKGLWIPEGEKVKIPVAIKELREATSPKANKEILDEAYVMASVDNPHVCRLLGICLTSTVQLITQLMPFGCLLDYVREHKDNIGSQYLLNWCVQIAKGMNYLEDRRLVHRDLAARNVLVKTPQHVKITDFGLAKLLGAEEKEYHAEGGKVPIKWMALESILHRIYTHQSDVWSYGVTVWELMTFGSKPYDGIPASEISSILEKGERLPQPPICTIDVYMIMVKCWMIDADSRPKFRELIIEFSKMARDPQRYLVIQGDERMHLPSPTDSNFYRALMDEEDMDDVVDADEYLIPQQGFFSSPSTSRTPLLSSLSATSNNSTVACIDRNGLQSCPIKEDSFLQRYSSDPTGALTEDSIDDTFLPVPGEWLVWKQSCSSTSSTHSAAASLQCPSQVLPPASPEGETVADLQTQ(配列番号:5)。

0038

いくつかの態様では、EGFRvVIは、優先的に腫瘍細胞中で発現する。例示的な腫瘍細胞は、膠芽腫細胞を含める。他の腫瘍細胞は、上皮腫瘍細胞を含め得る。腫瘍細胞は、これらに限定されないが、以下のがんの腫瘍細胞:膠芽腫、星状細胞腫、髄膜腫、頭頸部扁平上皮がん、黒色腫、子宮頸がん、腎細胞がん、肺がん、前立腺がん、膀胱がん、大腸がん、膵がん及び乳がんを含め得る。

0039

患者におけるEGFRvVIの同定は、患者ががんを有するか否か、がんを発達させるリスクがあるか否か、またはがんを発達させるより高い素因を有するか否かを決定するために使用され得る。これは、一つには、EGFR変異体が、がんを有しない健常対象において発現しないという事実のせいである。いくつかの態様では、特定のEGFR変異体は、特定のがんにおいてより高頻度に見られ得る。例えばEGFRvIIIは、非小細胞肺がん細胞(NSCLC)及びGBMにおいて見出される、最も頻度の高いEGFR突然変異である。いくつかの態様では、EGFRvVIは、神経系のがん、例えばGBMまたは星状細胞腫を有する患者において見出される。

0040

本明細書において使用されるがんは、過剰増殖性病状または障害に言及する。用語は、悪性及び非悪性細胞集団包含する。かかる障害は、細胞の一つ以上のサブセットの増加した細胞増殖、または過度の細胞増殖により特徴付けられ、それはしばしば形態学的且つ遺伝子型的に、取り囲む組織とは異なると思われる。患者由来組織試料における増加した細胞増殖、または過剰な細胞増殖は、参照試料の組織試料との細胞増殖の比較により決定され得る。参照試料は、一般集団もしくは健常対象集団、またはがんと診断されていない対象から由来する試料の集団から決定されたスコアであり得る。さらに参照試料は、同一の患者から異なる時点で得られた試料であり得る。細胞増殖は、Ki−67、BrDU、または有糸分裂マーカー等の増殖マーカーに関する生体試料の免疫組織化学的染色等の当業界において公知の任意の方法により測定され得る。過剰増殖性の細胞障害は、多様なタイプの動物、及びヒトにおいて生じ、そして影響を受けた細胞に応じて、多様な物理的兆候を生み出し得る。

0041

がんは、神経系のがん、上皮がん及び固形腫瘍がんを含める。かかるがんは、膠芽腫、星状細胞腫、髄膜腫、頭頸部扁平上皮がん、黒色腫、子宮頸がん、腎細胞がん、肺がん、前立腺がん、膀胱がん、大腸がん、膵がん及び乳がんを含める。

0042

特に注目のがんは、脳腫瘍を含める神経系のがんである。神経系の腫瘍は、例えば星状膠細胞のような、腫瘍が生じたと思われる細胞の種類に従い分類される。びまん性線維性星状細胞腫は、成人原発性脳腫瘍の最も一般的なタイプである。これらの腫瘍は、病理組織学的に三つの悪性グレード世界保健機関(WHO)グレードII星状細胞腫、WHOグレードIII未分化星状細胞腫及びWHOグレードIV多形性膠芽腫(GBM)に分けられる。WHOグレードII星状細胞腫は、最も進行が遅いびまん性の星状細胞腫スペクトルである。星状細胞腫は、周囲の脳に浸透し、局所制御での治療試みを悪化させる顕著な傾向を示す。これらの侵襲的な能力は、しばしば低いグレード及び高いグレードの腫瘍において明らかである。

0043

多形性膠芽腫は、殆どの患者が2年未満の生存時間である、星状細胞腫の最も悪性のステージである。組織学的にこれらの腫瘍は、高い増殖インデックス内皮増殖及び限局性壊死により特徴付けられる。これらの病変のより高い増殖性質は、多数のマイトジェン効果に起因するようだ。GBMの一つの顕著な特徴は、内皮の増殖である。成長因子の宿主及びそれらの受容体は、GBM中で増幅及び/または突然変異して見出される。

0044

抗体
フラグメント誘導体及びその類似物を含める本発明のEGFR変異体は、後に発表する診断、研究、及び治療方法における用途を有する抗体を産するための免疫原として使用され得る。抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルキメラヒト化単鎖(svFc)またはFabフラグメントであり得る。通常の当業者に公知である多様な手順は、かかる抗体及びフラグメントの生産及び標識化のために使用され得る。例えばBurns、編、Immunochemical Protocols、第3補改訂編、Humana Press(2005);Harlow and Lane、Antibodies:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory(1988);Kozbor等、Immunology Today 4:72(1983);Kohler及びMilstein、Nature 256:495(1975)を参照する。

0045

EGFRvVI及び全長野生型EGFRまたは他のEGFR変異体の間の差異を利用する抗体またはフラグメントは、特に好適である。特に注目すべきは、EGFRvVIを特異的に認識する抗体、またはその機能的なフラグメントである。“特異的に認識する”が何を意味しているかは、抗体、またはその機能的なフラグメントが、野生型EGFR及び/または他のEGFR変異体、例えばEGFRvIIIと比べて、EGFRvVIと優先的に結合することである。例えば抗体は、エクソン3及び7が融合されるEGFRvVIの領域に結合し得る。或いは3次元構造、または天然構造の天然のEGFRvVIタンパク質は、本明細書において開示されるEGFRvVI−特異的抗体により認識され得る野生型EGFRまたは他のEGFR変異体において存在し得ない、または入手し得ない新規のエピトープ提示し得る。

0046

EGFRvVI抗体の例示的な用途は、本明細書において開示されている。かかる用途は、診断方法及び予後診断方法を含める。

0047

診断的適用
本発明は、EGFRvVIを直接的または間接的に検出するような診断方法に基づくDNA、RNA及びタンパク質を提供する。さらに本発明は、診断目的のための組成物及びキットを提供する。

0048

本発明は、患者から生体試料を得ること、核酸またはタンパク質を抽出すること、そして生体試料中のEGFRvVIの存在、不存在、またはそのレベルを決定することを含んで成る診断方法を特徴とする。生体試料中のEGFRvVIの存在、不存在、またはそのレベルを決定するための方法は、本明細書においてさらに検討される。

0049

本発明の診断方法は、定性的または定量的であり得る。定量的な診断方法は、例えば予め定められたカットオフ、または閾値を介して、遅発性進行性のがんの間を見分けるために使用され得る。適切な場合には、さらに定性的または定量的な診断方法は、標的、シグナルまたは中間物(例えばユニバーサルプライマー)の増幅を含め得る。

0050

EGFRvVIは、マルチプレックスまたはパネルフォーマットにおいて、他のマーカーと共に検出され得る。マーカーは、単独、またはEGFR変異体との組み合わせにあるそれらの予測値のために選定される。さらにかかるマーカーは、EGFRvIII等の一つ以上の他のEGFR変異体を含め得る。さらに当業界において公知である他のがん、疾患、感染症、及び代謝性の病状についてのマーカーは、 マルチプレックスのパネルフォーマット中に含められることを熟慮される。

0051

さらに本発明の診断方法は、EGFRvVI等の特定のEGFR変異体を、疾患のステージ、悪性度もしくは進行、または転移の存在もしくはリスクと相関させるデータについての考察を含め得る。最終的に本発明の方法により提供される情報は、特定の患者への治療の最善策を選定する上で、医師を支援するだろう。

0052

試料
本明細書において使用される用語“生体試料”とは、DNA、RNA及びタンパク質等の生体材料を含む試料に言及する。いくつかの態様では、生体試料は、組織試料、細胞培養試料、または生検試料であり得る。いくつかの態様では、生体試料は、対象から由来する体液を適切に含んで成り得る。体液は、これらに限定されないが、例えば血液、血漿血清、尿、唾液髄液、脳脊髄液、胸膜液乳頭吸引液リンパ液気道液、腸液尿生殖路液体涙液、唾液、母乳リンパ系から由来する液体、精液、脳脊髄液、臓器系統の液体、腹水、腫瘍嚢胞液、羊水及びその組み合わせを含める対象の体のいずれの場所からでも単離される、好適には末梢の位置から単離される液体であり得る。いくつかの態様では、生体試料として使用するために好適な体液は、尿である。他の態様では、好適な体液は、脳脊髄液(CSF)、血清または血漿である。適切には、約0.1mL〜約30mLの液体の試料容積が使用され得る。液体の容積は、いくつかの要因、例えば使用される液体のタイプに左右され得る。例えば血清試料の容積は、約0.1mL〜約20mL、好適には約4mLであり得る。尿試料の容積は、約10mL〜約30mL、好適には約20mLであり得る。

0053

他の態様では、試料は、in vivoにあってよく、ここでEGFRvVIを発現する循環腫瘍細胞または微小胞(例えばエキソソーム)は、静脈カテーテルの挿入を介して、in vivoにおいて生体液から検出され得る。具体的には静脈カテーテルは、EGFRvVI、例えばEGFRvVI−特異的抗体に結合し得る検出薬を含んで成る。その後にカテーテルは、EGFRvVI−発現循環腫瘍細胞または微小胞を検出または収集する。静脈カテーテルは、少なくとも5分間、対象に挿入されたままで、少なくとも2.5リットルの血液が調査され得る。したがって本方法は、まれな腫瘍事象の検出を可能にする。

0054

用語“対象”とは、EGFR及びその変異体を発現することが示されている、またはEGFR及びその変異体を発現することが予測される全ての動物を含めることが意図される。特定の態様では、対象は、哺乳動物、ヒトまたは非ヒト霊長類イヌネコウマウシ、他の家畜、または齧歯動物(例えばマウスラットモルモット等)である。ヒト対象は、観察可能な異常、例えば疾患を伴わない正常のヒトであり得る。ヒト対象は、観察可能な異常、例えば疾患を伴うヒトであり得る。観察可能な異常は、そのヒト自身により、または医療専門家により観察され得る。用語“対象”、“患者”及び“個体”とは、本明細書において区別せずに使用される。

0055

生体試料は、EGFRvVI、または他の注目のマーカーの試料を単離または富ませるように設計される予備処理を要求し得る。いくつかの観点では、EGFRvVIまたは他の注目のマーカーを含む細胞、または他の核酸含有粒子が単離される。これらに限定されないが、遠心分離;免疫捕獲細胞融解;及び核酸標的捕獲(例えば参照によりその全体が本明細書に組み込まれているEP特許第1409727号を参照)を含める通常の当業者に公知である多様な技術は、本目的のために使用され得る。

0056

いくつかの態様では、微小胞フラクションを単離、精製し、または富ませるように生体試料を前処理することは、好都合であり得る。本明細書において使用される用語“微小胞”とは、細胞から剥がれ落ちる0.8ミクロン未満の全ての膜小胞について集合的に言及する。生体試料からの微小胞の単離は、遠心分離、ろ過、イオン交換クロマトグラフィーサイズ排除クロマトグラフィー及び親和性クロマトグラフィー、または任意のその組み合わせを通して達成され得る(例えばPCT出願WO2011/009104、WO2012/051622、及びWO2012/064993を参照)。核酸またはタンパク質の抽出に先立ち、微小胞フラクションの単離は、EGFRvVI及び他の注目のマーカーのより正確な、または特異的な検出に関し、より高い品質抽出をもたらす。

0057

核酸検出
EGFRvVIは、これらに限定されないが、核酸シークエンシング;核酸ハイブリダイゼーション;及び核酸増幅を含める通常の当業者に公知である多様な核酸技術を使用して、ゲノムDNAまたはキメラmRNAの染色体再配置として検出され得る。

0058

核酸シークエンシング技術の例は、これらに限定されないが、連鎖停止サンガー)シークエンシング及びダイターミネーターシークエンシングを含める。それらの通常の当業者は、RNAが細胞中でより安定ではなく、且つよりヌクレアーゼ攻撃への傾向にあるので、通常シークエンシング前に、RNAがDNAに逆転写されることを認識するだろう。RNAをcDNAに逆転写させるための方法及び試薬は、当業界において公知である。連鎖停止シークエンシングは、修飾ヌクレオチド基質放射性または他の標識化オリゴヌクレオチドプライマー、及び連鎖停止ヌクレオチドを使用するDNA合成反応の配列特異的末端を使用する。ダイターミネーターシークエンシングは、ターミネーターを標識し、そして完全なシークエンシングは、それぞれのジ−ジオキヌクレオチド連鎖停止剤を、別個蛍光染料で標識することにより、単一の反応において行われ得る。

0059

核酸ハイブリダイゼーション技術の例は、これらに限定されないが、in situハイブリダイゼーション(蛍光in situハイブリダイゼーション FISH等のISH)、マイクロアレイ、及びサザンまたはノーザンブロットを含める。ISHは、標識化された相補的なDNAまたはRNAプローブを使用し、組織の一部または部分において特定のDNAまたはRNA配列の場所を見つけ出し、または特定のDNAまたはRNA配列とハイブリダイズする(in situ)。マイクロアレイの例は、DNAマイクロアレイ(例えばcDNAマイクロアレイ及びオリゴヌクレオチドマイクロアレイ)、タンパク質マイクロアレイ組織マイクロアレイトランスフェクションまたは細胞マイクロアレイ、化合物マイクロアレイ、及び抗体マイクロアレイを含める。さらにDNAマイクロアレイは、一般に遺伝子チップDNAチップ、またはバイオチップとしても公知である。マイクロアレイは、何千もの遺伝子またはタンパク質の発現プロファイルを同時にモニタリングする目的のために、アレイを形成する固体表面(例えばガラスプラスチックまたはシリコンチップ)に付着したプローブ(例えばDNA、RNA、化合物または抗体)を集めることである。サザンブロット法は、特異的なフィルターに結合したDNA配列を、注目の配列に相補的標識化プローブとのハイブリダイゼーションにより検出するために利用される。ノーザンブロット法は、特異的なフィルターに結合したRNA配列を、注目の配列に相補的な標識化プローブとのハイブリダイゼーションにより検出するために利用される。

0060

EGFRvVIは、検出に先立ち、または検出と同時に行われる増幅により同定され得る。核酸増幅技術の例は、これらに限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)、転写仲介増幅(TMA)、リガーゼ連鎖反応(LCR)、鎖置換増幅(SDA)、及び核酸配列に基づく増幅(NASBA)を含める。特定の増幅技術(例えばPCR)は、増幅に先立ちRNAをDNAに逆転写することを要求するが(例えばRT−PCR)、他の増幅技術は、直接RNAを増幅する(例えばTMA及びNASBA)ということを、それらの通常の当業者は認識するだろう。

0061

一般にPCRと呼ばれるポリメラーゼ連鎖反応(それぞれが、その全体において参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第4,683,195号、4,683,202号、4,800,159号及び4,965,188号)は、多数のサイクル変性、逆鎖へのプライマー対アニーリング、及びプライマー伸長を使用して、標的の核酸配列のコピー数指数関数的に増加させる。RT−PCRと呼ばれる変形では、逆転写酵素(RT)は、相補的DNA(cDNA)をmRNAから作るために使用され、そしてその後にcDNAは、PCRにより増幅され、DNAの多数のコピーを産する。他の多様なPCRの変形については、例えばその全体において参照により本明細書に組み込まれている米国特許第4,683,195号、第4,683,202号及び第4,800,159号;Mullis等、Meth.Enzymol.155:335(1987);及びMurakawa等、DNA 7:287(1988)を参照する。一般にTMAと呼ばれる転写仲介増幅は、実質的に一定の温度、イオン強度、及びpHの条件下で、標的核酸配列の多数のコピーを自己触媒的に合成し、ここで標的配列の多数のRNAのコピーは、自己触媒的にさらなるコピーを作り出す。一般にLCRと呼ばれるリガーゼ連鎖反応は、標的核酸の隣接した領域にハイブリダイズする、2セットの相補的DNAオリゴヌクレオチドを使用する。DNAオリゴヌクレオチドは、繰り返される熱変性、ハイブリダイゼーション及びライゲーションのサイクルにおいて、DNAリガーゼにより共有結合され、検出可能な二本鎖及び結合したオリゴヌクレオチド産物を産する。一般にSDAと呼ばれる鎖置換増幅は、標的配列の逆鎖へのプライマー配列対のアニーリング、dNTPαSの存在中でのプライマー伸長のサイクルを使用し、二本鎖ヘミホスホロチオエートプライマー伸長産物を産する。このプライマー伸長産物は、半修飾された制限エンドヌクレアーゼ認識部位エンドヌクレアーゼに仲介されるニッキングを受け、そしてニックの3’末端からのポリメラーゼに仲介されるプライマー伸長は、既存の鎖を置き換え、そして次回のプライマーアニーリング、ニッキング及び鎖置換のための鎖を生み出すことにより、幾何学的な産物の増幅をもたらす。

0062

非増幅、または増幅されたEGFR変異体核酸は、任意の従来型の手段により検出され得る。例えばEGFRvVIは、検出可能な標識化プローブとのハイブリダイゼーション、及び得られるハイブリッドの測定により検出され得る。実例となる検出方法の非限定的な例は、以下に発表する。

0063

増幅工程の定量的評価は、リアルタイムで行われ得る。“リアルタイム”での増幅工程の評価は、連続的または定期的に、増幅反応の間、反応混合物中のアンプリコンの量を決定すること、及び決定された値を用いて、試料中に最初に存在する標的配列の量を計算することを伴う。リアルタイム増幅に基づき、試料中に存在する最初の標的配列の量を決定するための多様な方法は、当業界において周知である。これらは、それぞれその全体において、参照により本明細書に組み込まれている米国特許第6,303,305号及び第6,541,205号において開示されている方法を含める。リアルタイム増幅に基づかないが、試料中に最初に存在する標的配列の量を決定するための他の方法は、その全体において、参照により本明細書に組み込まれている米国特許第5,710,029号において開示されている。

0064

さらに本発明は、試料中のEGFRvVI核酸の存在の特異的検出のための、EGFRvVI核酸と結合する核酸を提供する。EGFRvVIを検出するための核酸は、EGFRvVIをコードするRNAもしくはDNA、またはEGFR遺伝子とハイブリダイズする、10〜1000個のヌクレオチド(好適には、10〜500、10〜100、10〜50、10〜35、20〜1000、20〜500、20〜100、20〜50、または20〜35個のヌクレオチド)から成る単離核酸を含んで成る。好適な態様では、核酸は、野生型EGFRvVI、または他のEGFR変異体のRNAまたはDNAではなく、EGFRvVIをコードするRNAまたはDNAと選択的にハイブリダイズする。特に単離核酸は、配列番号:5におけるアミノ酸配列を含んで成るEGFRvVIポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;配列番号:3または配列番号4における核酸配列を含んで成るヌクレオチド配列;EGFRvVI(配列番号:3)または野生型EGFR、例えば配列番号:1のエクソン1〜3、またはエクソン7〜28の任意の一つのヌクレオチド配列から成る群から選定される配列と、少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるポリヌクレオチド配列を含んで成る核酸分子から由来する、少なくとも10個の連続的なヌクレオチド(好適には、15、18、20、25、または30個)から成るヌクレオチド配列であり、または該配列と相補的であり、ここでヌクレオチド配列は、隣接したエクソン:または上記の任意のヌクレオチド配列と相補的である配列にも及び得る。好適にはヌクレオチド配列は、野生型EGFR、例えば配列番号:1のエクソン4、エクソン5、またはエクソン6と相補的な配列の配列を含まない。さらに相補的な配列は、それらがコード鎖と相補的である配列を含んで成る場合、アンチセンス核酸としても公知である。好適には核酸は、野生型EGFRの90〜221位でアミノ酸をコードするヌクレオチドとは特異的にハイブリダイズしない。さらに検出に有用な核酸は、本明細書においてプライマーまたはプローブとも呼ばれ、また本明細書において発表される多くの検出方法において利用され得る。

0065

一つの観点では、EGFRvVIを検出するための単離核酸分子は、EGFRvVI RNA、DNAまたはcDNAと特異的にハイブリダイズする10〜50個のヌクレオチドを含んで成る。核酸分子は、エクソン1〜3及び7〜28の隣接するエクソンに及ぶヌクレオチド配列を含める、EGFRvVI(配列番号:3)または野生型EGFR(配列番号:1)のEGFRvVIエクソン1〜3またはエクソン7〜28から由来する、少なくとも5個、少なくとも10個、少なくとも15個、または少なくとも20個の連続的なヌクレオチドから成るヌクレオチド配列であり、または該配列と相補的である。具体的には核酸分子は、野生型EGFRのアミノ酸90〜221をコードするヌクレオチド配列にはハイブリダイズしない。

0066

本発明において使用され得る特異的な核酸プライマー及びプローブの例は:
EGFRForw 1− CTGCTGGCTGCGCTCTG(配列番号:6)
EGFRv3 rev4 -CGTGATCTGTCACCACATAATTACC(配列番号:7)
EGFR プローブ6 -TTCCTCCAGAGCCCGACT(配列番号:8)
EGFR Forw 1− CTGCTGGCTGCGCTCTG(配列番号:6)
EGFR Rev 1− TTCCTCCATCTCATAGCTGTCG(配列番号:9)
EGFR プローブ6: TTCCTCCAGAGCCCGACT(配列番号:8)
EGFR qPCRエクソン3〜7 del forw 1: TGGTCCTTGGGAATTTGGAA(配列番号:10)
EGFR qPCR エクソン3〜7 del rev: GTGGGGTTGTAGAGCATGAGGA(配列番号:11)
EGFR qPCR エクソン3〜7 del プローブ: TACCTATGTGCAGAGGAA(配列番号:12)を含める。

0067

通常の当業者により理解されるように、多数の追加のプローブまたはプライマーは、配列番号:3から設計され得る。

0068

核酸プローブは、通常のハイブリダイゼーション方法により適切な染色体またはcDNAライブラリー精査し、本発明の他の核酸分子を得るために使用され得る。染色体DNAまたはcDNAライブラリーは、当業界において認識される方法に従い、適切な細胞から調製され得る(Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第二編、Sambrook、Fritsch、& Maniatis編、Cold Spring Harbor Laboratory、1989を参照)。

0069

別の方法では、化学合成は、PCA3アミノ酸配列のN−末端及びC−末端部分に対応するヌクレオチド配列を有する核酸プローブを得るために行われる。したがって合成された核酸プローブは、本発明のフラグメントを得るために適切な染色体、cDNAまたは細胞株ライブラリーを利用する認識されているPCR技術に従い、本質的にはPCRプロトコール、A Guide to Methodsand Applications、Michael等編、Academic Press、1990に従い行われる、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)におけるプライマーとして使用され得る。

0070

当業者は、本明細書において開示される配列に基づき、当業界において公知のコンピューターアライメント及び配列分析の方法(Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第二編、Sambrook、Fritsch、&Maniatis編、Cold Spring Harbor Laboratory、1989を参照)を用いて、かかるプローブを容易に設計し得る。

0071

本発明のハイブリダイゼーションプローブは、放射性標識酵素標識蛍光標識ビオチンアビジン標識、化学発光等による標準標識化技術により標識化され得る。例えばプローブは、FA染料により標識化される。ハイブリダイゼーション後にプローブは、公知の方法を用いて可視化され得る。

0072

本発明の核酸プライマー及びプローブは、当業界において公知の技術を用いて作り出されたプローブ等のRNA及びDNAプローブを含める。

0073

上記の方法の一つの態様では、核酸プローブは、固体の支持体上で固定される。かかる固体の支持体の例は、これらに限定されないが、ポリカーボネート等のプラスチック、アガロース及びセファロース等の複合糖質、並びにポリアクリルアミド及びラテックスビーズ等のアクリル樹脂を含める。核酸プローブをかかる固体支持体カップリングさせるための技術は、当業界において周知である。

0074

タンパク質検出
本発明のEGFRvVIは、これらに限定されないが、タンパク質シークエンシング及び免疫測定法を含める通常の当業者に公知である多様なタンパク質技術を用いて、先を切断されたEGFRタンパク質、キメラタンパク質または欠失を伴うタンパク質として検出され得る。タンパク質シークエンシング技術の例は、これらに限定されないが、質量分析法及びエドマン分解を含める。免疫測定法の例は、これらに限定されないが、免疫沈降ウエスタンブロット法ELISA、免疫組織化学、免疫細胞化学フローサイトメトリー、及び免疫−PCRを含める。通常の当業者に公知である多様な技術(例えば熱量測定、蛍光、化学発光または放射性標識)を用いて、検出可能な部分により標識化されたポリクローナルまたはモノクローナル抗体は、免疫測定における使用に適している。

0075

いくつかの態様では、コンピューターに基づく分析プログラムは、検出アッセイにより作り出される生データ(例えば所定のマーカー、または例えばEGFRvVIのようなマーカーの存在、不存在、または量)を、臨床医のための予測値のデータに翻訳するために使用される。臨床医は、任意の適切な手段を用いて、予測データを利用し得る。したがって、いくつかの好適な態様では、本発明は、恐らく遺伝子または分子生物学教育を受けていない臨床医が、生データを理解する必要がないという、さらなる利益を提供する。データは、その最も有用な形態で臨床医に直接提示される。その後に臨床医は、対象への配慮を最適化するために、情報を即座に利用することができる。本発明は、アッセイを行う研究室から情報を受け、処理し、そして研究室から研究室に伝えることができる任意の方法を検討し、情報は、医療従事者及び対象に提供される。

0076

さらにEGFRvVIは、これらに限定されないが、放射性核種画像化;ポジトロン放出断層撮影(PET);コンピューター断層撮影X線または磁気共鳴画像化、蛍光検出、及び化学発光検出を含めるin vivo画像化技術を用いて検出され得る。いくつかの態様では、in vivo画像化技術は、動物(例えばヒト、または非ヒト哺乳動物)におけるがんマーカーの発現の存在、または発現を可視化するために使用される。例えば、いくつかの態様では、がんマーカーmRNAまたはタンパク質は、がんマーカーに特異的な標識化抗体を用いて標識化される。特異的に結合され、且つ標識化された抗体は、これらに限定されないが、放射性核種画像化、ポジトロン放出型断層撮影、コンピューター断層撮影、X線または磁気共鳴画像化、蛍光検出、及び化学発光検出を含めるin vivo画像化法を用いて、個体において検出され得る。本発明のin vivo画像化法は、本発明のがんマーカーを発現するがんの診断に有用である(例えば膠芽腫)。in vivo画像化は、がんを示すマーカー、例えばEGFRvVIの存在を可視化するために使用される。かかる技術は、不快な生検の使用を伴わない診断を可能にする。さらに本発明のin vivo画像化法は、がん患者への予後診断を提供するのに有用である。例えば、転移の恐れのあるがんを示すマーカーの存在は、検出され得る。本発明のin vivo画像化法は、さらに身体の他の部分における転移性のがんを検出するために使用され得る。

0077

組成物及びキット
本発明の診断方法において使用するための組成物は、これらに限定されないがプローブ、増幅オリゴヌクレオチド、及び抗体を含める。特に好適な組成物は、任意の他のEGFR変異体ではなく、EGFRvVIを検出する。これらの組成物は、EGFRのエクソンからの5’部分が、エクソン7からの3’部分に結合するジャンクションとハイブリダイズする配列を含んで成る単一の標識化プローブまたはオリゴヌクレオチドプライマー;エクソン3及びエクソン7が、EGFRvVI中でつながるところで、一つの増幅オリゴヌクレオチドが、相同の切断点にハイブリダイズする配列を含んで成る、一対の増幅オリゴヌクレオチド;またはEGFRvVIを特異的に認識する抗体を含める。

0078

単独、または本発明の他の組成物との組み合わせにある、任意のこれらの組成物は、キットの形態において提供され得る。例えば、単一の標識化プローブ、及び増幅オリゴヌクレオチド対は、本発明のEGFR変異体の増幅及び検出のためのキットにおいて提供され得る。キットは、適切なコントロール及び/または検出試薬をさらに含んで成り得る。

0079

さらに本発明のプローブ及び抗体組成物は、アレイの形態において提供され得る。

0080

予後診断適用
EGFRvVI及びがんを伴う患者の予後診断の間で、相関性は存在し得る。いくつかの態様では、EGFRvVIの存在、不存在またはそのレベルは、その活性、悪性度、侵襲性、または転移能に基づき、腫瘍を、階層化または分類するための用途であり得る。したがって、いくつかの態様では、EGFRvVIを検出するためのアッセイは、予後診断を提供し、そして医師が適切な治療戦略を決定するのを助けるために使用される。例えば、いくつかの態様では、EGFRvVIを有する腫瘍を伴う患者は、野生型EGFRを有するものとは別に治療される。例えば、EGFRvVIを有する患者の予後診断は、EGFRvVIを欠く患者よりも悪くなり得るので、より積極的な治療計画を要求し得る。いくつかの態様では、EGFRvVIの存在は、生存率/時間、腫瘍の侵襲性、及び転移と相関する。

0081

本発明は、膠芽腫がん患者の予後診断を得ることとの関連において、最適に使用されるだろうが、さらに他の上皮または固形細胞腫瘍も調査されてよく、そして本明細書において発表されるアッセイ及びプローブは、特に悪性になる恐れがある、すなわち侵襲性及び転移性である恐れがあるこれらの腫瘍から由来するがん細胞が、EGFRvVIを発現するか否かの決定において使用され得る。本手段を用いて特徴化され得る腫瘍の例は、乳房、結腸、卵巣子宮食道肝臓腎臓、脳、皮膚及び筋肉の腫瘍を含める。さらに本発明のアッセイは、細胞株及び動物モデルにおいて、これらのがんを研究する研究者達にとって、価値のあるものになるだろう。

0082

薬物スクリーニング及び治療適用
いくつかの態様では、本発明は、薬物スクリーニングアッセイ(例えば抗がん剤をスクリーニングする)を提供する。本発明のスクリーニング方法は、EGFRvVIの生物学的機能を調節し得る化合物または化学物質(例えば小分子、薬物、タンパク質、ペプチドペプチド模倣物ペプトイド)の同定を提供する。例えば化合物または化学物質は、EGFRvVIがリガンド結合ドメインの一部を欠いているような、リガンド非依存性の方法において、EGFRvVIを阻害し得る。EGFRvVIの生物学的機能の阻害は、EGFRキナーゼ活性を阻害すること、EGFRvVIの上流もしくは下流であるシグナル経路を調節すること、またはEGFRvVIのプロテアソーム分解を増加させることを含め得る。EGFRvVIの活性を阻害する化合物は、増殖性疾患、例えばがんの治療において有用であり得る。

0083

いくつかの態様では、がん等の増殖性疾患の治療のために、EGFRvVIを調節または阻害するのは、好都合であり得る。本発明は、EGFRvVIを直接的または間接的に標的にする治療を包含する。EGFRvVIの機能を阻害するのに有用な治療の例は、siRNAs等のRNA干渉(RNAi)化合物、及びEGFRvVIをコードする標的核酸と特異的にハイブリダイズする他のアンチセンス化合物を含める。有用であり得る他の治療は、特異的にEGFRvVIを結合し、及び/またはEGFRvVIの活性を阻害する抗体を含める。いくつかの態様では、抗体は、細胞毒性物質(例えば毒素、薬物または放射性部分) と結合され得る。

0084

いくつかの態様では、本発明は、EGFRvVIの存在または不存在を分析することを含んで成る、EGFRvVIを検出し、特定の治療計画に対する対象の応答性を決定または評価するための方法を特徴とし、ここでの存在または不存在は、対象の治療計画への応答性に相関する。検出方法は、本明細書に開示されるようなEGFRvVI DNA、RNAまたはタンパク質を検出するために使用され得る。好適には、検出の方法は、核酸増幅、例えば定量的リアルタイムPCRによる。

0085

EGFRは、がんまたは増殖性疾患のための分子治療の代表的な標的であった。EGFRに特異的な治療は、一般にEGFRキナーゼ活性の阻害剤、及びEGFRのリガンド仲介活性化の阻害剤を含める。EGFRを標的にする治療の例は、細胞外N末端リガンド結合ドメインを遮断する抗体阻害剤を含める。リガンド結合ドメインの遮断は、EGFRの不十分な活性化及び下流のシグナル伝達を阻む。EGFRのリガンド結合ドメインを遮断する化学物質の例は、セツキシマブ(ERBITUX商標)、パニツムマブ(VECTIBIX 商標)、ザルツムマブ、ニモツズマブ(BioMab EGFR)、及びマツズマブ(EMD7200)を含める、他のEGFR特異的阻害剤は、ATP結合ポケットを可逆的または不可逆的に結合させることにより、EGFRチロシンキナーゼ活性を阻害する小分子を含める。これらの小分子は、細胞質タンパク質及びタンパク質のC末端上にあるキナーゼドメインを標的にする。かかる阻害剤は、例えばゲフィチニブ(IRESSA商標)、エルロチニブ(TARCEVA商標)及びラパチニブ(TYKERB商標)を含める。他のEGFR阻害剤は、リンドペピムト(Rindopepimut)(CDX−110, Celldex Therapeutics)等のEGFR欠失を標的にする、がんワクチンを含める。EGFR及び下流のシグナル伝達を間接的に阻害する、特に有用であり得る他の阻害剤は、PARP1阻害剤、例えば、5−AIQ塩酸塩、ABT−888、ミノサイクリンPARP阻害剤IX(EB−47)、PARP阻害剤XI(DR2313)、TIQ−A(Santa Cruz Biotechnologyから入手可能)である。

0086

しかしながら、特定の治療剤により標的にされるEGFRの部分の欠失を示す腫瘍特異的なEGFR変異体に部分的に寄与し得る、これらのEGFR阻害剤による治療に、全ての患者が反応するわけではない。例えば、EGFRvVIは、N末端リガンド結合ドメインの重要な部分を欠く。EGFRvVIの存在は、リガンド結合ドメインを標的にする分子を含んで成る治療計画が、がんの治療には効果がないであろうことを示し得る。EGFRvVIの存在は、対象が、リガンド結合ドメインを標的にする分子を含んで成る治療計画には応答性ではないだろうということを示し得る。したがって、EGFRvVIの存在の検出は、EGFR阻害剤を含んで成る治療計画を排除することを当業者に指示し得る。

0087

実施例1:新規のEGFR変異体の同定
本実施例では、患者(患者ID UCS−0001)からグリオーマ脳脊髄液(CSF)試料を得た。生検では、EGFRvIII陽性であった。微小胞は、4mLのCSF試料から抽出した。核酸、例えばRNAは、当業界において公知の方法により抽出した。

0088

EGFRPCRに基づく検出アッセイを行った。EGFRvIII特異的アッセイにおいて、以下のプライマー及びプローブ:
EGFR Forw 1− CTGCTGGCTGCGCTCTG(配列番号:6)
EGFRv3 rev4 -CGTGATCTGTCACCACATAATTACC(配列番号:7)
EGFRプローブ6 -TTCCTCCAGAGCCCGACT(FAM−染料で標識されたMinor Grove Binder (MGB)プローブ)(配列番号:8)を使用した。

0089

番目のEGFRPCRに基づく検出アッセイでは、以下のプライマー及びプローブ:
EGFR Forw 1− CTGCTGGCTGCGCTCTG(配列番号:6)
EGFR Rev 1−TTCCTCCATCTCATAGCTGTCG(配列番号:9)
EGFRプローブ6− TTCCTCCAGAGCCCGACT (FAM−染料で標識されたMinor Grove Binder (MGB)プローブ)(配列番号:8)を使用した。

0090

EGFRvIII特異的アッセイ(EGFR Forw 1、EGFRv3rev4、EGFRプローブ6)は、CSF試料から増幅産物を生み出さなかった。しかしながら2番目のEGFRアッセイ(EGFR Forw 1、EGFR Rev 1及びEGFR プローブ6)は、増幅産物を生み出した。

0091

2番目のEGFRアッセイからの本増幅産物を、定性的PCR増幅によりさらに調査した。以下のPCR設定:
EGFR Forw 1 (18μM) 1μL
EGFR Rev 1 (18μM) 1μL
dNTPs (10mM) 1μL
HF酵素緩衝剤(5×) 10μL
PhusionホットスタートII DNAポリメラーゼ0.5μL
DMSO 1.5μL
H2O 30μL
cDNA5μL
を使用した。

0092

PCRサイクル条件は、以下の通りであった。
1.98℃、30秒
2.98℃、10秒
3.62℃、15秒
4.72℃、15秒
5.72℃、5分
ステップ2〜4を、36サイクルで繰り返す。

0093

EGFRアッセイから増幅されたPCR産物を分析したら、EGFRvIIIよりも大きなバンドを示した。生物分析器の結果は、図3に示されるような電気泳動図中に作り出された。増幅されたPCR産物を、TOPOベクター中にクローン化し、そして配列化させた。エクソン1、2、エクソン3の一部、エクソン7の一部及びエクソン8のヌクレオチド配列を図4に示す。

0094

増幅されたPCR産物のシークエンシングでは、エクソン7中の中間につながるエクソン3中の3分の1の途切れを同定した。EGFRvIIIは欠失であり、ここでエクソン2〜7の全体は欠失し、ここでDNAの途切れは、イントロン領域中のいずれにおいてもあり得る。対照的に新しく同定されたEGFR変異体は、エクソン内部に生じるDNAの途切れにより特徴付けられるので、DNAへの定義された連結を有する。EGFRvVIは、10730bp長の欠失を含み、且つコード及び非コード領域を含める。EGFRvVIヌクレオチド配列は、図5において示すように、WT EGFRのアミノ酸90〜221を欠くポリペプチドをコードする。

0095

EGFRForw1(配列番号:6)及びEGFR Rev1(配列番号:9)に加えて、EGFRvVIの増幅のために使用され得るプライマーの更なる例は、以下のようなもの:
EGFR qPCRエクソン3〜7 del forw 1: TGGTCCTTGGGAATTTGGAA(配列番号:10)
EGFR qPCR エクソン3〜7 del rev: GTGGGGTTGTAGAGCATGAGGA(配列番号:11)
EGFR qPCR エクソン3〜7 delプローブ(FAMMGB): TACCTATGTGCAGAGGAA(配列番号:12)である。

実施例

0096

本発明は、特定の態様に関連して開示されているが、添付の明細書及び特許請求の範囲に発表されるような本発明の全範囲から逸脱せずに、発表される態様に多くの修飾、修正、及び変更を施すことは、可能である。

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