図面 (/)

この項目の情報は公開日時点(2016年3月10日)のものです。
また、この項目は機械的に抽出しているため、正しく解析できていない場合があります

図面 (12)

課題・解決手段

本明細書で提供されるのは、免疫細胞、例えば、Tリンパ球標的抗原へと方向づけることができ、かつ該抗原ポリペプチドと結合するときに、T細胞を増殖させ、又は該抗原を提示する細胞を殺すことができる、例えば、キメラ抗原受容体などの治療用ポリペプチドである。ここで、前記ポリペプチドはCTLA4又はPD-1のようなT細胞共抑制性タンパク質由来する膜貫通ドメインを含む。また、本明細書で提供されるのは、該ポリペプチドを発現するTリンパ球、及びそのようなTリンパ球の、癌等の疾病治療するための使用である。

概要

背景

(2.背景
Tリンパ球(T細胞とも呼ばれる)のような免疫系の細胞は、抗原の認識又はそれらとの相互作用の際に、細胞の活性化を引き起こす受容体又は受容体複合体を介して、特定の抗原を認識し、かつ相互作用する。そのような受容体の一例は、8つのタンパク質複合体である抗原特異的Tリンパ球受容体複合体(TCR/CD3)である。T細胞受容体(TCR)はTリンパ球の表面に発現する。一構成要素であるCD3は不変的構造を有し、リガンドによりTCRが占有された後に続く細胞内シグナルにおいて役割を果たす。抗原-CD3複合体(TCR/CD3)に対するTリンパ球受容体は、主要組織適合複合体MHC)タンパク質によりこの受容体に対し提示される抗原ペプチドを認識する。MHCとペプチドの複合体は抗原提示細胞及び他のTリンパ球標的の表面に発現する。TCR/CD3複合体の刺激は、Tリンパ球の活性化及びその結果起こる抗原特異的な免疫応答帰結する。TCR/CD3複合体はエフェクター機能及び免疫系の調節に中心的な役割を果たす。

Tリンパ球は最大限活性化するために第2の共刺激性シグナルを必要とする。そのようなシグナルなしでは、Tリンパ球はTCRへの抗原の結合に対し応答しないか、又はアネルギーに陥る。そのような共刺激性シグナルは、例えば、抗原産生細胞上のCD80及びCD86と相互作用するTリンパ球タンパク質であるCD28により提供される。もう一つのTリンパ球タンパク質であるICOS(誘導性共刺激性分子)は、ICOSリガンドと結合したときに共刺激性シグナルを提供する。CTLA4(細胞毒性T-リンパ球抗原4)は、CD152としても知られ、ヘルパーT細胞及びCD4+ T細胞の表面に発現する受容体であり、T細胞の活動を下方調節する。CTLA4がその認識リガンドであるCD80及びCD86と結合すると、T細胞の活性化及び増殖が減少する。PD-1(プログラム細胞死-1)はCD279としても知られ、現在では、T細胞受容体(TCR)シグナルを負に調節し、広く免疫応答を負に調節すると理解されている。

TCR複合体の不可欠な抗原結合、シグナル、及び刺激機能は、一般にキメラ抗原受容体(CAR)と呼ばれる単一ポリペプチド鎖への遺伝子組み換え法により減少してきた。例えば、Eshharの米国特許番号第7,741,465号;Eshharの米国特許出願公開番号第2012/0093842号を参照されたい。そのようなCARを備えるTリンパ球は、一般にCAR-Tリンパ球と呼ばれる。CARは特異的に構築され、CARが結合する特異的抗原に応答してT細胞の活性化及び増殖を刺激する。

概要

本明細書で提供されるのは、免疫細胞、例えば、Tリンパ球を標的抗原へと方向づけることができ、かつ該抗原がポリペプチドと結合するときに、T細胞を増殖させ、又は該抗原を提示する細胞を殺すことができる、例えば、キメラ抗原受容体などの治療用ポリペプチドである。ここで、前記ポリペプチドはCTLA4又はPD-1のようなT細胞共抑制性タンパク質に由来する膜貫通ドメインを含む。また、本明細書で提供されるのは、該ポリペプチドを発現するTリンパ球、及びそのようなTリンパ球の、癌等の疾病治療するための使用である。1

目的

もう一つのTリンパ球タンパク質であるICOS(誘導性共刺激性分子)は、ICOSリガンドと結合したときに共刺激性シグナルを提供する

効果

実績

技術文献被引用数
2件
牽制数
0件

この技術が所属する分野

(分野番号表示ON)※整理標準化データをもとに当社作成

ライセンス契約や譲渡などの可能性がある特許掲載中! 開放特許随時追加・更新中 詳しくはこちら

請求項1

(i) CTLA4又はPD-1由来膜貫通ドメイン、(ii)リンパ球活性化及び/又は増殖を引き起こす、該リンパ球の表面に発現する内在性タンパク質細胞ドメイン、及び(iii)抗原に結合する細胞外ドメインを含むポリペプチドであって:該膜貫通ドメインがCTLA4由来である場合は、該ポリペプチドの該細胞内ドメイン及び細胞外ドメインがCTLA4由来ではなく;かつ該膜貫通ドメインがPD-1由来である場合は、該ポリペプチドの該細胞内ドメイン及び細胞外ドメインがPD-1由来ではない、前記ポリぺプチド

請求項2

キメラ抗原受容体(CAR)である、請求項1記載のポリペプチド。

請求項3

前記ポリペプチドが前記抗原と結合する時に、該ポリペプチドを発現するTリンパ球が、活性化又は刺激され、増殖する、請求項1又は2記載のポリペプチド。

請求項4

Tリンパ球表面に発現された時に、Tリンパ球に前記抗原を発現する細胞を殺すよう方向づける、請求項1〜3のいずれか1項記載のポリペプチド。

請求項5

前記CTLA4の膜貫通ドメインがヒトCTLA4遺伝子のエキソン3にコードされるポリペプチド配列である、請求項1〜4のいずれか一項記載のポリペプチド。

請求項6

前記CTLA4の膜貫通ドメインが配列番号:1のアミノ酸配列であるか、又はそれを含む、請求項1〜4のいずれか一項記載のポリペプチド。

請求項7

前記CTLA4の膜貫通ドメインが配列番号:2のアミノ酸配列であるか、又はそれを含む、請求項1〜4のいずれか一項記載のポリペプチド。

請求項8

前記CTLA4の膜貫通ドメインが配列番号:3のアミノ酸配列であるか、又はそれを含む、請求項1〜4のいずれか一項記載のポリペプチド。

請求項9

前記CTLA4の膜貫通ドメインが配列番号:4のアミノ酸配列であるか、又はそれを含む、請求項1〜4のいずれか一項記載のポリペプチド。

請求項10

前記CTLA4の膜貫通ドメインが配列番号:5のアミノ酸配列であるか、又はそれを含む、請求項1〜4のいずれか一項記載のポリペプチド。

請求項11

前記PD-1の膜貫通ドメインが配列番号:6のポリペプチド配列であるか、又はそれを含む、請求項1〜4のいずれか一項記載のポリペプチド。

請求項12

前記PD-1の膜貫通ドメインが配列番号:7のポリペプチド配列であるか、又はそれを含む、請求項1〜4のいずれか一項記載のポリペプチド。

請求項13

前記PD-1の膜貫通ドメインが配列番号:8のポリペプチド配列であるか、又はそれを含む、請求項1〜4のいずれか一項記載のポリペプチド。

請求項14

前記細胞外ドメインが、前記抗原と結合する受容体又は受容体の一部を含む、請求項1〜13のいずれか一項記載のポリペプチド。

請求項15

前記細胞外ドメインが、前記抗原と結合する受容体又は受容体の一部である、請求項1〜13のいずれか一項記載のポリペプチド。

請求項16

前記細胞外ドメインが、抗体又はその抗原結合部位を含む、請求項1〜13のいずれか一項記載のポリペプチド。

請求項17

前記細胞外ドメインが、抗体又はその抗原結合部位である、請求項1〜13のいずれか一項記載のポリペプチド。

請求項18

前記細胞外ドメインが単鎖Fvドメインを含む、請求項1〜13のいずれか一項記載のポリペプチド。

請求項19

前記単鎖Fvドメインが可動リンカーによりVHに連結されるVLを含み、かつ該VL及びVHが前記抗原と結合する抗体由来である、請求項18記載のポリペプチド。

請求項20

前記抗原が腫瘍細胞上の抗原である、請求項1〜19のいずれか一項記載のポリペプチド。

請求項21

前記腫瘍細胞が固形腫瘍中の細胞である、請求項20記載のポリペプチド。

請求項22

前記腫瘍細胞が血液癌の細胞である、請求項20記載のポリペプチド。

請求項23

前記抗原が腫瘍関連抗原又は腫瘍特異的抗原である、請求項1〜22のいずれか一項記載のポリペプチド。

請求項24

前記腫瘍関連抗原又は腫瘍特異的抗原が、Her2、前立腺幹細胞抗原(PSCA)、アルファ-フェトプロテインAFP)、癌胎児性抗原CEA)、癌抗原-125(CA-125)、CA19-9、カルレチニン、MUC-1、上皮性膜タンパク質EMA)、上皮性腫瘍抗原(ETA)、チロシナーゼメラノーマ関連抗原(MAGE)、CD34、CD45、CD99、CD117、クロモグラニンサイトケラチンデスミングリア線維酸性タンパク質(GFAP)、肉眼的嚢胞性疾患液体タンパク質(GCDFP-15)、HMB-45抗原、タンパク質メラン-A(Tリンパ球に認識されるメラノーマ抗原;MART-1)、myo-D1、筋特異的アクチン(MSA)、ニューロフィラメント、神経特異的エノラーゼ(NSE)、胎盤アルカリホスファターゼシナプトファイシス、チログロブリン甲状腺転写因子-1、ピルビン酸キナーゼイソ酵素タイプM2の二量体形(腫瘍M2-PK)、CD19、CD22、CD27、CD30、CD70、GD2(ガングリオシドG2)、EGFRvIII(表皮性成長因子バリアントIII)、精子タンパク質17(Sp17)、メソセリンPAP前立腺酸性ホスファターゼ)、プロステイン、TARP(T細胞受容体ガンマオルターイトリーディングフレームタンパク質)、Trp-p8、STEAP1(プロステイト1の6回膜貫通型上皮性抗原)、異常rasタンパク質、異常p53タンパク質、インテグリンαvβ3(CD61)、ガラクチン、K-Ras(V-Ki-ras2キルテンラット肉腫ウイルス癌遺伝子)、又はRal-Bである、請求項23記載のポリペプチド。

請求項25

前記細胞外ドメインがリンカー、スペーサー、又はヒンジポリペプチド配列により前記膜貫通ドメインに結合されている、請求項1〜24のいずれか一項記載のポリペプチド。

請求項26

前記リンカー、スペーサー、又はヒンジポリペプチド配列がCD28由来である、請求項25記載のポリペプチド。

請求項27

前記リンカー、スペーサー、又はヒンジポリペプチド配列がCTLA4由来である、請求項25記載のポリペプチド。

請求項28

前記リンカー、スペーサー、又はヒンジポリペプチドがPD-1由来である、請求項25記載のポリペプチド。

請求項29

前記細胞内ドメインが、T細胞表面に発現し、かつ前記T細胞の活性化及び/又は増殖を引き起こすタンパク質の細胞内ドメインである、請求項1〜28のいずれか一項記載のポリペプチド。

請求項30

前記細胞内ドメインがCD3ζの細胞内シグナルドメインである、請求項29記載のポリペプチド。

請求項31

前記細胞内ドメインがリンパ球受容体鎖、TCR/CD3複合体タンパク質Fc受容体サブユニット、又はIL-2受容体サブユニットに由来する、請求項29記載のポリペプチド。

請求項32

前記ポリペプチドがさらに1以上の共刺激性ドメインを含む、請求項1〜31のいずれか一項記載のポリペプチド。

請求項33

前記1以上の共刺激性ドメインが、1以上の共刺激性CD27ポリペプチド配列、共刺激性CD28ポリペプチド配列、共刺激性OX40(CD134)ポリペプチド配列、共刺激性4-1BB(CD137)ポリペプチド配列、又は共刺激性誘導性T細胞共刺激性(ICOS)ポリペプチド配列を含む、請求項32記載のポリペプチド。

請求項34

N末端からC末端に向けて、順に:(i)抗原結合ドメイン;(ii) CD28又はCTLA4のヒンジポリペプチド配列;(iii) CTLA4又はPD-1の膜貫通ドメイン;(iv)共刺激性ドメイン;及び(v)細胞内シグナルドメインを含む、請求項1〜33のいずれか一項記載のポリペプチド。

請求項35

N末端からC末端に向けて、順に:(i)可動性リンカーによりVHに連結されるVLを含む、単鎖Fvドメイン、ここで、該VL及びVHは前記抗原に結合する抗体に由来する;(ii) CD28のヒンジポリペプチド配列;(iii) CTLA4の膜貫通ドメイン;(iv) CD28の共刺激性ドメイン;及び(v) CD3ζの細胞内シグナルドメインを含む、請求項34記載のポリペプチド。

請求項36

N末端からC末端に向けて、順に:(i)可動性リンカーによりVHに連結されるVLを含む、単鎖Fvドメイン、ここで、該VL及びVHは前記抗原に結合する抗体に由来する;(ii) CTLA4のヒンジポリペプチド配列;(iii) CTLA4の膜貫通ドメイン;(iv) CD28の共刺激性ドメイン;及び(v) CD3ζの細胞内シグナルドメインを含む、請求項34記載のポリペプチド。

請求項37

N末端からC末端に向けて、順に:(i)可動性リンカーによりVHに連結されるVLを含む、単鎖Fvドメイン、ここで、該VL及びVHは前記抗原に結合する抗体に由来する;(ii) CD28のヒンジポリペプチド配列;(iii) PD-1の膜貫通ドメイン;(iv) CD28の共刺激性ドメイン;及び(v) CD3ζの細胞内シグナルドメインを含む、請求項34記載のポリペプチド。

請求項38

N末端からC末端に向けて、順に:(i)可動性リンカーによりVHに連結されるVLを含む、単鎖Fvドメイン、ここで、該VL及びVHは前記抗原に結合する抗体に由来する;(ii) CTLA4のヒンジポリペプチド配列;(iii) PD-1の膜貫通ドメイン;(iv) CD28の共刺激性ドメイン;及び(v) CD3ζの細胞内シグナルドメインを含む、請求項34記載のポリペプチド。

請求項39

N末端からC末端に向けて、順に:(i)可動性リンカーによりVHに連結されるVLを含む、単鎖Fvドメイン、ここで、該VL及びVHは前記抗原に結合する抗体に由来する;(ii)PD-1のヒンジポリペプチド配列;(iii) CTLA4の膜貫通ドメイン;(iv) CD28の共刺激性ドメイン;及び(v) CD3ζの細胞内シグナルドメインを含む、請求項34記載のポリペプチド。

請求項40

N末端からC末端に向けて、順に:(i)可動性リンカーによりVHに連結されるVLを含む、単鎖Fvドメイン、ここで、該VL及びVHは前記抗原に結合する抗体に由来する;(ii)PD-1のヒンジポリペプチド配列;(iii) PD-1の膜貫通ドメイン;(iv) CD28の共刺激性ドメイン;及び(v) CD3ζの細胞内シグナルドメインを含む、請求項34記載のポリペプチド。

請求項41

膜結合ポリペプチドを含むTリンパ球であって、前記ポリペプチドが、(i) CTLA4又はPD-1(プログラム細胞死1)由来の膜貫通ドメイン、(ii) 前記リンパ球の活性化及び/又は増殖を引き起こす、リンパ球の表面に発現する内在性タンパク質の細胞内ドメイン、及び(iii)抗原に結合する細胞外ドメインを含み、かつ該膜貫通ドメインがCTLA4由来である場合は、該ポリペプチドの該細胞内ドメイン及び細胞外ドメインがCTLA4由来ではなく;かつ該膜貫通ドメインがPD-1由来である場合は、該ポリペプチドの該細胞内ドメイン及び細胞外ドメインがPD-1由来ではない、前記Tリンパ球。

請求項42

前記ポリペプチドがキメラ抗原受容体(CAR)である、請求項41記載のTリンパ球。

請求項43

該ポリペプチドが前記抗原と結合する時に、前記ポリペプチドを発現するTリンパ球が、活性化又は刺激されて増殖する、請求項41又は請求項42記載のTリンパ球。

請求項44

前記ポリペプチドが、前記Tリンパ球表面に発現された時に、該Tリンパ球に前記抗原を発現する細胞を殺すよう方向づける、請求項41〜43のいずれか一項記載のTリンパ球。

請求項45

前記CTLA4の膜貫通ドメインがヒトCTLA4遺伝子のエキソン3にコードされるポリペプチド配列である、請求項41〜44のいずれか一項記載のTリンパ球。

請求項46

前記CTLA4の膜貫通ドメインが配列番号:1のアミノ酸配列であるか、又はそれを含む、請求項41〜44のいずれか一項記載のTリンパ球。

請求項47

前記CTLA4の膜貫通ドメインが配列番号:2のアミノ酸配列であるか、又はそれを含む、請求項41〜44のいずれか一項記載のTリンパ球。

請求項48

前記CTLA4の膜貫通ドメインが配列番号:3のアミノ酸配列であるか、又はそれを含む、請求項41〜44のいずれか一項記載のTリンパ球。

請求項49

前記CTLA4の膜貫通ドメインが配列番号:4のアミノ酸配列であるか、又はそれを含む、請求項41〜44のいずれか一項記載のTリンパ球。

請求項50

前記CTLA4の膜貫通ドメインが配列番号:1のアミノ酸配列であるか、又はそれを含む、請求項41〜44のいずれか一項記載のTリンパ球。

請求項51

前記PD-1の膜貫通ドメインが配列番号:6のポリペプチド配列であるか、又はそれを含む、請求項41〜44のいずれか一項記載のTリンパ球。

請求項52

前記PD-1の膜貫通ドメインが配列番号:7のポリペプチド配列であるか、又はそれを含む、請求項41〜44のいずれか一項記載のTリンパ球。

請求項53

前記PD-1の膜貫通ドメインが配列番号:8のポリペプチド配列であるか、又はそれを含む、請求項41〜44のいずれか一項記載のTリンパ球。

請求項54

前記細胞外ドメインが、前記抗原と結合する受容体又は受容体の一部を含む、請求項41〜53のいずれか一項記載のTリンパ球。

請求項55

前記細胞外ドメインが、前記抗原と結合する受容体又は受容体の一部である、請求項41〜53のいずれか一項記載のTリンパ球。

請求項56

前記細胞外ドメインが、抗体又はその抗原結合部位を含む、請求項41〜53のいずれか一項記載のTリンパ球。

請求項57

前記細胞外ドメインが、抗体又はその抗原結合部位である、請求項41〜53のいずれか一項記載のTリンパ球。

請求項58

前記細胞外ドメインが単鎖Fvドメインを含む、請求項41〜53のいずれか一項記載のTリンパ球。

請求項59

前記単鎖Fvドメインが可動リンカーによりVHに連結されるVLを含み、前記VL及びVHが前記抗原と結合する抗体由来である、請求項58記載のTリンパ球。

請求項60

前記抗原が腫瘍細胞上の抗原である、請求項41〜59のいずれか一項記載のTリンパ球。

請求項61

前記腫瘍細胞が固形腫瘍中の細胞である、請求項60記載のTリンパ球。

請求項62

前記腫瘍細胞が血液癌の細胞である、請求項60記載のTリンパ球。

請求項63

前記抗原が腫瘍関連抗原又は腫瘍特異的抗原である、請求項41〜62のいずれか一項記載のTリンパ球。

請求項64

前記腫瘍関連抗原又は腫瘍特異的抗原が、Her2、前立腺幹細胞抗原(PSCA)、アルファ-フェトプロテイン(AFP)、癌胎児性抗原(CEA)、癌抗原-125(CA-125)、CA19-9、カルレチニン、MUC-1、上皮性膜タンパク質(EMA)、上皮性腫瘍抗原(ETA)、チロシナーゼ、メラノーマ関連抗原(MAGE)、CD34、CD45、CD99、CD117、クロモグラニン、サイトケラチン、デスミン、グリア線維酸性タンパク質(GFAP)、肉眼的嚢胞性疾患液体タンパク質(GCDFP-15)、HMB-45抗原、タンパク質メラン-A(Tリンパ球に認識されるメラノーマ抗原;MART-1)、myo-D1、筋特異的アクチン(MSA)、ニューロフィラメント、神経特異的エノラーゼ(NSE)、胎盤アルカリホスファターゼ、シナプトファイシス、チログロブリン、甲状腺転写因子-1、ピルビン酸キナーゼイソ酵素タイプM2の二量体形(腫瘍M2-PK)、異常rasタンパク質、異常p53タンパク質、CD19、CD22、CD27、CD30、CD70、GD2(ガングリオシドG2)、EGFRvIII(表皮性成長因子バリアントIII)、精子タンパク質17(Sp17)、メソセリン、PAP(前立腺酸性ホスファターゼ)、プロステイン、TARP(T細胞受容体ガンマオルターネイトリーディングフレームタンパク質)、Trp-p8、STEAP1(プロステイト1の6回膜貫通型上皮性抗原)、異常rasタンパク質、異常p53タンパク質、インテグリンαvβ3(CD61)、ガラクチン、K-Ras(V-Ki-ras2キルステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子)、又はRal-Bである、請求項63記載のTリンパ球。

請求項65

前記細胞外ドメインがリンカー、スペーサー、又はヒンジポリペプチド配列により前記膜貫通ドメインに結合された、請求項41〜64のいずれか一項記載のTリンパ球。

請求項66

前記リンカー、スペーサー、又はヒンジポリペプチド配列がCD28由来である、請求項65記載のTリンパ球。

請求項67

前記リンカー、スペーサー、又はヒンジポリペプチド配列がCTLA4由来である、請求項65記載のTリンパ球。

請求項68

前記リンカー、スペーサー、又はヒンジポリペプチド配列がPD-1由来である、請求項65記載のTリンパ球。

請求項69

前記細胞内ドメインがT細胞表面に発現し、かつ前記T細胞の活性化及び/又は増殖を引き起こすタンパク質の細胞内ドメインである、請求項41〜68のいずれか一項記載のTリンパ球。

請求項70

前記細胞内ドメインがCD3ζの細胞内シグナルドメインである、請求項69記載のTリンパ球。

請求項71

前記細胞内ドメインがリンパ球受容体鎖、TCR/CD3複合体タンパク質、Fc受容体サブユニット、又はIL-2受容体サブユニットに由来する、請求項69記載のTリンパ球。

請求項72

前記ポリペプチドがさらに1以上の共刺激性ドメインを含む、請求項41〜71のいずれか一項記載のTリンパ球。

請求項73

前記1以上の共刺激性ドメインが、1以上の共刺激性CD27ポリペプチド配列、共刺激性CD28ポリペプチド配列、共刺激性OX40(CD134)ポリペプチド配列、共刺激性4-1BB(CD137)ポリペプチド配列、又は共刺激性誘導性T細胞共刺激性(ICOS)ポリペプチド配列を含む、請求項72記載のTリンパ球。

請求項74

前記ポリペプチドがN末端からC末端に向けて、順に:(i)抗原結合ドメイン;(ii) CD28又はCTLA4のヒンジポリペプチド配列;(iii) CTLA4又はPD-1の膜貫通ドメイン;(iv)共刺激性ドメイン;及び(v)細胞内シグナルドメインを含む、請求項41〜73のいずれか一項記載のTリンパ球。

請求項75

前記ポリペプチドがN末端からC末端に向けて、順に:(i)可動性リンカーによりVHに連結されるVLを含む、単鎖Fvドメイン、ここで、前記VL及びVHは前記抗原に結合する抗体に由来する;(ii) CD28のヒンジポリペプチド配列;(iii) CTLA4の膜貫通ドメイン;(iv) CD28の共刺激性ドメイン;及び(v) CD3ζの細胞内シグナルドメインを含む、請求項74記載のTリンパ球。

請求項76

前記ポリペプチドがN末端からC末端に向けて、順に:(i)可動性リンカーによりVHに連結されるVLを含む、単鎖Fvドメイン、ここで、前記VL及びVHは前記抗原に結合する抗体に由来する;(ii) CTLA4のヒンジポリペプチド配列;(iii) CTLA4の膜貫通ドメイン;(iv) CD28の共刺激性ドメイン;及び(v) CD3ζの細胞内シグナルドメインを含む、請求項74記載のTリンパ球。

請求項77

前記ポリペプチドがN末端からC末端に向けて、順に:(i)可動性リンカーによりVHに連結されるVLを含む、単鎖Fvドメイン、ここで、前記VL及びVHは前記抗原に結合する抗体に由来する;(ii) CD28のヒンジポリペプチド配列;(iii) PD-1の膜貫通ドメイン;(iv) CD28の共刺激性ドメイン;及び(v) CD3ζの細胞内シグナルドメインを含む、請求項74記載のTリンパ球。

請求項78

前記ポリペプチドがN末端からC末端に向けて、順に:(i)可動性リンカーによりVHに連結されるVLを含む、単鎖Fvドメイン、ここで、前記VL及びVHは前記抗原に結合する抗体に由来する;(ii) CTLA4のヒンジポリペプチド配列;(iii) PD-1の膜貫通ドメイン;(iv) CD28の共刺激性ドメイン;及び(v) CD3ζの細胞内シグナルドメインを含む、請求項74記載のTリンパ球。

請求項79

前記ポリペプチドがN末端からC末端に向けて、順に:(i)可動性リンカーによりVHに連結されるVLを含む、単鎖Fvドメイン、ここで、前記VL及びVHは前記抗原に結合する抗体に由来する;(ii)PD-1のヒンジポリペプチド配列;(iii) CTLA4の膜貫通ドメイン;(iv) CD28の共刺激性ドメイン;及び(v) CD3ζの細胞内シグナルドメインを含む、請求項74記載のTリンパ球。

請求項80

前記ポリペプチドがN末端からC末端に向けて、順に:(i)可動性リンカーによりVHに連結されるVLを含む、単鎖Fvドメイン、ここで、前記VL及びVHは前記抗原に結合する抗体に由来する;(ii)PD-1のヒンジポリペプチド配列;(iii) PD-1の膜貫通ドメイン;(iv) CD28の共刺激性ドメイン;及び(v) CD3ζの細胞内シグナルドメインを含む、請求項74記載のTリンパ球。

技術分野

0001

本願は2012年12月20日に提出された米国仮特許出願番号第61/740,113号、及び2013年3月13日に提出された米国仮特許出願番号第61/779,925号に基づく優先権を主張する。これらのそれぞれはその全体が引用により本明細書に組み込まれている。

0002

(1.分野)
本明細書における開示は、免疫学分野、さらに具体的には、Tリンパ球又は他の免疫細胞改変に関する。

背景技術

0003

(2.背景
Tリンパ球(T細胞とも呼ばれる)のような免疫系の細胞は、抗原の認識又はそれらとの相互作用の際に、細胞の活性化を引き起こす受容体又は受容体複合体を介して、特定の抗原を認識し、かつ相互作用する。そのような受容体の一例は、8つのタンパク質複合体である抗原特異的Tリンパ球受容体複合体(TCR/CD3)である。T細胞受容体(TCR)はTリンパ球の表面に発現する。一構成要素であるCD3は不変的構造を有し、リガンドによりTCRが占有された後に続く細胞内シグナルにおいて役割を果たす。抗原-CD3複合体(TCR/CD3)に対するTリンパ球受容体は、主要組織適合複合体MHC)タンパク質によりこの受容体に対し提示される抗原ペプチドを認識する。MHCとペプチドの複合体は抗原提示細胞及び他のTリンパ球標的の表面に発現する。TCR/CD3複合体の刺激は、Tリンパ球の活性化及びその結果起こる抗原特異的な免疫応答帰結する。TCR/CD3複合体はエフェクター機能及び免疫系の調節に中心的な役割を果たす。

0004

Tリンパ球は最大限活性化するために第2の共刺激性シグナルを必要とする。そのようなシグナルなしでは、Tリンパ球はTCRへの抗原の結合に対し応答しないか、又はアネルギーに陥る。そのような共刺激性シグナルは、例えば、抗原産生細胞上のCD80及びCD86と相互作用するTリンパ球タンパク質であるCD28により提供される。もう一つのTリンパ球タンパク質であるICOS(誘導性共刺激性分子)は、ICOSリガンドと結合したときに共刺激性シグナルを提供する。CTLA4(細胞毒性T-リンパ球抗原4)は、CD152としても知られ、ヘルパーT細胞及びCD4+ T細胞の表面に発現する受容体であり、T細胞の活動を下方調節する。CTLA4がその認識リガンドであるCD80及びCD86と結合すると、T細胞の活性化及び増殖が減少する。PD-1(プログラム細胞死-1)はCD279としても知られ、現在では、T細胞受容体(TCR)シグナルを負に調節し、広く免疫応答を負に調節すると理解されている。

0005

TCR複合体の不可欠な抗原結合、シグナル、及び刺激機能は、一般にキメラ抗原受容体(CAR)と呼ばれる単一ポリペプチド鎖への遺伝子組み換え法により減少してきた。例えば、Eshharの米国特許番号第7,741,465号;Eshharの米国特許出願公開番号第2012/0093842号を参照されたい。そのようなCARを備えるTリンパ球は、一般にCAR-Tリンパ球と呼ばれる。CARは特異的に構築され、CARが結合する特異的抗原に応答してT細胞の活性化及び増殖を刺激する。

0006

(3.概要
一態様では、本明細書で提供されるのは、免疫系細胞、例えばTリンパ球(T細胞)によって発現することができ、そのような免疫系細胞において膜結合型であり、かつ通常そのような免疫系細胞に抑制シグナルを伝達する免疫系タンパク質由来膜貫通ドメイン、例えばCTLA4(細胞毒性T-リンパ球抗原4又は細胞毒性T-リンパ球関連タンパク質4)又はPD-1(プログラム細胞死-1)由来の膜貫通ドメインを含む、例えばキメラ抗原受容体(例えば、Eshharの米国特許番号第7,741,465号を参照されたい)のようなポリペプチドである。

0007

一実施態様では、本明細書で提供されるのは、(i) CTLA4(例えば、GenBankAccession No. NM_005214.4(CTLA4細胞毒性T-リンパ球関連タンパク質4(Homo sapiens);Gene ID: 1493))又はPD-1(例えば、GenBank Accession No. NM_005018.2(プログラム細胞死1(Homo sapiens); Gene ID: 5133))、又はそれらの一部に由来する膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメイン、(ii)リンパ球の活性化及び/又は増殖を引き起こすリンパ球表面に発現する内在性タンパク質の細胞内ドメイン(例えば、細胞質ドメイン)、及び(iii) 関心のある抗原に結合する細胞外ドメインを含むポリペプチドであり、ここで、該膜貫通ドメインがCTLA4由来である場合は、該ポリペプチドの該細胞内ドメイン及び細胞外ドメインはCTLA4由来ではなく;かつ該膜貫通ドメインがPD-1由来である場合は、該ポリペプチドの該細胞内ドメイン及び細胞外ドメインはPD-1由来ではない。具体的な実施態様では、該ポリペプチドはキメラ抗原受容体(CAR)である。具体的な実施態様では、該ポリペプチドを発現するTリンパ球、又は本明細書に記載されるようないずれかのポリペプチドは、該ポリペプチドが該抗原と結合したときに活性化又は刺激され、増殖する。具体的な実施態様では、該ポリペプチドは、Tリンパ球表面に発現された時に、該Tリンパ球を該抗原を発現する細胞を殺すよう方向づける

0008

具体的な実施態様では、本明細書で提供されるのは、CTLA4由来の膜貫通ドメインを含むポリペプチドであり、ここで、該CTLA4膜貫通ドメインは、ヒトctla4遺伝子のエキソン3にコードされる該ポリペプチド配列である(例えば、GenBankAccession No. NM_005214.4(CTLA4細胞毒性T-リンパ球関連タンパク質4(Homo sapiens);Gene ID: 1493))。

0009

他の具体的な実施態様では、本明細書で提供されるポリペプチドの該CTLA4膜貫通ドメインは、以下のアミノ酸配列であるか、又はこれを含む。

0010

他の具体的な実施態様では、本明細書で提供されるポリペプチドの該CTLA4膜貫通ドメインは、GenBankAccession No. NM_005214.4(CTLA4細胞毒性T-リンパ球関連タンパク質4(Homo sapiens); Gene ID: 1493)のヌクレオチド610〜722にコードされるポリペプチド配列であるか、又はこれを含む。

0011

他の具体的な実施態様では、本明細書で提供されるポリペプチドの該CTLA4膜貫通ドメインは、以下のアミノ酸配列であるか、又はこれを含む。

0012

他の具体的な実施態様では、本明細書で提供されるポリペプチドの該CTLA4膜貫通ドメインは、GenBankAccession No. NM_005214.4(CTLA4細胞毒性T-リンパ球関連タンパク質4(Homo sapiens); Gene ID: 1493)のヌクレオチド636〜699にコードされるポリペプチド配列であるか、又はこれを含む。

0013

他の具体的な実施態様では、本明細書で提供されるポリペプチドの該CTLA4膜貫通ドメインは、以下のアミノ酸配列であるか、又はこれを含む。

0014

他の具体的な実施態様では、本明細書で提供されるポリペプチドの該CTLA4膜貫通ドメインは、以下のポリペプチド配列であるか、又はこれを含む。

0015

他の具体的な実施態様では、本明細書で提供されるポリペプチドの該CTLA4膜貫通ドメインは、以下のポリペプチド配列であるか、又はこれを含む。

0016

他の具体的な実施態様では、本明細書で提供されるポリペプチドの該CTLA4膜貫通ドメインは、以下のポリペプチド配列であるか、又はこれを含む。

0017

他の具体的な実施態様では、本明細書で提供されるポリペプチドの該CTLA4膜貫通ドメインは、以下のポリペプチド配列であるか、又はこれを含む。

0018

他の具体的な実施態様では、本明細書で提供されるポリペプチドの該PD-1膜貫通ドメインは、以下のアミノ酸配列であるか、又はこれを含む。

0019

他の具体的な実施態様では、本明細書で提供されるポリペプチドの該PD-1膜貫通ドメインは、以下のアミノ酸配列であるか、又はこれを含む。

0020

他の具体的な実施態様では、本明細書で提供されるポリペプチドの該PD-1膜貫通ドメインは、以下のアミノ酸配列であるか、又はこれを含む。

0021

他の具体的な実施態様では、本明細書で提供されるポリペプチドの該PD-1膜貫通ドメインは、以下のアミノ酸配列であるか、又はこれを含む。

0022

本明細書に記載されるCTLA-4及びPD-1の膜貫通ドメイン配列(すなわち、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:7、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、及び配列番号:11)に例示されるように、特定の実施態様では、本明細書に記載される膜貫通ドメインは、それらが由来するタンパク質(すなわち、CTLA-4又はPD-1)の細胞外ドメイン由来の1以上のアミノ酸及び/又は細胞内ドメイン由来の1以上のアミノ酸を含む。特定の実施態様では、本明細書に記載される該膜貫通ドメインは、それらが由来するタンパク質(すなわち、CTLA-4又はPD-1)の細胞外ドメイン由来の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、又は25アミノ酸を含む。特定の実施態様では、本明細書に記載される該膜貫通ドメインは、それらが由来するタンパク質(すなわち、CTLA-4又はPD-1)の細胞内ドメイン由来の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、又は25アミノ酸を含む。特定の実施態様では、本明細書に記載される該膜貫通ドメインは、(i) それらが由来するタンパク質(すなわち、CTLA-4又はPD-1)の細胞外ドメイン由来の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、又は25アミノ酸、及び(ii) それらが由来するタンパク質(すなわち、CTLA-4又はPD-1)の細胞内ドメイン由来の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、又は25アミノ酸を含む。

0023

他の具体的な実施態様では、本明細書で提供されるのは膜貫通ドメインを含むポリペプチドであり、ここで、該膜貫通ドメインは配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:7、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、又は配列番号:11に開示される少なくとも10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、又は21の連続したアミノ酸であるか、又はこれらを含む。他の具体的な実施態様では、本明細書で提供されるのは膜貫通ドメインを含むポリペプチドであり、ここで、該膜貫通ドメインは、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:7、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、又は配列番号:11と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、又は少なくとも95%一致する。他の具体的な実施態様では、本明細書で提供されるポリペプチドは、該ポリペプチドの膜貫通ドメインに1、2、3、4、又は5個のアミノ変異、例えば保存されたアミノ酸変異(例えば、異なる疎水性アミノ酸に変異した疎水性アミノ酸)を含む。

0024

特定の実施態様では、本明細書で提供されるのは本明細書に開示されるポリペプチドの1つをコードするヌクレオチド配列である。具体的な実施態様では、本明細書で提供されるのは、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:7、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、又は配列番号:11に開示されるいずれかのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列である。他の具体的な実施態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載されるポリペプチドをコードする核酸であり、該核酸は配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:7、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、又は配列番号:11に開示される少なくとも10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、又は21の連続したアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を含む。他の具体的な実施態様では、本明細書で提供されるのは配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:7、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、又は配列番号:11と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、又は少なくとも95%一致するポリペプチドをコードする核酸配列である。

0025

特定の実施態様では、本明細書に記載されるいずれかのポリペプチドの細胞外ドメインは抗原と結合する受容体又は受容体の一部を含む。該細胞外ドメインは、例えば、該抗原と結合する受容体又は受容体の一部であり得る。特定の実施態様では、該細胞外ドメインは抗体又はその抗原結合部位を含むか、又はそのものである。具体的な実施態様では、該細胞外ドメインは、単鎖Fvドメインを含むか、又はそのものである。単鎖Fvドメインは例えば、可動性リンカーによりVHに連結されるVLを含むことができ、ここで、該VL及びVHは該抗原が結合する抗体に由来する。

0026

該ポリペプチドの該細胞外ドメインが結合する該抗原は、関心のある任意の抗原、例えば、腫瘍細胞上の抗原であり得る。該腫瘍細胞は、例えば固形腫瘍中の細胞、又は非固形腫瘍の細胞、例えば血液癌の細胞であり得る。特定の実施態様では、該抗原は、腫瘍関連抗原又は腫瘍特異的抗原である。具体的な実施態様では、該腫瘍関連抗原又は腫瘍特異的抗原は、限定はされないが、Her2、前立腺幹細胞抗原(PSCA)、アルファ-フェトプロテインAFP)、癌胎児性抗原CEA)、癌抗原-125(CA-125)、CA19-9、カルレチニン、MUC-1、上皮性膜タンパク質EMA)、上皮性腫瘍抗原(ETA)、チロシナーゼメラノーマ関連抗原(MAGE)、CD34、CD45、CD99、CD117、クロモグラニンサイトケラチンデスミングリア線維酸性タンパク質(GFAP)、肉眼的嚢胞性疾患液体タンパク質(gross cystic disease fluid protein)(GCDFP-15)、HMB-45抗原、タンパク質メラン-A(Tリンパ球に認識されるメラノーマ抗原;MART-1)、myo-D1、筋特異的アクチン(MSA)、ニューロフィラメント、神経特異的エノラーゼ(NSE)、胎盤アルカリホスファターゼシナプトファイシス、チログロブリン甲状腺転写因子-1、ピルビン酸キナーゼイソ酵素タイプM2の二量体形(腫瘍M2-PK)、CD19、CD22、CD27、CD30、CD70、GD2(ガングリオシドG2)、EGFRvIII(表皮性成長因子バリアントIII)、精子タンパク質17(Sp17)、メソセリンPAP前立腺酸性ホスファターゼ)、プロステイン、TARP(T細胞受容体ガンマオルターイトリーディングフレームタンパク質)、Trp-p8、STEAP1(プロステイト1の6回膜貫通型上皮性抗原)、異常rasタンパク質、又は異常p53タンパク質である。他の具体的な実施態様では、該腫瘍関連抗原又は腫瘍特異的抗原は、インテグリンαvβ3(CD61)、ガラクチン、K-Ras(V-Ki-ras2キルテンラット肉腫ウイルス癌遺伝子)、又はRal-Bである。

0027

特定の実施態様では、本明細書に記載されるポリペプチドの細胞外ドメインは、リンカースペーサー又はヒンジポリペプチド/ペプチド配列、例えばCH2CH3ヒンジ配列又はCD8、CD28、CTLA4、若しくはPD-1由来の配列により該ポリペプチドの膜貫通ドメインに結合される。

0028

特定の実施態様では、本明細書に記載されるポリペプチドの該細胞内ドメインは、T細胞表面に発現し、該T細胞の活性化及び/又は増殖を引き起こすタンパク質の細胞内ドメインであるか、又はこれを含む。具体的な実施態様では、該細胞内ドメインはCD3ζの細胞内シグナルドメインである。他の具体的な実施態様では、該細胞内ドメインはリンパ球受容体鎖、TCR/CD3複合体タンパク質Fc受容体サブユニット、又はIL-2受容体サブユニットを由来とする。

0029

特定の実施態様では、本明細書で提供されるポリペプチドはさらに、1以上の共刺激性ドメインを、例えば、該ポリペプチドの細胞内ドメインの一部として含む。該1以上の共刺激性ドメインは、限定されることなく、1以上の共刺激性CD27ポリペプチド配列、共刺激性CD28ポリペプチド配列、共刺激性OX40(CD134)ポリペプチド配列、共刺激性4-1BB(CD137)ポリペプチド配列、又は共刺激性誘導性T細胞共刺激性(ICOS)ポリペプチド配列であることができ、又はこれらを含むことができる。

0030

具体的な実施態様では、本明細書で提供されるポリペプチドは、N末端からC末端に向けて、順に:(i)抗原結合ドメイン(例えば、腫瘍細胞上の抗原に結合する抗原結合ドメイン、例えば、上記腫瘍細胞上の抗原);(ii) CD28又はCTLA4ヒンジポリペプチド配列;(iii) CTLA4又はPD-1の膜貫通ドメイン;(iv)共刺激性ドメイン;及び(v)細胞内シグナルドメインを含む。具体的な実施態様では、該ポリペプチドの該抗原結合ドメインはCD19に結合する。

0031

他の具体的な実施態様では、本明細書で提供されるポリペプチドは、N末端からC末端に向けて、順に:(i)抗原結合ドメイン(例えば、腫瘍細胞上の抗原に結合する抗原結合ドメイン、例えば、上記腫瘍細胞上の抗原);(ii) CH2CH3ヒンジポリペプチド配列;(iii) CTLA4又はPD-1膜貫通ドメイン;(iv) CD28共刺激性ドメイン;及び(v) CD3ζ細胞内シグナルドメインを含む。

0032

他の具体的な実施態様では、本明細書で提供されるポリペプチドは、N末端からC末端に向けて、順に:(i)抗原結合ドメイン(例えば、腫瘍細胞上の抗原に結合する抗原結合ドメイン、例えば、上記腫瘍細胞上の抗原);(ii) CD28ヒンジポリペプチド配列;(iii) CTLA4又はPD-1膜貫通ドメイン;(iv) 4-1BB共刺激性ドメイン;及び(v) CD3ζ細胞内シグナルドメインを含む。

0033

他の具体的な実施態様では、本明細書で提供されるポリペプチドは、N末端からC末端に向けて、順に:(i)リンカーによりVHに連結されるVLを含む単鎖Fvドメイン、ここで、該VL及びVHは関心のある抗原(例えば、腫瘍細胞上の抗原、例えば、上記腫瘍細胞上の抗原)と結合する抗体に由来する;(ii) CD28ヒンジポリペプチド配列;(iii) CTLA4膜貫通ドメイン;(iv) CD28共刺激性ドメイン;及び(v) CD3ζ細胞内シグナルドメインを含む。

0034

他の具体的な実施態様では、本明細書で提供されるポリペプチドは、N末端からC末端に向けて、順に:(i)リンカーによりVHに連結されるVLを含む単鎖Fvドメイン、ここで、該VL及びVHは関心のある抗原(例えば、腫瘍細胞上の抗原、例えば、上記腫瘍細胞上の抗原)と結合する抗体に由来する;(ii) CTLA4ヒンジポリペプチド配列;(iii) CTLA4膜貫通ドメイン;(iv) CD28共刺激性ドメイン;及び(v) CD3ζ細胞内シグナルドメインを含む。

0035

他の具体的な実施態様では、本明細書で提供されるポリペプチドは、N末端からC末端に向けて、順に:(i)リンカーによりVHに連結されるVLを含む単鎖Fvドメイン、ここで、該VL及びVHは関心のある抗原(例えば、腫瘍細胞上の抗原、例えば、上記腫瘍細胞上の抗原)と結合する抗体に由来する;(ii) CD28ヒンジポリペプチド配列;(iii) PD-1膜貫通ドメイン;(iv) CD28共刺激性ドメイン;及び(v) CD3ζ細胞内シグナルドメインを含む。

0036

他の具体的な実施態様では、本明細書で提供されるポリペプチドは、N末端からC末端に向けて、順に:(i)リンカーによりVHに連結されるVLを含む単鎖Fvドメイン、ここで、該VL及びVHは関心のある抗原(例えば、腫瘍細胞上の抗原、例えば、上記腫瘍細胞上の抗原)と結合する抗体に由来する;(ii) CTLA4ヒンジポリペプチド配列;(iii) PD-1膜貫通ドメイン;(iv) CD28共刺激性ドメイン;及び(v) CD3ζ細胞内シグナルドメインを含む。

0037

他の具体的な実施態様では、本明細書で提供されるポリペプチドは、N末端からC末端に向けて、順に:(i)抗原結合ドメイン(例えば、腫瘍細胞上の抗原、例えば、上記腫瘍細胞上の抗原に結合する抗原結合ドメイン);(ii) PD-1ヒンジポリペプチド配列;(iii) CTLA4又はPD-1膜貫通ドメイン;(iv)共刺激性ドメイン;及び(v)細胞内シグナルドメインを含む。

0038

他の具体的な実施態様では、本明細書で提供されるポリペプチドは、N末端からC末端に向けて、順に:(i)リンカーによりVHに連結されるVLを含む単鎖Fvドメイン、ここで、該VL及びVHは関心のある抗原(例えば、腫瘍細胞上の抗原、例えば、上記腫瘍細胞上の抗原)と結合する抗体に由来する;(ii) PD-1ヒンジポリペプチド配列;(iii) CTLA4膜貫通ドメイン;(iv) CD28共刺激性ドメイン;及び(v) CD3ζ細胞内シグナルドメインを含む。

0039

他の具体的な実施態様では、本明細書で提供されるポリペプチドは、N末端からC末端に向けて、順に:(i)リンカーによりVHに連結されるVLを含む単鎖Fvドメイン、ここで、該VL及びVHは関心のある抗原(例えば、腫瘍細胞上の抗原、例えば、上記腫瘍細胞上の抗原)と結合する抗体に由来する;(ii) PD-1ヒンジポリペプチド配列;(iii) PD-1膜貫通ドメイン;(iv) CD28共刺激性ドメイン;及び(v) CD3ζ細胞内シグナルドメインを含む。

0040

他の態様では、本明細書で提供されるのは、例えば細胞表面に発現される膜結合ポリペプチドを含むTリンパ球、例えばT細胞であり、ここで、該ポリペプチドは、(i) CTLA4若しくはPD-1、又はそれらの一部に由来する膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメイン、(ii)リンパ球表面に発現され、該リンパ球の活性化及び/又は増殖を引き起こす内在性タンパク質の細胞内ドメイン、及び(iii) 関心のある抗原に結合する細胞外ドメインを含み、ここで、該膜貫通ドメインがCTLA4由来である場合、該ポリペプチドの該細胞内ドメイン及び細胞外ドメイン(任意にCTLA4リンカーを除く)がCTLA4由来ではなく;かつ該膜貫通ドメインがPD-1由来である場合、該ポリペプチドの該細胞内ドメイン及び細胞外ドメインはPD-1由来ではない。具体的な実施態様では、該ポリペプチドはキメラ抗原受容体(CAR)である。

0041

具体的な実施態様では、本明細書で提供されるのはCTLA4由来の膜貫通ドメインを含むポリペプチドを含むTリンパ球であり、ここで、該CTLA4の膜貫通ドメインはヒトCTLA4遺伝子(例えば、GenBankAccession No. NM_005214.4(CTLA4細胞毒性T-リンパ球関連タンパク質4(Homo sapiens);Gene ID: 1493))のエキソン3にコードされるポリペプチド配列である。

0042

他の具体的な実施態様では、本明細書で提供されるのは、CTLA4由来の膜貫通ドメインを含むポリペプチドを含むTリンパ球であり、ここで、該CTLA4膜貫通ドメインは以下のアミノ酸配列であり、又はこれを含む。

0043

他の具体的な実施態様では、本明細書で提供されるのは、CTLA4由来の膜貫通ドメインを含むポリペプチドを含むTリンパ球であり、ここで、該CTLA4膜貫通ドメインは、GenBankAccession No. NM_005214.4(CTLA4細胞毒性T-リンパ球関連タンパク質4(Homo sapiens); Gene ID: 1493)のヌクレオチド610〜722にコードされるポリペプチド配列であるか、又はこれを含む。

0044

他の具体的な実施態様では、本明細書で提供されるのは、CTLA4由来の膜貫通ドメインを含むポリペプチドを含むTリンパ球であり、ここで、該CTLA4膜貫通ドメインは以下のアミノ酸配列であり、又はこれを含む。

0045

他の具体的な実施態様では、本明細書で提供されるのは、CTLA4由来の膜貫通ドメインを含むポリペプチドを含むTリンパ球であり、ここで、該CTLA4膜貫通ドメインは、GenBankAccession No. NM_005214.4(CTLA4細胞毒性T-リンパ球関連タンパク質4(Homo sapiens); Gene ID: 1493)のヌクレオチド636〜699にコードされるポリペプチド配列であるか、又はこれを含む。

0046

他の具体的な実施態様では、本明細書で提供されるのは、CTLA4由来の膜貫通ドメインを含むポリペプチドを含むTリンパ球であり、ここで、該CTLA4膜貫通ドメインは以下のアミノ酸配列であるか、又はこれを含む。

0047

他の具体的な実施態様では、本明細書で提供されるのは、CTLA4由来の膜貫通ドメインを含むポリペプチドを含むTリンパ球であり、ここで、該CTLA4膜貫通ドメインは以下のポリペプチド配列であるか、又はこれを含む。

0048

他の具体的な実施態様では、本明細書で提供されるのは、CTLA4由来の膜貫通ドメインを含むポリペプチドを含むTリンパ球であり、ここで、該CTLA4膜貫通ドメインは以下のポリペプチド配列であるか、又はこれを含む。

0049

他の具体的な実施態様では、本明細書で提供されるのは、CTLA4由来の膜貫通ドメインを含むポリペプチドを含むTリンパ球であり、ここで、該CTLA4膜貫通ドメインは以下のポリペプチド配列であるか、又はこれを含む。

0050

他の具体的な実施態様では、本明細書で提供されるのは、CTLA4由来の膜貫通ドメインを含むポリペプチドを含むTリンパ球であり、ここで、該CTLA4膜貫通ドメインは以下のポリペプチド配列であるか、又はこれを含む。

0051

他の具体的な実施態様では、本明細書で提供されるのは、PD-1由来の膜貫通ドメインを含むポリペプチドを含むTリンパ球であり、ここで、該PD-1膜貫通ドメインは以下のアミノ酸配列であるか、又はこれを含む。

0052

他の具体的な実施態様では、本明細書で提供されるのは、PD-1由来の膜貫通ドメインを含むポリペプチドを含むTリンパ球であり、ここで、該PD-1膜貫通ドメインは以下のアミノ酸配列であるか、又はこれを含む。

0053

他の具体的な実施態様では、本明細書で提供されるのは、PD-1由来の膜貫通ドメインを含むポリペプチドを含むTリンパ球であり、ここで、該PD-1膜貫通ドメインは以下のアミノ酸配列であるか、又はこれを含む。

0054

他の具体的な実施態様では、本明細書で提供されるのは、PD-1由来の膜貫通ドメインを含むポリペプチドを含むTリンパ球であり、ここで、該PD-1膜貫通ドメインは以下のアミノ酸配列であるか、又はこれを含む。

0055

特定の実施態様では、本明細書で提供されるTリンパ球(すなわち、本明細書に記載されるポリペプチドを含むTリンパ球)に発現し、又はコードされるヌクレオチド配列は、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:7、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、又は配列番号:11に開示されるいずれかのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。

0056

他の具体的な実施態様では、本明細書で提供されるのは、膜貫通ドメインを含むポリペプチドを含むTリンパ球であり、ここで、該膜貫通ドメインは、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:7、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、又は配列番号:11に開示される少なくとも10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、又は21の連続したアミノ酸であるか、又はこれを含む。特定の実施態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載されるポリペプチドをコードする核酸を含むTリンパ球であり、ここで、該核酸は配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:7、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、又は配列番号:11に開示される少なくとも10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、又は21の連続したアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を含む。

0057

特定の実施態様では、本明細書で提供されるTリンパ球に発現されるポリペプチドの細胞外ドメインは、関心のある抗原と結合する受容体、又は受容体の一部を含む。該細胞外ドメインは、例えば、該抗原と結合する受容体、又は受容体の一部であり得る。特定の実施態様では、該細胞外ドメインは抗体またはその抗原結合部位を含むか、又はそのものである。具体的な実施態様では、該細胞外ドメインは、単鎖Fvドメインを含むか、又はそのものである。該単鎖Fvドメインは、例えば、可動性リンカーによりVHに連結されるVLを含むことができ、ここで、該VL及びVHは該抗原と結合する抗体に由来する。

0058

本明細書で提供されるTリンパ球に発現されるポリペプチドの細胞外ドメインが結合し、そのためにT細胞が該ポリペプチドによって方向づけられる抗原は、例えば腫瘍細胞上の抗原のような関心のある任意の抗原であり得る。該腫瘍細胞は、例えば、固形腫瘍中の細胞、又は非固形腫瘍の細胞、例えば血液癌の細胞であり得る。特定の実施態様では、該抗原は腫瘍関連抗原又は腫瘍特異的抗原である。特定の実施態様では、該抗原は、1以上のカッパラムダ、CD19、CD22、CD27、CD30、CD70、GD2、HER2、CEA、EGFRvIII、精子タンパク質17、PSCA、メソセリン、PAP(前立腺酸性ホスファターゼ)、プロステイン、TARP(T細胞受容体ガンマオルターネイトリーディングフレームタンパク質)、Trp-p8、STEAP1(プロステイト1の6回膜貫通型上皮性抗原)及び/又はMUC-1である。様々な具体的態様では、限定はされず、腫瘍関連抗原又は腫瘍特異的抗原は、Her2、前立腺幹細胞抗原(PSCA)、アルファ-フェトプロテイン(AFP)、癌胎児性抗原(CEA)、癌抗原-125(CA-125)、CA19-9、カルレチニン、MUC-1、上皮性膜タンパク質(EMA)、上皮性腫瘍抗原(ETA)、チロシナーゼ、メラノーマ関連抗原(MAGE)、CD34、CD45、CD99、CD117、クロモグラニン、サイトケラチン、デスミン、グリア線維酸性タンパク質(GFAP)、肉眼的嚢胞性疾患液体タンパク質(GCDFP-15)、HMB-45抗原、タンパク質メラン-A(Tリンパ球に認識されるメラノーマ抗原;MART-1)、myo-D1、筋特異的アクチン(MSA)、ニューロフィラメント、神経特異的エノラーゼ(NSE)、胎盤アルカリホスファターゼ、シナプトファイシス、チログロブリン、甲状腺転写因子-1、ピルビン酸キナーゼイソ酵素タイプM2の二量体形(腫瘍M2-PK)、異常rasタンパク質、又は異常p53タンパク質である。他の具体的な実施態様では、該腫瘍関連抗原又は腫瘍特異的抗原は、インテグリンαvβ3(CD61)、ガラクチン、K-Ras(V-Ki-ras2キルステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子)、又はRal-Bである。

0059

特定の実施態様では、本明細書に記載されるTリンパ球に発現されるポリペプチドの該細胞外ドメインは、リンカー、スペーサー、又はヒンジポリペプチド配列、例えば、CD8、CD28、CTLA4、又はPD-1に由来する配列により該ポリペプチドの該膜貫通ドメインに結合される。

0060

特定の実施態様では、本明細書に記載されるTリンパ球に発現するポリペプチドの該細胞内ドメインは、通常T細胞表面に発現し、該T細胞の活性化及び/又は増殖を引き起こすタンパク質の細胞内ドメインである、又はこれを含む。具体的な実施態様では、該細胞内ドメインは、CD3ζの細胞内シグナルドメインである。他の実施態様では、該細胞内ドメインは、リンパ球受容体鎖、TCR/CD3複合体タンパク質、Fc受容体サブユニット、又はIL-2サブユニットに由来する。

0061

特定の実施態様では、本明細書に記載されるTリンパ球により発現されるポリペプチドは、1以上の共刺激性ドメインを、例えば該ポリペプチドの細胞内ドメインの一部としてさらに含む。該1以上の共刺激性ドメインは、1以上の共刺激性CD27ポリペプチド配列、共刺激性CD28ポリペプチド配列、共刺激性OX40(CD134)ポリペプチド配列、共刺激性4-1BB(CD137)ポリペプチド配列、又は共刺激性誘導性T細胞共刺激性(ICOS)ポリペプチド配列であり得、又はこれらを含み得る。

0062

具体的な実施態様では、本明細書で提供されるTリンパ球は、N末端からC末端に向けて、順に:(i)抗原結合ドメイン(例えば、腫瘍細胞上の抗原、例えば、上記腫瘍細胞上の抗原に結合する抗原結合ドメイン);(ii) CD28又はCTLA4ヒンジポリペプチド配列;(iii) CTLA4又はPD-1膜貫通ドメイン;(iv)共刺激性ドメイン;及び(v)細胞内シグナルドメインを含むポリペプチドを発現する、又は含む。具体的な実施態様では、該ポリペプチドの抗原結合ドメインは、CD19に結合する。

0063

具体的な実施態様では、本明細書で提供されるTリンパ球は、N末端からC末端に向けて、順に:(i)抗原結合ドメイン(例えば、腫瘍細胞上の抗原、例えば、上記腫瘍細胞上の抗原に結合する抗原結合ドメイン);(ii) CH2CH3ヒンジポリペプチド配列;(iii) CTLA4又はPD-1膜貫通ドメイン;(iv) CD28共刺激性ドメイン;及び(v) CD3ζ細胞内シグナルドメインを含むポリペプチドを発現する、又は含む。具体的な実施態様では、該ポリペプチドの該抗原結合ドメインは、HER2に結合する。

0064

具体的な実施態様では、本明細書で提供されるTリンパ球は、N末端からC末端に向けて、順に:(i)抗原結合ドメイン(例えば、腫瘍細胞上の抗原、例えば、上記腫瘍細胞上の抗原に結合する抗原結合ドメイン);(ii) CH2CH3ヒンジポリペプチド配列;(iii) CTLA4又はPD-1膜貫通ドメイン;(iv) CD28共刺激性ドメイン;及び(v) CD3ζ細胞内シグナルドメインを含むポリペプチドを発現する、又は含む。具体的な実施態様では、該ポリぺプチドの該抗原結合ドメインは、HER2に結合する。

0065

他の具体的な実施態様では、本明細書で提供されるTリンパ球は、N末端からC末端に向けて、順に:(i)リンカーによりVHに連結されるVLを含む単鎖Fvドメイン、ここで、該VL及びVHは関心のある抗原に結合する抗体に由来する(例えば、腫瘍細胞上の抗原、例えば、上記腫瘍細胞上の抗原);(ii) CD28ヒンジポリペプチド配列;(iii) CTLA4膜貫通ドメイン;(iv) CD28共刺激性ドメイン;及び(v) CD3ζ細胞内シグナルドメインを含むポリペプチドを発現する、又は含む。

0066

他の具体的な実施態様では、本明細書で提供されるTリンパ球は、N末端からC末端に向けて、順に:(i)リンカーによりVHに連結されるVLを含む単鎖Fvドメイン、ここで、該VL及びVHは関心のある抗原に結合する抗体に由来する(例えば、腫瘍細胞上の抗原、例えば、上記腫瘍細胞上の抗原);(ii) CTLA4ヒンジポリペプチド配列;(iii) CTLA4膜貫通ドメイン;(iv) CD28共刺激性ドメイン;及び(v) CD3ζ細胞内シグナルドメインを含むポリペプチドを発現する、又は含む。

0067

他の具体的な実施態様では、本明細書で提供されるTリンパ球は、N末端からC末端に向けて、順に:(i)リンカーによりVHに連結されるVLを含む単鎖Fvドメイン、ここで、該VL及びVHは関心のある抗原に結合する抗体に由来する(例えば、腫瘍細胞上の抗原、例えば、上記腫瘍細胞上の抗原);(ii) CD28ヒンジポリペプチド配列;(iii) PD-1膜貫通ドメイン;(iv) CD28共刺激性ドメイン;及び(v) CD3ζ細胞内シグナルドメインを含むポリペプチドを発現する、又は含む。

0068

他の具体的な実施態様では、本明細書で提供されるTリンパ球は、N末端からC末端に向けて、順に:(i)リンカーによりVHに連結されるVLを含む単鎖Fvドメイン、ここで、該VL及びVHは関心のある抗原に結合する抗体に由来する(例えば、腫瘍細胞上の抗原、例えば、上記腫瘍細胞上の抗原);(ii) CTLA4ヒンジポリペプチド配列;(iii) PD-1膜貫通ドメイン;(iv) CD28共刺激性ドメイン;及び(v) CD3ζ細胞内シグナルドメインを含むポリペプチドを発現する、又は含む。

0069

他の具体的な実施態様では、本明細書で提供されるTリンパ球は、N末端からC末端に向けて、順に:(i)抗原結合ドメイン(例えば、腫瘍上の抗原、例えば、上記腫瘍細胞上の抗原に結合する抗原結合ドメイン);(ii) PD-1ヒンジポリペプチド配列;(iii) CTLA4又はPD-1膜貫通ドメイン;(iv)共刺激性ドメイン;及び(v)細胞内シグナルドメインを含むポリペプチドを発現する、又は含む。

0070

他の具体的な実施態様では、本明細書で提供されるTリンパ球は、N末端からC末端に向けて、順に:(i)リンカーによりVHに連結されるVLを含む単鎖Fvドメイン、ここで、該VL及びVHは関心のある抗原に結合する抗体に由来する(例えば、腫瘍細胞上の抗原、例えば、上記腫瘍細胞上の抗原);(ii) PD-1ヒンジポリペプチド配列;(iii) CTLA4膜貫通ドメイン;(iv) CD28共刺激性ドメイン;及び(v) CD3ζ細胞内シグナルドメインを含むポリペプチドを発現する、又は含む。

0071

他の具体的な実施態様では、本明細書で提供されるTリンパ球は、N末端からC末端に向けて、順に:(i)リンカーによりVHに連結されるVLを含む単鎖Fvドメイン、ここで、該VL及びVHは関心のある抗原に結合する抗体に由来する(例えば、腫瘍細胞上の抗原、例えば、上記腫瘍細胞上の抗原);(ii) PD-1ヒンジポリペプチド配列;(iii) PD-1膜貫通ドメイン;(iv) CD28共刺激性ドメイン;及び(v) CD3ζ細胞内シグナルドメインを含むポリペプチドを発現する、又は含む。

0072

具体的な実施態様では、本明細書で提供されるTリンパ球は、本明細書で提供する1以上のポリペプチドを発現し、又は含み、該ポリぺププチドが、該ポリペプチドの該抗原結合ドメイン又は単鎖Fvドメインが特異性を示す抗原に結合したときに、活性化状態、又は刺激状態となり、増殖する。他の具体的な実施態様では、本明細書に記載されるTリンパ球は本明細書で提供される1以上のポリペプチドを発現し、又は含み、Tリンパ球が該抗原を発現する細胞と接触したときに、該ポリペプチドの該抗原結合ドメイン又は単鎖Fvドメインが特異性を示す抗原を発現する、又は含む細胞を殺す。

0073

他の態様では、本明細書で提供されるのは、疾病又は障害を有する個体の治療方法であって、ここで、該疾病又は障害は、抗原を発現する細胞により特徴づけられる、又は特徴づけることができ、かつ本明細書で提供される1以上のTリンパ球、すなわち本明細書に記載されるポリペプチドを含む、又は発現するTリンパ球を該個体に投与することを含む。

図面の簡単な説明

0074

(4.図面の簡単な説明)
CARを発現するレンチウイルスベクターによる該T細胞への伝達から3日後のT細胞によるCARの発現を示している。

0075

(i)休止期にある(第1のバー)、(ii) 抗CD28に曝露した後の(第2のバー);(iii) 0.25 μg/mlHER2-Fcに曝露した後の;(iv) 0.5 μg/ml HER2-Fcに曝露した後の;及び(v) 1.0 μg/ml HER2-Fcに曝露した後の、CAR T細胞によるインターロイキン-2(IL-2)の産生を示している。

0076

(i)休止期にある(第1のバー)、(ii) CD28に曝露した後の(第2のバー);(iii) 0.25 μg/mlHER2-Fcに曝露した後の;(iv) 0.5 μg/ml HER2-Fcに曝露した後の;及び(v) 1.0 μg/ml HER2-Fcに曝露した後のCAR T細胞によるGM-CSF産生を示している。

0077

(i)休止期にある(第1のバー)、(ii) CD28に曝露した後の(第2のバー)、(iii) 0.25 μg/mlHER2-Fcに曝露した後の;(iv) 0.5 μg/ml HER2-Fcに曝露した後の;及び(v) 1.0 μg/ml HER2-Fcに曝露した後のCAR T細胞によるインターフェロン-ガンマ(IFN-γ)の産生を示している。

0078

1.0 μg/mlHER2-Fcに複数回曝露した後のCAR T細胞による細胞内腫瘍壊死因子アルファ(TNF-α)の産生を示している。

0079

特定の抗HER2 CARを発現する、又は発現対照のCAR T細胞の、HER2-Fcによる刺激の不存在時(上のパネル)及び存在時(下のパネル)のパーセンテージを示している。A) 偽発現、HER2-28TMζ、又はHER2-28TM28ζを発現する抗HER2 CAR T細胞のパーセンテージ。B) HER2-CTLA4TM28ζ又はHER2-4-1BBTM28ζを発現する抗HER2 CAR T細胞のパーセンテージ。

0080

CARを発現するレンチウイルスベクターによるT細胞への伝達から11日後のT細胞によるCARの発現を示している。

0081

(i)休止期にある、(ii) 0.25、0.5、又は1.0 μg/mlHER2-Fcに曝露した後の;又は(iii) CD3/CD28の結合の後のCAR T細胞によるIL-2、TNF-α、及びIFN-γの産生を示している。各群の第1の(最も左の)バー:偽伝達細胞(CARを発現していない);各群の第2のバー:HER-PD1TM-CD28-CD3と名付けられたCARを伝達された細胞;各群の第3のバー:HER-CTLA4(189)TM-41BB-CD3と名付けられたCARを伝達された細胞;各群の第4のバー:HER-PD1TM-41BB-CD3と名付けられたCARを伝達された細胞;各群の第5の(最も右の)バー:HER2-CD28TM-CD28-CD3と名付けられたCARを伝達された細胞。

0082

(i)休止期にある、(ii) 0.25、0.5、又は1.0 μg/mlHER2-Fcに曝露した後の;又は(iii) CD3/CD28の結合の後のCAR T細胞によるGM-CSF、グランザイムB、及びIL-13産生を示している。各群の第1の(最も左の)バー:偽伝達細胞(CARを発現していない);各群の第2のバー:HER-PD1TM-CD28-CD3と名付けられたCARを伝達された細胞;各群の第3のバー:HER-CTLA4(189)TM-41BB-CD3と名付けられたCARを伝達された細胞;各群の第4のバー:HER-PD1TM-41BB-CD3と名付けられたCARを伝達された細胞;各群の第5の(最も右の)バー:HER2-CD28TM-CD28-CD3と名付けられたCARを伝達された細胞。

0083

HER2-Fcによる刺激後の生存T細胞数が示されている。第1の(最も左の)バー:HER2-CD28TM-CD28-CD3と名付けられたCARを伝達された細胞;第2のバー:HER-PD1TM-CD28-CD3と名付けられたCARを伝達された細胞;第3のバー:HER-CTLA4(189)TM-41BB-CD3と名付けられたCARを伝達された細胞;第4のバー:HER-PD1TM-41BB-CD3と名付けられたCARを伝達された細胞;第5の(最も右の)バー:偽伝達細胞(CARを発現していない)。

0084

(5.詳細な記述
一態様では、本明細書で提供されるのは、免疫系細胞、例えばTリンパ球(T細胞)によって発現することができ、そのような免疫系細胞において膜結合型であり、かつ通常そのような免疫系細胞に抑制シグナルを伝達する免疫系タンパク質由来の膜貫通ドメイン、例えばCTLA4(細胞毒性T-リンパ球抗原4又は細胞毒性T-リンパ球関連タンパク質4)又はPD-1(プログラム細胞死-1)由来の膜貫通ドメインを含む、例えばキメラ抗原受容体(例えば、Eshharの米国特許番号第7,741,465号を参照されたい)のようなポリペプチドである。さらに本明細書で提供されるのは、本明細書に記載される該ポリペプチドをコードする核酸配列である。同様に本明細書で提供されるのは、そのようなポリペプチドを発現する免疫系細胞、例えばTリンパ球(例えば、T細胞)である。

0085

本明細書で提供される該ポリペプチドは、抗原、例えば、細胞上の抗原に結合する細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び免疫細胞に第1の活性化シグナルを伝達する細胞内(細胞質)シグナルドメインを含む。本明細書で提供される該ポリペプチドは例えばT細胞の表面に発現されたとき、及び該CARの該細胞外ドメインが抗原と結合したときに、該細胞内シグナルドメインが、活性化し、及び/又は増殖するための、及び該抗原が細胞表面にある場合に該抗原を発現する細胞を殺すためのシグナルを、Tリンパ球に伝達する。Tリンパ球は完全に活性化するために2つのシグナル、第1の活性化シグナル及び共刺激性シグナルを要求するため、特定の実施態様では、本明細書に記載される該ポリペプチドは、該細胞外ドメインへの該抗原の結合が、第1の活性化シグナル及び共刺激性シグナルの双方の伝達をもたらすように共刺激性ドメインを含み得る。

0086

本明細書で提供される該ポリペプチド、例えばCARは、T細胞共刺激性タンパク質、例えばCTLA4又はPD-1に由来する膜貫通ドメインを含む、機能的な免疫刺激ポリペプチドである。一態様では、本明細書で提供されるのは、(i) CTLA4又はPD-1に由来する膜貫通ドメイン、(ii)リンパ球表面に発現し、該リンパ球の活性化及び/又は増殖を引き起こす内在性タンパク質の細胞内ドメイン(例えば、細胞質ドメイン)、及び(iii)抗原に結合する細胞外ドメインを含むポリペプチドであり、ここで、該膜貫通ドメインがCTLA4由来である場合は、該ポリペプチドの該細胞内ドメイン及び細胞外ドメインは、CTLA4由来ではなく;かつ該膜貫通ドメインがPD-1由来である場合は、該ポリペプチドの該細胞内ドメイン及び細胞外ドメインは、PD-1由来ではない。具体的な実施態様では、本明細書に記載されるポリペプチドを発現するTリンパ球は、該ポリペプチドが、該ポリペプチドが特異性を示す抗原(すなわち、該ポリペプチドの細胞外ドメインにより結合される抗原)に結合する時に、活性化され、又は刺激されて増殖する。具体的な実施態様では、該ポリペプチドは、Tリンパ球表面に発現された場合、該Tリンパ球を該抗原を発現する細胞を殺すよう方向づける。

0087

特定の実施態様では、本明細書で提供される該ポリペプチドは、CTLA4又はPD-1、又はそれらの一部に由来する膜貫通ドメインを含み、ここで、該CTLA4又はPD-1膜貫通ドメインは、哺乳類CTLA4又はPD-1、例えばヒト、霊長類齧歯類、例えばマウスのCTLA4又はPD-1に由来する。具体的な実施態様では、該膜貫通ドメインは、CTLA4又はPD-1の細胞内ドメイン、細胞外ドメイン、又は該細胞内若しくは細胞外ドメインのいずれかに由来するアミノ酸配列を含まない。CTLA4又はPD-1の膜貫通ドメイン配列の具体的な、限定されない例は、以下に提供される。

0088

具体的な実施態様では、本明細書で提供されるのは、CTLA4に由来する膜貫通ドメインを含むポリペプチドであり、ここで、該CTLA4膜貫通ドメインはヒトctla4遺伝子(例えば、GenBankAccession No. NM_005214.4 (CTLA4細胞毒性T-リンパ球関連タンパク質4(Homo sapiens);Gene ID: 1493))のエキソン3にコードされるポリペプチド配列である。

0089

他の具体的な実施態様では、本明細書で提供されるポリペプチドの該CTLA4膜貫通ドメインは、以下のアミノ酸配列であるか、又はこれを含む。

0090

他の具体的な実施態様では、本明細書で提供されるポリペプチドの該CTLA4膜貫通ドメインは、GenBankAccession No. NM_005214.4 (CTLA4細胞毒性T-リンパ球関連タンパク質4(Homo sapiens);Gene ID: 1493)のヌクレオチド610〜722にコードされるポリペプチド配列であるか、又はこれを含む。

0091

他の具体的な実施態様では、本明細書で提供されるポリペプチドの該CTLA4膜貫通ドメインは、以下のアミノ酸配列であるか、又はこれを含む。

0092

他の具体的な実施態様では、本明細書で提供されるポリペプチドの該CTLA4膜貫通ドメインは、GenBankAccession No. NM_005214.4 (CTLA4細胞毒性T-リンパ球関連タンパク質4(Homo sapiens);Gene ID: 1493)のヌクレオチド636〜699にコードされるポリペプチド配列であるか、又はこれを含む。

0093

他の具体的な実施態様では、本明細書で提供されるポリペプチドの該CTLA4膜貫通ドメインは、以下のアミノ酸配列であるか、又はこれを含む。

0094

他の具体的な実施態様では、本明細書で提供されるポリペプチドの該CTLA4膜貫通ドメインは、以下のポリペプチド配列であるか、又はこれを含む。

0095

他の具体的な実施態様では、本明細書で提供されるポリペプチドの該CTLA4膜貫通ドメインは、以下のポリペプチド配列であるか、又はこれを含む。

0096

他の具体的な実施態様では、本明細書で提供されるポリペプチドの該CTLA4膜貫通ドメインは、以下のポリペプチド配列であるか、又はこれを含む。

0097

他の具体的な実施態様では、本明細書で提供されるポリペプチドの該CTLA4膜貫通ドメインは、以下のポリペプチド配列であるか、又はこれを含む。

0098

他の具体的な実施態様では、本明細書で提供されるポリペプチドの該PD-1膜貫通ドメインは、以下のアミノ酸配列であるか、又はこれを含む。

0099

他の具体的な実施態様では、本明細書で提供されるポリペプチドの該PD-1膜貫通ドメインは、以下のアミノ酸配列であるか、又はこれを含む。

0100

他の具体的な実施態様では、本明細書で提供されるポリペプチドの該PD-1膜貫通ドメインは、以下のアミノ酸配列であるか、又はこれを含む。

0101

他の具体的な実施態様では、本明細書で提供されるポリペプチドの該PD-1膜貫通ドメインは、以下のアミノ酸配列であるか、又はこれを含む。

0102

本明細書に記載される該CTLA-4及びPD-1の膜貫通ドメイン配列(すなわち、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:7、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、及び配列番号:11)に例示されるように、本明細書に記載される該膜貫通ドメインは、特定の実施態様では、それらが由来するタンパク質(すなわち、CTLA-4又はPD-1)の該細胞外ドメインに由来する1以上のアミノ酸及び/又は該細胞内ドメインに由来する1以上のアミノ酸を含む。特定の実施態様では、本明細書に記載される該膜貫通ドメインは、それが由来するタンパク質(すなわち、CTLA-4又はPD-1)の細胞外ドメインに由来する1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、又は25アミノ酸を含む。特定の実施態様では、本明細書に記載される膜貫通ドメインは、それらが由来するタンパク質(すなわち、CTLA-4又はPD-1)の細胞内ドメインに由来する1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、又は25アミノ酸を含む。特定の実施態様では、本明細書に記載される該膜貫通ドメインは、(i) それらが由来するタンパク質(すなわち、CTLA-4又はPD-1)の該細胞外ドメインに由来する1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、又は25アミノ酸及び(ii) それらが由来するタンパク質(すなわち、CTLA-4又はPD-1)の該細胞内ドメインに由来する1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、又は25アミノ酸を含む。

0103

他の具体的な実施態様では、本明細書で提供されるのは、膜貫通ドメインを含むポリペプチドであり、ここで、該膜貫通ドメインは、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:7、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、又は配列番号:11に開示される少なくとも10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、又は21の連続アミノ酸であり、又はこれを含む。他の具体的な実施態様では、本明細書で提供されるのは、膜貫通ドメインを含むポリペプチドであり、ここで、該膜貫通ドメインが配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:7、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、又は配列番号:11と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、又は少なくとも95%一致する。

0104

特定の実施態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書に開示されるポリペプチドの1つをコードするヌクレオチド配列である。具体的な実施態様では、本明細書で提供されるのは、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:7、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、又は配列番号:11に開示されるいずれかのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列である。他の具体的な実施態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載されるポリペプチドをコードする核酸であり、ここで、該核酸は、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:7、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、又は配列番号:11に開示される少なくとも10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、又は21の連続アミノ酸をコードするヌクレオチド配列を含む。他の具体的な実施態様では、本明細書で提供されるのは、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:7、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、又は配列番号:11と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、又は少なくとも95%一致するポリペプチドをコードする核酸配列である。

0105

本明細書で提供される該ポリペプチドを構築する際に、特定の実施態様では、ヒト配列は、非ヒト配列と組み合され得る。例えば、ヒト細胞外及び細胞内ドメインのアミノ酸配列を含むポリペプチドは、ヒトでない種に由来する膜貫通ドメインを含み得る;例えば、マウスCTLA4の膜貫通ドメインまたはマウスPD-1の膜貫通ドメインを含み得る。より具体的な実施態様では、該ポリペプチドは、該細胞外及び細胞内ドメインについてはヒトのアミノ酸配列を含み、かつ配列番号:5のアミノ酸配列を有し、又はそれからなる膜貫通ドメインを含む。

0106

本明細書で提供される該ポリペプチドの細胞外ドメインは、関心のある抗原と結合する。特定の実施態様では、本明細書で提供されるポリペプチドの細胞外ドメインは、該抗原と結合する受容体、又は受容体の一部を含む。該細胞外ドメインは、例えば、該抗原と結合する受容体、又は受容体の一部であり得る。特定の実施態様では、該細胞外ドメインは、抗体又はその抗原結合部位を含む、又はそのものである。具体的な実施態様では、該細胞外ドメインは、単鎖Fvドメインを含む、又はそのものである。該単鎖Fvドメインは、例えば、可動性リンカーによりVHに連結されたVLを含むことができ、ここで、該VL及びVHは該抗原に結合する抗体に由来する。

0107

本明細書で提供される該ポリペプチドの該細胞外ドメインが結合する/認識する該抗原は、関心のある任意の抗原であり得、例えば、腫瘍細胞上の抗原であり得る。該腫瘍細胞は、例えば、固形腫瘍中の細胞、又は非固形腫瘍の細胞、例えば、血液癌の細胞であり得る。該抗原は、任意の腫瘍又は癌種の細胞に発現される任意の抗原であり得る。これは例えば、リンパ種、肺癌乳癌前立腺癌副腎皮質癌、甲状腺癌上咽頭癌、メラノーマ、例えば悪性メラノーマ皮膚癌結腸癌類腱腫線維形成性小円細胞腫瘍、内分泌腫瘍ユーイング肉腫末梢性原始神経外胚葉腫瘍固形胚細胞腫瘍肝芽細胞腫神経芽細胞腫、非横紋筋肉腫軟部組織肉腫(non-rhabdomyosarcoma soft tissue sarcoma)、骨肉腫網膜芽腫、横紋筋肉腫、ウィルムス腫瘍神経膠芽細胞腫粘液腫線維腫脂肪腫等の細胞である。より具体的な実施態様では、該リンパ腫は、慢性リンパ性白血病(小型リンパ性リンパ腫)、B細胞リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症脾臓周辺帯リンパ腫、形質細胞性骨髄腫形質細胞腫、節外周辺帯B細胞リンパ腫、MALTリンパ腫、節周辺帯B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫マントル細胞リンパ腫びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、縦隔胸腺)大細胞型B細胞リンパ腫、血管内大細胞型B細胞リンパ腫、原発性滲出液リンパ腫、バーキットリンパ腫、Tリンパ球前リンパ球性白血病、Tリンパ球大型顆粒リンパ球白血病、侵攻性NK細胞白血病、成人Tリンパ球白血病/リンパ腫、節外性NK/Tリンパ球リンパ腫、型、腸疾患型Tリンパ球リンパ腫、肝脾Tリンパ球リンパ腫、芽球性NK細胞リンパ腫、菌状息肉腫セザリー症候群、原発性皮膚未分化大細胞リンパ腫リンパ腫様丘疹症、血管免疫芽球性Tリンパ球リンパ腫、末梢性Tリンパ球リンパ腫(不特定)、未分化大細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、又は非ホジキンリンパ腫である。特定の癌に特異的な抗原並びにそのような抗原を同定する方法は、当該技術分野で公知である。

0108

癌が慢性リンパ球性白血病(CLL)である具体的な実施態様では、CLLのB細胞は正常核型を有する。癌が慢性リンパ球性白血病(CLL)である他の具体的な実施態様では、CLLのB細胞は17pの欠失、11qの欠失、12qのトリソミー、13qの欠失、又はp53の欠失を保有する。

0109

特定の実施態様では、本明細書に記載されるポリペプチドの該細胞外ドメインに認識される抗原は、腫瘍関連抗原(TAA)又は腫瘍特異的抗原(TSA)である。様々な具体的な実施態様では、該腫瘍関連抗原又は腫瘍特異的抗原は、限定されることなく、Her2、前立腺幹細胞抗原(PSCA)、アルファ-フェトプロテイン(AFP)、癌胎児性抗原(CEA)、癌抗原-125(CA-125)、CA19-9、カルレチニン、MUC-1、上皮性膜タンパク質(EMA)、上皮性腫瘍抗原(ETA)、チロシナーゼ、メラノーマ関連抗原(MAGE)、CD19、CD22、CD27、CD30、CD34、CD45、CD70、CD99、CD117、EGFRvIII(表皮性成長因子バリアントIII)、メソセリン、PAP(前立腺酸性ホスファターゼ)、プロステイン、TARP(T細胞受容体ガンマオルターネイトリーディングフレームタンパク質)、Trp-p8、STEAP1(プロステイト1の6回膜貫通型上皮性抗原)、クロモグラニン、サイトケラチン、デスミン、グリア線維酸性タンパク質(GFAP)、肉眼的嚢胞性疾患液体タンパク質(GCDFP-15)、HMB-45抗原、タンパク質メラン-A(Tリンパ球に認識されるメラノーマ抗原;MART-1)、myo-D1、筋特異的アクチン(MSA)、ニューロフィラメント、神経特異的エノラーゼ(NSE)、胎盤アルカリホスファターゼ、シナプトファイシス、チログロブリン、甲状腺転写因子-1、ピルビン酸キナーゼイソ酵素タイプM2の二量体形(腫瘍M2-PK)、異常rasタンパク質、又は異常p53タンパク質である。

0110

特定の実施態様では、本明細書に記載されるポリペプチドの該細胞外ドメインに認識される該TAA又はTSAは、インテグリンαvβ3(CD61)、ガラクチン、又はRal-Bである。

0111

特定の実施態様では、本明細書に記載されたポリペプチドの該細胞外ドメインに認識される該TAA又はTSAは、癌/精巣(CT)抗原、例えば、BAGE、CAGE、CTAGE、FATE、GAGE、HCA661、HOM-TES-85、MAGEA、MAGEB、MAGEC、NA88、NY-ESO-1、NY-SAR-35、OY-TES-1、SPANXB1、SPA17、SSX、SYCP1、又はTPTEである。

0112

特定の他の実施態様では、本明細書に記載されるポリペプチドの該細胞外ドメインに認識される該TAA又はTSAは、糖又はガングリオシド、例えば、fuc-GM1、GM2(癌胎児性抗原免疫性-1;OFA-I-1);GD2(OFA-I-2)、GM3、GD3などである。

0113

特定の他の実施態様では、本明細書に記載されるポリペプチドの該細胞外ドメインに認識される該TAA又はTSAは、アルファ-アクチニン-4、Bage-1、BCR-ABL、Bcr-Abl融合タンパク質ベータ-カテニン、CA 125、CA 15-3(CA 27.29\BCAA)、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、Casp-8、cdc27、cdk4、cdkn2a、CEA、coa-1、dek-can融合タンパク質、EBNA、EF2、エプスタイン-バールウイルス抗原、ETV6-AML1融合タンパク質、HLA-A2、HLA-A11、hsp70-2、KIAAO205、Mart2、Mum-1、2、及び3、neo-PAP、ミオシンクラスI、OS-9、pml-RARα融合タンパク質、PTPRK、K-ras、N-ras、トリオースリン酸イソメラーゼ、Gage 3、4、5、6、7、GnTV、Herv-K-mel、Lage-1、NA-88、NY-Eso-1/Lage-2、SP17、SSX-2、TRP2-Int2、gp100(Pmel 17)、チロシナーゼ、TRP-1、TRP-2、MAGE-1、MAGE-3、RAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15(58)、RAGE、SCP-1、Hom/Mel-40、PRAME、p53、H-Ras、HER-2/neu、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、ヒトパピローマウイルス(HPV)抗原E6及びE7、TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、TAG-72-4、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、13-カテニン、Mum-1、p16、TAGE、PSMA、CT7、テロメラーゼ、43-9F、5T4、791Tgp72、13HCG、BCA225、BTAA、CD68\KP1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733(EpCAM)、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB\70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90、TAAL6、TAG72、TLP、又はTPSである。他の腫瘍関連及び腫瘍特異的抗原は、当業者に公知である。

0114

TSA及びTAAに結合する抗体、scFvは、それらをコードするヌクレオチド配列同様、当該分野で公知である。

0115

特定の具体的な実施態様では、本明細書に記載されるポリペプチドの該細胞外ドメインに認識される該抗原は、TSA又はTAAであるとは考えられないが、にもかかわらず腫瘍細胞又は腫瘍によりもたらされる傷害に関連する抗原である。特定の実施態様では、例えば、該抗原は、例えば、成長因子、サイトカイン、又はインターロイキン、例えば、血管形成又は脈管形成に関連する成長因子、サイトカイン、又はインターロイキンである。そのような成長因子、サイトカイン、又はインターロイキンは、例えば、血管内皮増殖因子VEGF)、塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)、血小板由来成長因子(PDGF)、肝細胞増殖因子HGF)、インスリン様成長因子(IGF)、又はインターロイキン-8(IL-8)を含み得る。腫瘍は該腫瘍の局所低酸素環境を生み出すこともできる。従って、他の具体的な実施態様では、該抗原は低酸素関連因子、例えば、HIF-1α、HIF-1β、HIF-2α、HIF-2β、HIF-3α、又はHIF-3βである。腫瘍は正常組織に局所的な傷害をもまたもたらし、損傷関連分子パターン分子(DAMPアラーミンとしても知られる)として公知の分子の放出をもたらし得る。特定の他の具体的な実施態様では、そのため、該抗原はDAMP、例えば熱ショックタンパク質染色体関連タンパク質高運動性ボックス1(HMGB1)、S100A8(MRP8、カルグラニュリンA)、S100A9(MRP14、カルグラニュリンB)、血清アミロイドA(SAA)であり、又はデオキシリボ核酸アデノシントリリン酸尿酸、又はヘパリン硫酸であり得る。

0116

特定の実施態様では、本明細書に記載される該ポリペプチドの該細胞外ドメインは、リンカー、スペーサー、又はヒンジポリペプチド配列、例えば、CD28由来の配列又はCTLA4由来の配列により該ポリぺプチドの膜貫通ドメインに結合される。

0117

特定の実施態様では、本明細書に記載されるポリペプチドの該細胞内ドメインは、T細胞の表面に発現し、かつ該T細胞の活性化及び/又は増殖を引き起こすタンパク質の細胞内ドメイン又はモチーフであるか、又はこれを含む。そのようなドメイン又はモチーフは、CARの細胞外部分への抗原の結合に応答するTリンパ球の活性化に必要な第1抗原結合シグナルを伝達することができる。一般に、このドメイン又はモチーフは、ITAM(免疫受容活性化チロシンモチーフ)を含む、又はそのものである。CARにとって好適なITAM含有ポリペプチドは、例えば、ジータCD3鎖(CD3ζ)又はそのITAM含有部分を含む。具体的な実施態様では、該細胞内ドメインは、CD3ζの細胞内シグナルドメインである。他の具体的な実施態様では、該細胞内ドメインは、リンパ球受容体鎖、TCR/CD3複合体タンパク質、Fc受容体サブユニット、又はIL-2受容体サブユニットに由来する。

0118

特定の実施態様では、本明細書で提供されるポリペプチドは、1以上の共刺激性ドメイン又はモチーフを、例えば該ポリペプチドの該細胞内ドメインの一部として、さらに含む。該1以上の共刺激性ドメイン又はモチーフは、1以上の共刺激性CD27ポリペプチド配列、共刺激性CD28ポリペプチド配列、共刺激性OX40(CD134)ポリペプチド配列、共刺激性4-1BB(CD137)ポリペプチド配列、又は共刺激性誘導性T細胞共刺激性(ICOS)ポリペプチド配列、又は他の共刺激性ドメイン又はモチーフであり得、又はこれらを含み得る。

0119

具体的な実施態様では、本明細書で提供されるポリペプチドは、N末端からC末端に向けて、順に:(i)抗原結合ドメイン(例えば、腫瘍細胞上の抗原、例えば、上記腫瘍細胞上の抗原に結合する抗原結合ドメイン);(ii) CD28又はCTLA4ヒンジポリペプチド配列;(iii) CTLA4又はPD-1膜貫通ドメイン;(iv)共刺激性ドメイン;及び(v)細胞内シグナルドメインを含む。

0120

他の具体的な実施態様では、本明細書で提供されるポリペプチドは、N末端からC末端に向けて、順に:(i)抗原結合ドメイン(例えば、腫瘍細胞上の抗原、例えば、上記腫瘍細胞上の抗原に結合する抗原結合ドメイン);(ii) CH2CH3ヒンジポリペプチド配列;(iii) CTLA4又はPD-1膜貫通ドメイン;(iv) CD28共刺激性ドメイン;及び(v) CD3ζ細胞内シグナルドメインを含む。

0121

他の具体的な実施態様では、本明細書で提供されるポリペプチドは、N末端からC末端に向けて、順に:(i)抗原結合ドメイン(例えば、腫瘍細胞上の抗原、例えば、上記腫瘍細胞上の抗原に結合する抗原結合ドメイン);(ii) CD28ヒンジポリペプチド配列;(iii) CTLA4又はPD-1膜貫通ドメイン;(iv) 4-1BB共刺激性ドメイン;及び(v) CD3ζ細胞内シグナルドメインを含む。

0122

他の具体的な実施態様では、本明細書で提供されるポリペプチドは、N末端からC末端に向けて、順に:(i)抗原結合ドメイン(例えば、腫瘍細胞上の抗原、例えば、上記腫瘍細胞上の抗原に結合する抗原結合ドメイン);(ii) PD-1ヒンジポリペプチド配列;(iii) CTLA4又はPD-1膜貫通ドメイン;(iv)共刺激性ドメイン;及び(v)細胞内シグナルドメインを含む。

0123

他の具体的な実施態様では、本明細書で提供されるポリペプチドは、N末端からC末端に向けて、順に:(i)リンカーによりVHに連結されるVLを含む、単鎖Fvドメイン、ここで、該VL及びVHは関心のある抗原に結合する抗体に由来する(例えば、腫瘍細胞上の抗原、例えば、上記腫瘍細胞上の抗原);(ii) CD28ヒンジポリペプチド配列;(iii) CTLA4膜貫通ドメイン;(iv) CD28共刺激性ドメイン;及び(v) CD3ζ細胞内シグナルドメインを含む。

0124

他の具体的な実施態様では、本明細書で提供されるポリペプチドは、N末端からC末端に向けて、順に:(i)リンカーによりVHに連結されるVLを含む、単鎖Fvドメイン、ここで、該VL及びVHは関心のある抗原に結合する抗体に由来する(例えば、腫瘍細胞上の抗原、例えば、上記腫瘍細胞上の抗原);(ii) CTLA4ヒンジポリペプチド配列;(iii) CTLA4膜貫通ドメイン;(iv) CD28共刺激性ドメイン;及び(v) CD3ζ細胞内シグナルドメインを含む。

0125

他の具体的な実施態様では、本明細書で提供されるポリペプチドは、N末端からC末端に向けて、順に:(i)リンカーによりVHに連結されるVLを含む、単鎖Fvドメイン、ここで、該VL及びVHは関心のある抗原に結合する抗体に由来する(例えば、腫瘍細胞上の抗原、例えば、上記腫瘍細胞上の抗原);(ii) CD28ヒンジポリペプチド配列;(iii) PD-1膜貫通ドメイン;(iv) CD28共刺激性ドメイン;及び(v) CD3ζ細胞内シグナルドメインを含む。

0126

他の具体的な実施態様では、本明細書で提供されるポリペプチドは、N末端からC末端に向けて、順に:(i)リンカーによりVHに連結されるVLを含む、単鎖Fvドメイン、ここで、該VL及びVHは関心のある抗原に結合する抗体に由来する(例えば、腫瘍細胞上の抗原、例えば、上記腫瘍細胞上の抗原);(ii) CTLA4ヒンジポリペプチド配列;(iii) PD-1膜貫通ドメイン;(iv) CD28共刺激性ドメイン;及び(v) CD3ζ細胞内シグナルドメインを含む。

0127

他の具体的な実施態様では、本明細書で提供されるポリペプチドは、N末端からC末端に向けて、順に:(i)リンカーによりVHに連結されるVLを含む、単鎖Fvドメイン、ここで、該VL及びVHは関心のある抗原に結合する抗体に由来する(例えば、腫瘍細胞上の抗原、例えば、上記腫瘍細胞上の抗原);(ii) CTLA4ヒンジポリペプチド配列;(iii) PD-1膜貫通ドメイン;(iv) CD28共刺激性ドメイン;及び(v) CD3ζ細胞内シグナルドメインを含む。

0128

他の具体的な実施態様では、本明細書で提供されるポリペプチドは、N末端からC末端に向けて、順に:(i)抗原結合ドメイン(例えば、腫瘍細胞上の抗原、例えば、上記腫瘍細胞上の抗原に結合する抗原結合ドメイン);(ii) PD-1ヒンジポリペプチド配列;(iii) CTLA4又はPD-1膜貫通ドメイン;(iv)共刺激性ドメイン;及び(v)細胞内シグナルドメインを含む。

0129

他の具体的な実施態様では、本明細書で提供されるポリペプチドは、N末端からC末端に向けて、順に:(i)リンカーによりVHに連結されるVLを含む、単鎖Fvドメイン、ここで、該VL及びVHは関心のある抗原に結合する抗体に由来する(例えば、腫瘍細胞上の抗原、例えば、上記腫瘍細胞上の抗原);(ii) PD-1ヒンジポリペプチド配列;(iii) CTLA4膜貫通ドメイン;(iv) CD28共刺激性ドメイン;及び(v) CD3ζ細胞内シグナルドメインを含む。

0130

他の具体的な実施態様では、本明細書で提供されるポリペプチドは、N末端からC末端に向けて、順に:(i)リンカーによりVHに連結されるVLを含む、単鎖Fvドメイン、ここで、該VL及びVHは関心のある抗原に結合する抗体に由来する(例えば、腫瘍細胞上の抗原、例えば、上記腫瘍細胞上の抗原);(ii) PD-1ヒンジポリペプチド配列;(iii) PD-1膜貫通ドメイン;(iv) CD28共刺激性ドメイン;及び(v) CD3ζ細胞内シグナルドメインを含む。

0131

他の具体的な実施態様では、本明細書で提供されるポリペプチドは、N末端からC末端に向けて、順に:(i)リンカーによりVHに連結されるVLを含む、単鎖Fvドメイン、ここで、該VL及びVHは関心のある抗原に結合する抗体に由来する(例えば、腫瘍細胞上の抗原、例えば、上記腫瘍細胞上の抗原);(ii) CTLA4ヒンジポリペプチド配列;(iii) CTLA4膜貫通ドメイン;(iv) 4-1BB共刺激性ドメイン;及び(v) CD3ζ細胞内シグナルドメインを含む。

0132

他の具体的な実施態様では、該ポリペプチドは、N末端からC末端に向けて、順に:(i)リンカーによりVHに連結されるVLを含む、単鎖Fvドメイン、ここで、該VL及びVHは関心のある抗原に結合する抗体に由来する(例えば、腫瘍細胞上の抗原、例えば、上記腫瘍細胞上の抗原);(ii) CD28ヒンジポリペプチド配列;(iii) PD-1膜貫通ドメイン;(iv) 4-1BB共刺激性ドメイン;及び(v) CD3ζ細胞内シグナルドメインを含む。

0133

他の具体的な実施態様では、該ポリペプチドは、N末端からC末端に向けて、順に:(i)リンカーによりVHに連結されるVLを含む、単鎖Fvドメイン、ここで、該VL及びVHは関心のある抗原に結合する抗体に由来する(例えば、腫瘍細胞上の抗原、例えば、上記腫瘍細胞上の抗原);(ii) CTLA4ヒンジポリペプチド配列;(iii) PD-1膜貫通ドメイン;(iv) 4-1BB共刺激性ドメイン;及び(v) CD3ζ細胞内シグナルドメインを含む。

0134

他の具体的な実施態様では、該ポリペプチドは、N末端からC末端に向けて、順に:(i)リンカーによりVHに連結されるVLを含む、単鎖Fvドメイン、ここで、該VL及びVHは関心のある抗原に結合する抗体に由来する(例えば、腫瘍細胞上の抗原、例えば、上記腫瘍細胞上の抗原);(ii) PD-1ヒンジポリペプチド配列;(iii) CTLA4膜貫通ドメイン;(iv) 4-1BB共刺激性ドメイン;及び(v) CD3ζ細胞内シグナルドメインを含む。

0135

(5.1.単離ポリペプチド(キメラ抗原受容体))
CTLA4又はPD-1膜貫通ドメインを含む本明細書で提供されるTリンパ球刺激性ポリペプチドは、例えば、アシル化アミド化グリコシル化メチル化リン酸化硫酸化、SUMO化、ユビキチン化等により修飾され得る。該ポリペプチドは、検出可能なシグナルを提供することのできる標識、例えば、放射性同位体及び蛍光化合物により標識され得る。該第1又は第2ポリペプチドの1以上の側鎖は、例えば、リシン及びアミノ末端残基のコハク酸又は他の無水カルボン酸による誘導体化、又はメチルピコリンイミダートピリドキサールリン酸ピリドキサールクロボロヒドリドトリニトロベンゼンスルホン酸;O-メチルイソ尿素;2,4ペンタンジオン;及びグリオキシル酸を用いたトランスアミナーゼ触媒反応による誘導体化など、誘導体化され得る。カルボキシル側鎖、アスパルチル、又はグルタミルは、1-シクロヘキシル-3-(2-モルフォリニル-(4-エチル)カルボジイミド又は1-エチル-3-(4-アゾニア-4,4-ジメチルペンチル)カルボジイミドのようなカルボジイミド(R—N=C=N—R')による反応により選択的に修飾され得る。

0136

(5.2.単離核酸
本明細書で提供されるのは、本明細書で提供される1以上の該ポリペプチドをコードする核酸配列(ポリヌクレオチド)である。該ポリヌクレオチドは免疫細胞、例えばTリンパ球の形質転換に好適な任意のポリヌクレオチドベクターを含み得る。例えば、Tリンパ球は、該第1及び第2ポリペプチド(例えば、キメラ受容体)をコードするポリヌクレオチドを含む合成ベクターレンチウイルス又はレトロウイルスベクター自律複製プラスミドウイルス(例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、又はヘルペスウイルス)等を用いて形質転換することができる。Tリンパ球の形質転換に好適なレンチウイルスベクターは、限定はされないが、例えば、米国特許番号第5,994,136号;第6,165,782号;第6,428,953号;第7,083,981号;及び7,250,299号に記載される該レンチウイルスベクターを含み、これらの開示は、その全体が引用により本明細書に組み込まれる。Tリンパ球の形質転換に好適なHIVベクターは、限定はされないが、例えば、米国特許番号第5,665,577号に記載する該ベクターを含み、これらの開示は、その全体が引用により本明細書に組み込まれる。

0137

該第1及び第2ポリペプチドの産生に有用な核酸、例えば改変Tリンパ球内におけるものには、DNA、RNA、又は核酸アナログが含まれる。核酸アナログは塩基部分、糖部分、又はリン酸骨格を修飾することができ、デオキシチミジンに対するデオキシウリジンによる置換デオキシシチジンに対する5-メチル-2'-デオキシシチジン又は5-ブロモ-2'-デオキシシチジンによる置換を含み得る。糖部分の修飾は、リボース糖の2'ヒドロキシル基に2'-O-メチル又は2'O-アリル糖を形成させる修飾を含み得る。デオキシリボースリン酸骨格は修飾され、各々の塩基部分が6員のモルフォリノ環で連結されているモルフォリノ核酸、又はデオキシリン酸骨格が偽ペプチド骨格に置換され、かつ4種の塩基が保持されるペプチド核酸を生じ得る。例えば、Summerton及びWellerの文献(1997)Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 7: 187-195; 及びHyrupらの文献(1996)Bioorgan. Med. Chain. 4: 5-23を参照されたい。さらに、デオキシリン酸骨格は、例えば、ホスホロチオエート又はホスホジチオエート骨格、ホスホロアミダイト、又はアルキルホスホトリエステル骨格で置換され得る。

0138

(5.3.Tリンパ球)
本明細書で提供されるのは、本明細書で提供される該ポリペプチドを含む免疫細胞、例えばTリンパ球である。本明細書で提供される該Tリンパ球は、ナイーブT細胞又はMHCに拘束されるTリンパ球であり得る。特定の実施態様では、本明細書で提供される該Tリンパ球は腫瘍浸潤リンパ球(TIL)である。特定の実施態様では、本明細書で提供される該Tリンパ球は腫瘍生検から単離され、又は腫瘍生検から単離されたTリンパ球から拡張された。特定の他の実施態様では、本明細書で提供されるTリンパ球は末梢血臍帯血、又はリンパから拡張されたTリンパ球から単離され、又は拡張された。

0139

特定の実施態様では、本明細書で提供されるポリペプチドを含む本明細書で提供される該免疫細胞、例えば改変型Tリンパ球は、該改変型Tリンパ球が投与されるべき個体にとって自己由来である。特定の実施態様では、本明細書で提供される該改変型Tリンパ球は、改変型Tリンパ球が投与されるべき個体にとって同種異系である。改変型Tリンパ球の調製に同種異系のTリンパ球が使用される場合、Tリンパ球は個体における移植片対宿主病(GVHD)の可能性を減らすよう選択され得る。例えば、特定の実施態様では、ウイルス特異的Tリンパ球が改変型Tリンパ球の調製用に選択され得る。そのようなリンパ球は、任意の受容者の抗原に対して結合し、それにより活性化される固有能力が大きく低下していることが期待されるだろう。特定の実施態様では、受容者を介した同種異系Tリンパ球の拒絶反応は、1以上の免疫抑制剤、例えば、シクロスポリンタクロリムスシロリムスシクロホスファミド等を宿主に共投与することにより低減することができる。

0140

一実施態様では、Tリンパ球は個体から取得され、任意に拡張され、かつ続いて本明細書に記載されるCTLA4またはPD-1の膜貫通ドメインを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドで形質転換され、かつ任意に拡張される。他の実施態様では、Tリンパ球は個体から取得され、続いて任意に拡張され、かつ続いて本明細書に記載されるCTLA4又はPD-1の膜貫通ドメインを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドで形質転換され、かつ続いて任意に少なくとももう一度、拡張される。ポリヌクレオチドを含む細胞は選択マーカーを用いて選択され得る。

0141

特定の実施態様では、本明細書に記載される該改変型Tリンパ球は、該CTLA4又はPD-1の膜貫通ドメインを含むポリペプチドに加え、固有のTCRタンパク質、例えば、固有のTCR複合体を形成することのできるTCR-α及びTCR-βを発現し、又は含む。特定の他の実施態様では、該改変型Tリンパ球におけるTCR-α及びTCR-βをコードする固有の遺伝子のいずれか又は両方が、機能しなくなるように、例えば、一部またはすべてが欠失する、変異が挿入される等して改変される。

0142

特定の実施態様では、本明細書に記載される該Tリンパ球は腫瘍、例えば、腫瘍浸潤リンパ球から単離される;そのようなTリンパ球はTSA又はTAAに特異的であることが期待される。

0143

特定の実施態様では、該CTLA4又はPD-1の膜貫通ドメインを含むポリペプチド、例えば、CARのシグナルモチーフは、本明細書に記載される該改変型Tリンパ球の増殖及び拡張を促進するために使用することができる。例えば、非改変型Tリンパ球、及びCD3ζシグナルドメイン及びCD28共刺激性ドメインを含むポリペプチドを含むTリンパ球は、CD3及びCD28に対する抗体、例えばビーズ、又は細胞培養プレートの表面に付着させた抗体を用いることで拡張することができる;例えば、米国特許番号第5,948,893号;第6,534,055号;第6,352,694号;第6,692,964号;第6,887,466号;及び第6,905,681号を参照されたい。特定の実施態様では、該CTLA4又はPD-1の膜貫通ドメインを含むポリペプチドの該細胞外ドメインが結合する抗原は、該ポリペプチドを発現するTリンパ球の選択的拡張を促進するために使用することができる。例えば、該抗原がTSAである一実施態様では、該TSA、例えば、該TSAの可溶形態の存在時に培養される該ポリペプチドを含むTリンパ球は、該TSAの不存在時の培養と比較して、より高い増殖性につながる。

0144

特定の実施態様では、本明細書に記載されるCTLA4又はPD-1の膜貫通ドメインを含むポリペプチドを含むTリンパ球は、該ポリペプチドの該細胞外抗原結合ドメインにより結合することのできる該抗原と結合した該ポリペプチド上のシグナルドメインに結合する抗体を用いて刺激され、増殖する。例えば、該ポリペプチドのシグナルドメインがCD3ζであり、かつ該ポリペプチドに結合する該抗原がTSAである実施態様では、該ポリペプチドを含むTリンパ球は該TSA(例えば、該TSAの可溶形態)の存在時にCD3ζに結合する抗体と組み合わせて細胞を培養することにより、刺激され、増殖する。

0145

上記実施態様のいずれにおいても、該抗原及び/又は抗体は培養されているものがTリンパ球である培地中に遊離して存在することができ、又はいずれか一方、若しくは両方とも固体支持体、例えば、組織培養プラスチック表面、ビーズ等に付着することができる。

0146

本明細書に記載されるCTLA4又はPD-1の膜貫通ドメインを含むポリぺプチドを含むTリンパ球は、望む時に全ての、又は実質的に全てのTリンパ球を殺すことを可能とする「自殺遺伝子」又は「安全スイッチ」を任意に含むことができる。例えば、本明細書に記載される改変型Tリンパ球は、特定の実施態様では、ガンシクロビルとの接触により該改変型Tリンパ球の死をもたらすHSVチミジンキナーゼ遺伝子(HSV-TK)を含むことができる。他の実施態様では、該改変型Tリンパ球は誘導性カスパーゼ、例えば、誘導性カスパーゼ9(icaspase9)、例えば、特定の小分子医薬を用いて二量体化させることのできるカスパーゼ9及びヒトFK506結合タンパク質間の融合タンパク質を発現する、又は含む。Straathofらの文献、Blood 105(11):4247-4254 (2005)を参照されたい。

0147

(5.4.改変型Tリンパ球の使用方法
CTLA4又はPD-1の膜貫通ドメインを含むポリペプチド、例えば、CARを含む本明細書で提供される該改変型免疫細胞、例えば、該改変型Tリンパ球は、Tリンパ球の標的となることが望まれる1以上の細胞種、例えば、1以上の殺すべき細胞種を有する個体を治療するために使用することができる。特定の実施態様では、殺すべき細胞は癌細胞、例えば、腫瘍細胞である。特定の実施態様では、該癌細胞は固形腫瘍の細胞である。特定の実施態様では、該細胞はリンパ腫、肺癌、乳癌、前立腺癌、副腎皮質癌、甲状腺癌、鼻咽頭癌、メラノーマ、例えば悪性メラノーマ、皮膚癌、結腸癌、類腱腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、内分泌腫瘍、ユーイング肉腫、末梢性原始神経外胚葉腫瘍、固形胚細胞腫瘍、肝芽細胞腫、神経芽細胞腫、非横紋筋肉腫性軟部組織肉腫、骨肉腫、網膜芽腫、横紋筋肉腫、ウィルムス腫瘍、神経膠芽細胞腫、粘液腫、線維腫、脂肪腫等である。より具体的な実施態様では、該リンパ腫は、慢性リンパ性白血病(小型リンパ性リンパ腫)、B細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、脾臓周辺帯リンパ腫、形質細胞性骨髄腫、形質細胞腫、節外周辺帯B細胞リンパ腫、MALTリンパ腫、節周辺帯B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、縦隔(胸腺)大細胞型B細胞リンパ腫、血管内大細胞型B細胞リンパ腫、原発性滲出液リンパ腫、バーキットリンパ腫、Tリンパ球前リンパ球性白血病、Tリンパ球大型顆粒リンパ球性白血病、侵攻性NK細胞白血病、成人Tリンパ球白血病/リンパ腫、節外性NK/Tリンパ球リンパ腫、鼻型、腸疾患型Tリンパ球リンパ腫、肝脾Tリンパ球リンパ腫、芽球性NK細胞リンパ腫、菌状息肉腫、セザリー症候群、原発性皮膚未分化大細胞リンパ腫、リンパ腫様丘疹症、血管免疫芽球性Tリンパ球リンパ腫、末梢性Tリンパ球リンパ腫(不特定)、未分化大細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、又は非ホジキンリンパ腫の細胞であり得る。

0148

本明細書に記載された該改変型Tリンパ球の効力は、Tリンパ球により治療できる疾病又は疾患を有する個体、例えば、癌を有する個体への投与後、特定の疾病又は疾患に特異的な1以上の基準であって、当業者に公知であり、疾病又は疾患の進行を示すものにより評価することができる。一般に、本明細書に記載された該改変型Tリンパ球のそのような固体への投与は、1以上の該基準が、検出可能な程度に、例えば、有意に、病的状態の値又は範囲から、正常な値又は範囲へと、又はそれに向かって動くときに、有効である。

0149

本明細書に記載される該改変型Tリンパ球は、任意の医薬として許容し得る溶液中に、好ましくは、生細胞送達に好適な溶液、例えば、生理食塩溶液リンガー溶液等)、ゼラチン、糖(例えば、乳糖アミロースデンプン等)、脂肪酸エステルヒドロキシメチルセルロースポリビニルピロリドン等の中に、製剤化することができる。そのような調製物は、好ましくは該改変型Tリンパ球の追加に先立って滅菌され、滑剤保存料、安定剤、乳化剤浸透圧に影響する塩、緩衝液、及び着色料のような補助物質と混合され得る。該改変型Tリンパ球の製剤化に使用するのに好適な医薬担体は、当該分野で公知であり、例えば、WO 96/05309に記載されている。

0150

特定の実施態様では、本明細書に記載される該改変型Tリンパ球は、個別の用量へと製剤化され、ここで、該個別の用量は、少なくとも、最大でも、又は約1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、又は1×1011個の改変型Tリンパ球を含む。特定の実施態様では、該改変型Tリンパ球は、静脈内、動脈内、非経口的、筋肉内、皮下、髄膜内、若しくは眼球内投与、又は特定の器官若しくは組織内への投与のために製剤化される。

0151

(6.実施例)
(6.1.実施例1:B細胞リンパ腫の治療)
個体はB細胞慢性リンパ球性白血病、B細胞リンパ腫を提示する。該個体由来のB細胞の試験から、該B細胞が17pの欠失を保有することが決定される。Tリンパ球は該個体から取得され、キメラ抗原受容体(CAR)をコードするヌクレオチド配列を含むレンチウイルスベクターを用いて遺伝子導入され、かつ投与に十分な数までCD3+CD28-コートしたビーズを用いて拡張される。該キメラ受容体はCD19に結合する細胞外抗原結合領域;CTLA4由来の膜貫通ドメイン;CD28由来の細胞内共刺激性ドメイン;及びCD3ζの細胞内ドメインを含む。該個体は200 mlの生理食塩溶液中の109から1010個の該Tリンパ球を、30分にわたって静脈内注入により投与される。該個体は、その後2週間モニターされ、該個体血液中のCD19+ B細胞の少なくとも90%減少が成立する。

0152

(6.2.実施例2:B細胞リンパ腫の治療)
個体はB細胞慢性リンパ球性白血病、B細胞リンパ腫を提示する。該個体由来のB細胞の試験から、該B細胞が17pの欠失を保有することが決定される。約106個のTリンパ球が該個体から取得され、CARをコードするヌクレオチド配列を含むレンチウイルスベクターを遺伝子導入される。該CARは、CD19に結合する細胞外抗原結合領域;PD-1に由来する膜貫通ドメイン;CD28に由来する細胞内共刺激性ドメイン;及び細胞内CD3ζドメインを含む。CARを発現するT細胞は、事前に該T細胞を拡張させることなく該個体に投与する。該個体は200 mlの生理食塩溶液中の105から106個の該Tリンパ球を、30分にわたって静脈内注入により投与される。該個体はその後2週間モニターされ、該個体血液中のCD19+ B細胞の少なくとも90%減少が成立する。

0153

(6.3.実施例3:B細胞リンパ腫の治療)
個体はB細胞慢性リンパ球性白血病、B細胞リンパ腫を提示する。該個体由来のB細胞の試験から、該B細胞がp53の欠失を保有することが決定される。Tリンパ球は該個体から取得され、CARをコードするヌクレオチド配列を含むレンチウイルスベクターを遺伝子導入され、かつ投与に十分な数までCD3+CD28-コートしたビーズを用いて拡張される。該CARはCD19に結合する細胞外抗原結合領域;CTLA4由来の膜貫通ドメイン;CD28、4-1BB、及びOX40のそれぞれに由来する細胞内共刺激性ドメイン;及び細胞内CD3ζドメインを含む。該個体は200 mlの生理食塩溶液中の109から1010個の該Tリンパ球を、30分にわたって静脈内注入により投与される。該個体はその後2週間モニターされ、該個体血液中のCD19+ B細胞の少なくとも90%減少が成立する。
(6.4.実施例4:B細胞リンパ腫の治療)
個体はB細胞慢性リンパ球性白血病、B細胞リンパ腫を提示する。該個体由来のB細胞の試験から、該B細胞がp53の欠失を保有することが決定される。約106個のTリンパ球は該個体から取得され、CARをコードするヌクレオチド配列を含むレンチウイルスベクターを遺伝子導入される。該CARはCD19に結合する細胞外抗原結合領域;PD-1由来の膜貫通ドメイン;CD28、4-1BB、及びOX40のそれぞれに由来する細胞内共刺激性ドメイン;及び細胞内CD3ζドメインを含む。CARを発現するT細胞は、事前に該T細胞を拡張させることなく該個体に投与した。該個体は200 mlの生理食塩溶液中の105から106個の該Tリンパ球を、30分にわたって静脈内注入により投与される。該個体はその後2週間モニターされ、該個体血液中のCD19+ B細胞の少なくとも90%減少が成立する。

0154

(6.5.実施例5:前立腺癌の治療)
個体は、領域に又は他のリンパ節に拡がっていない(N0、M0)、ステージT2の前立腺癌を提示する。組織学的な等級はG2であると決定される。全体的に、該個体はステージI1の前立腺癌を有すると決定される。該個体は200 mlの生理食塩溶液中の109から1010個のCARを含む改変型Tリンパ球を、30分にわたって静脈内注入により投与される。該CARはPSCAに結合する細胞外抗原結合領域、CTLA4由来の膜貫通ドメイン、CD28由来の細胞内共刺激性ドメイン、及び細胞内CD3ζドメインを含む。該個体は投与から30日、60日、及び90日後に、前立腺癌ステージ及びリンパ節への転移再評価され、かつ生検とされた前立腺組織の組織学分析が行われる。

0155

(6.6. 実施例6:前立腺癌の治療)
個体は、領域に又は他のリンパ節に拡がっていない(N0、M0)、ステージT2の前立腺癌を提示する。組織学的な等級はG2であると決定される。全体的に、該個体はステージI1の前立腺癌を有すると決定される。該個体は200 mlの生理食塩溶液中の109から1010個のCARを含む改変型Tリンパ球を、30分にわたって静脈内注入により投与される。該CARはPSCAに結合する細胞外抗原結合領域、PD-1由来の膜貫通ドメイン、CD28由来の細胞内共刺激性ドメイン、及び細胞内CD3ζドメインを含む。該個体は投与から30日、60日、及び90日後に、前立腺癌ステージ及びリンパ節への転移を再評価され、かつ生検とされた前立腺組織の組織学分析が行われる。

0156

(6.7.実施例7:前立腺癌の治療)
個体は、領域に又は他のリンパ節に拡がっていない(N0、M0)、ステージT2の前立腺癌を提示する。組織学的な等級はG2であると決定される。全体的に、該個体はステージI1の前立腺癌を有すると決定される。該個体は200 mlの生理食塩溶液中の109から1010個のCARを含む改変型Tリンパ球を、30分にわたって静脈内注入により投与される。該CARはPSCAに結合する細胞外抗原結合領域、CTLA-4由来の膜貫通ドメイン、CD28、4-1BB、及びOX40のそれぞれに由来する細胞内共刺激性ドメイン、及び細胞内CD3ζドメインを含む。該個体は投与から30日、60日、及び90日後に、前立腺癌ステージ及びリンパ節への転移を再評価され、かつ生検とされた前立腺組織の組織学分析が行われる。

0157

(6.8.実施例8:前立腺癌の治療)
個体は、領域に又は他のリンパ節に拡がっていない(N0、M0)、ステージT2の前立腺癌を提示する。組織学的な等級はG2であると決定される。全体的に、該個体はステージI1の前立腺癌を有すると決定される。該個体は200 mlの生理食塩溶液中の109から1010個のCARを含む改変型Tリンパ球を、30分にわたって静脈内注入により投与される。該CARはPSCAに結合する細胞外抗原結合領域、PD-1由来の膜貫通ドメイン、CD28、4-1BB、及びOX40のそれぞれに由来する細胞内共刺激性ドメイン、及び細胞内CD3ζドメインを含む。該個体は投与から30日、60日、及び90日後に、前立腺癌ステージ及びリンパ節への転移を再評価され、かつ生検とされた前立腺組織の組織学分析が行われる。

0158

(6.9.実施例9:CTLA-4又はPD-1の膜貫通ドメインを含むCAR)
本実施例は、CTLA-4又はPD-1の膜貫通ドメインを含むキメラ抗原受容体がT細胞中で機能的で、活性があることを示す。

0159

(6.9.1 CTLA-4の膜貫通ドメインを含むCAR)
抗原HER2と結合する細胞外ドメイン(抗HER2 scFV)を含むCARを作製した。具体的に、以下のCARが作製された:(i) 抗HER2 scFV、CD28膜貫通ドメイン、及びCD3ζ細胞内ドメインを含むHER-28TMζ;(ii) 抗HER2 scFV、CD28膜貫通ドメイン、及びCD28-CD3ζ細胞内ドメインを含むHER-28TM28ζ;(iii) 抗HER2 scFV、CH2CH3ヒンジ、CTLA-4膜貫通ドメイン(配列番号:10)、及びCD28-CD3ζ細胞内ドメインを含むHER2-CTLA4TM28ζ;及び(iv) 抗HER2 scFV、CD8ヒンジ、4-1BB膜貫通ドメイン、及びCD28-CD3ζ細胞内ドメインを含むHER2-41BBTM28ζ。

0160

ヒトT細胞の上記CARを発現する能力を評価した。汎T細胞及びナイーブ汎T細胞をそれぞれhuman Pan T isolation Kit II及びhuman naive Pan T isolation kit(Miltenyi、Cambridge、MA)を用いた負の選択によりドナーサンプル血液のバフィーコートから単離された。単離されたT細胞は10 ng/mlIL-7の存在下RPMI完全培地中で11日間培養し、続いてMOI5でCARコンストラクトを発現するレンチウイルスにより伝達された。

0161

伝達から3日後、CAR T細胞の表現型は、該細胞をHER2-Fc融合タンパク質(R&D Systems、Minneapolis、MN)で染色し、続いてFITC又はAPCと結合したポリクローナルヤギ抗ヒトIgG-Fc抗体(Jackson ImmunoResearch、West Grove、PA)で染色することにより、特徴づけた。同日に、T細胞は、0.25 μg/mlから1 μg/mlの範囲の勾配のついた濃度のHER2-Fc融合タンパク質で刺激された。上清サイトメトリックビーズアレイ(CBA)分析のために刺激後48時間に回収し、特製のCBA flex set(BD Biosciences、San Jose、CA)を使用して該T細胞によるサイトカイン産生を評価した。上清除去の後の培養物由来の細胞を、蛍光色素結合抗ヒトモノクローナル抗体(BD Biosciences)を使用して、T細胞活性化の表面マーカーCD69、4-1BB、CD71、HLA-DR、及びCD25の測定のために染色した。CBA及び表面マーカーの両方に対するフローサイトメトリー分析は、FACSCanto II装置上で行い、データはFACSDivaソフトウェア(BD Biosciences)を用いて取得した。該CBAデータをFCAPアッセイソフトウェア(Soft Flow Ltd.、Pecs、Hungary)によって解析した。表面マーカーのフローデータはFlowJoフローサイトメトリーソフトウェア(Tree Star、Ashland、OR)を使用して解析した。

0162

図1に示すように、作製されたCARの内、CTLA-4の膜貫通ドメインを有するCARを含む3つが、該T細胞に高発現していた。T細胞活性化の表面マーカーであるCD69、4-1BB、及びHLA-DRはそれぞれCARの結合により、すなわち、CAR T細胞がHER2-Fc融合タンパク質により刺激されたときに上方調節された。各々のケースのうち、最も高い水準は、HER2-CTLA4TM28ζのコンストラクトを発現するCAR T細胞において観察された。

0163

図2〜4に示すように、4セットのCAR T細胞のうち、2つはHER2刺激に応答してサイトカイン産生を示した。具体的には、HER2-28TM28ζと名付けられたCARを発現するT細胞及びHER2-CTLA4TM28ζと名付けられたCARを発現するT細胞は、サイトカインのインターロイキン-2(IL-2)(図2)、GM-CSF(図3)、及びインターフェロン-ガンマ(IFN-γ)(図4)を、HER2刺激への応答において、用量依存的な様式で産生した。驚くべきことに、通常は抑制性シグナルを免疫系細胞に伝達するタンパク質に由来する膜貫通ドメイン(すなわち、CTLA-4の膜貫通ドメイン)を含むCARを発現するT細胞は、HER2-28TM28ζと名付けられたCARを発現するT細胞を含む、他のCARのそれぞれを発現するT細胞と比較して、それぞれのサイトカインをずっと高水準に産生した。図2〜4を参照されたい。

0164

上記CARを発現するT細胞をHER2で刺激することにより、T細胞による細胞内腫瘍壊死因子-アルファ(TNF-α)の産生が誘導されるか否かをさらに調べた。CAR T細胞はIL-2(50 IU/ml)を含む培地中で2日間HER2-Fc(1 μg/ml)により刺激された。HER2刺激は、各回ごとに7日間の間隔を入れてさらに2回行われた。3回目の刺激の後、細胞内TNF-αをフローサイトメトリーで調べた。図5に示すように、HER2-28TM28ζと名付けられたCARを発現するT細胞、HER2-CTLA4TM28ζと名付けられたCARを発現するT細胞、及びHER2-28TMζと名付けられたCARを発現するT細胞はTNF-αを産生し、通常は抑制性シグナルを免疫系細胞に伝達するタンパク質に由来する膜貫通ドメイン(すなわち、CTLA-4の膜貫通ドメイン)を含むCARを発現するT細胞が最も多量のTNF-αを産生した。

0165

最後に、上記CARを発現するT細胞のHER2による刺激が、CAR T細胞群濃縮に帰結するかどうかを決定した。上記CARを発現するCAR T細胞をHER2-Fc融合タンパク質で刺激した。HER2による刺激から13日後、CAR T細胞を上記のようにフローサイトメトリーで分析した。驚くべきことに、図6に示すように、HER2-CTLA4TM28ζと名付けられたCARを発現するCAR T細胞のみがHER2刺激後に濃縮された。

0166

(6.9.2 PD-1又はCTLA-4の膜貫通ドメインを含むCAR)
本実施例はCTLA-4の膜貫通ドメイン又はPD-1の膜貫通ドメインを含むキメラ抗原受容体がT細胞中で機能的で、活性を示すことを示す。

0167

抗原HER2に結合する細胞外ドメイン(抗HER2 scFV)を含むCARを作製した。具体的には、以下のCARが作製された:(i) 抗HER2 scFV、CH2CH3ヒンジ、PD-1膜貫通ドメイン(配列番号:11)、及びCD28-CD3細胞内ドメインを含む、HER-PD1TM-CD28-CD3;(ii) 抗HER2 scFV、CD28ヒンジ、CTLA-4膜貫通ドメイン(配列番号:10)、及び4-1BB-CD3細胞内ドメインを含むHER-CTLA4(189)TM-41BB-CD3;(iii) 抗HER2 scFV、CD28ヒンジ、PD-1膜貫通ドメイン(配列番号:11)、及び4-1BB-CD3細胞内ドメインを含むHER-PD1TM-41BB-CD3;及び(iv) 抗HER2 scFV、CD28ヒンジ、CD28膜貫通ドメイン、及びCD28-CD3細胞内ドメインを含むHER2-CD28TM-CD28-CD3。

0168

汎T細胞及びナイーブ汎T細胞は、それぞれhuman Pan T isolation Kit II及びhuman naive Pan T isolation kit(Miltenyi、Cambridge、MA)を使用した負の選択により、ドナーサンプル血液のバフィーコートから単離された。単離T細胞を10 ng/mlIL-7の存在下RPMI完全培地中で11日間培養し、続いてMOI7のCARコンストラクトを発現するレンチウイルスで伝達した。

0169

伝達から3日後、CAR T細胞の表現型は該細胞をHER2-Fc融合タンパク質(R&D Systems、Minneapolis、MN)で染色し、続いてFITC又はAPCと結合したポリクローナルヤギ抗ヒトIgG-Fc抗体(Jackson ImmunoResearch、West Grove、PA)で染色することにより、特徴づけた。同日に、T細胞は、0.25 μg/mlから1 μg/mlの範囲の勾配のついた濃度のHER2-Fc融合タンパク質で刺激された。上清をサイトメトリックビーズアレイ(CBA)分析のために刺激後48時間に回収し、特製のCBA flex set(BD Biosciences、San Jose、CA)を使用して該T細胞によるサイトカイン産生を評価した。上清除去の後の培養物由来の細胞を、蛍光色素結合抗ヒトモノクローナル抗体(BD Biosciences)を使用して、T細胞活性化の表面マーカーCD69、4-1BB、CD71、HLA-DR、及びCD25の測定のために染色した。CBA及び表面マーカーの両方に対するフローサイトメトリー分析は、FACSCanto II装置上で行い、データはFACSDivaソフトウェア(BD Biosciences)を用いて取得した。該CBAデータをFCAPアッセイソフトウェア(Soft Flow Ltd.、Pecs、Hungary)によって解析した。表面マーカーのフローデータはFlowJoフローサイトメトリーソフトウェア(Tree Star、Ashland、OR)を使用して解析した。

0170

図7に示すように、作製されたCARのそれぞれは、T細胞に高発現していた。T細胞活性化の表面マーカーであるCD69、CD71、及びHLA-DRのそれぞれは、上記CAR T細胞のHER2による刺激により上方調節された。それぞれのケースで、上方調節の観察される水準は、PD-1又はCTLA-4のいずれかの膜貫通ドメインを有するCARを発現するCAR T細胞で、最高であった。

0171

図8〜9に示すように、CAR T細胞はHER2刺激に応答してサイトカイン産生を示した。具体的には、上記CARを発現するT細胞はサイトカインのIL-2(図8)、TNF-α(図8)、及びIFN-γ(図8)、GM-CSF(図9)グランザイムB(図9)、及びIL-13(図9)を、HER2刺激に応答して用量依存的な様式で産生した。それぞれのケースで、PD-1又はCTLA-4の膜貫通ドメインを含むCARを発現するT細胞が、最も高い水準のサイトカイン産生を示し、HER-PD1TM-CD28-CD3と名付けられたCARを発現するT細胞が一貫してそれぞれのサイトカインを最も高い水準で産生した(図8及び9を参照されたい)。

0172

最後に、上記CARを発現するT細胞のHER2による刺激がCAR T細胞群の濃縮に帰結するかどうかを決定した。上記CARを発現するCAR T細胞をHER2-Fc融合タンパク質で刺激した。HER2による刺激から11日後、CAR T細胞を上記のようにフローサイトメトリーで分析した。図10に示すように、HER-PD1TM-CD28-CD3と名付けられたCARを発現するCAR T細胞はHER2刺激後に濃縮され、記載された他のCARを発現するT細胞は、初めの細胞数に対して緩い水準の生細胞の増加を示した。

0173

(6.9.3結論
結論として、通常は抑制性シグナルを免疫系細胞に伝達する、タンパク質に由来する膜貫通ドメインを含むCARを発現するT細胞の作製を示した。さらに、そのようなCAR T細胞は驚くべき特性を有することが示された。特に、そのようなT細胞は、(i) それらが発現するCARの細胞外ドメインが方向づけられる抗原による刺激に応答して、通常は刺激性シグナルを免疫系細胞に伝達するタンパク質に由来する膜貫通ドメインを含むCARを発現するT細胞よりも、高水準のサイトカイン産生を示し;かつ(ii) それらが発現するCARの、細胞外ドメインが方向づけられる抗原の存在下、培養されたときに濃縮される。一方で、通常は刺激性シグナルを免疫系細胞に伝達するタンパク質に由来する、膜貫通ドメインを含むCARを発現するT細胞は、抗原に刺激されたときには同程度には濃縮されない。

0174

等価物
本開示は本明細書に記載される具体的な実施態様により範囲を限定されない。実に、本明細書で提供される主題事項の様々な改変は、記載されているものに加え、先行の記述から当業者には明らかとなるであろう。そのような改変は添付された特許請求の範囲内に位置付けられるよう意図されている。

実施例

0175

様々な刊行物、特許、及び特許出願が本明細書中に引用され、それらの開示は、その全てが引用により組み込まれている。

ページトップへ

この技術を出願した法人

この技術を発明した人物

ページトップへ

関連する挑戦したい社会課題

関連する公募課題

該当するデータがありません

ページトップへ

技術視点だけで見ていませんか?

この技術の活用可能性がある分野

分野別動向を把握したい方- 事業化視点で見る -

(分野番号表示ON)※整理標準化データをもとに当社作成

ページトップへ

新着 最近 公開された関連が強い 技術

  • DR.C医薬株式会社の「 医薬製剤及び医療器具」が 公開されました。( 2018/12/06)

    【課題・解決手段】本発明は、鼻腔内粘膜に投与される医薬製剤を提供することを課題とし、かかる課題を解決するために、本発明は、鼻腔内粘膜に投与される医薬製剤であって、1個以上の酸化チタン粒子と、1個以上の... 詳細

  • 株式会社友愈の「 よもぎ蒸し組成物」が 公開されました。( 2018/11/29)

    【課題】漢方薬として一般的に用いられている生薬以外の成分を患者の体質に合わせて用いたよもぎ蒸し組成物を提供する。【解決手段】たんぽぽの花(タンポポノハナ)と、松かさ(マツカサ)と、落花生の殻(ラッカセ... 詳細

  • タカラバイオ株式会社の「 内皮細胞の製造方法」が 公開されました。( 2018/11/29)

    【課題・解決手段】本発明は、(a)多能性幹細胞より、胚様体が形成されることなく、内皮前駆細胞を含有する中胚葉系細胞集団を誘導する工程、及び(b)内皮前駆細胞を含有する中胚葉系細胞集団をRepSoxの存... 詳細

この 技術と関連性が強い人物

関連性が強い人物一覧

この 技術と関連する挑戦したい社会課題

関連する挑戦したい社会課題一覧

この 技術と関連する公募課題

該当するデータがありません

astavision 新着記事

サイト情報について

本サービスは、国が公開している情報(公開特許公報、特許整理標準化データ等)を元に構成されています。出典元のデータには一部間違いやノイズがあり、情報の正確さについては保証致しかねます。また一時的に、各データの収録範囲や更新周期によって、一部の情報が正しく表示されないことがございます。当サイトの情報を元にした諸問題、不利益等について当方は何ら責任を負いかねることを予めご承知おきのほど宜しくお願い申し上げます。

主たる情報の出典

特許情報…特許整理標準化データ(XML編)、公開特許公報、特許公報、審決公報、Patent Map Guidance System データ