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技術 PCSK9iRNA組成物及びその使用方法

出願人 アルナイラムファーマシューティカルズ,インコーポレイテッド
発明者 アナ・ボロドフスキーラジーブ・ジー・カラントッタティルケビン・フィッツジェラルドマリア・フランク-カメネツキーウィリアム・クアーベスマルティン・マイアークラウス・カリセサティアナラヤーナ・クチマンチムティア・マノハランスチュアート・ミルスタイン
出願日 2013年12月5日 (6年2ヶ月経過) 出願番号 2015-545846
公開日 2016年3月3日 (3年11ヶ月経過) 公開番号 2016-506240
状態 不明
技術分野
  • -
主要キーワード 構造規制 吸収ベース 維持段階 タクソン 白みがかった アルカリ金属アルキル硫酸塩 参照文 医療介護提供者
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課題・解決手段

本発明は、PCSK9遺伝子を標的とするRNAi剤、例えば、二本鎖RNAi剤、及びPCSK9の発現阻害するためのこのようなRNAi剤の使用方法及び高脂血症などの脂質障害罹患している対象の処置方法に関する。

概要

背景

プロタンパク質転換酵素サブチリシンケキシン9(PCSK9)は、サブチリシンセリンプロテアーゼファミリーメンバーである。他の8つの哺乳動物サブチリシンプロテアーゼ、PCSK1−PCSK8(PC1/3、PC2、フーリン、PC4、PC5/6、PACE4、PC7、及びS1P/SKI−1とも呼ばれる)は、分泌経路において様々なタンパク質プロセシングし、多様な生物学的過程において役割を果たすプロタンパク質転換酵素である(非特許文献1、非特許文献2、非特許文献3、非特許文献4、及び非特許文献5)。

PCSK9は、コレステロール代謝において役割を果たすことが提案されている。PCSK9mRNA発現は、コレステロール生合成酵素及び低比重リポタンパク質受容体(LDLR)と同様に、マウスにおいて食事性コレステロール摂食によって下方制御され(非特許文献6)、HepG2細胞においてスタチンによって上方制御され(非特許文献7)、ステロール調節要素結合タンパク質(SREBP)トランスジェニックマウスにおいて上方制御される(非特許文献8)。更に、PCSK9ミスセンス突然変異が、常染色優性高コレステロール血症の一形態(Hchola3)と関連していることが分かっている(非特許文献9、非特許文献10、非特許文献11)。一塩基多型(SNP)が、日本人集団コレステロールレベルに関連しているため、PCSK9は、一般集団LDLコレステロールベルを決定する役割も果たし得る(非特許文献12)。

常染色優性高コレステロール血症(ADH)は、患者が、総コレステロール及びLDLコレステロールレベルの上昇、黄色腫、及び早期のアテローム性動脈硬化症を示す単一遺伝子疾患である(非特許文献13)。ADH及び劣性型常染色体劣性高コレステロール血症(ARH)(非特許文献14)の病因は、肝臓によるLDL取り込みの欠陥によるものである。ADHは、LDL取り込みを防止する、LDLR突然変異によって、又はLDLRに結合するLDL上のタンパク質である、アポリポタンパク質Bの突然変異によって引き起こされ得る。ARHは、クラスリンとのその相互作用を介したLDLR−LDL複合体のエンドサイトーシスに必要なARHタンパク質の突然変異によって引き起こされる。したがって、PCSK9突然変異が、Hchola3ファミリーにおいて原因である場合、PCSK9が、受容体を介したLDL取り込みにおいて役割を果たす可能性が高いと考えられる。

過剰発現の研究は、LDLRレベル、ひいては、肝臓によるLDL取り込みを制御するPCSK9の役割を指摘している(非特許文献15、非特許文献16、非特許文献17)。マウスにおける3日間又は4日間のマウス又はヒトPCSK9のアデノウイルス媒介性過剰発現は、総コレステロール及びLDLコレステロールレベルの上昇をもたらし;この効果は、LDLRノックアウト動物では見られない(非特許文献15、非特許文献16、非特許文献17)。更に、PCSK9過剰発現は、LDLRmRNAレベル、SREBPタンパク質レベル、又はSREBPタンパク質核対細胞質比に影響を及ぼさずに、肝臓LDLRタンパク質の著しい減少をもたらす。

高コレステロール血症自体は無症候性であるが、血清コレステロールの長期にわたる上昇が、アテローム性動脈硬化症につながり得る。何十年にわたって、慢性的に上昇した血清コレステロールは、動脈中の粥状の形成の原因となり、これが、病変動脈の進行性狭窄又は更には完全な閉塞につながり得る。更に、より小さい斑が破裂して、凝血塊を形成させ、血流を妨げて、例えば、心筋梗塞及び/又は卒中をもたらし得る。狭窄又は閉塞の形成が漸進的である場合、組織及び器官への血液供給は、器官の機能が損なわれるまで、ゆっくりと減少する。

概要

本発明は、PCSK9遺伝子を標的とするRNAi剤、例えば、二本鎖RNAi剤、及びPCSK9の発現阻害するためのこのようなRNAi剤の使用方法及び高脂血症などの脂質障害罹患している対象の処置方法に関する。

目的

本発明は、細胞内でのプロタンパク質転換酵素サブチリシンケキシン9(PCSK9)の発現を阻害することが可能なRNAi剤、例えば、二本鎖RNAi剤であって、二本鎖RNAi剤が、アンチセンス鎖相補的センス鎖を含み、アンチセンス鎖が、PCSK9をコードするmRNAの一部に相補的な領域を含み、各鎖が、約14〜約30ヌクレオチド長であり、二本鎖RNAi剤が、式(III):
センス:5’np−Na−(XXX)i−Nb−YYY−Nb−(ZZZ)j−Na−nq3’
アンチセンス:3’np’−Na’−(X’X’X’)k−Nb’−Y’Y’Y’−Nb’−(Z’Z’Z’)l−Na’−nq’5’(III)
(式中:
i、j、k、及びlがそれぞれ、独立して、0又は1であり;
p、p’、q、及びq’がそれぞれ、独立して、0〜6であり;
各Na及びNa’が、独立して、修飾又は非修飾のいずれかの0〜25のヌクレオチド又はそれらの組合せを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列が、少なくとも2つの異なる修飾のヌクレオチドを含み;
各Nb及びNb’が、独立して、修飾又は非修飾のいずれかの0〜10のヌクレオチド又はそれらの組合せを含むオリゴヌクレオチド配列を表し;
それぞれ存在していても又は存在していなくてもよい各np、np’、nq、及びnq’が、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し;
XXX、YYY、ZZZ、X’X’X’、Y’Y’Y’、及びZ’Z’Z’がそれぞれ、独立して、3連続ヌクレオチド上の3つの同一の修飾の1つのモチーフを表し;
Nb上の修飾が、Y上の修飾と異なり、Nb’上の修飾が、Y’上の修飾と異なり;
センス鎖が、少なくとも1つのリガンドコンジュゲートされている)
によって表される二本鎖RNAi剤を提供する

効果

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請求項1

細胞内でのプロタンパク質転換酵素サブチリシンケキシン9(PCSK9)の発現阻害することが可能な二本鎖RNAi剤であって、前記二本鎖RNAi剤が、アンチセンス鎖相補的センス鎖を含み、前記アンチセンス鎖が、PCSK9をコードするmRNAの一部に相補的な領域を含み、各鎖が、約14〜約30ヌクレオチド長であり、前記二本鎖RNAi剤が、式(III):センス:5’np−Na−(XXX)i−Nb−YYY−Nb−(ZZZ)j−Na−nq3’アンチセンス:3’np’−Na’−(X’X’X’)k−Nb’−Y’Y’Y’−Nb’−(Z’Z’Z’)l−Na’−nq’5’(III)(式中:i、j、k、及びlがそれぞれ、独立して、0又は1であり;p、p’、q、及びq’がそれぞれ、独立して、0〜6であり;各Na及びNa’が、独立して、修飾又は非修飾のいずれかの0〜25のヌクレオチド又はそれらの組合せを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列が、少なくとも2つの異なる修飾のヌクレオチドを含み;各Nb及びNb’が、独立して、修飾又は非修飾のいずれかの0〜10のヌクレオチド又はそれらの組合せを含むオリゴヌクレオチド配列を表し;それぞれ存在していても又は存在していなくてもよい各np、np’、nq、及びnq’が、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し;XXX、YYY、ZZZ、X’X’X’、Y’Y’Y’、及びZ’Z’Z’がそれぞれ、独立して、3連続ヌクレオチド上に3つの同一の修飾の1つのモチーフを表し;Nb上の修飾が、Y上の前記修飾と異なり、Nb’上の修飾が、Y’上の前記修飾と異なり;前記センス鎖が、少なくとも1つのリガンドコンジュゲートされている)によって表される二本鎖RNAi剤。

請求項2

iが0であり;jが0であり;iが1であり;jが1であり;i及びjの両方が0であり;又はi及びjの両方が1である、請求項1に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項3

kが0であり;lが0であり;kが1であり;lが1であり;k及びlの両方が0であり;又はk及びlの両方が1である、請求項1に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項4

XXXが、X’X’X’に相補的であり、YYYが、Y’Y’Y’に相補的であり、ZZZが、Z’Z’Z’に相補的である、請求項1に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項5

前記YYYモチーフが、前記センス鎖の切断部位又はその近傍に存在する、請求項1に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項6

前記Y’Y’Y’モチーフが、前記5’末端の前記アンチセンス鎖の11位、12位及び13位に存在する、請求項1に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項7

前記Y’が、2’−O−メチルである、請求項6に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項8

式(III)が、式(IIIa):センス:5’np−Na−YYY−Na−nq3’アンチセンス:3’np’−Na’−Y’Y’Y’−Na’−nq’5’(IIIa)によって表される、請求項1に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項9

式(III)が、式(IIIb):センス:5’np−Na−YYY−Nb−ZZZ−Na−nq3’アンチセンス:3’np’−Na’−Y’Y’Y’−Nb’−Z’Z’Z’−Na’−nq’5’(IIIb)(式中、各Nb及びNb’が、独立して、1〜5つの修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す)によって表される、請求項1に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項10

式(III)が、式(IIIc):センス:5’np−Na−XXX−Nb−YYY−Na−nq3’アンチセンス:3’np’−Na’−X’X’X’−Nb’−Y’Y’Y’−Na’−nq’5’(IIIc)(式中、各Nb及びNb’が、独立して、1〜5つの修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す)によって表される、請求項1に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項11

式(III)が、式(IIId):センス:5’np−Na−XXX−Nb−YYY−Nb−ZZZ−Na−nq3’アンチセンス:3’np’−Na’−X’X’X’−Nb’−Y’Y’Y’−Nb’−Z’Z’Z’−Na’−nq’5’(IIId)(式中、各Nb及びNb’が、独立して、1〜5つの修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各Na及びNa’が、独立して、2〜10の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す)によって表される、請求項1に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項12

前記二本鎖領域が、15〜30ヌクレオチド対長である、請求項1に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項13

前記二本鎖領域が、17〜23ヌクレオチド対長である、請求項12に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項14

前記二本鎖領域が、17〜25ヌクレオチド対長である、請求項12に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項15

前記二本鎖領域が、23〜27ヌクレオチド対長である、請求項12に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項16

前記二本鎖領域が、19〜21ヌクレオチド対長である、請求項12に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項17

前記二本鎖領域が、21〜23ヌクレオチド対長である、請求項12に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項18

各鎖が、15〜30のヌクレオチドを有する、請求項1に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項19

前記ヌクレオチド上の修飾が、LNA、HNA、CeNA、2’−メトキシエチル、2’−O−アルキル、2’−O−アリル、2’−C−アリル、2’−フルオロ、2’−デオキシ、2’−ヒドロキシル、及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項1に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項20

前記ヌクレオチド上の修飾が、2’−O−メチル又は2’−フルオロ修飾である、請求項19に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項21

前記リガンドが、二価又は三価分枝鎖リンカーを介して結合された1つ又は複数のGalNAc誘導体である、請求項1に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項22

前記リガンドが、である、請求項1に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項23

前記リガンドが、前記センス鎖の3’末端に結合される、請求項1に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項24

以下の概略図(式中、Xが、O又はSである)に示される前記リガンドにコンジュゲートされている、請求項23に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項25

少なくとも1つのホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合を更に含む、請求項1に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項26

前記ホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合が、1つの鎖の3’末端にある、請求項25に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項27

前記鎖が、前記アンチセンス鎖である、請求項26に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項28

前記鎖が、前記センス鎖である、請求項26に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項29

前記ホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合が、1つの鎖の5’末端にある、請求項25に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項30

前記鎖が、前記アンチセンス鎖である、請求項29に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項31

前記鎖が、前記センス鎖である、請求項29に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項32

前記ホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合が、1つの鎖の5’末端及び3’末端の両方にある、請求項25に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項33

前記鎖が、前記アンチセンス鎖である、請求項32に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項34

前記二本鎖の前記アンチセンス鎖の5’末端の1位における塩基対が、AU塩基対である、請求項1に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項35

前記Yヌクレオチドが、2’−フルオロ修飾を含む、請求項1に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項36

前記Y’ヌクレオチドが、2’−O−メチル修飾を含む、請求項1に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項37

p’>0である、請求項1に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項38

p’=2である、請求項1に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項39

q’=0、p=0、q=0、及びp’オーバーハングヌクレオチドが、前記標的mRNAに相補的である、請求項38に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項40

q’=0、p=0、q=0、及びp’オーバーハングヌクレオチドが、前記標的mRNAに非相補的である、請求項38に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項41

前記センス鎖が、合計で21のヌクレオチドを有し、前記アンチセンス鎖が、合計で23のヌクレオチドを有する、請求項28に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項42

少なくとも1つのnp’が、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合される、請求項37〜41のいずれか一項に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項43

全てのnp’が、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合される、請求項42に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項44

表1、表2、表9、表10、表12、及び図12Aに列挙されるRNAi剤の群から選択される、請求項1に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項45

AD−53815、AD−56663、AD−56658、AD−56676、AD−56666、AD−57928、及びAD−60212からなる群から選択される、請求項1に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項46

細胞内でのプロタンパク質転換酵素サブチリシンケキシン9(PCSK9)の発現を阻害することが可能な二本鎖RNAi剤であって、前記二本鎖RNAi剤が、アンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖が、PCSK9をコードするmRNAの一部に相補的な領域を含み、各鎖が、約14〜約30ヌクレオチド長であり、前記二本鎖RNAi剤が、式(III):センス:5’np−Na−(XXX)i−Nb−YYY−Nb−(ZZZ)j−Na−nq3’アンチセンス:3’np’−Na’−(X’X’X’)k−Nb’−Y’Y’Y’−Nb’−(Z’Z’Z’)l−Na’−nq’5’(III)(式中:i、j、k、及びlがそれぞれ、独立して、0又は1であり;p、p’、q、及びq’がそれぞれ、独立して、0〜6であり;各Na及びNa’が、独立して、修飾又は非修飾のいずれかの0〜25のヌクレオチド又はそれらの組合せを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列が、少なくとも2つの異なる修飾のヌクレオチドを含み;各Nb及びNb’が、独立して、修飾又は非修飾のいずれかの0〜10のヌクレオチド又はそれらの組合せを含むオリゴヌクレオチド配列を表し;それぞれ存在していても又は存在していなくてもよい各np、np’、nq、及びnq’が、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し;XXX、YYY、ZZZ、X’X’X’、Y’Y’Y’、及びZ’Z’Z’がそれぞれ、独立して、3連続ヌクレオチド上に3つの同一の修飾の1つのモチーフを表し、前記修飾が、2’−O−メチル又は2’−フルオロ修飾であり;Nb上の修飾が、Y上の前記修飾と異なり、Nb’上の修飾が、Y’上の前記修飾と異なり;前記センス鎖が、少なくとも1つのリガンドにコンジュゲートされている)によって表される二本鎖RNAi剤。

請求項47

細胞内でのプロタンパク質転換酵素サブチリシンケキシン9(PCSK9)の発現を阻害することが可能な二本鎖RNAi剤であって、前記二本鎖RNAi剤が、アンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖が、PCSK9をコードするmRNAの一部に相補的な領域を含み、各鎖が、約14〜約30ヌクレオチド長であり、前記二本鎖RNAi剤が、式(III):センス:5’np−Na−(XXX)i−Nb−YYY−Nb−(ZZZ)j−Na−nq3’アンチセンス:3’np’−Na’−(X’X’X’)k−Nb’−Y’Y’Y’−Nb’−(Z’Z’Z’)l−Na’−nq’5’(III)(式中:i、j、k、及びlがそれぞれ、独立して、0又は1であり;それぞれ存在していても又は存在していなくてもよい各np、nq、及びnq’が、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し;p、q、及びq’がそれぞれ、独立して、0〜6であり;np’>0であり、少なくとも1つのnp’が、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合され;各Na及びNa’が、独立して、修飾又は非修飾のいずれかの0〜25のヌクレオチド又はそれらの組合せを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列が、少なくとも2つの異なる修飾のヌクレオチドを含み;各Nb及びNb’が、独立して、修飾又は非修飾のいずれかの0〜10のヌクレオチド又はそれらの組合せを含むオリゴヌクレオチド配列を表し;XXX、YYY、ZZZ、X’X’X’、Y’Y’Y’、及びZ’Z’Z’がそれぞれ、独立して、3連続ヌクレオチド上に3つの同一の修飾の1つのモチーフを表し、前記修飾が、2’−O−メチル又は2’−フルオロ修飾であり;Nb上の修飾が、Y上の前記修飾と異なり、Nb’上の修飾が、Y’上の前記修飾と異なり;前記センス鎖が、少なくとも1つのリガンドにコンジュゲートされている)によって表される二本鎖RNAi剤。

請求項48

細胞内でのプロタンパク質転換酵素サブチリシンケキシン9(PCSK9)の発現を阻害することが可能な二本鎖RNAi剤であって、前記二本鎖RNAi剤が、アンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖が、PCSK9をコードするmRNAの一部に相補的な領域を含み、各鎖が、約14〜約30ヌクレオチド長であり、前記二本鎖RNAi剤が、式(III):センス:5’np−Na−(XXX)i−Nb−YYY−Nb−(ZZZ)j−Na−nq3’アンチセンス:3’np’−Na’−(X’X’X’)k−Nb’−Y’Y’Y’−Nb’−(Z’Z’Z’)l−Na’−nq’5’(III)(式中:i、j、k、及びlがそれぞれ、独立して、0又は1であり;それぞれ存在していても又は存在していなくてもよい各np、nq、及びnq’が、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し;p、q、及びq’がそれぞれ、独立して、0〜6であり;np’>0であり、少なくとも1つのnp’が、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合され;各Na及びNa’が、独立して、修飾又は非修飾のいずれかの0〜25のヌクレオチド又はそれらの組合せを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列が、少なくとも2つの異なる修飾のヌクレオチドを含み;各Nb及びNb’が、独立して、修飾又は非修飾のいずれかの0〜10のヌクレオチド又はそれらの組合せを含むオリゴヌクレオチド配列を表し;XXX、YYY、ZZZ、X’X’X’、Y’Y’Y’、及びZ’Z’Z’がそれぞれ、独立して、3連続ヌクレオチド上に3つの同一の修飾の1つのモチーフを表し、前記修飾が、2’−O−メチル又は2’−フルオロ修飾であり;Nb上の修飾が、Y上の前記修飾と異なり、Nb’上の修飾が、Y’上の前記修飾と異なり;前記センス鎖が、少なくとも1つのリガンドにコンジュゲートされ、前記リガンドが、二価又は三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された1つ又は複数のGalNAc誘導体である)によって表される二本鎖RNAi剤。

請求項49

細胞内でのプロタンパク質転換酵素サブチリシンケキシン9(PCSK9)の発現を阻害することが可能な二本鎖RNAi剤であって、前記二本鎖RNAi剤が、アンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖が、PCSK9をコードするmRNAの一部に相補的な領域を含み、各鎖が、約14〜約30ヌクレオチド長であり、前記二本鎖RNAi剤が、式(III):センス:5’np−Na−(XXX)i−Nb−YYY−Nb−(ZZZ)j−Na−nq3’アンチセンス:3’np’−Na’−(X’X’X’)k−Nb’−Y’Y’Y’−Nb’−(Z’Z’Z’)l−Na’−nq’5’(III)(式中:i、j、k、及びlがそれぞれ、独立して、0又は1であり;それぞれ存在していても又は存在していなくてもよい各np、nq、及びnq’が、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し;p、q、及びq’がそれぞれ、独立して、0〜6であり;np’>0であり、少なくとも1つのnp’が、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合され;各Na及びNa’が、独立して、修飾又は非修飾のいずれかの0〜25のヌクレオチド又はそれらの組合せを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列が、少なくとも2つの異なる修飾のヌクレオチドを含み;各Nb及びNb’が、独立して、修飾又は非修飾のいずれかの0〜10のヌクレオチド又はそれらの組合せを含むオリゴヌクレオチド配列を表し;XXX、YYY、ZZZ、X’X’X’、Y’Y’Y’、及びZ’Z’Z’がそれぞれ、独立して、3連続ヌクレオチド上に3つの同一の修飾の1つのモチーフを表し、前記修飾が、2’−O−メチル又は2’−フルオロ修飾であり;Nb上の修飾が、Y上の前記修飾と異なり、Nb’上の修飾が、Y’上の前記修飾と異なり;前記センス鎖が、少なくとも1つのホスホロチオエート結合を含み;前記センス鎖が、少なくとも1つのリガンドにコンジュゲートされ、前記リガンドが、二価又は三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された1つ又は複数のGalNAc誘導体である)によって表される二本鎖RNAi剤。

請求項50

細胞内でのプロタンパク質転換酵素サブチリシンケキシン9(PCSK9)の発現を阻害することが可能な二本鎖RNAi剤であって、前記二本鎖RNAi剤が、アンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖が、PCSK9をコードするmRNAの一部に相補的な領域を含み、各鎖が、約14〜約30ヌクレオチド長であり、前記二本鎖RNAi剤が、式(III):センス:5’np−Na−YYY−Na−nq3’アンチセンス:3’np’−Na’−Y’Y’Y’−Na’−nq’5’(IIIa)(式中:それぞれ存在していても又は存在していなくてもよい各np、nq、及びnq’が、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し;p、q、及びq’がそれぞれ、独立して、0〜6であり;np’>0であり、少なくとも1つのnp’が、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合され;各Na及びNa’が、独立して、修飾又は非修飾のいずれかの0〜25のヌクレオチド又はそれらの組合せを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列が、少なくとも2つの異なる修飾のヌクレオチドを含み;YYY及びY’Y’Y’がそれぞれ、独立して、3連続ヌクレオチド上の3つの同一の修飾の1つのモチーフを表し、前記修飾が、2’−O−メチル又は2’−フルオロ修飾であり;前記センス鎖が、少なくとも1つのホスホロチオエート結合を含み;前記センス鎖が、少なくとも1つのリガンドにコンジュゲートされ、前記リガンドが、二価又は三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された1つ又は複数のGalNAc誘導体である)によって表される二本鎖RNAi剤。

請求項51

表1、表2、表9、表10、表12、及び図12Aに列挙されるRNAi剤の群から選択されるRNAi剤。

請求項52

請求項1及び46〜51のいずれか一項に記載の二本鎖RNAi剤を含有する細胞。

請求項53

請求項1及び46〜51のいずれか一項に記載の二本鎖RNAi剤を含む医薬組成物

請求項54

RNAi剤が、非緩衝液中で投与される、請求項53に記載の医薬組成物。

請求項55

前記非緩衝液が、生理食塩水又は水である、請求項54に記載の医薬組成物。

請求項56

前記siRNAが、緩衝液とともに投与される、請求項53に記載の医薬組成物。

請求項57

前記緩衝液が、酢酸緩衝液クエン酸緩衝液プロラミン緩衝液、炭酸緩衝液、若しくはリン酸緩衝液又はそれらの任意の組合せを含む、請求項56に記載の医薬組成物。

請求項58

前記緩衝液が、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)である、請求項57に記載の医薬組成物。

請求項59

細胞内でのPCSK9発現の阻害方法であって、(a)前記細胞を、請求項1及び46〜51のいずれか一項に記載の二本鎖RNAi剤又は請求項53〜58のいずれか一項に記載の医薬組成物と接触させる工程と;(b)工程(a)で生成された前記細胞を、PCSK9遺伝子のmRNA転写物の分解を得るのに十分な時間にわたって維持し、それにより、前記細胞内での前記PCSK9遺伝子の発現を阻害する工程とを含む方法。

請求項60

前記細胞が、対象中にある、請求項59に記載の方法。

請求項61

前記対象がヒトである、請求項60に記載の方法。

請求項62

前記PCSK9発現が、少なくとも約30%だけ阻害される、請求項59〜61のいずれか一項に記載の方法。

請求項63

PCSK9発現によって媒介される障害罹患している対象の処置方法であって、治療有効量の請求項1及び46〜51のいずれか一項に記載の二本鎖RNAi剤又は請求項53〜58のいずれか一項に記載の医薬組成物を前記対象に投与し、それにより、前記対象を処置する工程を含む方法。

請求項64

前記対象がヒトである、請求項63に記載の方法。

請求項65

前記ヒトが、高コレステロール血症に罹患している、請求項64に記載の方法。

請求項66

前記二本鎖RNAi剤が、約0.01mg/kg〜約10mg/kg又は約0.5mg/kg〜約50mg/kgの用量で投与される、請求項63に記載の方法。

請求項67

前記二本鎖RNAi剤が、約10mg/kg〜約30mg/kgの用量で投与される、請求項66に記載の方法。

請求項68

前記二本鎖RNAi剤が、皮下投与される、請求項66に記載の方法。

請求項69

前記二本鎖RNAi剤が、静脈内投与される、請求項66に記載の方法。

請求項70

前記RNAi剤が、2つ以上の用量で投与される、請求項66に記載の方法。

請求項71

前記RNAi剤が、初期投与段階と、その後の維持段階を含む投与計画で投与され、前記初期投与段階が、週に5回、2mg/kg、1mg/kg又は0.5mg/kgの用量を投与することを含み、前記維持段階が、週に1回、週に2回、週に3回、2週間に1回、3週間に1回、月に1回、2ヶ月に1回、3ヶ月に1回、4ヶ月に1回、5ヶ月に1回、又は6ヶ月に1回、2mg/kg、1mg/kg又は0.5mg/kgの用量を投与することを含む、請求項70に記載の方法。

請求項72

前記RNAi剤が、約12時間に1回、約24時間に1回、約48時間に1回、約72時間に1回、及び約96時間に1回からなる群から選択される間隔で投与される、請求項70に記載の方法。

請求項73

対象における高コレステロール血症の処置方法であって、治療有効量の請求項1及び46〜51のいずれか一項に記載の二本鎖RNAi剤又は請求項53〜58のいずれか一項に記載の医薬組成物を前記対象に投与し、それにより、前記対象を処置する工程を含む方法。

請求項74

前記対象が、霊長類はげ歯類である、請求項73に記載の方法。

請求項75

前記対象がヒトである、請求項73に記載の方法。

請求項76

前記二本鎖RNAi剤が、約0.01mg/kg〜約10mg/kg又は約0.5mg/kg〜約50mg/kgの用量で投与される、請求項73に記載の方法。

請求項77

前記二本鎖RNAi剤が、約10mg/kg〜約30mg/kgの用量で投与される、請求項73に記載の方法。

請求項78

前記RNAi剤が、2つ以上の用量で投与される、請求項73に記載の方法。

請求項79

前記RNAi剤が、初期投与段階と、その後の維持段階を含む投与計画で投与され、前記初期投与段階が、週に5回、2mg/kg、1mg/kg又は0.5mg/kgの用量を投与することを含み、前記維持段階が、週に1回、2回、若しくは3回、2週間に1回、3週間に1回、月に1回、2ヶ月に1回、3ヶ月に1回、4ヶ月に1回、5ヶ月に1回、又は6ヶ月に1回、2mg/kg、1mg/kg又は0.5mg/kgの用量を投与することを含む、請求項73に記載の方法。

請求項80

前記RNAi剤が、約12時間に1回、約24時間に1回、約48時間に1回、約72時間に1回、及び約96時間に1回からなる群から選択される間隔で投与される、請求項73に記載の方法。

請求項81

前記二本鎖RNAi剤が、皮下投与される、請求項73に記載の方法。

請求項82

前記二本鎖RNAi剤が、静脈内投与される、請求項73に記載の方法。

請求項83

前記対象のLDLR遺伝子型又は表現型を決定する工程を更に含む、請求項73に記載の方法。

請求項84

投与により、前記対象における血清コレステロールが低下される、請求項73に記載の方法。

請求項85

前記対象における前記血清コレステロールレベルを決定する工程を更に含む、請求項73に記載の方法。

技術分野

0001

関連出願
本出願は、2012年12月5日に出願された米国仮特許出願第61/733,518号;2013年3月15日に出願された米国仮特許出願第61/793,530号;2013年10月4日に出願された米国仮特許出願第61/886,916号;及び2013年10月17日に出願された米国仮特許出願第61/892,188号の優先権を主張するものである。本出願は、2011年11月18日に出願された米国仮特許出願第61/561,710号にも関する。上記の仮特許出願のそれぞれの全内容が、参照により本明細書に援用される。

0002

配列表
本出願は、全体が参照により本明細書に援用される、ASCII形式電子的に提出されている配列表を含む。2013年10月29日に作成された前記ASCIIのコピー名称は、121301−00420_SL.txtであり、サイズは433,512バイトである。

背景技術

0003

プロタンパク質転換酵素サブチリシンケキシン9(PCSK9)は、サブチリシンセリンプロテアーゼファミリーメンバーである。他の8つの哺乳動物サブチリシンプロテアーゼ、PCSK1−PCSK8(PC1/3、PC2、フーリン、PC4、PC5/6、PACE4、PC7、及びS1P/SKI−1とも呼ばれる)は、分泌経路において様々なタンパク質プロセシングし、多様な生物学的過程において役割を果たすプロタンパク質転換酵素である(非特許文献1、非特許文献2、非特許文献3、非特許文献4、及び非特許文献5)。

0004

PCSK9は、コレステロール代謝において役割を果たすことが提案されている。PCSK9mRNA発現は、コレステロール生合成酵素及び低比重リポタンパク質受容体(LDLR)と同様に、マウスにおいて食事性コレステロール摂食によって下方制御され(非特許文献6)、HepG2細胞においてスタチンによって上方制御され(非特許文献7)、ステロール調節要素結合タンパク質(SREBP)トランスジェニックマウスにおいて上方制御される(非特許文献8)。更に、PCSK9ミスセンス突然変異が、常染色優性高コレステロール血症の一形態(Hchola3)と関連していることが分かっている(非特許文献9、非特許文献10、非特許文献11)。一塩基多型(SNP)が、日本人集団コレステロールレベルに関連しているため、PCSK9は、一般集団LDLコレステロールベルを決定する役割も果たし得る(非特許文献12)。

0005

常染色優性高コレステロール血症(ADH)は、患者が、総コレステロール及びLDLコレステロールレベルの上昇、黄色腫、及び早期のアテローム性動脈硬化症を示す単一遺伝子疾患である(非特許文献13)。ADH及び劣性型常染色体劣性高コレステロール血症(ARH)(非特許文献14)の病因は、肝臓によるLDL取り込みの欠陥によるものである。ADHは、LDL取り込みを防止する、LDLR突然変異によって、又はLDLRに結合するLDL上のタンパク質である、アポリポタンパク質Bの突然変異によって引き起こされ得る。ARHは、クラスリンとのその相互作用を介したLDLR−LDL複合体のエンドサイトーシスに必要なARHタンパク質の突然変異によって引き起こされる。したがって、PCSK9突然変異が、Hchola3ファミリーにおいて原因である場合、PCSK9が、受容体を介したLDL取り込みにおいて役割を果たす可能性が高いと考えられる。

0006

過剰発現の研究は、LDLRレベル、ひいては、肝臓によるLDL取り込みを制御するPCSK9の役割を指摘している(非特許文献15、非特許文献16、非特許文献17)。マウスにおける3日間又は4日間のマウス又はヒトPCSK9のアデノウイルス媒介性過剰発現は、総コレステロール及びLDLコレステロールレベルの上昇をもたらし;この効果は、LDLRノックアウト動物では見られない(非特許文献15、非特許文献16、非特許文献17)。更に、PCSK9過剰発現は、LDLRmRNAレベル、SREBPタンパク質レベル、又はSREBPタンパク質核対細胞質比に影響を及ぼさずに、肝臓LDLRタンパク質の著しい減少をもたらす。

0007

高コレステロール血症自体は無症候性であるが、血清コレステロールの長期にわたる上昇が、アテローム性動脈硬化症につながり得る。何十年にわたって、慢性的に上昇した血清コレステロールは、動脈中の粥状の形成の原因となり、これが、病変動脈の進行性狭窄又は更には完全な閉塞につながり得る。更に、より小さい斑が破裂して、凝血塊を形成させ、血流を妨げて、例えば、心筋梗塞及び/又は卒中をもたらし得る。狭窄又は閉塞の形成が漸進的である場合、組織及び器官への血液供給は、器官の機能が損なわれるまで、ゆっくりと減少する。

先行技術

0008

Bergeron,F.(2000)J.Mol.Endocrinol.24,1−22
Gensberg,K.,(1998)Semin.Cell Dev.Biol.9,11−17
Seidah,N.G.(1999)Brain Res.848,45−62
Taylor,N.A.,(2003)FASEB J.17,1215−1227
Zhou,A.,(1999)J.Biol.Chem.274,20745−20748
Maxwell,K.N.,(2003)J.Lipid Res.44,2109−2119
Dubuc,G.,(2004)Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.24,1454−1459
Horton,J.D.,(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100,12027−12032
Abifadel,M.,et al.(2003)Nat.Genet.34,154−156
Timms,K.M.,(2004)Hum.Genet.114,349−353
Leren,T.P.(2004)Clin.Genet.65,419−422
Shioji,K.,(2004)J.Hum.Genet.49,109−114
Rader,D.J.,(2003)J.Clin.Invest.111,1795−1803
Cohen,J.C.,(2003)Curr.Opin.Lipidol.14,121−127
Maxwell,K.N.(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101,7100−7105
Benjannet,S.,et al.(2004)J.Biol.Chem.279,48865−48875
Park,S.W.,(2004)J.Biol.Chem.279,50630−50638

発明が解決しようとする課題

0009

したがって、高脂血症、例えば、高コレステロール血症などのPCSK9に関連する疾病の有効な処置が当該技術分野において必要とされている。

課題を解決するための手段

0010

以下により詳細に記載されるように、PCSK9を標的とするRNAi剤、例えば、二本鎖iRNA剤を含む組成物が本明細書に開示される。PCSK9発現阻害し、PCSK9発現に関連する病態、例えば、高コレステロール血症を処置するための本発明の組成物の使用方法も開示される。

0011

したがって、一態様において、本発明は、細胞内でのプロタンパク質転換酵素サブチリシンケキシン9(PCSK9)の発現を阻害することが可能なRNAi剤、例えば、二本鎖RNAi剤であって、二本鎖RNAi剤が、アンチセンス鎖相補的センス鎖を含み、アンチセンス鎖が、PCSK9をコードするmRNAの一部に相補的な領域を含み、各鎖が、約14〜約30ヌクレオチド長であり、二本鎖RNAi剤が、式(III):
センス:5’np−Na−(XXX)i−Nb−YYY−Nb−(ZZZ)j−Na−nq3’
アンチセンス:3’np’−Na’−(X’X’X’)k−Nb’−Y’Y’Y’−Nb’−(Z’Z’Z’)l−Na’−nq’5’(III)
(式中:
i、j、k、及びlがそれぞれ、独立して、0又は1であり;
p、p’、q、及びq’がそれぞれ、独立して、0〜6であり;
各Na及びNa’が、独立して、修飾又は非修飾のいずれかの0〜25のヌクレオチド又はそれらの組合せを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列が、少なくとも2つの異なる修飾のヌクレオチドを含み;
各Nb及びNb’が、独立して、修飾又は非修飾のいずれかの0〜10のヌクレオチド又はそれらの組合せを含むオリゴヌクレオチド配列を表し;
それぞれ存在していても又は存在していなくてもよい各np、np’、nq、及びnq’が、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し;
XXX、YYY、ZZZ、X’X’X’、Y’Y’Y’、及びZ’Z’Z’がそれぞれ、独立して、3連続ヌクレオチド上の3つの同一の修飾の1つのモチーフを表し;
Nb上の修飾が、Y上の修飾と異なり、Nb’上の修飾が、Y’上の修飾と異なり;
センス鎖が、少なくとも1つのリガンドコンジュゲートされている)
によって表される二本鎖RNAi剤を提供する。

0012

一実施形態において、iが0であり;jが0であり;iが1であり;jが1であり;i及びjの両方が0であり;又はi及びjの両方が1である。別の実施形態において、kが0であり;lが0であり;kが1であり;lが1であり;k及びlの両方が0であり;又はk及びlの両方が1である。

0013

一実施形態において、XXXが、X’X’X’に相補的であり、YYYが、Y’Y’Y’に相補的であり、ZZZが、Z’Z’Z’に相補的である。

0014

一実施形態において、YYYモチーフが、センス鎖の切断部位又はその近傍に存在する。

0015

一実施形態において、Y’Y’Y’モチーフが、5’末端のアンチセンス鎖の11位、12位及び13位に存在する。

0016

一実施形態において、Y’が、2’−O−メチルである。

0017

一実施形態において、式(III)が、式(IIIa):
センス:5’np−Na−YYY−Na−nq3’
アンチセンス:3’np’−Na’−Y’Y’Y’−Na’−nq’5’(IIIa)
によって表される。

0018

別の実施形態において、式(III)が、式(IIIb):
センス:5’np−Na−YYY−Nb−ZZZ−Na−nq3’
アンチセンス:3’np’−Na’−Y’Y’Y’−Nb’−Z’Z’Z’−Na’−nq’5’(IIIb)
(式中、各Nb及びNb’が、独立して、1〜5つの修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す)
によって表される。

0019

更に別の実施形態において、式(III)が、式(IIIc):
センス:5’np−Na−XXX−Nb−YYY−Na−nq3’
アンチセンス:3’np’−Na’−X’X’X’−Nb’−Y’Y’Y’−Na’−nq’5’(IIIc)
(式中、各Nb及びNb’が、独立して、1〜5つの修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す)
によって表される。

0020

一実施形態において、式(III)が、式(IIId):
センス:5’np−Na−XXX−Nb−YYY−Nb−ZZZ−Na−nq3’
アンチセンス:3’np’−Na’−X’X’X’−Nb’−Y’Y’Y’−Nb’−Z’Z’Z’−Na’−nq’5’(IIId)
(式中、各Nb及びNb’が、独立して、1〜5つの修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各Na及びNa’が、独立して、2〜10の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す)
によって表される。

0021

一実施形態において、二本鎖領域は、15〜30ヌクレオチド対長である。別の実施形態において、二本鎖領域は、17〜23ヌクレオチド対長である。更に別の実施形態において、二本鎖領域は、17〜25ヌクレオチド対長である。一実施形態において、二本鎖領域は、23〜27ヌクレオチド対長である。別の実施形態において、二本鎖領域は、19〜21ヌクレオチド対長である。別の実施形態において、二本鎖領域は、21〜23ヌクレオチド対長である。一実施形態において、各鎖は、15〜30のヌクレオチドを有する。

0022

一実施形態において、ヌクレオチド上の修飾は、LNA、HNA、CeNA、2’−メトキシエチル、2’−O−アルキル、2’−O−アリル、2’−C−アリル、2’−フルオロ、2’−デオキシ、2’−ヒドロキシル、及びそれらの組合せからなる群から選択される。別の実施形態において、ヌクレオチド上の修飾は、2’−O−メチル又は2’−フルオロ修飾である。

0023

一実施形態において、リガンドは、二価又は三価分枝鎖リンカーを介して結合された1つ又は複数のGalNAc誘導体である。別の実施形態において、リガンドは、



である。

0024

一実施形態において、リガンドは、センス鎖の3’末端に結合される。

0025

一実施形態において、RNAi剤は、以下の概略図



(式中、XがO又はSである)に示されるリガンドにコンジュゲートされている。特定の実施形態において、XがOである。

0026

一実施形態において、剤は、少なくとも1つのホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合を更に含む。

0027

一実施形態において、ホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合は、1つの鎖の3’末端にある。一実施形態において、鎖は、アンチセンス鎖である。別の実施形態において、鎖は、センス鎖である。

0028

一実施形態において、ホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合は、1つの鎖の5’末端にある。一実施形態において、鎖は、アンチセンス鎖である。別の実施形態において、鎖は、センス鎖である。

0029

一実施形態において、ホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合は、1つの鎖の5’末端及び3’末端の両方にある。一実施形態において、鎖は、アンチセンス鎖である。

0030

一実施形態において、二本鎖のアンチセンス鎖の5’末端の1位における塩基対が、AU塩基対である。

0031

一実施形態において、Yヌクレオチドが、2’−フルオロ修飾を含む。

0032

一実施形態において、Y’ヌクレオチドが、2’−O−メチル修飾を含む。

0033

一実施形態において、p’>0である。別の実施形態において、p’=2である。

0034

一実施形態において、q’=0であり、p=0であり、q=0であり、p’オーバーハングヌクレオチドが、標的mRNAに相補的である。別の実施形態において、q’=0であり、p=0であり、q=0であり、p’オーバーハングヌクレオチドが、標的mRNAに非相補的である。

0035

一実施形態において、センス鎖が、合計で21のヌクレオチドを有し、アンチセンス鎖が、合計で23のヌクレオチドを有する。

0036

一実施形態において、少なくとも1つのnp’が、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合される。

0037

一実施形態において、全てのnp’が、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合される。

0038

一実施形態において、RNAi剤は、表1、表2、表9、表10、表12、及び図12に列挙されるRNAi剤の群から選択される。

0039

一実施形態において、RNAi剤は、AD−53815、AD−56663、AD−56658、AD−56676、AD−56666、AD−57928、及びAD−60212からなる群から選択される。

0040

別の態様において、本発明は、細胞内でのプロタンパク質転換酵素サブチリシンケキシン9(PCSK9)の発現を阻害することが可能なRNAi剤、例えば、二本鎖RNAi剤であって、二本鎖RNAi剤が、アンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、アンチセンス鎖が、PCSK9をコードするmRNAの一部に相補的な領域を含み、各鎖が、約14〜約30ヌクレオチド長であり、二本鎖RNAi剤が、式(III):
センス:5’np−Na−(XXX)i−Nb−YYY−Nb−(ZZZ)j−Na−nq3’
アンチセンス:3’np’−Na’−(X’X’X’)k−Nb’−Y’Y’Y’−Nb’−(Z’Z’Z’)l−Na’−nq’5’(III)
(式中:
i、j、k、及びlがそれぞれ、独立して、0又は1であり;
p、p’、q、及びq’がそれぞれ、独立して、0〜6であり;
各Na及びNa’が、独立して、修飾又は非修飾のいずれかの0〜25のヌクレオチド又はそれらの組合せを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列が、少なくとも2つの異なる修飾のヌクレオチドを含み;
各Nb及びNb’が、独立して、修飾又は非修飾のいずれかの0〜10のヌクレオチド又はそれらの組合せを含むオリゴヌクレオチド配列を表し;
それぞれ存在していても又は存在していなくてもよい各np、np’、nq、及びnq’が、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し;
XXX、YYY、ZZZ、X’X’X’、Y’Y’Y’、及びZ’Z’Z’がそれぞれ、独立して、3連続ヌクレオチド上の3つの同一の修飾の1つのモチーフを表し、修飾が、2’−O−メチル又は2’−フルオロ修飾であり;
Nb上の修飾が、Y上の修飾と異なり、Nb’上の修飾が、Y’上の修飾と異なり;
センス鎖が、少なくとも1つのリガンドにコンジュゲートされている)
によって表される二本鎖RNAi剤を提供する。

0041

更に別の態様において、本発明は、細胞内でのプロタンパク質転換酵素サブチリシンケキシン9(PCSK9)の発現を阻害することが可能なRNAi剤、例えば、二本鎖RNAi剤であって、二本鎖RNAi剤が、アンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、アンチセンス鎖が、PCSK9をコードするmRNAの一部に相補的な領域を含み、各鎖が、約14〜約30ヌクレオチド長であり、二本鎖RNAi剤が、式(III):
センス:5’np−Na−(XXX)i−Nb−YYY−Nb−(ZZZ)j−Na−nq3’
アンチセンス:3’np’−Na’−(X’X’X’)k−Nb’−Y’Y’Y’−Nb’−(Z’Z’Z’)l−Na’−nq’5’(III)
(式中:
i、j、k、及びlがそれぞれ、独立して、0又は1であり;
それぞれ存在していても又は存在していなくてもよい各np、nq、及びnq’が、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し;
p、q、及びq’がそれぞれ、独立して、0〜6であり;
np’>0であり、少なくとも1つのnp’が、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合され;
各Na及びNa’が、独立して、修飾又は非修飾のいずれかの0〜25のヌクレオチド又はそれらの組合せを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列が、少なくとも2つの異なる修飾のヌクレオチドを含み;
各Nb及びNb’が、独立して、修飾又は非修飾のいずれかの0〜10のヌクレオチド又はそれらの組合せを含むオリゴヌクレオチド配列を表し;
XXX、YYY、ZZZ、X’X’X’、Y’Y’Y’、及びZ’Z’Z’がそれぞれ、独立して、3連続ヌクレオチド上の3つの同一の修飾の1つのモチーフを表し、修飾が、2’−O−メチル又は2’−フルオロ修飾であり;
Nb上の修飾が、Y上の修飾と異なり、Nb’上の修飾が、Y’上の修飾と異なり;
センス鎖が、少なくとも1つのリガンドにコンジュゲートされている)
によって表される二本鎖RNAi剤を提供する。

0042

更なる態様において、本発明は、細胞内でのプロタンパク質転換酵素サブチリシンケキシン9(PCSK9)の発現を阻害することが可能なRNAi剤、例えば、二本鎖RNAi剤であって、二本鎖RNAi剤が、アンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、アンチセンス鎖が、PCSK9をコードするmRNAの一部に相補的な領域を含み、各鎖が、約14〜約30ヌクレオチド長であり、二本鎖RNAi剤が、式(III):
センス:5’np−Na−(XXX)i−Nb−YYY−Nb−(ZZZ)j−Na−nq3’
アンチセンス:3’np’−Na’−(X’X’X’)k−Nb’−Y’Y’Y’−Nb’−(Z’Z’Z’)l−Na’−nq’5’(III)
(式中:
i、j、k、及びlがそれぞれ、独立して、0又は1であり;
それぞれ存在していても又は存在していなくてもよい各np、nq、及びnq’が、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し;
p、q、及びq’がそれぞれ、独立して、0〜6であり;
np’>0であり、少なくとも1つのnp’が、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合され;
各Na及びNa’が、独立して、修飾又は非修飾のいずれかの0〜25のヌクレオチド又はそれらの組合せを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列が、少なくとも2つの異なる修飾のヌクレオチドを含み;
各Nb及びNb’が、独立して、修飾又は非修飾のいずれかの0〜10のヌクレオチド又はそれらの組合せを含むオリゴヌクレオチド配列を表し;
XXX、YYY、ZZZ、X’X’X’、Y’Y’Y’、及びZ’Z’Z’がそれぞれ、独立して、3連続ヌクレオチド上の3つの同一の修飾の1つのモチーフを表し、修飾が、2’−O−メチル又は2’−フルオロ修飾であり;
Nb上の修飾が、Y上の修飾と異なり、Nb’上の修飾が、Y’上の修飾と異なり;
センス鎖が、少なくとも1つのリガンドにコンジュゲートされ、リガンドが、二価又は三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された1つ又は複数のGalNAc誘導体である)
によって表される二本鎖RNAi剤を提供する。

0043

別の態様において、本発明は、細胞内でのプロタンパク質転換酵素サブチリシンケキシン9(PCSK9)の発現を阻害することが可能なRNAi剤、例えば、二本鎖RNAi剤であって、二本鎖RNAi剤が、アンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、アンチセンス鎖が、PCSK9をコードするmRNAの一部に相補的な領域を含み、各鎖が、約14〜約30ヌクレオチド長であり、二本鎖RNAi剤が、式(III):
センス:5’np−Na−(XXX)i−Nb−YYY−Nb−(ZZZ)j−Na−nq3’
アンチセンス:3’np’−Na’−(X’X’X’)k−Nb’−Y’Y’Y’−Nb’−(Z’Z’Z’)l−Na’−nq’5’(III)
(式中:
i、j、k、及びlがそれぞれ、独立して、0又は1であり;
それぞれ存在していても又は存在していなくてもよい各np、nq、及びnq’が、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し;
p、q、及びq’がそれぞれ、独立して、0〜6であり;
np’>0であり、少なくとも1つのnp’が、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合され;
各Na及びNa’が、独立して、修飾又は非修飾のいずれかの0〜25のヌクレオチド又はそれらの組合せを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列が、少なくとも2つの異なる修飾のヌクレオチドを含み;
各Nb及びNb’が、独立して、修飾又は非修飾のいずれかの0〜10のヌクレオチド又はそれらの組合せを含むオリゴヌクレオチド配列を表し;
XXX、YYY、ZZZ、X’X’X’、Y’Y’Y’、及びZ’Z’Z’がそれぞれ、独立して、3連続ヌクレオチド上の3つの同一の修飾の1つのモチーフを表し、修飾が、2’−O−メチル又は2’−フルオロ修飾であり;
Nb上の修飾が、Y上の修飾と異なり、Nb’上の修飾が、Y’上の修飾と異なり;
センス鎖が、少なくとも1つのホスホロチオエート結合を含み;
センス鎖が、少なくとも1つのリガンドにコンジュゲートされ、リガンドが、二価又は三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された1つ又は複数のGalNAc誘導体である)
によって表される二本鎖RNAi剤を提供する。

0044

更に別の態様において、本発明は、細胞内でのプロタンパク質転換酵素サブチリシンケキシン9(PCSK9)の発現を阻害することが可能なRNAi剤、例えば、二本鎖RNAi剤であって、二本鎖RNAi剤が、アンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、アンチセンス鎖が、PCSK9をコードするmRNAの一部に相補的な領域を含み、各鎖が、約14〜約30ヌクレオチド長であり、二本鎖RNAi剤が、式(III):
センス:5’np−Na−YYY−Na−nq3’
アンチセンス:3’np’−Na’−Y’Y’Y’−Na’−nq’5’(IIIa)
(式中:
それぞれ存在していても又は存在していなくてもよい各np、nq、及びnq’が、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し;
p、q、及びq’がそれぞれ、独立して、0〜6であり;
np’>0であり、少なくとも1つのnp’が、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合され;
各Na及びNa’が、独立して、修飾又は非修飾のいずれかの0〜25のヌクレオチド又はそれらの組合せを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列が、少なくとも2つの異なる修飾のヌクレオチドを含み;
YYY及びY’Y’Y’がそれぞれ、独立して、3連続ヌクレオチド上の3つの同一の修飾の1つのモチーフを表し、修飾が、2’−O−メチル又は2’−フルオロ修飾であり;
センス鎖が、少なくとも1つのホスホロチオエート結合を含み;
センス鎖が、少なくとも1つのリガンドにコンジュゲートされ、リガンドが、二価又は三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された1つ又は複数のGalNAc誘導体である)
によって表される二本鎖RNAi剤を提供する。

0045

本発明は、本発明の二本鎖RNAi剤を含む、細胞、ベクター宿主細胞、及び医薬組成物も提供する。

0046

一実施形態において、本発明は、表1、表2、表9、表10、表12、及び図12に列挙されるRNAi剤の群から選択されるRNAi剤を提供する。

0047

ある実施形態において、RNAi剤は、医薬組成物を用いて投与される。

0048

好ましい実施形態において、RNAi剤は、溶液中で投与される。あるこのような実施形態において、siRNAは、非緩衝液中で投与される。一実施形態において、siRNAは、水中で投与される。他の実施形態において、siRNAは、酢酸緩衝液クエン酸緩衝液プロラミン緩衝液、炭酸緩衝液、若しくはリン酸緩衝液又はそれらの任意の組合せなどの緩衝液とともに投与される。ある実施形態において、緩衝液は、リン酸緩衝生理食塩水PBS)である。

0049

一実施形態において、医薬組成物は、脂質製剤を更に含む。一実施形態において、脂質製剤は、LNP、又はXTCを含む。別の実施形態において、脂質製剤は、MC3を含む。

0050

一態様において、本発明は、細胞内でのPCSK9発現の阻害方法を提供する。本方法は、細胞を、本発明のRNAi剤、例えば、二本鎖RNAi剤、又はベクターと接触させる工程と;工程(a)で生成された細胞を、PCSK9遺伝子のmRNA転写物の分解を得るのに十分な時間にわたって維持し、それにより、細胞内でのPCSK9遺伝子の発現を阻害する工程とを含む。

0051

一実施形態において、細胞は、対象中にある。

0052

一実施形態において、対象はヒトである。

0053

一実施形態において、PCSK9発現は、少なくとも約30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%又は95%だけ阻害される。

0054

別の態様において、本発明は、PCSK9発現によって媒介される障害罹患している対象の処置方法を提供する。本方法は、治療有効量の本発明のRNAi剤、例えば、二本鎖RNAi剤、又はベクターを対象に投与し、それにより、対象を処置する工程を含む。

0055

一実施形態において、対象はヒトである。

0056

一実施形態において、ヒトは、高コレステロール血症に罹患している。

0057

一実施形態において、RNAi剤、例えば、二本鎖RNAi剤は、約0.01mg/kg〜約10mg/kg、約0.5mg/kg〜約50mg/kg、約10mg/kg〜約30mg/kg、約10mg/kg〜約20mg/kg、約15mg/kg〜約20mg/kg、約15mg/kg〜約25mg/kg、約15mg/kg〜約30mg/kg、又は約20mg/kg〜約30mg/kgの用量で投与される。

0058

一実施形態において、RNAi剤、例えば、二本鎖RNAi剤は、皮下又は静脈内投与される。

0059

一実施形態において、RNAi剤は、初期投与段階(loading phase)と、その後の維持段階(maintenance phase)を含む投与計画で投与され、初期投与段階は、週に5回、2mg/kg、1mg/kg又は0.5mg/kgの用量を投与することを含み、維持段階は、週に1回、2回、若しくは3回、2週間に1回、3週間に1回、月に1回、2ヶ月に1回、3ヶ月に1回、4ヶ月に1回、5ヶ月に1回、又は6ヶ月に1回、2mg/kg、1mg/kg又は0.5mg/kgの用量を投与することを含む。

0060

一実施形態において、RNAi剤は、2つ以上の用量で投与される。特定の実施形態において、RNAi剤は、約12時間に1回、約24時間に1回、約48時間に1回、約72時間に1回、及び約96時間に1回からなる群から選択される間隔で投与される。

0061

更に別の態様において、本発明は、対象における高コレステロール血症の処置方法を提供する。本方法は、治療有効量の本発明のRNAi剤、例えば、二本鎖RNAi剤、又はベクターを対象に投与し、それにより、対象を処置する工程を含む。

0062

一実施形態において、対象は、霊長類はげ歯類である。別の実施形態において、対象はヒトである。

0063

一実施形態において、RNAi剤、例えば、二本鎖RNAi剤は、約0.01mg/kg〜約10mg/kg又は約0.5mg/kg〜約50mg/kgの用量で投与される。別の実施形態において、二本鎖RNAi剤は、約10mg/kg〜約30mg/kgの用量で投与される。

0064

一実施形態において、RNAi剤、例えば、二本鎖RNAi剤は、皮下又は静脈内投与される。

0065

一実施形態において、RNAi剤は、初期投与段階と、その後の維持段階を含む投与計画で投与され、初期投与段階は、週に5回、2mg/kg、1mg/kg又は0.5mg/kgの用量を投与することを含み、維持段階は、週に1回、2回、若しくは3回、2週間に1回、3週間に1回、月に1回、2ヶ月に1回、3ヶ月に1回、4ヶ月に1回、5ヶ月に1回、又は6ヶ月に1回、2mg/kg、1mg/kg又は0.5mg/kgの用量を投与することを含む。

0066

一実施形態において、RNAi剤は、2つ以上の用量で投与される。特定の実施形態において、RNAi剤は、約12時間に1回、約24時間に1回、約48時間に1回、約72時間に1回、及び約96時間に1回からなる群から選択される間隔で投与される。

0067

一実施形態において、本方法は、対象のLDLR遺伝子型又は表現型を決定する工程を更に含む。

0068

一実施形態において、投与により、対象における血清コレステロールが低下される。

0069

一実施形態において、本方法は、対象における血清コレステロールレベルを決定する工程を更に含む。

0070

本発明は、以下の詳細な説明及び図面によって更に例示される。

図面の簡単な説明

0071

試験される全ての3つの投与量でGalNAcにコンジュゲートされるAD−48400による用量応答効果があることを示すグラフである。GalNAcにコンジュゲートされるAD−48399は、対照として働く。
示されるsiRNAについてのインビボでの有効性及び応答の持続時間を示すグラフである。
インビボでの有効性及びリード最適化について分析された二本鎖のセンス(出現する順にそれぞれ、配列番号1633〜1642)鎖及びアンチセンス(出現する順にそれぞれ、配列番号1643〜1652)鎖の配列を示す表である。
リード最適化のためのインビボでの有効性アッセイの結果を示すグラフである。
PCSK9トランスジェニックマウスにおいて行われるインビボでの用量応答アッセイの結果を示すグラフである。10mg/kg、3mg/kg、1mg/kg、及び0.3mg/kgのAD−57928の単回投与の72時間後、PCSK9タンパク質レベルを、ELISAによって測定した。
「初期投与段階」中の5×2mg/kgの用量及び「維持段階」中の1×2mg/kg又は2×2mg/kgの用量でのAD−57928の投与の後のPCSK9トランスジェニックマウスの血清中のPCSK9タンパク質のレベルを示すグラフである。
「初期投与段階」中の5×1mg/kgの用量及び「維持段階」中の1×1mg/kg又は2×1mg/kgの用量でのAD−57928の投与の後のPCSK9トランスジェニックマウスの血清中のPCSK9タンパク質のレベルを示すグラフである。
「初期投与段階」中の5×0.5mg/kgの用量及び「維持段階」中の1×0.5mg/kg又は2×0.5mg/kgの用量でのAD−57928の投与の後のPCSK9トランスジェニックマウスの血清中のPCSK9タンパク質のレベルを示すグラフである。
PCSK9トランスジェニックマウスにおいて行われるインビボでの用量応答アッセイの結果を示すグラフである。0.3mg/kgのsiRNAの単回投与の72時間後、PCSK9タンパク質レベルを、ELISAによって測定した。
1mg/kgのAD−57928又はAD−58895の単回用量を投与した後のC57B6野生型マウスの肝臓のナノグラム当たりのAD−57928及びAD−58895の量を示すグラフである。
1mg/kgのAD−57928又はAD−58895の単回用量を投与した後のC57B6野生型マウスの肝臓中の理論量における%として表されるAD−57928及びAD−58895の量を示すグラフである。
AD−57928配列と比較した際の、最適化された配列を含む本発明のiRNA剤を示す表である。図12Aには、出現する順にそれぞれ、配列番号1653〜1658としての「センス」配列、及び出現する順にそれぞれ、配列番号1659〜1664としての「アンチセンス」配列が開示されている。
示されるiRNA剤のIC50値を示すグラフである。
示されるiRNA剤の単回の1mg/kgの用量の投与の後の、野生型マウスの肝臓中の示されるiRNA剤のレベルを示すグラフである。
qdx5+qwx3での示されるiRNA剤の投与の後の、PCSK9の前採血(pre−bleed)のレベルに対して残っているPCSK9のパーセントとして表される非ヒト霊長類の血清中のPCSK9タンパク質の量を示すグラフである。
qdx5+qwx3での示されるiRNA剤の投与の後の、非ヒト霊長類の血清中のPCSK9タンパク質の絶対量を示すグラフである。
qdx5+qwx3での示されるiRNA剤の投与の後の、LDLの前採血のレベルに対して残っているLDLのパーセントとして表される非ヒト霊長類の血清中の低比重リポタンパクコレステロール(LDL又はLDLc)の量を示すグラフである。
2mg/kg、q1w及び1mg/kg、2xwでのAD−57928の投与の後の、LDLの前採血のレベルの平均量におけるパーセントとして表される非ヒト霊長類の血清中の低比重リポタンパクコレステロール(LDL又はLDLc)の量を示すグラフである。
2mg/kg、q1w及び1mg/kg、2xwでのAD−57928の投与の後の、非ヒト霊長類の血清中の前採血の量に対するPCSK9タンパク質の量を示すグラフである。
2mg/kg、2xw及び単回の25mg/kgの用量でのAD−57928の投与の後の、LDLの前採血のレベルの平均量におけるパーセントとして表される非ヒト霊長類の血清中の低比重リポタンパクコレステロール(LDL又はLDLc)の量を示すグラフである。2mg/kg、2xw群の最終投与は、36日目であった。
2mg/kg、2xw及び単回の25mg/kgの用量でのAD−57928の投与の後の、非ヒト霊長類の血清中の前採血の量に対するPCSK9タンパク質の量を示すグラフである。
qdx5+qwx3での示されるiRNA剤の投与の後の、LDLの前採血のレベルに対して残っているLDLのパーセントとして表される非ヒト霊長類の血清中の低比重リポタンパクコレステロール(LDL又はLDLc)の量を示すグラフである。
qdx5+qwx3での示されるiRNA剤の投与の後の、LDLの前採血のレベルに対して残っているLDLのパーセントとして表される非ヒト霊長類の血清中の低比重リポタンパクコレステロール(LDL又はLDLc)の量を示すグラフである。

0072

本発明は、PCSK9を標的とするRNAi剤、例えば、二本鎖iRNA剤を含む組成物を提供する。PCSK9発現を阻害し、PCSK9発現に関連する病変、例えば、高コレステロール血症を処置するための本発明の組成物の使用方法も開示される。

0073

I.定義
本発明がより容易に理解され得るように、いくつかの用語がまず定義される。更に、変数の値又は値の範囲が記載されるときは常に、記載される値の中間の値及び範囲も、本発明の一部であることが意図されることに留意されたい。

0074

詞「a」及び「an」は、その冠詞の文法目的語の1つ又は2つ以上(すなわち、少なくとも1つ)を指すために本明細書において使用される。例として、「要素(an element)」は、1つの要素又は2つ以上の要素、例えば、複数の要素を意味する。

0075

「〜を含む(including)」という用語は、「〜を含むがこれらに限定されない(including but not limited to)」という語句を意味するために本明細書において使用され、この語句と同義的に使用される。

0076

「又は」という用語は、文脈上明らかに他の意味を示さない限り、「及び/又は」という用語を意味するために本明細書において使用され、この用語と同義的に使用される。

0077

本明細書において使用される際、「PCSK9」は、プロタンパク質転換酵素サブチリシンケキシン9遺伝子又はタンパク質を指す。PCSK9は、FH3、HCHOLA3、NARC−1、又はNARClとしても知られている。CSK9という用語は、ヒトPCSK9(そのアミノ酸及びヌクレオチド配列が、例えば、GenBank登録番号GI:299523249に見られる);マウスPCSK9(そのアミノ酸及びヌクレオチド配列が、例えば、GenBank登録番号GI:163644257に見られる);ラットPCSK9(そのアミノ酸及びヌクレオチド配列が、例えば、GenBank登録番号GI:77020249に見られる)を含む。PCSK9mRNA配列の更なる例が、例えば、GenBankを用いて容易に利用可能である。

0078

本明細書において使用される際、「標的配列」は、一次転写産物のRNAプロセシングの産物であるmRNAを含む、PCSK9遺伝子の転写の際に形成されるmRNA分子のヌクレオチド配列の連続する部分を指す。

0079

本明細書において使用される際、「配列を含む鎖」という用語は、標準的なヌクレオチドの命名法を用いて示される配列によって表されるヌクレオチドの鎖を含むオリゴヌクレオチドを指す。

0080

「G」、「C」、「A」及び「U」はそれぞれ、一般に、それぞれ、塩基としてグアニンシトシンアデニン、及びウラシルを含むヌクレオチドを表す。「T」及び「dT」は、本明細書において同義的に使用され、核酸塩基が、チミン、例えば、デオキシリボチミン、2’−デオキシチミジン又はチミジンであるデオキシリボヌクレオチドを指す。しかしながら、「リボヌクレオチド」又は「ヌクレオチド」又は「デオキシリボヌクレオチド」という用語は、以下に更に詳述されるように、修飾ヌクレオチド、又は代理置換部分(surrogate replacement moiety)も指し得ることが理解されよう。当業者は、グアニン、シトシン、アデニン、及びウラシルが、このような置換部分を有するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの塩基対合特性をそれほど変化させずに他の部分によって置換され得ることを十分に認識している。例えば、限定はされないが、その塩基としてイノシンを含むヌクレオチドが、アデニン、シトシン、又はウラシルを含むヌクレオチドと塩基対合し得る。したがって、ウラシル、グアニン、又はアデニンを含むヌクレオチドは、本発明のヌクレオチド配列において、例えば、イノシンを含むヌクレオチドによって置換され得る。このような置換部分を含む配列は、本発明の実施形態である。

0081

本明細書において同義的に使用される「iRNA」、「RNAi剤」、「iRNA剤」、「RNA干渉剤」という用語は、その用語が本明細書において定義されるように、RNAを含有し、且つRNA誘導サイレンシング複合体RISC)経路を介してRNA転写物の標的化された切断を仲介する剤を指す。iRNAは、RNA干渉(RNAi)として公知のプロセスによってmRNAの配列に特異的な分解を導く。iRNAは、細胞、例えば、哺乳動物対象などの対象中の細胞内でのPCSK9の発現を調節する(例えば阻害する)。

0082

一実施形態において、本発明のRNAi剤は、標的RNA配列、例えば、PCSK9標的mRNA配列と相互作用して、標的RNAの切断を導く一本鎖RNAを含む。理論に制約されるのを望むものではないが、細胞中に導入される長い二本鎖RNAが、Dicerとして公知のIII型エンドヌクレアーゼによってsiRNAに分解されると考えられる(Sharp et al.(2001)Genes Dev.15:485)。リボヌクレアーゼII様酵素であるDicerは、dsRNAをプロセシングして、特徴的な2つの塩基3’オーバーハングを有する19〜23塩基対の短干渉RNAにする(Bernstein,et al.,(2001)Nature 409:363)。次に、siRNAは、RNA誘導サイレンシング複合体(RISC)に組み込まれ、ここで、1つ又は複数のヘリカーゼが、siRNA二本鎖をほどいて、相補的なアンチセンス鎖が、標的認識を導くことを可能にする(Nykanen,et al.,(2001)Cell 107:309)。適切な標的mRNAに結合すると、RISC中の1つ又は複数のエンドヌクレアーゼが標的を切断して、サイレンシングを誘導する(Elbashir,et al.,(2001)Genes Dev.15:188)。ここで、一態様において、本発明は、細胞中で生成され、且つ標的遺伝子、すなわち、PCSK9遺伝子のサイレンシングをもたらすRISC複合体の形成を促進する一本鎖RNA(siRNA)に関する。したがって、「siRNA」という用語はまた、上記のRNAiを指すために本明細書において使用される。

0083

別の実施形態において、RNAi剤は、標的mRNAを阻害するために細胞又は生物に導入される一本鎖siRNAであり得る。一本鎖RNAi剤は、RISCエンドヌクレアーゼArgonaute 2に結合し、これが、次に、標的mRNAを切断する。一本鎖siRNAは、一般に、15〜30のヌクレオチドであり、化学的に修飾される。一本鎖siRNAの設計及び試験が、米国特許第8,101,348号明細書及びLima et al.,(2012)Cell 150:883−894に記載され、それぞれの全内容が、参照により本明細書に援用される。本明細書に記載されるアンチセンスヌクレオチド配列のいずれかが、本明細書に記載されるような又はLima et al.,(2012)Cell 150;:883−894に記載される方法によって化学的に修飾される一本鎖siRNAとして使用され得る。

0084

別の実施形態において、本発明の組成物、使用及び方法に使用するための「iRNA」は、二本鎖RNAであり、本明細書において「二本鎖RNAi剤」、「二本鎖RNA(dsRNA)分子」、「dsRNA剤」、又は「dsRNA」と呼ばれる。「dsRNA」という用語は、標的RNA、すなわち、PCSK9遺伝子に対する「センス」及び「アンチセンス」配向を有することが示される、2本の逆平行で且つ実質的に相補的な核酸鎖を含む二本鎖構造を有するリボ核酸分子の複合体を指す。本発明のある実施形態において、二本鎖RNA(dsRNA)は、本明細書においてRNA干渉又はRNAiと呼ばれる、転写後遺伝子サイレンシング機構による、標的RNA、例えば、mRNAの分解を引き起こす。

0085

一般に、dsRNA分子のそれぞれの鎖のヌクレオチドの大部分は、リボヌクレオチドであるが、本明細書において詳細に記載されるように、それぞれの又は両方の鎖は、1つ又は複数の非リボヌクレオチド、例えば、デオキシリボヌクレオチド及び/又は修飾ヌクレオチドも含み得る。更に、本明細書において使用される際、「RNAi剤」は、化学的修飾を有するリボヌクレオチドを含んでいてもよく;RNAi剤は、複数のヌクレオチドにおける実質的な修飾を含み得る。このような修飾は、本明細書に開示されるか又は当該技術分野において公知のあらゆるタイプの修飾を含み得る。siRNAタイプの分子に使用される際のいずれのこのような修飾も、本明細書及び特許請求の範囲の目的のために「RNAi剤」によって包含される。

0086

二本鎖構造を形成する2本の鎖は、1つのより大きいRNA分子の異なる部分であってもよく、又はそれらは別個のRNA分子であってもよい。2本の鎖が、1つのより大きい分子の一部であり、したがって、二本鎖構造を形成する1本の鎖の3’末端とその他方の鎖の5’末端との間のヌクレオチドの連続した鎖によって結合された場合、結合するRNA鎖は、「ヘアピンループ」と呼ばれる。2本の鎖が、二本鎖構造を形成する1本の鎖の3’末端とその他方の鎖の5’末端との間のヌクレオチドの連続した鎖以外の手段によって共有結合された場合、結合構造は、「リンカー」と呼ばれる。RNA鎖は、同じか又は異なる数のヌクレオチドを有し得る。塩基対の最大数は、dsRNAの最も短い鎖のヌクレオチドの数から、二本鎖に存在するオーバーハングを引いた数である。二本鎖構造に加えて、RNAi剤は、1つ又は複数のヌクレオチドオーバーハングを含み得る。

0087

一実施形態において、本発明のRNAi剤は、標的RNA配列、例えば、PCSK9標的mRNA配列と相互作用して、標的RNAの切断を導く24〜30のヌクレオチドのdsRNAである。理論に制約されるのを望むものではないが、細胞中に導入される長い二本鎖RNAは、Dicerとして公知のIII型エンドヌクレアーゼによってsiRNAに分解される(Sharp et al.(2001)Genes Dev.15:485)。リボヌクレアーゼIII様酵素であるDicerは、dsRNAをプロセシングして、特徴的な2つの塩基3’オーバーハングを有する19〜23塩基対短干渉RNAにする(Bernstein,et al.,(2001)Nature 409:363)。次に、siRNAは、RNA誘導サイレンシング複合体(RISC)に組み込まれ、ここで、1つ又は複数のヘリカーゼが、siRNA二本鎖をほどいて、相補的なアンチセンス鎖が、標的認識を導くことを可能にする(Nykanen,et al.,(2001)Cell 107:309)。適切な標的mRNAに結合すると、RISC中の1つ又は複数のエンドヌクレアーゼが標的を切断して、サイレンシングを誘導する(Elbashir,et al.,(2001)Genes Dev.15:188)。本明細書において使用される際、「ヌクレオチドオーバーハング」は、RNAi剤の1本の鎖の3’末端が、他方の鎖の5’末端を越えて延びるか、又はその逆である場合、RNAi剤の二本鎖構造から突出する1つ又は複数の不対ヌクレオチドを指す。「平滑な」又は「平滑末端」は、二本鎖RNAi剤の該当する末端に不対ヌクレオチドが存在しない、即ち、ヌクレオチドオーバーハングが存在しないことを意味する。「平滑末端」RNAi剤は、その全長にわたって二本鎖である、即ち、分子のいずれの末端にもヌクレオチドオーバーハングが存在しないdsRNAである。本発明のRNAi剤は、一方の末端にヌクレオチドオーバーハングを有するRNAi剤(即ち、1つのオーバーハング及び1つの平滑末端を有する剤)又は両方の末端にヌクレオチドオーバーハングを有するRNAi剤を含む。

0088

「アンチセンス鎖」という用語は、標的配列に実質的に相補的な領域を含む二本鎖RNAi剤(例えば、ヒトPCSK9mRNA)の鎖を指す。本明細書において使用される際、「トランスサイレチンをコードするmRNAの一部に相補的な領域」という用語は、PCSK9mRNA配列の一部に実質的に相補的なアンチセンス鎖の領域を指す。相補性の領域が、標的配列に完全には相補的でない場合、ミスマッチは、末端領域において最も許容され、存在する場合、一般に、1つ又は複数の末端領域、例えば、5’末端及び/又は3’末端の6、5、4、3、又は2つのヌクレオチド中に存在する。

0089

本明細書において使用される際の「センス鎖」という用語は、アンチセンス鎖の領域と実質的に相補的な領域を含むdsRNAの鎖を指す。

0090

本明細書において使用される際、「切断領域」という用語は、切断部位に直接隣接して位置する領域を指す。切断部位は、標的における、切断が生じる部位である。ある実施形態において、切断領域は、切断部位のいずれかの末端で、切断部位に直接隣接した3つの塩基を含む。ある実施形態において、切断領域は、切断部位のいずれかの末端で、切断部位に直接隣接した2つの塩基を含む。ある実施形態において、切断部位は、アンチセンス鎖のヌクレオチド10及び11によって結合される部位で特異的に生じ、切断領域は、ヌクレオチド11、12及び13を含む。

0091

本明細書において使用される際、特に示されない限り、「相補的な」という用語は、当業者により理解されるように、第1のヌクレオチド配列を第2のヌクレオチド配列と関連して記載するのに使用される場合、第1のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドが、所定の条件下で、第2のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドとハイブリダイズし、二本鎖構造を形成する能力を指す。このような条件は、例えば、ストリンジェントな条件であり得、ここで、ストリンジェントな条件は、400mMのNaCl、40mMのPIPES(pH6.4)、1mMのEDTA、50℃又は70℃で12〜16時間と、それに続く洗浄を含み得る。生物の内部で起こり得る生理学的に関連した条件などの他の条件を適用することができる。例えば、相補的な配列は、核酸の関連する機能、例えば、RNAiを進行させるのに十分である。当業者は、ハイブリダイズされたヌクレオチドの最終的な用途に従って、2つの配列の相補性の試験に最も適切な条件の組を決定することができるであろう。

0092

配列は、第1及び第2のヌクレオチド配列の全長にわたる、第1のヌクレオチド配列を含むヌクレオチドと、第2のヌクレオチド配列を含むヌクレオチドとの塩基対合がある場合、互いに対して「完全に相補的」であり得る。しかしながら、第1の配列が、本明細書において第2の配列に対して「実質的に相補的な」と称される場合、2つの配列は、完全に相補的であり得、又は、それらの最終的な適用に最も関連する条件下でハイブリダイズする能力を保持しながら、ハイブリダイゼーションを行うと、それらは、1つ又は複数であるが、一般に、4、3又は2以下のミスマッチ塩基対を形成し得る。しかしながら、2つのオリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーションの際に1つ又は複数の一本鎖オーバーハングを形成するように設計されている場合、このようなオーバーハングは、相補性の決定に関してはミスマッチと見なされないものとする。例えば、本明細書に記載される目的のために、21ヌクレオチド長の一方のオリゴヌクレオチドと、23ヌクレオチド長の別のオリゴヌクレオチドとを含むdsRNAは、長い方のオリゴヌクレオチドが、短い方のオリゴヌクレオチドに対して完全に相補的な21ヌクレオチドの配列を含む場合、「完全に相補的な」と称されてもよい。

0093

本明細書において使用される際の「相補的な」配列は、それらのハイブリダイズする能力に関連した上記の要求が満たされる限り、非ワトソンクリック塩基対及び/又は非天然及び修飾ヌクレオチドから形成される塩基対も含むことができ、又はこのような塩基対から完全に形成され得る。このような非ワトソン−クリック塩基対としては、限定はされないが、G:Uゆらぎ又はフーグスティーン型塩基対が挙げられる。

0094

本明細書における「相補的な」、「完全に相補的な」及び「実質的に相補的な」という用語は、それらの使用の状況から理解されるように、dsRNAのセンス鎖とアンチセンス鎖との間で、又はdsRNAのアンチセンス鎖と標的配列との間で、一致する塩基に関連して使用され得る。

0095

本明細書において使用される際、メッセンジャーRNA(mRNA)「の少なくとも一部に実質的に相補的な」ポリヌクレオチドは、5’UTR、オープンリーディングフレーム(ORF)、又は3’UTRを含む目的のmRNA(例えば、PCSK9をコードするmRNA)の連続する部分に実質的に相補的なポリヌクレオチドを指す。例えば、ポリヌクレオチドは、その配列がPCSK9をコードするmRNAの連続する部分と実質的に相補的である場合、PCSK9 mRNAの少なくとも一部に相補的である。

0096

本明細書において使用される際の「阻害する」という用語は、「低下させる」、「サイレンシングする」、「下方制御する」、「抑制する」及び他の類似語と同義的に使用され、任意のレベルの阻害を含む。

0097

本明細書において使用される際の「PCSK9の発現を阻害する」という語句は、任意のPCSK9遺伝子(例えば、マウスPCSK9遺伝子、ラットPCSK9遺伝子、サルPCSK9遺伝子、又はヒトPCSK9遺伝子など)ならびに変異体、(例えば、自然発生変異体)、又はPCSK9遺伝子の突然変異体の発現の阻害を含む。したがって、PCSK9遺伝子は、野生型PCSK9遺伝子、突然変異体PCSK9遺伝子、又は遺伝子組み換えされた細胞、細胞群、又は生物の文脈におけるトランスジェニックPCSK9遺伝子であり得る。

0098

「PCSK9遺伝子の発現を阻害する」は、PCSK9遺伝子の任意のレベルの阻害、例えば、少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%,少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%などの、PCSK9遺伝子の発現の少なくとも部分的な抑制を含む。

0099

PCSK9遺伝子の発現は、PCSK9遺伝子の発現に関連する任意の変数のレベル、例えば、PCSK9mRNAレベル、PCSK9タンパク質レベル、又は血清脂質レベルに基づいて評価され得る。阻害は、対照のレベルと比較したこれらの変数の1つ又は複数の絶対的又は相対的レベルの低下によって評価され得る。対照のレベルは、当該技術分野において用いられる任意のタイプの対照のレベル、例えば、投与前ベースライン(pre−dose baseline)レベル、又は非処理又は対照(例えば、緩衝液のみの対照又は不活性な剤の対照など)で処理された同様の対象、細胞、又は試料から測定されるレベルであり得る。

0100

本明細書において使用される際の「細胞を二本鎖RNAi剤と接触させる」という語句は、任意の可能な手段によって細胞を接触させることを含む。細胞を二本鎖RNAi剤と接触させる工程は、細胞をRNAi剤とインビトロで接触させる工程又は細胞をRNAi剤とインビボで接触させる工程を含む。接触は、直接又は間接的に行われ得る。したがって、例えば、RNAi剤は、方法を個々に行うことによって細胞と物理的に接触されてもよく、あるいは、RNAi剤は、それを後に細胞と接触させるのを可能にするか又はそれを後に細胞と接触させる状況に置かれてもよい。

0101

細胞をインビトロで接触させる工程は、例えば、RNAi剤とともに細胞をインキュベートすることによって行われ得る。細胞をインビボで接触させる工程は、RNAi剤が接触される細胞が位置する組織に後に到達するように、例えば、RNAi剤を、細胞が位置する組織中又は組織の近傍に注入することによって、又はRNAi剤を、別の領域、血流又は皮下腔中に注入することによって行われ得る。例えば、RNAi剤は、目的の部位、例えば、肝臓にRNAi剤を指向するリガンド、例えば、GalNAc3リガンドを含んでいてもよく、及び/又はそれに結合され得る。インビトロ及びインビボでの接触方法の組合せも可能である。本発明の方法に関連して、細胞はまた、RNAi剤とインビトロで接触され、その後、対象に移植されてもよい。

0102

本明細書において使用される際の「患者」又は「対象」は、ヒト又は非ヒト動物のいずれか、好ましくは、哺乳動物、例えば、サルを含むことが意図される。最も好ましくは、対象又は患者はヒトである。

0103

本明細書において使用される際の「PCSK9に関連する疾病」は、PCSK9遺伝子又はタンパク質に関連する任意の疾病を含むことが意図される。このような疾病は、例えば、PCSK9タンパク質の過剰な産生によって、PCSK9遺伝子の突然変異によって、PCSK9タンパク質の異常な切断によって、PCSK9と他のタンパク質との間の異常な相互作用又は他の内因性若しくは外因性物質によって引き起こされ得る。例示的なPCSK9に関連する疾病としては、脂肪血症、例えば、高脂質血症、ならびに高コレステロール血症、高トリグリセリド血症及び心疾患及び循環器系疾患などのこれらの障害に関連する病態などの他の形態の脂質の不均衡が挙げられる。

0104

本明細書において使用される際の「治療有効量」は、PCSK9に関連する疾病を処置するために患者に投与される場合、(例えば、既存の疾病又は疾病の1つ又は複数の症状を軽減し、改善し、又は維持することによって)この疾病の処置を行うのに十分な、RNAi剤の量を含むことが意図される。「治療有効量」は、RNAi剤、RNAi剤が投与される方法、疾病及びその重症度ならびに処置される患者の病歴年齢、体重、家族歴遺伝子構造、PCSK9発現によって媒介される病理学過程の段階、もしあれば、以前の処置又は併用処置のタイプ、及び他の個体特性に応じて変化し得る。

0105

本明細書において使用される際の「予防的に有効な量」は、PCSK9に関連する疾病の症状をまだ生じても又は示してもいないが、この疾病に罹患しやすい可能性のある対象に投与される場合、この疾病又はこの疾病の1つ又は複数の症状を予防又は改善するのに十分な、RNAi剤の量を含むことが意図される。疾病の改善は、この疾病の経過を遅らせること又は後から発症する疾病の重症度を軽減することを含む。「予防的に有効な量」は、RNAi剤、薬剤が投与される方法、疾病に罹患する危険度、ならびに処置される患者の病歴、年齢、体重、家族歴、遺伝子構造、もしあれば、以前の処置又は併用処置のタイプ、及び他の個体特性に応じて変化し得る。

0106

「治療有効量」又は「予防的に有効な量」はまた、任意の処置に適用される妥当ベネフィットリスク比(benefit/risk ratio)である所望の局所又は全身的作用を生じる、RNAi剤の量を含む。本発明の方法に用いられるiRNA剤(gent)は、このような処置に適用される妥当なベネフィット・リスク比を得るのに十分な量で投与され得る。

0107

本明細書において使用される際の「試料」という用語は、対象から単離された類似の体液、細胞、又は組織、ならびに対象中に存在する体液、細胞、又は組織の集合体を含む。生体液の例としては、血液、血清及び漿膜液、血漿脳脊髄液、眼液、リンパ液、尿、唾液などが挙げられる。組織試料は、組織、器官又は局所領域に由来する試料を含み得る。例えば、試料は、特定の器官、器官の部分、あるいはそれらの器官中の体液又は細胞に由来し得る。特定の実施形態において、試料は、肝臓(例えば、全肝臓又は肝臓の特定の部分又は、例えば、肝細胞などの肝臓中の特定のタイプの細胞)に由来し得る。好ましい実施形態において、「対象に由来する試料」は、対象から得られる血液又は血漿を指す。更なる実施形態において、「対象に由来する試料」は、対象から得られる肝臓組織(又はその小部分(subcomponent))を指す。

0108

II.本発明のiRNA
対象、例えば、哺乳動物(脂質障害、例えば、高コレステロール血症に罹患しているヒトなど)中の細胞などの細胞内でのPCSK9遺伝子の発現を阻害する改良された二本鎖RNAi剤及びこのような二本鎖RNAi剤の使用が本明細書に記載される。

0109

本発明の二本鎖RNAi剤としては、例えば、全内容が参照により本明細書に援用される、2011年11月18日に出願された米国仮特許出願第61/561,710号明細書に開示される化学的修飾を有する薬剤が挙げられる。

0110

本明細書及び米国仮特許出願第61/561,710号明細書に示されるように、より優れた結果が、3連続ヌクレオチド上の3つの同一の修飾の1つ又は複数のモチーフを、RNAi剤のセンス鎖及び/又はアンチセンス鎖中、特に、切断部位又はその近傍に導入することによって得られる。ある実施形態において、RNAi剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖は、あるいは完全に修飾され得る。これらのモチーフの導入により、存在する場合、センス鎖及び/又はアンチセンス鎖の修飾パターン中断される。RNAi剤は、例えば、センス鎖上で、GalNAc誘導体リガンドと任意選択でコンジュゲートされ得る。得られたRNAi剤は、より優れた遺伝子サイレンシング活性を示す。

0111

より詳細には、二本鎖RNAi剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖が、RNAi剤の少なくとも1つの鎖の切断部位又はその近傍に3連続ヌクレオチド上の3つの同一の修飾の1つ又は複数のモチーフを有するように完全に修飾される場合、RNAi剤の遺伝子サイレンシング活性が優位に向上されたことが意外にも発見された。

0112

したがって、本発明は、インビボでの標的遺伝子(即ち、プロタンパク質転換酵素サブチリシンケキシン9(PCSK9)遺伝子)の発現を阻害することが可能な二本鎖RNAi剤を提供する。RNAi剤は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含む。RNAi剤の各鎖は、12〜30ヌクレオチド長の範囲であり得る。例えば、各鎖は、14〜30ヌクレオチド長、17〜30ヌクレオチド長、25〜30ヌクレオチド長、27〜30ヌクレオチド長、17〜23ヌクレオチド長、17〜21ヌクレオチド長、17〜19ヌクレオチド長、19〜25ヌクレオチド長、19〜23ヌクレオチド長、19〜21ヌクレオチド長、21〜25ヌクレオチド長、又は21〜23ヌクレオチド長であり得る。

0113

センス鎖及びアンチセンス鎖は、典型的に、本明細書において「RNAi剤」とも呼ばれる二本鎖RNA(「dsRNA」)を形成する。RNAi剤の二本鎖領域は、12〜30ヌクレオチド対長であり得る。例えば、二本鎖領域は、14〜30ヌクレオチド対長、17〜30ヌクレオチド対長、27〜30ヌクレオチド対長、17〜23ヌクレオチド対長、17〜21ヌクレオチド対長、17〜19ヌクレオチド対長、19〜25ヌクレオチド対長、19〜23ヌクレオチド対長、19〜21ヌクレオチド対長、21〜25ヌクレオチド対長、又は21〜23ヌクレオチド対長であり得る。別の例では、二本鎖領域は、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、及び27ヌクレオチド長から選択される。

0114

一実施形態において、RNAi剤は、1つ又は両方の鎖の3’末端、5’末端、又は両方の末端において1つ又は複数のオーバーハング領域及び/又はキャッピング基を含み得る。オーバーハングは、1〜6ヌクレオチド長、例えば、2〜6ヌクレオチド長、1〜5ヌクレオチド長、2〜5ヌクレオチド長、1〜4ヌクレオチド長、2〜4ヌクレオチド長、1〜3ヌクレオチド長、2〜3ヌクレオチド長、又は1〜2ヌクレオチド長であり得る。オーバーハングは、1つの鎖が他の鎖より長い結果であるか、又は同じ長さの2つの鎖が互い違いになっている結果であり得る。オーバーハングは、標的mRNAとのミスマッチを形成し得るか、又はオーバーハングは、標的とされる遺伝子配列に相補的であり得るか、又は別の配列であり得る。第1及び第2の鎖がまた、例えば、ヘアピンを形成するように更なる塩基によって、又は他の非塩基リンカーによって結合され得る。

0115

一実施形態において、RNAi剤のオーバーハング領域中のヌクレオチドはそれぞれ、独立して、限定はされないが、2−F、2’−Oメチル、チミジン(T)、2’−O−メトキシエチル−5−メチルウリジン(Teo)、2’−O−メトキシエチルアデノシンAeo)、2’−O−メトキシエチル−5−メチルシチジン(m5Ceo)、及びそれらの任意の組合せなどの、2’−糖修飾を含む、修飾又は非修飾ヌクレオチドであり得る。例えば、TTは、いずれかの鎖上のいずれかの末端のためのオーバーハング配列であり得る。オーバーハングは、標的mRNAとのミスマッチを形成し得るか、又はオーバーハングは、標的とされる遺伝子配列に相補的であり得るか、又は別の配列であり得る。

0116

RNAi剤のセンス鎖、アンチセンス鎖又は両方の鎖における5’−又は3’−オーバーハングは、リン酸化され得る。ある実施形態において、オーバーハング領域は、2つのヌクレオチド間にホスホロチオエートを有する2つのヌクレオチドを含み、ここで、2つのヌクレオチドは、同じか又は異なり得る。一実施形態において、オーバーハングは、センス鎖、アンチセンス鎖、又は両方の鎖の3’末端に存在する。一実施形態において、この3’−オーバーハングは、アンチセンス鎖中に存在する。一実施形態において、この3’−オーバーハングは、センス鎖中に存在する。

0117

RNAi剤は、その全体的安定性に影響を与えずに、RNAiの干渉活性を強化し得る1つのみのオーバーハングを含み得る。例えば、一本鎖オーバーハングは、センス鎖の3’末端、あるいは、アンチセンス鎖の3’末端に位置し得る。RNAiは、アンチセンス鎖の5’末端(又はセンス鎖の3’末端)又はその逆に位置する平滑末端も有し得る。一般に、RNAiのアンチセンス鎖は、3’末端にヌクレオチドオーバーハングを有し、5’末端は平滑である。理論に制約されるのを望むものではないが、アンチセンス鎖の5’末端及びアンチセンス鎖の3’末端オーバーハングにおける非対称の平滑末端は、RISCプロセスへのガイド鎖導入に有利に働く。

0118

一実施形態において、RNAi剤は、19ヌクレオチド長の平滑末端二本鎖(double ended bluntmer)であり、センス鎖は、5’末端から7位、8位、9位の3連続ヌクレオチドにおける3つの2’−F修飾の少なくとも1つのモチーフを含む。アンチセンス鎖は、5’末端から11位、12位、13位の3連続ヌクレオチドにおける3つの2’−O−メチル修飾の少なくとも1つのモチーフを含む。

0119

別の実施形態において、RNAi剤は、20ヌクレオチド長の平滑末端二本鎖であり、センス鎖は、5’末端から8位、9位、10位の3連続ヌクレオチドにおける3つの2’−F修飾の少なくとも1つのモチーフを含む。アンチセンス鎖は、5’末端から11位、12位、13位の3連続ヌクレオチドにおける3つの2’−O−メチル修飾の少なくとも1つのモチーフを含む。

0120

更に別の実施形態において、RNAi剤は、21ヌクレオチド長の平滑末端二本鎖であり、センス鎖は、5’末端から9位、10位、11位の3連続ヌクレオチドにおける3つの2’−F修飾の少なくとも1つのモチーフを含む。アンチセンス鎖は、5’末端から11位、12位、13位の3連続ヌクレオチドにおける3つの2’−O−メチル修飾の少なくとも1つのモチーフを含む。

0121

一実施形態において、RNAi剤は、21ヌクレオチドセンス鎖及び23ヌクレオチドアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、5’末端から9位、10位、11位の3連続ヌクレオチドにおける3つの2’−F修飾の少なくとも1つのモチーフを含み;アンチセンス鎖は、5’末端から11位、12位、13位の3連続ヌクレオチドにおける3つの2’−O−メチル修飾の少なくとも1つのモチーフを含み、RNAi剤の一方の末端が平滑である一方、他方の末端は、2つのヌクレオチドオーバーハングを含む。好ましくは、2つのヌクレオチドオーバーハングは、アンチセンス鎖の3’末端にある。2つのヌクレオチドオーバーハングが、アンチセンス鎖の3’末端にある場合、末端の3つのヌクレオチドの間に2つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合があり得、3つのうちの2つのヌクレオチドが、オーバーハングヌクレオチドであり、第3のヌクレオチドは、オーバーハングヌクレオチドに隣接する対合ヌクレオチドである。一実施形態において、RNAi剤は、センス鎖の5’末端及びアンチセンス鎖の5’末端の両方における末端の3つのヌクレオチドの間に2つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を更に有する。一実施形態において、モチーフの一部であるヌクレオチドを含む、RNAi剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖中の全てのヌクレオチドが、修飾ヌクレオチドである。一実施形態において、各残基が、独立して、例えば、交互のモチーフ中で、2’−O−メチル又は3’−フルオロで修飾される。任意選択で、RNAi剤は、リガンド(好ましくは、GalNAc3)を更に含む。

0122

一実施形態において、RNAi剤は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、RNAi剤は、少なくとも25且つ29以下のヌクレオチド長を有する第1の鎖と、5’末端から11位、12位、13位の3連続ヌクレオチドにおける3つの2’−O−メチル修飾の少なくとも1つのモチーフを含む、30ヌクレオチド長以下を有する第2の鎖とを含み;第1の鎖の3’末端及び第2の鎖の5’末端が、平滑末端を形成し、第2の鎖は、その3’末端で第1の鎖より1〜4ヌクレオチド長く、二本鎖領域は、少なくとも25ヌクレオチド長であり、第2の鎖は、RNAi剤が哺乳動物細胞中に導入されたときに標的遺伝子の発現を低下させるように、第2の鎖長の少なくとも19のヌクレオチドに沿って標的mRNAに十分に相補的であり、RNAi剤のダイサー切断(dicer cleavage)が、第2の鎖の3’末端を含むsiRNAを優先的にもたらし、それにより、哺乳動物における標的遺伝子の発現を低下させる。任意選択で、RNAi剤は、リガンドを更に含む。

0123

一実施形態において、RNAi剤のセンス鎖は、3連続ヌクレオチドにおける3つの同一の修飾の少なくとも1つのモチーフを含み、モチーフの1つは、センス鎖の切断部位に存在する。

0124

一実施形態において、RNAi剤のアンチセンス鎖も、3連続ヌクレオチドにおける3つの同一の修飾の少なくとも1つのモチーフを含むことができ、モチーフの1つは、アンチセンス鎖の切断部位又はその近傍に存在する。

0125

17〜23ヌクレオチド長の二本鎖領域を有するRNAi剤では、アンチセンス鎖の切断部位は、典型的に、5’末端から10位、11位及び12位の付近である。したがって、3つの同一の修飾のモチーフは、アンチセンス鎖の5’末端から1つ目のヌクレオチドから数え始めて、又は、アンチセンス鎖の5’末端から、二本鎖領域内の1つ目の対合ヌクレオチドから数え始めて、アンチセンス鎖の9位、10位、11位;10位、11位、12位;11位、12位、13位;12位、13位、14位;又は13位、14位、15位に存在し得る。アンチセンス鎖中の切断部位はまた、5’末端からのRNAiの二本鎖領域の長さに応じて変化し得る。

0126

RNAi剤のセンス鎖は、鎖の切断部位に3連続ヌクレオチドにおける3つの同一の修飾の少なくとも1つのモチーフを含んでいてもよく;アンチセンス鎖は、鎖の切断部位又はその近傍に3連続ヌクレオチドにおける3つの同一の修飾の少なくとも1つのモチーフを有し得る。センス鎖及びアンチセンス鎖がdsRNA二本鎖を形成する場合、センス鎖及びアンチセンス鎖は、センス鎖における3つのヌクレオチドの1つのモチーフ及びアンチセンス鎖における3つのヌクレオチドの1つのモチーフが、少なくとも1つのヌクレオチドの重複を有し、即ち、センス鎖中のモチーフの3つのヌクレオチドのうちの少なくとも1つが、アンチセンス鎖中のモチーフの3つのヌクレオチドのうちの少なくとも1つと塩基対を形成するように整列され得る。あるいは、少なくとも2つのヌクレオチドが重複してもよく、又は全ての3つのヌクレオチドが重複してもよい。

0127

一実施形態において、RNAi剤のセンス鎖は、3連続ヌクレオチドにおける3つの同一の修飾の2つ以上のモチーフを含み得る。第1のモチーフは、鎖の切断部位又はその近傍に存在してもよく、他のモチーフは、ウイング修飾(wing modification)であり得る。本明細書における「ウイング修飾」という用語は、同じ鎖の切断部位又はその近傍のモチーフから離れた鎖の別の部分に存在するモチーフを指す。ウイング修飾は、第1のモチーフに隣接するか、又は少なくとも1つ又は複数のヌクレオチドによって隔てられている。モチーフが、互いに直接隣接している場合、モチーフの化学構造は、互いに異なり、モチーフが、1つ又は複数のヌクレオチドによって隔てられている場合、化学構造は、同じか又は異なり得る。2つ以上のウイング修飾が存在し得る。例えば、2つのウイング修飾が存在する場合、各ウイング修飾は、切断部位又はその近傍の第1のモチーフに対して1つの端部に又はリードモチーフ(lead motif)のいずれかの側に存在し得る。

0128

センス鎖と同様に、RNAi剤のアンチセンス鎖は、3連続ヌクレオチドにおける3つの同一の修飾の2つ以上のモチーフを含んでいてもよく、モチーフの少なくとも1つが、鎖の切断部位又はその近傍に存在する。このアンチセンス鎖はまた、センス鎖に存在し得るウイング修飾と同様の配列で1つ又は複数のウイング修飾を含み得る。

0129

一実施形態において、RNAi剤のセンス鎖又はアンチセンス鎖におけるウイング修飾は、典型的に、鎖の3’末端、5’末端又は両方の末端に第1の1つ又は2つの末端ヌクレオチドを含まない。

0130

別の実施形態において、RNAi剤のセンス鎖又はアンチセンス鎖におけるウイング修飾は、典型的に、鎖の3’末端、5’末端又は両方の末端の二本鎖領域内に第1の1つ又は2つの対合ヌクレオチドを含まない。

0131

RNAi剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖がそれぞれ、少なくとも1つのウイング修飾を含む場合、ウイング修飾は、二本鎖領域の同じ末端に位置してもよく、1つ、2つ又は3つのヌクレオチドの重複を有し得る。

0132

RNAi剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖がそれぞれ、少なくとも2つのウイング修飾を含む場合、センス鎖及びアンチセンス鎖は、1つの鎖からの2つの修飾がそれぞれ、二本鎖領域の1つの末端に位置して、1つ、2つ又は3つのヌクレオチドの重複を有し;1つの鎖からの2つの修飾がそれぞれ、二本鎖領域の他方の末端に位置して、1つ、2つ又は3つのヌクレオチドの重複を有し;1つの鎖からの2つの修飾がリードモチーフの各側に位置して、二本鎖領域中に1つ、2つ又は3つのヌクレオチドの重複を有するように整列され得る。

0133

一実施形態において、モチーフの一部であるヌクレオチドを含む、RNAi剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖中の全てのヌクレオチドが修飾され得る。各ヌクレオチドは、同じ又は異なる修飾で修飾されてもよく、この修飾は、非結合リン酸酸素及び/又は結合リン酸酸素の1つ又は複数の一方又は両方の1つ又は複数の変更;リボース糖の成分、例えば、リボース糖の2’ヒドロキシルの変更;「脱リン(dephospho)」リンカーによるリン酸部分の大規模な置換;天然の塩基の修飾又は置換;及びリボース−リン酸骨格の置換又は修飾を含み得る。

0134

核酸が、サブユニットポリマーであるため、例えば、塩基、又はリン酸部分、又はリン酸部分の非結合Oの修飾といった修飾の多くは、核酸内の繰り返される位置に存在する。場合によっては、修飾は、核酸中の目的の位置の全てに存在し得るが、多くの場合、そうではない。例として、修飾は、3’又は5’末端位置のみに存在してもよく、末端領域、例えば、末端ヌクレオチド上の位置又は鎖の最後の2、3、4、5、又は10のヌクレオチドのみに存在してもよい。修飾は、二本鎖領域、一本鎖領域、又はその両方に存在してもよい。修飾は、RNAの二本鎖領域のみに存在してもよく、又はRNAの一本鎖領域のみに存在してもよい。例えば、非結合O位置におけるホスホロチオエート修飾は、一方又は両方の末端のみに存在してもよく、末端領域、例えば、末端ヌクレオチド上の位置又は鎖の最後の2、3、4、5、又は10のヌクレオチドのみに存在してもよく、又は二本鎖及び一本鎖領域、特に、末端に存在してもよい。5’末端又は両方の末端が、リン酸化され得る。

0135

例えば、安定性を高めること、オーバーハング中に特定の塩基を含むこと、又は一本鎖オーバーハング、例えば、5’又は3’オーバーハング、又はその両方に修飾ヌクレオチド又はヌクレオチド代用物(surrogate)を含むことが可能であり得る。例えば、オーバーハング中にプリンヌクレオチドを含むことが望ましいことがある。ある実施形態において、3’又は5’オーバーハング中の塩基の全て又は一部が、例えば、本明細書に記載される修飾で修飾されてもよい。修飾は、例えば、当該技術分野において公知の修飾によるリボース糖の2’位における修飾の使用、例えば、核酸塩基のリボ糖の代わりにデオキシリボヌクレオチド、2’−デオキシ−2’−フルオロ(2’−F)又は2’−O−メチル修飾の使用、及びリン酸基の修飾、例えば、ホスホロチオエート修飾を含み得る。オーバーハングは、標的配列と相同である必要はない。

0136

一実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖の各残基は、独立して、LNA、HNA、CeNA、2’−メトキシエチル、2’−O−メチル、2’−O−アリル、2’−C−アリル、2’−デオキシ、2’−ヒドロキシル、又は2’−フルオロで修飾される。鎖は、2つ以上の修飾を含み得る。一実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖の各残基は、独立して、2’−O−メチル又は2’−フルオロで修飾される。

0137

少なくとも2つの異なる修飾が、典型的に、センス鎖及びアンチセンス鎖に存在する。それらの2つの修飾は、2’−O−メチル又は2’−フルオロ修飾、又は他のものであり得る。

0138

一実施形態において、Na及び/又はNbは、交互のパターンの修飾を含む。本明細書において使用される際の「交互のモチーフ」という用語は、1つ又は複数の修飾を有するモチーフを指し、各修飾が、1つの鎖の交互のヌクレオチドに存在する。交互のヌクレオチドは、1つおきのヌクレオチドに1つ又は3つおきのヌクレオチドに1つ、又は同様のパターンを指し得る。例えば、A、B及びCがそれぞれ、ヌクレオチドに対する1つのタイプの修飾を表す場合、交互のモチーフは、「ABABABABABAB・・・」、「AABBAABBAABB・・・」、「AABAABAABAAB・・・」、「AAABAAABAAAB・・・」、「AAABBBAAABBB・・・」、又は「ABCABCABCABC・・・」などであり得る。

0139

交互のモチーフに含まれる修飾のタイプは、同じか又は異なり得る。例えば、A、B、C、Dがそれぞれ、ヌクレオチド上の1つのタイプの修飾を表す場合、交互のパターン、即ち、1つおきのヌクレオチドにおける修飾は、同じであってもよいが、センス鎖又はアンチセンス鎖のそれぞれが、「ABABAB・・・」、「ACACAC・・・」「BDBDBD・・・」又は「CDCDCD・・・」などの交互のモチーフ内の修飾のいくつかの可能性から選択され得る。

0140

一実施形態において、本発明のRNAi剤は、アンチセンス鎖における交互のモチーフの修飾パターンに対してシフトされた、センス鎖における交互のモチーフの修飾パターンを含む。このシフトは、センス鎖のヌクレオチドの修飾基が、アンチセンス鎖のヌクレオチドの異なる修飾の基に対応するか、その逆であるようなシフトであり得る。例えば、センス鎖は、dsRNA二本鎖におけるアンチセンス鎖と対合される場合、センス鎖における交互のモチーフは、鎖の5’から3’へと「ABABAB」から開始してもよく、アンチセンス鎖における交互のモチーフは、二本鎖領域内の鎖の5’から3’へと「BABABA」から開始され得る。別の例として、センス鎖における交互のモチーフは、鎖の5’から3’へと「AABBAABB」から開始してもよく、アンチセンス鎖における交互のモチーフは、二本鎖領域内の鎖の5’から3’へと「BBAABBAA」から開始してもよく、それにより、センス鎖とアンチセンス鎖との間の修飾パターンの完全な又は部分的なシフトが存在する。

0141

一実施形態において、RNAi剤は、センス鎖における2’−O−メチル修飾及び2’−F修飾の交互のモチーフのパターンを含み、このパターンは、最初に、アンチセンス鎖における2’−O−メチル修飾及び2’−F修飾の交互のモチーフのパターンに対するシフトを有し、即ち、センス鎖における2’−O−メチル修飾ヌクレオチドが、アンチセンス鎖における2’−F修飾ヌクレオチドと塩基対を形成し、その逆も同様である。センス鎖の1位は、2’−F修飾から開始してもよく、アンチセンス鎖の1位は、2’−O−メチル修飾から開始してもよい。

0142

センス鎖及び/又はアンチセンス鎖への、3連続ヌクレオチド上の3つの同一の修飾の1つ又は複数のモチーフの導入は、センス鎖及び/又はアンチセンス鎖中に存在する最初の修飾パターンを中断する。センス鎖及び/又はアンチセンス鎖に3連続ヌクレオチド上の3つの同一の修飾の1つ又は複数のモチーフを導入することによる、センス鎖及び/又はアンチセンス鎖の修飾パターンのこの中断は、標的遺伝子の対する遺伝子サイレンシング活性を意外にも高める。

0143

一実施形態において、3連続ヌクレオチド上の3つの同一の修飾のモチーフが、鎖のいずれかに導入される場合、モチーフに隣接するヌクレオチドの修飾は、モチーフの修飾と異なる修飾である。例えば、モチーフを含む配列の一部は、「・・・NaYYYNb・・・」であり、ここで、「Y」は、3連続ヌクレオチドにおける3つの同一の修飾のモチーフの修飾を表し、「Na」及び「Nb」は、Yの修飾と異なる、モチーフ「YYY」に隣接するヌクレオチドの修飾を表し、Na及びNbは、同じか又は異なる修飾であり得る。あるいは、Na及び/又はNbは、ウイング修飾が存在する場合、存在していても又は存在していなくてもよい。

0144

RNAi剤は、少なくとも1つのホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合を更に含み得る。ホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合の修飾は、鎖のいずれかの位置の、センス鎖又はアンチセンス鎖又は両方の鎖の任意のヌクレオチドに存在し得る。例えば、ヌクレオチド間結合の修飾は、センス鎖及び/又はアンチセンス鎖における全てのヌクレオチドに存在してもよく;各ヌクレオチド間結合の修飾は、センス鎖及び/又はアンチセンス鎖において交互のパターンで存在してもよく;又はセンス鎖又はアンチセンス鎖は、交互のパターンで両方のヌクレオチド間結合の修飾を含み得る。センス鎖におけるヌクレオチド間結合の修飾の交互のパターンは、アンチセンス鎖と同じか又は異なっていてもよく、センス鎖におけるヌクレオチド間結合の修飾の交互のパターンは、アンチセンス鎖におけるヌクレオチド間結合の修飾の交互のパターンに対するシフトを有し得る。

0145

一実施形態において、RNAiは、オーバーハング領域にホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合の修飾を含む。例えば、オーバーハング領域は、2つのヌクレオチド間にホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合を有する2つのヌクレオチドを含み得る。ヌクレオチド間結合の修飾はまた、オーバーハングヌクレオチドを、二本鎖領域内の末端の対合ヌクレオチドと結合するために形成され得る。例えば、少なくとも2、3、4、又は全てのオーバーハングヌクレオチドが、ホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合によって結合されてもよく、任意選択で、オーバーハングヌクレオチドを、オーバーハングヌクレオチドに隣接する対合ヌクレオチドと結合する更なるホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合が存在し得る。例えば、末端の3つのヌクレオチド間に少なくとも2つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合が存在してもよく、3つのヌクレオチドのうちの2つが、オーバーハングヌクレオチドであり、第3のヌクレオチドが、オーバーハングヌクレオチドに隣接する対合ヌクレオチドである。これらの末端の3つのヌクレオチドは、アンチセンス鎖の3’末端、センス鎖の3’末端、アンチセンス鎖の5’末端、及び/又はアンチセンス鎖の5’末端に存在し得る。

0146

一実施形態において、2つのヌクレオチドオーバーハングは、アンチセンス鎖の3’末端にあり、末端の3つのヌクレオチド間に2つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合が存在し、3つのヌクレオチドのうちの2つが、オーバーハングヌクレオチドであり、第3のヌクレオチドが、オーバーハングヌクレオチドに隣接する対合ヌクレオチドである。任意選択で、RNAi剤は、センス鎖の5’末端及びアンチセンス鎖の5’末端の両方において、末端の3つのヌクレオチド間に2つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を更に有し得る。

0147

一実施形態において、RNAi剤は、標的とのミスマッチ、二本鎖内のミスマッチ、又はそれらの組合せを含む。ミスマッチは、オーバーハング領域又は二本鎖領域で生じ得る。塩基対は、解離又は融解(例えば、特定の対合の結合又は解離の自由エネルギーに対してであり、最も簡単な手法は、個々の対ごとに対を調べることであるが、類似の又は同様の分析も使用され得る)を促進する傾向に基づいて評価され得る。解離の促進に関して:A:Uが、G:Cより好ましく;G:Uが、G:Cより好ましく;I:Cが、G:Cより好ましい(I=イノシン)。ミスマッチ、例えば、非正準又は正準以外の対合(本明細書の他の箇所に記載される)が、正準な(A:T、A:U、G:C)対合より好ましく;ユニバーサル塩基を含む対合が、正準な対合より好ましい。

0148

一実施形態において、RNAi剤は、A:U、G:U、I:Cの群から独立して選択されるアンチセンス鎖の5’末端からの二本鎖領域内の最初の1つ、2つ、3つ、4つ、又は5つの塩基対のうちの少なくとも1つ、及び二本鎖の5’末端におけるアンチセンス鎖の解離を促進するためのミスマッチ対、例えば、非正準又は正準以外の対合又はユニバーサル塩基を含む対合を含む。

0149

一実施形態において、アンチセンス鎖の5’末端からの二本鎖領域内の1位におけるヌクレオチドは、A、dA、dU、U、及びdTからなる群から選択される。あるいは、アンチセンス鎖の5’末端からの二本鎖領域内の最初の1、2又は3塩基対のうちの少なくとも1つは、AU塩基対である。例えば、アンチセンス鎖の5’末端からの二本鎖領域内の第1の塩基対は、AU塩基対である。

0150

一実施形態において、センス鎖配列は、式(I):
5’np−Na−(XXX)i−Nb−YYY−Nb−(ZZZ)j−Na−nq3’(I)
(式中:
i及びjがそれぞれ、独立して、0又は1であり;
p及びqがそれぞれ、独立して、0〜6であり;
各Naが、独立して、0〜25の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列が、少なくとも2つの異なる修飾のヌクレオチドを含み;
各Nbが、独立して、0〜10の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し;
各np及びnqが、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し;
ここで、Nb及びYが、同じ修飾を有さず;
XXX、YYY及びZZZがそれぞれ、独立して、3連続ヌクレオチドにおける3つの同一の修飾の1つのモチーフを表す)
によって表され得る。好ましくは、YYYが、全て2’−F修飾ヌクレオチドである。

0151

一実施形態において、Na及び/又はNbは、交互のパターンの修飾を含む。

0152

一実施形態において、YYYモチーフは、センス鎖の切断部位又はその近傍に存在する。例えば、RNAi剤が、17〜23ヌクレオチド長の二本鎖領域を有する場合、YYYモチーフは、5’末端から1つ目のヌクレオチドから数え始めて;又は任意選択で、5’末端から、二本鎖領域内の1つ目の対合ヌクレオチドから数え始めて、センス鎖の切断部位又はその近傍に存在し得る(例えば:6位、7位、8位、7位、8位、9位、8位、9位、10位、9位、10位、11位、10位、11位、12位又は11位、12位、13位に存在し得る)。

0153

一実施形態において、iが1であり、jが0であり、又はiが0であり、jが1であり、又はi及びjの両方が1である。したがって、センス鎖は、以下の式によって表され得る:
5’np−Na−YYY−Nb−ZZZ−Na−nq3’(Ib);
5’np−Na−XXX−Nb−YYY−Na−nq3’(Ic);又は
5’np−Na−XXX−Nb−YYY−Nb−ZZZ−Na−nq3’(Id)。

0154

センス鎖が、式(Ib)によって表される場合、Nbは、0〜10、0〜7、0〜5、0〜4、0〜2又は0の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Naは、独立して、2〜20、2〜15、又は2〜10の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し得る。

0155

センス鎖が、式(Ic)として表される場合、Nbは、0〜10、0〜7、0〜10、0〜7、0〜5、0〜4、0〜2又は0の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Naは、独立して、2〜20、2〜15、又は2〜10の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し得る。

0156

センス鎖が、式(Id)として表される場合、各Nbは、独立して、0〜10、0〜7、0〜5、0〜4、0〜2又は0の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。好ましくは、Nbは、0、1、2、3、4、5又は6である。各Naは、独立して、2〜20、2〜15、又は2〜10の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し得る。

0157

X、Y及びZのそれぞれが、互いに同じか又は異なり得る。

0158

他の実施形態において、iが0であり、jが0であり、センス鎖は、以下の式によって表され得る:
5’np−Na−YYY−Na−nq3’(Ia)。

0159

センス鎖が、式(Ia)によって表される場合、各Naは、独立して、2〜20、2〜15、又は2〜10の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し得る。

0160

一実施形態において、RNAiのアンチセンス鎖配列は、式(II):
5’nq’−Na’−(Z’Z’Z’)k−Nb’−Y’Y’Y’−Nb’−(X’X’X’)l−N’a−np’3’(II)
(式中:
k及びlがそれぞれ、独立して、0又は1であり;
p’及びq’がそれぞれ、独立して、0〜6であり;
各Na’が、独立して、0〜25の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列が、少なくとも2つの異なる修飾のヌクレオチドを含み;
各Nb’が、独立して、0〜10の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し;
各np’及びnq’が、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し;
ここで、Nb’及びY’が、同じ修飾を有さず;
X’X’X’、Y’Y’Y’及びZ’Z’Z’がそれぞれ、独立して、3連続ヌクレオチドにおける3つの同一の修飾の1つのモチーフを表す)
によって表され得る。

0161

一実施形態において、Na’及び/又はNb’は、交互のパターンの修飾を含む。

0162

Y’Y’Y’モチーフは、アンチセンス鎖の切断部位又はその近傍に存在する。例えば、RNAi剤が、17〜23ヌクレオチド長の二本鎖領域を有する場合、Y’Y’Y’モチーフは、5’末端から1つ目のヌクレオチドから数え始めて;又は任意選択で、5’末端から、二本鎖領域内の1つ目の対合ヌクレオチドから数え始めて、アンチセンス鎖の9位、10位、11位;10位、11位、12位;11位、12位、13位;12位、13位、14位;又は13位、14位、15位に存在し得る。好ましくは、Y’Y’Y’モチーフは、11位、12位、13位に存在する。

0163

一実施形態において、Y’Y’Y’モチーフは、全て2’−OMe修飾ヌクレオチドである。

0164

一実施形態において、kが1であり、lが0であり、又はkが0であり、lが1であり、又はk及びlの両方が1である。

0165

したがって、アンチセンス鎖は、以下の式によって表され得る:
5’nq’−Na’−Z’Z’Z’−Nb’−Y’Y’Y’−Na’−np’3’(IIb);
5’nq’−Na’−Y’Y’Y’−Nb’−X’X’X’−np’3’(IIc);又は
5’nq’−Na’−Z’Z’Z’−Nb’−Y’Y’Y’−Nb’−X’X’X’−Na’−np’3’(IId)。

0166

アンチセンス鎖が、式(IIb)によって表される場合、Nb’は、0〜10、0〜7、0〜10、0〜7、0〜5、0〜4、0〜2又は0の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Na’は、独立して、2〜20、2〜15、又は2〜10の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。

0167

アンチセンス鎖が、式(IIc)として表される場合、Nb’は、0〜10、0〜7、0〜10、0〜7、0〜5、0〜4、0〜2又は0の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Na’は、独立して、2〜20、2〜15、又は2〜10の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。

0168

アンチセンス鎖が、式(IId)として表される場合、各Nb’は、独立して、0〜10、0〜7、0〜10、0〜7、0〜5、0〜4、0〜2又は0の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Na’は、独立して、2〜20、2〜15、又は2〜10の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。好ましくは、Nbは、0、1、2、3、4、5又は6である。

0169

他の実施形態において、kが0であり、lが0であり、アンチセンス鎖は、以下の式によって表され得る:
5’np’−Na’−Y’Y’Y’−Na’−nq’3’(Ia)。

0170

アンチセンス鎖が、式(IIa)として表される場合、各Na’は、独立して、2〜20、2〜15、又は2〜10の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。

0171

X’、Y’及びZ’のそれぞれが、互いに同じか又は異なり得る。

0172

センス鎖及びアンチセンス鎖の各ヌクレオチドは、独立して、LNA、HNA、CeNA、2’−メトキシエチル、2’−O−メチル、2’−O−アリル、2’−C−アリル、2’−ヒドロキシル、又は2’−フルオロで修飾され得る。例えば、センス鎖及びアンチセンス鎖の各ヌクレオチドは、独立して、2’−O−メチル又は2’−フルオロで修飾される。各X、Y、Z、X’、Y’及びZ’は、特に、2’−O−メチル修飾又は2’−フルオロ修飾を表し得る。

0173

一実施形態において、RNAi剤のセンス鎖は、二本鎖領域が21のヌクレオチドである場合、5’末端から1つ目のヌクレオチドから数え始めて;又は任意選択で、5’末端から、二本鎖領域内の1つ目の対合ヌクレオチドから数え始めて、鎖の9位、10位及び11位に存在するYYYモチーフを含んでいてもよく;Yは、2’−F修飾を表す。センス鎖は、二本鎖領域の反対側の末端にウイング修飾としてXXXモチーフ又はZZZモチーフを更に含んでいてもよく;XXX及びZZZはそれぞれ、独立して、2’−OMe修飾又は2’−F修飾を表す。

0174

一実施形態において、アンチセンス鎖は、5’末端から1つ目のヌクレオチドから数え始めて;又は任意選択で、5’末端から、二本鎖領域内の1つ目の対合ヌクレオチドから数え始めて、鎖の11位、12位、13位に存在するY’Y’Y’モチーフを含んでいてもよく;Y’は、2’−O−メチル修飾を表す。アンチセンス鎖は、二本鎖領域の反対側の末端にウイング修飾としてX’X’X’モチーフ又はZ’Z’Z’モチーフを更に含んでいてもよく;X’X’X’及びZ’Z’Z’はそれぞれ、独立して、2’−OMe修飾又は2’−F修飾を表す。

0175

上の式(Ia)、(Ib)、(Ic)、及び(Id)のいずれか1つによって表されるセンス鎖はそれぞれ、式(IIa)、(IIb)、(IIc)、及び(IId)のいずれか1つによって表されるアンチセンス鎖と二本鎖を形成する。

0176

したがって、本発明の方法に使用するためのRNAi剤は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含んでいてもよく、各鎖は、14〜30のヌクレオチドを有し、RNAi二本鎖は、式(III):
センス:5’np−Na−(XXX)i−Nb−YYY−Nb−(ZZZ)j−Na−nq3’
アンチセンス:3’np’−Na’−(X’X’X’)k−Nb’−Y’Y’Y’−Nb’−(Z’Z’Z’)l−Na’−nq’5’
(III)
(式中:
i、j、k、及びlがそれぞれ、独立して、0又は1であり;
p、p’、q、及びq’がそれぞれ、独立して、0〜6であり;
各Na及びNa’が、独立して、0〜25の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列が、少なくとも2つの異なる修飾のヌクレオチドを含み;
各Nb及びNb’が、独立して、0〜10の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し;
ここで、
それぞれ存在していても又は存在していなくてもよい各np’、np、nq’、及びnqが、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し;
XXX、YYY、ZZZ、X’X’X’、Y’Y’Y’、及びZ’Z’Z’がそれぞれ、独立して、3連続ヌクレオチド上に3つの同一の修飾の1つのモチーフを表す)
によって表される。

0177

一実施形態において、iが0であり、jが0であり;又はiが1であり、jが0であり;又はiが0であり、jが1であり;又はi及びjの両方が0であり;又はi及びjの両方が1である。別の実施形態において、kが0であり、lが0であり;又はkが1であり、lが0であり;kが0であり、lが1であり;又はk及びlの両方が0であり;又はk及びlの両方が1である。

0178

RNAi二本鎖を形成するセンス鎖及びアンチセンス鎖の例示的な組合せは、以下の式を含む:
5’np−Na−YYY−Na−nq3’
3’np’−Na’−Y’Y’Y’−Na’nq’5’
(IIIa)
5’np−Na−YYY−Nb−ZZZ−Na−nq3’
3’np’−Na’−Y’Y’Y’−Nb’−Z’Z’Z’−Na’nq’5’
(IIIb)
5’np−Na−XXX−Nb−YYY−Na−nq3’
3’np’−Na’−X’X’X’−Nb’−Y’Y’Y’−Na’−nq’5’
(IIIc)
5’np−Na−XXX−Nb−YYY−Nb−ZZZ−Na−nq3’
3’np’−Na’−X’X’X’−Nb’−Y’Y’Y’−Nb’−Z’Z’Z’−Na−nq’5’
(IIId)

0179

RNAi剤が、式(IIIa)によって表される場合、各Naは、独立して、2〜20、2〜15、又は2〜10の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。

0180

RNAi剤が、式(IIIb)によって表される場合、各Nbは、独立して、1〜10、1〜7、1〜5又は1〜4の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Naは、独立して、2〜20、2〜15、又は2〜10の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。

0181

RNAi剤が、式(IIIc)として表される場合、各Nb、Nb’は、独立して、0〜10、0〜7、0〜10、0〜7、0〜5、0〜4、0〜2又は0の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Naは、独立して、2〜20、2〜15、又は2〜10の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。

0182

RNAi剤が、式(IIId)として表される場合、各Nb、Nb’は、独立して、0〜10、0〜7、0〜10、0〜7、0〜5、0〜4、0〜2又は0の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Na、Na’は、独立して、2〜20、2〜15、又は2〜10の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。Na、Na’、Nb及びNb’のそれぞれは、独立して、交互のパターンの修飾を含む。

0183

式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)、及び(IIId)中のX、Y及びZのそれぞれは、互いに同じか又は異なり得る。

0184

RNAi剤が、式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)、及び(IIId)によって表される場合、Yヌクレオチドの少なくとも1つが、Y’ヌクレオチドの1つと塩基対を形成し得る。あるいは、Yヌクレオチドの少なくとも2つが、対応するY’ヌクレオチドと塩基対を形成し;又はYヌクレオチドの全ての3つが全て、対応するY’ヌクレオチドと塩基対を形成する。

0185

RNAi剤が、式(IIIb)又は(IIId)によって表される場合、Zヌクレオチドの少なくとも1つが、Z’ヌクレオチドの1つと塩基対を形成し得る。あるいは、Zヌクレオチドの少なくとも2つが、対応するZ’ヌクレオチドと塩基対を形成し;又はZヌクレオチドの全ての3つが全て、対応するZ’ヌクレオチドと塩基対を形成する。

0186

RNAi剤が、式(IIIc)又は(IIId)として表される場合、Xヌクレオチドの少なくとも1つが、X’ヌクレオチドの1つと塩基対を形成し得る。あるいは、Xヌクレオチドの少なくとも2つが、対応するX’ヌクレオチドと塩基対を形成し;又はXヌクレオチドの全ての3つが全て、対応するX’ヌクレオチドと塩基対を形成する。

0187

一実施形態において、Yヌクレオチド上の修飾は、Y’ヌクレオチド上の修飾と異なり、Zヌクレオチド上の修飾は、Z’ヌクレオチド上の修飾と異なり、及び/又はXヌクレオチド上の修飾は、X’ヌクレオチド上の修飾と異なる。

0188

一実施形態において、RNAi剤が、式(IIId)によって表される場合、Na修飾は、2’−O−メチル又は2’−フルオロ修飾である。別の実施形態において、RNAi剤が、式(IIId)によって表される場合、Na修飾は、2’−O−メチル又は2’−フルオロ修飾であり、np’>0であり、少なくとも1つのnp’が、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合される。更に別の実施形態において、RNAi剤が、式(IIId)によって表される場合、Na修飾は、2’−O−メチル又は2’−フルオロ修飾であり、np’>0であり、少なくとも1つのnp’が、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合され、センス鎖は、二価又は三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された1つ又は複数のGalNAc誘導体にコンジュゲートされる。別の実施形態において、RNAi剤が、式(IIId)によって表される場合、Na修飾は、2’−O−メチル又は2’−フルオロ修飾であり、np’>0であり、少なくとも1つのnp’が、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合され、センス鎖は、少なくとも1つのホスホロチオエート結合を含み、センス鎖は、二価又は三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された1つ又は複数のGalNAc誘導体にコンジュゲートされる。

0189

一実施形態において、RNAi剤が、式(IIIa)によって表される場合、Na修飾は、2’−O−メチル又は2’−フルオロ修飾であり、np’>0であり、少なくとも1つのnp’が、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合され、センス鎖は、少なくとも1つのホスホロチオエート結合を含み、センス鎖は、二価又は三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された1つ又は複数のGalNAc誘導体にコンジュゲートされる。

0190

一実施形態において、RNAi剤は、式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)、及び(IIId)によって表される少なくとも2つの二本鎖を含む多量体であり、この二本鎖は、リンカーによって結合される。リンカーは、切断可能又は切断不可能であり得る。任意選択で、多量体は、リガンドを更に含む。二本鎖のそれぞれは、同じ遺伝子又は2つの異なる遺伝子を標的とすることができ;又は二本鎖のそれぞれは、2つの異なる標的部位において同じ遺伝子を標的とすることができる。

0191

一実施形態において、RNAi剤は、式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)、及び(IIId)によって表される3つ、4つ、5つ、6つ又はそれ以上の二本鎖を含む多量体であり、この二本鎖は、リンカーによって結合される。リンカーは、切断可能又は切断不可能であり得る。任意選択で、多量体は、リガンドを更に含む。二本鎖のそれぞれは、同じ遺伝子又は2つの異なる遺伝子を標的とすることができ;又は二本鎖のそれぞれは、2つの異なる標的部位において同じ遺伝子を標的とすることができる。

0192

一実施形態において、式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)、及び(IIId)によって表される2つのRNAi剤は、5’末端、及び3’末端の一方又は両方で互いに結合され、任意選択で、リガンドにコンジュゲートされる。RNAi剤のそれぞれは、同じ遺伝子又は2つの異なる遺伝子を標的とすることができ;又はRNAi剤のそれぞれは、2つの異なる標的部位において同じ遺伝子を標的とすることができる。

0193

様々な刊行物に、本発明の方法に使用され得る多量体RNAi剤が記載されている。このような刊行物としては、国際公開第2007/091269号パンフレット、米国特許第7858769号明細書、国際公開第2010/141511号パンフレット、国際公開第2007/117686号パンフレット、国際公開第2009/014887号パンフレット及び国際公開第2011/031520号パンフレットが挙げられ、それぞれの全内容が、参照により本明細書に援用される。

0194

RNAi剤に対する1つ又は複数の炭水化物部分コンジュゲーションを含むRNAi剤は、RNAi剤の1つ又は複数の特性を最適化することができる。多くの場合、炭水化物部分は、RNAi剤の修飾サブユニットに結合される。例えば、dsRNA剤の1つ又は複数のリボヌクレオチドサブユニットのリボース糖は、別の部分、例えば、炭水化物リガンドが結合される非炭水化物(好ましくは環状の)担体で置換され得る。サブユニットのリボース糖がこのように置換されたリボヌクレオチドサブユニットは、本明細書において、リボース置換修飾サブユニット(RRMS)と呼ばれる。環状担体は、炭素環系であってもよく、即ち、全ての環原子が、炭素原子であり、又は複素環系、即ち、1つ又は複数の環原子が、ヘテロ原子、例えば、窒素、酸素、硫黄であり得る。環状担体は、単環系であってもよく、又は2つ以上の環、例えば縮合環を含み得る。環状担体は、完全に飽和した環系であってもよく、又は1つ又は複数の二重結合を含み得る。

0195

リガンドは、担体を介してポリヌクレオチドに結合され得る。担体は、(i)少なくとも1つの「骨格結合点」、好ましくは、2つの「骨格結合点」及び(ii)少なくとも1つの「テザー結合点(tethering attachment point)」を含む。本明細書において使用される際の「骨格結合点」は、官能基、例えば、ヒドロキシル基、又は一般に、骨格、例えば、リン酸塩、又は修飾リン酸塩、例えば、硫黄を含有する、リボ核酸骨格中への担体の組み込みに利用可能であり且つそれに適した結合を指す。「テザー結合点」(TAP)は、ある実施形態において、選択された部分を接続する環状担体の構成環原子、例えば、炭素原子又はヘテロ原子(骨格結合点を提供する原子と異なる)を指す。この部分は、例えば、炭水化物、例えば、単糖二糖三糖四糖オリゴ糖及び多糖であり得る。任意選択で、選択された部分は、介在するテザー(intervening tether)によって環状担体に接続される。したがって、環状担体は、多くの場合、官能基、例えば、アミノ基を含み、又は一般に、構成環への別の化学成分、例えば、リガンドの組み込み又は連結(tethering)に適した結合を提供する。

0196

RNAi剤は、担体を介してリガンドにコンジュゲートされてもよく、この担体は、環式基又は環式基であり得;好ましくは、環式基は、ピロリジニルピラゾニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニルピペラジニル、[1,3]ジオキソランオキサゾリジニルイソキサゾリジニル、モルホリニルチアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニルピリダジノニル(pyridazinonyl)、テトラヒドロフリル及びデカリンから選択され;好ましくは、環式基は、セリノール骨格又はジエタノールアミン骨格から選択される。

0197

ある特定の実施形態において、本発明の方法に使用するためのRNAi剤は、表1及び表2に列挙される剤の群から選択される剤である。

0198

これらの剤は、リガンドを更に含み得る。

0199

A.リガンド
本発明の二本鎖RNA(dsRNA)剤は、任意選択で、1つ又は複数のリガンドにコンジュゲートされ得る。リガンドは、3’末端、5’末端又は両方の末端において、センス鎖、アンチセンス鎖又は両方の鎖に結合され得る。例えば、リガンドは、センス鎖にコンジュゲートされ得る。好ましい実施形態において、リガンドは、センス鎖の3’末端にコンジュゲートされる。好ましい一実施形態において、リガンドは、GalNAcリガンドである。特に好ましい実施形態において、リガンドは、GalNAc3である:

0200

ある実施形態において、リガンド、例えば、GalNAcリガンドは、RNAi剤の3’末端に結合される。一実施形態において、RNAi剤は、以下の概略図



(式中、Xが、O又はSである)に示されるように、リガンド、例えば、GalNAcリガンドにコンジュゲートされる。一実施形態において、XがOである。

0201

様々な構成要素が、本発明のRNAi剤に結合され得る。好ましい部分は、介在するテザーを介して直接又は間接的に、好ましくは共有結合で結合されるリガンドである。

0202

好ましい実施形態において、リガンドは、リガンドが組み込まれる分子の分布、標的化又は寿命を変化させる。好ましい実施形態において、リガンドは、例えば、このようなリガンドが存在しない種と比較して、選択された標的、例えば、分子、細胞又は細胞型区画、受容体、例えば、細胞若しくは器官の区画、組織、器官又は身体の領域に対する向上した親和性を提供する。選択された標的に対する向上した親和性を提供するリガンドは、標的化リガンドとも呼ばれる。

0203

一部のリガンドは、エンドソーム溶解特性を有し得る。エンドソーム溶解リガンドは、エンドソームの溶解及び/又は本発明の組成物、又はその成分の、エンドソームから細胞の細胞質への輸送を促進する。エンドソーム溶解リガンドは、pH依存性の膜活性及び融合性(fusogenicity)を示すポリアニオン性ペプチド又はペプチド模倣体であり得る。一実施形態において、エンドソーム溶解リガンドは、エンドソームのpHでその活性立体配座を取る。「活性」立体配座は、エンドソーム溶解リガンドが、エンドソームの溶解及び/又は本発明の組成物、又はその成分の、エンドソームから細胞の細胞質への輸送を促進する立体配座である。例示的なエンドソーム溶解リガンドとしては、GALAペプチド(Subbarao et al.,Biochemistry,1987,26:2964−2972)、EALAペプチド(Vogel et al.,J.Am.Chem.Soc.,1996,118:1581−1586)、及びそれらの誘導体(Turk et al.,Biochem.Biophys.Acta,2002,1559:56−68)が挙げられる。一実施形態において、エンドソーム溶解成分は、pHの変化に応じて電荷の変化又はプロトン化を起こす化学基(例えば、アミノ酸)を含み得る。エンドソーム溶解成分は、直鎖状又は分枝鎖状であり得る。

0204

リガンドは、輸送、ハイブリダイゼーション、及び特異性の特性を向上させることができ、得られる天然若しくは修飾オリゴリボヌクレオチド、又は本明細書に記載されるモノマーの任意の組合せを含むポリマー分子及び/又は天然若しくは修飾リボヌクレオチドヌクレアーゼ耐性も向上させ得る。

0205

リガンドは、一般に、例えば、取り込みを向上させるための、治療用修飾因子;例えば、分布を監視するための診断化合物又はレポーター基架橋剤;及びヌクレアーゼ耐性を与える部分を含み得る。一般的な例としては、脂質、ステロイドビタミン、糖、タンパク質、ペプチド、ポリアミン、及びペプチド模倣体が挙げられる。

0206

リガンドは、タンパク質(例えば、ヒト血清アルブミンHSA)、低比重リポタンパク(LDL)、高比重リポタンパク(HDL)、又はグロブリン);炭水化物(例えば、デキストランプルランキチンキトサンイヌリンシクロデキストリン又はヒアルロン酸);又は脂質などの天然の物質を含み得る。リガンドはまた、合成ポリマー、例えば、合成ポリアミノ酸、オリゴヌクレオチド(例えば、アプタマー)などの、組み換え又は合成分子であり得る。ポリアミノ酸の例としては、ポリアミノ酸は、ポリリジンPLL)、ポリL−アスパラギン酸、ポリL−グルタミン酸スチレンマレイン酸無水物コポリマー、ポリ(L−ラクチド−コ−グリコリドコポリマージビニルエーテル無水マレイン酸コポリマー、N−(2−ヒドロキシプロピルメタクリルアミドコポリマー(HMPA)、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリビニルアルコールPVA)、ポリウレタン、ポリ(2−エチルアクリル酸)、N−イソプロピルアクリルアミドポリマー、又はポリホスファジンである。ポリアミンの例としては、ポリエチレンイミン、ポリリジン(PLL)、スペルミンスペルミジン、ポリアミン、擬似ペプチド−ポリアミン、ペプチド模倣ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニンアミジンプロタミンカチオン性脂質カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの第四級塩、又はα−へリックスペプチドが挙げられる。

0207

リガンドはまた、標的基、例えば、細胞又は組織標的剤、例えば、レクチン糖タンパク質、脂質又はタンパク質、例えば、腎細胞などの特定の細胞型に結合する抗体を含み得る。標的基は、サイロトロピンメラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、界面活性剤タンパク質A、ムチン炭水化物、多価ラクトース、多価ガラクトース、N−アセチルガラクトサミン、N−アセチル−グルコサミン、多価マンノース、多価フコースグリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリンビスホスホネートポリグルタメートポリアスパルテート、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸フォレートビタミンB12、ビオチン、RGDペプチド、RGDペプチド模倣体又はアプタマーであり得る。

0208

リガンドの他の例としては、色素挿入剤(例えばアクリジン)、架橋剤(例えばソラレンマイトマイシンC)、ポルフィリン(TPPC4、テキサフィリンサフィリン)、多環式芳香族炭化水素(例えば、フェナジンジヒドロフェナジン)、人工エンドヌクレアーゼ又はキレート剤(例えばEDTA)、親油性分子、例えば、コレステロール、コール酸アダマンタン酢酸、1−ピレン酪酸ジヒドロテストステロン、1,3−ビス−O(ヘキサデシルグリセロールゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオールメントール、1,3−プロパンジオールヘプタデシル基パルミチン酸ミリスチン酸、O3−(オレオイルリトコール酸、O3−(オレオイル)コレン酸(cholenic acid)、ジメトキシトリチル、又はフェノキサジン)及びペプチド複合体(例えば、アンテナペディア(antennapedia)ペプチド、Tatペプチド)、アルキル化剤ホスフェート、アミノ、メルカプト、PEG(例えば、PEG−40K)、MPEG、[MPEG]2、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル放射性標識マーカー、酵素、ハプテン(例えばビオチン)、輸送/吸収促進剤(例えば、アスピリンビタミンE葉酸)、合成リボヌクレアーゼ(例えば、イミダゾールビスイミダゾールヒスタミン、イミダゾールクラスター(cluster)、アクリジン−イミダゾール複合体、Eu3+テトラアザ員環複合体)、ジニトロフェニル、HRP、又はAPが挙げられる。

0209

リガンドは、タンパク質、例えば、糖タンパク質、又はペプチド、例えば、コリガンド(co−ligand)、又は抗体、例えば、癌細胞内皮細胞、又は骨細胞などの特定の細胞型に結合する抗体に対する特異親和性を有する分子であり得る。リガンドはまた、ホルモン及びホルモン受容体を含んでもよい。リガンドはまた、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補因子、多価ラクトース、多価ガラクトース、N−アセチル−ガラクトサミン、N−アセチル−グルコサミン、多価マンノース、多価フコース又はアプタマーなどの非ペプチド種を含み得る。リガンドは、例えば、リポ多糖、38MAPキナーゼ活性化因子、又はNF−κBの活性化因子であり得る。

0210

リガンドは、例えば、細胞の微小管マイクロフィラメント、及び/又は中間径フィラメント破壊することによって、例えば、細胞骨格を破壊することによって、細胞中へのiRNA剤の取り込みを向上させ得る物質、例えば、薬剤であり得る。薬剤は、例えば、タクソンビンクリスチンビンブラスチンサイトカラシン、ノコダゾール、ジャスプラキノリド、ラトランクリンA、ファロイジン、スウィンホリドA、インダノシン、又はミオセルビンであり得る。

0211

リガンドは、例えば、炎症反応を活性化することによって、細胞中へのオリゴヌクレオチドの取り込みを増加させ得る。このような効果を与え得る例示的なリガンドとしては、腫瘍壊死因子α(TNFα)、インターロイキン−1β、又はγインターフェロンが挙げられる。

0212

一態様において、リガンドは、脂質又は脂質ベースの分子である。このような脂質又は脂質ベースの分子は、好ましくは、血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン(HSA)に結合する。HSA結合リガンドは、身体の標的組織、例えば、非腎臓標的組織へのコンジュゲートの分配を可能にする。例えば、標的組織は、肝臓の実質細胞を含む肝臓であり得る。HSAに結合し得る他の分子も、リガンドとして使用され得る。例えば、ナプロキセン又はアスピリンが使用され得る。脂質又は脂質ベースのリガンドは、(a)コンジュゲートの分解に対する耐性を増大し、(b)標的細胞又は細胞膜への標的化又は輸送を増大し、及び/又は(c)血清タンパク質、例えば、HSAへの結合を調整するのに使用され得る。

0213

脂質ベースのリガンドを用いて、標的組織へのコンジュゲートの結合を調節すること、例えば、制御することができる。例えば、より強くHSAに結合する脂質又は脂質ベースのリガンドは、腎臓に対して標的化される可能性が低く、したがって、身体から除去される可能性が低い。より弱くHSAに結合する脂質又は脂質ベースのリガンドを用いて、コンジュゲートを腎臓に対して標的化することができる。

0214

好ましい実施形態において、脂質ベースのリガンドは、HSAに結合する。好ましくは、脂質ベースのリガンドは、コンジュゲートが好ましくは非腎臓組織に分配されるような十分な親和性でHSAに結合する。しかしながら、親和性は、HSA−リガンド結合が反転され得ないほど強力でないのが好ましい。

0215

別の好ましい実施形態において、コンジュゲートが好ましくは腎臓に分配されるように、脂質ベースのリガンドは、HSAに弱く結合するか又は全く結合しない。腎細胞を標的とする他の部分も、脂質ベースのリガンドの代わりに又はそれに加えて使用され得る。

0216

別の態様において、リガンドは、標的細胞、例えば、増殖細胞によって取り込まれる部分、例えば、ビタミンである。これらは、例えば、悪性又は非悪性の望ましくない細胞増殖、例えば、癌細胞を特徴とする障害を処置するのに特に有用である。例示的なビタミンは、ビタミンA、E、及びKを含む。他の例示的なビタミンは、ビタミンB、例えば、葉酸、B12、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサール又は他のビタミンあるいは癌細胞によって取り込まれる栄養素を含む。HAS、低比重リポタンパク(LDL)及び高比重リポタンパク(HDL)も含まれる。

0217

別の態様において、リガンドは、細胞透過剤(cell−permeation agent)、好ましくは、らせん状細胞透過剤である。好ましくは、この剤は両親媒性である。例示的な剤は、tat又はアンテノペディア(antennopedia)などのペプチドである。この剤がペプチドである場合、それは、ペプチジル模倣体逆転異性体、非ペプチド又は擬ペプチド結合、及びD−アミノ酸の使用を含めて修飾され得る。らせん状剤は、好ましくはα−へリックス剤であり、これは、好ましくは、親油性及び疎油性相を有する。

0218

リガンドは、ペプチド又はペプチド模倣体であり得る。ペプチド模倣体(本明細書においてオリゴペプチド模倣体とも呼ばれる)は、天然ペプチドと類似した明確な三次元構造に折り畳まれることが可能な分子である。ペプチド又はペプチド模倣体部分は、約5〜50個のアミノ酸の長さ、例えば、約5、10、15、20、25、30、35、40、45、又は50個のアミノ酸の長さであり得る。ペプチド又はペプチド模倣体は、例えば、細胞透過性ペプチドカチオン性ペプチド両親媒性ペプチド、又は疎水性ペプチド(例えば、主にTyr、Trp又はPheからなる)であり得る。ペプチド部分は、デンドリマーペプチド、構造規制(constrained)ペプチド又は架橋ペプチドであり得る。別の代替例において、ペプチド部分は、疎水性膜輸送配列MTS)を含み得る。例示的な疎水性MTS含有ペプチドは、アミノ酸配列AAVALLPAVLLALLAP(配列番号1)を有するRFGFである。疎水性MTSを含有するRFGF類似体(例えば、アミノ酸配列AALLPVLLAAP(配列番号2)も、標的部分であり得る。ペプチド部分は、細胞膜を介してペプチド、オリゴヌクレオチド、及びタンパク質を含む大型極性分子運搬することができる「送達」ペプチドであり得る。例えば、HIVTatタンパク質に由来する配列(GRKKRRQRRRPPQ(配列番号3)及びショウジョウバエアンテナペディア(Drosophila Antennapedia)タンパク質(RQKIWFQNRRMKWKK(配列番号4)は、送達ペプチドとして機能することが可能であることが分かっている。ペプチド又はペプチド模倣体は、ファージディスプレイライブラリー、又は1ビーズ1化合物(one−bead−one−compound)(OBOC)コンビナトリアルライブラリーから特定されたペプチドなどの、DNAのランダム配列によってコードされ得る(Lam et al.,Nature,354:82−84、1991)。好ましくは、組み込まれたモノマー単位を介してiRNA剤に結合されたペプチド又はペプチド模倣体は、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸(RGD)−ペプチド、又はRGD模倣体などのペプチドである。ペプチド部分は、約5つのアミノ酸から約40個のアミノ酸の長さの範囲であり得る。ペプチド部分は、安定性又は直接配座特性を高めるためなどの構造修飾を有し得る。後述される構造修飾のいずれも用いられ得る。RGDペプチド部分は、内皮腫瘍細胞又は乳癌腫瘍細胞などの腫瘍細胞を標的とするのに使用され得る(Zitzmann et al.,Cancer Res.,62:5139−43,2002)。RGDペプチドは、、腎臓、脾臓、又は肝臓を含む様々な他の組織の腫瘍に対するiRNA剤の標的化を促進することができる(Aoki et al.,Cancer Gene Therapy 8:783−787,2001)。好ましくは、RGDペプチドは、腎臓に対するiRNA剤の標的化を促進する。RGDペプチドは、直鎖状又は環状であり得、特定の組織に対する標的化を促進するために、修飾、例えば、グリコシル化又はメチル化され得る。例えば、グリコシル化RGDペプチドは、iRNA剤を、αVβ3を発現する腫瘍細胞に送達することができる(Haubner et al.,Jour.Nucl.Med.,42:326−336,2001)。増殖細胞に豊富なマーカーを標的とするペプチドが使用され得る。例えば、RGD含有ペプチド及びペプチド模倣体は、癌細胞、特に、インテグリンを示す細胞を標的とすることができる。したがって、RGDペプチド、RGDを含有する環状ペプチド、D−アミノ酸を含むRGDペプチド、ならびに合成RGD模倣体を使用し得る。RGDに加えて、インテグリンリガンドを標的とする他の部分を使用することができる。一般に、このようなリガンドは、増殖細胞及び血管新生を制御するのに使用され得る。このタイプのリガンドの好ましいコンジュゲートは、PECAM−1、VEGF、又は他の癌遺伝子、例えば、本明細書に記載される癌遺伝子を標的とする。

0219

「細胞透過性ペプチド」は、細胞、例えば、細菌又は真菌細胞などの微生物細胞、あるいはヒト細胞などの哺乳動物細胞を透過することが可能である。微生物細胞を透過するペプチドは、例えば、α−へリックス直鎖状ペプチド(例えば、LL−37又はCeropin P1)、ジスルフィド結合含有ペプチド(例えば、α−デフェンシン、β−デフェンシン又はバクテネシン(bactenecin))、又は1つ若しくは2つの支配的アミノ酸のみを含有するペプチド(例えば、PR−39又はインドリシジン)であり得る。細胞透過性ペプチドはまた、核局在化シグナルNLS)を含み得る。例えば、細胞透過性ペプチドは、HIV−1 gp41の融合ペプチドドメイン及びSV40大型T抗原のNLSに由来する、MPGなどの二分両親媒性ペプチドであり得る(Simeoni et al.,Nucl.AcidsRes.31:2717−2724,2003)。

0220

一実施形態において、標的化ペプチドは、両親媒性α−へリックスペプチドであり得る。例示的な両親媒性α−へリックスペプチドとしては、限定はされないが、セクロピンリコトキシン(lycotoxin)、パラダキシン(paradaxin)、ブフォリン、CPF、ボンビニン様ペプチドBLP)、カテリシジンセラトトキシン(ceratotoxin)、エボヤ(S.clava)ペプチド、メクラウナギの腸由来の抗菌性ペプチド(HFIAP)、マガイニンブレビニン−2、デルマセプチンメリチンプレウロシジン、H2Aペプチド、アフリカツメガエル(Xenopus)ペプチド、エスクレンチニス−1(esculentinis−1)、及びカエリン(caerin)が挙げられる。いくつかの因子が、好ましくは、へリックス安定性の完全性を維持するものと考えられる。例えば、最大数のヘリックス安定化残基(例えば、leu、ala、又はlys)が用いられ、最小数のヘリックス不安定化残基(例えば、プロリン、又は環状モノマー単位が用いられる。キャッピング残基が考えられる(例えば、Glyが、例示的なN−キャッピング残基であり、及び/又はC末端アミド化が、へリックスを安定させるために追加のH結合を提供するのに使用され得る。i±3位、又はi±4位だけ離間された、反対の電荷を有する残基間の塩架橋の形成により、安定性が提供され得る。例えば、リジン、アルギニン、ホモ−アルギニン、オルニチン又はヒスチジンなどのカチオン性残基が、アニオン性残基であるグルタミン酸又はアスパラギン酸と塩架橋を形成し得る。

0221

ペプチド及びペプチド模倣体リガンドとしては、天然又は修飾ペプチド、例えば、D又はLペプチド;α、β、又はγペプチド;N−メチルペプチド;アザペプチド;1つ又は複数の尿素結合チオ尿素結合、カルバメート結合、又はスルホニル尿素結合で置換された1つ又は複数のアミド結合、即ち、ペプチド結合を有するペプチド;又は環状ペプチドを有するリガンドが挙げられる。

0222

標的化リガンドは、特定の受容体を標的とすることが可能な任意のリガンドであり得る。例は、葉酸塩、GalNAc、ガラクトース、マンノース、マンノース−6P、GalNAcクラスター、マンノースクラスター、ガラクトースクラスターなどの糖のクラスター、又はアプタマーである。クラスターは、2つ以上の糖単位の組合せである。標的化リガンドは、インテグリン受容体リガンド、ケモカイン受容体リガンド、トランスフェリン、ビオチン、セロトニン受容体リガンド、PSMA、エンドセリンGCPII、ソマトスタチン、LDL及びHDLリガンドも含む。リガンドはまた、核酸、例えば、アプタマーに基づき得る。アプタマーは、非修飾であり得、又は本明細書に開示される修飾の任意の組合せを有し得る。

0223

エンドソーム放出剤としては、イミダゾール、ポリ又はオリゴイミダゾール、PEI、ペプチド、融合性ペプチドポリカルボキシレートポリカチオンマスクオリゴ又はポリカチオン又はアニオンアセタールポリアセタールケタールポリケタールオルトエステルマスク又は非マスクカチオン又はアニオン電荷を有するポリマー、マスク又は非マスクカチオン又はアニオン電荷を有するデンドリマーが挙げられる。

0224

PK調節剤は、薬物動態学的調節剤(pharmacokinetic modulator)を表す。PK調節剤としては、親油性物質(lipophile)、胆汁酸、ステロイド、リン脂質類似体、ペプチド、タンパク質結合剤、PEG、ビタミンなどが挙げられる。例示的なPK調節剤としては、限定はされないが、コレステロール、脂肪酸、コール酸、リトコール酸、ジアルキルグリセリドジアシルグリセリドリン脂質スフィンゴ脂質、ナプロキセン、イブプロフェン、ビタミンE、ビオチンなどが挙げられる。いくつかのホスホロチオエート結合を含むオリゴヌクレオチドも、血清タンパク質に結合することが知られており、したがって、骨格に複数のホスホロチオエート結合を含む短鎖オリゴヌクレオチド、例えば、約5塩基、10塩基、15塩基又は20塩基のオリゴヌクレオチドも、リガンドとして(例えば、PK調節リガンドとして)本発明に適している。

0225

更に、血清成分(例えば、血清タンパク質)に結合するアプタマーも、PK調節リガンドとして本発明に適している。

0226

本発明に適した他のリガンドコンジュゲートが、2004年8月10日に出願された米国特許出願第10/916,185号明細書;2004年9月21日に出願された米国特許出願第10/946,873号明細書;2007年8月3日に出願された米国特許出願第10/833,934号明細書;2005年4月27日に出願された米国特許出願第11/115,989号明細書、及び2007年11月21日に出願された米国特許出願第11/944,227号明細書に記載されており、これらの文献は、あらゆる目的のために、全体が参照により援用される。

0227

2つ以上のリガンドが存在する場合、リガンドは、全て同じ特性を有してもよく、全て異なる特性を有してもよく、又は一部のリガンドが同じ特性を有する一方、他のリガンドが異なる特性を有する。例えば、リガンドは、標的化特性を有してもよく、エンドソーム溶解活性を有してもよく、又はPK調節特性を有してもよい。好ましい実施形態において、全てのリガンドが、異なる特性を有する。

0228

リガンドは、様々な位置、例えば、3’末端、5’末端、及び/又は内部位置で、オリゴヌクレオチドに結合され得る。好ましい実施形態において、リガンドは、介在するテザー、例えば、本明細書に記載される担体を介してオリゴヌクレオチドに結合される。リガンド又は連結配位子は、モノマーが、成長している鎖に組み込まれるとき、モノマーに存在し得る。ある実施形態において、リガンドは、「前駆体」モノマーが、成長している鎖に組み込まれた後、「前駆体」モノマーへの結合によって組み込まれ得る。例えば、アミノ末端のテザーを例えば有するモノマー(即ち、リガンドが結合されてない)、例えばTAP−(CH2)nNH2が、成長しているオリゴヌクレオチド鎖に組み込まれ得る。その後の作業において、即ち、前駆体モノマーを鎖に組み込んだ後、求電子基を有する、例えば、ペンタフルオロフェニルエステル基又はアルデヒド基を有するリガンドが、その後、リガンドの求電子基を前駆体モノマーのテザーの末端求電子基と結合することによって、前駆体モノマーに結合され得る。

0229

別の例では、クリック化学反応に関与するのに適した化学基を有するモノマーが、例えば、アジド又はアルキン末端のテザー/リンカーに組み込まれ得る。その後の作業において、即ち、前駆体モノマーを鎖に組み込んだ後、相補的な化学基、例えば、アルキン又はアジドを有するリガンドが、アルキン及びアジドを一緒に結合することによって、前駆体モノマーに結合され得る。

0230

二本鎖オリゴヌクレオチドの場合、リガンドが、一方又は両方の鎖に結合され得る。ある実施形態において、二本鎖iRNA剤は、センス鎖にコンジュゲートされるリガンドを含む。他の実施形態において、二本鎖iRNA剤は、アンチセンス鎖にコンジュゲートされるリガンドを含む。

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