技術 顕微鏡照明システム

0001

蛍光顕微鏡では、サンプルが蛍光色素で標識され、その後、サンプルホルダを用いて顕微鏡上に配置される。サンプルホルダは、顕微鏡の対物レンズの前方焦点面がサンプルの領域と一致しているようにサンプルを位置決めする。その後、サンプルは、対物レンズを通して差し込む１つ又は複数の光ビームによって照明される。それに応じて、サンプル内の蛍光色素が、一般に、照明している光の波長とは実質的に異なる波長にある光を放射し、それゆえ、色素によって染色された物体を、色素を吸収しなかった物体と区別することができる。顕微鏡は、サンプルによって放射された光が、幾つかのレンズ及びミラーを用いて、上記の対物レンズ焦点面と共役な面と一致する検出器、通常はカメラ上に収集されるように構成される。この結果として、検出器上にサンプルの画像が形成される。

0002

照明のタイプによって区別される幾つかの異なる蛍光顕微鏡法モードがある。異なるモードは、顕微鏡が使用されている実験の具体的な目的によって決まる異なる利点を提供する。各タイプの照明は、被検物上に異なる照明パターンを必要とする。通常、各照明パターンは、光源から被検物上に所望の照明パターンを形成するための異なる構成の光学素子に対応する。光学素子は、場合によっては、光源からの或る光を選択的に遮断するマスクを含む。異なるパターンは異なるマスクによって特徴付けられ、それゆえ、照明パターンを切り替える際にマスクが変更されなければならず、これには、一群の異なるマスクを保持し、既存のマスクを取り出し、新たなマスクを挿入することが必要となる。

0003

本発明は照明システムと、その照明システムを動作させる方法とを含む。

0004

本発明は照明システムと、その照明システムを動作させる方法とを含む。照明システムは、空間光変調器（ＳＬＭ）と、第１及び第２の光学系と、コントローラと、マスクとを備える。ＳＬＭは、入射光ビームを受光するように位置決めされる。第１の光学系は、ＳＬＭから出る光を、光の一部分を遮断するマスク上に結像する。第２の光学系は、マスクから出る光を、照明されることになるサンプル上に結像する。コントローラは、ＳＬＭにＳＬＭパターンを表示させ、ＳＬＭパターンは、入射光ビームから照明光ビーム及びスプリアス光ビームを生成し、照明ビームはマスクを通り抜け、マスクは、複数の開口部を有する固定部と、固定部に対して移動し、１つの開口部を有する可動部とを含む。本発明の一態様では、入射光ビームは、コリメートされた直線偏光光ビームである。

0005

本発明の別の態様では、ＳＬＭパターンは、入射光ビームの一部分を回折させて、照明ビームを生成するパターンを含む。ＳＬＭは、透過性ＳＬＭ又は反射性ＳＬＭとすることができる。

0006

本発明の更に別の態様では、可動部内の開口部は、固定部上の基準点からの距離によって特徴付けられ、基準点及びＳＭＬパターンは、複数の照明モードのうちの１つを指定するユーザ入力に応答して、コントローラによって決定され、各モードは異なる照明パターンに対応する。

0007

本発明の別の態様では、マスクの固定部は透過性スロットと、複数の開口部とを備え、可動部は、この可動部がスロットを覆うように固定部に対して移動する。可動部内の開口部は、スロット内の可動部の位置を変更することによって変更することができる位置によって特徴付けられるマスク内の開口部を設ける。一態様では、固定部内の開口部は対向する対として配置される。各対は固定部上の基準点を中心にして位置する。スロットは、基準点を通って径方向に延在する軸によって特徴付けられ、可動部は軸に対して平行な方向に移動する。

0008

本発明の別の態様では、ＳＬＭを出る光は複数の光ビームを含み、マスクは複数の光ビームのうちの１つを遮断する。

0009

本発明の更に別の態様では、ＳＬＭパターン、及びマスクの可動部は、マスクを出る光が複数の所定の照明パターンのうちの１つを与えるように構成され、複数の所定の照明パターンのうちの１つはユーザ入力によって決定される。

0010

本発明の更に別の態様では、複数の所定の照明パターンのうちの１つは、内部全反射顕微鏡法、偏斜照明顕微鏡法、２次元構造化照明顕微鏡法、３次元構造化照明顕微鏡法又は落射蛍光明視野顕微鏡法に適合する。

0011

本発明による光源の基本光学素子を示す図である。
図１に示される構成において利用することができるマスクの一実施形態の図である。
ディスク３１に対して可動部３２を位置決めすることによって得られる種々のマスク構成を示す図である。
ディスク３１に対して可動部３２を位置決めすることによって得られる種々のマスク構成を示す図である。
ディスク３１に対して可動部３２を位置決めすることによって得られる種々のマスク構成を示す図である。
内部全反射顕微鏡法及び偏斜照明顕微鏡法の場合の顕微鏡ビーム経路の断面図である。
２次元構造化照明顕微鏡法の場合の顕微鏡ビーム経路の断面図である。
明視野落射蛍光顕微鏡法の場合の顕微鏡ビーム経路の断面図である。
３次元構造化照明顕微鏡法の場合の顕微鏡ビーム経路の断面図である。
本発明の一実施形態による、例示的な光源を示す図である。
本発明の一実施形態による、例示的な光源を示す図である。
本発明の実施形態において偏斜照明を生成するのに使用することができる、より小さな調整可能な直径を有する傾斜したビームを生成するための空間光変調器パターンを示す図である。
本発明の実施形態において偏斜照明を生成するのに使用することができる、より小さな調整可能な直径を有する傾斜したビームを生成するための空間光変調器パターンを示す図である。
本発明の一実施形態による、別の例示的な光源を示す図である。
本発明の一実施形態による、別の例示的な光源を示す図である。
本発明の実施形態において偏斜照明を生成するのに使用することができる、より小さな調整可能な直径を有する傾斜したビームを生成するための別の空間光変調器パターンを示す図である。
本発明の実施形態において偏斜照明を生成するのに使用することができる、より小さな調整可能な直径を有する傾斜したビームを生成するための別の空間光変調器パターンを示す図である。

0012

本発明は、顕微鏡又は他の器具において視認するための被検物を照明するための光源を含む。その光源は、マスクの設定及びＳＬＭのプログラミングによって決まる幾つかの異なる照明パターンを与えることができる。本発明がその利点を提供する方法は、図１を参照すると、より容易に理解することができる。図１は、本発明による光源の基本光学素子を示す。照明システム１０は場所１７において物体を照明する。コリメートされた直線偏光光源１１からの光、通常、レーザが、ＳＬＭ１２によって１つ又は複数のビームに分割される。１つ又は複数のビームの詳細は、生成されることになる特定の照明パターンによって決まる。ＳＬＭ１２は、直接的又は間接的にシステムユーザの制御下にあるコントローラ１３から制御される。ＳＬＭ１２によって生成される光ビームは、第１のレンズアセンブリ１４によってマスク１５上に合焦する。マスク１５は、所望の１つ又は複数の光ビームが通り抜ける１つ又は複数の開口部を有する。マスク１５を出る１つ又は複数のビームは、第２のレンズアセンブリ１６によって、所望のパターンにおいて被検物上に結像される。

0013

ここで、図１に示される構成において利用することができるマスクの一実施形態である図２を参照する。マスク３０は、互いに対して移動する２つの部分を有する。ディスク３１は、ディスク３１の中心から一定の半径にあるディスク３１の外縁の周囲に配置される複数の円形開口部３４を有するディスクである。開口部は、対向する開口として配置される。ディスク３１の直径は、一実施形態では数ミリメートルであるが、図１に示される光学素子のサイズによって決まる異なるサイズを利用することができる。また、ディスク３１は、ディスク３１の中心を通る直線に沿って光が通り抜けるように、ディスク３１の中心を越えて延在するスロット３３も含む。

0014

また、マスク３０は、スロット３３の幅よりわずかに広い幅を有する可動部３２も含む。可動部３２は１つの開口部３５を有し、開口部３５は、可動部３２及びディスク３１の組み合わせがスロット３３の軸３７に沿って１つの開口部を設けることができるように位置決めされ、スロット３３は、ディスク３１の中心と円形開口部３４が配置される半径との間の任意の位置においてディスク３１の半径に沿って位置決めすることができる。また、マスクは、開口部３５が位置決めされる場所を除いてスロット３３が覆われるように、軸３６に沿って可動部３２を移動させる線形アクチュエータも含む。

0015

ここで、ディスク３１に対して可動部３２を位置決めすることによって得られる種々のマスク構成を示す図３Ａ〜図３Ｃを参照する。図３Ａを参照すると、可動部３２の開口部３５は、光軸に対して様々な距離に位置決めされる。本発明の一態様では、線形アクチュエータ３６が、矢印によって示されるように、可動部３２を移動させる。アクチュエータ３６は、周囲の構造体又はディスク３１に取り付けることができる。この構成は、１つの位置が可動部の開口と一致するように複数の位置において複数の回折次数を生成するプログラマブル光源に関するパターンとともに使用されることを意図している。この結果として、マスクを通り抜ける単一の軸外ビームが生成される。この構成は、内部全反射蛍光（ＴＩＲＦ：total internal reflection fluorescence）顕微鏡法及び偏斜照明構成において利用される。

0016

ＴＩＲＦ顕微鏡法では、単一の照明光ビームが、光軸に対して十分な角度をなして対物レンズを出る。また、ビームが前方焦点面と光軸との交点において対物レンズの前方焦点面を横切るように、ビームは、横にシフトされた位置において対物レンズを出る。これは、この焦点面におけるサンプル上の被照明領域が光軸を中心にして位置することを意味する。ＴＩＲＦ顕微鏡法の利点は、背景信号を低減できることである。

0017

偏斜照明では、ＴＩＲＦと同様のモードにおいて単一のビームが用いられる。しかしながら、使用される角度は浅い。そのビームは、顕微鏡の視野より小さな直径をなすことができる。しかしながら、他のビーム径を利用することもできる。より小さな直径を用いることによって、照明光が、対物レンズ焦点面の上方及び下方においてサンプルを通り抜けることが回避される。そのような焦点外れの照明光線は、蛍光に対する背景の原因となる可能性があるので、画像コントラストを低下させる可能性がある。さらに、照明ビームは、照明において完全なカバレッジを達成するために、サンプルの異なる横方向領域に順次に位置決めすることができる。各ビームステップにおいて画像が順次に取り込まれる。このモードの利点は、背景信号を低減することである。

0018

ここで、ＴＩＲＦ及び偏斜照明の場合の顕微鏡ビーム経路の断面図を示す図４を参照する。コリメートされた光源３０４から到来する単一の光ビーム３０２が、光軸３０６に対してある角度をなして伝搬し、幾つかのレンズ３０１によって合焦する。そのビームは、可動部３２が中心を外れた開口を作り出すように位置決めされているマスク３０を通り抜ける。また、マスク３０は迷光を遮断する。また、マスク３０は、光源が異なる角度において同時に他の不要なビームを放射する場合には、不要な光ビームを遮断する。ビームは、より小さな直径からなるコリメートされたビームとして最後の（すなわち、対物）レンズを出て、対物レンズの前方焦点面３０５を或る角度で横切る。それは特定のレンズ構成であり、サンプル上により小さなビーム径をもたらすマスクではないことに留意されたい。

0019

ここで図３Ｂを参照する。ここでは、開口部３５が、下にあるディスク３１の部分によって覆われ、マスク上の３対の対向する開口のみを開いたままにするように、可動部３２が位置決めされる。この構成は、２Ｄ構造化照明顕微鏡法（ＳＩＭ：structured illumination microscopy）において使用することができる。ここでは、２つのビームが、光軸に対して逆符号の２つの角度をなして対物レンズを出る。２つのビームが光軸を中心にして位置する領域において前方焦点面を横切るように、両方のビームが個々の距離だけ横にシフトされる。ここでもまた、これは、前方焦点面上の被照明領域が光軸を中心にして位置するのを確実にする。２Ｄ ＳＩＭの利点は、２つのビームの干渉によって生成されたパターンを用いて、顕微鏡の横方向解像度を高めることができることである。

0020

ここで、２ＤＳＩＭ照明のための顕微鏡ビーム経路の断面図を示す図５を参照する。コリメートされた光源６０４から到来する２つの光ビーム６０２Ａ及び６０２Ｂが、光軸６０６に対して或る角度をなして伝搬し、幾つかのレンズ６０１において合焦する。ビームは、中心を外れた２つの開口を利用してマスク３０を通り抜ける。また、マスク３０は、光源が異なる角度において同時に他の不要なビームを放射する場合には、不要な光ビームを遮断する。ビームは、より小さな直径からなる２つのコリメートされたビームとして最後の（すなわち、対物）レンズを出て、或る角度で対物レンズの前方焦点面６０５を横切る。

0021

ここで、図３Ｃを参照する。第３の構成では、可動部３２が、マスク内に中心開口を設けるように位置決めされる。この構成は、明視野照明又は３ＤＳＩＭのいずれの場合にも用いることができ、プログラマブル光源上に表示されるパターンによって決まる。落射蛍光明視野顕微鏡法では、照明ビームは、光軸に沿って、すなわち、対物レンズの前方焦点面に対して直交して対物レンズを出る。明視野顕微鏡法の利点は、簡単、かつロバストであることである。

0022

ここで、明視野顕微鏡法の場合の顕微鏡ビーム経路の断面図を示す図６を参照する。コリメートされた光源４０４から到来する単一の光ビーム４０２が、光軸４０６に沿って伝搬し、幾つかのレンズ４０１において合焦する。ビームはマスク３０を通り抜け、マスクは中心開口を設けるように構成される。マスク３０は迷光を遮断する。ビームは、より小さな直径からなるコリメートされたビームとして最後の（すなわち、対物）レンズを出て、対物レンズの前方焦点面４０５を垂直に横切る。

0023

３ＤＳＩＭでは、２つのビームが、２Ｄ ＳＩＭの場合に用いられるのと同じようにして構成され、一方、第３のビームが明視野顕微鏡法の場合と同じようにして構成される。３つのビームはサンプルにおいて干渉する。３Ｄ ＳＩＭの利点は、結果として生成された干渉パターンを用いて、３つ全ての次元において顕微鏡の解像度を高めることができることである。

0024

ここで、３ＤＳＩＭ照明のための顕微鏡ビーム経路の断面図を示す図を示す図７を参照する。ここで、光源は３つの光ビーム７０２Ａ〜７０２Ｃを生成する。ビーム７０２Ａ及び７０２Ｂは、光軸７０６に対して或る角度をなして伝搬する。ビーム７０２Ｃは、光軸７０６に対して平行に伝搬する。ビームはレンズ７０１によって合焦する。ビームはマスク３０を通り抜け、マスクは、中心を外れた２つの開口と、開口がディスク３１の中心に位置するように可動部３２を位置決めすることによって形成される１つの中心に位置する開口とを使用する。マスク３０は迷光を遮断し、光源が異なる角度において同時に他の不要なビームを放射する場合にも有用である。ビームは、より小さな直径からなる３つのコリメートされたビームとして最後の（すなわち、対物）レンズ７０１を出て、或る角度で対物レンズの前方焦点面７０５を横切る。

0025

本発明の上記の実施形態は、ディスクの形状をなす固定部を有するマスクを利用する。しかしながら、同様に配置された開口部を有する他のマスク形状も利用することができる。利点を提供するのは開口部の位置であり、固定部及び可動部の形状ではない。

0026

ここで、上記の構成において使用することができる本発明の一実施形態による例示的な光源を示す図８Ａ及び図８Ｂを参照する。図８Ａは、ＳＬＭ２０２によって処理される光ビームの断面図であり、図８Ｂは、ＳＬＭ２０２上に生成されるパターンの正面図である。本検討において、透過性ＳＬＭは、デバイスを通り抜ける光ビームに１組の局在化した位相シフト、振幅シフト又はその両方を課すデバイスである。対照的に、反射性ＳＬＭは、デバイスから反射した光ビームに１組の局在化した位相シフト、振幅シフト又はその両方を課すデバイスである。ＳＬＭは、反射性及び透過性のいずれであっても、通常、長方形又は正方形のピクセル格子に区分される。位相シフト及び振幅シフトは、個々のピクセルによって覆われる領域にわたって均一であるが、ピクセル間では異なることができる。ピクセルの位相シフト及び振幅シフトに関する値は、ソフトウェアによってアドレス指定可能であり、毎秒少なくとも幾つかの異なる値の頻度で変更することができる。ピクセル間には、ソフトウェアによって制御不可能であり、かつ光を一定の割合で遮断、反射、又は減衰させる場合がある「デッドゾーン」が存在する場合がある。

0027

図８Ａを参照すると、コリメートされたコヒーレント光ビーム２０１が、光軸２０５に対して実質的に垂直な角度で位置決めされるＳＬＭ２０２に突き当たる。ＳＬＭは、各ピクセルがそのピクセルを通り抜ける光に特定の位相シフトを導入するピクセルパターンを設けるようにプログラムすることができる。回折格子を設けるパターンの一例が、図８Ｂに示される。このパターンでは、大きな位相シフトを導入する横縞が、明るい帯として示されており、暗い帯として示される小さな位相シフトを与える等幅の領域と周期的に交互に入れ替わる。このパターンの結果として、ＳＬＭが干渉格子としての役割を果たすようになる。ＳＬＭに突き当たるコリメートされた光の部分は、２０４において示されるように回折する。図面を簡単にするために、１次の回折次数のみが示される。格子の実効性は有限であり、それゆえ、全ての光が回折するとは限らないので、コリメートされた光の一部が透過し、ビーム２０３を形成するようになる。この光源は、表示されるパターンによって決まる角度だけ傾斜したビームを柔軟に生成することができる。ＳＬＭ上でパターンを回転させることによって、光軸を中心にして、回折したビーム対も回転する。これは、上記のＳＬＭの場合に説明されたように、サンプル上に回転した干渉パターンを生成するのに有用である。しかしながら、この光源は逆の角度のビーム対を常に放射することになり、光軸に対して平行なビームを常に生成することになるので、上記のようなマスクを必要とする。

0028

ここで、本発明の実施形態において偏斜照明を生成するのに使用することができる、より小さな調整可能な直径を有する傾斜したビームを生成するためのＳＬＭパターンを示す図９Ａ及び図９Ｂを参照する。上記で言及されたように、偏斜照明構成は、複数の場所に位置決めされ、或る角度をなして光源を出る、より小さなビームを必要とする。ＳＬＭ２０２上に表示される、図９Ｂに示される位相シフトのパターンは、２つの領域に分離される。２０２Ａに示される第１の領域では、光が図３Ａに示されるような可動部３２内の開口部を通ってマスクの軸外開口を通り抜けることができるようにするのに回折角が適しているような周期性を有する。この領域は、入力ビーム１３０１から、１３０４Ａ及び１３０４Ｂに示される２つのビームを生成する。これらのビームは、入力ビーム１３０１より小さい直径を有する。入力ビーム１３０１の中心線に対するビームのオフセットは、入力ビーム１３０１の中心線に対する領域２０２Ａのオフセットによって決定される。領域２０２Ｂでは、パターンの周期性が領域２０２Ａの周期性より小さく、結果として、より急角度の回折角を生成する。この領域は、１３０３に示される２つのビームを生成する。これらのビームは、マスク３０によって阻止される。ＳＬＭ２０２は、サンプル面に対して共役な顕微鏡内の平面に位置決めされる。それゆえ、２つの領域は、サンプル上の２つの領域に対応することになる。それゆえ、このパターンが上記のようなマスクとともに使用される場合には、２つの領域のサイズが、傾斜したビームによって、サンプルのどの部分が照明されることになるかを決定する。ＳＬＭを再プログラムすることによって、任意のサイズ、形状及び位置の異なる照明ビームを得ることができる。

0029

上記の実施形態では、ＳＬＭは、入射光が一方からＳＬＭ上に向けられ、ＳＬＭを通り抜ける光の一部分が利用される伝導構造として示される。しかしながら、反射性ＳＬＭを利用する実施形態も構成することができる。そのような実施形態では、入射光は一方からＳＬＭに向けられ、光源はコリメートされた光ビームを生成するように構成され、その光ビームはＳＬＭによって回折し、ＳＬＭから反射され、レンズアセンブリ１４に入る複数の光ビームが生成される。ここで、本発明による光源の別の実施形態を示す図１０Ａ及び図１０Ｂを参照する。図１０Ａは、光源１４００の断面図であり、図１０Ｂは、図１０Ａに示されるＳＬＭ１４０２の端面図である。光源１４００は、反射性ＳＬＭを利用して、図８Ａに示される光ビームを与える。ここで図１０Ａを参照する。到来する光ビーム１４０１が、図１０Ｂに示される回折格子パターンを有する反射性ＳＬＭ１４０２から反射される。到来する光は回折してビーム１４６０及び１４０４になる。ビーム１４６０は回折しない反射ビームであり、図８Ａに示されるビーム２０３に類似である。

0030

ここで、本発明による光源の別の実施態様を示す図１１Ａ及び図１１Ｂを参照する。図１１Ａは光源１５００の断面図であり、図１１Ｂは図１１Ａに示されるＳＬＭ１５０２の端面図である。光源１５００は、反射性ＳＬＭを利用して、図９Ａに示される光ビームを与える。ここで図１１Ａを参照する。到来する光ビーム１５０１は、図１１Ｂに示される回折格子パターンを有する反射性ＳＬＭ１５０２から反射される。到来する光は、１５０２Ａにおいて示されるパターンの部分によって回折し、ビーム１５０４になる。１５０２Ｂにおいて示されるパターンの部分は、光ビーム１５０５及び１５０６を生成する。

0031

上記の実施形態は、回折格子を設けるようにプログラムされたＳＬＭを利用するが、他のパターンを利用することもできる。原理的には、上記で論じられた複数のビームを与える任意のパターンを利用することができる。さらに、ＳＬＭ上のパターンは長方形である必要はないことに留意されたい。また、位相に関する変化だけでなく、輝度に関する変化を導入するＳＬＭも利用できることにも留意されたい。

0032

本発明の上述した実施形態は、本発明の種々の態様を示すために提供されている。しかし、異なる特定の実施形態において示される本発明の異なる態様を組み合わせて、本発明の他の実施形態を提供することができることが理解される。さらに、本発明に対する種々の変更形態が、上記の説明及び添付図面から明らかになるであろう。したがって、本発明は、以下の特許請求の範囲の範囲だけによって制限される。