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技術 スフィンゴシン−1−リン酸受容体2活性化化合物含有非傷害部位投与製剤

出願人 国立大学法人岐阜大学
発明者 湊口信也出澤真理吉田正順
出願日 2015年3月25日 (4年11ヶ月経過) 出願番号 2015-063396
公開日 2016年10月20日 (3年5ヶ月経過) 公開番号 2016-183119
状態 特許登録済
技術分野 微生物、その培養処理 化合物または医薬の治療活性 他の有機化合物及び無機化合物含有医薬
主要キーワード 外側前面 修復箇所 ビニルチューブ 誘導操作 非薄化 体年齢 ヘキサデセナール テトラヒドロキシブチル
関連する未来課題
重要な関連分野

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図面 (4)

課題

より実用的な形態でMuse細胞を利用できる製剤を提供する。

解決手段

スフィンゴシン−1−リン酸受容体2(S1PR2)を活性化する化合物を有効成分とする、心筋傷害治療のために非傷害部位投与する製剤とする。

概要

背景

間葉系細胞画分に存在し、誘導操作なしに得られる、SSEA−3(Stage-Specific Embryonic Antigen -3)を表面抗原として発現している多能性幹細胞(Multilineage-differentiating Stress Enduring cells;Muse細胞)が間葉系細胞画分の有する多能性を担っていることが知られている(特許文献1、非特許文献1、2)。また、経脈管的に投与されたMuse細胞が、スフィンゴシン−1−リン酸(S1P)受容体2(S1PR2)を活性化する化合物(例えば、SIP自体)の投与部位誘導されることから、当該化合物がMuse細胞の遊走因子であることが報告されている(特許文献2)。

また、SIPの投与部位にMuse細胞は、組織再生に基づく各種疾患の治療に適用できる可能性があることがわかってきている。なかでも、心筋梗塞に対して、Muse細胞を経静脈的に投与すると、疾患部位である心臓集積して、当該部位において梗塞領域を低減することが報告されている(特許文献3)。

概要

より実用的な形態でMuse細胞を利用できる製剤を提供する。スフィンゴシン−1−リン酸受容体2(S1PR2)を活性化する化合物を有効成分とする、心筋傷害の治療のために非傷害部位に投与する製剤とする。なし

目的

本明細書は、上記問題に鑑みて、より実用的な形態でMuse細胞を利用できる製剤を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

スフィンゴシン−1−リン酸受容体2(S1PR2)を活性化する化合物を有効成分とする、心筋傷害治療のために非傷害部位投与する製剤。

請求項2

多能性幹細胞移植を伴わないで前記心筋障害治療する、請求項1に記載の製剤。

請求項3

前記心筋傷害は、急性心筋梗塞である、請求項1又は2に記載の製剤。

請求項4

経皮投与製剤である、請求項1〜3のいずれかに記載の製剤。

請求項5

皮下注射剤又は筋肉注射剤である、請求項1〜4のいずれかに記載の製剤。

請求項6

日投与量が1mg/kg以上10mg/kg以下である、請求項1〜5のいずれかに記載の製剤。

請求項7

前記化合物は、スフィンゴシン−1−リン酸受容体2に対するアゴニストである、請求項1〜6のいずれかに記載の製剤。

請求項8

前記内因性多能性幹細胞は、以下の特徴;(a)SSEA3及び/又はCD105に関して陽性である、及び(b)CD117及び/又はCD146に関して陰性であるの1種又は2種を有する、請求項1〜7のいずれかに記載の製剤。

請求項9

スフィンゴシン−1−リン酸受容体2を活性化する化合物を有効成分とする、内因性多能性幹細胞を傷害部位へ送達するための非傷害部位投与製剤

請求項10

経皮投与製剤である、請求項9に記載の製剤。

請求項11

前記化合物は、スフィンゴシン−1−リン酸受容体2に対するアゴニストである、請求項9又は10に記載の製剤。

技術分野

0001

本明細書は、スフィンゴシン−1−リン酸受容体活性化化合物含有非傷害部位投与製剤に関する。

背景技術

0002

間葉系細胞画分に存在し、誘導操作なしに得られる、SSEA−3(Stage-Specific Embryonic Antigen -3)を表面抗原として発現している多能性幹細胞(Multilineage-differentiating Stress Enduring cells;Muse細胞)が間葉系細胞画分の有する多能性を担っていることが知られている(特許文献1、非特許文献1、2)。また、経脈管的に投与されたMuse細胞が、スフィンゴシン−1−リン酸(S1P)受容体2(S1PR2)を活性化する化合物(例えば、SIP自体)の投与部位誘導されることから、当該化合物がMuse細胞の遊走因子であることが報告されている(特許文献2)。

0003

また、SIPの投与部位にMuse細胞は、組織再生に基づく各種疾患の治療に適用できる可能性があることがわかってきている。なかでも、心筋梗塞に対して、Muse細胞を経静脈的に投与すると、疾患部位である心臓集積して、当該部位において梗塞領域を低減することが報告されている(特許文献3)。

0004

国際公開WO2011/007900パンフレット
国際公開WO2014/133170パンフレット
国際公開WO2014/027684パンフレット

先行技術

0005

: Dezawa,M.,et al.,J.Clin.Invest.,Vol.113,p.1701−1710(2004):
Dezawa,M.,et al.,Science,Vol.309,p.314−317(2005)

発明が解決しようとする課題

0006

Muse細胞の疾患治療への使用形態としては、特許文献3に示すように、疾患に罹患している患者個体から採取し、あるいは採取・培養して、再び個体に移植するという、細胞移植の形態を採る使用形態が挙げられる。

0007

しかしながら、細胞移植を伴うにあたっては、必要な細胞数まで増殖させること、培養細胞品質管理などにおいて困難を伴う場合もある。

0008

また、S1PR2活性化化合物が遊走因子であったとしても、当該化合物を傷害部位に投与する必要性がある。しかしながら、当該化合物の傷害部位への投与やデリバリーは必ずしも容易ではない。

0009

以上のように、細胞治療はその有用性は高いものの、適切なMuse細胞の調製は依然として困難であり、治療へのハードルは低くはない。また、S1PR2活性化化合物の投与についても困難性があった。

0010

本明細書は、上記問題に鑑みて、より実用的な形態でMuse細胞を利用できる製剤を提供する。

課題を解決するための手段

0011

本発明者らは、Muse細胞は、ヒトなどにおいて内在する多能性幹細胞であるため、本来的に個体内に内在する又は傷害時に骨髄から誘導されるMuse細胞(以下、これらを内因性Muse細胞という。)を、そのまま傷害部位に一層効果的にデリバリーさせるのに好適な製剤を見出した。本明細書は、こうした知見に基づき以下の手段を提供する。

0012

(1)スフィンゴシン−1−リン酸受容体2(S1PR2)を活性化する化合物を有効成分とする、心筋傷害の治療のための非傷害部位投与製剤。
(2)多能性幹細胞の移植を伴わないで前記心筋障害を治療する、(1)に記載の製剤。
(3)前記心筋傷害は、急性心筋梗塞である、(1)又は(2)に記載の製剤。
(4)経皮投与製剤である、(1)〜(3)のいずれかに記載の製剤。
(5)皮下注射剤又は筋肉注射剤である、(1)〜(4)のいずれかに記載の製剤。
(6)1日投与量が1mg/kg以上10mg/kg以下である、(1)〜(5)のいずれかに記載の製剤。
(7)前記化合物は、スフィンゴシン−1−リン酸受容体2に対するアゴニストである、(1)〜(6)のいずれかに記載の製剤。
(8)前記内因性多能性幹細胞は、以下の特徴;
(a)SSEA3及び/又はCD105に関して陽性である、及び
(b)CD117及び/又はCD146に関して陰性である
の1種又は2種を有する、(1)〜(7)のいずれかに記載の製剤。
(9)S1PR2を活性化する化合物を有効成分とする、内因性多能性幹細胞を傷害部位へ送達するための非傷害部位投与製剤。
(10)経皮投与製剤である、(9)に記載の製剤。
(11)前記化合物は、スフィンゴシン−1−リン酸受容体2に対するアゴニストである、(10)に記載の製剤。

図面の簡単な説明

0013

ウサギ心筋梗塞モデルを用いたS1P投与試験プロトコール概要を示す図である。
ウサギ心筋梗塞モデルの血中のMuse細胞の測定結果を示す図である。
ウサギ心筋梗塞モデルに対するS1P投与の効果を示す図である。
血中のS1P量の評価結果を示す図である。

0014

本明細書の開示は、心筋傷害の治療用の製剤及び内因性多能性幹細胞の傷害部位への送達用の製剤に関する。

0015

本開示の製剤(以下、単に、本製剤という。)は、S1PR2活性化化合物(以下、単に、本化合物という。)を含有することができる。本製剤によれば、本化合物を非傷害部位に投与して血流中に含有させることにより、内因性Muse細胞などの多能性幹細胞を血流中に動員して傷害部位に送達することができる。

0016

本製剤の投与部位は、個体において組織や細胞の傷害が生じている傷害部位とは異なる部位である。本製剤は、本化合物を、いわゆる遊走因子としてではなく、内因性Muse細胞等の多能性幹細胞を血流中に動員させるために用いている。このため、Muse細胞を集積させたい部位ではない部位に投与することによって、内因性Muse細胞を傷害部位に集積させることができる。

0017

このため、本製剤は、細胞移植を伴うことなく、また、傷害部位に本化合物を投与することなく、内因性Muse細胞などの内因性多能性幹細胞を血流に動員し傷害部位に集積させて、傷害部位における組織や細胞の再生に寄与させることができる。

0018

本製剤は、心筋障害治療に用いることができる。本製剤を心筋障害の傷害部位でない部位に投与することで、内因性多能性幹細胞を血流中に動員し、心筋傷害部位へと送達して梗塞領域の拡大を抑制又は梗塞領域を縮小させることができる。これにより、心筋障害を治療し又は改善することができる。

0019

以下、本開示の実施形態について詳細に説明する。

0020

(S1PR2活性化化合物を含有する、心筋障害の治療のための非傷害部位投与製剤)
本開示の心筋障害治療のための非傷害部位投与製剤(以下、本治療用製剤という。)は、S1PR2活性化化合物を有効成分として含有することができる。本治療用製剤は、内因性幹細胞を血流中に動員し、心筋障害部位に送達することができる。以下、まず、内因性多能性幹細胞について説明する。

0021

(内因性多能性幹細胞)
本治療用製剤は、生体内に予め存在する内因性である多能性幹細胞に対して作用することができる。なお、本明細書において、「内因性多能性幹細胞」とは、移植によらないで、本来的に生体内に存在するか又は生体において生じた傷害に起因して誘導された多能性幹細胞を意味している。

0022

内因性多能性幹細胞としては、本発明者らの一人である出澤が、ヒト生体内にその存在を見出し、「Muse(Multilineage−differentiating Stress Enduring)細胞」と命名した細胞が挙げられる。Muse細胞は、骨髄液真皮結合組織等の皮膚組織から得ることができ、各臓器結合組織にも散在する。また、この細胞は、多能性幹細胞と間葉系幹細胞の両方の性質を有する細胞である。

0023

Muse細胞などの内因性多能性幹細胞は、少なくともSSEA3陽性及びCD105陽性のいずれかであることが好ましい。

0024

例えば、Muse細胞は、それぞれの細胞表面マーカーである「SSEA−3(Stage−specific embryonic antigen−3)」と「CD105」のダブル陽性として同定される。したがって、Muse細胞又はMuse細胞を含む細胞集団は、例えば、これらの抗原マーカー指標として生体組織から分離することができる。Muse細胞の分離法同定法、及び特徴などの詳細は、国際公開第WO2011/007900号に開示されている。また、Wakaoら(2011、上述)によって報告されているように、骨髄、皮膚などから間葉系細胞を培養し、それをMuse細胞の母集団として用いる場合、SSEA−3陽性細胞の全てがCD105陽性細胞であることが分かっている。すなわち、生体の間葉系組織又は培養間葉系幹細胞からMuse細胞を分離する場合は、単にSSEA−3を抗原マーカーとしてMuse細胞を精製し、使用することができる。

0025

なお、本明細書においては、SSEA−3を抗原マーカーとして、生体の間葉系組織又は培養間葉系組織から分離された多能性幹細胞(Muse細胞)又はMuse細胞を含む細胞集団を単に「SSEA−3陽性細胞」と記載することがある。また、本明細書においては、「非Muse細胞」とは、生体の間葉系組織又は培養間葉系組織に含まれる細胞であって、「SSEA−3陽性細胞」以外の細胞を指す。

0026

より具体的には、Muse細胞又はMuse細胞を含む細胞集団は、細胞表面マーカーであるSSEA−3に対する抗体を単独で用いて、又はSSEA−3及びCD105に対するそれぞれの抗体を両方用いて、生体組織(例えば、間葉系組織)から分離することができる。ここで、「生体」とは、哺乳動物の生体をいう。本開示において、生体には、受精卵胞胚期より発生段階が前のは含まれないが、胎児や胞胚を含む胞胚期以降の発生段階の胚は含まれる。哺乳動物には、限定されないが、ヒト、サル等の霊長類マウスラット、ウサギ、モルモット等のげっ歯類ネコイヌヒツジブタウシウマロバヤギフェレット等が挙げられる。

0027

なお、本開示においてMuse細胞は、生体の組織由来である点で、胚性幹細胞ES細胞)や胚性生殖幹細胞(EG細胞)と明確に区別される。また、「間葉系組織」とは、骨、滑膜脂肪、血液、骨髄、骨格筋真皮靭帯歯髄臍帯などの組織及び各種臓器に存在する結合組織をいう。例えば、Muse細胞は、骨髄や皮膚から得ることができる。例えば、生体の間葉系組織を採取し、この組織からMuse細胞を分離し、利用することが好ましい。また、上記分離手段を用いて、培養間葉系細胞からMuse細胞を分離してもよい。

0028

また、Muse細胞などの内因性多能性幹細胞は、CD34(EP及びADSCマーカー)、CD117(c−kit)(MBのマーカー)、CD146(PC及びADSCのマーカー)、CD271(NGFR)(NCSCのマーカー)、NG2(PCのマーカー)、vWF因子フォンビルブランド因子)(EPのマーカー)、Sox10(NCSCのマーカー)、Snai1(SKPのマーカー)、Slug(SKPのマーカー)、Tyrp1(MBのマーカー)、及びDct(MBのマーカー)からなる群から選択される11個のマーカーのうち少なくとも1個、例えば、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個又は11個のマーカーの非発現を指標に分離することができる。例えば、限定されないが、CD117及びCD146の非発現を指標に分離することができ、さらに、CD117、CD146、NG2、CD34、vWF及びCD271の非発現を指標に分離することができ、さらに、上記の11個のマーカーの非発現を指標に分離することができる。

0029

上記のように、Muse細胞又はMuse細胞を含む細胞集団は、例えば、SSEA−3陽性又はSSEA−3陽性とCD105陽性の二重陽性を指標にして生体組織から分離することができる。ヒト成人皮膚等には、種々のタイプの幹細胞及び前駆細胞を含むことが知られている。しかしながら、Muse細胞は、これらの細胞と区別されるものである。すなわち、このような幹細胞及び前駆細胞には、皮膚由来前駆細胞(SKP)、神経堤幹細胞(NCSC)、メラノブラスト(MB)、血管周囲細胞(PC)、内皮前駆細胞(EP)、脂肪由来幹細胞(ADSC)が挙げられる。したがって、これらの細胞に固有のマーカーの「非発現」を指標として、Muse細胞を分離することができる。

0030

また、本発明において対象とされる上記特徴を有するMuse細胞は、以下:
(i)テロメラーゼ活性が低いか又は無い;
(ii)三胚葉のいずれの胚葉の細胞に分化する能力を持つ;
(iii)腫瘍性増殖を示さない;及び
(iv)セルフリニューアル能を持つ
からなる群から選択される少なくとも1つの性質を有してもよい。好ましくは、2以上、より好ましくは3以上、さらに好ましくはすべての特徴を有している。

0031

上記(i)について、「テロメラーゼ活性が低いか又は無い」とは、例えば、TRAPEZE XL telomerase detection kit(Millipore社)を用いてテロメラーゼ活性を検出した場合に、低いか又は検出できないことをいう。テロメラーゼ活性が「低い」とは、例えば、体細胞であるヒト線維芽細胞と同程度のテロメラーゼ活性を有しているか、又はHela細胞に比べて1/5以下、好ましくは1/10以下のテロメラーゼ活性を有していることをいう。

0032

上記(ii)について、Muse細胞は、in vitro及びin vivoにおいて、三胚葉(内胚葉系、中胚葉系、及び外胚葉系)に分化する能力を有し、例えば、in vitroで誘導培養することにより、肝細胞神経細胞骨格筋細胞平滑筋細胞骨細胞脂肪細胞等に分化し得る。また、in vivoで精巣に移植した場合にも三胚葉に分化する能力を示す場合がある。さらに、静注により生体に移植することで損傷を受けた臓器(心臓、皮膚、脊髄、肝、筋肉等)に遊走及び生着し、分化する能力を有する。

0033

上記(iii)について、Muse細胞は、浮遊培養では増殖速度約1.3日で増殖するが、10日間程度で増殖が止まるという性質を有し、さらに精巣に移植した場合、少なくとも半年間は癌化しないという性質を有する。

0034

上記(iv)について、Muse細胞は、セルフリニューアル(自己複製)能を有する。ここで、「セルフリニューアル」とは、1個のMuse細胞を浮遊培養することにより得られる胚様体様細胞塊に含まれる細胞を培養し、再度胚様体様細胞塊を形成させることをいう。セルフリニューアルは1回又は複数回のサイクルを繰り返せばよい。

0035

(S1PR2活性化化合物)
本治療用製剤は、S1PR2活性化化合物を有効成分とすることができる。S1PR2は、スフィンゴシン−1−リン酸(SIP)に対する受容体の1つである。内因性多能性幹細胞であるMuse細胞において特異的に発現していることが報告されている(特許文献1等)。

0036

S1PR2受容体活性化化合物としては、スフィンゴシン−1−リン酸(S1P)、スフィンゴシン−1−リン酸誘導体、並びにスフィンゴシン−1−リン酸受容体のアゴニストが挙げられる。ここで、「スフィンゴシン−1−リン酸(S1P)」とは、下記式で表される。SIPは、細胞膜を構成するスフィンゴ脂質代謝産物であり、ある種の酵素によって細胞膜から切り出されて遊離した後、細胞膜上に発現しているGタンパク質共役受容体に結合することにより、細胞遊走などを引き起こす生理活性物質として知られている。また、S1Pに対する受容体としては、Gタンパク質共役受容体であるS1P受容体が知られ、これまでにS1PR1〜S1PR5の5種類が存在することが分かっている。

0037

0038

S1PR2活性化化合物としては、SIPのほか、内因性多能性幹細胞の血流への動員能を有している限り、そのS1P誘導体使用可能である。S1P誘導体としては、特に限定されないが、スフィンゴシルコリンガラクトシルスフィンゴシン(サイコシン)、グルコシルスフィンゴシン(グルコサイコシン)、スルホガラクトシルスフィンゴシン(リゾスルファチド)、N,N−ジメチルスフィンゴシン1−リン酸、N,N,N−トリメチルスフィンゴシン1−リン酸、セラミド1−リン酸、ジヒドロスフィンゴシン1−リン酸、フィトスフィンゴシン1−リン酸、及びデハイドロフィトスフィンゴシン1−リン酸、並びにそれらの塩を挙げることができる。

0039

また、S1PR2活性化化合物としては、S1PR2に対するアゴニストを用いることができる。このようなアゴニストとしては、以下の化合物(1)〜(5)が挙げられる。
(1)1−(2−(1−ベンジル−2,5−ジメチル−1H−ピロール−3−イル)−2−オキソエチル)−5−(トリフルオロメチルピリジン−2(1H)−オン(例えば、Park,S.W.,et al.,J.Am.Soc.Nephrol.,23,p.266−80(2012)参照)
(2)1−(2−(1−ベンジル−2,5−ジメチル−1H−ピロール−3−イル)−2−オキソエチル)ピロリジン−2,5−ジオン
(3)1−(2−(1−ベンジル−2,5−ジメチル−1H−ピロール−3−イル)−2−オキソエチル)−3−メチルイミダゾリジン−2,4,5−トリオン
(4)1−(1−ベンジル−2,5−ジメチル−1H−ピロール−3−イル)−2−((1−メチル−1H−テトラゾール−5−イル)チオエタノン
(5)(S)−1−(2−(1−ベンジル−2,5−ジメチル−1H−ピロール−3−イル)−2−オキソエチル)−2’,3’−ジヒドロスピロイミダゾリジン−4,1’−インデン]−2,5−ジオン

0040

0041

S1PR2活性化化合物としては、脱リン酸化反応を担うS1Pリアーゼ阻害する物質が挙げられる。また、S1Pは、生体内において、小胞体に存在するスフィンゴシン−1−リン酸リアーゼにより脱リン酸化され、trans−2−ヘキサデセナールエタノールアミンリン酸に分解されるが、通常、この脱リン酸化反応と、trans−2−ヘキサデセナールにリン酸を付加する反応とは平衡状態にあることが知られている。

0042

こうした阻害剤としては、以下の化合物(6)〜(8)が挙げられる。
(6)(E)−1−(4−((1R,2S,3R)−1,2,3,4−テトラヒドロキシブチル)−1H−イミダゾール−2−イル)エタノンオキシム(例えば、Bagdanoff,J.T.,et al.,J.Med.Chem.,vol.53,p.8650−8662(2010)を参照)
(7)(1R,2S,3R)−1−(2−(イソキサゾール−3−イル)−1H−イミダゾール−4−イル)ブタン−1,2,3,4−テトラオール(Bagdanoffら、上述)
(8)1−(5−((1R,2S,3R)−1,2,3,4−テトラヒドロキシブチル)−1H−イミダゾール−2−イル)エタノン(例えば、Cayman Chemical Item Number 13222Cayman Chemical Com.,Michigan,USA)

0043

0044

本治療用製剤は、心筋障害治療のために用いることができる。本明細書において、心筋障害とは、心筋障害とは、冠動脈狭窄閉塞によって生じる、心筋への血流の減少又は停止に起因する傷害をいう。例えば、狭心症不安定狭心症及び心筋梗塞が挙げられる。心筋梗塞は、特に、重症大型心筋梗塞、及びそれに伴う心不全を含む。ここで、「心筋梗塞」とは、冠動脈の閉塞によってもたらされる心筋壊死をいう。また、「心不全」とは、十分量の血流を押し出す心機能不全に原因する症候群をいい、心拍出量の低下とそれに伴う静脈圧の増大、またその結果として生じる種々の臨床症状が含まれる。心筋梗塞は、急性心臓死及び慢性心臓死を引き起こす原因となる。

0045

本治療用製剤の適用対象である心筋障害は、急性心筋梗塞とすることが有利である。本治療用製剤は、発症後迅速に処置するのに好適な製剤であるからである。急性心筋梗塞の場合、死亡率は35〜50%と高く、その死亡例の60〜70%は発症後1〜2時間以内の死亡である。また、初回発作の心筋壊死が大きい場合には、心筋梗塞を再発する危険性が高い。したがって、心筋梗塞の治療においては、発作が起きたときに迅速に処置することが求められ、壊死した心筋の大きさ、すなわち梗塞サイズを可及的小にとどめることが重要とされている。

0046

また、本治療用製剤の適用対象である心筋障害は、重症大型心筋梗塞とすることが有利である。なかでも、心筋の左室リモデリングが進行する程度の心筋梗塞とすることが有利である。心筋梗塞の重症度判定には、種々の分類がある。そのような分類としては、例えば、時間的経過による分類、形態学的分類(心筋層内範囲、部位、壊死の大きさなど)、心筋の壊死形態、梗塞後心室再構築血行動態的分類(治療、予後などに関連する)、臨床的重症度による分類などが挙げられる。ここで、重症度が高く、より広範囲に心筋壊死に陥った心筋梗塞を特に「重症大型心筋梗塞」という。例えば、左冠動脈近位部の完全閉塞が挙げられる。また、重症大型心筋梗塞では、心筋の左室リモデリングが進行し、心不全に陥るため生命予後は悪いことが知られている。心筋梗塞後の「左室リモデリング」とは、心筋梗塞後に生じる梗塞部位非薄化による心機能低下の代償として起こる非梗塞部位心筋細胞肥大間質細胞外マトリックス)の増加、心内腔の拡大などの一連の変化を指す。心筋梗塞後の長期予後は、左室機能不全の程度と相関するため、左室リモデリングを抑制することは左室の機能を維持及び保存するために不可欠である。

0047

本治療用製剤は、S1PR2活性化化合物を非傷害部位に投与する製剤である。ここで非傷害部位とは、心筋障害の傷害部位とな異なる部位をいう。本明細書において、心筋障害の傷害部位とは、心筋組織又は細胞において、外傷、炎症、疾患、虚血、壊死、腫瘍形成、又は加齢等を原因とした各種細胞及び組織との変性又は脱落によって失われた特定の部位を意味する。例えば、心筋における傷害部位は、心筋において血管の狭窄や閉塞によって血流が減少又は停止したことによって細胞や組織が損傷された部位が挙げられる。

0048

本製剤は、傷害部位とは異なる部位、すなわち、非傷害部位に投与される。非傷害部位とは、上記した傷害部位以外の部位である。すなわち、本治療用製剤は、傷害部位とは異なる部位に投与することで、多能性幹細胞を移植することなく、傷害部位に対して内因性多能性幹細胞を集積させることができるものである。

0049

投与部位としての非傷害部位は、特に限定するものではないが、心臓以外の部位であることが好ましい。したがって、例えば、一般的な製剤の投与経路に適用される投与部位であって局所としての心臓以外であればよい。

0050

本治療用製剤は、経口投与のほか、皮下投与筋肉内投与静脈内投与髄腔内投与下、経直腸経膣経鼻吸入経皮口腔粘膜インプラント等、非経口投与を意図した製剤形態を採ることができる。製剤形態としても、特に限定するものではないが、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与、髄腔内投与については、注射剤などの注入剤等が挙げられる。また、経皮、口腔粘膜、インプラント等においては、パッチフィルム等も可能である。

0051

本治療用製剤は、静脈投与製剤以外の製剤形態が好適であり、例えば、皮下投与製剤、筋肉内投与製剤、経皮製剤が好適である。なかでも、皮下注射剤や筋肉注射剤などの経皮的投与製剤が好適である。これらの製剤は、Muse細胞を血流中に動員するのに好適な製剤形態であるからである。例えば、皮下注射剤や筋肉注射剤の場合には、特に限定するものではないが、上腕部や臀部を投与部位とすることができる。

0052

本治療用製剤は、投与形態等に応じて、公知の製剤方法を利用して製造することができる。注射剤を調製する場合は、pH調節剤緩衝剤安定化剤等張化剤局所麻酔剤等を添加し、常法を利用して局所用注射剤を製造することができる。pH調製剤及び緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム酢酸ナトリウムリン酸ナトリウム等が挙げられる。安定化剤としては、例えば、ピロ亜硫酸ナトリウムEDTAエデト酸ナトリウム)、チオグリコール酸チオ乳酸等が挙げられる。局所麻酔剤としては、例えば、塩酸プロカイン塩酸リドカイン等が挙げられる。等張化剤としては、例えば、塩化ナトリウムブドウ糖等が挙げられる。

0053

本治療用製剤に含めるS1PR2活性化化合物の濃度は、傷害部位における損傷の程度等によって適宜変更することができる。例えば、Muse細胞を血流に動員させ傷害部位に集積させるために有効なS1PR2活性化化合物の濃度は、特に限定するものではないが、例えば、1nM〜100μMである。

0054

本治療用製剤の投与量は、心筋障害の重症度、発症経過日数、個体年齢等によっても異なるが、1mg/kg体重、日以上10mg/kg体重、日以下とし、こうした投与を、例えば、1回から適数回(例えば、10回以下程度、2回以上8回以下程度など)にわたって実施することができる。投与量は、3mg/kg体重、日以上8mg/kg体重、日以下であってもよいし、好ましくは4mg/kg体重、日以上6mg/kg体重、日以下であってもよい。また、例えば、急性心筋梗塞発症後においては、発症後24時間以内に少なくとも1回投与することが好ましい。

0055

本治療用製剤は、S1PR2活性化化合物を有効成分とし、心筋障害の非傷害部位に投与することにより、心筋障害を治療することができる。すなわち、本治療用製剤は、非傷害部位に投与しつつ、生体内に内在するMuse細胞及び/又は傷害時に生体内に誘導されるMuse細胞を傷害部位に集積させることができ、内因性のMuse細胞の再生能を利用して傷害部位を修復し、傷害の進行を抑制し又は傷害を低減させることができる。

0056

推論であって本開示を拘束するものではないが、本治療用製剤は、S1PR2活性化化合物の血中濃度を増大させることにより、骨髄中のMuse細胞などの内因性多能性幹細胞を、血流中に動員することができる。一旦、血流中に動員されたMuse細胞は、その遊走能に基づいて障害部位に集積するものと考えられる。本発明者の一部は、既に、S1PR2活性化化合物を遊走因子として用いてMuse細胞を傷害部位に集積させることを見出している。しかしながら、遊走因子は、その因子の濃度勾配に応じて、遊走因子高濃度側に被遊走要素(ここではMuse細胞)を誘導するものである。

0057

これに対して、本治療用製剤は、S1PR2活性化化合物を遊走因子として使用するものではない。その結果、本治療用製剤は、傷害部位でない非傷害部位にS1PR2活性化化合物を投与し、かつ内因性多能性幹細胞を傷害部位に集積させるものである。本治療用製剤は、S1PR2活性化化合物を傷害部位に投与しない点、非傷害部位に投与するのに内因性多能性幹細胞を傷害部位に集積させることができる点において、特許文献2に記載の医薬組成物によりも有利であるといえる。また、特許文献2等に接した当業者といえども、非傷害部位へのS1PR2活性化化合物によるMuse細胞の傷害部位への送達程度は、当業者といえども予測することができないものである。また、このような用法及び用量により心筋障害を治療できることも想到しえないものである。

0058

(内因性多能性幹細胞を傷害部位へ送達するための非傷害部位投与製剤)
本開示の非傷害部位投与製剤(以下、単に本送達用製剤という。)は、スフィンゴシン−1−リン酸受容体2を活性化する化合物を有効成分とすることができる。本送達用製剤は、非傷害部位への投与により、内因性多能性幹細胞を傷害部位へ送達することができる。本送達用製剤における、S1PR2活性化化合物、非傷害部位については、既に本治療用製剤について説明した各種実施態様をそのまま適用できる。

0059

本送達用製剤は、特に、疾患等の適用対象を想定するものではない。生体内において傷害部位が発生しているような疾患や、傷害が発生しているようなあるいはそのような障害予見されるような状態に適用される。ここでいう、傷害部位は、上記した心筋障害に限定されないで、生体内における各種の臓器、器官、及び組織において、外傷、炎症、疾患、虚血、壊死、腫瘍形成、又は加齢等を原因とした各種細胞及び組織との変性又は脱落によって失われた特定の部位を意味する。

0060

(生体における傷害の診断補助する方法又は生体における傷害の検査方法)。
本明細書によれば、血中のS1P量を測定する工程を備える、生体における傷害の診断を補助する方法又は生体における傷害の検査方法を提供することができる。この方法によれば、血中S1P量を測定することによって、生体のいずれかの箇所における損傷の発生に対して肯定的に判断するか又は肯定的な判断を補助することができる。血中におけるS1P量の増大は、Muse細胞の動員を意味している。すなわち、生体における要修復箇所の発生を意味しているからである。

0061

血中のS1P量は特に限定しないで、公知の方法、例えば、MS、HPLC、呈色(蛍光)法等の当業者に公知の方法により測定することができる。

0062

以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。

0063

本実施例では、ウサギ心筋梗塞モデルについて、図1に示すプロトコールに基づき、S1Pを皮下注により投与し、血中Muse細胞及び梗塞領域について評価した。なお、本実施例におけるウサギを用いた実験プロトコールは、岐阜大学の動物実験に関する倫理委員会によって承認されたものであり、米国国立衛生研究所(NIH)によって刊行された「実験動物の管理と使用に関する指針」(1996年改定版)に沿って実施された。

0064

(ウサギ心筋梗塞モデルの作製)
日本白色種ウサギ(約2〜3kg/匹)は、30mg/kgペントバルビタールナトリウムを用いて麻酔された。ウサギにおいて、連続的に動脈ガス分析を行い、動脈ガス生理学的範囲に維持するように換気条件を適宜調整した。左頸動脈及び頸静脈カニュレートし、動脈圧監視した。3番目肋間腔において左開胸後、心臓を露出させ、左室の外側前面の中央を下行する大冠動脈枝下で4−0絹糸結紮を行った。縫合糸の両末端に細いビニルチューブを通し、その縫合糸を引くことによって冠動脈枝を閉塞した。次に、モスキート止血鉗子を用いてこのチューブクランプすることによって固定した。心筋虚血は、局所的チアノーゼ及び心電図の変化によって確認した。閉塞(虚血)時間は適宜調整される。縫合糸を開放後、危険領域全体での心筋の赤色への変化によって確認した(Yasudaら,Am.J.Physiol.Heart.Circ.Physiol.,296:H1558−1565,2009を参照されたい)。

0065

(S1PR2アゴニスト皮下投与による血中Muse細胞及び心筋梗塞サイズの縮小効果)
図1に示すプロトコールに基づき、ウサギにおいて、結紮による梗塞(虚血)時間を30分間(ヒトにおいては虚血3時間に対応する)とし、その後、縫合糸を開放し、再還流を開始した。再還流24時間後に、コントロール群は、生理食塩水を、S1P投与群は、スフィンゴシン−1−リン酸受容体2に対するアゴニストであるSID46371153(既述の化合物(1))を5mg/kgとなるようにウサギの背中に筋肉内に対して注射を実施した。

0066

(血中Muse細胞の測定)
再灌流から48時間後に、各群から血液を採取して、FACSによりSSEA3及びCD44陽性細胞をカウントした。結果を図2に示す。

0067

図2に示すように、S1P投与群は、コントロール群に対して約1.5倍のMuse細胞が血中に動員されていることがわかった。

0068

(梗塞領域の評価)
再還流から14日後に、各群における梗塞サイズの縮小効果を比較検討した。より具体的には、再灌流14日後のウサギをヘパリン(500U/kg)処理し、過剰量のペントバルビタール静脈注射することによって安楽死させた。心臓を摘出し、心筋組織における梗塞サイズの縮小効果をまた、マッソントリクローム染色により、組織化学的に検討した。

0069

摘出した心臓を10%ホルマリン液中で固定し、パラフィン包埋後、房室輪が得られるように各標本から横断面方向に切片を作製した。その後、常法に従ってマッソントリクロームMT)染色し、心筋梗塞領域視覚化した。このMT染色では、生細胞からなる組織では赤く染色され、一方、膠原線維化された組織は青白く、色が抜けたように観察される。結果を図3に示す。

0070

図3上段に示すように、生理食塩水を投与されたコントロール群では、MTに染色されない膠原線維化された組織(梗塞部位)が広がっていることがわかる。一方、S1P投与群の左室組織は、対照と比較して青白い部分が小さく、梗塞サイズが減少しているのがわかる。また、特徴的に、乳頭筋についても梗塞から回復していることが観察された。

0071

また、図3下段に示すように、コントロール群の梗塞領域は、33.46%であったのに対し、S1P投与群では18.26%であった。すなわち、約半分程度にまで梗塞領域が減少していることがわかった。

0072

以上のことから、皮下から投与したS1PR2アゴニストは、Muse細胞を血中に動員して、心臓の傷害部位に到達して梗塞領域を低減できることがわかった。

0073

本実施例では、急性心筋梗塞発症後の血中S1Pの評価を行った。コントロール群(健常人群;63人、平均年齢62.4±12.9、男性38人、女性22人)、冠動脈疾患CAD)(群(健常人群;63人、平均年齢62.4±12.9、男性38人、女性22人)及び急性心筋梗塞(AMI)発症群(健常人群;63人、平均年齢62.4±12.9、男性38人、女性22人)のうち、コントロール群7名、CAD群5名及びAMI群7人につき、血中濃度を測定した。AMI群については、発症後28日まで定期的に血液を採取し、その最大値を平均した。なお、S1Pは、LC/MS/MSを用いて一般的なプロトコールにより測定した。結果を図4に示す。

実施例

0074

図4に示すように、AMI群においては、血中S1P量が高値になっていることがわかった。したがって、血中S1Pは、生体における心筋梗塞などによる傷害部位の発生に対応して上昇することがわかった。

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