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課題

解決手段

本発明は、孵化鶏卵又はMDCK細胞内で高力価に複製するインフルエンザ・ウィルス単離体由来する少なくとも5種の内部遺伝子を含む、例えばヘルパー・ウィルスの不存在において、高力価インフルエンザ・ウィルスを調製するのに有用な組成物を提供する。

概要

背景

背景
マイナスセンスRNAウィルスは、一般的なヒト病原体、例えば呼吸器合胞体ウィルスインフルエンザウィルス麻疹ウィルス、及びエボラ・ウィルス、並びに家禽及び畜牛産業に大きな経済打撃を与える動物ウィルス(例えばニューカッスル病ウィルス及び牛疫ウィルス)を含む7つの科(Rhabdoviridae、Paramyxoviridae、Filoviridae、Bornaviridae、Orthomyxoviridae、Bunyaviridae、及びArenaviridae)に分類される。最初の4つの科は、非セグメントゲノムによって特徴付けられるのに対して、後者の3つの科は、それぞれ6〜8つ、3つ、又は2つのマイナス−センスRNAセグメントから成るゲノムを有する。マイナス−センスRNAウィルスの共通の特徴は、これらのRNAゲノムの負の極性である。すなわちウィルスRNA(vRNA)は、mRNAに対して相補であり、従ってそれ自体は感染性でない。ウィルス転写及び複製を開始するために、vRNAは、ウィルス・ポリメラーゼ複合体及び核タンパク質によって、それぞれプラス−センスmRNA又はcRNAに転写されなければならず、インフルエンザA型ウィルスの場合、ウィルス・ポリメラーゼ複合体は、3種のポリメラーゼタンパク質PB2、PB1、及びPAから成っている。ウィルス複製中、cRNAが、新しいvRNA分子の合成のための鋳型として役立つ。全てのマイナス鎖RNAウィルスに関して、vRNA及びcRNAの5’及び3’の両末端における非コード領域が、ウィルス・ゲノムの転写及び複製にとって重要である。細胞又はウィルスmRNA転写産物とは異なり、cRNA及びvRNAは5’末端でキャップされることはなく、また、真の3’末端でポリアデニル化されることもない。

多くのウィルス・タンパク質の基本機能が、生化学的に、且つ/又はウイルス感染との関連において解明されている。しかしながら、逆遺伝技術系が、ウィルス複製及び病原性に関して、並びに生の弱毒化ウィルス・ワクチンの開発に関して、マイナス鎖セグメントRNAウィルス及び非セグメントRNAウィルスについての我々の知識を劇的に増大させている。逆遺伝技術という用語は分子ウィルス学において使用されるが、この逆遺伝技術は、クローン化cDNAから誘導されたゲノムを有するウィルスを発生させることとして定義される(概説に関してはNeumann他、2002年を参照)。

マイナス鎖RNAウィルスのウィルス複製を開始するために、vRNA又はcRNAはポリメラーゼ複合体及び核タンパク質と共発現されなければならない。狂犬病ウィルスが、クローン化cDNAから全体的に生成された最初の非セグメント・マイナス−センスRNAウィルスであった。すなわちSchnell他(1994)は、完全長cRNAをコードするcDNA構造と、L、P、及びNタンパク質に対応するタンパク質発現構造とを、全てT7RNAポリメラーゼプロモーターの制御下で共トランスフェクトすることにより、組み換え狂犬病ウィルスを生成した。T7 RNAポリメラーゼを提供する、組み換えワクシニア・ウィルスによる感染の結果、感染性狂犬病ウィルスが発生した。このT7ポリメラーゼ系の場合、T7 RNAポリメラーゼの制御下で完全長cRNAを一次転写する結果、非キャップcRNA転写産物が生じた。しかし、T7 RNAポリメラーゼの最適な開始配列を形成する3つのグアニジンヌクレオチドが5’末端に付着された。増殖感染サイクルにとって必須のcRNA転写産物の真正3’末端を形成するために、cRNA転写産物の3’末端における正確な自己触媒的切断に際してデルタ肝炎リボザイム(HDVRz)が使用された。

Schnell他(1994)による最初の報告以来、同様の技術を用いた逆遺伝技術系は、多くの非セグメント・マイナス鎖RNAウィルスを発生させた(Conzelmann、1996; Conzelmann、1998; Conzelmann他、1996; Marriott他、1999; Munoz他、2000; Nagai、1999; Neumann他、2002; Roberts他、1998; Rose、1996)。元の救出処置の改良は、安定にトランスフェクトされた細胞系(Radecke他、1996)から、又はタンパク質発現プラスミド(Lawson他、1995)からのT7RNAポリメラーゼの発現、又は救出効率を高めるための熱ショック処置(Parks他、1999)を含んだ。T7ポリメラーゼ系に基づいて、Bridgen及びElliott(1996)は、クローン化cDNAからBunyamweraウィルス(Bunyaviridae科)を形成し、T7ポリメラーゼ系によってセグメント・マイナス−センスRNAウィルスを人工的に生成することの実現可能性を実証した。

1999年に、クローン化cDNAからセグメント・インフルエンザA型ウィルスを全体的に生成するための細胞RNAポリメラーゼIに基づいて、プラスミドをベースとする逆遺伝技術が生み出された(Fodor他、1999;Neumann及びKawaoka、1999)。RNAポリメラーゼI、核小体酵素は、インフルエンザ・ウィルスRNAと同様に5’キャップ又は3’ポリA構造を含有しないリボソームRNAを合成する。RNAポリメラーゼIプロモーター及びターミネーター配列によってフランキングされた、インフルエンザ・ウィルスcDNAを含有する構造のRNAポリメラーゼI転写の結果、インフルエンザvRNA合成が生じた(Fodor他、1999; Neumann及びKawaoka、1999;Neumann及びKawaoka、2001; Pekosz他、1999)。このシステムは高効率であり、トランスフェクション後48時間で、プラスミド・トランスフェクト細胞上澄み1ml当たり108個を上回る感染性ウィルス粒子を生成した。

必要とされるものは、クローン化cDNAから全体的に、高力価オルトミクソウィルス、例えばインフルエンザA型ウィルスを調製する方法である。

概要

ワクチンのための高力価組み換えインフルエンザ・ウィルスの提供。本発明は、孵化鶏卵又はMDCK細胞内で高力価に複製するインフルエンザ・ウィルス単離体由来する少なくとも5種の内部遺伝子を含む、例えばヘルパー・ウィルスの不存在において、高力価インフルエンザ・ウィルスを調製するのに有用な組成物を提供する。なし

目的

本発明は、本発明の複数のインフルエンザ・ウィルス・ベクター、例えば7:1再構築体、6:1:1再構築体、5:1:2再構築体、5:1:1:1再構築体を含む再構築体ウィルスを調製するのに有用なインフルエンザ・ウィルス・ベクターを含んでなる組成物を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

再構築インフルエンザウィルスのための複数のインフルエンザ・ウィルス・ベクターを含んでなる組成物であって、a)転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスPAcDNA作用結合されたプロモーターを含んでなるvRNA生産用ベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスPB1cDNAに作用結合されたプロモーターを含んでなるvRNA生産用ベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスPB2cDNAに作用結合されたプロモーターを含んでなるvRNA生産用ベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスHAcDNAに作用結合されたプロモーターを含んでなるvRNA生産用ベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスNPcDNAに作用結合されたプロモーターを含んでなるvRNA生産用ベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスNAcDNAに作用結合されたプロモーターを含んでなるvRNA生産用ベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスMcDNAに作用結合されたプロモーターを含んでなるvRNA生産用ベクター、及び転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスNScDNAに作用結合されたプロモーターを含んでなるvRNA生産用ベクター、ここで、PB1、PB2、PA、NP、M、及びNSに対応するcDNAは、配列番号1〜6によりコードされる対応ポリペプチドに少なくとも97%の隣接アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードするPB1、PB2、PA、NP、M、及びNSの配列を有し、HAに対応するcDNAは、異種HAの配列を有し、ここで、NSに対するcDNAは、位置55にGlu残基を有し、そしてNAに対応するcDNAは、異種NAの配列を有するか又は配列番号8によりコードされる対応ポリペプチドに少なくとも95%の隣接アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする、HAとNAの両者が異種である場合、それらは異なる単離物由来する;並びにb)インフルエンザ・ウィルスPAをコードするDNAセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるウィルス・タンパク質生産用ベクター、インフルエンザ・ウィルスPB1をコードするDNAセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるウィルス・タンパク質生産用ベクター、インフルエンザ・ウィルスPB2をコードするDNAセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるウィルス・タンパク質生産用ベクター、及びインフルエンザ・ウィルスNPをコードするDNAセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるウィルス・タンパク質生産用ベクター、並びに任意には、インフルエンザ・ウィルスHAをコードするDNAセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるウィルス・タンパク質生産用ベクター、インフルエンザ・ウィルスNAをコードするDNAセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるウィルス・タンパク質生産用ベクター、インフルエンザ・ウィルスM1をコードするDNAセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるウィルス・タンパク質生産用ベクター、インフルエンザ・ウィルスM2をコードするDNAセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるウィルス・タンパク質生産用ベクター、又はインフルエンザ・ウィルスNS2をコードするDNAセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるウィルス・タンパク質生産用ベクター、を含んでなる、組成物。

請求項2

前記プロモーターが、RNAポリメラーゼIプロモーター、RNAポリメラーゼIIプロモーター、RNAポリメラーゼIIIプロモーター、T3プロモーター又はT7プロモーターである、請求項1に記載の組成物。

請求項3

前記HAがA型HAであるか又はB型HAである、請求項1に記載の組成物。

請求項4

前記HAがH5である、請求項1に記載の組成物。

請求項5

前記a)の複数のベクターが、RNAポリメラーゼIプロモーター、又はRNAポリメラーゼIIプロモーターを含む、請求項1に記載の組成物。

請求項6

前記b)のベクターの全てが、RNAポリメラーゼIIプロモーターを含む、請求項1に記載の組成物。

請求項7

前記a)の各ベクター又は前記b)の各ベクターが別個プラスミド上にある、請求項1に記載の組成物。

請求項8

前記NA又はHAがキメラNA又はHAである、請求項1に記載の組成物。

請求項9

前記HAに対応するcDNAは、SEQIDNo.7によってコードされるポリペプチドに対応するポリペプチドをコードしない、請求項1に記載の組成物。

請求項10

前記NA内のストークが20超のアミノ酸長である、請求項1に記載の組成物。

請求項11

前記HAが無毒形H5HAである、請求項1に記載の組成物。

請求項12

前記NAに対応するcDNAは、配列番号8によりコードされる対応ポリペプチドに少なくとも97%の隣接アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする、請求項1に記載の組成物。

請求項13

前記PB1、PB2、PA、NP、NA、M、及びNSに対応するcDNAは、配列番号1〜6、及び8によりコードされる対応ポリペプチドに少なくとも99%の隣接アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードするPB1、PB2、PA、NP、NA、M、及びNSの配列を有する、請求項1に記載の組成物。

請求項14

前記NSに対応するcDNAは、配列番号38によりコードされる対応ポリペプチドに少なくとも97%の隣接アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする、請求項1に記載の組成物。

請求項15

前記NAは、N1である、請求項1に記載の組成物。

請求項16

インフルエンザ・ウィルスの製造方法であって、細胞を、感染性インフルエンザ・ウィルスを産出するために有効な量の、a)転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスPAcDNAに作用結合されたプロモーターを含んでなるvRNA生産用ベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスPB1cDNAに作用結合されたプロモーターを含んでなるvRNA生産用ベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスPB2cDNAに作用結合されたプロモーターを含んでなるvRNA生産用ベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスHAcDNAに作用結合されたプロモーターを含んでなるvRNA生産用ベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスNPcDNAに作用結合されたプロモーターを含んでなるvRNA生産用ベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスNAcDNAに作用結合されたプロモーターを含んでなるvRNA生産用ベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスMcDNAに作用結合されたプロモーターを含んでなるvRNA生産用ベクター、及び転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスNScDNAに作用結合されたプロモーターを含んでなるvRNA生産用ベクター、ここで、PB1、PB2、PA、NP、M、及びNSに対応するcDNAは、配列番号1〜6によりコードされる対応ポリペプチドに少なくとも97%の隣接アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードするPB1、PB2、PA、NP、M、及びNSの配列を有し、HAに対応するcDNAは、異種HAの配列を有し、ここで、NSに対するcDNAは、位置55にGlu残基を有し、そしてNAに対応するcDNAは、異種NAの配列を有するか又は配列番号8によりコードされる対応ポリペプチドに少なくとも95%の隣接アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする、HAとNAの両者が異種である場合、それらは異なる単離物に由来する;並びにb)インフルエンザ・ウィルスPAをコードするDNAセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるウィルス・タンパク質生産用ベクター、インフルエンザ・ウィルスPB1をコードするDNAセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるウィルス・タンパク質生産用ベクター、インフルエンザ・ウィルスPB2をコードするDNAセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるウィルス・タンパク質生産用ベクター、及びインフルエンザ・ウィルスNPをコードするDNAセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるウィルス・タンパク質生産用ベクター、並びに任意には、インフルエンザ・ウィルスHAをコードするDNAセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるウィルス・タンパク質生産用ベクター、インフルエンザ・ウィルスNAをコードするDNAセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるウィルス・タンパク質生産用ベクター、インフルエンザ・ウィルスM1をコードするDNAセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるウィルス・タンパク質生産用ベクター、インフルエンザ・ウィルスM2をコードするDNAセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるウィルス・タンパク質生産用ベクター、又はインフルエンザ・ウィルスNS2をコードするDNAセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるウィルス・タンパク質生産用ベクター、と接触させることを含む、インフルエンザ・ウィルスの製造方法。

請求項17

前記ウィルスを単離することをさらに含む、請求項16に記載の方法。

請求項18

請求項17に記載の方法によって得られたウィルス。

請求項19

孵化卵内で高力価に複製するインフルエンザ・ウィルスに由来するPB1、PB2、PA、NP、M、及びNAのウィルス・セグメントと、配列番号1〜5、及び8によりコードされる対応ポリペプチドに少なくとも97%の隣接アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドの配列と、位置55にGlu残基を有するNSのウィルス・セグメントと、異種HAのウィルス・セグメントとを含む、単離された組み換えインフルエンザ・ウィルス。

請求項20

前記高力価に複製する該インフルエンザ・ウィルスがPR8HGである、請求項19に記載の単離された組み換えインフルエンザ・ウィルス。

請求項21

前記HAのウィルス・セグメントがH5に対応する、請求項19に記載の単離された組み換えインフルエンザ・ウィルス。

請求項22

医薬として使用するための請求項18〜21のいずれか1項に記載のウィルス。

請求項23

不活性化インフルエンザ・ウィルス・ワクチンの製造における請求項18〜22のいずれか1項に記載のウィルスの使用。

請求項24

該個体を免疫化するために有効な医薬の製造における請求項18〜22のいずれか1項に記載のウィルスの使用。

請求項25

前記PB1、PB2、PA、NP、M、及びNSに対応するcDNAは、配列番号1〜6によりコードされる対応ポリペプチドに少なくとも99%の隣接アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードするPB1、PB2、PA、NP、M、及びNSの配列を有する、請求項1に記載の組成物。

請求項26

前記NAに対応するcDNAは、異種NAの配列を有する、請求項25に記載の組成物。

請求項27

前記NAに対応するcDNAは、配列番号8によりコードされる対応ポリペプチドに少なくとも95%の隣接アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする、請求項26に記載の組成物。

請求項28

前記PB1、PB2、PA、NP、M、及びNSに対応するcDNAは、配列番号1〜6によりコードされる対応ポリペプチドに少なくとも99%の隣接アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードするPB1、PB2、PA、NP、M、及びNSの配列を有する、請求項16に記載の方法。

請求項29

前記NAに対応するcDNAは、異種NAの配列を有する、請求項28に記載の方法。

請求項30

前記NAに対応するcDNAは、配列番号8によりコードされる対応ポリペプチドに少なくとも95%の隣接アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする、請求項28に記載の方法。

技術分野

0001

関連出願の相互参照
本出願は、2006年3月31日付けで出願された米国特許出願第60/787,766号明細書の出願日の優先権を主張し、前記明細書の開示内容を参考のため本明細書中引用する。

0002

政府支援
本発明は、国立衛生研究所(National Institutes of Health)からの認可番号AI044386のもとで政府の支援によって行われた。合衆国政府は本発明において一定の権利を有する。

背景技術

0003

背景
マイナスセンスRNAウィルスは、一般的なヒト病原体、例えば呼吸器合胞体ウィルスインフルエンザウィルス麻疹ウィルス、及びエボラ・ウィルス、並びに家禽及び畜牛産業に大きな経済打撃を与える動物ウィルス(例えばニューカッスル病ウィルス及び牛疫ウィルス)を含む7つの科(Rhabdoviridae、Paramyxoviridae、Filoviridae、Bornaviridae、Orthomyxoviridae、Bunyaviridae、及びArenaviridae)に分類される。最初の4つの科は、非セグメントゲノムによって特徴付けられるのに対して、後者の3つの科は、それぞれ6〜8つ、3つ、又は2つのマイナス−センスRNAセグメントから成るゲノムを有する。マイナス−センスRNAウィルスの共通の特徴は、これらのRNAゲノムの負の極性である。すなわちウィルスRNA(vRNA)は、mRNAに対して相補であり、従ってそれ自体は感染性でない。ウィルス転写及び複製を開始するために、vRNAは、ウィルス・ポリメラーゼ複合体及び核タンパク質によって、それぞれプラス−センスmRNA又はcRNAに転写されなければならず、インフルエンザA型ウィルスの場合、ウィルス・ポリメラーゼ複合体は、3種のポリメラーゼタンパク質PB2、PB1、及びPAから成っている。ウィルス複製中、cRNAが、新しいvRNA分子の合成のための鋳型として役立つ。全てのマイナス鎖RNAウィルスに関して、vRNA及びcRNAの5’及び3’の両末端における非コード領域が、ウィルス・ゲノムの転写及び複製にとって重要である。細胞又はウィルスmRNA転写産物とは異なり、cRNA及びvRNAは5’末端でキャップされることはなく、また、真の3’末端でポリアデニル化されることもない。

0004

多くのウィルス・タンパク質の基本機能が、生化学的に、且つ/又はウイルス感染との関連において解明されている。しかしながら、逆遺伝技術系が、ウィルス複製及び病原性に関して、並びに生の弱毒化ウィルス・ワクチンの開発に関して、マイナス鎖セグメントRNAウィルス及び非セグメントRNAウィルスについての我々の知識を劇的に増大させている。逆遺伝技術という用語は分子ウィルス学において使用されるが、この逆遺伝技術は、クローン化cDNAから誘導されたゲノムを有するウィルスを発生させることとして定義される(概説に関してはNeumann他、2002年を参照)。

0005

マイナス鎖RNAウィルスのウィルス複製を開始するために、vRNA又はcRNAはポリメラーゼ複合体及び核タンパク質と共発現されなければならない。狂犬病ウィルスが、クローン化cDNAから全体的に生成された最初の非セグメント・マイナス−センスRNAウィルスであった。すなわちSchnell他(1994)は、完全長cRNAをコードするcDNA構造と、L、P、及びNタンパク質に対応するタンパク質発現構造とを、全てT7RNAポリメラーゼプロモーターの制御下で共トランスフェクトすることにより、組み換え狂犬病ウィルスを生成した。T7 RNAポリメラーゼを提供する、組み換えワクシニア・ウィルスによる感染の結果、感染性狂犬病ウィルスが発生した。このT7ポリメラーゼ系の場合、T7 RNAポリメラーゼの制御下で完全長cRNAを一次転写する結果、非キャップcRNA転写産物が生じた。しかし、T7 RNAポリメラーゼの最適な開始配列を形成する3つのグアニジンヌクレオチドが5’末端に付着された。増殖感染サイクルにとって必須のcRNA転写産物の真正3’末端を形成するために、cRNA転写産物の3’末端における正確な自己触媒的切断に際してデルタ肝炎リボザイム(HDVRz)が使用された。

0006

Schnell他(1994)による最初の報告以来、同様の技術を用いた逆遺伝技術系は、多くの非セグメント・マイナス鎖RNAウィルスを発生させた(Conzelmann、1996; Conzelmann、1998; Conzelmann他、1996; Marriott他、1999; Munoz他、2000; Nagai、1999; Neumann他、2002; Roberts他、1998; Rose、1996)。元の救出処置の改良は、安定にトランスフェクトされた細胞系(Radecke他、1996)から、又はタンパク質発現プラスミド(Lawson他、1995)からのT7RNAポリメラーゼの発現、又は救出効率を高めるための熱ショック処置(Parks他、1999)を含んだ。T7ポリメラーゼ系に基づいて、Bridgen及びElliott(1996)は、クローン化cDNAからBunyamweraウィルス(Bunyaviridae科)を形成し、T7ポリメラーゼ系によってセグメント・マイナス−センスRNAウィルスを人工的に生成することの実現可能性を実証した。

0007

1999年に、クローン化cDNAからセグメント・インフルエンザA型ウィルスを全体的に生成するための細胞RNAポリメラーゼIに基づいて、プラスミドをベースとする逆遺伝技術が生み出された(Fodor他、1999;Neumann及びKawaoka、1999)。RNAポリメラーゼI、核小体酵素は、インフルエンザ・ウィルスRNAと同様に5’キャップ又は3’ポリA構造を含有しないリボソームRNAを合成する。RNAポリメラーゼIプロモーター及びターミネーター配列によってフランキングされた、インフルエンザ・ウィルスcDNAを含有する構造のRNAポリメラーゼI転写の結果、インフルエンザvRNA合成が生じた(Fodor他、1999; Neumann及びKawaoka、1999;Neumann及びKawaoka、2001; Pekosz他、1999)。このシステムは高効率であり、トランスフェクション後48時間で、プラスミド・トランスフェクト細胞上澄み1ml当たり108個を上回る感染性ウィルス粒子を生成した。

0008

必要とされるものは、クローン化cDNAから全体的に、高力価オルトミクソウィルス、例えばインフルエンザA型ウィルスを調製する方法である。

0009

発明の概要
本発明は、本発明の複数のインフルエンザ・ウィルス・ベクター、例えば7:1再構築体、6:1:1再構築体、5:1:2再構築体、5:1:1:1再構築体を含む再構築体ウィルスを調製するのに有用なインフルエンザ・ウィルス・ベクターを含んでなる組成物を提供する。本発明の1実施態様の場合、組成物は、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスPAcDNAに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスPB1 cDNAに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスPB2 cDNAに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスHAcDNAに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスNP cDNAに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスNA cDNAに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスM cDNAに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、及び転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスNS cDNAに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、から選択されたvRNA生成のためのベクターを含む。組成物はまた、インフルエンザ・ウィルスPAをコードするベクター、インフルエンザ・ウィルスPB1をコードするベクター、インフルエンザ・ウィルスPB2をコードするベクター、及びインフルエンザ・ウィルスNPをコードするベクター、及び任意には、インフルエンザ・ウィルスNP、NS、M、例えばM1及びM2、HA又はNAをコードする1種又は2種以上のベクター、から選択されたウィルス・タンパク質生成のためのベクターを含む。好ましくは、ウィルス・タンパク質をコードするベクターはさらに、転写終結配列を含んでなる。

0010

1実施態様の場合、PB1、PB2、PA、NP、M、及びNS、及び任意にはNAに対応するcDNAは、孵化卵内で高力価に複製するインフルエンザ・ウィルスに由来する、PB1、PB2、PA、NP、M、及びNS、及び任意にはNAの配列を有し、そしてHAに対応するcDNAは、異なるインフルエンザ・ウィルス株に由来する(同じ又は異なるHAサブタイプを有する異種インフルエンザ・ウィルス単離体、すなわち異種HAに由来する)配列を有する。孵化卵内で高力価に成長しない病原性H5N1ウィルスに由来するHAの場合、少なくともNAに対応するcDNAが、孵化卵内で高力価に複製するN1インフルエンザ・ウィルスに由来する配列を有する。

0011

1実施態様の場合、PB1、PB2、PA、NP、M、及びNSに対応するcDNAは、高力価、例えば108EID50/mL超、例えば109 EID50/mL、1010 EID50/mL、又はこれを上回る力価のインフルエンザ・ウィルスのタンパク質のうちの少なくとも1つをコードする配列に対応する核酸分子ポリヌクレオチド)を含む。孵化卵内で高力価を有する本発明の範囲内の再構築体の力価は、5:1:1:1再構築体(NS K55を有する)、5:1:2再構築体(NS K55を有する)、及び6:1:1再構築体(NS K55を有する)の場合、少なくとも約109 EID50/mLであり、また、5:1:1:1再構築体(NS K55Eを有する)、又は5:1:2再構築体(NS K55Eを有する)の場合、少なくとも4x108PFU/mLである。MDCK細胞内で高力価を有する本発明の範囲内の再構築体の力価は、5:1:1:1又は6:1:1の場合、少なくとも0.75x108PFU/mL、少なくとも2.0x108PFU/mLである。

0012

1実施態様の場合、本発明は、5:1:2又は6:1:1再構築体のための複数のインフルエンザ・ウィルス・ベクターを含んでなる組成物を含む。組成物は、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスPAcDNAに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスPB1 cDNAに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスPB2 cDNAに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスHAcDNAに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスNP cDNAに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスNA cDNAに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスM cDNAに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、及び転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスNS cDNAに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクターを含む。PB1、PB2、PA、NP、及びMに対応するcDNAは、孵化卵内で高力価に複製する1種又は2種以上のインフルエンザ・ウィルスに由来する配列を有し、NSに対応するcDNAは、孵化卵内で高力価に複製する1種又は2種以上のインフルエンザ・ウィルスに由来し、NAに対応するcDNAは、孵化卵内で高力価に複製する1種又は2種以上のインフルエンザ・ウィルスに由来するか、又は異種NAの配列を有し、そしてHAに対応するcDNAは、少なくともPB1、PB2、PA、NP、及びMのウィルス遺伝子セグメントに対して異種の、異種HAの配列を有する。1実施態様の場合、NSに対応するcDNAは、位置55にGluを有する。組成物はまた、インフルエンザ・ウィルスPAをコードするDNAセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、インフルエンザ・ウィルスPB1をコードするDNAセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、インフルエンザ・ウィルスPB2をコードするDNAセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、及びインフルエンザ・ウィルスNPをコードするDNAセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、及び任意には、インフルエンザ・ウィルスHAをコードするDNAセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、インフルエンザ・ウィルスNAをコードするDNAセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、インフルエンザ・ウィルスM1をコードするDNAセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、インフルエンザ・ウィルスM2をコードするDNAセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、又はインフルエンザ・ウィルスNS2をコードするDNAセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、を含む。1実施態様の場合、PB1、PB2、PA、NP、M、及びNSに対応するcDNAは、高力価、例えば108EID50/mL超、例えば109 EID50/mL、1010 EID50/mL、又はこれを上回る力価のインフルエンザ・ウィルスのタンパク質のうちの少なくとも1つをコードする配列に対応する核酸分子(ポリヌクレオチド)を含む。

0013

1実施態様の場合、本発明は、5:1:1:1又は6:1:1再構築体のための複数のインフルエンザ・ウィルス・ベクターを含んでなる組成物を含む。組成物は、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスPAcDNAに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスPB1 cDNAに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスPB2 cDNAに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスHAcDNAに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスNP cDNAに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスNA cDNAに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスM cDNAに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、及び転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスNS cDNAに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクターを含む。PB1、PB2、PA、NP、及びMに対応するcDNAは、MDCK細胞内で高力価に複製する1種又は2種以上のインフルエンザ・ウィルスに由来する配列を有し、NSに対応するcDNAは、MDCK細胞内で高力価に複製する1種又は2種以上のインフルエンザ・ウィルスに由来し、NAに対応するcDNAは、異種NAの配列を有し、そしてHAに対応するcDNAは、異種HAの配列を有する。組成物はまた、インフルエンザ・ウィルスPAをコードするDNAセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、インフルエンザ・ウィルスPB1をコードするDNAセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、インフルエンザ・ウィルスPB2をコードするDNAセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、及びインフルエンザ・ウィルスNPをコードするDNAセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、及び任意には、インフルエンザ・ウィルスHAをコードするDNAセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、インフルエンザ・ウィルスNAをコードするDNAセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、インフルエンザ・ウィルスM1をコードするDNAセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、インフルエンザ・ウィルスM2をコードするDNAセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、又はインフルエンザ・ウィルスNS2をコードするDNAセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、を含む。1実施態様の場合、PB1、PB2、PA、NP、M、及びNSに対応するcDNAは、高力価、例えば108EID50/mL超、例えば109 EID50/mL、1010 EID50/mL、又はこれを上回る力価のインフルエンザ・ウィルスのタンパク質のうちの少なくとも1つをコードする配列に対応する核酸分子(ポリヌクレオチド)を含む。

0014

本明細書中に記載されているように、組み換え(6:2再構築体)ウィルスは、野生型PR8株よりも、たとえこれらが同じPR8「内部」遺伝子(すなわちHA及びNA以外の遺伝子)を有するとしても、卵内では成長が悪い。卵内での強い成長が、不活性化ワクチンの生成に際して使用されるワクチン種ウィルスの必須の特性であるので、卵内でPR8供与体株と同じく良好に成長するH5N1ワクチン候補を生成した。HA−NAバランス及びPB1機能が重要な成長決定因子であることが判った。このような知識を持って、WHO推奨NIBRG−14ウィルスを含むよりコンベンショナルな6:2再構築体に対する卵内の成長を評価するために、PR8バックグラウンドを有する、HA−NAバランスを変化させた一連のH5N1ウィルスを生成した。7:1再構築体ウィルス及び6:2再構築体のうちの1つは、卵内の成長の向上を示した。このように、一般に卵内で低い力価を生じさせるワクチン・ウィルスに対して、少なくともワクチン・ウィルスのNAの代わりに、卵内で良好に成長するインフルエンザ・ウィルスのNAを使用するか、又はワクチン・ウィルスのHA及びNA以外の全て、又はHA以外の全ての代わりに、卵内で高力価に成長するインフルエンザ・ウィルスに由来する他のウィルス遺伝子セグメントを使用する結果、著しく高いウィルス力価をもたらすことができる。本発明の再構築体ウィルスの力価は、対応する非再構築体ワクチン・ウィルスの2倍、3倍、又はそれ以上、例えば7倍以上であってよい。これも本明細書中に記載されているように、2種の異なるPR8ウィルス単離体に由来する遺伝子を有する卵内の再構築体の高い成長速度に関与する内部遺伝子が見極められた。最高ウィルス力価は、内部遺伝子の大部分がPR8HG(PR8(UW))に由来する場合の力価であった。具体的には、5:1:2再構築体(PR8(UW)PB1、PB2、PA、NP及びM;PR8(Cam)NS;及びH5N1 HA及びNA)及び6:1:1再構築体(PR8(UW)NA、PB1、PB2、PA、NP及びM;PR8(Cam)NS;及びH5 HA)が卵内で高力価を有した。

0015

これも本明細書中に記載されているように、MDCK細胞(おそらくワクチン・ウィルス源として承認されると思われる細胞)中の高い成長速度に関与するウィルス遺伝子を評価した。MDCK細胞中の最高成長速度は、PR8(UW)に由来するPB2、PR8(Cam)に由来するNS、又はPR8(UW)に由来するK55E、及び長いストーク、例えば20アミノ酸超であるがしかし約100アミノ酸未満、例えば約40超であり且つ最大80アミノ酸長のストークを有するNAで見いだされた。このように、PR8(UW)PA、PB1、PB2、NP、及びM、及びPR8(UW)又はPR8(Cam)に由来するNS K55E、PR8(UW)に由来するNA、又は異種NA源、及び異種HAを有する5:1:1:1及び6:1:1再構築体が、MDCK細胞中で最高力価に成長した。

0016

1実施態様の場合、核酸分子は、SEQID No:1〜6及び8のうちの1つによってコードされる対応ポリペプチドと実質的に同じ活性を有するPB1、PB2、PA、NP、M、及びNS、及び任意にはNAをコードする配列に対応する。本明細書中に使用される「実質的に同じ活性」は、対応する完全長ポリペプチドの活性の約0.1%、1%、10%、30%、50%、90%(例えば最大100%)、又はそれを上回る活性、又は対応する完全長ポリペプチドのタンパク質レベルの約80%、90%、又はそれを上回る検出可能なタンパク質レベルを含む。1実施態様の場合、核酸分子は、SEQ ID No:1〜6及び8のうちの1つによってコードされたポリペプチドと実質的に同じである、例えばこのポリペプチドに対して少なくとも80%、例えば90%、92%、95%、97%、又は99%の隣接アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする配列に対応する。1実施態様の場合、単離及び/又は精製された核酸分子は、SEQ ID No:1〜6、8、又は33〜38のうちの1つと実質的に同じである、例えばこれに対して少なくとも50%、例えば60%、70%、80%、又は90%、又はそれを上回る隣接核酸配列同一性を有するヌクレオチド配列を含んでなり、そして1実施態様の場合、さらに、SEQ ID No:1〜6、8、又は33〜38のうちの1つによってコードされたポリペプチドに対して少なくとも80%、例えば90%、92%、95%、97%、又は99%の隣接アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする。1実施態様の場合、単離及び/又は精製された核酸分子は、SEQ ID No:1〜6、又は8のうちの1つによってコードされたポリペプチドに対して1又は2以上の、例えば2、5、10、15,20又はそれを上回る同類アミノ酸置換、例えば最大10%又は20%の残基の同類置換を有するポリペプチドをコードする。同類アミノ酸置換は、同様の側鎖を有する残基の相互交換可能性を意味する。例えば脂肪族側鎖を有するアミノ酸の基はグリシンアラニンバリンロイシン、及びイソロイシンであり、脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の基は、セリン及びトレオニンであり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸の基はアスパラギン及びグルタミンであり、芳香族側鎖を有するアミノ酸の基は、フェニルアラニンチロシン、及びトリプトファンであり、塩基性側鎖を有するアミノ酸の基はリシンアルギニン、及びヒスチジンであり、そして硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の基はシステイン及びメチオニンである。1実施態様の場合、同類アミノ酸置換は、バリン−ロイシン−イソロイシン;フェニルアラニン−チロシン;リシン−アルギニン;アラニン−バリン;グルタミン酸アスパラギン酸、及びアスパラギン−グルタミンである。1実施態様の場合、単離及び/又は精製された核酸分子は、SEQ ID No:1〜6、8、又は33〜38のうちの1つによってコードされたポリペプチドに対して、1又は2以上の、例えば2、3又は4の非同類アミノ酸置換を有するポリペプチドをコードする。例えば、K55E NS及びS360Y PB2置換は、非同類置換である。

0017

別の実施態様の場合、PB1、PB2、PA、NP、M、及びNS、及び任意にはNAを有する核酸分子の配列、又はその相補形は、低緊縮性、中緊縮性、又は緊縮条件下で、SEQID No:1〜6、8、又は33〜38のうちの1つ、又はその相補形とハイブリッド形成する。例えば、下記条件が採用されてよい:50℃の2XSSC、0.1%SDS中の洗浄を伴う50℃の7%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、0.5M NaPO4、1mMEDTA中(低緊縮性)、より望ましくは、50℃の1X SSC、0.1%SDS中の洗浄を伴う50℃の7%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中(中緊縮性)、さらにより望ましくは、50℃の0.5X SSC、0.1%SDS中の洗浄を伴う50℃の7%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中(緊縮性)、好ましくは、50℃の0.1X SSC、0.1%SDS中の洗浄を伴う50℃の7%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中(より高緊縮性)、より好ましくは、65℃の0.1X SSC、0.1%SDS中の洗浄を伴う50℃の7%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中(極めて高緊縮性)。1実施態様の場合、核酸分子は、SEQ ID No:1〜6、又は33〜38のうちの1つと実質的に同じである、例えばこれに対して少なくとも50%、例えば60%、70%、80%、又は90%、又はそれを上回る隣接核酸配列同一性を有するポリペプチドをコードし、そして好ましくは、SEQ ID No:1〜6、8又は33〜38のうちの1つによってコードされた対応する完全長ポリペプチドと実質的に同じ活性を有する。これらの核酸分子、又は卵内で良好に成長する他のN1株に由来する核酸分子は、任意のHA、例えばH5に対応する核酸と共に採用されてよい。

0018

このように、インフルエンザ・タンパク質を発現させるため、例えば他のインフルエンザ・ウィルス遺伝子を含む他のウィルス遺伝子と、キメラ遺伝子を調製するため、且つ/又は組み換えウィルスを調製するために、核酸分子が採用されてよい。こうして、本発明はまた、単離されたポリペプチド、組み換えウィルス、及び本発明の核酸分子又は組み換えウィルスと接触させられた宿主細胞を提供する。

0019

本発明はまた単離及び/又は精製された複数の下記ベクター:転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスPAcDNAに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスPB1 cDNAに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスPB2 cDNAに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスHAcDNAに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスNP cDNAに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスNA cDNAに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスM cDNAに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、及び転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスNS cDNAに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクターを提供し、少なくとも1つのベクターが、SEQID No:1〜6又は8のうちの1つによってコードされた対応ポリペプチドと実質的に同じ活性を有する、PB1、PB2、PA、NP、M、NS、及び任意にはNA、又はこれらの一部をコードする配列に対応する配列、例えば、SEQ ID No:1〜6、8又は33〜38のうちの1つによってコードされたポリペプチドに対して少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドをコードする配列を含んでなる。任意には、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスM cDNAに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクターの代わりに、2種のベクター、例えば転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスM1 cDNAに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、及び転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスM2 cDNAに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクターが採用されてよい。

0020

本発明は、インフルエンザ・ウィルス・タンパク質を発現させるか又はコードする、或いは、インフルエンザvRNA、天然及び組み換え双方のvRNAを発現させるか又はコードする、単離及び精製されたベクター又はプラスミドの使用を含む。好ましくは、ベクターは、インフルエンザcDNA、例えばインフルエンザA型(例えば15種のHAサブタイプ又は9種のNAサブタイプのいずれかを含む任意のインフルエンザA遺伝子)、B又はC型DNA(FieldsVirologyの第45及び46章参照、Fileds他編, Lippincott-Raven Publ., Philadelphia, PA (1996)、これを参考のため具体的に本明細書中に引用する)を含んでなるが、任意の生物の遺伝子を本発明のベクター又は方法において採用することも考えられる。cDNAは、プロモータに対してセンス配向又はアンチセンス配向を成してよい。こうして、本発明のベクターは、インフルエンザ・ウィルス・タンパク質(センス)又はvRNA(アンチセンス)をコードしてよい。タンパク質又はペプチド、例えばウィルス・タンパク質又はペプチド、非ウィルス病原体のタンパク質又はペプチド、又は治療用タンパク質又はペプチドを発現させるために、任意の好適なプロモーター又は転写終結配列が採用されてよい。

0021

本発明の組成物は、当該遺伝子又はオープンリーディングフレーム、例えばワクチンとして有用な免疫原性ペプチド又はタンパク質をコードする外来遺伝子を含んでもよい。こうして、本発明の別の実施態様は、ベクターのうちの1つの代わりに、転写終結配列に結合された3’インフルエンザ・ウィルス・コード配列又はこれらの一部を任意に含む3’インフルエンザ・ウィルス配列に結合された、所期核酸配列、例えば所期cDNAに結合された、5’インフルエンザ・ウィルス・コード配列又はこれらの一部を任意に含む5’インフルエンザ・ウィルス配列に結合されたプロモーターを含むベクターが使用されるか、又は組成物がさらにこのベクターを含むような上記本発明の組成物を含んでなる。好ましくは、所期核酸配列、例えばcDNAはアンチセンス配向を成している。インフルエンザ・ウィルス複製に対して許容状態の宿主細胞にこのような組成物を導入する結果、ベクターの配列に対応するvRNAを含んでなる組み換えウィルスが生じる。vRNA生成のためのこのようなベクター内のプロモーターは、RNAポリメラーゼIプロモーター、RNAポリメラーゼIIプロモーター、RNAポリメラーゼIIIプロモーター、T7プロモーター、及びT3プロモーターであってよく、そして任意にはベクターは、転写終結配列、例えばRNAポリメラーゼI転写終結配列、RNAポリメラーゼII転写終結配列、RNAポリメラーゼIII転写終結配列、又はリボザイムを含んでなる。1実施態様の場合、所期核酸配列を含むベクターは、当該cDNAを含んでなる。当該cDNAは、vRNA生成のためのベクター内にあろうとタンパク質生成のためのベクター内にあろうと、免疫原性エピトープ、例えば癌治療又はワクチンにおいて有用なエピトープ、又は癌治療において有用なペプチド又はポリペプチドをコードすることができる。ウィルスを調製するとき、当該遺伝子又はcDNAを含んでなるベクター又はプラスミドは、インフルエンザ・ウィルス遺伝子のためのベクター又はプラスミドの代わりとなってよく、或いは、全てのインフルエンザ・ウィルス遺伝子のためのベクター又はプラスミドに追加されてもよい。

0022

本発明の複数のベクターは、物理的に結合されてよく、或いは各ベクターは、個々のプラスミド又はその他の、例えば線状の核酸送達ビヒクル上に存在していてよい。

0023

vRNA又はウィルス・タンパク質発現ベクター内のプロモーター又は転写終結配列は、プロモーター又は任意の他のベクターに対して同じであるか又は異なっていてよい。好ましくは、インフルエンザvRNAを発現させるベクター又はプラスミドは、少なくとも1種の特定の宿主細胞、例えば鳥類又は哺乳類宿主細胞、例えば、又はヒト細胞を含む霊長類細胞における発現、又は好ましくは2種以上の宿主における発現に適したプロモーターを含んでなる。

0024

1実施態様の場合、vRNA生成のための1つ又は2つ以上のベクターは、例えばRNAポリメラーゼIプロモーター、例えばヒトRNAポリメラーゼIプロモーター、RNAポリメラーゼIIプロモーター、RNAポリメラーゼIIIプロモーター、T7プロモーター、又はT3プロモーターを含むプロモーターを含んでなる。vRNAベクターのための好ましい転写終結配列の一例としては、RNAポリメラーゼI転写終結配列、RNAポリメラーゼII転写終結配列、RNAポリメラーゼIII転写終結配列、又はリボザイムが挙げられる。本発明の範囲内に含まれるリボザイムの一例としては、テトラヒメナ・リボザイム、RNaseP、ハンマーヘッド型リボザイム、ヘアピン型リボザイム、肝炎リボザイム、並びに合成リボザイムが挙げられる。

0025

1実施態様の場合、vRNAのための少なくとも1つのベクターは、任意にはRNAポリメラーゼII転写終結配列に結合された別のリボザイム配列に結合されたウィルス・コード配列に結合されたリボザイム配列に結合されたRNAポリメラーゼIIプロモーターを含んでなる。1実施態様の場合、vRNA生成のための少なくとも2つの、好ましくは3つ以上、例えば3、4、5、6、7又は8つのベクターは、転写終結配列に対して5’方向の第2リボザイム配列、第2リボザイム配列に対して5’方向のウィルス・コード配列を含むウィルス配列に対応する配列、ウィルス配列に対応する配列に対して5’方向の第1リボザイム配列、RNAポリメラーゼIIプロモーターを含んでなる。各vRNAベクター内の各RNAポリメラーゼIIプロモーターは、任意の他のvRNAベクターにおけるRNAポリメラーゼIIプロモーターと同じ又はこれとは異なっていてよい。同様に、各vRNAベクター内の各リボザイム配列も、任意の他のvRNAベクターにおけるリボザイム配列と同じ又はこれとは異なっていてよい。1実施態様の場合、単一のベクター内のリボザイム配列は同じではない。

0026

本発明はまた、インフルエンザ・ウィルスを調製する方法を提供する。この方法は、例えば感染性インフルエンザ・ウィルスを産出するのに効果的な量の本発明の組成物を採用して、細胞を本発明の複数のベクターと、例えば逐次的に又は同時に接触させることを含んでなる。本発明はまた、組成物と接触させた細胞からウィルスを単離することを含む。このように、本発明はさらに、単離されたウィルス、並びに、本発明の組成物又はウィルスと接触させられた宿主細胞を提供する。別の実施態様の場合、本発明は、細胞を1種又は2種以上のベクター、vRNA又はタンパク質生成ベクターと、他のベクター、vRNA又はタンパク質生成ベクターの前に接触させることを含む。

0027

ヘルパーウィルス感染を必要としない本明細書に記載されたウィルスを製造する方法は、ウィルス突然変異誘発研究、及びワクチンの製造(例えばAIDS、インフルエンザ、B型肝炎C型肝炎ライノウィルスフィロウィルス、マラリアヘルペス、及び口蹄疫用)、及び遺伝子治療ベクター(例えば癌、AIDS、アデノシンデアミナーゼ筋ジストロフィーオルニチントランスカルバミラー欠損症、及び中枢神経系腫瘍用)において有用である。こうして、医学的治療(例えばワクチン又は遺伝子治療)において使用するためのウィルスが提供される。

0028

本発明はまた、病原体、例えばバクテリア、ウィルス、又は寄生生物、又は悪性腫瘍に対して個体を免疫化する方法を提供する。この方法は、個体を免疫化するのに効果的な量の少なくとも1種の本発明の単離ウィルスを、任意にはアジュバントと組み合わせて個体に投与することを含んでなる。ウィルスは、病原体又は腫瘍特異的ポリペプチドによってコードされるポリペプチドを含むvRNAを含んでなる。

0029

また、内在性タンパク質の量の減少又は欠如によって特徴付けられる兆候又は疾患を有する哺乳動物において、内在性タンパク質の発現を増加又は増大させる方法も提供される。この方法は、哺乳動物における内在性タンパク質量を増加又は増大させるのに効果的な量の本発明の単離ウィルスを哺乳動物に投与することを含んでなる。好ましくは、哺乳動物はヒトである。

図面の簡単な説明

0030

図1は、種々のインフルエンザ・ウィルスの力価を示す図である。
図2は、逆遺伝技術によってH5N1/PR8再構築体ウィルスを生成するために使用されるN1 NAを示す概略図である。VN1203fillは、H5N1前駆体株GsGd96のN1から誘導された20アミノ酸(aa)挿入部を含有する。VN1203fill.N2は、GsGd96 NAからの20aaに加えて、N2 NAからの14−aa挿入部を含有し、その結果、VN1203 NAのストーク内には34−aa挿入部が生じる。VN1202fill.N2N9は、GsGd96 NAからの20aa、及びN2 NAからの14aaに加えて、N9 NAからの14−aa挿入部を含有し、その結果、VN1203のストーク内には48−aa挿入部が生じる。各NAの予想ストーク領域長は、各分子の下に与えられている。
図3は、孵化鶏卵内のH5N1/PR8再構築体ウィルスの成長を示す図である。無毒形VN1203HA、及び異種NA(VN1203)又は異種NA(VN1203fill、VN1203fill.N2、HK213、又はPR8)をPR8バックグラウンドと共に含有する再構築体ウィルスの力価を、MDCK細胞を用いたプラーク滴定によって比較した。野生型(適応)PR8の力価も比較のために含まれる。データは、各ウィルスを接種された3つの卵に対する平均力価及び標準偏差として報告する。
図4は、孵化鶏卵内のH5N1再構築体ウィルスの成長動態を示す。我々は、PR8 NA(PR8)、VN1203 NA(VN1203)、又はVN1203fill NA(VN1203fill)を含有する同量(104EID50)のウィルスを卵に接種した。各ウィルスを接種された3つの卵に対する平均HA力価及び標準偏差を、指示時点で測定した。
図5は、鶏赤血球からのウィルス溶離を示す図である。異なるストーク長を有するVN1203 NA、又はPR8 NAを含有する各ウィルス(HA力価1:1024)の二倍希釈体を、1時間にわたって4℃のマイクロタイタープレート内で鶏赤血球と共にインキュベートした。次いでプレートを37℃で貯蔵し、HA力価の低減を8時間にわたって記録した。
図6は、孵化鶏卵内のH5N1/PR8再構築体ウィルスの成長の比較を示す図である。WHO推奨のNIBRG−14株(VN1194/PR8 6:2再構築体ウィルス)を含む6:2及び7:1再構築体ウィルスのウィルス力価を、MDCK細胞によるプラーク滴定によって比較した。各ウィルスを接種された3つの卵の平均力価及び標準偏差を示す。このように、H5N1のNAだけをPR8のNAと置き換えることにより、卵内の力価を改善することができる。
図7は、孵化鶏卵におけるPR8(UW)又はPR8(Cambridge)内部遺伝子を有する再構築体H5N1ウィルスの成長を示す図である。アスタリスクは、PR8(UW)/1194と比較した感染価の有意な(p<0.05、スチューデントt検定)低減を示す図である。
図8は、孵化鶏卵におけるウィルスの成長に対するM及びNS遺伝子の効果を示す。アスタリスクは、PR8(UW)/1194と比較した感染価の有意な(p<0.05、スチューデントのt検定)増大を示す図である。
図9は、MDCK細胞における、PR8(UW)/1194及びNIBRG−14ウィルスの成長を示す図である。
図10は、MDCK細胞内でNIBRG−14と比較してPR8(UW)/1194の成長が高められることに関与する遺伝子セグメントの同定を示す図である。
図11は、MDCK細胞内のワクチン種ウィルスの高い成長速度に関与するPB2内のアミノ酸の同定を示す図である。
図12は、異なるHA、NA、及びNS遺伝子を有する再構築体のMDCK細胞における成長速度を示す図である。アスタリスクは、PR8(UW)/1194と比較して著しく良好なウィルス成長を示す。二重のアスタリスクは、PR8(UW)NSを発現させるウィルスと比較して著しく良好なウィルス成長を示す。
図13は、異種NSセグメントを含有するH5N1ワクチン種ウィルスのMDCK細胞における成長を示す図である。
図14は、孵化鶏卵又はMDCK細胞内に高成長能力を有するH5N1ワクチン種ウィルスの遺伝子タイプを示す概略図である。
PR8(Cambridge)遺伝子(SEQID No:28〜33)に対応するヌクレオチド配列である。
PR8(Cambridge)遺伝子(SEQ ID No:28〜33)に対応するヌクレオチド配列である。
PR8(Cambridge)遺伝子(SEQ ID No:28〜33)に対応するヌクレオチド配列である。

0031

発明の詳細な説明
定義
本明細書中に使用される「単離及び/又は精製された」という用語は、本発明のベクター、プラスミド、又はウィルスのin vitroの調製、単離、及び/又は精製を意味し、この場合これはin vivo物質とは関連せず、実質的にin vitro物質から調製が行われる。単離ウィルスの調製は、一般にin vitroの培養及び増殖によって、及び/又は卵内の継代を介して達成され、そして他の感染性物質は実質的に存在しない。
本明細書中に使用される「実質的に存在しない」は、特定の感染性物質に対する標準的な検出方法を用いたときに、その物質の検出レベルを下回ることを意味する。

0032

「組み換え」ウィルスは、ウィルス・ゲノムに変化を導入するために、例えば組み換えDNA技術を用いて、in vitroで操作されたウィルスである。組み換え又は非組み換え技術によって再構築体ウィルスを調製することができる。

0033

本明細書中に使用される「組み換え核酸」又は「組み換えDNA配列又はセグメント」という用語は、源から誘導又は単離され、続いてin vitroで化学的に変更されてよい核酸、例えばDNAを意味し、この場合、その配列は天然には発生せず、又は、天然ゲノム内で配置されるであろうようには配置されない天然発生配列に相当する。源から「誘導」されたDNAの例は、有用な断片として同定され、次いで本質的に純粋な形で化学的に合成されたDNA配列である。源から「単離」されたこのようなDNAの例は、化学手段によって、例えば制限エンドヌクレアーゼの使用によって、前記源から切除又は除去された有用なDNA配列であり、この場合、DNAは遺伝子工学の方法によって、本発明における使用のために、さらに操作、例えば増幅することができる。

0034

本明細書中に使用される「異種」インフルエンザ・ウィルス遺伝子又は遺伝子セグメントは、再構築体インフルエンザ・ウィルス内の他のインフルエンザ・ウィルス遺伝子又は遺伝子セグメントの大部分とは異なるインフルエンザ・ウィルス源に由来する。

0035

インフルエンザ・ウィルス複製
インフルエンザA型ウィルスは、全部で10種のタンパク質をコードする8つの単鎖マイナス−センス・ウィルスRNA(vRNA)のゲノムを有する。インフルエンザ・ウィルス寿命サイクルは、宿主細胞の表面上のシアル酸含有受容体に対する血球凝集素(HA)の結合で始まり、これに、受容体媒介エンドサイトーシスが続く。後期エンドソームにおける低pHが、HA内のコンフォメーションシフトを引き起こし、これにより、HA2サブユニット(いわゆる融合ペプチド)のN末端露出させる。融合ペプチドは、ウィルス膜エンドソーム膜との融合を開始し、そしてマトリックス・タンパク質(M1)及びRNPの複合体が細胞質内に放出される。RNPは、vRNAをカプシド包む核タンパク質(NP)と、PA、PB1、及びPB2タンパク質によって形成されたウィルス・ポリメラーゼ複合体とから成る。RNPは核内に輸送され、この場所で転写及び複写が行われる。RNAポリメラーゼ複合体は、3つの異なる反応、すなわち:5’キャップ及び3’ポリA構造を有するmRNAの合成、完全長相補RNA(cRNA)の合成、及びcDNAを鋳型として使用したゲノムvRNAの合成を触媒する。次いで、新たに合成されたvRNA、NP、及びポリメラーゼ・タンパク質が集成されてRNPになり、核から搬出され、そして原形質膜に輸送され、この場所で子孫ウィルス粒子の発が発生する。ノイラミニダーゼ(NA)タンパク質は、シアリルオリゴ糖からシアル酸を除去し、ひいては新たに集成されたビリオンを細胞表面から放出し、そしてウィルス粒子の自己会合を防止することにより、感染後期に重要な役割を演じる。ウィルス集成体はタンパク質−タンパク質、及びタンパク質−vRNAの相互作用に関与するが、これらの相互作用の性質はほとんど知られていない。

0036

インフルエンザB型及びC型ウィルスは構造上及び機能上、インフルエンザA型ウィルスに類似しているが、いくつかの相違点がある。例えばインフルエンザB型ウィルスはM2タンパク質を有さない。同様にインフルエンザC型ウィルスもM2タンパク質を有さない。

0037

本発明において使用することができる細胞系及びインフルエンザ・ウィルス
本発明によれば、インフルエンザ・ウィルスのための受容体である、低減又は減少したレベルの1種又は2種以上のシアル酸を発現させる突然変異細胞を含む、インフルエンザ・ウィルスの効率的な複製を支援する任意の細胞を採用することができる。本発明により得られたウィルスを再構築体ウィルスに形成することができる。

0038

好ましくは、細胞は、WHOによって認定された、又は認定可能な連続した細胞系である。このような細胞系を認定する要件は、系統成長特性免疫学的マーカー、ウィルス感受性腫瘍原性、及び貯蔵条件のうちの少なくとも1つに関する特徴付け、並びに、動物、卵、及び細胞培養における試験による特徴付けを含む。このような特徴付けは、これらの細胞に、検出可能な偶発性物質が存在しないことを確認するために使用される。いくつかの国では核学が必要とされることもある。加えて、ワクチン生成のために使用されるのと同じ継代レベルにある細胞中で、腫瘍原性が好ましくは試験される。ウィルスは好ましくは、ワクチン生成のために不活性又は弱毒化されるまえに、一貫した結果をもたらすことが判っているプロセスによって精製される(例えばWorld Health Organization、1982参照)。

0039

最終生成物純度のための適切な試験を含むことができるように、使用されるべき細胞系の完全な特徴付けを確立することが好ましい。本発明において使用されるべき細胞を特徴付けするために用いることができるデータは、(a)その起源派生、及び継代履歴に関する情報;(b)その成長及び形態学的特徴に関する情報;(c)偶発性物質の試験結果;(d)際立った特徴、例えば細胞が他の細胞系の中から明らかに認識されるのを可能にする生化学的、免疫学的、及び細胞遺伝学的パターン;及び(e)腫瘍原性の試験結果を含む。使用される宿主細胞の継代レベル、又は集団倍加時間は、可能な限り低いことが好ましい。

0040

細胞内で生成されるウィルスが、ワクチン又は遺伝治療製剤の前に高精製される。一般に、精製処置は、細胞DNA、他の細胞成分、及び偶発性物質の広範囲の除去をもたらすことになる。DNAを広範囲に分解又は変性させる処置を利用することもできる。例えばMizrahi、1990参照。

0041

ワクチン
本発明のワクチンは、任意の病原体の糖タンパク質を含む免疫原性タンパク質、例えば1種又は2種以上のバクテリア、ウィルス、酵母、又は真菌に由来する免疫原性タンパク質を含んでよい。このように、1実施態様の場合、本発明のインフルエンザ・ウィルスは、インフルエンザ・ウィルス、又は一例としてはレンチウィルス、例えばHIV、B型肝炎、C型肝炎ウィルス、ヘルペス・ウィルス、例えばCMV又はHSV又は口蹄疫ウィルスを含むその他のウィルス病原体のためのワクチン・ベクターであってよい。

0042

完全なビリオン・ワクチンは、限外濾過によって濃縮され、次いで、ゾーン遠心分離によって、又はクロマトグラフィによって精製される。これは例えばホルマリン又はベータ−プロピオラクトンを使用して精製の前又は後で不活性化される。

0043

サブユニット・ワクチンは、精製糖タンパク質を含んでなる。このようなワクチンは下記のように調製されてよい:洗剤で処理することにより断片化されたウィルス懸濁液を使用して、例えば超遠心分離によって表面抗原を精製する。サブユニット・ワクチンはこうして、主にHAタンパク質、そしてNAをも含有する。使用される洗剤は例えばカチオン性洗剤、例えば臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム(Bachmeyer、1975)、アニオン性洗剤、例えばデオキシコール酸アンモニウム(Laver & Webster、1976);又は非イオン性洗剤、例えばTRITON X100という名称で商業化されている洗剤であってよい。血球凝集素は、プロテアーゼ、例えばブロメリンでビリオンを処理した後で単離され、次いでGrand及びSkehel(1972)によって記載されているような方法によって精製されてもよい。

0044

スプリット・ワクチンは、脂質を溶解する物質による処理を施されたビリオンを含んでなる。スプリット・ワクチンは下記のように調製することができる:上記のように得られ、不活性化された又はされていない精製ウィルスの水性懸濁液を、洗剤と関連する脂質溶媒、例えばエチルエーテル又はクロロホルムによって、攪拌しながら処理する。ウィルス・エンベロープ脂質の溶解の結果、ウィルス粒子が断片化される。主に、最初の脂質環境が除去された血球凝集素及びノイラミニダーゼ、及びコア又はその分解生成物から成るスプリット・ワクチンを含有する水性相回収される。次いで、残留感染性粒子が、不活性化がすでに行われていない場合には不活性化される。

0045

不活性化ワクチン。本発明の不活性化インフルエンザ・ウィルス・ワクチンは、周知の方法、例えばホルマリン又はβ−プロピオラクトン処理を用いて、本発明の複製ウィルスを不活性化することにより提供される。本発明において使用することができる不活性化ワクチン・タイプは、全ウィルス(WV)ワクチン又はサブビリオン(SV)(スプリット)ワクチンを含むことができる。WVワクチンはインタクトの不活性化ウィルスを含有するのに対して、SVワクチンは、脂質含有ウィルス・エンベロープを可溶化する洗剤で分裂され、続いて残存ウィルスの化学的不活性化を施された精製ウィルスを含有する。

0046

加えて、使用することができるワクチンは、単離されたHA及びNA表面タンパク質を含有するワクチンを含む。これらのタンパク質は表面抗原又はサブユニット・ワクチンと呼ばれる。一般に、SV及び表面抗原(すなわち精製HA又はNA)ワクチンに対する応答は同様である。流行性ウィルスに免疫学的に関連するNA抗原及び無関係のHAを含有する実験的な不活性WVワクチンは、コンベンショナルなワクチンよりも効果が低いように思われる(Ogra他、1977)。両方の関連表面抗原を含有する不活性ワクチンが好ましい。

0047

生の弱毒化ウィルス・ワクチン。周知の方法ステップに従って、インフルエンザ・ウィルス感染を予防又は治療するために、生の弱毒化ウィルス・ワクチンを使用することもできる。弱毒化は好ましくは、弱毒化遺伝子を弱毒化供与体ウィルスから、複製された単離体又は再構築ウィルスへ、周知の方法に従って移す(例えばMurphy, 1993)ことにより単一のステップで達成される。インフルエンザA型ウィルスに対する耐性がHA及びNA糖タンパク質に対する免疫応答の発生により媒介されるので、これらの表面抗原をコードする遺伝子は、再構築ウィルス又は高成長臨床単離体に由来しなければならない。弱毒化遺伝子は、弱毒化された親から誘導される。このアプローチにおいて、弱毒化をもたらす遺伝子は好ましくは、HA及びNA糖タンパク質をコードしない。さもなければ、これらの遺伝子は、臨床ウィルス単離体の表面抗原を含有する再構築体に移すことができないおそれがある。

0048

多くの供与体ウィルスが、インフルエンザ・ウィルスを再生可能に弱毒化する能力に関して評価されている。一例としては、弱毒化ワクチン生成のために、A/Ann Arbor(AA)/6/60(H2N2)低温適応型(ca)供与体ウィルスを使用することができる(例えばEdwards, 1994;Murphy, 1993)。加えて、生の弱毒化再構築体ウィルス・ワクチンは、ca供与体ウィルスと、本発明の毒性複製ウィルスとを接合することにより発生させることができる。再構築体子孫を次いで、弱毒化A/AA/6/60(H2N2)ca供与体ウィルスの表面抗原を含有するウィルスの複製を阻害するH2N2抗血清の存在において、25℃(悪性ウィルスの複製にとって制限的)で選択される。

0049

数多くの一連のH1N1及びH3N2再構築体は、ヒトにおいて評価されており、また申し分なく:(a)感染性であり、(b)血清反応陰性小児及び免疫学的にプライミングされた成人に対して弱毒化されており、(c)免疫原性であり、そして(d)遺伝子的に安定であることが判っている。ca再構築体の免疫原性はこれらの複製レベルと平行する。こうして、ca供与体ウィルスの6つの移動可能な遺伝子を新しい野生型ウィルスによって捕捉することにより、感染しやすい成人及び小児にワクチン接種する際に使用するためのこれらのウィルスを再現可能に弱毒化している。

0050

他の弱毒突然変異部位特異的突然変異誘発によってインフルエンザ・ウィルス遺伝子内に導入することにより、これらの突然変異遺伝子を含有する感染性ウィルスを救出することができる。弱毒突然変異は、ゲノムの非コード領域内に、並びにコード領域内に導入することができる。このような弱毒突然変異は、HA又はNA以外の遺伝子、例えばPB2ポリメラーゼ遺伝子内に導入することもできる(Subbarao他、1993)。このように、部位特異的突然変異誘発によって導入された弱毒突然変異を含有する新しい供与体ウィルスを生成することもでき、またこのような新しい供与体ウィルスは、A/AA/6/60ca供与体ウィルスに関して上述したものと同様に、生の弱毒化再構築体H1N1及びH3N2ワクチン候補を低減するのに使用することができる。同様に、哺乳動物のワクチン接種時に使用するのに適した弱毒化ワクチンを得るために、他の周知のそして好適な弱毒化供与体株を本発明のインフルエンザ・ウィルスと共に再構築することもできる(Enami他、1990;Muster他、1991;Subbarao他、1993)。

0051

このような弱毒化ウィルスは、元の臨床単離体と実質的に同様の抗原決定因子をコードするウィルスから遺伝子を維持することが好ましい。その理由は、弱毒化ウィルスの目的が、ウィルスの元の臨床単離体と実質的に同じ抗原性を提供すると同時に、ワクチンがワクチン接種された哺乳動物において深刻な病原性状態を誘発するという変化を最小限にしかもたらさない程度まで感染性を欠くことであるからである。

0052

ウィルスはこのように、動物、例えば哺乳動物において免疫応答を誘発するためのワクチンとして、周知の方法に従って、弱毒化又は不活性化し、製剤し、そして投与することができる。このような弱毒化又は不活性化ワクチンが、臨床単離体又はそれから誘導された高成長株と同様の抗原性を維持しているかどうかを見極める方法が当業者によく知られている。このような周知の方法は、供与体ウィルスの抗原決定因子を発現させるウィルスを排除するための抗血清又は抗体の使用;化学的選択(例えばアマンタジン又はリマンジン);HA及びNA活性及び阻害;及び、抗原決定因子をコードする供与体遺伝子(HA又はNA遺伝子)が弱毒化ウィルス内に存在しないことを確認するためのDNAスクリーニング(例えばプローブハイブリダイゼーション又はPCR)を含む。例えばRobertsn他、1988;Kilbourne、1969;Aymard-Henry他、1985;Robertson他、1992を参照されたい。

0053

医薬組成物
接種に適した、又は非経口又は経口投与に適した本発明の医薬組成物は、弱毒化又は不活性化されたインフルエンザ・ウィルスを含んでなり、任意にはさらに、滅菌水性又は非水性溶液、懸濁液、及びエマルジョンを含んでなる。組成物はさらに、当業者によく知られた助剤又は賦形剤を含んでなる。例えばBerkow他、1987;Avery's Drug Treatment, 1987; Osol、1980;Katzung、1992を参照されたい。本発明の組成物は、一般に、個々の投与量(単位投与量)の形態で提供される。

0054

コンベンショナルなワクチンは一般に、これらの組成物中に進入する株のそれぞれから約0.1〜200μg、好ましくは10〜15μgの血球凝集素を含有する。本発明のワクチン組成物の主成分を形成するワクチンは、A、B又はC型ウィルス、又はこれらの組み合わせ、例えば3つのタイプのうちの少なくとも2種、異なるサブタイプのうちの少なくとも2種、同じタイプのうちの少なくとも2種、同じサブタイプのうちの少なくとも2種、又は異なる単離体又は再構築体を含んでなる。ヒト・インフルエンザ・ウィルスA型は、H1N1、H2N2、及びH3N2サブタイプを含む。

0055

非経口投与のための製剤は、滅菌水性又は非水性溶液、懸濁液、及び/又はエマルジョンを含み、これらは、当業者に知られた助剤又は賦形剤を含有してよい。非水性溶剤の例は、プロピレングリコールポリエチレングリコール植物油、例えばオリーブ油、及び注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルである。皮膚浸透性を高め、そして抗原吸収率を高めるために、キャリヤ又は密封包帯を使用することができる。経口投与のための液状投与形態は、一般に液状投与形態を含有するリポソーム溶液を含んでいてよい。リポソームを懸濁させるのに適した形態は、当業者に広く知られた不活性希釈剤、例えば精製水を含有するエマルジョン、懸濁液、溶液シロップ、及びエリキシルを含む。不活性希釈剤の他に、このような組成物はアジュバント、湿潤剤乳化懸濁剤、又は甘味剤矯味剤、又は芳香剤を含むこともできる。例えばBerkow他、1992;Avery、1987; Osol、1980;Katzung、1992を参照されたい。

0056

本発明の組成物が個体への投与のために使用されるときには、この組成物はさらに、塩、緩衝剤、アジュバント、又は組成物の効力を改善するために望ましい他の物質を含むこともできる。ワクチンの場合には、アジュバント、つまり特異的な免疫応答を増強することができる物質を使用することができる。通常、アジュバントと組成物とは、免疫系への提供前に混合されるか、又は別々に、しかし免疫化される生物の同じ部位内に提供される。ワクチン組成物中の使用に適した材料の例は、Osol (1980)において提供されている。

0057

ワクチンにおける異質性は、少なくとも2種のインフルエンザ・ウィルス株、例えば2〜50株又はこの中の任意の範囲又は値に対応する複製インフルエンザ・ウィルスを混合することによって提供されてよい。最新抗原組成物を有するインフルエンザA型又はB型ウィルス株が好ましい。本発明によれば、当業者に知られた技術を用いて、インフルエンザ・ウィルスの単一株を変化させるようにワクチンを提供することができる。

0058

本発明による医薬組成物はさらに又は付加的に、少なくとも1種の化学療法化合物、例えば、遺伝子治療の場合には免疫抑制剤抗炎症剤、又は免疫促進剤、そしてワクチンの場合には、例えばガンマグロブリン、アマンタジン、グアニジン、ヒドロキシベンズイミダゾールインターフェロンαインターフェロンβインターフェロンγ腫瘍壊死因子アルファチオセミカルバルゾン、メチサゾンリファンピンリバビリンピリミジン類似体プリン類似体、フォスカルネットホスホノ酢酸アシクロビルジデオキシヌクレオシドプロテアーゼ阻害剤、又はガンシクロビルを含む化学療法薬を含んでよい。例えばKatzung (1992)、及びそれぞれその第798〜800頁及び第680〜681頁に引用された文献を参照されたい。

0059

組成物は可変の、しかし少量の内毒素非含有ホルムアルデヒド、及び組成物が投与される生物において安全であり、また望ましくない効果に関与しないことが判っている保存剤を含有することもできる。

0060

医薬上の目的
組成物(又は組成物が誘発する抗血清)は、「予防」又は「治療」目的で投与されてよい。予防的に提供されるときには、ワクチンである本発明の組成物は、病原体感染の症状が明らかになる前に提供される。組成物の予防的投与は、後続の感染を防止又は軽減するのに役立つ。予防的に提供されるときには、本発明の遺伝子治療組成物は、疾患の症状が明らかになる前に提供される。組成物の予防的投与は、疾患と関連する1つ又は2つ以上の症状を防止又は軽減するのに役立つ。

0061

治療的に抵抗されるときには、弱毒化又は不活性化されたウィルス・ワクチンは、実際の感染の症状を検出したときに提供される。化合物治療的投与は、実際の感染を軽減するのに役立つ。例えばBerkow他、1992;Avery、1987;及びKatzung、1992を参照されたい。治療的に抵抗されるときには、遺伝子治療組成物は、疾患の症状又は兆候を検出したときに提供される。化合物の治療的投与は、その疾患の症状又は兆候を軽減するのに役立つ。

0062

従って、本発明の弱毒化又は不活性化されたワクチン組成物はこうして、(予想される感染を防止又は軽減するように)感染の開始前に、又は実際の感染の開始後に提供されてよい。同様に、遺伝子治療の場合にも、組成物が、症状又は疾患の症状が明らかになる前、又は1つ又は2つ以上の症状が検出された後に提供されてよい。

0063

組成物の投与を受容患者が耐容し得る場合、その組成物は「薬理学的に許容し得る」と言われる。このような薬剤は、その投与量が生理学的に有意である場合に、「治療上効果的な量」で投与されると言われる。本発明の組成物は、その存在が受容患者の生理学的特性の検出可能な変化をもたらす、例えば感染性インフルエンザ・ウィルスの少なくとも1種の株に対する少なくとも1つの一次的又は二次的な液性又は細胞性免疫応答を向上させる場合、生理学的に有意である。

0064

対照個体群又は患者群と比較して統計的に有意な改善があるならば、提供される「防御」は絶対的なものである必要はなく、すなわち、インフルエンザ感染は全体的に予防又は根絶される必要はない。防御は、インフルエンザ・ウィルス感染の症状の開始の重症度又は速さを軽減することに制限されてよい。

0065

医薬投与
本発明の組成物は、受動免疫法又は能動免疫法によって、1種又は2種以上の病原体、例えば1種又は2種以上のインフルエンザ・ウィルス株に対する耐性を与えることができる。能動免疫法の場合、不活性化又は弱毒化された生ワクチン組成物が宿主(例えば哺乳動物)に予防的に投与され、そしてこの投与に対する宿主の免疫応答が、感染及び/又は疾患に対する防御を行う。受動免疫法の場合、誘発された抗血清を回収し、そして少なくとも1種のインフルエンザ・ウィルス株によって引き起こされる感染を有することが疑われる受容者にこれを投与することができる。本発明の遺伝子治療は、能動免疫法によって予防的又は治療的レベルの所期遺伝子生成物を産出することができる。

0066

1実施態様の場合、ワクチンは哺乳動物の女性妊娠又は出産時又は前)に、女性及び胎児又は新生児の双方を守るのに役立つ免疫応答の生成を引き起こすのに十分な時間及び量の条件下で提供される(胎盤を介した又は母乳中の抗体の受動的取り込みを介して)。

0067

本発明はこのように、障害又は疾患、例えば少なくとも1種の病原体株による感染を防止又は軽減する方法を含む。本明細書中に使用されるワクチンは、その投与の結果、疾患の症状又は状態の全体的又は部分的な軽減(すなわち抑制)、又は疾患に対する個体の全体的又は部分的な免疫が生じる場合、疾患を防止又は軽減すると言われる。遺伝子治療組成物は、その投与の結果、疾患の症状又は状態の全体的又は部分的な軽減(すなわち抑制)、又は疾患に対する個体の全体的又は部分的な免疫が生じる場合、疾患を防止又は軽減すると言われる。

0068

本発明の少なくとも1種の活性化又は弱毒化されたインフルエンザ・ウィルス、又はその組成物は、前記医薬組成物を使用して、所期の目的を達成する任意の手段によって投与されてよい。

0069

例えば、このような組成物は、種々の非経口経路、例えば皮下、静脈内、皮内、筋内、腹腔内、鼻腔内、経口又は経皮経路によって投与されてよい。非経口投与は、ボーラス注入によって、又は所定の時間にわたる漸次灌流によって行うことができる。本発明の医薬組成物の好ましい使用様式は、筋内又は皮下適用によるものである。例えばBerkow他、1992;Avery、1987;及びKatzung、1992を参照されたい。

0070

インフルエンザ・ウィルス関連病理を防止、抑制、又は治療するための典型的な投与計画は、単回治療として投与されるか、又は1週間〜約24か月まで(この値を含む)、又はこの中の任意の範囲又は値の期間にわたって促進投与又はブースター投与として繰り返される、本明細書中に記載された効果的な量のワクチン組成物の投与を含んでなる。

0071

本発明によれば、組成物の「効果的な量」は、所期の生物学的効果を達成するのに十分な量である。効果的な投与量が、受容者の年齢性別健康状態、及び体重、もしあるならば並行治療の種類、治療の頻度、及び望まれる効果の性質に依存することは明らかである。下に示す効果的な投与量の範囲は、本発明を限定しようとするものではなく、好ましい投与量範囲を表す。しかしながら、最も好ましい投与量は、当業者によって理解され見極めることができるように、その個体に合わせて調整されることになる。例えばBerkow他、1992;Avery、1987;及びKatzung、1992を参照されたい。

0072

哺乳動物(例えばヒト)又は鳥類の成体生物のための弱毒化ウィルスの投与量は、約103〜107プラーク形成単位(PFU)/kg、又はその中の任意の範囲又は値であることが可能である。不活性化ワクチンの投与量は約0.1〜200、例えば50μgの血球凝集素タンパク質であることが可能である。しかしながら、投与量は、既存のワクチンを出発点として、コンベンショナルな方法によって見極められた安全且つ効果的な量であるべきである。

0073

複製ウィルス・ワクチンの各投与量における免疫反応性HAの投与量は、好適な量、例えば1〜50μg又はその中の任意の範囲又は値、又は通常、3の年長児に対しては1成分当たり15μg、そして3歳未満の年長児に対しては1成分当たり7.5μgという米国公衆衛生局(PHS)によって推奨された量を含有するように標準化することができる。NAの量は標準化することもできるが、しかしこの糖タンパク質は、処理装置による精製及び貯蔵中に不安定であるおそれがある(Kendal他、1980)。各0.5mlのワクチン投与量は好ましくは、ほぼ10億〜500億個のウィルス粒子、好ましくは100億個の粒子を含有する。
下記非限定的な例によって本発明をさらに説明する。

0074

例1
インフルエンザA/Puerto Rico/8/34の逆遺伝技術系を開発するために、製造業者プロトコルに従ってRNeasy Miniキット(Qiagen)を使用して、ウィルスRNAをA/Puerto Rico/8/34(H1N1)、Madison高成長変異形(PR8HG)の尿膜腔液から抽出した。MMLV-RTase(Promega)及びUni12プライマーを使用して、cDNAを合成した。下記のものを用いたPCRによってcDNAを一晩増幅した:
プライマー・セット

0075

0076

0077

0078

DNAポリメラーゼ:pfu Native DNAポリメラーゼ(Stratagene)
PCR生成物ゲル電気泳動によって分離し、そしてゲル抽出キット(Qiagen)を使用してアガロース・ゲルから抽出した。Takaraライゲーション・キットver.II(Takara)を使用して、抽出された遺伝子をpT7Blue平滑ベクター(Novagen)内にライゲートした。5時間後、ライゲートされた遺伝子がJM109(PB2、M、及びNS遺伝子)又はDH5アルファ(PA、PB1、及びNP)に形質転換された。各遺伝子毎に6つのコロニーを8時間にわたってTB中で培養した。バクテリア培地からプラスミドを抽出し、そして1遺伝子当たり4つのクローン配列決定した。

0079

pT7Blue内のPA、NP、M、及びNS遺伝子をBsm BI酵素(New England Biolabs)によって切除した。PB1遺伝子をBsa I(New England Biolabs)によって切除した。切除された遺伝子を、Bsm BIで消化されたヒトRNAポリメラーゼIプロモーター及びマウスRNAポリメラーゼIターミネーターを含有するpPolIRベクターと一晩ライゲートした。pT7Blue内のPB2遺伝子の前側断片を、BsrGI(New England Biolabs)及びBam HI(Roche)によって切除し、そして後側断片をBsr GI(New England Biolabs)及びSpe I(Roche)によって切除した。切除された断片を混合し、そしてBsa Iによって消化させた。6時間後、消化された遺伝子を、PCR精製キット(Qiagen)を使用して精製し、そしてpPolIRベクターのBsm BI部位間で一晩にわたってライゲートした。

0080

JM 109(M及びNS遺伝子)又はDHアルファ(PB1、PA、及びNP遺伝子)を一晩にわたって形質転換するために、ライゲートされたPB1、PA、NP、M、及びNS−pPolIR遺伝子を使用した。形質転換されたバクテリアのコロニーをLB中で一晩培養した。JM 109を一晩形質転換するために、ライゲートされたPB2−pPolIR遺伝子を使用した。

0081

プラスミドをバクテリア培地から抽出し、そして遺伝子挿入を酵素消化によって確認した。PB2−pPolIRによって形質転換されたバクテリアのコロニーをLB中で8時間にわたって培養した。プラスミドを次いで抽出し、そして遺伝子挿入を酵素消化によって確認した。pPolI構造が望ましくない突然変異を含有しないことを保証するために、全てのpPolI構造を配列決定した。

0082

PR8HGに対応するpPolIR構造を、A/WSN/33(WSN)−HA及びNA、A/Hong Kong/483/97(HK)−HAavir及びNA、又はA/Kawasaki/01(Kawasaki)−HA及びNA PolI構造、及びポリメラーゼ・タンパク質のための4つのタンパク質発現構造、及びA/WSN/33のNPを有する293Tヒト胚腎臓細胞内にトランスフェクトした。トランスフェクトされた293T細胞から得られた上澄みを連続希釈し(無希釈から10-7)、そして9日齢の孵化鶏卵の尿膜腔内に感染させた。感染させた卵の尿膜腔液を収穫し、そしてこれらのウィルス力価をHAアッセイによって試験した(表1)。

0083

0084

HA陽性試料(10-2のWSN−HA NAを有するウィルス、及び無希釈のHK−HAavir NAを有するウィルス)を、10-2から10-8まで連続希釈し、100μlの各希釈液を孵化鶏卵内に感染させた。感染させた卵の尿膜腔液を収穫し、そしてこれらのウィルス力価をHAアッセイによって試験した(表2)。プラスミドから調製されたA/Puerto Rico/8/34(H1N1)の50%卵感染用量(EID50)は1010.33/mlであり、またHA力価は1:3200であった。

0085

A/Hong Kong/213/2003(H5N1)に由来するHA及びNA遺伝子、及びPR8HGに由来するA型インフルエンザ・ウィルス遺伝子の残りを有する組み換えウィルスを調製した。組み換えウィルスの力価は1010.67/mlであり、またHA力価は1:1600であった。

0086

0087

PR8遺伝子の配列:

0088

0089

0090

0091

0092

0093

0094

0095

0096

0097

0098

0099

例2
インフルエンザ・ウィルスA/Hong Kong/213/2003(H5N1、HK213)は鶏において全身的に複製し、致死的な感染を引き起こす。さらに、このウィルスは、鶏胚にとって致死的である。このように、その表面タンパク質は現在循環している病原性鳥インフルエンザ・ウィルスに大きく関連してはいるが、HK213は、孵化鶏卵内でこれを成長させようという試みが低品質の尿膜腔液を生成することになるため、ワクチン株として使用することはできない。加えて、ワクチン生成におけるこのような高毒性ウィルスの使用は、ワクチン作業者にとって安全でない。マスター・ワクチン株としてA/PR/8/34を使用することの実現可能性を試験するために、HK213の血球凝集素(HA)遺伝子の切断部位(複数の塩基性アミノ酸を含有する)を、毒性表現型から無毒表現型へ(RERRRKKR(SEQID No:29)から----TETR(SEQ ID No:30)へ)突然変異させた。突然変異HA遺伝子を含有するウィルスは、鶏において非致死的な局在化感染をもたらした。加えて、突然変異ウィルスは、鶏胚に対して非致死的であった。このように、孵化卵内の突然変異ウィルスの成長は、高品質の尿膜腔液を産出し、そしてこの弱毒化形態において、ウィルスはワクチン製造者にとって安全である。

0100

ノイラミニダーゼ(NA)及びHK213に由来する突然変異HA遺伝子、及び高力価A/PR/8/34(H1N1、HG−PR8)ウィルス(例1)に由来する残りの全ての遺伝子を含有する、卵内の他のA/PR/8/34 PR8株よりも10倍良好に成長する(1010EID50/ml;HA力価:1:8,000)組み換えウィルスを、孵化鶏卵内で発生させた。現在循環している病原性鳥インフルエンザ・ウィルスに関連する表面タンパク質を発現させるこの組み換えウィルスは、孵化鶏卵内で高力価に成長した(図1)。このように、HG−PR8のHA及びNA遺伝子の代わりに、現在循環しているインフルエンザ・ウィルス株を使用する結果、安全に生成することができるワクチン株をもたらし、そしてPR8−HGのマスター・ワクチン株としての使用を実証する。

0101

例3
1997年香において、高病原性H5N1鳥インフルエンザ・ウィルスがからヒトへ直接伝染し、18件の感染が確認され、6名が死亡するに至った(Subbarao他、1998;Claas他、1998)。2004〜6年には、H5N1ウィルスの地理的分布アジアにおいて拡大し、いくつかの隣接するヨーロッパの国々及びアフリカに広がった。全体で、ウィルスに感染した96名の人々がベトナム、タイ、カンボジアインドシア、中国、トルコ、及びイラクで死亡した(Li他、2004;WHO)。汎流行病のこのような致命的な発生及び持続する脅威が、ヒトに使用するためのH5N1ウィルス・ワクチンの開発をもたらした。しかし、病原性H5N1ウィルスは孵化鶏卵内ではよく成長せず、ワクチン製造者に対する深刻なバイオセーフティの懸念をもたらすので、ワクチン候補を生成するために、逆遺伝技術が利用されている(Subbarao他、2003;Webby他、2004;Stephanson他、2004;Wood & Robertson、2004)。

0102

両方とも病原性H5N1株から誘導された修飾無毒型血球凝集素(HA)及びノイラミニダーゼ(NA)遺伝子を、卵内で良好に成長する供与体ウィルスに由来する全ての残りの遺伝子と共に有する組み換え(6:2再構築体)ウィルスが、この方法によって生成されるべき候補の中にある。世界保健機関(WHO)は、人体における安全性及び卵内の強い成長により、供与体ウィルスとしてA/Puerto Rico/8/34(H5N1;PR8)を推奨している(Wood & Robertson、2004;Webby & Webster、2003)。最近、このような組み換えウィルスは、同じPR8「内部」遺伝子(すなわち、HA及びNA以外の遺伝子)を有しているとしても、野生型PR8株よりも卵内での成長がよくないことが判った(Horimoto他、2006)。

0103

卵内の強い成長が、下記のように、不活性化ワクチンの生成に使用されるワクチン種ウィルスの必須の特性であるので、卵内でPR8供与体株と同じく良好に成長するH5N1ワクチン候補を生成した。先ず、PR8と、卵内での成長が悪いWSN株との間の再構築体分析を用いてこの特性に関与する遺伝子を定義することにより、卵におけるPR8の高成長の分子基盤を見極めた。HA−NAバランス及びPB1機能が重要な成長決定因子であることが判った。このような知識を持って、WHO推奨NIBRG−14ウィルスを含むよりコンベンショナルな6:2再構築体に対する卵内の成長を評価するために、PR8バックグラウンドを有する、HA−NAの組み合わせを変化させた一連のH5N1ウィルスを生成した。

0104

方法
細胞及びウィルス
10%ウシ胎仔血清及び抗生物質を含むDulbecco変性イーグル最小必須培地DMEM)中に、293Tヒト胚腎臓細胞を維持した。Madin-Darbyイヌ腎臓(MDCK)細胞を、5%新生ウシ血清及び抗生物質を含むMEM中で成長させた。ヒト・ワクチン製造に使用するためのバイオセーフティ試験(Sugawara他、2002)後に樹立されたアフリカミドリザルVero WCB細胞を、抗生物質を含む無血清VP−SFM培地(GIBCO−BRL)中に維持した。細胞を5%CO2中に37℃で維持した。ヒトから単離されたA/Vietnam/1194/2004及びA/Vietnam/1203/2004(H5N1;VN1194及びVN1203)株を、10日齢孵化鶏卵内で2日間にわたって37℃で増殖させ、その後、ウィルスを含有する尿膜腔液を収穫し、そして更なる試験のために使用した。これらのウィルスを用いた試験は、バイオセーフティ・レベル3の閉じ込め実験室内で行った。WHO推奨ワクチン種ウィルスNIBRG−14(VN1194/PR8 6:2再構築体ウィルス)は、英国National Institute for Biological Standardsand ControlのJohn Wood及びJim Robertson両博士の厚意により贈呈された。

0105

プラスミドの構成及び逆遺伝技術
インフルエンザA型ウィルスの再構築体を生成するために、プラスミドに基づく逆遺伝技術(Neumann他、1999)を用いた。VN1194又はVN1203に由来するウィルスRNAを、商業的キット(ISOGEN LS, Nippon Gene)を使用することにより、尿膜腔液から抽出し、そして逆転写酵素(SuperScript III;GIBCO-BRL)、及びH5ウィルスのRNAセグメントの3’末端のコンセンサス配列を含有するプライマーを使用することにより、cDNAに変換した。次いで、完全長cDNAを、ProofStartポリメラーゼ(QIAGEN)及びH5サブタイプ特異的プライマー対PCR増幅し、そしてヒト・ポリメラーゼIプロモーター及びマウスRNAポリメラーゼIターミネーター(PolIプラスミド)の制御下でプラスミド内にクローニングし、それぞれVN1194又はVN1203HA遺伝子を含有するPolI−VN1194/HA又はPolI−VN1203/HA構造を生成した。Horimoto他(2006)に記載されているように、バックトゥ−バック・プライマー対を使用した逆PCR法に続いてライゲーションを行うことによって、無毒型配列(RETR;SEQID No:31)を形成するために、野生型VN1194又はVN1203(RERRRKKR;SEQ ID No:29)ウィルスのHA切断部位配列を変更した。この文献の開示内容を参考のため本明細書中に引用する。N1特異的プライマーを有するRT−PCR処置(上記)によって、VN1203 NA遺伝子を含有するPolI−VN1203 NAを構成した。逆PCRによって、一連のpPolI NA突然変異プラスミドを調製した。PolI−VN1203 NAを鋳型として使用して、pPolI−NAfillを構成した。pPolI−NAfillは、A/goose/Guangdong/1/96(H5N1;GsGd96)NAから誘導された、48−Proと49−Ileとの間のNAストーク内への20アミノ酸(aa)(CNQSIITYENNTWVNQTYVN;SEQ ID No.32)挿入部を含有する突然変異体NAをコードする。各NAサブタイプのストーク領域から誘導されたN2(12aa)又はN2+N9(12+12aa)配列が、42−Asnと43−Glnとの間のNAストーク内に挿入されたpPolI−NAfill.N2及び−NAfill.N2N9を、Castrucci他(1993)に記載されているように構成した。これらの構造の全てを、望ましくない突然変異が存在しないことを保証するために配列決定した。

0106

A/WSN/33(H5N1;WSN)及びPR株から誘導された、前に生成された一連のPolI構造を、逆遺伝技術のために使用した(Horimoto他、2006;Neumann他、1999)。加えてA/Hong Kong/213/03(H5N1;HK213)、及びA/Kanagawa/173/2001(H1N1;Kanagawa)から誘導されたNA遺伝子を含有するPolI構造をこの研究に使用した(Horimoto他、2006;Kobasa他、1999;Peiris他、2004)。

0107

鶏βアクチン・プロモーターの制御下でWSN又はPR8 NP、PA、PB1、又はPB2を発現させるプラスミドを、全ての逆遺伝子学試験のために使用した(Horimoto他、2006;Neumann他、1999)。手短に述べると、PolIプラスミド及びタンパク質発現プラスミドを、トランスフェクション試薬Trans-IT 293T(Panvera)と混合し、15分間にわたって室温でインキュベートし、次いで293T細胞に添加した。トランスフェクトされた細胞を48時間にわたってOpti-MEMI(GIMCO-BRL)中にインキュベートした。Vero WCB細胞における逆遺伝子学のために、エレクトロポレーター(Amaxa)を使用することにより、製造業者の指示書に従ってプラスミド混合物をトランスフェクトした。トランスフェクションから16時間後に、調製されたばかりのVero WCB細胞を、トランスフェクトされた細胞上に添加し、そしてTPCK−トリプシン(1μg/ml)を6時間後に培地に添加した。トランスフェクトされた細胞を全部で4日間にわたって無血清VP−SFM中でインキュベートした。感染性ウィルスを含有する上澄みを収穫し、孵化卵内で限界希釈を行うことによって生物学的にクローニングし、そして更なる試験に使用した。

0108

卵内のウィルス複製の特性
ウィルスを10日齢の孵化鶏卵の尿膜腔内に接種し、48時間にわたって37℃でインキュベートした。0.5%鶏赤血球又は0.8%モルモット赤血球を使用した、又は卵内のHAアッセイによって尿膜腔液中のウィルスを滴定することにより、ウィルス1ml当たりのメディアン卵感染用量(EID50)を見極めた。いくつかのウィルスの場合、MDCK細胞及びTPCK−トリプシン(1μg/ml)を用いてプラーク滴定を実施した。104EID50のウィルスを接種した後、いくつかのウィルスの成長動態を卵内で評価した。

0109

鶏赤血球からのウィルス溶離アッセイ
HA力価1:1024を含有するウィルスの2倍希釈液50μlを、0.5%鶏赤血球50μlと共に1時間にわたって4℃でマイクロタイター・プレート内でインキュベートした。プレートを次いで37℃で貯蔵し、HA力価の低減を定期的に記録した。6.8mM CaCl2を有するリン酸緩衝生理食塩水希釈剤として使用した。

0110

結果
鶏卵におけるPR8の高成長特性の分子基盤
逆遺伝子学に基づくH5インフルエンザ・ワクチンを生成するための供与体ウィルスとして使用するために、PR8がWHOによって推奨されているが、その高成長特性の分子基盤は十分には理解されていない。M遺伝子は、卵内のPR8の強い成長に関与すると言われているが(Subbarao他、2003)、しかしこの主張は、発表されたオリジナル・データ(Kilbourne他、1969)には一見したところ見いだされない。従って卵内の成長が悪いWSN株を使用して、再構築体分析を行った。表3は、孵化鶏卵におけるウィルス成長に関して、PR8対WSN株のHAとNAとの適合性を示す。全ての再構築体試験ウィルスは、野生型WSNよりも良好に成長するが、しかし卵適応PR8よりも成長が良くない。このことは表面糖タンパク質及び内部タンパク質の両方が、PR8の高成長特性に関与していることを実証する。

0111

0112

PR8糖タンパク質の両方、及びWSNから誘導された6種全ての内部タンパク質を含有する再構築体ウィルスの成長は、PR8と比較して卵内で大幅に低減された(表3及び4)ので、この特性に関与する内部タンパク質を定義するために一連の再構築体ウィルスを生成した。WSN PB1、及びPR8に由来する全ての残りの遺伝子を含有する単一遺伝子再構築ウィルスは成長が悪く、内部タンパク質をコードするWSN遺伝子の全てを含有する再構築体と同様の成長レベルであるのに対して、PR8 PB1、及び全ての残りの内部タンパク質をコードするWSN遺伝子を含有する再構築体は、高力価に複製した(表4)。このように、この役割にMセグメントが関係しているとみなしている以前の報告(Subbarao他、2003)とは対照的に、PR8 PB1が卵内のウィルス・ゲノム複製のための最適なポリメラーゼ活性を有していると思われる。

0113

0114

鶏卵内で高められた成長能力を有するH5N1ワクチン種候補の生成
以前の研究において、卵内のWSNの成長は、NA機能を増大させるためにNAストークを長くすることによって高められる、すなわちストークが長ければ長いほど、ウィルスの複製がより良好に行われることが示された(Castrucci他、1993)。この発見は、PR8バックグラウンドと共に突然変異又は異種N1を含んでなる一連のH5N1ワクチンの生成、及び卵内のこれらの成長の比較を促した。A/Vietnam/1203/2004(H5N1;VN1203)NAは、ストーク領域内に20アミノ酸(20−aa)末梢部を含有する(すなわち、ストーク内に24aa)。従って、前駆体ウィルスA/goose/Guangdong/1/96(H5N1)(Xu他、1999)と同様に44−aaストークを含有する突然変異体NA、VN1023fill、並びに他のNA突然変異体、すなわち、より長いストーク、58−及び72−aaをそれぞれ含有するVN1023fill.N2及びVN1023fill.N2N9を構成した(図2)。ストーク内に44−aaを含有するA/Hong Kong/213/03(H5N1;HK213)に由来する異種N1も試験した。H1N1株、例えば、全てストーク内に24aaを有するPR8、A/Kanagawa/173/2001(H1N1;Kanagawa)、及びWSNに由来するNAも試験した。これらのNA構造を使用して、全部で8種の再構築体ウィルス、すなわち、修飾無毒型VN1203HA及びPR8バックグランドを有する7種の6:2及び1種の7:1再構築体を生成した(表5)。修飾無毒型A/Vietnam/1194/2004(H5N1;VN1194)HAを有する別の一連の再構築体ウィルスを構成した。親VN1203 NAを含有する構造と比較することにより7:1再構築体ウィルス、及び修飾されたVN1194 HAとVN1203fill NAとの組み合わせを含有する6:2再構築体だけが、卵内の成長の向上を示した。

0115

0116

ストック・ウィルスのプラーク・アッセイによって、選択された再構築体ウィルスをさらに試験することにより、PR8 NAを含有する再構築体ウィルスが、卵適応PR8ほど良好に成長することはないものの、親VN1203 NAを含有するウィルスと比較して3倍超高い力価(p=0.003、スチューデントt検定)を示した(図3)。卵内のPR8、VN1203fill、又はVN1203 NAを有する再構築ウィルスの成長動態を評価することにより、PR8 NA(7:1再構築体)を有するウィルスの高い成長速度が明らかになった(図4)。

0117

7:1再構築体ウィルスにおいて観察された高成長特性の分子基盤を見極めるために、鶏赤血球からのウィルス溶離を評価するアッセイによって、再構築体ウィルスのNA機能を試験した(図5)。PR8又はVN1203fill NAを含有する再構築体ウィルスが、親VN1203 NAを有する再構築体ウィルスよりも急速に赤血球から溶離され、このことは、PR8又はVN1203fill NAのNA活性がより大きいことを示す。これらの結果は、高いNA機能が卵内のウィルス成長を促進するという考え(Castrucci他、1993)を支持する。

0118

この研究で生成されたH5N1ワクチン種候補と、卵内のWHO推奨ワクチン種ウィルスNIBRG−14との成長比
H5N1ワクチンの生成における候補種ウィルスの潜在能力の有効性を確認するために、これらの感染価を、同じ試験条件下でWHO提供のNIBRG−14ウィルスの感染価と比較した。VN1194又はNV120誘導型HA、及びPR8株に由来する全ての他の遺伝子を含有する7:1再構築体ウィルスは、EID50(表6)及びプラーク滴定(図6)によって評価して、卵内のNIBRG−14ウィルスよりも著しく高い力価(p<0.05、スチューデントt検定)を示した。興味深いことに、VN1194ウィルスに由来するHA及びNAの両方を含有する6:2再構築体ウィルスでさえ(またVN1194/PR8 6:2再構築体ウィルスも)、プラーク滴定(図5)によって測定して、NIBRG−14よりも著しく良好に(約7倍、p=0.047)成長した。同一のVN1194 HA及びNAを有する2種の6:2再構築体ウィルスの成長の差は、この研究で使用されるPR8株が、卵内のワクチン生成中の高いウィルス成長を支援するためのNIBRG−14を生成するために使用されるPR8株よりも優れていることを示す。

0119

0120

考察
両方ともH5N1ヒト単離体から誘導された修飾無毒型HA及びNA遺伝子と、PR8株に由来する全ての残りの遺伝子とを有する組み換えウィルス(6:2再構築体)が生成されており、そして、ヒト臨床試験において今や試験されようとする不活性インフルエンザ・ワクチンのための種ウィルスとして使用されている(Wood & Robertson、2004)。このように使用される種株は、孵化卵内で良好に成長しなければならない。卵適応PR8はこの要件を満たすが、いくつかの6:2再構築体ウィルスは、PR8に由来する6種の内部遺伝子を含有しているにもかかわらず、卵内ではよく成長しない(表3及び5)。ここで、鶏卵内の卵適応PR8の成長が、HA及びNA表面糖タンパク質の機能バランスによって影響を受けることが実証される。

0121

PR8バックグラウンド、及び高病原性鳥ウィルスに由来する表面糖タンパク質を有するいくつかの6:2再構築体ウィルスの低い収率は、卵内の成長に対するHA−NA機能アンバランスから生じるだけでなく、鳥表面糖タンパク質とPR8に由来する内部遺伝子との遺伝的(及び/又は機能的)不適合性から生じるものと考えられる。ここでは、ここでは、PR8の内部遺伝子の中で、卵内の高い成長に関してPB1が極めて重要である。この情報は、逆遺伝技術に基づくH5N1ワクチン生成のための別の戦略示唆する。すなわち、ワクチン種ウィルスのための、強く成長する再構築体を生成するためには、PB8 PB1遺伝子単独で十分である場合がある。このように、PR8以外の株から非PB1内部タンパク質をコードする遺伝子を使用することにより、鳥ウィルスとPR8ウィルスとの遺伝的不適合性が回避されるかもしれない。卵内のPB8 PB1の高成長特性の分子基盤を分析するための研究は、相当に重要となる。例えば、PB8のPB1又はPB1−F2とWSNとの間の構造的及び機能的相違(それぞれアミノ酸が18個及び10個だけ異なる;Chen他、2004)を分析することもできるはずである。

0122

この研究で生成された7:1再構築体ウィルスは、WHO推奨6:2再構築体ウィルスNIBRG−14よりも著しく良好に(プラーク滴定で測定して20倍超)複製した。起源のPR8株を除いてNIBRG−14と同一の6:2再構築体でさえ、推奨ウィルスよりも7倍良好に複製した。これらの発見は、この研究において使用されたPR8株が、逆遺伝技術に基づく汎流行病ワクチンの生成のための優れた供与体ウィルスであり得ることを示唆している。

0123

(PR8及び高病原性ウィルスの双方がN1 NAを含有するとしても)7:1再構築体ウィルスがNAタンパク質内の抗原性の差異により防御免疫応答損失を引き起こすことが論議され得る(Murphy他、1972;Kilbourne他、1968;Chen他、2000)。しかし、HAは不活性化ワクチン中の主要な防御抗原であるので、PR8 NAによって与えられるより高い成長特性が、このような少量の防御抗原における限られた抗原性不一致を相殺すると思われる。高病原性鳥インフルエンザ・ウィルスによって引き起こされる汎流行病の場合、鶏卵が不足することになる。このような条件下では、卵内に高められた成長特性を有する7:1再構築体に基づくワクチン種ウィルスが、逆遺伝技術に基づくH5ワクチン・ウィルスの生成のための魅力的選択肢を提供することが提案される。

0124

例4
孵化鶏卵内のH5N1ワクチン種ウィルスの高い成長速度に関与する遺伝子を同定するために、孵化鶏卵内にPR8(UW)又はPR8(Cambridge)内部遺伝子を有する再構築体H5N1ウィルスの成長を評価した(図7)。再構築体ウィルス全てのHA及びNA遺伝子は、A/Vietnam/1194/2002から誘導された。全てのその他の遺伝子は、NIBRG−14ワクチン株の非HA及び非NA遺伝子をも提供するPR8(UW)又はPR8(Cambridge)から誘導された。内部遺伝子の大部分がPR8(UW)に由来するときには、より高い力価が得られた。

0125

孵化鶏卵内のウィルスの成長に対するM及びNS遺伝子の効果を図8に示す。PR8(UW)/1194−CamM及びPR8(UW)/1194−CamNSの場合、M及びNS遺伝子セグメントはそれぞれPR8(Cambridge)から誘導されたのに対して、他の内部セグメントはPR8(UW)に由来した。HA及びNAセグメントは、A/Vietnam/1194/2004から誘導された。PR8(UW)のM遺伝子セグメント及びPR8(Cambridge)のNS遺伝子によって、最高力価が得られた。

0126

図7〜8の結果は、ポリメラーゼ・サブユニット(PA、PB1、及びPB2)及びPR8(UW)のNP遺伝子が、孵化鶏卵内のH5N1ワクチン種ウィルスの成長を向上させたことを示している。また、PR8(Cambridge)のNS遺伝子も、孵化鶏卵内のH5N1ワクチン種ウィルスの成長を向上させた。

0127

MDCK細胞内のH5N1ワクチン種ウィルスの高い成長速度に関与する遺伝子及びアミノ酸を同定するために、MDCK細胞内のPR8(UW)/1194及びNIBRG−14ウィルスの成長を評価した。図9のデータは、PR8(UW)/1194の成長がMDCK細胞内のNIBRG−14の成長よりも著しく良好であったことを示している。さらに、PR8(UW)のPB2セグメントは、MDCK細胞内のワクチン種ウィルスの成長を向上させた(図10)。PR8(UW)のPB2中の位置360におけるチロシン残基は、MDCK細胞内のワクチン種ウィルスの高い成長速度に関与すると考えられる(図11)。

0128

MDCK細胞内のH5N1ワクチン種ウィルスの高い成長に関与する遺伝子の組み合わせを同定するために、種々異なるHA、NA、及びNS遺伝子を有する再構築体の、MDCK細胞内の成長速度を測定した。PR8(Cambridge)に由来するNS及び長いストークを有するNA(例えばA/Hong Kong/213/2003又はVN1203Fillに由来する)が、MDCK細胞内のウィルス成長を向上させた(図12)。

0129

NS中のどのアミノ酸が、MDCK細胞中のH5N1ワクチン種ウィルスの成長速度に関与するかを見極めるために、異種NSセグメントを含有するH5N1ワクチン種ウィルスのMDCK細胞中の成長を測定した。NS1の位置55でK[PR8(UW)NS]からE[PR8(Cambridge)]へアミノ酸置換することによって、MDCK細胞中のH5N1ワクチン種ウィルスの成長を向上させた(図13)。

0130

図14は、孵化鶏卵又はMDCK細胞内の高成長能力を有するH5N1ワクチン種ウィルスの遺伝子型を要約する。

0131

0132

0133

0134

0135

実施例

0136

全ての刊行物、特許明細書、及び特許出願明細書を参考のために本明細書中に引用する。本明細書において或る好ましい実施態様と関連して本発明を記述し、また多くの詳細を例示の目的で説明してきたが、当業者には明らかなように、本発明は更なる実施態様を受け入れることができ、また、本明細書中に記載した詳細のうちの或るものを、本発明の基本原理を逸脱することなしに大幅に変化させることができる。

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