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課題

ATP増加作用を呈するジェウェノールA誘導体およびその製造方法を提供する。

解決手段

ジェウェノールA誘導体とはジェウェノールAとフロログルシノールからなる誘導体である。製造方法はアカメガシワの葉及び大豆粉末納豆本舗製の納豆菌を添加して発酵させた発酵液をさらにベニコウジ菌で発酵する工程からなる。得られるジェウェノールA誘導体は優れた効果を呈し、化粧料食品製剤医薬品として応用される。特に、化粧料に利用した場合、ATPを増加させ、皮膚上皮を保持する。また、肝臓腎臓上皮細胞内のATPも増加させ、上皮組織の保護に役立つ。神経組織に対してもATP産生を介した働きがある。

概要

背景

ATP細胞エネルギー源であり、細胞の維持、細胞の補強物質細胞内輸送原形質流動遺伝子発現細胞内情報伝達などを調整する低分子リン酸化合物である。脂質、糖質たんぱく質から細胞質またはミトコンドリア内酵素を介して産生される。

ATPは皮膚、肝臓消化管、神経、筋肉などの上皮細胞内にも認められ、これらの上皮細胞もATPを利用して細胞機能を発揮している。

ATPはcAMP原料でもあり、細胞内情報伝達にも関与している。ATPの減少は細胞機能の低下を意味している。また、カロリーを代謝してATPを産生する作用が欠落することにより、カロリーが脂肪に変化して中性脂肪蓄積肥満をもたらす。

ATPを増加させることは細胞機能の亢進、細胞の機能性を高め、健康維持とダイエットにもつながるため、ATPを増加させる物質についていろいろな研究がなされている。トリカフェオイルキナ酸からなり神経細胞においてATPの産生を促進するためのATP産生促進剤の発明(例えば、特許文献1参照。)があり、トリカフェオイルキナ酸のATP産生が示されている。しかし、その程度は軽度であり、産業への利用は限定されている。

また、ATP産生促進剤および表皮細胞賦活化剤(例えば、特許文献2参照。)があり、そこではウコンヒバマタカンゾウキナアンズマルメロクララクチナシサンシシクマザサグレーフルーツゲンノショウコ紅茶緑茶冬虫夏草ゴボウコメヌカシイタケアカヤジオウシソボダイジュショウガワレモコウドクダミシラカバスギナセキセツソウタマサキツヅラフジ、クワトウキンセンカダイダイマツホドブッチャーブルームプルーン及びマロニエからなる群から選ばれる1種又は2種以上の抽出物を有効成分として含有することを特徴とするATP産生促進剤が提示されているが、活性の程度は軽度である。

概要

ATP増加作用を呈するジェウェノールA誘導体およびその製造方法を提供する。 ジェウェノールA誘導体とはジェウェノールAとフロログルシノールからなる誘導体である。製造方法はアカメガシワの葉及び大豆粉末納豆本舗製の納豆菌を添加して発酵させた発酵液をさらにベニコウジ菌で発酵する工程からなる。得られるジェウェノールA誘導体は優れた効果を呈し、化粧料食品製剤医薬品として応用される。特に、化粧料に利用した場合、ATPを増加させ、皮膚上皮を保持する。また、肝臓や腎臓の上皮細胞内のATPも増加させ、上皮組織の保護に役立つ。神経組織に対してもATP産生を介した働きがある。 なし

目的

そこで、副作用が弱く優れたATP増加作用を呈する天然物及びそれを効率良く製造する製造方法が望まれている

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

下記の式(1)で示されるATP増加作用を呈するジェウェノールA誘導体

請求項2

アカメガシワの葉、大豆粉末納豆本舗製の納豆菌を添加して発酵させた発酵液紅麹本舗製のベニコウジ菌で発酵させる工程からなるATP増加作用を呈するジェウェノールA誘導体の製造方法。

技術分野

0001

この発明はATP増加作用を呈するジェウェノールA誘導体及びその製造方法に関するものである。

背景技術

0002

ATPは細胞エネルギー源であり、細胞の維持、細胞の補強物質細胞内輸送原形質流動遺伝子発現細胞内情報伝達などを調整する低分子リン酸化合物である。脂質、糖質たんぱく質から細胞質またはミトコンドリア内酵素を介して産生される。

0003

ATPは皮膚、肝臓消化管、神経、筋肉などの上皮細胞内にも認められ、これらの上皮細胞もATPを利用して細胞機能を発揮している。

0004

ATPはcAMP原料でもあり、細胞内情報伝達にも関与している。ATPの減少は細胞機能の低下を意味している。また、カロリーを代謝してATPを産生する作用が欠落することにより、カロリーが脂肪に変化して中性脂肪蓄積肥満をもたらす。

0005

ATPを増加させることは細胞機能の亢進、細胞の機能性を高め、健康維持とダイエットにもつながるため、ATPを増加させる物質についていろいろな研究がなされている。トリカフェオイルキナ酸からなり神経細胞においてATPの産生を促進するためのATP産生促進剤の発明(例えば、特許文献1参照。)があり、トリカフェオイルキナ酸のATP産生が示されている。しかし、その程度は軽度であり、産業への利用は限定されている。

0006

また、ATP産生促進剤および表皮細胞賦活化剤(例えば、特許文献2参照。)があり、そこではウコンヒバマタカンゾウキナアンズマルメロクララクチナシサンシシクマザサグレーフルーツゲンノショウコ紅茶緑茶冬虫夏草ゴボウコメヌカシイタケアカヤジオウシソボダイジュショウガワレモコウドクダミシラカバスギナセキセツソウタマサキツヅラフジ、クワトウキンセンカダイダイマツホドブッチャーブルームプルーン及びマロニエからなる群から選ばれる1種又は2種以上の抽出物を有効成分として含有することを特徴とするATP産生促進剤が提示されているが、活性の程度は軽度である。

先行技術

0007

特許第5403582号
特願2008−109372

発明が解決しようとする課題

0008

既存の物質によるATP増加作用は軽度であり、産業上への利用が限定されるという課題があり、また、化学合成された物質では安全性に問題があり、利用が限られている。

0009

そこで、副作用が弱く優れたATP増加作用を呈する天然物及びそれを効率良く製造する製造方法が望まれている。

課題を解決するための手段

0010

上記の目的を達成するために、請求項1に記載の発明は下記の式(1)で示されるATP増加作用を有するジェウェノールA誘導体に関するものである。

0011

0012

上記の目的を達成するために、請求項2に記載の発明はATP増加作用を有するジェウェノールA誘導体の製造方法に関するものである。

発明の効果

0013

この発明は、以上のように構成されているため、次のような効果を奏する。

0014

請求項1に記載のジェウェノールA誘導体はATP増加作用に優れている。

0015

請求項2に記載の製造方法によれば、効率良くジェウェノールA誘導体を製造することができる。

0016

以下、この発明を具体化した実施形態について詳細に説明する。

0017

ATP増加作用を呈するジェウェノールA誘導体とは、下記の式(1)で示される構造からなるものである。

0018

0019

前記の式(1)のようにジェウェノールAの1分子とフロログルシノールの2分子からなる。これらの結合はすべて天然型であり、水酸基酸素を介した結合である。

0020

ジェウェノールAはジテルペン分類される天然物であり、類似体としてジェウェノールBがある。このジェウェノールAの分子式はC20H34O4であり、分子量は338.49である。フロログルシノールとはポリフェノール一種であり、植物に存在して抗酸化作用抗菌作用を発揮する。また、医薬品としても利用され、鎮痙作用を発揮する。分子式はC6H6O3であり、分子量は126.11である。

0021

このジェウェノールA誘導体はジェウェノールAのアルコール性水酸基にフロログルシノールのフェノール性水酸基が結合した形状を示す。水酸基を4個有しており、強い抗酸化作用を呈する。また、水、アルコール、油や有機溶媒にも溶解しやすく、産業上利用しやすい。

0022

このジェウェノールA誘導体は細胞膜ミトコンドリア膜核膜浸透しやすく、細胞膜を安定化させる働きがある。特に、ミトコンドリア膜には親和性が高く、ミトコンドリア酸化を防止し、かつ、ビタミン類の酸化も抑制することによりATP産生を増加させる。

0023

このジェウェノールA誘導体は少量であれば、化学的合成経路により合成することも可能である。ジェウェノールAとフロログルシノールの水酸基を保護しながら、有機合成できる。しかし、コストが高く、溶媒の影響も生じやすいことからこの製造方法は産業上の利用が限定される。しかし、標準物質採取には利用できる。

0024

このジェウェノールA誘導体は標準品構造解析により同定され、化学合成された標準品の400MHzのH−NMRでは重水中ケミカルシフトは0.28〜1.4、2.22〜2.908、3.134、3.308、3.640、3.779、6.541、6.616、7.028などのppmであり、特徴的なピークを認める。

0025

このジェウェノールA誘導体は筋肉細胞にも浸透しやすく、筋肉細胞でATP産生を増加し、筋肉の活動を高める。カロリーが消費されることから糖質や脂肪を減少させ、ダイエット作用を呈する。

0026

さらに、このジェウェノールA誘導体は皮膚上皮細胞のATP産生を増加させ、皮膚の分化と増殖を促進する。皮膚上皮細胞のATPを増加させることによ、シワタルミを抑制する。筋肉細胞の増強と皮膚上皮細胞の増殖により優れた美容作用を発揮する。

0027

このジェウェノールA誘導体は神経細胞にも働き、ATPの増加を介して神経細胞を活性化することにより神経細胞の増殖と伝達を高める。この働きは認知症アルツハイマー症パーキンソン症にも適している。

0028

このジェウェノールA誘導体は肝臓及び腎臓に存在するエステラーゼによりジェウェノールAとフロログルシノールに分解され、代謝されることから、過剰量が摂取され、または、塗布された場合にも、過剰による副作用は少ない。

0029

また、このジェウェノールA誘導体は自然界に存在する物質であり、その食経験や化粧品としての利用実績豊富であることから安全性が確認されている。

0030

さらに、このジェウェノールA誘導体は眼の角膜細胞水晶体細胞筋肉組織視神経のATPを増加して構造を補強し、視力回復に利用される。

0031

これらのジェウェノールA誘導体によるATP産生はミトコンドリア膜の安定化と抗酸化NADH、FADと鉄などによる電子伝達系を増強させるメカニズムにより、他の医薬品や原料とも併用できる点は好ましい。

0032

このジェウェノールA誘導体は天然にも存在しており、アカメガシワの葉などに極微量認められる。このジェウェノールA誘導体を精製により上記の植物から抽出することは可能である。

0033

ただし、精製には大量の原料を必要とすることから、製造方法として産業上への利用は制限される。

0034

このジェウェノールA誘導体はアカメガシワ葉などの植物から得ることが可能であるが、含有量が少ないことから、発酵法などにより増加させることは好ましい。発酵の方法として大豆と混合して納豆菌ベニコウジ菌により発酵させて得ることは食経験があり、増加量も多いことから好ましい。

0035

得られたジェウェノールA誘導体を医薬品素材として利用する場合、目的とするジェウェノールA誘導体を分離精製することは、目的とするジェウェノールA誘導体の純度が高まり、不純物を除去できる点から好ましい。

0036

医薬品として、注射剤または経口剤または塗布剤などの非経口剤として利用され、医薬部外品としては、錠剤カプセル剤ドリンク剤石鹸、塗布剤、ゲル剤歯磨き粉等に配合されて利用される。

0037

経口剤としては、錠剤、カプセル剤、散剤シロップ剤、ドリンク剤等が挙げられる。前記の錠剤及びカプセル剤に混和される場合には、結合剤賦形剤膨化剤、滑沢剤甘味剤香味剤等とともに用いることができる。前記の錠剤は、シェラックまたは砂糖被覆することもできる。

0038

また、前記のカプセル剤の場合には、上記の材料にさらに油脂等の液体担体を含有させることができる。前記のシロップ剤及びドリンク剤の場合には、甘味剤、防腐剤色素香味剤等を添加することができる。

0039

非経口剤としては、軟膏剤クリーム剤水剤等の外用剤の他に、注射剤が挙げられる。外用剤の基材としては、ワセリンパラフィン油脂類ラノリンマクロゴールド等が用いられ、通常の方法によって軟膏剤やクリーム剤等とすることができる。

0040

注射剤には、液剤があり、その他、凍結乾燥剤がある。これは使用時、注射用蒸留水生理食塩液等に無菌的に溶解して用いられる。

0041

食品製剤としてATP産生を増加することによる機能性をもたらすサプリメント滋養強壮系の食品、皮膚の健康を維持する美容サプリメント、神経、肝臓や腎臓の機能を向上させる健康食品、筋肉を増強し、脂肪を分解するダイエットなどを目的とした健康食品、美容食品などに利用される。また、保健機能食品として、栄養機能食品特定保健用食品に利用することは好ましい。

0042

得られた食品製剤をイヌネコなどのペット家畜動物に利用する場合、ATPの増加による上皮組織や筋肉、骨細胞強化を目的として飼料やサプリメントとして利用される。

0043

化粧料として常法に従って界面活性化剤溶剤増粘剤、賦形剤等とともに用いることができる。例えば、クリーム毛髪用ジェル洗顔剤美容液化粧水等の形態とすることができる。

0044

化粧料の形態は任意であり、溶液状、クリーム状、ペースト状、ゲル状、ジェル状固形状または粉末状として用いることができる。

0045

得られた化粧料は皮膚上皮細胞のATPを増加させることにより皮膚の構築を強固にし、シワを防止し、たるみを防ぐことは好ましい。

0046

また、ジェウェノールA部分が抗菌作用を発揮することにより、歯磨き剤入浴剤などに利用できる。

0047

次に、アカメガシワの葉、大豆粉末納豆本舗製の納豆菌を添加して発酵させた発酵液紅麹本舗製のベニコウジ菌で発酵する工程からなるATP増加作用を呈するジェウェノールA誘導体の製造方法について説明する。

0048

ここでいうジェウェノールA誘導体とはジェウェノールAの1分子とフロログルシノールの2分子からなる物質であり、これらの結合はすべて天然型であり、水酸基の酸素を介した結合である。ジェウェノールA誘導体はミトコンドリア膜の安定化とビタミン類の抗酸化によりATP産生を促進する。

0049

このジェウェノールA誘導体のジェウェノールAとフロログルシノールは天然に存在し、食経験も豊富であり、安全性が認められていることから好ましい。

0050

この誘導体は皮膚や神経、骨、筋肉などの上皮細胞に働き、ATPを増加させ、組織を強化する。

0051

この製造方法とはアカメガシワの葉、大豆粉末と納豆本舗製の納豆菌を添加して発酵させた発酵液を紅麹本舗製のベニコウジ菌で発酵する工程からなる。

0052

原料となる物質はアカメガシワの葉、大豆粉末、納豆本舗製の納豆菌及び紅麹本舗製のベニコウジ菌である。

0053

ここでいうアカメガシワは学名Mallotus Japonicusであり、赤槲や赤芽柏とも表記される。トウダイグサ科アカメガシワ属の落葉高木であり、樹皮医薬品原料としても利用されている。この葉は食用として利用され、和え物などになる。特に、若葉は食用として適している。

0054

アカメガシワの葉には色素、ポリフェノールやジェウェノールAが含有されていることからこのジェウェノールA誘導体を製造する原料として好ましい。

0055

アカメガシワの葉は日本、中国、台湾、アメリカなどいずれの国の由来でも良い。特に、日本産で低農薬や減農薬で生産されたものは好ましい。

0056

アカメガシワの葉は乾燥され、粉末化されることが好ましく、発酵の前にオートクレーブ滅菌されることは発酵をスムーズに行うることから好ましい。

0057

マイクロメーター以下の粒子サイズの粉末が発酵の工程を実施しやすくすることから好ましい。

0058

原料となる大豆粉末は、日本産、中国産、アメリカ産、ロシア産などいずれの産地の大豆でも利用できるが、トレーサビリティーが確実であり、生産者が明確である日本産が好ましい。

0059

このうち、有機栽培や無農薬で栽培された大豆は有害な農薬や金属を含有しないことから、さらに好ましい。

0060

大豆は使用に際して、株式会社奈良機械製作所製の自由ミルスーパー自由ミル、サンプルミル、ゴブリン、スーパークリーンミル、マイクロス、減圧乾燥機として東洋理工製の小型減圧乾燥機、株式会社マツイ製の小型減圧伝熱乾燥機DPTH−40、エーキューエム九州テクノス株式会社製のクリーンドライVD−7、VD−20、中山技術研究所製DM−6などの粉砕機粉砕される。これにより発酵の工程が効率的に進行されやすい。

0061

さらに、アカメガシワの葉と大豆は粉砕後、オートクレーブなどにより滅菌されることは雑菌繁殖防御できることから好ましい。

0062

用いる納豆本舗製の納豆菌は学名バチルスサブチリスで日本では納豆の製造に汎用され、食経験が豊富で有用な食用菌である。縄や鹿児島などの日本産、中国や台湾の東アジア原産の菌種が用いられる。用いる納豆菌は納豆本舗製であり、高い発酵性を呈する。

0063

この納豆菌はアカメガシワの葉と大豆からなるジェウェノールAとフロログルシノールの結合を促進する。

0064

前記の発酵に関するそれぞれの添加量はアカメガシワの葉の乾燥粉末1重量に対し、大豆粉末は0.05〜4重量及び納豆本舗製の納豆菌は0.001〜0.03重量が好ましい。納豆菌は発酵される前に、前培養することは、発酵の初発時間を短縮し、発酵時間が短縮されることから好ましい。

0065

前記の発酵は清浄な培養用タンクで実施され、滅菌された水道水により前記の材料を混合することは好ましい。

0066

また、この発酵は39〜44℃に加温され、発酵は、2日間から30日間行われる。目的とするジェウェノールA誘導体をHPLCTLCにより定量することならびに、菌体増殖性を確認することにより、発酵の工程管理を実施することは好ましい。

0067

前記の発酵は清浄な培養用タンクで実施され、滅菌された水道水により前記の材料を混合することは好ましい。

0068

この発酵の工程によってジェウェノールAとフロログルシノールとが結合するものの、その結合が不安定であることから次の紅麹本舗製のベニコウジ菌による発酵を行う。

0069

用いる紅麹本舗製のベニコウジ菌は学名Monascuc purpureusの糸状菌であり、古くから日本、中国や台湾において紅酒や豆腐ようなどの発酵食品に利用されている。また、沖縄や鹿児島などの日本産、中国や台湾の東南アジア原産の菌種が用いられる。紅麹本舗製のベニコウジ菌は発酵効率に優れている。

0070

前記の発酵に関するそれぞれの添加量は前記の発酵物1重量に対してベニコウジ菌は0.0001〜0.004重量が好ましい。紅麹本舗製のベニコウジ菌は発酵される前に、前培養することは、発酵の初発時間を短縮し、発酵時間が短縮されることから好ましい。

0071

前記の発酵は清浄な培養用タンクで実施され、滅菌された水道水により前記の材料を混合することは好ましい。

0072

また、この発酵は37〜42℃に加温され、発酵は1日間から15日間行われる。この発酵の工程によってベニコウジ菌の還元作用によりジェウェノールAとフロログルシノールとの結合が安定化される。

0073

前記の発酵物は含水エタノールで抽出されることは、生成物を効率良く回収し、菌を滅菌でき、次の工程が実施しやすいことから、好ましい。また、得られた発酵物を超音波処理することは、生成物が分離しやすいことから、好ましい。また、凍結乾燥などにより、濃縮することは、以下の工程が短時間に実施できることから好ましい。

0074

前記の還元反応物から、目的とするジェウェノールA誘導体を分離し、精製することは純度の高い物質として摂取量を減少させることができる点から好ましい。この精製の方法としては、分離用樹脂などの精製操作を利用することが好ましい。

0075

例えば、分離用担体または樹脂により分離され、分取されることにより目的とするジェウェノールA誘導体が得られる。分離用担体または樹脂としては、表面が後述のようにコーティングされた、多孔性多糖類酸化珪素化合物ポリアクリルアミドポリスチレンポリプロピレンスチレンビニルベンゼン共重合体等が用いられる。0.1〜300μmの粒度を有するものが好ましく、粒度が細かい程、精度の高い分離が行なわれるが、分離時間が長い欠点がある。

0076

例えば、逆相担体または樹脂として表面が疎水性化合物でコーティングされたものは、疎水性の高い物質の分離に利用される。陽イオン物質でコーティングされたものは陰イオン性に荷電した物質の分離に適している。また、陰イオン物質でコーティングされたものは陽イオン性に荷電した物質の分離に適している。特異的な抗体をコーティングした場合には、特異的な物質のみを分離するアフィニティ担体または樹脂として利用される。

0077

アフィニティ担体または樹脂は、抗原抗体反応を利用して抗原の特異的な調製に利用される。分配性担体または樹脂は、シリカゲルメルク社製)等のように、物質と分離用溶媒の間の分配係数差異がある場合、それらの物質の単離に利用される。

0078

これらのうち、製造コストを低減することができる点から、吸着性担体または樹脂、分配性担体または樹脂、分子篩担体または樹脂及びイオン交換担体または樹脂が好ましい。さらに、分離用溶媒に対して分配係数の差異が大きい点から、逆相担体または樹脂及び分配性担体または樹脂はより好ましい。

0079

分離用溶媒として有機溶媒を用いる場合には、有機溶媒に耐性を有する担体または樹脂が用いられる。また、医薬品製造または食品製造に利用される担体または樹脂は好ましい。

0080

これらの点から吸着性担体としてダイヤイオン(三菱化学(株)社製)及びXAD−2またはXAD−4(ロームアンドハース社製)、分子篩用担体としてセファデックスLH−20(アマシャムファルマシア社製)、分配用担体としてシリカゲル、イオン交換担体としてIRA−410(ロームアンドハース社製)、逆相担体としてDM1020T(富士シリシア社製)がより好ましい。

0081

これらのうち、ダイヤイオン、セファデックスLH−20及びDM1020Tはさらに好ましい。

0082

得られた抽出物は、分離前に分離用担体または樹脂を膨潤化させるための溶媒に溶解される。その量は、分離効率の点から抽出物の重量に対して1〜30倍量が好ましく、4〜25倍量がより好ましい。分離の温度としては物質の安定性の点から6〜32℃が好ましく、10〜22℃がより好ましい。

0083

分離用溶媒には、水、または、水を含有する低級アルコール親水性溶媒親油性溶媒が用いられる。低級アルコールとしては、メタノールエタノールプロパノールブタノールが用いられるが、食用として利用されているエタノールが好ましい。

0084

セファデックスLH−20を用いる場合、分離用溶媒には低級アルコールが好ましい。シリカゲルを用いる場合、分離用溶媒にはクロロホルム、メタノール、酢酸またはそれらの混合液が好ましい。

0085

ダイヤイオン及びDM1020Tを用いる場合、分離用溶媒はメタノール、エタノール等の低級アルコールまたは低級アルコールと水の混合液が好ましい。

0086

ジェウェノールA誘導体を含む画分を採取して乾燥または真空乾燥により溶媒を除去し、目的とするジェウェノールA誘導体を粉末または濃縮液として得ることは溶媒による影響を除外できることから、好ましい。

0087

また、最終抽出を食用油や化粧料に用いる油脂で実施することは、得られるジェウェノールA誘導体が安定に維持されることから好ましい。例えば、大豆油米ぬか油、グレープシード油オリーブ油ホホバ油で抽出することは好ましい。

0088

また、このジェウェノールA誘導体を粉末化することは防腐の目的から好ましい。

0089

以下、前記実施形態を実施例及び試験例を用いて具体的に説明する。なお、これらは一例であり、素材、原料や検体の違いに応じて常識の範囲内で条件を変更させることが可能である。

0090

長崎県で減農薬と有機肥料により栽培されたアカメガシワの葉を特定非営利活動法人對次世代協議会より購入して用いた。この葉を水道水で水洗後、天日で乾燥させ、粉砕機(株式会社奈良機械製作所製のスーパー自由ミル)にて粉砕し、アカメガシワの葉の乾燥粉末粉砕物を1.0kg得た。

0091

北海道産の大豆をミキサー(クイジナート製)に供し、大豆の粉砕物1.7kgを得た。前記のアカメガシワの葉と大豆の粉砕物をオートクレーブに供し、121℃、20分間、滅菌した。

0092

これらを清浄な発酵タンク(滅菌された発酵用丸形40リットルタンク)に入れ、滅菌された水道水5kgを添加し、攪拌した。

0093

これとは別に、納豆本舗製の粉末納豆菌の12gを小型発酵タンクに供し、滅菌した大豆粉末と前培養させた培養液を用意した。

0094

前記の前培養した納豆菌の培養液とアカメガシワの葉の乾燥粉末と大豆とを入れた発酵タンクに添加し、攪拌後、40〜42℃の温度範囲で加温し、発酵させた。

0095

発酵過程では、通気によりバブリングと攪拌を行いつつ、発酵液のサンプリングを行った。発酵終了後、発酵タンクより発酵物を取り出し、煮沸滅菌した。この発酵物を濾過布により濾過して、納豆菌による発酵液4.1kgを得た。この発酵液1kgに対して紅麹本舗製のベニコウジ菌の12gを添加し、37℃で2日間発酵させた。

0096

この発酵物にエタノールを添加して煮沸滅菌した。これを濾過し、濾過液を目的とするジェウェノールA誘導体とした。これを検体1とした。

0097

さらに、構造解析及び実験の目的で精製物を得た。つまり、前述の検体1のジェウェノールA誘導体の50gに7%エタノール含有精製水の1Lを添加し、ダイアイオン(三菱化学製)500gを7%エタノール液に懸濁して充填したガラスカラムに供した。

0098

これに2Lの7%エタノール液を添加して清浄し、さらに、60%エタノール液を1L添加して目的とするジェウェノールA誘導体を溶出させ、濃縮して精製した。精製されたジェウェノールA誘導体を減圧蒸留により、エタノール部分を除去し、水溶液とした。これをジェウェノールA誘導体の精製物13gを検体2とした。

0099

以下に、ジェウェノールA誘導体の構造解析に関する試験方法及び結果について説明する。
(試験例1)

0100

上記のように得られた検体2をエタノールに溶解し、質量分析器付き高速液体クロマトグラフィ(HPLC、島津製作所)で分析した。

0101

させら、核磁気共鳴装置(400MHz、H−NMR、ブルカー製)で解析した結果、検体2からジェウェノールA、フロログルシノールからなるジェウェノールA誘導体が検出された。

0102

すなわち、H−NMRのケミカルシフトは、0.286、1.14、2.227、2.573、2.908、3.134、3.308、3.64、3.779、6.335、6.541、6.616、6.753、6.906、7.028及び7.141ppmのピークを呈した。

0103

上記の解析結果は、化学的に合成した標準品と同一構造を呈することが判明したことから、検体2はジェウェノールA1分子とフロログルシノール2分子がエーテル結合したジェウェノールA誘導体であると確認できた。

0104

以下にヒト皮膚上皮細胞を用いた確認試験について述べる。
(試験例2)

0105

クラボウ株式会社より購入したヒト皮膚上皮細胞を用いた。培養液としては、5%牛胎児血清含有MEM培地(Sigma製)を用いて培養した、1000個の細胞を35mm培養シャーレ播種し、5%炭酸ガス下、37℃で培養した。これに、前記の実施例1で得られた検体1及び陽性対照としてEGF(フナコシ(株)、ヒトタイプ)を0.1mg/mlの最終濃度で添加した。これを48時間培養した。

0106

細胞を剥離後、細胞数計数した後、細胞懸濁液を調整し、細胞内のATP量を抗ATP抗体(低分子、酸性タイプ)を用いたELISA法にて測定した。なお、シャーレは5枚を用いてその平均値を算出した。

0107

その結果、検体1の0.1mg/mlの添加により上皮細胞数が溶媒対照群に比して平均値として167%に増加した。また、検体2では233%に増加した。一方、EGFでは160%の増加であり、検体1及び検体2の方が優れていた。

0108

ATP量については検体1により溶媒対照群に比して254%に増加した。また、検体2の添加により溶媒対照の426%となった。EGFでは231%となり、検体1及び検体2のATP産生量が著しかった。

0109

以下にヒト肝臓細胞を用いた確認試験について述べる。
(試験例3)

0110

クラボウ株式会社より購入したヒト肝臓細胞を用いた。培養液としては、専用の培養液を用いて培養した、1000個の細胞を35mm培養シャーレに播種し、5%炭酸ガス下、37℃で培養した。これに、1%のエタノールを添加してヒト肝臓細胞を弱らせた。

0111

ここに、前記の実施例1で得られた検体1及び陽性対照としてHGF(フナコシ(株)、ヒトタイプ)を0.1mg/mlの最終濃度で添加した。これを48時間培養した。

0112

細胞を剥離後、細胞数を計数した後、細胞懸濁液を調整し、肝臓細胞内のATP量を抗ATP抗体(低分子、酸性タイプ)を用いたELISA法にて測定した。なお、シャーレは5枚を用いてその平均値を算出した。

0113

その結果、検体1の0.1mg/mlの添加により肝臓細胞数が溶媒対照群に比して平均値として166%に増加した。また、検体2では228%に増加した。一方、HGFでは155%の増加であり、検体1及び検体2の方が優れていた。

実施例

0114

ATP量については検体1により溶媒対照群に比して170%に増加した。また、検体2の添加により溶媒対照の338%となった。HGFでは156%となり、検体1及び検体2のATP産生量が著しかった。

0115

本発明で得られるジェウェノールA誘導体はATPの増加を介して上皮細胞と上皮組織を強化することから皮膚、肝臓、神経などの健康障害を軽減し、かつ、副作用が少ないことから、国民のQOLを改善し、健康な労働人口を増加させ、かつ、医療費を削減できる。

0116

本発明で得られるジェウェノールA誘導体は皮膚を改善する作用を有することから、化粧料としてシワ、たるみなどの肌トラブルに悩む方の肌の改善に貢献し、化粧品業界の発展に寄与する。

0117

本発明で得られるジェウェノールA誘導体は食品としても利用できることから、食品業界の発展に寄与する。

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