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課題

グルコース脱水素酵素、該酵素をコードするポリヌクレオチド、該酵素の製造方法、該酵素を用いたグルコース測定方法測定試薬組成物及びバイオセンサを提供すること。

解決手段

以下の(a)、(b)又は(c)のアミノ酸配列を有し、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質からなるフラビン結合型グルコース脱水素酵素:(a)配列番号2又は3に示されるアミノ酸配列;(b)配列番号2又は3に示されるアミノ酸配列において1又はそれ以上のアミノ酸欠失置換もしくは付加されたアミノ酸配列;(c)配列番号2又は3に示されるアミノ酸配列と類似性を有するアミノ酸配列。

概要

背景

液中グルコース血糖)濃度の測定は、主に糖尿病患者血糖コントロールにおいて重要である。血糖測定において、酵素を利用した血糖測定機器として、バイオセンサが広く使われている。

バイオセンサに使用可能な酵素として、グルコース酸化酵素グルコース脱水素酵素が知られている。しかし、グルコース酸化酵素は、血中の溶存酸素により測定誤差が生じるという問題があった。グルコース脱水素酵素のうち、真核細胞由来フラビン結合型グルコース脱水素酵素は、溶存酸素の影響を受けないこと、補酵素の添加を必要としないこと及び基質特異性に優れることから、バイオセンサ用の酵素として有用である(特許文献1〜5)。

概要

グルコース脱水素酵素、該酵素をコードするポリヌクレオチド、該酵素の製造方法、該酵素を用いたグルコースの測定方法測定試薬組成物及びバイオセンサを提供すること。 以下の(a)、(b)又は(c)のアミノ酸配列を有し、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質からなるフラビン結合型グルコース脱水素酵素:(a)配列番号2又は3に示されるアミノ酸配列;(b)配列番号2又は3に示されるアミノ酸配列において1又はそれ以上のアミノ酸欠失置換もしくは付加されたアミノ酸配列;(c)配列番号2又は3に示されるアミノ酸配列と類似性を有するアミノ酸配列。

目的

本発明は、基質特異性の高いグルコース脱水素酵素、該酵素をコードするポリヌクレオチド、該酵素の製造方法、該酵素を用いたグルコースの測定方法、測定試薬組成物及びバイオセンサを提供する

効果

実績

技術文献被引用数
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牽制数
0件

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請求項1

以下の(a)、(b)又は(c)のアミノ酸配列を有し、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質からなるフラビン結合型グルコース脱水素酵素:(a)配列番号2又は3に示されるアミノ酸配列;(b)配列番号2又は3に示されるアミノ酸配列において1又はそれ以上のアミノ酸欠失置換もしくは付加されたアミノ酸配列;(c)配列番号2又は3に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%の類似性を有するアミノ酸配列。

請求項2

以下の(i)、(ii)、(iii)、(iv)又は(v)からなるポリヌクレオチド:(i)請求項1記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド;(ii)配列番号1に示される塩基配列を有するポリヌクレオチド;(iii)配列番号1に示される塩基配列において1又は数個塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を有し、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;(iv)配列番号1に示される塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;(v)配列番号1に示される塩基配列と少なくとも80%の同一性を有する塩基配列を有し、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。

請求項3

請求項2記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター

請求項4

請求項3記載のベクターにより形質転換した形質転換細胞

請求項5

請求項4記載の細胞を培養し、培養物からフラビン結合型グルコース脱水素酵素を採取することを特徴とするフラビン結合型グルコース脱水素酵素の製造方法。

請求項6

請求項1記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素を使用するグルコース測定方法

請求項7

請求項1記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素を含むグルコース測定試薬組成物

請求項8

請求項1記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素を含むグルコース測定用バイオセンサ

技術分野

0001

本発明は、グルコース脱水素酵素、該酵素をコードするポリヌクレオチド、該酵素の製造方法、該酵素を用いたグルコース測定方法測定試薬組成物及びバイオセンサ等に関する。

背景技術

0002

液中のグルコース(血糖)濃度の測定は、主に糖尿病患者血糖コントロールにおいて重要である。血糖測定において、酵素を利用した血糖測定機器として、バイオセンサが広く使われている。

0003

バイオセンサに使用可能な酵素として、グルコース酸化酵素やグルコース脱水素酵素が知られている。しかし、グルコース酸化酵素は、血中の溶存酸素により測定誤差が生じるという問題があった。グルコース脱水素酵素のうち、真核細胞由来フラビン結合型グルコース脱水素酵素は、溶存酸素の影響を受けないこと、補酵素の添加を必要としないこと及び基質特異性に優れることから、バイオセンサ用の酵素として有用である(特許文献1〜5)。

先行技術

0004

国際公開2004/058958号パンフレット
国際公開2006/101239号パンフレット
国際公開2008/001903号パンフレット
国際公開2013/031664号パンフレット
国際公開2013/147206号パンフレット

発明が解決しようとする課題

0005

血糖測定において、より基質特異性の高い酵素が求められていた。本発明は、基質特異性の高いグルコース脱水素酵素、該酵素をコードするポリヌクレオチド、該酵素の製造方法、該酵素を用いたグルコースの測定方法、測定試薬組成物及びバイオセンサを提供する。更に、測定試薬組成物の製造方法及びバイオセンサの製造方法を提供する。

課題を解決するための手段

0006

発明者らは、種々の微生物由来のグルコース脱水素酵素を探索し、基質特異性の高いフラビン結合型グルコース脱水素酵素を見出した。更に、効率的なフラビン結合型グルコース脱水素酵素の製造方法を見出し、本発明を完成した。

0007

すなわち、本発明は、以下の[1]〜[8]の態様に関する。
[1]以下の(a)、(b)又は(c)のアミノ酸配列を有し、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質からなるフラビン結合型グルコース脱水素酵素:
(a)配列番号2又は3に示されるアミノ酸配列;
(b)配列番号2又は3に示されるアミノ酸配列において1又はそれ以上のアミノ酸欠失置換もしくは付加されたアミノ酸配列;
(c)配列番号2又は3に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%の類似性を有するアミノ酸配列。
[2]以下の(i)、(ii)、(iii)、(iv)又は(v)からなるポリヌクレオチド:
(i)[1]記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(ii)配列番号1に示される塩基配列を有するポリヌクレオチド;
(iii)配列番号1に示される塩基配列において1又は数個塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を有し、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(iv)配列番号1に示される塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(v)配列番号1に示される塩基配列と少なくとも80%の同一性を有する塩基配列を有し、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
[3][2]に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター
[4][3]に記載のベクターにより形質転換した形質転換細胞
[5][4]に記載の細胞を培養し、培養物からフラビン結合型グルコース脱水素酵素を採取することを特徴とするフラビン結合型グルコース脱水素酵素の製造方法。
[6][1]に記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素を使用するグルコースの測定方法。
[7][1]に記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素を含むグルコース測定試薬組成物
[8][1]に記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素を含むグルコース測定用バイオセンサ。

発明の効果

0008

本発明によって、基質特異性の高いフラビン結合型グルコース脱水素酵素が得られた。該酵素を簡便に製造できるようになった。更に、該酵素を使用することで、他の糖類の影響を受け難い測定が可能になり、精度の高い測定が可能な測定試薬組成物及びバイオセンサが製造できるようになった。

図面の簡単な説明

0009

本発明の酵素によるD−グルコース測定結果を示す図である。

0010

本発明のグルコース脱水素酵素は、下記(a)、(b)又は(c)のアミノ酸配列を有し、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質である。「タンパク質」とは糖タンパク質も含む。
(a)配列番号2又は3に示されるアミノ酸配列。
(b)配列番号2又は3に示されるアミノ酸配列において1又はそれ以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列。変異数は、好ましくは多くとも60個、55個、50個、40個、30個、20個、15個、10個、5個、3個又は2個である。
(c)配列番号2又は3に示されるアミノ酸配列と相同性を有するアミノ酸配列。相同性を有するとは、類似性が好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも92%、93%、94%、95%、96%、97%又は98%のアミノ酸配列である。又は同一性が好ましくは少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、92%又は95%のアミノ酸配列である。
該酵素は、好ましくは(a)、(b)又は(c)のアミノ酸配列からなり、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質である。

0011

本発明のグルコース脱水素酵素は、前記配列を有するタンパク質であれば特に限定されず、野生株由来の酵素でもよく、遺伝子組換えによって得られた組換え酵素でもよく、合成によって得られた合成酵素でもよい。好ましくは組換え酵素である。

0012

本発明のフラビン結合型グルコース脱水素酵素は、下記の性質(1)〜(4)を有する。フラビンとしては、フラビンアデニンジヌクレオチドFAD)、フラビンモノヌクレオチドFMN)が挙げられ、好ましくはFADである。
(1)作用:電子受容体存在下で、グルコースを酸化する反応を触媒する酵素である。
(2)可溶性である。

0013

(3)基質特異性が高い。50mMグルコースに対する作用性を100%とした場合に、50mMマルトースD−キシロース又はD−ガラクトースに対する作用性が、何れも好ましくは多くとも2.0%、より好ましくは多くとも1.5%、1.0%又は0.5%である。

0014

(4)酵素のポリペプチド分子量が60〜70kDaである。好ましくは、65〜70kDaである。酵素のポリペプチドの分子量とは、糖鎖を除去したタンパク質部分をSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で分子量を測定した場合の分子量のことである。SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による酵素全体の分子量については、培養条件や精製条件等により、糖鎖付加量が変われば分子量は異なり、組換え酵素においてはその宿主等によっても糖鎖の有無や糖付加量が変わり、分子量は異なってくる。

0015

本発明のポリヌクレオチドは、下記(i)、(ii)、(iii)、(iv)又は(v)からなる。
(i)前記(a)、(b)及び(c)に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。(ii)配列番号1に示される塩基配列を有するポリヌクレオチド。
(iii)配列番号1に示される塩基配列において1又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を有し、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。変異数は、好ましくは多くとも10個、8個、5個、3個又は2個である。
(iv)配列番号1に示される塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(v)配列番号1に示される塩基配列と少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%又は99%の同一性を有し、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。

0016

本発明において、ハイブリダイズに際しての「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ」の具体的な条件とは、例えば、50%ホルムアミド、5×SSC(150mM塩化ナトリウム、15mMクエン酸三ナトリウム、10mMリン酸ナトリウム、1mMエチレンジアミン四酢酸、pH7.2)、5×デンハート(Denhardt’s)溶液、0.1% SDS、10%デキストラン硫酸及び100μg/mLの変性サケ精子DNAで42℃インキュベーションした後、フィルターを0.2×SSC中42℃で洗浄することを例示することができる。

0017

類似性は、GENETYX(ゼネティックス社製)のアミノ酸配列同士のホモロジー解析により算出されたSimilarityの値に基づく。
同一性は、GENETYX(ゼネティックス社製)の塩基配列同士又はアミノ酸配列同士のホモロジー解析により算出されたidentityの値に基づく。

0018

本発明のポリヌクレオチドは、配列番号2又は3記載のアミノ酸配列を用いて、機能未知の公開配列に対して例えばBLAST(blastp又はtblastn)等のホモロジー検索を行い、同一性が少なくとも55%、好ましくは少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%又は98%の同一性でヒットしたアミノ酸配列をコードする遺伝子配列を利用することができる。具体的には、該公開配列から全長配列を合成して利用できる。又は、該公開配列からプライマーデザインし、該公開配列の由来株のDNA又はRNAを鋳型としてPCR又はRT−PCRにより増幅して得ることができる。更に増幅して得たポリヌクレオチドを用いて常法により組換えタンパク質を得て、グルコース脱水素酵素活性を確認することができ、グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであれば良い。DNA又はRNAは、公開配列の由来株と同種又は同属の株からも得ることができる。更に、それらの方法で取得したポリヌクレオチドを一部改変したポリヌクレオチドであって、グルコース脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドも、本発明のポリヌクレオチドである。本発明のポリヌクレオチドは、染色体DNAでも良く、cDNAでも良い。

0019

本発明の組換えベクターは、クローニングベクター又は発現ベクターであり、ベクターは適宜選択し、インサートとして本発明のポリヌクレオチドを含む。インサートとしては、宿主細胞に対応して、コドンユーセージを最適化したポリヌクレオチドを導入しても良い。更に、宿主が原核細胞の場合は、イントロンを含まない遺伝子を用いる。真核細胞の場合、イントロンを含んだ遺伝子でも良い。終止コドンを宿主に最適な終止コドンに置換することで組換えタンパク質の発現量を向上させても良い。インサート側に開始コドンを含まない場合は、インサート側に開始コドンを付加するか、又はベクター側の開始コドンを利用して、融合タンパク質として発現するベクターを選択しても良い。発現ベクターとしては、原核細胞発現用ベクター又は真核細胞発現用ベクターの何れでも良い。尚、必要に応じて、シャペロンリゾチームなどの発現に寄与するポリヌクレオチドを、本発明のポリヌクレオチドと同一及び/又は別のベクターに導入することも可能である。更に、Hisタグ、FLAGタグ、GFPなど各種タグを付加した融合蛋白質として発現できるベクターを使用して、本発明のグルコース脱水素酵素を発現しても良い。

0020

配列番号1のような分泌シグナル配列をコードする配列を含むグルコース脱水素酵素遺伝子を用いて、大腸菌などのグラム陰性菌で組換えタンパク質を発現させる場合は、組換えタンパク質がペリプラズム移行されるため、生産性が悪い。そのため、組換えタンパク質を効率よく回収したい場合は、シグナル配列をコードする遺伝子配列を削除した配列を用いるのが良い。特にグラム陰性菌の場合、イントロンを含まずシグナル配列をコードする配列を含まないポリヌクレオチド、例えば配列番号3に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドに開始コドンATGを付加したポリヌクレオチドが好ましい。発現ベクターとしては、pUC系、pBluescriptII、pET発現システム、pGEX発現システム、pCold発現システムなどが例示できる。

0021

一方、真核細胞で発現させて生産させる場合には、配列番号1のような分泌シグナル配列をコードする配列を含むグルコース脱水素酵素遺伝子全体をベクターに挿入すれば良い。又は、シグナル配列をコードする配列を、例えば宿主に適切な配列に置換したポリヌクレオチドでも良い。更に、ベクター側のシグナル配列をコードする配列を利用しても良い。発現ベクターとしては、pKA1、pCDM8、pSVK3、pSVL、pBK-CMV、pBK-RSV、EBVベクター、pRS、pYE82などが例示できる。

0022

分泌シグナル配列は、例えば国際公開2006/101239に記載のアスペルギルステレウス由来グルコース脱水素酵素配列のシグナル配列(該公報の配列番号2の1〜19に示されるアミノ酸配列)と比較することで推測できる。更に、シグナル配列予測イト(例:Signal P:http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)を用いても推測できる。例えば、配列番号2では1から20アミノ酸までのMSFSRSLLVTLTAASSALGをシグナル配列と推測できる。

0023

本発明の形質転換細胞としては、例えば、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、真菌酵母アスペルギルス属などの子嚢菌担子菌等)、昆虫細胞哺乳動物細胞等の真核細胞等を使用することができ、本発明のベクターで形質転換させて得ることができる。前記ベクターを、プラスミドのような状態で形質転換細胞内に維持しても良く、染色体中に組み込ませて維持しても良い。更に、糖鎖の要、不要、その他のペプチド修飾の必要性に応じて、適宜宿主は選択することができるが、糖鎖付加可能な宿主を選択し、糖鎖を有する酵素を製造することが好ましい。

0024

本発明の形質転換細胞を培養して得られた培養物からグルコース脱水素酵素を採取することによって、組換えグルコース脱水素酵素を製造することができる。

0025

本発明で使用されるグルコース脱水素酵素生産菌の培養には、通常の微生物培養用培地が使用できる。例えば、炭素源窒素源ビタミン類無機物、その他使用する微生物が必要とする微量栄養素を程よく含有するものであれば、合成培地天然培地の何れでも使用可能である。炭素源としては、グルコース、スクロースデキストリン澱粉グリセリン及び糖蜜等が使用できる。窒素源としては、塩化アンモニウム硝酸アンモニウム硫酸アンモニウム及びリン酸アンモニウム等の無機塩類、DL−アラニン及びL−グルタミン酸等のアミノ酸類、並びに、ペプトン肉エキス酵母エキス麦芽エキス及びコーンスティープリカー等の窒素含有天然物が使用できる。無機物としては、リン酸一ナトリウムリン酸二ナトリウムリン酸一カリウムリン酸二カリウム硫酸マグネシウム及び塩化第二鉄等が使用できる。

0026

本発明のグルコース脱水素酵素を得るための培養は、通常、振盪培養通気攪拌等の方法による好気的条件下で行うのが良い。グルコース脱水素酵素生産菌の特性を踏まえて、グルコース脱水素酵素の生産に適した培養条件に設定すれば良い。例えば、培養温度は20℃から50℃、かつpH4からpH8の範囲で行うのが好ましく、生産性を考慮して培養中にpH調整をしても良い。培養期間は、2日から10日の範囲が好ましい。この様な方法で培養することにより、培養物中にグルコース脱水素酵素を生成蓄積することができる。

0027

培養物中からグルコース脱水素酵素を得る方法は、通常のタンパク質の製造方法が利用できる。例えば、最初にグルコース脱水素酵素生産菌を培養後、遠心分離により培養上清液を得る。又は培養菌体を得、適当な方法で該培養微生物破砕し、破砕液から遠心分離等によって上清液を得る。次に、これらの上清液中に含まれるグルコース脱水素酵素を、通常のタンパク質の精製方法で精製し、精製酵素を得ることができる。例えば、限外ろ過塩析溶媒沈殿熱処理透析イオン交換クロマトグラフィー疎水性クロマトグラフィーゲルろ過アフィニティークロマトグラフィー等の精製操作を組み合わせることによって精製できる。

0028

本発明のグルコース脱水素酵素を用いて、グルコースを測定することができる。本発明のグルコース測定方法は、グルコースを含む被検試料と本発明のグルコース脱水素酵素とを接触させる工程を含むことにより、被検試料中のグルコースを定量できる。本発明の測定対象は特に限定されないが、例えば生体試料が例示でき、具体例として血液試料が例示できる。本発明の酵素は、特に血糖測定に有用である。本発明の酵素は基質特異性が高いため、グルコース濃度の測定において、試料中の他の糖類の影響を受け難く、精度の高い測定が可能である。

0029

本発明は、本発明のグルコース脱水素酵素を用いてグルコース測定試薬組成物を製造する製造方法又はグルコース測定用バイオセンサを製造する製造方法を提供する。本発明の酵素は基質特異性が高いため、測定試料中の他の糖類の影響を受け難く、測定精度の高い試薬組成物又はバイオセンサが提供できる。

0030

本発明の試薬組成物は、酵素として本発明のグルコース脱水素酵素を含む試薬組成物であれば良い。該組成物中の酵素量は、測定対象を測定できれば特に限定されないが、0.05から50U程度が好ましく、0.1から20U程度がより好ましい。該組成物は、安定化剤又は緩衝剤等の当業者に公知の他の任意成分を適宜含有させ、該酵素や試薬成分熱安定性や保存安定性を高めても良い。前記成分としては、牛血清アルブミンBSA)若しくは卵白アルブミン、該酵素と作用性のない糖類若しくは糖アルコール類カルボキシル基含有化合物アルカリ土類金属化合物アンモニウム塩硫酸塩又はタンパク質等を例示できる。更に、被験試料中に存在する、測定に影響を与える夾雑物質の影響を抑える公知の物質を、該測定試薬に含ませても良い。

0031

本発明のバイオセンサは、酵素として本発明のグルコース脱水素酵素を含むセンサであれば良い。例えば、電気化学式バイオセンサは、絶縁性基板上にスクリーン印刷蒸着等の方法を利用して対極及び作用極を備える電極系を形成し、更に該酵素とメディエータとを備えることによって作製される。メディエータは、ヘム等の蛋白質電子メディエータや、フェリシアン化化合物キノン系化合物オスミウム系化合物、フェナジン系化合物フェノチアジン系化合物等が例示できる。この他に、イオン変化発色強度又はpH変化等を検知する方式のバイオセンサも構築可能である。

0032

更に本発明のグルコース脱水素酵素は、バイオ電池に用いることができる。本発明のバイオ電池は、酸化反応を行うアノード極及び還元反応を行うカソード極から構成され、必要に応じてアノードカソードを隔離する電解質層を含んで構成される。上記の電子メディエータ及びグルコース脱水素酵素を含む酵素電極アノード電極に使用し、基質を酸化することによって生じた電子電極に取り出すと共に、プロトンを発生させる。一方、カソード側には、一般的にカソード電極に使用される酵素を使用すれば良く、例えばラッカーゼアスコルビン酸オキシダーゼ又はビリルビンオキシダーゼを使用し、アノード側で発生させたプロトンを酸素と反応させることによって水を生成させる。電極としては、カーボン、金、白金等、一般的にバイオ電池に使用される電極を用いることができる。

0033

本酵素の活性測定においては、該酵素を、好ましくは終濃度0.15−0.6U/mLになるように適宜希釈して用いる。尚、該酵素の酵素活性単位(U)は1分間に1μmolのグルコースを酸化する酵素活性である。本発明のグルコース脱水素酵素の酵素活性は、次の方法で測定できる。

0034

(グルコース脱水素酵素(GLD)活性測定法
100mMリン酸カリウム緩衝液(pH6.0)1.00mL、1M D−グルコース溶液1.00mL、3mM 2,6−ジクロロフェノールインドフェノール(以下DCIPという)0.14mL及び3mM 1−メトキシ−5−メチルフェナジウムメチルサルフェイト0.20mL及び超純水0.61mLを混合し、37℃で10分間保温後、酵素溶液0.05mLを添加し、反応を開始した。反応開始時から5分間、酵素反応の進行に伴う600nmにおける吸光度の1分間あたりの減少量(ΔA600)を測定し、直線部分から次式に従い酵素活性を算出した。この際、酵素活性は、37℃、pH6.0で1分間に1μmolのDCIPを還元する酵素量を1Uと定義した。

0035

グルコース脱水素酵素(GLD)活性(U/mL)=(−(ΔA600−ΔA600blank)×3.0×酵素の希釈倍率)/(10.8×1.0×0.05)
尚、式中の3.0は反応試薬+酵素溶液の液量(mL)、10.8はpH6.0におけるDCIPのモル吸光係数、1.0はセル光路長(cm)、0.05は酵素溶液の液量(mL)、ΔA600blankは酵素の希釈溶液を酵素溶液の代わりに添加して反応開始した場合の600nmにおける吸光度の1分間あたりの減少量を表す。

0036

以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例によって限定されるものではない。

0037

[実施例1]
(フラビン結合型グルコース脱水素酵素(GLD)の取得)
自然界から分離した菌株からGLD生産菌の探索を行った結果、培養上清にGLD活性がみられた菌株が確認できた。このGLD生産菌由来のグルコース脱水素酵素のクローニングを行った。

0038

(1)菌体培養
パイデックス(化学工業社製)4%(w/v)、脱脂大豆(昭和産業社製)1%(w/v)、コーンスティープリカー(サンエイ糖化社製)1%(w/v)、リン酸二水素カリウムナカライテスク社製)0.5%(w/v)、硫酸マグネシウム七水和物(ナカライテスク社製)0.05%(w/v)及び水からなる液体培地をpH6.0に調整し、10mLを太試験管に入れ、121℃、20分間オートクレーブした。冷却した液体培地に、前記GLD生産菌を接種し、25℃で72時間振とう培養した後、さらしを用いて、湿菌体を回収した。

0039

(2)全RNAの単離
(1)で取得した湿菌体200mgを−80℃で凍結した後、ISOGENII(ニッポンジーン社製)を用いて100μgの全RNAを抽出した。

0040

(3)cDNAライブラリーの調製
(2)で取得したRNAから、逆転写酵素およびアダプター配列付きオリゴdTプライマーを用いた逆転写反応によりcDNAライブラリーを調製した。反応試薬は、「SMARTer RACE cDNA Amplification kit」(タカラバイオ社製)を使用し、反応条件説明書記載のプロトコールに準じて行った。

0041

(4)GLD遺伝子のクローニング
(3)で取得したcDNAライブラリーを鋳型とし、GLD遺伝子取得用プライマー対を用いてPCRを行った。その結果、GLD遺伝子の内部配列と思われるPCR産物が確認された。尚、前記プライマー対は、本発明者らによって既に解明されていた複数のGLD配列を基に、種々のGLD遺伝子取得用に設計したプライマーである。前記PCR産物を精製し、DNA Ligation Kit(タカラバイオ社製)を用いて、T−vector PMD20(タカラバイオ社製)にライゲーションした。

0042

得られたプラスミドベクターを用い、公知の方法で大腸菌JM109コンピテントセル(タカラバイオ社製)を形質転換した。得られた形質転換体からNucleoSpin Plasmid QuickPure(タカラバイオ社製)を用いてプラスミドベクターを抽出・精製し、インサートの塩基配列を決定した。決定した塩基配列を基に、GLD遺伝子の上流及び下流配列を解明するためのプライマーを設計した。これらのプライマーを用いて5’RACE法及び3’RACE法によって、GLD遺伝子全長を解明した。

0043

GLD遺伝子配列を配列番号1に示した。更に、当該遺伝子配列より予測したアミノ酸配列を配列番号2に示した。配列番号3は、配列番号2の配列について、SignalP4.1で予測したシグナル部分を除いた配列である。

0044

(5)GLD遺伝子を含む発現用プラスミドベクターの調製
公知文献1(Aspergillus属の異種遺伝子発現系、時俊貴、化学と生物、38、12、831−838、2000)に記載してあるアスペルギルス・オリゼ由来のアミラーゼ系の改良プロモーターを使用してプラスミドベクターを調製した。最初に、(3)で取得したcDNAライブラリーを鋳型とし、GLD遺伝子を含むPCR産物を取得した。下記のF5126−Ori(配列番号4)及びF5126−R−1st(配列番号5)のプライマー対を使用した。次に、前記PCR産物を鋳型とし、ベクター挿入用のGaGLD遺伝子を調製した。下記のF5126−Ori(配列番号4)及びF5126−R−2nd(配列番号6)のプライマー対を使用した。

0045

最終的に、前記プロモーターの下流に調製したGLD遺伝子を結合させて、該遺伝子が発現可能なプラスミドベクターを作製した。作製した発現用プラスミドベクターを大腸菌JM109株に導入して形質転換した。得られた形質転換体を培養して、集菌した菌体から、illustra plasmidPrep Midi Flow Kit(GEヘルスケア社製)を用いてプラスミドベクターを抽出した。該プラスミドベクター中のインサートの配列解析を行ったところ、GLD遺伝子を含む塩基配列が確認できた。

0046

F5126−Ori(配列番号4):
5’−(CCGCAGCTCGTCAAA)ATGTCGTTCTCTCGCTCGTC−3’
括弧内:転写増強因子
F5126−R−1st(配列番号5):
5’−((GTTCATTTA))GACCTGGCTCTTGATGATATCAGCC−3’
(二重括弧内:pSENベクター配列)
F5126−R−2nd(配列番号6):
5’−((GTTACGCTTCTAGAGCATGCGTTCATTTA))GACCTGGCTC−3’
(二重括弧内:pSENベクター配列、下線部:制限酵素部位(SphI))

0047

(6)形質転換体の取得
(5)で抽出したプラスミドベクターを用いて、公知文献2(Biosci. Biotech. Biochem.,61(8),1367−1369,1997)及び公知文献3(清酒麹菌遺伝子操作技術、五味勝也、醸協、494−502、2000)に記載の方法に準じて、GLDを生産する組換えカビ(アスペルギルス・オリゼ)を作製した。得られた組換え株をCzapek−Dox固体培地純化した。使用する宿主としては、アスペルギルス・オリゼNS4株を使用した。本菌株は、公知文献2にあるように、1997年(平成9年)に醸造試験所育種され、現在は、独立行政法人酒類総合研究所で分譲されているものが入手可能である。

0048

(7)組換えカビ由来GLDの確認
パインデックス(松谷化学工業社製)4%(w/v)、脱脂大豆(昭和産業社製)1%(w/v)、コーンスティープリカー(サンエイ糖化社製)1%(w/v)、リン酸二水素カリウム(ナカライテスク社製)0.5%(w/v)、硫酸マグネシウム七水和物(ナカライテスク社製)0.05%(w/v)及び水からなる液体培地をpH7.0に調整し、10mLを太試験管(22mm×200mm)に入れ、121℃、20分間オートクレーブした。冷却した液体培地に、(6)で取得した形質転換体を植菌し、30℃で3日間振とう培養した。培養終了後、遠心して上清を回収し、前述のGLD活性測定法でGLD活性を測定したところ、本発明のGLD活性が確認できた。

0049

(8)GLDの精製
(7)に記載の液体培地150mLを500mL容の坂口フラスコに入れ、121℃、20分間オートクレーブした。冷却した液体培地に、(6)で取得した形質転換体を植菌し、30℃で3日間振とう培養して種培養液とした。前記と同様の培地組成クロラムフェニコール(ナカライテスク社製)0.005%(w/v)、消泡剤を添加した培地3.5Lを5L容ジャーファーメンターに入れ、121℃、30分間オートクレーブした。冷却した液体培地に、前記種培養液を50mL植菌し、30℃、400rpm、1v/v/mで4日間培養した。培養終了後、培養液ろ布でろ過し、回収したろ液を遠心して上清を回収し、更にメンブレンフィルター(10μm、アドバンテック社製)でろ過して培養上清を回収した。

0050

回収した培養上清について、Cellufine A−500(JNC社製)カラム及びTOYOPEARLButyl−650C(東ソー社製)カラムを用いて夾雑蛋白を除去して精製した。精製サンプル分画分子量8,000の限外ろ過膜濃縮後、水置換し、精製GLDとした。該精製GLDをSDS−ポリアクリルアミド電気泳動に供したところ、単一バンドを示すことを確認した。

0051

[実施例2]
(本発明のGLDの酵素化学的性質の検討)
実施例1で得られた精製GLDの諸性質を調べた。
(1)吸収スペクトルの測定
実施例1で得られたGLDについて、D−グルコース添加前後の200−700nmにおける吸収スペクトルをプレートリーダー(SpectraMax Plus384、モレキュラーデバイス社製)を用いて測定した。その結果、波長360−380nm付近及び波長450−460nm付近に認められた吸収極大が、D−グルコース添加により消失したことから、本発明のGLDはフラビン結合型タンパク質であることが明らかになった。

0052

(2)グルコース酸化酵素(GOD)活性の測定
1Mリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)0.2mL、1M D−グルコース2.0mL、25mM4−アミノアンチピリン0.2mL、420mMフェノール0.2mL、1mg/mLペルオキシダーゼ0.2mL及び超純水0.2mLを混合し、混合液0.1mLを96穴プレートに入れ、25℃で5分間保温した。実施例1で得られたGLD0.1mLを添加し、反応を開始した。反応開始時から5分間、酵素反応の進行に伴う500nmにおける吸光度変化を前記プレートリーダーで測定し、GOD活性を調べた。尚、コントロールは、GLDの代わりに水を添加して反応を開始した。その結果、GLDはコントロールと同様に吸光度変化は見られなかった。

0053

よって、本発明のGLDは酸素を電子受容体として利用しないため、D−グルコースを定量する際に反応系の溶存酸素の影響を受けにくいことが示された。

0054

(3)基質特異性
前記GLD活性測定法に準じ、基質に終濃度50mMのD−グルコース、マルトース、D−キシロース又はD−ガラクトースをそれぞれ用いて、各基質に対する各GLDの活性を測定した。結果を表1に示す。

0055

0056

本発明のGLDは、D−グルコースに対する活性を100%とした場合に、マルトース、D−キシロース又はD−ガラクトースに対する活性は0.3%、0.4%又は0.1%であり、何れも1.0%以下だった。

実施例

0057

[実施例3]
(本発明のGLDによるグルコースの測定)
実施例1で得られたGLDを用いて、前記GLD活性測定法に準じ、20、40、50及び60mM D−グルコースにおける、吸光度変化を測定した。各グルコース濃度における相対活性値図1に示す。その結果、本発明のGLDでD−グルコースの定量が可能であることが示された。

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