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図面 (2)

課題

殺虫性タンパク質をコードするDNAを含むトランスジェニック植物の提供。

解決手段

フォールアーミーワーム昆虫防除するため、昆虫による抵抗性発達を遅らせるか阻止するためのトランスジェニック植物であり、Cry1Da殺虫性タンパク質およびCry1Be殺虫性タンパク質をコードするDNAを含む、ならびにCry1Fa、Vip3Ab、Cry1CaおよびCry1Eからなる群から選択される第三のコア毒素含有タンパク質をコードするDNAをさらに含む。

概要

背景

人は、食物用途およびエネルギー用途のためにトウモロコシ栽培する。人は、ダイズ
およびワタを含む他の多くの作物も栽培する。昆虫は、植物を食べて損害を与え、それに
よってこれらの人の努力を台無しにする。害虫防除するために毎年何10億ドルも費や
され、害虫が与える損害に対してさらに数10億ドルが失われる。合成有機化学殺虫剤
、害虫を防除するために用いられる主な手段であったが、バチルスチューリンゲンシス
(Bacillus thuringiensis)(Bt)に由来する殺虫性タンパク質などの生物殺虫剤が一
部の領域である重要な役割を演じている。Bt殺虫性タンパク質遺伝子による形質転換
通して昆虫抵抗性植物を作出する能力により現代農業革新されて、殺虫性タンパク質お
よびその遺伝子の重要性および価値が高まっている。

今日までに首尾よく登録され商品化に至った昆虫抵抗性のトランスジェニック植物を作
製するために、数種のBtタンパク質が用いられてきた。このBtタンパク質としては、
トウモロコシのCry1Ab、Cry1Ac、Cry1FおよびCry3Bb、ワタのC
ry1AcおよびCry2Ab、ならびにジャガイモのCry3Aが挙げられる。

これらのタンパク質を発現する市販製品は、2種のタンパク質の組合殺虫スペクトル
が所望される場合(例えば、それぞれ鱗翅目害虫およびルートワームへの抵抗性を付与す
るために組み合わされた、トウモロコシのCry1AbおよびCry3Bb)、または2
種のタンパク質のそれぞれ独立した作用により、これらのタンパク質が感受性昆虫集団
の抵抗性の発達を遅らせるための手段として有用となる場合(例えば、オオタバコガのた
めの抵抗対応を付与するために組み合わされた、ワタのCry1AcおよびCry2Ab
)を除いて、単一のタンパク質しか発現しない。ヘリベルパ・ゼア(Helicoverpa zea
)またはヘリコベルパ・アーゲライン(Helicoverpa armigerain)の防除のためのCr
y2タンパク質+Vip3Aa、Cry1FまたはCry1Aに関する米国特許出願公開
第2009/0313717号も参照されたい。国際公開第2009/132850号は
スポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)を防除するためのCry1F
またはCry1AおよびVip3Aaに関する。米国特許出願公開第2008/0311
096号は、Cry1F抵抗性のECBを防除するためのCry1Abに一部関する。

すなわち、昆虫抵抗性トランスジェニック植物の特質のいくつかは、この技術の急速で
広範囲な採用をもたらし、これらの植物によって生成される殺虫性タンパク質に対する抵
抗性有害生物集団が発達させるという懸念も生む。高用量のタンパク質を、緩衝帯と組
み合わせて利用すること、及び異なる毒素と交互にまたは同時利用で利用することを含む
、Bt系昆虫抵抗性形質有用性を維持するためのいくつかの戦略が提案されている(Mc
Gaughey et al. (1998), "B.t. Resistance Management," Nature Biotechnol. 16:144-1
46)。

あるタンパク質に対して発達した抵抗性が別のタンパク質に対する抵抗性を付与しない
(すなわち、これらタンパク質に対する交差抵抗性がない)ように、昆虫抵抗性対応(I
RM)スタックで用いるために選択されるタンパク質は、それらの殺虫効果を独立して発
揮する必要がある。例えば、「タンパク質A」に対する抵抗性について選択した有害生物
集団が「タンパク質B」に感受性である場合、そこには交差抵抗性がなく、タンパク質A
およびタンパク質Bの組合せがタンパク質A単独に対する抵抗性を遅らせるのに有効であ
ろうと結論付けられるであろう。

抵抗性な昆虫集団が存在しない場合、作用機構および交差抵抗性能力に関連すると推測
される他の特性に基づいて評価を行うことができる。受容体媒介結合が交差抵抗性を示す
可能性のない殺虫性タンパク質を同定するのに有用であることが示唆されている(van Me
llaert et al. 1999)。この手法に特有の交差抵抗性の欠如の重要な予測因子は、殺虫性
タンパク質が感受性昆虫種の受容体をめぐって競合しないことである。

2つのBt毒素が同じ受容体をめぐって競合する場合には、その受容体がその昆虫で突
然変異して毒素の1つがその受容体にもはや結合せず、よって昆虫に対してもはや殺虫性
でないならば、昆虫は別の毒素(同じ受容体に競合的に結合する)にも抵抗性になる場合
もあり得る。すなわち、昆虫は両方のBt毒素に交差抵抗性であると言われる。しかし、
2つの毒素が2つの異なる受容体に結合する場合には、これは昆虫がそれら2つの毒素に
同時に抵抗性にならないことを示す指標であろう。

例えば、Cry1Faタンパク質は、ユーロピアコーンボーラー(ECB;オストリ
ニア・ヌビラリス(Ostrinia nubilalis)(Huebner))およびFAWを含む多く
の鱗翅目害虫の種の防除で有用であり、シュガーケーンボーラー(SCB;ジアトラエア
サッカラリス(Diatraea saccharalis))に対する活性を有する。事象TC1507を
含むトランスジェニックトウモロコシ植物で生成されるようなCry1Faタンパク質は
、FAW防除のための業界をリードする昆虫抵抗性形質を担う。Cry1Faは、Her
culex(登録商標)、SmartStax(商標)およびWideStrike(商
標)製品でさらに利用されている。

受容体結合性アッセイでの検出のためのタンパク質を標識するのに利用できる最も一般
的な技術がCry1Faタンパク質の殺虫活性不活性化するので、Cry1Faタンパ
ク質を用いる(競合的または相同的)受容体結合性試験を行う能力は制限される。

さらなるCry毒素は、公式なB.t.命名委員会ウェブサイト(Crickmore et al.
; lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/)に記載されている。ほぼ60個の主
要群の「Cry」毒素(Cry1〜Cry59)が現在あり、さらなるCyt毒素および
VIP毒素などがある。数字で表した各群の多くは大文字サブグループを有し、大文字
のサブグループは小文字のサブサブグループを有する。(例えば、Cry1はA〜Lを有
し、Cry1Aはa〜iを有する)。

概要

殺虫性タンパク質をコードするDNAを含むトランスジェニック植物の提供。フォールアーミーワーム昆虫を防除するため、昆虫による抵抗性の発達を遅らせるか阻止するためのトランスジェニック植物であり、Cry1Da殺虫性タンパク質およびCry1Be殺虫性タンパク質をコードするDNAを含む、ならびにCry1Fa、Vip3Ab、Cry1CaおよびCry1Eからなる群から選択される第三のコア毒素含有タンパク質をコードするDNAをさらに含む。なし

目的

一部の好ましいピラミッドの実
施形態では、選択される毒素の組合せは、FAWに対して3つの作用部位を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

この技術が所属する分野

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請求項1

Cry1Da殺虫性タンパク質をコードするDNAおよびCry1Be殺虫性タンパク質をコードするDNAを含むトランスジェニック植物

請求項2

Cry1Fa、Vip3Ab、Cry1CaおよびCry1Eからなる群から選択される第三のコア毒素含有タンパク質をコードするDNAをさらに含む、請求項1に記載のトランスジェニック植物。

請求項3

Cry1Faタンパク質をコードするDNAと、Cry2A、Cry1I、DIG−3およびCry1Abからなる群から選択される第四のタンパク質をコードするDNAとをさらに含む、請求項2に記載のトランスジェニック植物。

請求項4

請求項1から3のいずれかに記載の植物の種子。

請求項5

非Bt緩衝帯植物および請求項1〜3のいずれかに記載の複数の植物を備える植物の圃場であって、前記緩衝帯植物は前記圃場の全ての作物植物の40%未満を構成する、圃場。

請求項6

前記緩衝帯植物が前記圃場の全ての作物植物の30%未満を構成する、請求項5に記載の植物の圃場。

請求項7

前記緩衝帯植物が前記圃場の全ての作物植物の20%未満を構成する、請求項5に記載の植物の圃場。

請求項8

前記緩衝帯植物が前記圃場の全ての作物植物の10%未満を構成する、請求項5に記載の植物の圃場。

請求項9

前記緩衝帯植物が前記圃場の全ての作物植物の5%未満を構成する、請求項5に記載の植物の圃場。

請求項10

前記緩衝帯植物がブロックまたは帯状地にある、請求項5に記載の植物の圃場。

請求項11

非Bt緩衝帯植物からの緩衝帯種子および請求項4に記載の複数の種子を含む種子混合物であって、前記緩衝帯種子は混合物の全ての種子の40%未満を構成する、種子混合物。

請求項12

前記緩衝帯種子が混合物の全ての種子の30%未満を構成する、請求項11に記載の種子混合物。

請求項13

前記緩衝帯種子が混合物の全ての種子の20%未満を構成する、請求項11に記載の種子混合物。

請求項14

前記緩衝帯種子が混合物の全ての種子の10%未満を構成する、請求項11に記載の種子混合物。

請求項15

前記緩衝帯種子が混合物の全ての種子の5%未満を構成する、請求項11に記載の種子混合物。

請求項16

種子を播いて請求項5に記載の植物の圃場を作製することを含む、昆虫によるCry毒素への抵抗性発達に対応する方法。

請求項17

前記植物が10エーカーよりも多くを占める、請求項1から3のいずれかに記載の圃場。

請求項18

トウモロコシダイズおよびワタからなる群から選択される、請求項1から3のいずれかに記載の植物。

請求項19

メイズ植物である、請求項18に記載の植物。

請求項20

前記植物細胞が、前記Cry1Be殺虫性タンパク質をコードするDNAおよび前記Cry1Da殺虫性タンパク質をコードするDNAを含み、前記Cry1Be殺虫性タンパク質が配列番号1と少なくとも99%同一であり、前記Cry1Da殺虫性タンパク質が配列番号2と少なくとも99%同一である、請求項1から3のいずれかに記載の植物の植物細胞。

請求項21

前記Cry1Be殺虫性タンパク質が配列番号1を含み、前記Cry1Da殺虫性タンパク質が配列番号2を含む、請求項1から3のいずれかに記載の植物。

請求項22

請求項20に記載の植物細胞を生成する方法。

請求項23

フォールアーミーワーム昆虫をCry1Be殺虫性タンパク質およびCry1Da殺虫性タンパク質と接触させることによって前記昆虫を防除する方法。

背景技術

0001

人は、食物用途およびエネルギー用途のためにトウモロコシ栽培する。人は、ダイズ
およびワタを含む他の多くの作物も栽培する。昆虫は、植物を食べて損害を与え、それに
よってこれらの人の努力を台無しにする。害虫防除するために毎年何10億ドルも費や
され、害虫が与える損害に対してさらに数10億ドルが失われる。合成有機化学殺虫剤
、害虫を防除するために用いられる主な手段であったが、バチルスチューリンゲンシス
(Bacillus thuringiensis)(Bt)に由来する殺虫性タンパク質などの生物殺虫剤が一
部の領域である重要な役割を演じている。Bt殺虫性タンパク質遺伝子による形質転換
通して昆虫抵抗性植物を作出する能力により現代農業革新されて、殺虫性タンパク質お
よびその遺伝子の重要性および価値が高まっている。

0002

今日までに首尾よく登録され商品化に至った昆虫抵抗性のトランスジェニック植物を作
製するために、数種のBtタンパク質が用いられてきた。このBtタンパク質としては、
トウモロコシのCry1Ab、Cry1Ac、Cry1FおよびCry3Bb、ワタのC
ry1AcおよびCry2Ab、ならびにジャガイモのCry3Aが挙げられる。

0003

これらのタンパク質を発現する市販製品は、2種のタンパク質の組合殺虫スペクトル
が所望される場合(例えば、それぞれ鱗翅目害虫およびルートワームへの抵抗性を付与す
るために組み合わされた、トウモロコシのCry1AbおよびCry3Bb)、または2
種のタンパク質のそれぞれ独立した作用により、これらのタンパク質が感受性昆虫集団
の抵抗性の発達を遅らせるための手段として有用となる場合(例えば、オオタバコガのた
めの抵抗対応を付与するために組み合わされた、ワタのCry1AcおよびCry2Ab
)を除いて、単一のタンパク質しか発現しない。ヘリベルパ・ゼア(Helicoverpa zea
)またはヘリコベルパ・アーゲライン(Helicoverpa armigerain)の防除のためのCr
y2タンパク質+Vip3Aa、Cry1FまたはCry1Aに関する米国特許出願公開
第2009/0313717号も参照されたい。国際公開第2009/132850号は
スポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)を防除するためのCry1F
またはCry1AおよびVip3Aaに関する。米国特許出願公開第2008/0311
096号は、Cry1F抵抗性のECBを防除するためのCry1Abに一部関する。

0004

すなわち、昆虫抵抗性トランスジェニック植物の特質のいくつかは、この技術の急速で
広範囲な採用をもたらし、これらの植物によって生成される殺虫性タンパク質に対する抵
抗性有害生物集団が発達させるという懸念も生む。高用量のタンパク質を、緩衝帯と組
み合わせて利用すること、及び異なる毒素と交互にまたは同時利用で利用することを含む
、Bt系昆虫抵抗性形質有用性を維持するためのいくつかの戦略が提案されている(Mc
Gaughey et al. (1998), "B.t. Resistance Management," Nature Biotechnol. 16:144-1
46)。

0005

あるタンパク質に対して発達した抵抗性が別のタンパク質に対する抵抗性を付与しない
(すなわち、これらタンパク質に対する交差抵抗性がない)ように、昆虫抵抗性対応(I
RM)スタックで用いるために選択されるタンパク質は、それらの殺虫効果を独立して発
揮する必要がある。例えば、「タンパク質A」に対する抵抗性について選択した有害生物
集団が「タンパク質B」に感受性である場合、そこには交差抵抗性がなく、タンパク質A
およびタンパク質Bの組合せがタンパク質A単独に対する抵抗性を遅らせるのに有効であ
ろうと結論付けられるであろう。

0006

抵抗性な昆虫集団が存在しない場合、作用機構および交差抵抗性能力に関連すると推測
される他の特性に基づいて評価を行うことができる。受容体媒介結合が交差抵抗性を示す
可能性のない殺虫性タンパク質を同定するのに有用であることが示唆されている(van Me
llaert et al. 1999)。この手法に特有の交差抵抗性の欠如の重要な予測因子は、殺虫性
タンパク質が感受性昆虫種の受容体をめぐって競合しないことである。

0007

2つのBt毒素が同じ受容体をめぐって競合する場合には、その受容体がその昆虫で突
然変異して毒素の1つがその受容体にもはや結合せず、よって昆虫に対してもはや殺虫性
でないならば、昆虫は別の毒素(同じ受容体に競合的に結合する)にも抵抗性になる場合
もあり得る。すなわち、昆虫は両方のBt毒素に交差抵抗性であると言われる。しかし、
2つの毒素が2つの異なる受容体に結合する場合には、これは昆虫がそれら2つの毒素に
同時に抵抗性にならないことを示す指標であろう。

0008

例えば、Cry1Faタンパク質は、ユーロピアコーンボーラー(ECB;オストリ
ニア・ヌビラリス(Ostrinia nubilalis)(Huebner))およびFAWを含む多く
の鱗翅目害虫の種の防除で有用であり、シュガーケーンボーラー(SCB;ジアトラエア
サッカラリス(Diatraea saccharalis))に対する活性を有する。事象TC1507を
含むトランスジェニックトウモロコシ植物で生成されるようなCry1Faタンパク質は
、FAW防除のための業界をリードする昆虫抵抗性形質を担う。Cry1Faは、Her
culex(登録商標)、SmartStax(商標)およびWideStrike(商
標)製品でさらに利用されている。

0009

受容体結合性アッセイでの検出のためのタンパク質を標識するのに利用できる最も一般
的な技術がCry1Faタンパク質の殺虫活性不活性化するので、Cry1Faタンパ
ク質を用いる(競合的または相同的)受容体結合性試験を行う能力は制限される。

0010

さらなるCry毒素は、公式なB.t.命名委員会ウェブサイト(Crickmore et al.
; lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/)に記載されている。ほぼ60個の主
要群の「Cry」毒素(Cry1〜Cry59)が現在あり、さらなるCyt毒素および
VIP毒素などがある。数字で表した各群の多くは大文字サブグループを有し、大文字
のサブグループは小文字のサブサブグループを有する。(例えば、Cry1はA〜Lを有
し、Cry1Aはa〜iを有する)。

課題を解決するための手段

0011

本発明は、Cry1DaおよびCry1Beがフォールアーミーワーム(FAW;スポ
ドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda))の腸細胞膜調製物における結合部
位に関して競合しないという意外な発見に一部関する。当業者であれば本開示に鑑みて認
識するであろうが、これらのタンパク質(完全長タンパク質の殺虫性部分を含む)の両方
とも生成する植物は、これらの殺虫性タンパク質のいずれか単独に対する抵抗性の発達を
遅らせるか阻止することができる。トウモロコシおよびダイズが一部の好ましい植物であ
る。

0012

したがって、本発明は、Cry1Beタンパク質と組み合わせたCry1Daタンパク
質の使用に一部関する。これらのタンパク質の両方とも生成する植物(およびそのような
植物を植える土地)は、本発明の範囲内に含まれる。

0013

本発明はまた、3つ(以上)の毒素の三重スタックまたは「ピラミッド」に一部関し、
Cry1DaおよびCry1Beが基礎となる組である。一部の好ましいピラミッドの実
施形態では、選択される毒素の組合せは、FAWに対して3つの作用部位を提供する。一
部の好ましい「3つの作用部位」のピラミッドの組合せは、対象のタンパク質の基礎とな
る組に加えて、FAWを標的にするための第三タンパク質としてCry1Fa、Vip3
AbまたはCry1Eを含む。本発明によるこれらの特定の三重スタックは、FAWに対
して3つの作用部位を有利に意外なほどに提供する。これは、緩衝帯地所の要件を低減ま
たは除去するのを助けることができる。

0014

さらなる毒素/遺伝子を本発明によって加えることもできる。例えば、Cry1Faが
対象のタンパク質の組と一緒にスタックされる場合(Cry1FaおよびCry1Beの
両方はFAWおよびユーロピアンコーンボーラー(ECB)の両方に対して活性である)
、その第四の追加タンパク質はECBを標的にする1つの追加のタンパク質をこの三重ス
タックに加えることは、FAWに対する3つの作用部位、およびECBに対する3つの作
用部位を提供するであろう。この追加タンパク質(第四のタンパク質)は、Cry2A、
Cry1I、D1G−3およびCry1Abからなる群から選択され得る。これは、2つ
の昆虫(ECBおよびFAW)に対して3つの作用部位を有する4タンパク質スタックを
もたらすであろう。

図面の簡単な説明

0015

図1は、非標識の相同的Cry1Be(●)および非相同的Cry1Da(○)による競合に対する、FAW由来BBMVにおける125I Cry1Be(0.5nM)の特異的結合百分率を示す。
図2は、非標識の相同的Cry1Da(○)および非相同的Cry1Be(●)による競合に対する、FAW由来BBMVにおける125I Cry1Da(0.5nM)の特異的結合の百分率を示す。

0016

本発明は、Cry1DaおよびCry1Beがフォールアーミーワーム(FAW;スポ
ドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda))の腸において、結合に関して互い
に競合しないという意外な発見に一部関する。したがって、これらのタンパク質のいずれ
か単独への抵抗性をFAWが発達させることを遅らせるか阻止するために、Cry1Da
タンパク質は、トランスジェニックトウモロコシ(および他の植物、例えばワタおよびダ
イズ)でCry1Beタンパク質と組み合わせて用いることができる。Cry抵抗性のフ
ォールアーミーワームによる損害から植物(メイズ植物(maize plant)および/またはダ
イズ植物など)を保護することにおいて、対象のタンパク質の組は効果的であり得る。す
なわち、本発明の1つの用途は、Cry1DaまたはCry1Beへの抵抗性を発達させ
るかもしれないフォールアーミーワーム集団に起因する損害および収量減からトウモロコ
シおよび他の経済的に重要な植物種を保護することである。

0017

したがって、本発明は、これらのタンパク質の一方または両方へのFAWによる抵抗性
の発達を阻止または軽減するための、Cry1DaおよびCry1Beを含む昆虫抵抗性
対応(IRM)スタックを教示する。

0018

本発明は、Cry1Da殺虫性タンパク質およびCry1Be殺虫性タンパク質を生成
する細胞を含む、鱗翅目害虫を防除するための組成物を提供する。

0019

本発明は、Cry1Da殺虫性タンパク質およびCry1Be殺虫性タンパク質の両方
を生成するように形質転換された、微生物または植物細胞である宿主をさらに含む。対象
ポリヌクレオチド複数可)は、好ましくは非バチルス・チューリンゲンシス(Bacillus
thuringiensis)プロモーター(複数可)の制御下の遺伝子構築物中にある。対象ポリ
クレオチドは、植物での強化された発現のためのコドン使用頻度を含むことができる。

0020

本発明は、鱗翅目害虫を防除する方法であって、前記鱗翅目害虫または前記鱗翅目害虫
の環境を、Cry1Daコア毒素含有タンパク質を含み、さらにCry1Beコア毒素含
有タンパク質を含む組成物の有効量と接触させることを含む方法を提供することがさらに
意図される。

0021

本発明の実施形態は、Cry1Be殺虫性タンパク質をコードする、植物による発現が
可能な遺伝子、およびCry1Da殺虫性タンパク質をコードする、植物による発現が可
能な遺伝子を含むメイズ植物、およびそのような植物の種子を含む。

0022

本発明のさらなる実施形態は、Cry1Be殺虫性タンパク質をコードする、植物によ
る発現が可能な遺伝子およびCry1Da殺虫性タンパク質をコードする、植物による発
現が可能な遺伝子が遺伝子移入されたメイズ植物、およびそのような植物の種子を含む。

0023

実施例に記載されているように、放射性標識されたCry1DaおよびCry1Beタ
ンパク質を用いる競合的受容体結合性試験は、Cry1Daが結合するFAW組織におい
てCry1Beタンパク質が結合に関して競合しないことを示す。これらの結果は、Cr
y1DaおよびCry1Beタンパク質の組合せが、これらのタンパク質のいずれかに対
するFAW集団での抵抗性の発達を軽減する効果的な手段になることができることも示す
。したがって、本明細書に記載されるデータに一部基づき、Cry1BeおよびCry1
Daタンパク質の同時生成(スタッキング)をFAWのための高用量IRMスタックを生
成するために用いることができると考えられる。

0024

他のタンパク質をこの組に加えることができる。例えば、本発明は、3つ(以上)の毒
素の三重スタックまたは「ピラミッド」にも一部関し、Cry1DaおよびCry1Be
が基礎となる組である。一部の好ましいピラミッドの実施形態では、選択される毒素は、
FAWに対して3つの別々の作用部位を有する。一部の好ましい「3つの作用部位」のピ
ラミッドの組合せは、対象のタンパク質の基礎となる組に加えて、FAWを標的にするた
めの第三のタンパク質としてCry1Fa、Vip3AbまたはCry1Eを含む。本発
明によるこれらの特定の三重スタックは、FAWに対して3つの作用部位を有利に、およ
び意外なほど提供する。これは、緩衝帯の必要を低減または除去するのを助けることがで
きる。「別々の作用部位」は、所与のタンパク質のいずれも互いに交差抵抗性を引き起こ
さないことを意味する。

0025

さらなる毒素/遺伝子を、本発明によって加えることもできる。例えば、Cry1Fa
が対象のタンパク質の組と一緒にスタックされる場合(Cry1FaおよびCry1Be
の両方はFAWおよびユーロピアンコーンボーラー(ECB)の両方に対して活性である
)、その第四の追加タンパク質はECBを標的にする1つの追加のタンパク質をこの三重
スタックに加えることは、FAWに対する3つの作用部位、およびECBに対する3つの
作用部位を提供する。これらの追加のタンパク質(第四のタンパク質)は、Cr2A、C
ry1I、DIG−3(米国特許出願シリアル番号61/284,278(2009年1
2月16日に出願された)およびUS2010 00269223を参照)およびCry
1Ab(US2008 0311096)からなる群から選択することができる。これは
、2つの昆虫(ECBおよびFAW)に対して3つの作用部位を有する4タンパク質スタ
ックをもたらす。

0026

したがって、1つの利用選択肢は、対象のタンパク質の組を第三毒素/遺伝子と組み合
わせて用いること、およびこれらの毒素のいずれかに対するFAWでの抵抗性の発達を軽
減するためにこの三重スタックを用いることである。したがって、本発明は、3つ(以上
)の毒素の三重スタックまたは「ピラミッド」にも一部関する。一部の好ましいピラミッ
ドの実施形態では、選択される毒素は、FAWに対して3つの別々の作用部位を有する。

0027

本発明の利用選択肢には、FAWが抵抗性集団を発達させることができる作物栽培地
で、対象タンパク質の2つ、3つまたはそれ以上のタンパク質を用いることが含まれる。
例えば、Cry1Faに加えてCry1Dの使用については、Cry1DがCry1F抵
抗性のFAWに対して活性であることを示す米国特許出願シリアル番号61/284,2
52(2009年12月16日に出願された)を参照。この出願は、Cry1DがFAW
膜調製物における結合に関してCry1Fと競合しないことを示す。Cry1Faおよび
Cry1Beの使用に関するガイダンスについては、米国特許出願シリアル番号61/2
84,294を、Vip3Abについては「COMBINED USE OF Vip3Ab AND CRY1Fa FOR MA
NAGEMENTOF RESISTANT INSECTS」という題名の同時係属して出願された出願を参照され
たい。Cry1FaはFAW(およびユーロピアンコーンボーラー(ECB))に対して
活性であり、Cry1DaにCry1BeおよびCry1Faをプラスしたものは、本発
明により、FAWに対する3つの作用部位を有利に意外なほどに提供するであろう。これ
は、緩衝帯の要件を低減または除去するのを助けることができる。

0028

Cry1Faは、Herculex(登録商標)、SmartStax(商標)および
WideStrike(商標)製品で利用されている。対象の遺伝子の組(Cry1Da
およびCry1Be)は、例えばHerculex(登録商標)、SmartStax(
商標)およびWideStrike(商標)などのCry1Fa製品に組み込むことがで
きる。したがって、対象のタンパク質の組は、これらのおよび他の市販タンパク質への淘
汰圧を有意に低減できる。したがって、対象のタンパク質の組は、トウモロコシおよび他
の植物(例えばワタおよびダイズ)のための3遺伝子組合せの場合のように用いることが
できる。

0029

上記のように本発明にしたがって、さらなる毒素/遺伝子を追加できる。ECBを標的
にするために、Cry2A、Cry1Iおよび/またはDIG−3を用いることができる
。米国特許出願シリアル番号61/284,278(2009年12月16日に出願され
た)を参照されたい。Cry1Abの追加(ECBを防除するために)については、米国
特許出願公開第2008/0311096号を参照されたい。FAWを防除するためのC
ry1Eの使用については、米国特許出願シリアル番号61/284,278(2009
年12月16日に出願された)を参照されたい。

0030

対象のタンパク質の組合せのいずれかを生成する植物(およびそのような植物を植える
土地)は、本発明の範囲内に含まれる。さらなる毒素/遺伝子を加えることもできるが、
上記の特定のスタックは、FAWおよび/またはECBに対する複数の作用部位を有利に
、および意外なほど提供する。これは、緩衝帯地所の要件を低減または除去するのを助け
ることができる。したがって、10エーカー以上のこのように植えられる圃場は、本発明
に含まれる。

0031

本明細書で議論される遺伝子およびタンパク質のいずれかの配列を得るために、GEN
BANKを用いることもできる。下の付録Aを参照されたい。特許も、関連する配列を開
示する。例えば、米国特許第5,188,960号および米国特許第5,827,514
号は、本発明の実施で使用するために適するCry1Faコア毒素含有タンパク質を記載
する。米国特許第6,218,188号は、本発明で使用するために適するCry1Fa
コア毒素含有タンパク質をコードする植物最適化DNA配列を記載する。

0032

本明細書に記載されるタンパク質の組合せは、鱗翅目害虫を防除するために用いること
ができる。成体鱗翅目、例えばチョウおよびガは、主に花蜜を食し、受粉の重要な実行
者である。ほとんど全ての鱗翅目幼虫、すなわちイモムシは植物を食し、多くは重大な有
害生物である。イモムシは、植物の葉の表面もしくは内部、または根部またはを食し、
植物から栄養を奪い、多くの場合植物の物理支持構造物破壊する。さらに、イモムシ
果物、組織ならびに貯蔵された穀物および小麦粉を食し、売物のこれらの商品を破壊す
るかそれらの価値を激減させる。本明細書で用いるように、鱗翅目害虫への言及は、幼虫
期を含めた、鱗翅目害虫の様々なライフステージを指す。

0033

本発明の一部のキメラ毒素は、Bt毒素の完全なN末端コア毒素部分を含み、コア毒素
部分の末端を過ぎたある場所で、タンパク質は異種プロトキシン配列への移行を有する。
Bt毒素のN末端の殺虫活性毒素部分は、「コア」毒素と呼ばれる。コア毒素セグメント
から異種プロトキシンセグメントへの移行は、ほぼ毒素/プロトキシン接合部に存在して
もよいし、その代わり元のプロトキシンの部分(コア毒素部分を過ぎて延びる)を保持し
て異種プロトキシン部分への移行が下流に存在してもよい。

0034

例えば、本発明の1つのキメラ毒素は、Cry1Daの完全なコア毒素部分(アミノ酸
1〜601)および/または異種プロトキシン(アミノ酸602からC末端)である。好
ましい一実施形態では、プロトキシンを含むキメラ毒素の部分は、Cry1Abタンパク
質毒素に由来する。好ましい実施形態では、プロトキシンを含むキメラ毒素の部分は、C
ry1Abタンパク質毒素に由来する。

0035

Bt毒素は、Cry1Beなどの特定のクラス内でさえ、長さおよびコア毒素部分から
プロトキシン部分への移行の正確な位置が多少異なることを、当分野の技術者は認識する
。一般的に、Cry1Be毒素は、長さが約1150から約1200アミノ酸である。コ
ア毒素部分からプロトキシン部分への移行は、代表的に完全長毒素の約50%から約60
%の間に存在する。本発明のキメラ毒素は、このN末端コア毒素部分の全長を含む。した
がって、キメラ毒素は、Cry1Beタンパク質の完全長の少なくとも約50%を含む。
これは、一般的に少なくとも約590アミノ酸である。プロトキシン部分に関して、Cr
y1Abプロトキシン部分の全長は、コア毒素部分の末端から分子のC末端まで伸びる。

0036

遺伝子および毒素。
本発明による有用な遺伝子および毒素には、開示される完全長配列だけでなく、本明細
書で具体的に例示される毒素の特徴的な殺虫活性を保持するこれらの配列の断片、変異体
突然変異体、および融合タンパク質も含まれる。本明細書で用いるように、遺伝子の「
変異体」または「変形形態」という用語は、同じ毒素をコードするか、殺虫活性を有する
同等毒素をコードするヌクレオチド配列を指す。本明細書で用いるように、用語「同等毒
素」は、標的有害生物に対して特許請求する毒素と同じか事実上同じである生物的活性を
有する毒素を指す。

0037

本明細書で用いるように、「Revision of the Nomenclature for the Bacillus thurin
giensis Pesticidal Crystal Proteins」、N. Crickmore, D.R. Zeigler, J. Feitelson,
E. Schnepf, J. Van Rie, D. Lereclus, J. Baum, and D.H. Dean. Microbiology and M
olecular Biology Reviews (1998) Vol 62: 807-813、により、境界は約95%(Cry
1DaおよびCry1Be)、78%(Cry1DおよびCry1B)および45%(C
ry1)の配列同一性を表す。これらのカットオフは、コア毒素だけに適用することもで
きる。

0038

活性毒素をコードする遺伝子は、いくつかの手段を通して同定し、得ることができるこ
とは、当分野の技術者に明らかとなるはずである。本明細書で例示される具体的な遺伝子
または遺伝子部分は、培養株保管所寄託されている分離株から得ることができる。これ
らの遺伝子、またはその部分もしくは変異体は、合成的に、例えば遺伝子合成装置を用い
構築することもできる。遺伝子の変形形態は、点突然変異を作製する標準技術を用いて
、容易に構築することができる。また、これらの遺伝子の断片は、市販のエキソヌクレア
ーゼまたはエンドヌクレアーゼ標準手順に従って用いることによって作製することがで
きる。例えば、これらの遺伝子の末端からヌクレオチドを体系的に切断するために、Ba
l31などの酵素または部位特異的突然変異誘発を用いることができる。活性断片をコー
ドする遺伝子は、様々な制限酵素を用いて得ることもできる。これらのタンパク質毒素の
活性断片を直接的に得るために、プロテアーゼを用いることができる。

0039

例示される毒素の殺虫活性を保持する断片および同等物は、本発明の範囲内である。ま
た、遺伝子コード冗長性のため、様々な異なるDNA配列が本明細書で開示されるアミ
ノ酸配列をコードすることができる。同じか事実上同じである毒素をコードするこれらの
代替DNA配列を作製することは、当業者の技量の範囲内である。これらの変異体DNA
配列は、本発明の範囲内である。本明細書で用いるように、「事実上同じ」配列への言及
は、殺虫活性に実質的な影響を及ぼさないアミノ酸の置換欠失、付加または挿入を有す
る配列を指す。殺虫活性を保持するタンパク質をコードする遺伝子の断片も、この定義に
含まれる。

0040

本発明により有用な毒素をコードする遺伝子および遺伝子部分を同定するためのさらな
る方法は、オリゴヌクレオチドプローブを用いることによるものである。これらのプロー
ブは、検出可能なヌクレオチド配列である。これらの配列は、適当な標識によって検出可
能であってもよいし、国際出願公開第93/16094号に記載されているように本来的
蛍光性にしてもよい。当技術分野で周知であるように、プローブ分子および核酸試料
2つの分子間で強力な結合を形成することによってハイブリダイズする場合、プローブ
よび試料は実質的な相同性を有すると合理的に仮定することができる。好ましくは、ハイ
ブリダイゼーションは、例えばKeller, G. H., M. M. Manak (1987) DNA Probes, Stockt
onPress, New York, N.Y., pp. 169- 170に記載されているような、当分野で周知の技術
によってストリンジェント条件の下で行われる。塩濃度および温度の組合せの一部の例は
、以下の通りである(ストリンジェンシーが上がる順序で):室温で2×SSPEまたは
SSC;42℃で1×SSPEまたはSSC;42℃で0.1×SSPEまたはSSC;
65℃で0.1×SSPEまたはSSC。プローブの検出は、ハイブリダイゼーション
起こったかどうかを既知の方法で判定するための手段を提供する。そのようなプローブ分
析は、本発明の毒素コード遺伝子を同定するための迅速な方法を提供する。本発明による
プローブとして用いられるヌクレオチドセグメントは、DNA合成装置および標準手順を
用いて合成することができる。本発明の遺伝子を増幅するPCRプライマーとして、これ
らのヌクレオチド配列を用いることもできる。

0041

変異体毒素。
本発明の特定の毒素が、本明細書で具体的に例示されている。これらの毒素は本発明の
毒素の例示にすぎないので、本発明が例示毒素と同じか類似した殺虫活性を有する変異体
または同等毒素(および同等毒素をコードするヌクレオチド配列)を含むことは容易に明
らかなはずである。同等毒素は、例示される毒素とのアミノ酸相同性を有する。このアミ
酸相同性は、一般的に75%を超え、好ましくは90%を超え、最も好ましくは95%
を超える。アミノ酸相同性は、生物的活性を担う毒度の重要領域、又は最終的に生物的活
性を担う3次元構造の決定に関与する毒素の重要領域で最も高くなる。この点に関しては
、それらの置換が活性に重要でない領域にあるか、分子の3次元構造に影響を及ぼさない
保存的アミノ酸置換であるならば、特定のアミノ酸置換許容でき、期待できる。例えば
、アミノ酸は以下のクラスに入れることができる:無極性無電荷極性塩基性および酸
性。1つのクラスのアミノ酸が同じ種類の別のアミノ酸で置換される保存的置換は、その
置換が化合物の生物的活性を実質的に変更しない限り本発明の範囲内である。下記は、各
クラスに属するアミノ酸の例のリストである。

0042

場合によって、非保存的置換を加えることもできる。重要な要素は、これらの置換が毒
素の生物的活性をあまり損なってはならないということである。

0043

組換え体宿主。
本発明の毒素をコードする遺伝子は、多種類の微生物または植物宿主に導入することが
できる。毒素遺伝子の発現は、直接または間接的に、殺虫剤の細胞内での生成および維持
をもたらす。本発明の両毒素を発現するBt株を作製するために、接合移入および組換え
移入を用いることができる。他の宿主生物体を毒素遺伝子の一方または両方で形質転換し
、次に相乗効果を達成するために用いることもできる。適する微生物宿主、例えばシュー
ドモナス(Pseudomonas)で、微生物を有害生物の位置へ施用することができ、そこでそ
れらは増殖して摂取される。この結果が有害生物の防除である。あるいは、毒素遺伝子を
受け入れる微生物は、毒素の活性を長引かせ、細胞を安定させる条件の下で処理すること
ができる。毒性活性を保持する処理細胞は、次に標的有害生物の環境に施用することがで
きる。

0044

Bt毒素遺伝子が適するベクターを通して微生物宿主に導入され、前記宿主が生きた状
態で環境へ施用される場合、特定の宿主微生物が用いられることが必須である。対象の1
つまたは複数の作物の「植物」(葉面葉圏根圏および/または根面)を占めること
が知られている微生物宿主が選択される。これらの微生物は、特定の環境(作物および他
の昆虫生息地)で野生型微生物とよく競合することが可能であるように、ポリペプチド
虫剤を発現する遺伝子の安定した維持および発現を提供するように、および、望ましくは
環境中での分解および不活性化からの殺虫剤の向上した保護を提供するように選択される

0045

多数の微生物が、多種類の重要作物の葉面(植物葉の表面)および/または根圏(植物
根を囲む土)に生息することが知られている。これらの微生物には、細菌、藻および真菌
類が含まれる。特に興味深いものは、細菌、例えばシュードモナス属(Pseudomonas)、
エルウィニア属(Erwinia)、セラチア属(Serratia)、クレブシェラ属(Klebsiella)
キサントモナス属(Xanthomonas)、ストレプトマイセス属(Streptomyces)、根粒菌
属(Rhizobium)、ロドシュードモナス属(Rhodopseudomonas)、メチロフィウス(Met
hylophilius)、アグロバクテナム属(Agrobactenum)、アセトバクター属(Acetobacter
)、ラクトバシラス属(Lactobacillus)、アルトロバクター属(Arthrobacter)、アゾ
トバクター属(Azotobacter)、ロイコノストック属(Leuconostoc)およびアルカリゲネ
ス属(Alcaligenes);真菌類、特に酵母、例えばサッカロミセス属(Saccharomyces)、
クリプトコックス属(Cryptococcus)、クルイベロミセス属(Kluyveromyces)、スポロ
ボロミセス属(Sporobolomyces)、ロドトルラ属(Rhodotorula)およびオーレオバシジ
ウム属(Aureobasidium)などの微生物である。特に興味深いものは、シュードモナス
シリンゲ(Pseudomonas syringae)、蛍光菌(Pseudomonas fluorescens)、セラチア
マルセッセンス(Serratia marcescens)、アセトバクターキシリナム(Acetobacter x
ylinum)、アグロバクテニウム・ツメファシエンス(Agrobactenium tumefaciens)、ロ
ドシュードモナス・スフェロイデス(Rhodopseudomonas spheroides)、キサントモナス
カンペストリス(Xanthomonas campestris)、リゾビウム・メリオチ(Rhizobium meli
oti)、アルカリゲネス・エントロファス(Alcaligenes entrophus)およびアゾトバクタ
ー・ビンランジ(Azotobacter vinlandii)のような植物圏細菌種;ならびにロドトルラ
・ルブラ(Rhodotorula rubra)、R.グルニス(R. glutinis)、R.マリーナ(R. m
arina)、R.オーラチアカ(R. aurantiaca)、クリプトコックスアルビダス(Cryp
tococcus albidus)、C.ジフルエンス(C. diffluens)、C.ローレンチ(C. laurent
ii)、サッカロミセス・ロゼイ(Saccharomyces rosei)、S.プレトリエンシス(S. pr
etoriensis)、S.セレビシエ(S. cerevisiae)、スポロボロミセス・ロゼウス(Sporo
bolomyces roseus)、S.オドルス(S. odorus)、クルイベロミセスベロネ(Kluyver
omyces veronae)およびオーレオバシジウムポルランス(Aureobasidium pollulans)
などの植物圏酵母種である。色の着いた微生物が、特に興味深い。

0046

遺伝子の安定した維持および発現を可能にする条件の下で、毒素をコードするBt遺伝
子を微生物宿主に導入するために、多種類の方法を利用できる。これらの方法は当業者に
周知であり、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第5,135,867
号に記載されている。

0047

細胞の処理。
Bt毒素を発現するバチルス・チューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis)または
組換え体の細胞は、毒素活性を長引かせ、細胞を安定させるために処理することができる
。形成される殺虫剤マイクロカプセルは、安定化された細胞構造の中にBt毒素(複数可
)を含み、このマイクロカプセルが標的有害生物の環境へ施用されるときに毒素を保護す
る。適する宿主細胞には、原核生物または真核生物のいずれかが含まれてよく、通常、哺
動物などの高等生物体有毒である物質を生成しない細胞に限定される。しかし、毒性
物質が不安定であるか、哺乳動物宿主への毒性のいかなる可能性も避けるために施用量
十分に低い場合、高等生物体にとって有毒である物質を生成する生物体が用いられてもよ
い。宿主としては、原核生物および真菌類などの下等真核生物が特に興味深い。

0048

処理時、細胞は通常、胞子の形態ではなくそのままの状態であり実質的に増殖形である
が、一部の例では胞子を利用してもよい。

0049

微生物細胞、例えばB.t.毒素遺伝子(複数可)を含む微生物の処理は、その技術が
毒素の特性に悪い影響を及ぼさず、毒素を保護する細胞の能力も低下させない限り、化学
的または物理的な手段により、または化学的および/または物理的な手段の組合せによる
ことができる。化学試薬の例は、ハロゲン化剤、特に原子番号17〜80のハロゲン原子
である。より詳しくは、穏和な条件の下で、かつ所望の結果を達成するのに十分な時間、
ヨウ素を用いることができる。他の適する技術には、グルタルアルデヒドなどのアルデヒ
ド;塩化ゼフィランおよび塩化セチルピリジニウムなどの消毒剤イソプロピルおよびエ
タノールなどのアルコール;ルゴールヨウ素、ブアン固定液、様々な酸およびヘリー固定
液などの様々な組織固定剤(Humason, Gretchen L., Animal Tissue Techniques, W. H.
Freeman and Company, 1967を参照);または細胞が宿主環境に施用されるときに細胞内
で生成される毒素の活性を保存し、長引かせる物理的(熱)および化学的作用因子の組合
せによる処理が含まれる。物理的手段の例は、ガンマ線放射およびX線放射などの短波長
放射凍結UV照射凍結乾燥などである。微生物細胞の処理のための方法は、米国特
許第4,695,455号および4,695,462号で開示され、それらは参照により
本明細書に組み込まれる。

0050

細胞は、環境条件への抵抗性を増強する強化された構造安定性を一般に有する。殺虫剤
がプロ型である場合、細胞処理の方法は、標的有害生物の病原体による殺虫剤のプロ型か
成熟型へのプロセッシングを妨げないように選択されるべきである。例えば、ホルムア
ルデヒドはタンパク質を架橋し、ポリペプチド殺虫剤のプロ型のプロセッシングを妨げる
ことができる。処理の方法は、毒素の生物学的利用能または生物活性の少なくとも実質的
な部分を保持するべきである。

0051

生成のための宿主細胞の選択で特に興味深い特性には、B.t.遺伝子(複数可)を宿
主に導入することの容易さ、発現系の利用可能性発現効率、宿主での殺虫剤の安定性
よび補助的遺伝子能力の存在が含まれる。殺虫剤マイクロカプセルとして用いるための興
味深い特性には、厚い細胞壁、着色および細胞内パッケージングまたは封入体形成などの
殺虫剤保護特性水性環境での生存人畜毒性の欠如;摂取のための有害生物への誘引
果;殺滅の容易さおよび毒素を害さずに固着させること;などが含まれる。他の考慮事項
には、製剤化および取扱いの容易さ、経済性貯蔵安定性などが含まれる。

0052

細胞の増殖。
B.t.殺虫性遺伝子(複数可)を含む細胞宿主は、DNA構築物選択有利性を提供
し、細胞の実質的に全てまたは全てがB.t.遺伝子を保持するように選択培地を提供す
る、任意の便利な栄養培地で増殖させることができる。これらの細胞は次いで、従来の方
法に従って収穫することができる。あるいは、収穫する前に細胞を処理することができる

0053

本発明の毒素を生成するB.t.細胞は、標準技術の培地および発酵技術を用いて培養
することができる。発酵サイクルが終了すると、最初に当技術分野で周知である手段によ
ってB.t.胞子および結晶発酵培養液から分離することによって細菌を収穫すること
ができる。取扱いおよび特定の標的有害生物への施用を容易にするために、界面活性剤
分散剤不活性担体および他の構成成分の添加によって、回収されたB.t.胞子および
結晶を水和剤濃厚液剤粒剤または他の製剤に製剤化することができる。これらの製剤
および施用手法は、全て当技術分野で周知である。

0054

製剤。
誘引剤ならびにB.t.分離株の胞子、結晶および毒素、または本明細書で開示される
B.t.分離株から入手できる遺伝子を含む組換え体微生物を含む製剤化された粒剤は
土壌に施用することができる。製剤化された製品は、種子コーティングまたは作物サイ
クルの後期段階で根部処理もしくは植物全体処理として施用することもできる。B.t.
細胞の植物および土壌処理は、様々な不活性の材料、例えば無機鉱物フィロシリケート
炭酸塩硫酸塩、リン酸塩など)または植物材料粉末状の穂軸籾殻クルミ殻など
)と混合することによって、水和剤、粒剤または粉剤として使用することができる。製剤
は、展着助剤安定化剤、他の殺虫性添加剤または界面活性剤を含むことができる。液体
製剤は水性または非水性であってよく、フォームゲル、懸濁液、乳剤などとして使用す
ることができる。これらの成分には、レオロジー調整剤、界面活性剤、乳化剤、分散剤ま
たはポリマーが含まれてよい。

0055

当分野の技術者によって認識されるように、特定の製剤の性質、特にそれが濃厚剤であ
るか直接的に用いられるものであるかによって、殺虫剤濃度は広く変動する。殺虫剤は少
なくとも1重量%で存在し、100重量%であってもよい。乾燥製剤は約1〜95重量%
の殺虫剤を有するが、液体製剤は一般に液相中に約1〜60重量%の固形分である。製剤
は、1mgにつき約102から約104細胞を一般に有する。これらの製剤は、1ヘクタ
ールにつき約50mg(液体または乾燥物)から1kg以上で投与される。

0056

製剤は、噴霧散粉散水その他によって、鱗翅目害虫の環境、例えば葉または土へ施
用することができる。

0057

植物の形質転換。
本発明の殺虫性タンパク質の生成のための好ましい組換え体宿主は、形質転換された植
物である。本明細書で開示されるようなBt毒素タンパク質をコードする遺伝子は、当技
術分野で周知である様々な技術を用いて植物細胞に挿入することができる。例えば、大腸
菌(Escherichia coli)の複製系および形質転換細胞の選択を可能にするマーカーを含む
多数のクローニングベクターが、高等植物への外来遺伝子の挿入のための調製のために利
用できる。ベクターには、例えば、とりわけpBR322、pUCシリーズ、M13mp
シリーズ、pACYC184が含まれる。したがって、Bt毒素タンパク質をコードする
配列を有するDNA断片は、適する制限部位でベクターに挿入することができる。生じた
プラスミドは、大腸菌(E. coli)への形質転換のために用いられる。大腸菌(E. coli)
細胞は適する栄養培地で培養され、次に収穫され、溶解される。プラスミドを回収する。
配列分析、制限酵素解析電気泳動および他の生化学分子生物学的方法が、分析方法
して一般に実行される。各操作の後、用いたDNA配列を切断して次のDNA配列に連結
することができる。各プラスミド配列は、同じか他のプラスミドにクローニングすること
ができる。植物への所望の遺伝子の挿入の方法によっては他のDNA配列が必要なことも
ある。例えば、植物細胞の形質転換のためにTiまたはRiプラスミドが用いられるなら
ば、TiまたはRiプラスミドT−DNAの少なくともライトボーダーが、しかし多くの
場合はライトボーダーとレフトボーダーとが、挿入される遺伝子の隣接領域として連結さ
れなければならない。植物細胞の形質転換のためのT−DNAの使用は集中的に研究され
ており、EP120516、Lee and Gelvin (2008)、Hoekema (1985)、Fraley et al.,
(1986)およびAn et al., (1985)で十分に記載され、当技術分野でよく確立されている。

0058

挿入されたDNAが植物ゲノムに組み込まれると、それは比較的安定である。形質転換
ベクターは、形質転換された植物細胞に、とりわけビアラホスカナマイシン、G418
ブレオマイシンまたはハイグロマイシンなどの生物致死剤または抗生物質への抵抗性を
付与する選択マーカーを通常含む。したがって、個々に使用されるマーカーは、挿入され
たDNAを含まない細胞ではなく形質転換された細胞の選択を可能にするはずである。

0059

DNAを植物宿主細胞に挿入するために、多数の技術を利用できる。それらの技術には
形質転換因子としてアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaci
ens)もしくはアグロバクテリウム・リゾゲネス(Agrobacterium rhizogenes)を用いる
T−DNAによる形質転換、融合、注射、微粒子銃微小粒子ボンバードメント)、また
エレクトロポレーションならびに他の可能な方法が含まれる。アグロバクテリウム菌
形質転換のために用いられる場合、挿入されるDNAは特別なプラスミド、すなわち中間
型ベクターまたはバイナリーベクターのいずれかにクローニングされなければならない。
中間型ベクターは、T−DNAの配列に相同性である配列のため、相同組み換えによって
TiまたはRiプラスミドに組み込むことができる。TiまたはRiプラスミドは、T−
DNAの移入のために必要なvir領域も含む。中間型ベクターは、アグロバクテリウム
菌ではそれ自身を複製することができない。中間型ベクターは、ヘルパープラスミドによ
ってアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)に移動させ
ることができる(コンジュゲーション)。バイナリーベクターは、大腸菌(E. coli)お
よびアグロバクテリウム菌の両方でそれ自身を複製することができる。それらバイナリー
ベクターは選択マーカー遺伝子およびリンカーまたはポリリンカーを含み、これらは左右
のT−DNAボーダー領域によってフレーム決めされる。それらバイナリーベクターは、
アグロバクテリウム菌に直接に形質転換させることができる(Holsters et al., 1978)
。宿主細胞として用いられるアグロバクテリウム菌は、vir領域を運ぶプラスミドを含
むものとする。vir領域は、植物細胞へのT−DNAの移入のために必要である。さら
なるT−DNAが含まれてもよい。そのように形質転換される細菌は、植物細胞の形質転
換のために用いられる。植物外植片は、植物細胞へのDNAの移入のために、アグロバク
テリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)またはアグロバクテリウム
・リゾゲネス(Agrobacterium rhizogenes)と都合よく培養することができる。次いで、
選択のための抗生物質または生物致死剤を含んでもよい適する培地で、感染植物材料(例
えば、葉片、茎、根の断片だけでなく、プロトプラストまたは懸濁培養細胞も)から完全
体植物を再生させることができる。そのように得られる植物は次いで、挿入されたDNA
の存在について試験することができる。注射およびエレクトロポレーションの場合、プラ
スミドに特別に要求されるものはない。通常のプラスミド、例えばpUC派生体を用いる
ことができる。

0060

形質転換細胞は、植物内で通常の方法で増殖する。それらは胚細胞を形成することがで
き、形質転換された形質(複数可)を後代植物へ伝えることができる。そのような植物は
通常の方法で生育させること、および同じ形質転換遺伝因子または他の遺伝因子を有する
植物と交配することができる。生じる雑種個体は、対応する表現型特性を有する。

0061

本発明の好ましい実施形態では、植物は、コドン使用頻度が植物のために最適化されて
いる遺伝子で形質転換される。例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第5
,380,831号を参照。一部のトランケーションされた毒素が本明細書で例示される
が、130kDa型(完全長)毒素がコア毒素であるN末端半分およびプロトキシン「尾
部」であるC末端半分を有することは、Bt技術の分野では周知である。したがって、適
当な「尾部」を、本発明のトランケーションされた/コア毒素と共に用いることができる
。例えば米国特許第6,218,188号および米国特許第6,673,990号を参照
。さらに、植物で使用するための合成Bt遺伝子の作製方法が当技術分野で公知である(
Stewart and Burgin, 2007)。好ましい形質転換植物の1つの非限定例は、植物にて発現
可能なCry1Daタンパク質コード遺伝子を含み、さらに第二の、植物にて発現可能な
Cry1Beタンパク質コード遺伝子を含む稔性のメイズ植物である。

0062

近交系メイズ系統へのCry1DaおよびCry1Be決定形質(複数可)の移入(ま
たは遺伝子移入)は、回帰性選抜育種、例えば戻し交配によって達成することができる
。この場合には、所望の反復親が、Cry1DおよびCry1Be決定形質のための適当
な遺伝子(複数可)を運ぶドナーの近交系(一回親)と先ず交配される。この交配の後代
は、次に反復親と戻し交配され、続いて生じる後代において、一回親から移入される所望
の形質(複数可)について選択される。所望の形質(複数可)の選択によって反復親との
3世代、好ましくは4世代、より好ましくは5世代以上の戻し交配の後、後代は移入され
る形質(複数可)を支配する遺伝子座ヘテロ接合性になるが、他のほとんどまたはほと
んど全ての遺伝子については反復親と同様のものである(例えば、Poehlman & Sleper (1
995) Breeding Field Crops, 4th Ed., 172-175、Fehr (1987) Principles of Cultivar
Development, Vol. 1 : Theory and Technique, 360-376を参照)。

0063

昆虫抵抗性対応(IRM)戦略。
例えばRoush et al.は、「ピラミッド化」または「スタッキング」とも呼ばれる、殺虫
トランスジェニック作物の対応のための2毒素戦略を概説している。(The Royal Soci
ety. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. (1998) 353, 1777-1786)。

0064

米国環境保護庁は、そのウェブサイト(epa.gov/oppbppdl/biopesticides/pips bt_cor
n_refuge_2006.htm)で、標的有害生物に対して活性である単一のBtタンパク質を生成
するトランスジェニック作物で用いるための非トランスジェニック(すなわち、非B.t
.)緩衝帯(非Bt作物/トウモロコシの区域)を提供するための以下の要件を公表する

「コーンボーラー保護Bt(Cry1AbまたはCry1F)トウモロコシ製品の特定
構造化要件は、以下の通りである:
構造化緩衝帯:
コーンベルトで20%の非鱗翅目Btトウモロコシ緩衝帯;
コットンベルトで50%の非鱗翅目Bt緩衝帯
ブロック
内部(すなわち、Bt圃場内
外部(すなわち、任意交配を最大にするためにBt圃場から1/2マイル(可能であ
れば1/4マイル)以内に別個の圃場)
圃場内の帯状
幼虫の移動の影響を低減するために、帯状地は少なくとも4条(好ましくは6条)の
幅でなければならない」

0065

さらに、National Corn Growers Associationも、
そのウェブサイト:(ncga.com/insect-resistance-management-fact-sheet-bt-corn)で
、緩衝帯要件に関して類似した指針を提供する。例えば以下である:
「コーンボーラーIRMの要件:
・トウモロコシ畑地の少なくとも20%に緩衝帯雑種を植える
綿花生産地では、緩衝帯は50%でなければならない
・緩衝帯雑種の1/2マイル以内に植えなければならない
・緩衝帯は、Bt圃場内に帯状地として植えることができる;緩衝帯の帯状地は少なく
とも4条の幅でなければならない
・標的昆虫の経済的許容限界に到達する場合だけ、緩衝帯を従来の殺虫剤で処理するこ
とができる
・Btベースの噴霧可能な殺虫剤を緩衝帯トウモロコシで用いることはできない
・Btトウモロコシのあらゆる農場に適当な緩衝帯を設けなければならない」

0066

Roush et al.(例えば、1780頁および1784頁の右欄)によって述べられている
ように、標的有害生物に各々有効で、ほとんど又は全く交差抵抗性のない2つの異なるタ
ンパク質のスタッキングまたはピラミッド化は、より小さな緩衝帯の使用を可能にする。
成功したスタックは、緩衝帯10%未満の緩衝帯サイズが、単一(非ピラミッド化)形質
のための約50%の緩衝帯と同等の抵抗性対応を提供することができることをRoush
は示唆する。今日利用できるピラミッド化Btトウモロコシ製品については、米国環境保
は単一形質製品(一般に20%)についてよりもかなり低く(一般に5%)構造化さ
れた非Btトウモロコシの緩衝帯を設けることを要求している。

0067

Roush et al.(前掲)および米国特許第6,551,962号によってさらに論じられ
ているように、圃場での様々な幾何学的栽植様式(上記のような)および袋入種子混合物
を含む、緩衝帯のIRM効果を提供する様々な方法がある。

0068

上記の百分率または類似した緩衝帯比率は、対象の二重または三重のスタックまたはピ
ラミッドのために用いることができる。単一の標的有害生物に対して3つの作用部位を有
する三重スタックについては、目標は緩衝帯がゼロ(または、例えば5%未満の緩衝帯)
である。これは、例えば10エーカー以上の商業用の土地に特にあてはまる

0069

本明細書で参照または引用される全ての特許、特許出願、仮出願および刊行物は、それ
らがこの明細書の明白な教示と矛盾しない範囲で、参照により全体が組み込まれる。

0070

具体的に示されるか含意されない限り、本明細書で用いられるように、用語「a」、「
an」および「the」は「少なくとも1つ」を示す。

0071

以下は、本発明を実施するための手法を例示する実施例である。これらの実施例は、限
定するものと解釈されるべきでない。特記されない限り全ての百分率は重量によるもので
あり、全ての溶媒混合割合は容量によるものである。全ての温度は、摂氏温度である。

0072

Cryタンパク質の125I標識
Cry毒素のヨウ素化
Iodo−BeadまたはIodo−gen(Pierce)を用いて、精製したトラ
ンケーション化Cry毒素をヨウ素化した。簡潔には、2つのIodo−Beadを50
0μlのリン酸緩衝食塩水PBS(20mMリン酸ナトリウム、0.15M NaCl
、pH7.5)で2回洗浄し、鉛シールドの裏で1.5ml遠心管に入れた。これに、1
00μlのPBSを加えた。フード内で、および適切な放射能取扱い技術を用いることに
より、0.5mCiNa125I(17.4Ci/mg、Lot0114、Amers
ham)をIodo−BeadのPBS溶液に加えた。構成成分を室温で5分間反応させ
、次に高度に純粋なトランケーション化Cryタンパク質の2〜25μgをその溶液に加
え、さらなる3〜5分間反応させた。Iodo−Beadから溶液を取り出し、それをP
BS平衡させた0.5mlの脱塩Zebaスピンカラム(InVitrogen)に加
えることによって、反応を停止した。Iodo−Beadを各々10μlのPBSで2回
洗浄し、洗浄溶液も脱塩カラムに加えた。放射性溶液を1,000×gで2分間の遠心
よって脱塩カラムを通して溶出した。Cry1Daの場合、放射能標識法を行うためにl
odo−gen法を用いた。この手法を用いて、100mMリン酸緩衝液(pH8)中の
Cry毒素を小さな0.5mlポリミキシンカラムに複数回通すことによって、リポポリ
サッカライドLPS)を先ず除いた。Iodo−genチューブ(Pierce Ch
em.Co.)に20μgの無LPSのCry1Da毒素を加え、次に0.5mCiのN
a125Iを加えた。反応混合液を25℃で15分間振盪させた。溶液をチューブから取
り出し、50μlの0.2Mの非放射性標識NaIを加えて反応をクエンチした。緩衝液
を3回交換してタンパク質をPBSに対して透析し、未結合の125Iを除去した。

0073

ヨウ素化されたCryタンパク質の放射純度を、SDS−PAGE、蛍光画像化および
ガンマ計数によって測定した。簡潔には、2μlの放射性タンパク質をSDS−PAGE
によって分離した。分離後製造業者説明書に従ってBioRadゲル乾燥装置を用い
てゲルを乾燥させた。マイラー膜(厚さ12μm)で包み、Molecular Dyn
amics保存蛍光スクリーン(35cm×43cm)の下でそれらを1時間露光させる
ことによって、乾燥ゲルを画像化した。Molecular Dynamics Sto
rm820蛍光造影装置を用いてプレート現像し、その画像をImageQuant(
商標)ソフトウェアを用いて分析した。放射性バンドと一緒にバンドの直ぐ上下の領域を
かみそりの刃を用いてゲルから切断し、ガンマ計数器で計数した。放射能は、Cryタン
パク質バンドおよびバンドの下の領域で検出されただけであった。放射能はバンドより上
で検出されず、全ての放射性汚染物質がトランケーション化Cryタンパク質よりも小さ
タンパク質構成成分からなることを示した。これらの構成成分は、分解生成物を表す可
能性が高い。

0074

BBMV調製プロトコル
溶性BBMVの調製および分画
終齢スポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)、オストリニア・ヌビラ
リス(Ostrinia nubilalis)またはヘレオチス・ゼア(Heleothis zea)幼虫を一晩絶食
させ、次いで、翌の上で15分間冷やしたのちに解剖した。中腸組織を体腔から取
り出し、外皮接着した後腸を残した。中腸を、仕入先の推奨通りに希釈したプロテア
阻害剤カクテル1(SigmaP−2714)を補充した、9倍容量氷冷ホモジナイ
ゼーション緩衝液(300mMマンニトール、5mM EGTA、17mMトリス、塩基
、pH7.5)に入れた。15ストロークガラス組織ホモジナイザーで組織をホモジナ
イズした。Wolfersberger(1993)のMgCl2沈殿法によってBBM
Vを調製した。簡潔には、300mMマンニトール中の等量の24mM MgCl2溶液
を中腸ホモジネートと混合し、5分間撹拌し、氷上で15分間静置させた。4℃で15分
間、2,500×gで溶液を遠心分離した。上清を保存し、元の容量の0.5倍希釈のホ
モジナイゼーション緩衝液にペレットを懸濁して再び遠心分離した。2つの上清を合わせ
、4℃で30分間、27,000×gで遠心分離してBBMV分画を形成した。ペレット
を10mlホモジナイゼーション緩衝液に懸濁し、プロテアーゼ阻害剤を追加し、4℃で
30分間、27,000×gで再び遠心分離してBBMVを洗浄した。生じたペレットを
BBMV保存緩衝液(10mMHEPES、130mM KCl、10%グリセロール
、pH7.4)に懸濁して、約3mg/mlタンパク質の濃度にした。タンパク質濃度
、標準としてウシ血清アルブミン(BSA)を用いてBradford法(1976)を
用いることによって測定した。製造業者の説明書に従ってSigmaアッセイを用いて、
試料を凍結させる前にアルカリ性ホスファターゼの測定を行った。BBMV分画中のこの
マーカー酵素比活性は、中腸ホモジネート分画で見られるものと比較して一般的に7倍
増加した。BBMVを250μlの試料に等分し、液体N2で瞬間冷凍し、−80℃で保
存した。
(1カクテル構成成分の最終濃度(μΜ)は、AEBSF(500)、EDTA(250
mM)、ベスタチン(32)、E−64(0.35)、ロイペプチン(0.25)および
アプロチニン(0.075)である。)

0075

BBMVタンパク質への125ICryタンパク質の結合を測定する方法
BBMVへのl25I Cryタンパク質の結合。
結合アッセイで用いるBBMVタンパク質の最適量を決定するために、飽和曲線を作成
した。125I放射性標識Cryタンパク質(0.5nM)を、結合緩衝液(8mM N
aHPO4、2mM KH2PO4、150mM NaCl、0.1%ウシ血清アルブミ
ン、pH7.4)中に0〜500μg/mlの様々な量のBBMVタンパク質と、28℃
で1時間インキュベートした。全容量は、0.5mlであった。1.5ml遠心管から5
00μl遠心管に反応混合液の150μlを3つ組で採取し、室温で6分間、14,00
0×gで試料を遠心分離することによって、結合した125I Cryタンパク質を未結
合のものから分離した。上清を静かに除去し、氷冷結合緩衝液でペレットを3回静かに洗
浄した。ペレットを含む遠心器の底を切り取り、13×75mmガラス培養試験管に入れ
た。試料をガンマ計数器でそれぞれ5分間計数した。試料に含まれる計数をバックグラ
ンド計数(タンパク質なしでの反応)から差し引き、BBMVタンパク質濃度に対してプ
ロットした。用いるタンパク質の最適量は、0.15mg/mlのBBMVタンパク質で
あると決定された。

0076

結合動態を決定するために、飽和曲線を作成した。簡潔には、BBMV(150μg/
ml)を、0.01から10nMの範囲で125ICry毒素の濃度を増加させて28
℃で1時間インキュベートした。各濃度の150μlを3つ組で採取し、試料の遠心およ
び計数は前記の通りに実行して、全結合を測定した。全ての非特異的受容体結合部位を飽
和させるために反応混合液に1,000nMの相同トリプシン処理非放射性Cry毒素を
添加することにより、非特異的結合を同様に測定した。特異的結合を、全結合と非特異的
結合との間の差として計算した。

0077

相同的および非相同的競合結合アッセイを、150μg/mlのBBMVタンパク質お
よび0.5nMの125I放射性標識Cryタンパク質を用いて実施した。真の結合競合
保証するために反応混合液に加えた競合的非放射性標識Cry毒素の濃度は0.045
から1,000nMであり、放射性リガンドと同時に加えた。インキュベーションは28
℃で1時間実施し、その受容体毒素に結合した125I Cryタンパク質の量を、前記
のように非特異的結合を差し引いて測定した。100パーセントの全結合は、全ての競合
リガンド非存在下で測定した。加えた競合的リガンドの濃度に対する全特異的結合の百
分率として、結果を片対数グラフプロットした。

0078

結果の要約
図1は、非標識の相同的Cry1Be(●)および非相同的Cry1Da(○)による
競合に対する、FAW由来BBMVにおける125I Cry1Be(0.5nM)の特
異的結合の百分率を示す。Cry1Beによる相同的競合の置換曲線は、約2nMのCr
y1Beで放射性リガンドの50%の置換を示すS字形曲線をもたらす。1,000n
Mの濃度のCry1Da(置換される125I Cry1Beよりも2,000倍多い)
は、50%未満の置換をもたらす。エラーバーは、3つ組の測定から得られた値域を表す

0079

図2は、非標識の相同的Cry1Da(○)および非相同的Cry1Be(●)による
競合に対する、FAW由来BBMVにおける125I Cry1Da(0.5nM)の特
異的結合の百分率を示す。Cry1Daによる相同的競合の置換曲線は、約1.5nMの
Cry1Daで放射性リガンドの50%の置換を示すS字形の曲線をもたらす。Cry1
Beは、1,000nMまで、またはアッセイで用いられた125I Cry1Daの濃
度の2,000倍まで、試験されたいかなる濃度においても125I Cry1Daの特
異的結合を置換しない。

0080

0081

実施例

0082

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