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図面 (20)

課題

合コンテントアルブミン及びアルブミン関連ポリペプチド、並びに少なくとも一部分を有するこれらの複合体、並びにこれらをコードするポリヌクレオチドを提供することを目的とする。

解決手段

アルブミンの三次元構造に基づいて、本発明者は、遊離チオール基を有する、1又は複数のシステイン残基を有する変異体ポリペプチド変異タンパク質)をデザインした(以下、「チオアルブミン」と呼ぶ)。変異体ポリペプチドは、システイン残基の硫黄原子を介して、結合パートナー、例えば生物活性化合物に結合させる。

概要

背景

血清アルブミンは、融合分子の特性を改善するために、遺伝子融合又は化学融合を介して、生物活性分子が融合する重要なスキャフォールドを供する(Leger, R. et al. (2004). Bioorg Med Chem Lett 14(17): 4395-8; Thibau- deau, K., et al. (2005). Bioconjug Chem 16(4): 1000〜8; Balan, V. et al. (2006). Antivir Ther 11 (1 ): 35〜45; EP 0 413 622; WO 90/13653; EP 1 681 304; WO 1997/024445; WO 01/79271)。アルブミン及びアルブミン粒子はまた、薬物及びプロドラッグをこれらの作用部位運ぶ又は届けるために重要である(Kratz (2008) Journal of Controlled Release, 132 (3), p.171-183)。融合及び粒子技術は、改善された薬物動態特性、例えば半減期延長などに起因する改善された投与計画を供し、そしてバイオアベイラビリティを改善し、融合した生物活性分子を不活化から保護する。

アルブミンの生化学遺伝学及び医学的な応用は、特徴がはっきりしている(「All about Albumin」, T. Peters Jr., Academic Press N. Y., and http://www. albumin.org/)。ヒト血清アルブミンHSA,HAとも呼ばれる)は、〜60g/L濃度のヒト血漿中で最も豊富タンパク質である。HSAの配列は、配列番号1で供される。HSAの自然変異体は生じており、そして周知の多型の一覧は、Minchiotti等(2008)のHum Mutat 29(8):1007−16.,及びhttp://www.uniprot.org/uniprot/P02768に掲載される。

組換え型ヒトアルブミンの生成物及び精製は、確立されており(WO 95/23857; WO 00/44772; WO 2006/066595; EP 0 305 216; Sleep et al. 1990 Biotechnology (N Y). 1990 Jan; 8(1):42-6))、薬学的応用のための組換え型ヒトアルブミンを含む(Bosse et al. (2005). J Clin Pharmacol 45(1): 57-67)。HSAの三次元構造は、X線結晶によって解明されている(Carter et al. (1989). Science 244(4909): 1 195〜8; Sugio et al. (1999). Protein Eng 12(6): 439-46)。HSAポリペプチド鎖は、35個のシステイン残基を有し、成熟タンパク質(配列番号1)の34位に17個のジスルフィド結合及び1つの不対(自由)システインを形成する。システイン34は、分子のアルブミンへの結合のために使用されており(Leger et al. (2004) Bioorg Med Chem Lett 14(17): 4395-8; Thibaudeau et al. (2005). Bioconjug Chem 16(4): 1000-8)、結合に関して正確であり且つ十分に規定された部位を供する。しかしながら、システイン34での結合は、単一部分の付着のためのたった1つの部位を供し、従って結合部位の選択はない。また、1つの結合部位の提供は、たった1つの部分を各アルブミン分子に結合させることができることを意味する。よって、1又は複数の代替付着部位を供するアルブミン分子が必要である。

概要

合コンテントアルブミン及びアルブミン関連ポリペプチド、並びに少なくとも一部分を有するこれらの複合体、並びにこれらをコードするポリヌクレオチドを提供することを目的とする。アルブミンの三次元構造に基づいて、本発明者は、遊離チオール基を有する、1又は複数のシステイン残基を有する変異体ポリペプチド変異タンパク質)をデザインした(以下、「チオアルブミン」と呼ぶ)。変異体ポリペプチドは、システイン残基の硫黄原子を介して、結合パートナー、例えば生物活性化合物に結合させる。なし

目的

高い結合コンピテンスを有するチオアルブミンの利点は、分子のチオアルブミンへの有効な結合を可能にすることである

効果

実績

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請求項1

列番号1のアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列、又は1若しくは数個アミノ酸残基が配列番号1のアミノ酸配列において欠失置換若しくは付加されているアミノ酸配列を含む結合コンテントポリペプチドであって、該ポリペプチドは、配列番号1のN若しくはC末端に関して1番目、2番目、3番目、4番目若しくは5番目の残基に相当するアミノ酸残基位置のN側若しくはC側で位置され又は挿入され、或いは以下の条件:a)少なくとも80%の溶媒表面接触性;b)少なくとも30のBファクタースコア;c)熱不安定性を生じることが知られる多型が存在しないこと、を満たすアミノ酸残基位置に位置され、又は該アミノ酸残基位置のN側若しくはC側に挿入される結合コンピテントシステイン残基を有し、ここで、前記結合コンピテントポリペプチドがヒト血清アルブミンとして機能する、上記結合コンピテントポリペプチド。

請求項2

前記結合コンピテントシステイン残基が、以下の条件:a)二次構造内に存在せず、Bファクターが少なくとも60であり、及び表面接触性が少なくとも90%である;b)二次構造内に存在し、Bファクターが少なくとも40であり、及び表面接触性が少なくとも90%である;c)二次構造内に存在せず、Bファクターが少なくとも50である;或いは、d)二次構造内に存在し、Bファクターが少なくとも30である、を満たすアミノ酸残基位置に位置され、又は該アミノ酸残基位置のN側若しくはC側に挿入される、請求項1に記載の結合コンピテントポリペプチド。

請求項3

前記結合コンピテントシステイン残基が、ヒト血清アルブミン(HSA)のD38、E40、E48、T52、A55、D56、S58、E60、D63、T76、T79、L80、R81、E82、T83、E86、D89、A92、Q94、P96、Q104、N109、N111、P113、R114、L115、V116、P118、E119、D121、V122、T125、D129、N130、Q170、A172、E227、A229、E266、D269、S270、S273、E280、P282、L283、E294、E297、M298、A300、D301、P303、S304、D308、E311、K313、D314、N318、A320、E321、D324、V325、T355、K359、A362、A364、D365、E368、A371、D375、P379、N386、Q390、E396、Q397、K439、P441、E442、A443、T467、P468、V469、D471、T478、E479、N483、A490、E492、E495、T496、V498、P499、K500、E501、N503、A504、E505、T506、T508、H510、D512、T515、K538、A539、K541、E542、A546、D549、D550、K560、D562、K564、E565、T566、K573、K574、A577、A578、Q580、A581、及びA582から選択されるアミノ酸残基位置に位置され、又は該アミノ酸残基のN側若しくはC側に挿入される、請求項1又は2に記載の結合コンピテントポリペプチド。

請求項4

配列番号1の位置2及び585と等価な位置に、結合コンピテントシステイン残基を含んでなる、請求項1〜3のいずれか1項に記載の結合コンピテントポリペプチド。

請求項5

前記ポリペプチドが、1又は複数の:a)配列番号1の残基L585、D1、A2、D562、A364、A504、E505、T79、E86、D129、D549、A581、D121、E82、S270、Q397及びA578のいずれかと等価な位置に相当する位置における、システイン以外のアミノ酸のシステインでの置換;b)配列番号1の残基L585、D1、A2、D562、A364、A504、E505、T79、E86、D129、D549、A581、D121、E82、S270、Q397及びA578のいずれかと等価な位置に相当するアミノ酸のN又はC側に隣接する位置におけるシステインの挿入;c)C369、C361、C91、C177、C567、C316、C75、C169、C124及びC558のいずれかにおいて結合コンピテントシステインを生じるための、配列番号1のC360、C316、C75、C168、C558、C361、C91、C124、C169及びC567のいずれかに相当する位置におけるシステインの欠失;d)アルブミン配列のN末端残基のN側又はアルブミン配列のC末端残基のC側へのシステインの付加、を含んでなるポリペプチドであって、これにより、(a)、(b)、(c)及び(d)の置換、欠失、付加又は挿入事象は、ポリペプチド配列の結合コンピテントシステイン残基数を、当該置換、挿入、欠失及び付加事象前のポリペプチドに対して増加する結果となる、請求項1〜4のいずれか1項に記載の結合コンピテントポリペプチド。

請求項6

少なくとも1個のシステイン残基が、異なるアミノ酸残基、特にSer、Thr、Val又はAlaで置換された、請求項1〜5のいずれか1項に記載の結合コンピテントポリペプチド。

請求項7

3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19又は20個の結合コンピテントシステイン残基を含んでなる、請求項1〜6のいずれか1項に記載の結合コンピテントポリペプチド。

請求項8

前記ポリペプチドが3個又はそれ以上の結合コンピテントシステイン残基を含んでなる場合に、ポリペプチドが折り畳まれると、2個又はそれ以上の結合コンピテントシステイン残基の間に少なくとも10Åの距離が存在する、請求項1〜7のいずれか1項に記載の結合コンピテントポリペプチド。

請求項9

1又は複数の結合コンピテントシステインが、生物活性分子に結合される、請求項1〜8のいずれか1項に記載の結合コンピテントポリペプチド。

請求項10

前記ポリペプチドが、配列番号1と少なくとも95%の配列同一性を有し、(a)A2+L585、(b)A2+A364+D562+L585C、(c)A2及びアルブミンのC末端のC側の隣接部位(d)T79+A364;(e)A364+D1;(f)T79+D562+A364;(g)D562+A364+D1;(h)T79+D562+A364+A504;(i)T79+D562+A364+L585;C)T79+D562+A364+D1;(k)T79+D562+A364+L585+D1;(I)E86+D562+A364+A504+A2;(m)S270+A581;(n)S270+D129;(o)S270+A581+E82;(p)S270+A581+D129;(q)S270+A581+E82+D129;(r)S270+A581+E82+D129+Q397;(s)C369+C177;(t)A364+A581;(u)T79+A364+A581;(v)A364+A581+D129;(w)A364+C177;(x)D562+C369;(y)D129+C369;(z)A581+C369;又は(ai)D562+D129+C369に位置する結合コンピテント残基を含んでなる、請求項1〜9のいずれか1項に記載の結合コンピテントポリペプチド。

請求項11

前記ポリペプチドが、生物活性化合物に結合できるさらなるリンカーをさらに含んでなる、請求項1〜10のいずれか1項に記載の結合コンピテントポリペプチド。

請求項12

請求項1〜11のいずれか1項に記載の結合コンピテントポリペプチドと融合パートナーポリペプチドを含む融合ポリペプチド

請求項13

請求項1〜12のいずれか1項に記載のポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド

請求項14

請求項13に記載のポリヌクレオチドを含んでなる、プラスミド

請求項15

請求項13に記載のポリヌクレオチド及び/又は請求項14に記載のプラスミドを含んでなる、宿主細胞

請求項16

酵母細胞、特に出芽酵母細胞である、請求項15に記載の宿主細胞。

請求項17

生物活性化合物及び請求項1〜16のいずれか1項に記載のポリペプチドを含んでなる複合体であって、ここで生物活性化合物が、ポリペプチドの結合コンピテントシステイン残基を介してポリペプチドに結合される複合体。

請求項18

1又は複数のさらなる生物活性化合物をさらに含んでなり、各生物活性化合物が、ポリペプチドの結合コンピテントシステイン残基を介してポリペプチドに結合される、請求項17に記載の複合体。

請求項19

a)前記ポリペプチドの発現が可能な条件下で、請求項15又は16に記載の宿主細胞を培養する段階;及び、b)宿主細胞及び/又は宿主細胞成長培地からポリペプチドを回収する段階、を含んでなる、請求項1〜18のいずれか1項に記載のポリペプチドの製造方法。

請求項20

前記ポリペプチドの結合コンピテントシステイン残基を介して、請求項1〜12のいずれか1項に記載のポリペプチドに、生物活性化合物を結合させる段階を含んでなる、請求項17又は18に記載の複合体の製造方法。

請求項21

前記宿主細胞が増強されたシャペロン活性を示す、請求項19又は20に記載の方法。

請求項22

請求項17又は18に記載の複合体、及び少なくとも1個の医薬的に許容されるキャリア又は希釈剤を含んでなる組成物

請求項23

疾病治療、疾患の治療及び/又は診断のための、請求項17若しくは18に記載の複合体、又は請求項19〜21のいずれか1項に記載の方法によって生成される複合体の使用。

請求項24

前記ポリペプチドの受容体結合能力及び/又は結合コンピテンスを測定する段階、並びに受容体結合能力及び/又は結合コンピテンスを有するポリペプチドを選択する段階をさらに含んでなる、請求項19又は20に記載の方法。

技術分野

0001

配列表への言及
本願は、コンピューター可読形式の配列表を含む。コンピューター可読形式は、明細書中に参照により組み込まれている。

0002

本発明の分野
本発明は、結合コンテントアルブミン及びアルブミン関連ポリペプチド、並びに少なくとも一部分を有するこれらの複合体、並びにこれらをコードするポリヌクレオチドに関する。

背景技術

0003

血清アルブミンは、融合分子の特性を改善するために、遺伝子融合又は化学融合を介して、生物活性分子が融合する重要なスキャフォールドを供する(Leger, R. et al. (2004). Bioorg Med Chem Lett 14(17): 4395-8; Thibau- deau, K., et al. (2005). Bioconjug Chem 16(4): 1000〜8; Balan, V. et al. (2006). Antivir Ther 11 (1 ): 35〜45; EP 0 413 622; WO 90/13653; EP 1 681 304; WO 1997/024445; WO 01/79271)。アルブミン及びアルブミン粒子はまた、薬物及びプロドラッグをこれらの作用部位運ぶ又は届けるために重要である(Kratz (2008) Journal of Controlled Release, 132 (3), p.171-183)。融合及び粒子技術は、改善された薬物動態特性、例えば半減期延長などに起因する改善された投与計画を供し、そしてバイオアベイラビリティを改善し、融合した生物活性分子を不活化から保護する。

0004

アルブミンの生化学遺伝学及び医学的な応用は、特徴がはっきりしている(「All about Albumin」, T. Peters Jr., Academic Press N. Y., and http://www. albumin.org/)。ヒト血清アルブミンHSA,HAとも呼ばれる)は、〜60g/L濃度のヒト血漿中で最も豊富タンパク質である。HSAの配列は、配列番号1で供される。HSAの自然変異体は生じており、そして周知の多型の一覧は、Minchiotti等(2008)のHum Mutat 29(8):1007−16.,及びhttp://www.uniprot.org/uniprot/P02768に掲載される。

0005

組換え型ヒトアルブミンの生成物及び精製は、確立されており(WO 95/23857; WO 00/44772; WO 2006/066595; EP 0 305 216; Sleep et al. 1990 Biotechnology (N Y). 1990 Jan; 8(1):42-6))、薬学的応用のための組換え型ヒトアルブミンを含む(Bosse et al. (2005). J Clin Pharmacol 45(1): 57-67)。HSAの三次元構造は、X線結晶によって解明されている(Carter et al. (1989). Science 244(4909): 1 195〜8; Sugio et al. (1999). Protein Eng 12(6): 439-46)。HSAポリペプチド鎖は、35個のシステイン残基を有し、成熟タンパク質(配列番号1)の34位に17個のジスルフィド結合及び1つの不対(自由)システインを形成する。システイン34は、分子のアルブミンへの結合のために使用されており(Leger et al. (2004) Bioorg Med Chem Lett 14(17): 4395-8; Thibaudeau et al. (2005). Bioconjug Chem 16(4): 1000-8)、結合に関して正確であり且つ十分に規定された部位を供する。しかしながら、システイン34での結合は、単一部分の付着のためのたった1つの部位を供し、従って結合部位の選択はない。また、1つの結合部位の提供は、たった1つの部分を各アルブミン分子に結合させることができることを意味する。よって、1又は複数の代替付着部位を供するアルブミン分子が必要である。

0006

ヒト血清アルブミン(HSA)、アルブミンポリペプチド内の保存残基及びこれらの自然多型の三次元構造の分析に基づいて、本発明者は、1又は複数の結合コンピテント(conjugation competent)システイン残基を有するアルブミンの変異体ポリペプチド変異タンパク質)をデザインした。用語「チオアルブミン」は、1又は複数の不対システイン残基を含んでなるアルブミン変異体、特に1又は複数の不対システイン残基がアルブミンの自然発生変異体中に生じないアルブミン変異体を説明するために本明細書中で使用される。従って、チオアルブミンは、「結合コンピテントアルブミン」である。チオアルブミンは、「アルブミンのシステイン変異体」と呼んでもよい。
本明細書を通じて、用語「アルブミン」は、自然発生のアルブミン、アルブミン関連タンパク質及びこれらの変異体、例えば天然及び組換え変異体などを含む。変異体は、多型、断片、例えばドメイン及びサブドメイン、断片及び/又は融合タンパク質などを含む。アルブミンは、配列番号1と少なくとも40、50、60、70、80、90、95、96、97、98、99%の類似性又は同一性を有する。従って、本発明のチオアルブミンは、このようなアルブミンのいずれかの誘導体である、又はいずれかに基づいてよい。

0007

不対システイン残基は、アルブミン配列の挿入、欠失置換、付加又は延長によって提供されてよい。本発明はまた、少なくとも1つ、例えば2、3、4、5又は6個の結合パートナー、例えば生物活性化合物及び本発明のポリペプチドなどを含んでなる複合体に関する。

0008

本発明はまた、結合コンピテントアルブミンをデザインするための方法を供する。

図面の簡単な説明

0009

図1−1は、結合コンピテントシステインの生成のためのアミノ酸置換、挿入及び欠失のための、ヒト血清アルブミン(配列番号1)中の部位選択のために使用される判定基準を示している表である。
図1−2は、結合コンピテントシステインの生成のためのアミノ酸置換、挿入及び欠失のための、ヒト血清アルブミン(配列番号1)中の部位選択のために使用される判定基準を示している表である。
図1−3は、結合コンピテントシステインの生成のためのアミノ酸置換、挿入及び欠失のための、ヒト血清アルブミン(配列番号1)中の部位選択のために使用される判定基準を示している表である。
図1−4は、結合コンピテントシステインの生成のためのアミノ酸置換、挿入及び欠失のための、ヒト血清アルブミン(配列番号1)中の部位選択のために使用される判定基準を示している表である。
図1−5は、結合コンピテントシステインの生成のためのアミノ酸置換、挿入及び欠失のための、ヒト血清アルブミン(配列番号1)中の部位選択のために使用される判定基準を示している表である。
図1−6は、結合コンピテントシステインの生成のためのアミノ酸置換、挿入及び欠失のための、ヒト血清アルブミン(配列番号1)中の部位選択のために使用される判定基準を示している表である。
図1−7は、結合コンピテントシステインの生成のためのアミノ酸置換、挿入及び欠失のための、ヒト血清アルブミン(配列番号1)中の部位選択のために使用される判定基準を示している表である。
図1−8は、結合コンピテントシステインの生成のためのアミノ酸置換、挿入及び欠失のための、ヒト血清アルブミン(配列番号1)中の部位選択のために使用される判定基準を示している表である。
図1−9は、結合コンピテントシステインの生成のためのアミノ酸置換、挿入及び欠失のための、ヒト血清アルブミン(配列番号1)中の部位選択のために使用される判定基準を示している表である。
図1−10は、結合コンピテントシステインの生成のためのアミノ酸置換、挿入及び欠失のための、ヒト血清アルブミン(配列番号1)中の部位選択のために使用される判定基準を示している表である。
図1−11は、結合コンピテントシステインの生成のためのアミノ酸置換、挿入及び欠失のための、ヒト血清アルブミン(配列番号1)中の部位選択のために使用される判定基準を示している表である。
図1−12は、結合コンピテントシステインの生成のためのアミノ酸置換、挿入及び欠失のための、ヒト血清アルブミン(配列番号1)中の部位選択のために使用される判定基準を示している表である。
図1−13は、結合コンピテントシステインの生成のためのアミノ酸置換、挿入及び欠失のための、ヒト血清アルブミン(配列番号1)中の部位選択のために使用される判定基準を示している表である。
図1−14は、結合コンピテントシステインの生成のためのアミノ酸置換、挿入及び欠失のための、ヒト血清アルブミン(配列番号1)中の部位選択のために使用される判定基準を示している表である。
図1−15は、結合コンピテントシステインの生成のためのアミノ酸置換、挿入及び欠失のための、ヒト血清アルブミン(配列番号1)中の部位選択のために使用される判定基準を示している表である。
図1−16は、結合コンピテントシステインの生成のためのアミノ酸置換、挿入及び欠失のための、ヒト血清アルブミン(配列番号1)中の部位選択のために使用される判定基準を示している表である。
図1−17は、結合コンピテントシステインの生成のためのアミノ酸置換、挿入及び欠失のための、ヒト血清アルブミン(配列番号1)中の部位選択のために使用される判定基準を示している表である。
図1−18は、結合コンピテントシステインの生成のためのアミノ酸置換、挿入及び欠失のための、ヒト血清アルブミン(配列番号1)中の部位選択のために使用される判定基準を示している表である。
図1−19は、結合コンピテントシステインの生成のためのアミノ酸置換、挿入及び欠失のための、ヒト血清アルブミン(配列番号1)中の部位選択のために使用される判定基準を示している表である。
図1−20は、結合コンピテントシステインの生成のためのアミノ酸置換、挿入及び欠失のための、ヒト血清アルブミン(配列番号1)中の部位選択のために使用される判定基準を示している表である。
図1−21は、結合コンピテントシステインの生成のためのアミノ酸置換、挿入及び欠失のための、ヒト血清アルブミン(配列番号1)中の部位選択のために使用される判定基準を示している表である。

0010

図2−1は、ヒト血清アルブミンのアミノ酸配列(配列番号1=ヒト-P02768.pro)の、15種の他の哺乳類由来のアルブミンとのアライメントを示している。「マジョリティ」は、コンセンサス配列を示す。「+マジョリティ」は、16個全ての配列間の相対的相同性棒グラフ形態で示し、棒の長さは相対的相同性20、40、60、80及び100%を示す。タンパク質配列は、リーダー配列を含む。
図2−2は、ヒト血清アルブミンのアミノ酸配列(配列番号1=ヒト-P02768.pro)の、15種の他の哺乳類由来のアルブミンとのアライメントを示している。「マジョリティ」は、コンセンサス配列を示す。「+マジョリティ」は、16個全ての配列間の相対的相同性を棒グラフ形態で示し、棒の長さは相対的相同性20、40、60、80及び100%を示す。タンパク質配列は、リーダー配列を含む。
図2−3は、ヒト血清アルブミンのアミノ酸配列(配列番号1=ヒト-P02768.pro)の、15種の他の哺乳類由来のアルブミンとのアライメントを示している。「マジョリティ」は、コンセンサス配列を示す。「+マジョリティ」は、16個全ての配列間の相対的相同性を棒グラフ形態で示し、棒の長さは相対的相同性20、40、60、80及び100%を示す。タンパク質配列は、リーダー配列を含む。
図2−4は、ヒト血清アルブミンのアミノ酸配列(配列番号1=ヒト-P02768.pro)の、15種の他の哺乳類由来のアルブミンとのアライメントを示している。「マジョリティ」は、コンセンサス配列を示す。「+マジョリティ」は、16個全ての配列間の相対的相同性を棒グラフ形態で示し、棒の長さは相対的相同性20、40、60、80及び100%を示す。タンパク質配列は、リーダー配列を含む。
図2−5は、ヒト血清アルブミンのアミノ酸配列(配列番号1=ヒト-P02768.pro)の、15種の他の哺乳類由来のアルブミンとのアライメントを示している。「マジョリティ」は、コンセンサス配列を示す。「+マジョリティ」は、16個全ての配列間の相対的相同性を棒グラフ形態で示し、棒の長さは相対的相同性20、40、60、80及び100%を示す。タンパク質配列は、リーダー配列を含む。
図2−6は、ヒト血清アルブミンのアミノ酸配列(配列番号1=ヒト-P02768.pro)の、15種の他の哺乳類由来のアルブミンとのアライメントを示している。「マジョリティ」は、コンセンサス配列を示す。「+マジョリティ」は、16個全ての配列間の相対的相同性を棒グラフ形態で示し、棒の長さは相対的相同性20、40、60、80及び100%を示す。タンパク質配列は、リーダー配列を含む。
図2−7は、ヒト血清アルブミンのアミノ酸配列(配列番号1=ヒト-P02768.pro)の、15種の他の哺乳類由来のアルブミンとのアライメントを示している。「マジョリティ」は、コンセンサス配列を示す。「+マジョリティ」は、16個全ての配列間の相対的相同性を棒グラフ形態で示し、棒の長さは相対的相同性20、40、60、80及び100%を示す。タンパク質配列は、リーダー配列を含む。
図2−8は、ヒト血清アルブミンのアミノ酸配列(配列番号1=ヒト-P02768.pro)の、15種の他の哺乳類由来のアルブミンとのアライメントを示している。「マジョリティ」は、コンセンサス配列を示す。「+マジョリティ」は、16個全ての配列間の相対的相同性を棒グラフ形態で示し、棒の長さは相対的相同性20、40、60、80及び100%を示す。タンパク質配列は、リーダー配列を含む。

0011

図3−1は、一部が哺乳類である他の32種に由来するアルブミンと共に、ヒト血清アルブミン(P02768.pro=配列番号1)のアミノ酸配列のアライメントを示す。「マジョリティ」は、コンセンサス配列を示す。「+マジョリティ」は、33個全ての配列間の相対的相同性を棒グラフ形態で示し、棒の長さは相対的相同性20、40、60、80及び100%を示す。タンパク質配列は、リーダー配列を含む。P02768.pro:ヒト;P02769.pro:ウシ;P49064.pro:ネコ;P49822.pro:イヌ;Q5XLE4.pro:ロバ;J C5838.pro:スナネズミ;ACF10391,1.pro:ヤギ断片;AAQ20088.pro:モルモット;P35747.pro:ウマ;Q28522.pro:マカク;P07724.pro:ネズミ;P08835.pro:ブタ;P02770.pro:ラット;P49065.pro:ウサギ;Q28522.pro:アカゲザル;P14639.pro:ヒツジ;NP_001127106.pro:オランウータン;P19121.pro:ニワトリ;P01012.pro:ニワトリ卵白アルブミン;073860.pro:シチメンチョウ卵白アルブミン;AAC63407.pro:ウミヤツメ;Q91274.pro:ウミヤツメ;P21847.pro:ウシガエル;AAD09358.pro:アルニアカエル(Rana shqiperica);ABXL68.pro:ゼノパス;NP_001004887.pro:ゼノパス;AAL56646.pro:スポティッドサラマンダー(Spotted Salamander);Q03156.pro:大西洋サケ;P21848.pro:大西洋サケ;AAM46104.pro:ムカシトカゲ;P83517.pro:オーストラリア肺魚;S59517.pro:モノルコブラ;AAL08579.pro:マンソン住血吸虫

0012

図3−2は、一部が哺乳類である他の32種に由来するアルブミンと共に、ヒト血清アルブミン(P02768.pro=配列番号1)のアミノ酸配列のアライメントを示す。「マジョリティ」は、コンセンサス配列を示す。「+マジョリティ」は、33個全ての配列間の相対的相同性を棒グラフ形態で示し、棒の長さは相対的相同性20、40、60、80及び100%を示す。タンパク質配列は、リーダー配列を含む。P02768.pro:ヒト;P02769.pro:ウシ;P49064.pro:ネコ;P49822.pro:イヌ;Q5XLE4.pro:ロバ;J C5838.pro:スナネズミ;ACF10391,1.pro:ヤギ断片;AAQ20088.pro:モルモット;P35747.pro:ウマ;Q28522.pro:マカク;P07724.pro:ネズミ;P08835.pro:ブタ;P02770.pro:ラット;P49065.pro:ウサギ;Q28522.pro:アカゲザル;P14639.pro:ヒツジ;NP_001127106.pro:オランウータン;P19121.pro:ニワトリ;P01012.pro:ニワトリ卵白アルブミン;073860.pro:シチメンチョウ卵白アルブミン;AAC63407.pro:ウミヤツメ;Q91274.pro:ウミヤツメ;P21847.pro:ウシガエル;AAD09358.pro:アルバニア水カエル(Rana shqiperica);ABXL68.pro:ゼノパス;NP_001004887.pro:ゼノパス;AAL56646.pro:スポッティッドサラマンダー(Spotted Salamander);Q03156.pro:大西洋サケ;P21848.pro:大西洋サケ;AAM46104.pro:ムカシトカゲ;P83517.pro:オーストラリア肺魚;S59517.pro:モノクルコブラ;AAL08579.pro:マンソン住血吸虫。

0013

図3−3は、一部が哺乳類である他の32種に由来するアルブミンと共に、ヒト血清アルブミン(P02768.pro=配列番号1)のアミノ酸配列のアライメントを示す。「マジョリティ」は、コンセンサス配列を示す。「+マジョリティ」は、33個全ての配列間の相対的相同性を棒グラフ形態で示し、棒の長さは相対的相同性20、40、60、80及び100%を示す。タンパク質配列は、リーダー配列を含む。P02768.pro:ヒト;P02769.pro:ウシ;P49064.pro:ネコ;P49822.pro:イヌ;Q5XLE4.pro:ロバ;J C5838.pro:スナネズミ;ACF10391,1.pro:ヤギ断片;AAQ20088.pro:モルモット;P35747.pro:ウマ;Q28522.pro:マカク;P07724.pro:ネズミ;P08835.pro:ブタ;P02770.pro:ラット;P49065.pro:ウサギ;Q28522.pro:アカゲザル;P14639.pro:ヒツジ;NP_001127106.pro:オランウータン;P19121.pro:ニワトリ;P01012.pro:ニワトリ卵白アルブミン;073860.pro:シチメンチョウ卵白アルブミン;AAC63407.pro:ウミヤツメ;Q91274.pro:ウミヤツメ;P21847.pro:ウシガエル;AAD09358.pro:アルバニア水カエル(Rana shqiperica);ABXL68.pro:ゼノパス;NP_001004887.pro:ゼノパス;AAL56646.pro:スポッティッドサラマンダー(Spotted Salamander);Q03156.pro:大西洋サケ;P21848.pro:大西洋サケ;AAM46104.pro:ムカシトカゲ;P83517.pro:オーストラリア肺魚;S59517.pro:モノクルコブラ;AAL08579.pro:マンソン住血吸虫。
図3−4は、一部が哺乳類である他の32種に由来するアルブミンと共に、ヒト血清アルブミン(P02768.pro=配列番号1)のアミノ酸配列のアライメントを示す。「マジョリティ」は、コンセンサス配列を示す。「+マジョリティ」は、33個全ての配列間の相対的相同性を棒グラフ形態で示し、棒の長さは相対的相同性20、40、60、80及び100%を示す。タンパク質配列は、リーダー配列を含む。P02768.pro:ヒト;P02769.pro:ウシ;P49064.pro:ネコ;P49822.pro:イヌ;Q5XLE4.pro:ロバ;J C5838.pro:スナネズミ;ACF10391,1.pro:ヤギ断片;AAQ20088.pro:モルモット;P35747.pro:ウマ;Q28522.pro:マカク;P07724.pro:ネズミ;P08835.pro:ブタ;P02770.pro:ラット;P49065.pro:ウサギ;Q28522.pro:アカゲザル;P14639.pro:ヒツジ;NP_001127106.pro:オランウータン;P19121.pro:ニワトリ;P01012.pro:ニワトリ卵白アルブミン;073860.pro:シチメンチョウ卵白アルブミン;AAC63407.pro:ウミヤツメ;Q91274.pro:ウミヤツメ;P21847.pro:ウシガエル;AAD09358.pro:アルバニア水カエル(Rana shqiperica);ABXL68.pro:ゼノパス;NP_001004887.pro:ゼノパス;AAL56646.pro:スポッティッドサラマンダー(Spotted Salamander);Q03156.pro:大西洋サケ;P21848.pro:大西洋サケ;AAM46104.pro:ムカシトカゲ;P83517.pro:オーストラリア肺魚;S59517.pro:モノクルコブラ;AAL08579.pro:マンソン住血吸虫。
図3−5は、一部が哺乳類である他の32種に由来するアルブミンと共に、ヒト血清アルブミン(P02768.pro=配列番号1)のアミノ酸配列のアライメントを示す。「マジョリティ」は、コンセンサス配列を示す。「+マジョリティ」は、33個全ての配列間の相対的相同性を棒グラフ形態で示し、棒の長さは相対的相同性20、40、60、80及び100%を示す。タンパク質配列は、リーダー配列を含む。P02768.pro:ヒト;P02769.pro:ウシ;P49064.pro:ネコ;P49822.pro:イヌ;Q5XLE4.pro:ロバ;J C5838.pro:スナネズミ;ACF10391,1.pro:ヤギ断片;AAQ20088.pro:モルモット;P35747.pro:ウマ;Q28522.pro:マカク;P07724.pro:ネズミ;P08835.pro:ブタ;P02770.pro:ラット;P49065.pro:ウサギ;Q28522.pro:アカゲザル;P14639.pro:ヒツジ;NP_001127106.pro:オランウータン;P19121.pro:ニワトリ;P01012.pro:ニワトリ卵白アルブミン;073860.pro:シチメンチョウ卵白アルブミン;AAC63407.pro:ウミヤツメ;Q91274.pro:ウミヤツメ;P21847.pro:ウシガエル;AAD09358.pro:アルバニア水カエル(Rana shqiperica);ABXL68.pro:ゼノパス;NP_001004887.pro:ゼノパス;AAL56646.pro:スポッティッドサラマンダー(Spotted Salamander);Q03156.pro:大西洋サケ;P21848.pro:大西洋サケ;AAM46104.pro:ムカシトカゲ;P83517.pro:オーストラリア肺魚;S59517.pro:モノクルコブラ;AAL08579.pro:マンソン住血吸虫。
図3−6は、一部が哺乳類である他の32種に由来するアルブミンと共に、ヒト血清アルブミン(P02768.pro=配列番号1)のアミノ酸配列のアライメントを示す。「マジョリティ」は、コンセンサス配列を示す。「+マジョリティ」は、33個全ての配列間の相対的相同性を棒グラフ形態で示し、棒の長さは相対的相同性20、40、60、80及び100%を示す。タンパク質配列は、リーダー配列を含む。P02768.pro:ヒト;P02769.pro:ウシ;P49064.pro:ネコ;P49822.pro:イヌ;Q5XLE4.pro:ロバ;J C5838.pro:スナネズミ;ACF10391,1.pro:ヤギ断片;AAQ20088.pro:モルモット;P35747.pro:ウマ;Q28522.pro:マカク;P07724.pro:ネズミ;P08835.pro:ブタ;P02770.pro:ラット;P49065.pro:ウサギ;Q28522.pro:アカゲザル;P14639.pro:ヒツジ;NP_001127106.pro:オランウータン;P19121.pro:ニワトリ;P01012.pro:ニワトリ卵白アルブミン;073860.pro:シチメンチョウ卵白アルブミン;AAC63407.pro:ウミヤツメ;Q91274.pro:ウミヤツメ;P21847.pro:ウシガエル;AAD09358.pro:アルバニア水カエル(Rana shqiperica);ABXL68.pro:ゼノパス;NP_001004887.pro:ゼノパス;AAL56646.pro:スポッティッドサラマンダー(Spotted Salamander);Q03156.pro:大西洋サケ;P21848.pro:大西洋サケ;AAM46104.pro:ムカシトカゲ;P83517.pro:オーストラリア肺魚;S59517.pro:モノクルコブラ;AAL08579.pro:マンソン住血吸虫。
図3−7は、一部が哺乳類である他の32種に由来するアルブミンと共に、ヒト血清アルブミン(P02768.pro=配列番号1)のアミノ酸配列のアライメントを示す。「マジョリティ」は、コンセンサス配列を示す。「+マジョリティ」は、33個全ての配列間の相対的相同性を棒グラフ形態で示し、棒の長さは相対的相同性20、40、60、80及び100%を示す。タンパク質配列は、リーダー配列を含む。P02768.pro:ヒト;P02769.pro:ウシ;P49064.pro:ネコ;P49822.pro:イヌ;Q5XLE4.pro:ロバ;J C5838.pro:スナネズミ;ACF10391,1.pro:ヤギ断片;AAQ20088.pro:モルモット;P35747.pro:ウマ;Q28522.pro:マカク;P07724.pro:ネズミ;P08835.pro:ブタ;P02770.pro:ラット;P49065.pro:ウサギ;Q28522.pro:アカゲザル;P14639.pro:ヒツジ;NP_001127106.pro:オランウータン;P19121.pro:ニワトリ;P01012.pro:ニワトリ卵白アルブミン;073860.pro:シチメンチョウ卵白アルブミン;AAC63407.pro:ウミヤツメ;Q91274.pro:ウミヤツメ;P21847.pro:ウシガエル;AAD09358.pro:アルバニア水カエル(Rana shqiperica);ABXL68.pro:ゼノパス;NP_001004887.pro:ゼノパス;AAL56646.pro:スポッティッドサラマンダー(Spotted Salamander);Q03156.pro:大西洋サケ;P21848.pro:大西洋サケ;AAM46104.pro:ムカシトカゲ;P83517.pro:オーストラリア肺魚;S59517.pro:モノクルコブラ;AAL08579.pro:マンソン住血吸虫。
図3−8は、一部が哺乳類である他の32種に由来するアルブミンと共に、ヒト血清アルブミン(P02768.pro=配列番号1)のアミノ酸配列のアライメントを示す。「マジョリティ」は、コンセンサス配列を示す。「+マジョリティ」は、33個全ての配列間の相対的相同性を棒グラフ形態で示し、棒の長さは相対的相同性20、40、60、80及び100%を示す。タンパク質配列は、リーダー配列を含む。P02768.pro:ヒト;P02769.pro:ウシ;P49064.pro:ネコ;P49822.pro:イヌ;Q5XLE4.pro:ロバ;J C5838.pro:スナネズミ;ACF10391,1.pro:ヤギ断片;AAQ20088.pro:モルモット;P35747.pro:ウマ;Q28522.pro:マカク;P07724.pro:ネズミ;P08835.pro:ブタ;P02770.pro:ラット;P49065.pro:ウサギ;Q28522.pro:アカゲザル;P14639.pro:ヒツジ;NP_001127106.pro:オランウータン;P19121.pro:ニワトリ;P01012.pro:ニワトリ卵白アルブミン;073860.pro:シチメンチョウ卵白アルブミン;AAC63407.pro:ウミヤツメ;Q91274.pro:ウミヤツメ;P21847.pro:ウシガエル;AAD09358.pro:アルバニア水カエル(Rana shqiperica);ABXL68.pro:ゼノパス;NP_001004887.pro:ゼノパス;AAL56646.pro:スポッティッドサラマンダー(Spotted Salamander);Q03156.pro:大西洋サケ;P21848.pro:大西洋サケ;AAM46104.pro:ムカシトカゲ;P83517.pro:オーストラリア肺魚;S59517.pro:モノクルコブラ;AAL08579.pro:マンソン住血吸虫。
図3−9は、一部が哺乳類である他の32種に由来するアルブミンと共に、ヒト血清アルブミン(P02768.pro=配列番号1)のアミノ酸配列のアライメントを示す。「マジョリティ」は、コンセンサス配列を示す。「+マジョリティ」は、33個全ての配列間の相対的相同性を棒グラフ形態で示し、棒の長さは相対的相同性20、40、60、80及び100%を示す。タンパク質配列は、リーダー配列を含む。P02768.pro:ヒト;P02769.pro:ウシ;P49064.pro:ネコ;P49822.pro:イヌ;Q5XLE4.pro:ロバ;J C5838.pro:スナネズミ;ACF10391,1.pro:ヤギ断片;AAQ20088.pro:モルモット;P35747.pro:ウマ;Q28522.pro:マカク;P07724.pro:ネズミ;P08835.pro:ブタ;P02770.pro:ラット;P49065.pro:ウサギ;Q28522.pro:アカゲザル;P14639.pro:ヒツジ;NP_001127106.pro:オランウータン;P19121.pro:ニワトリ;P01012.pro:ニワトリ卵白アルブミン;073860.pro:シチメンチョウ卵白アルブミン;AAC63407.pro:ウミヤツメ;Q91274.pro:ウミヤツメ;P21847.pro:ウシガエル;AAD09358.pro:アルバニア水カエル(Rana shqiperica);ABXL68.pro:ゼノパス;NP_001004887.pro:ゼノパス;AAL56646.pro:スポッティッドサラマンダー(Spotted Salamander);Q03156.pro:大西洋サケ;P21848.pro:大西洋サケ;AAM46104.pro:ムカシトカゲ;P83517.pro:オーストラリア肺魚;S59517.pro:モノクルコブラ;AAL08579.pro:マンソン住血吸虫。
図3−10は、一部が哺乳類である他の32種に由来するアルブミンと共に、ヒト血清アルブミン(P02768.pro=配列番号1)のアミノ酸配列のアライメントを示す。「マジョリティ」は、コンセンサス配列を示す。「+マジョリティ」は、33個全ての配列間の相対的相同性を棒グラフ形態で示し、棒の長さは相対的相同性20、40、60、80及び100%を示す。タンパク質配列は、リーダー配列を含む。P02768.pro:ヒト;P02769.pro:ウシ;P49064.pro:ネコ;P49822.pro:イヌ;Q5XLE4.pro:ロバ;J C5838.pro:スナネズミ;ACF10391,1.pro:ヤギ断片;AAQ20088.pro:モルモット;P35747.pro:ウマ;Q28522.pro:マカク;P07724.pro:ネズミ;P08835.pro:ブタ;P02770.pro:ラット;P49065.pro:ウサギ;Q28522.pro:アカゲザル;P14639.pro:ヒツジ;NP_001127106.pro:オランウータン;P19121.pro:ニワトリ;P01012.pro:ニワトリ卵白アルブミン;073860.pro:シチメンチョウ卵白アルブミン;AAC63407.pro:ウミヤツメ;Q91274.pro:ウミヤツメ;P21847.pro:ウシガエル;AAD09358.pro:アルバニア水カエル(Rana shqiperica);ABXL68.pro:ゼノパス;NP_001004887.pro:ゼノパス;AAL56646.pro:スポッティッドサラマンダー(Spotted Salamander);Q03156.pro:大西洋サケ;P21848.pro:大西洋サケ;AAM46104.pro:ムカシトカゲ;P83517.pro:オーストラリア肺魚;S59517.pro:モノクルコブラ;AAL08579.pro:マンソン住血吸虫。
図3−11は、一部が哺乳類である他の32種に由来するアルブミンと共に、ヒト血清アルブミン(P02768.pro=配列番号1)のアミノ酸配列のアライメントを示す。「マジョリティ」は、コンセンサス配列を示す。「+マジョリティ」は、33個全ての配列間の相対的相同性を棒グラフ形態で示し、棒の長さは相対的相同性20、40、60、80及び100%を示す。タンパク質配列は、リーダー配列を含む。P02768.pro:ヒト;P02769.pro:ウシ;P49064.pro:ネコ;P49822.pro:イヌ;Q5XLE4.pro:ロバ;J C5838.pro:スナネズミ;ACF10391,1.pro:ヤギ断片;AAQ20088.pro:モルモット;P35747.pro:ウマ;Q28522.pro:マカク;P07724.pro:ネズミ;P08835.pro:ブタ;P02770.pro:ラット;P49065.pro:ウサギ;Q28522.pro:アカゲザル;P14639.pro:ヒツジ;NP_001127106.pro:オランウータン;P19121.pro:ニワトリ;P01012.pro:ニワトリ卵白アルブミン;073860.pro:シチメンチョウ卵白アルブミン;AAC63407.pro:ウミヤツメ;Q91274.pro:ウミヤツメ;P21847.pro:ウシガエル;AAD09358.pro:アルバニア水カエル(Rana shqiperica);ABXL68.pro:ゼノパス;NP_001004887.pro:ゼノパス;AAL56646.pro:スポッティッドサラマンダー(Spotted Salamander);Q03156.pro:大西洋サケ;P21848.pro:大西洋サケ;AAM46104.pro:ムカシトカゲ;P83517.pro:オーストラリア肺魚;S59517.pro:モノクルコブラ;AAL08579.pro:マンソン住血吸虫。
図3−12は、一部が哺乳類である他の32種に由来するアルブミンと共に、ヒト血清アルブミン(P02768.pro=配列番号1)のアミノ酸配列のアライメントを示す。「マジョリティ」は、コンセンサス配列を示す。「+マジョリティ」は、33個全ての配列間の相対的相同性を棒グラフ形態で示し、棒の長さは相対的相同性20、40、60、80及び100%を示す。タンパク質配列は、リーダー配列を含む。P02768.pro:ヒト;P02769.pro:ウシ;P49064.pro:ネコ;P49822.pro:イヌ;Q5XLE4.pro:ロバ;J C5838.pro:スナネズミ;ACF10391,1.pro:ヤギ断片;AAQ20088.pro:モルモット;P35747.pro:ウマ;Q28522.pro:マカク;P07724.pro:ネズミ;P08835.pro:ブタ;P02770.pro:ラット;P49065.pro:ウサギ;Q28522.pro:アカゲザル;P14639.pro:ヒツジ;NP_001127106.pro:オランウータン;P19121.pro:ニワトリ;P01012.pro:ニワトリ卵白アルブミン;073860.pro:シチメンチョウ卵白アルブミン;AAC63407.pro:ウミヤツメ;Q91274.pro:ウミヤツメ;P21847.pro:ウシガエル;AAD09358.pro:アルバニア水カエル(Rana shqiperica);ABXL68.pro:ゼノパス;NP_001004887.pro:ゼノパス;AAL56646.pro:スポッティッドサラマンダー(Spotted Salamander);Q03156.pro:大西洋サケ;P21848.pro:大西洋サケ;AAM46104.pro:ムカシトカゲ;P83517.pro:オーストラリア肺魚;S59517.pro:モノクルコブラ;AAL08579.pro:マンソン住血吸虫。
図3−13は、一部が哺乳類である他の32種に由来するアルブミンと共に、ヒト血清アルブミン(P02768.pro=配列番号1)のアミノ酸配列のアライメントを示す。「マジョリティ」は、コンセンサス配列を示す。「+マジョリティ」は、33個全ての配列間の相対的相同性を棒グラフ形態で示し、棒の長さは相対的相同性20、40、60、80及び100%を示す。タンパク質配列は、リーダー配列を含む。P02768.pro:ヒト;P02769.pro:ウシ;P49064.pro:ネコ;P49822.pro:イヌ;Q5XLE4.pro:ロバ;J C5838.pro:スナネズミ;ACF10391,1.pro:ヤギ断片;AAQ20088.pro:モルモット;P35747.pro:ウマ;Q28522.pro:マカク;P07724.pro:ネズミ;P08835.pro:ブタ;P02770.pro:ラット;P49065.pro:ウサギ;Q28522.pro:アカゲザル;P14639.pro:ヒツジ;NP_001127106.pro:オランウータン;P19121.pro:ニワトリ;P01012.pro:ニワトリ卵白アルブミン;073860.pro:シチメンチョウ卵白アルブミン;AAC63407.pro:ウミヤツメ;Q91274.pro:ウミヤツメ;P21847.pro:ウシガエル;AAD09358.pro:アルバニア水カエル(Rana shqiperica);ABXL68.pro:ゼノパス;NP_001004887.pro:ゼノパス;AAL56646.pro:スポッティッドサラマンダー(Spotted Salamander);Q03156.pro:大西洋サケ;P21848.pro:大西洋サケ;AAM46104.pro:ムカシトカゲ;P83517.pro:オーストラリア肺魚;S59517.pro:モノクルコブラ;AAL08579.pro:マンソン住血吸虫。
図3−14は、一部が哺乳類である他の32種に由来するアルブミンと共に、ヒト血清アルブミン(P02768.pro=配列番号1)のアミノ酸配列のアライメントを示す。「マジョリティ」は、コンセンサス配列を示す。「+マジョリティ」は、33個全ての配列間の相対的相同性を棒グラフ形態で示し、棒の長さは相対的相同性20、40、60、80及び100%を示す。タンパク質配列は、リーダー配列を含む。P02768.pro:ヒト;P02769.pro:ウシ;P49064.pro:ネコ;P49822.pro:イヌ;Q5XLE4.pro:ロバ;J C5838.pro:スナネズミ;ACF10391,1.pro:ヤギ断片;AAQ20088.pro:モルモット;P35747.pro:ウマ;Q28522.pro:マカク;P07724.pro:ネズミ;P08835.pro:ブタ;P02770.pro:ラット;P49065.pro:ウサギ;Q28522.pro:アカゲザル;P14639.pro:ヒツジ;NP_001127106.pro:オランウータン;P19121.pro:ニワトリ;P01012.pro:ニワトリ卵白アルブミン;073860.pro:シチメンチョウ卵白アルブミン;AAC63407.pro:ウミヤツメ;Q91274.pro:ウミヤツメ;P21847.pro:ウシガエル;AAD09358.pro:アルバニア水カエル(Rana shqiperica);ABXL68.pro:ゼノパス;NP_001004887.pro:ゼノパス;AAL56646.pro:スポッティッドサラマンダー(Spotted Salamander);Q03156.pro:大西洋サケ;P21848.pro:大西洋サケ;AAM46104.pro:ムカシトカゲ;P83517.pro:オーストラリア肺魚;S59517.pro:モノクルコブラ;AAL08579.pro:マンソン住血吸虫。
図3−15は、一部が哺乳類である他の32種に由来するアルブミンと共に、ヒト血清アルブミン(P02768.pro=配列番号1)のアミノ酸配列のアライメントを示す。「マジョリティ」は、コンセンサス配列を示す。「+マジョリティ」は、33個全ての配列間の相対的相同性を棒グラフ形態で示し、棒の長さは相対的相同性20、40、60、80及び100%を示す。タンパク質配列は、リーダー配列を含む。P02768.pro:ヒト;P02769.pro:ウシ;P49064.pro:ネコ;P49822.pro:イヌ;Q5XLE4.pro:ロバ;J C5838.pro:スナネズミ;ACF10391,1.pro:ヤギ断片;AAQ20088.pro:モルモット;P35747.pro:ウマ;Q28522.pro:マカク;P07724.pro:ネズミ;P08835.pro:ブタ;P02770.pro:ラット;P49065.pro:ウサギ;Q28522.pro:アカゲザル;P14639.pro:ヒツジ;NP_001127106.pro:オランウータン;P19121.pro:ニワトリ;P01012.pro:ニワトリ卵白アルブミン;073860.pro:シチメンチョウ卵白アルブミン;AAC63407.pro:ウミヤツメ;Q91274.pro:ウミヤツメ;P21847.pro:ウシガエル;AAD09358.pro:アルバニア水カエル(Rana shqiperica);ABXL68.pro:ゼノパス;NP_001004887.pro:ゼノパス;AAL56646.pro:スポッティッドサラマンダー(Spotted Salamander);Q03156.pro:大西洋サケ;P21848.pro:大西洋サケ;AAM46104.pro:ムカシトカゲ;P83517.pro:オーストラリア肺魚;S59517.pro:モノクルコブラ;AAL08579.pro:マンソン住血吸虫。
図3−16は、一部が哺乳類である他の32種に由来するアルブミンと共に、ヒト血清アルブミン(P02768.pro=配列番号1)のアミノ酸配列のアライメントを示す。「マジョリティ」は、コンセンサス配列を示す。「+マジョリティ」は、33個全ての配列間の相対的相同性を棒グラフ形態で示し、棒の長さは相対的相同性20、40、60、80及び100%を示す。タンパク質配列は、リーダー配列を含む。P02768.pro:ヒト;P02769.pro:ウシ;P49064.pro:ネコ;P49822.pro:イヌ;Q5XLE4.pro:ロバ;J C5838.pro:スナネズミ;ACF10391,1.pro:ヤギ断片;AAQ20088.pro:モルモット;P35747.pro:ウマ;Q28522.pro:マカク;P07724.pro:ネズミ;P08835.pro:ブタ;P02770.pro:ラット;P49065.pro:ウサギ;Q28522.pro:アカゲザル;P14639.pro:ヒツジ;NP_001127106.pro:オランウータン;P19121.pro:ニワトリ;P01012.pro:ニワトリ卵白アルブミン;073860.pro:シチメンチョウ卵白アルブミン;AAC63407.pro:ウミヤツメ;Q91274.pro:ウミヤツメ;P21847.pro:ウシガエル;AAD09358.pro:アルバニア水カエル(Rana shqiperica);ABXL68.pro:ゼノパス;NP_001004887.pro:ゼノパス;AAL56646.pro:スポッティッドサラマンダー(Spotted Salamander);Q03156.pro:大西洋サケ;P21848.pro:大西洋サケ;AAM46104.pro:ムカシトカゲ;P83517.pro:オーストラリア肺魚;S59517.pro:モノクルコブラ;AAL08579.pro:マンソン住血吸虫。
図3−17は、一部が哺乳類である他の32種に由来するアルブミンと共に、ヒト血清アルブミン(P02768.pro=配列番号1)のアミノ酸配列のアライメントを示す。「マジョリティ」は、コンセンサス配列を示す。「+マジョリティ」は、33個全ての配列間の相対的相同性を棒グラフ形態で示し、棒の長さは相対的相同性20、40、60、80及び100%を示す。タンパク質配列は、リーダー配列を含む。P02768.pro:ヒト;P02769.pro:ウシ;P49064.pro:ネコ;P49822.pro:イヌ;Q5XLE4.pro:ロバ;J C5838.pro:スナネズミ;ACF10391,1.pro:ヤギ断片;AAQ20088.pro:モルモット;P35747.pro:ウマ;Q28522.pro:マカク;P07724.pro:ネズミ;P08835.pro:ブタ;P02770.pro:ラット;P49065.pro:ウサギ;Q28522.pro:アカゲザル;P14639.pro:ヒツジ;NP_001127106.pro:オランウータン;P19121.pro:ニワトリ;P01012.pro:ニワトリ卵白アルブミン;073860.pro:シチメンチョウ卵白アルブミン;AAC63407.pro:ウミヤツメ;Q91274.pro:ウミヤツメ;P21847.pro:ウシガエル;AAD09358.pro:アルバニア水カエル(Rana shqiperica);ABXL68.pro:ゼノパス;NP_001004887.pro:ゼノパス;AAL56646.pro:スポッティッドサラマンダー(Spotted Salamander);Q03156.pro:大西洋サケ;P21848.pro:大西洋サケ;AAM46104.pro:ムカシトカゲ;P83517.pro:オーストラリア肺魚;S59517.pro:モノクルコブラ;AAL08579.pro:マンソン住血吸虫。
図3−18は、一部が哺乳類である他の32種に由来するアルブミンと共に、ヒト血清アルブミン(P02768.pro=配列番号1)のアミノ酸配列のアライメントを示す。「マジョリティ」は、コンセンサス配列を示す。「+マジョリティ」は、33個全ての配列間の相対的相同性を棒グラフ形態で示し、棒の長さは相対的相同性20、40、60、80及び100%を示す。タンパク質配列は、リーダー配列を含む。P02768.pro:ヒト;P02769.pro:ウシ;P49064.pro:ネコ;P49822.pro:イヌ;Q5XLE4.pro:ロバ;J C5838.pro:スナネズミ;ACF10391,1.pro:ヤギ断片;AAQ20088.pro:モルモット;P35747.pro:ウマ;Q28522.pro:マカク;P07724.pro:ネズミ;P08835.pro:ブタ;P02770.pro:ラット;P49065.pro:ウサギ;Q28522.pro:アカゲザル;P14639.pro:ヒツジ;NP_001127106.pro:オランウータン;P19121.pro:ニワトリ;P01012.pro:ニワトリ卵白アルブミン;073860.pro:シチメンチョウ卵白アルブミン;AAC63407.pro:ウミヤツメ;Q91274.pro:ウミヤツメ;P21847.pro:ウシガエル;AAD09358.pro:アルバニア水カエル(Rana shqiperica);ABXL68.pro:ゼノパス;NP_001004887.pro:ゼノパス;AAL56646.pro:スポッティッドサラマンダー(Spotted Salamander);Q03156.pro:大西洋サケ;P21848.pro:大西洋サケ;AAM46104.pro:ムカシトカゲ;P83517.pro:オーストラリア肺魚;S59517.pro:モノクルコブラ;AAL08579.pro:マンソン住血吸虫。
図3−19は、一部が哺乳類である他の32種に由来するアルブミンと共に、ヒト血清アルブミン(P02768.pro=配列番号1)のアミノ酸配列のアライメントを示す。「マジョリティ」は、コンセンサス配列を示す。「+マジョリティ」は、33個全ての配列間の相対的相同性を棒グラフ形態で示し、棒の長さは相対的相同性20、40、60、80及び100%を示す。タンパク質配列は、リーダー配列を含む。P02768.pro:ヒト;P02769.pro:ウシ;P49064.pro:ネコ;P49822.pro:イヌ;Q5XLE4.pro:ロバ;J C5838.pro:スナネズミ;ACF10391,1.pro:ヤギ断片;AAQ20088.pro:モルモット;P35747.pro:ウマ;Q28522.pro:マカク;P07724.pro:ネズミ;P08835.pro:ブタ;P02770.pro:ラット;P49065.pro:ウサギ;Q28522.pro:アカゲザル;P14639.pro:ヒツジ;NP_001127106.pro:オランウータン;P19121.pro:ニワトリ;P01012.pro:ニワトリ卵白アルブミン;073860.pro:シチメンチョウ卵白アルブミン;AAC63407.pro:ウミヤツメ;Q91274.pro:ウミヤツメ;P21847.pro:ウシガエル;AAD09358.pro:アルバニア水カエル(Rana shqiperica);ABXL68.pro:ゼノパス;NP_001004887.pro:ゼノパス;AAL56646.pro:スポッティッドサラマンダー(Spotted Salamander);Q03156.pro:大西洋サケ;P21848.pro:大西洋サケ;AAM46104.pro:ムカシトカゲ;P83517.pro:オーストラリア肺魚;S59517.pro:モノクルコブラ;AAL08579.pro:マンソン住血吸虫。

0014

図4は、20個のアミノ酸クラス及び関係を示しているベン図である。
図5Aは、1又は複数の結合コンピテントシステインの生成のためのアミノ酸置換、挿入及び欠失のための、ヒト血清アルブミン(配列番号1)における好適な部位のグループを示す表である。
図5Bは、1又は複数の結合コンピテントシステインの生成のためのアミノ酸置換、挿入及び欠失のための、ヒト血清アルブミン(配列番号1)における好適な部位のグループを示す表である。
図5C−1は、1又は複数の結合コンピテントシステインの生成のためのアミノ酸置換、挿入及び欠失のための、ヒト血清アルブミン(配列番号1)における好適な部位のグループを示す表である。
図5C−2は、1又は複数の結合コンピテントシステインの生成のためのアミノ酸置換、挿入及び欠失のための、ヒト血清アルブミン(配列番号1)における好適な部位のグループを示す表である。
図5D−1は、1又は複数の結合コンピテントシステインの生成のためのアミノ酸置換、挿入及び欠失のための、ヒト血清アルブミン(配列番号1)における好適な部位のグループを示す表である。
図5D−2は、1又は複数の結合コンピテントシステインの生成のためのアミノ酸置換、挿入及び欠失のための、ヒト血清アルブミン(配列番号1)における好適な部位のグループを示す表である。
図6Aは、1又は複数の結合コンピテントシステインの生成のための1又は複数のジスルフィド結合の切断のための、ヒト血清アルブミン(配列番号1)における好適な部位のグループを示す表である。
図6Bは、1又は複数の結合コンピテントシステインの生成のための1又は複数のジスルフィド結合の切断のための、ヒト血清アルブミン(配列番号1)における好適な部位のグループを示す表である。
図7は、プラスミドpDB2244のマップである。
図8は、プラスミドpDB2243のマップである。
図9は、プラスミドpDB2713のマップである。

0015

図10−1は、配列番号1の折り畳みアルブミン上の結合のための好適な部位の相対的位置に従って分類した、これらの部位を示している表である。
図10−2は、配列番号1の折り畳みアルブミン上の結合のための好適な部位の相対的位置に従って分類した、これらの部位を示している表である。
図11−1は、自然のヒト血清アルブミンのCys−34に加えて単一遊離チオール基を有する分子を生成するために、自然のヒト血清アルブミンに対して行った変異(第二列を参照されたい)を示している表である。
図11−2は、自然のヒト血清アルブミンのCys−34に加えて単一遊離チオール基を有する分子を生成するために、自然のヒト血清アルブミンに対して行った変異(第二列を参照されたい)を示している表である。
図12は、プラスミドpDB3927のマップである。
図13は、プラスミドpDB3964のマップである。
図14は、プラスミドpBD3936のマップである。
図15は、配列番号1のCys−34における遊離チオール基及び棒グラフで下に示す位置においてさらなる遊離チオールを有するアルブミン分子の発現標準偏差でμg/ml)を示している、SDS−PAGE分析、及びHPLCデータ(棒グラフ)を示す。

0016

図16−1は、自然のヒト血清アルブミンのCys−34に加えて1又は複数の遊離チオール基を有する及び/又はCys−34を除去した分子を生成するために、自然のヒト血清アルブミンに対して行った変異(第二列を参照されたい)を示している表である。
図16−2は、自然のヒト血清アルブミンのCys−34に加えて1又は複数の遊離チオール基を有する及び/又はCys−34を除去した分子を生成するために、自然のヒト血清アルブミンに対して行った変異(第二列を参照されたい)を示している表である。
図17は、自然のヒト血清アルブミンのCys−34に加えて1又は複数の遊離チオール基を有する及び/又はCys−34を除去したアルブミン分子の発現(標準偏差でμg/ml)を示しているSDS−PAGE分析、及びHPLCデータ(棒グラフ)を示す。
図18は、発酵収量及び1又は複数の遊離チオールを含んでなるアルブミン分子への結合の相対レベルを示している表である。
図19は、DTNBでの処理前の、3個の遊離チオール(Cys-34, A2C及び585C)を有するようデザインされたrHA分子の質量分析データである。
図20は、DTNBでの処理後の、3個の遊離チオール(Cys-34, A2C 及びL585C)を有するようデザインされたrHA分子の質量分析データである。
図21は、DTNBでの処理前の、4個の遊離チオール(Cys-34, D129C, C360S及びL585C)を有するようにデザインされたrHA分子の質量分析データである。
図22は、DTNBでの処理後に4個の遊離チオール(Cys-34, D129C, C360S及びL585C)を有するようにデザインされたrHA分子の質量分析データである。
図23は、DTNBでの処理前に3個の遊離チオール(Cys-34, A2C及びC末端遊離チオール)を有するようデザインされたrHA分子の質量分析データである。
図24は、3個の遊離チオール(Cys-34, A2C及びC末端遊離チオール)を有するようデザインされたrHA分子の質量分析データである。

0017

本発明の詳細な説明
本発明の第一の態様は、1又は複数の結合コンピテントシステイン残基を含んでなる変異体アルブミンをデザイン及び/又は調製するための方法を供する。従って、ポリペプチドは、結合能力があるとみなしてよい。このようなアルブミンは、「チオアルブミン」又はアルブミンの「システイン変異体」と呼ぶ。用語「結合コンピテントシステイン」は、他のシステインにジスルフィド結合しておらず、且つ好適には、好ましくない立体障害に起因する(「結合パートナー」と呼ぶ)他の分子への結合がブロックされていないチオールを有するシステインを含む。すなわち、好適には折り畳みポリペプチド内又は上のシステインの位置は、結合に使用可能である。

0018

多数の選択判定基準は、結合コンピテントシステイン残基の導入のための適当な部位を特定するために、単独又は任意の組合せで使用しても使用しなくてもよい。従って、本発明は、結合コンピテントシステインが導入される、アルブミンのアミノ酸配列の部位の演繹的な同定のための方法及び/又はルールを供する。このような部位は、「候補残基」と呼ぶ。変異体アルブミンが基づくアルブミン配列は、配列番号1又は任意の他のアルブミンである。例えば、変異体アルブミンは、アミノ酸配列の34位、又は等価な位置にシステインを有する又は有しないアルブミンに基付いている。システイン残基は、1又は複数の置換、挿入、欠失、延長及び付加によって導入されても導入されなくてもよい。部位は、アルブミン又はこの変異体の三次元構造に関して選択されても選択されなくてもよい。次の判定基準は、適当な部位を選択するために使用されても使用されなくてもよい:

0019

(a)溶媒接触可能表面領域(「表面接触性」(%SASA))。
表面接触性は高いことが好適である。例えば、好適には表面接触性が、少なくとも60%、より好適には60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98又は99%から65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99又は100%までである。%SASAは、明細書中で説明される方法を使用して「生スコア(raw score)」として測定されても、又はタンパク質中の最大表面接触性を有する残基のスコアに対して計算されてもよい。例えば、HSA1AO6のアルブミンは、最大表面接触性229.0を有し、これはHSA中の最も高いスコアの残基である。高い表面接触性は、残基がタンパク質の表面上にあり、これにより結合に利用可能であることを示す。このような接触性は、明細書中で説明されるような方法を使用して計算されてよい。

0020

(b)結晶Bファクターの存在又は非存在
Bファクターは、三次元構造内のアミノ酸残基の相対的可塑性を示す。好適には、Bファクターは、少なくとも30、40、50、60、70、80又は90%から、少なくとも40、50、60、70、80、90又は100%までであり、これは分子内の任意のアミノ酸残基の最大のBファクタースコアに対するものでも対するものでなくてもよい。HSA(例えば、1AO6)に関して、好適にはBファクタースコアは、(例えば、明細書中で説明されるBファクタースコア化ステムを使用して)例えば少なくとも30、40、50、60、70、80、90又は100から、少なくとも40、50、60、70、80、90、100又は106までと高い。また、Bファクタースコアは、明細書中で説明されるように、100、90、80、70、60、50、40、30、20又は10%未満若しくは同等でよい。

0021

シミュレーションの最後のナノ秒中のC−アルファ炭素原子のBファクター(根平均二乗揺らぎ)は、D.van derSpoel,E.Lindahl,B.Hess,G.Groenhof,A.E.Mark及びH.J.C.Berendsen:GROMACS:Fast,Flexible and Free,J.Comp.Chem.26pp.1701−1718(2005)に基づいた、Gromacs tool「g_rmsf」、バージョン3.3を使用して計算されてよい。

0022

(c)二次構造SS)の存在の有無。
候補残基は、二次構造、例えばH(へリックス)、B(単離されたベータブリッジ)又はE(拡張シート)内に位置しても位置しなくてもよい。二次構造の外側の残基の位置は、二次構造内に位置する残基よりも二次構造にあまり重要でなく且つ/又は結合に利用可能である可能性が高いことを示す。

0023

(d)他のアルブミンとの相対的相同性。
所定のタンパク質配列内で、他の類似配列との高い相同性を示しているアミノ酸残基は、このような残基又は領域がタンパク質の構造及び/又は機能に重要であることを示す可能性がある。従って、残基が周知のアルブミン(例えば、哺乳類アルブミン、例えば図2に示されるものなど、又は哺乳類及び非哺乳類アルブミン、例えば図3に示されるものなどの組み合わせ)を有して位置するアルブミンのアライメント(alignment)に対して、候補残基が100%未満の相同性を示すことが好ましい。100、98、96、95、94、92、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10、5%未満の相同性が好適である。相同性は、当技術分野で周知のアルゴリズム、例えばClustal、例えばClustal W(Thompson et al. (1994). Nucleic AcidsRes 22(22): 4673-80)又はClustal V(Higgins, D. G. and P. M. Sharp (1989). "Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer." Comput Appl Biosci 5(2): 151-3.)を使用して測定することができる。低い相同性は、残基が特にタンパク質の構造及び/又は機能に重要又は重大でないことを示す。好適には、相同性は、図2の16個の哺乳類アルブミン、又は図3の33個の哺乳類及び非哺乳類アルブミンに関して測定される。

0024

(e)隣接保存残基の存在の有無。
アミノ酸配列内で、各残基は1又は2個の隣接残基を有する。候補残基が直接隣接する1又は複数の周知のアルブミンに対して低相同性を有する残基の場合には、これは、候補残基がタンパク質の構造及び/又は機能に特に重要又は重大である可能性が低いことを示す。これは、候補残基はタンパク質の相対的に保存されない領域内に位置し得るからである。従って、候補残基がアルブミンのアライメントに関して周知のアルブミンと100%相同性を有する残基に隣接しないことが好適である。相同性は、明細書中で説明されるように測定されてよい。候補残基は、アルブミンのアライメントに関して周知のアルブミン(例えば、図2又は図3)とそれぞれ100%の相同性を有する2つの残基(すなわち、1つの残基が候補残基に関してC末端であり、1つの残基が候補残基に関してN末端である)に隣接してよい。候補残基が100、98、96、95、94、92、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10、5未満の相同性を有する1又は2個の残基に隣接することが好ましく、そしてこれらの相同性レベルを「閾値」と呼んでよい。相同性は、明細書中で説明されているように測定されてよい。相同性閾値を考慮すると、保存領域に対するアミノ酸の位置は、例えば相同性の閾値0を上回っている任意のアミノ酸に隣接しないアミノ酸のスコア化、閾値1を上回っている1個のアミノ酸に隣接するアミノ酸のスコア化、及び閾値2を上回っている2個のアミノ酸に隣接するアミノ酸のスコア化によって定量化されてよい。

0025

(f)多型についての証拠
多型は遺伝的変異であり、多型は表現型変化が得られるタンパク質に生じても生じなくてもよい。好適には、候補残基は表現型変化を生じている多型が分かっている位置にない。より好適には、候補残基は、多型が熱不安定性を生じる又は生じることが分かっている位置にない。HSA(配列番号1)に関して周知の多型は図1に詳述され、またMinchiotti等(2008) Hum Mutat 29(8):1007〜16及びhttp://www.uniprot.org/uniprot/P02768においても考察される。多型の存在、非存在及び/又は効果は、例えば表現型変化がない周知の多型の0でのスコア化、表現型変化が周知の(しかしながら熱不安定性を生じることが分かっていない)多型の1でのスコア化、及び熱不安定性を生じることが分かっている多型の2でのスコア化によって定量化されてよい。

0026

(g)候補アミノ酸及びシステインの相対的な保存。
アミノ酸は、様々な周知のクラスに分類される。従って、一部のアミノ酸は他のアミノ酸よりもより密接に関連している。導入されたシステイン残基は、候補アミノ酸を有して保存の相対的に高いレベルを維持しても維持しなくてもよい。図4は、保存レベルを定量化することができる1つのシステムを供するベン図である。図4のスコア化システムは、高保存の置換をスコア0で示し、低保存の置換をスコア5で示し、中間的な保存の置換をスコア1、2、3又は4で示すスケール0〜5を使用する。好適には、候補残基の置換は、非保存置換でなく、つまり好適には(図4のスコア化システムを使用して)候補残基は(システインに関して)保存スコア5でない。より好適には、候補残基は、システインに関してより高い保存(例えば、スコア4, 3, 2 、より好適には1)を有する。スコア化システムは、(以下の)「保存置換」というタイトルセクションに記載される。

0027

(h)発現レベル
チオアルブミンは、適当な発現系、例えば酵母(例えば、サッカロミセス属(Saccharomyces), 例えば出芽酵母(S. cerevisiae))又はアスペルギルス属(Aspergillus.)由来の未修飾アルブミン(例えば配列番号1など)の発現に対して、少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、90又は100%のレベルで発現されることができてもできなくてもよい。相対的な発現レベルは、例えば、後にSDS−PAGE、HPLC又はウエスタンブロット法による定量化が続くタンパク質の発現によって測定することができる。

0028

(i)結合コンピテンス。
チオアルブミンは、Cys34において唯一の結合コンピテントシステインを有する配列番号1から成るアルブミンの結合コンピテンスに対して、例えば少なくとも50、60、70、80、90、95又は100%の高レベルの結合コンピテンスを有しても有しなくでもよい。結合コンピテンスは、任意の複合体形成可能な(conjugatable)目的の分子(結合パートナー)、例えば生物活性分子又は蛍光染料に対して測定されてよい。測定は、生物活性化合物の活性質量分析又は定量化、例えばその蛍光などを介してよい。高い結合コンピテンスを有するチオアルブミンの利点は、分子のチオアルブミンへの有効な結合を可能にすることである。結合コンピテンスは、時間に対して測定してよい。好適なチオアルブミンは、(a)最大結合を急速に達成するもの、又は(b)最大結合をゆっくりと達成するものである。

0029

(j)結合化合物の活性。
本発明のチオアルブミンは、化合物(結合パートナー)、例えば生物活性化合物が、非結合状態における活性に対して高レベルの活性を有するように、化合物に結合してよい。好適には、結合化合物は、非結合状態の活性に対して少なくとも1、10、20、40、50、60、70、80、80、最も好適には100%の活性を示す。高レベル活性を有する結合化合物の利点は、望ましい効果、例えば所望の治療効果の達成に必要な結合化合物の量を減少することである。

0030

(k)アルブミンの受容体結合能力。
結合及び/又は非結合チオアルブミンは、少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、90又は100%のヒト血清アルブミン(配列番号1)の受容体結合活性を有しても有さなくてもよい。或いは、結合及び/又は非結合チオアルブミンは、ヒト血清アルブミンよりも、例えば多くて0、10、20、30、40、50、60、70、80又は90%低い受容体結合活性を有しても有さなくてもよい。受容体結合活性は、例えばFcRnへの結合などに関して、アッセイによって測定される。図1は、HSA(配列番号1)の各アミノ酸残基のスコアをそれぞれのパラメーター(a)〜(g)に関して示す。明確にするために、インビボ(in vivo)で、HSAは初めは、最初の24個のアミノ酸がリーダー配列である609個のアミノ酸タンパク質として生成される。リーダー配列は切断され、585個のアミノ酸成熟タンパク質を生じる。本明細書を通じて、成熟タンパク質は配列番号1と呼ぶ。HSAモデルA106の構造は、配列番号1の最初の4個の残基及び最後の3個の残基が3Dモデル中で分解されないのでこれらを無視する。従って、モデルA106の残基1は、配列番号1の残基5と等価である。本明細書を通じて、特に記載しない限り、全ての残基は配列番号1に関して言及される。HSA(すなわち、天然のC末端リーダー配列を有するHSA)の未成熟配列は、配列番号102で供される。

0031

図1の列の表示を、以下に詳述する:
1AO6における位置:PDB identity 1AO6又は1ao6の入力でのRCSDタンパク質データバンク(PDB, http://www.rcsb.org/pdb/)に由来する、ヒト血清アルブミンの結晶構造におけるアミノ酸の位置を意味する(Sugio, S., A. Kashima, et at. (1999). Protein Eng 12(6): 439-46)。成熟HSA配列(配列番号1)と比較すると、1AO6構造は配列番号1の(当該構造から欠失する最初の4個のアミノ酸を有する)残基5Sで開始し、(当該構造から欠失する終末の3つのアミノ酸を有する)582Aで終了することに留意されたい。結合コンピテントシステインを生じるために変化する位置を説明するために、明細書中で使用されるアミノ酸の位置は、1ao6でなく、配列番号1中の位置を意味する。

0032

成熟HSAにおける位置:HSAの585残基分泌型に由来する配列番号1におけるアミノ酸の位置{国立生物工学情報センター受入番号:1A06_AVERSION Gl:3212456 (24-SEP-2008), A鎖,ヒト血清アルブミンの結晶構造}(Sugio et at. (1999). Protein Eng 12(6): 439-46)。

0033

リーダー配列を有する位置:24個のアミノ酸分泌リーダー配列を含有するヒト血清アルブミンの未処理形態中の位置に言及する。

0034

アミノ酸:20個の各アミノ酸に関する標準的な1文字コード(例えば、A = Ala =アラニン)。

0035

%SASA:Kabschand及びSander(1983).Biopolymers 22(12):2577〜637で説明されるDSSPソフトウェアを使用して、各残基に関して計算される溶媒接触可能表面領域。各溶媒接触可能表面領域を、その位置において確認される特定のアミノ酸の標準値割り100を乗じ、これにより各残基に関する標準値のパーセンテージを得た。20個の異なるアミノ酸に関する標準的な溶媒接触可能表面領域は、(アミノ酸に関して1文字コードを使用して):A=62、C=92、D=69、E=156、F=123、G=50、H=130、l=84、K=174、L=97、M=103、N=85、P=67、Q=127、R=211、S=64、T=80、V=81、W=126、Y=104と定義する。
Bファクター:Cアルファ原子に関する結晶Bファクター値を、PDBファイルから直接抽出した。Bファクターは、1ao6 PDBファイルPDB,(http://www.rcsb.org/pdb/)の桁番号11にある。

0036

SS(二次構造):DSSPソフトウェアKabsch and Sander(1983).Biopolymers 22(12):2577−637を使用して、各残基に対して測定した二次構造。二次構造をH(ヘリックス)、B(単離されたベータブリッジ)又はE(拡張シート)を定義する場合に、残基を「1」、或いは「0」で表示する。

0037

アライン(Align)1(Mamm. W):Clustal Wに基づくMegAlignプログラム(DNASTAR, Lasergene, version 8.0.2)を使用して求められたP02768で特定される、様々な哺乳類アルブミンファミリータンパク質のアライメントのHSA(配列番号1)との相同性レベル;相同性は、最高=100%、これから20%ずつ減少し、最低=0%である6つのレベルで測定される(図2)。

0038

隣接100%(アライン1):HSAを図2の哺乳類アルブミンと並べた場合の、隣接残基の保存が高かった(100%)か否かに関するスコア。スコア0は、HSAを図2の哺乳類アルブミンと並べた場合に、残基が100%の相同性を有する残基に隣接しないことを示し;スコア1は、HSAを哺乳類アルブミンと並べた場合に、残基が100%の相同性を有する1つの残基に隣接することを示し;スコア2は、HSAを哺乳類アルブミンと並べた場合に、残基が100%の相同性を有する2つの残基に隣接することを示す。

0039

アライン2(Var. Sps. V):Clustal Vに基づくMegAlignプログラム(DNASTAR, Lasergene, version 8.0.2)を使用して求められたP02768で特定される、様々なアルブミンファミリータンパク質のアライメントのHSA(配列番号1)との相同性レベル;最高=100%、これから20%ずつ徐々に減少し、最低=0%である6個の相同性レベルで測定される(図3)。

0040

多形.:これは、アミノ酸残基において多型が判明しているか否かを特定するものである。ヒト血清アルブミン(配列番号1)の単一アミノ酸多型は、24個のアミノ酸分泌リーダー配列を含むヒト血清アルブミンの未処理形態由来のアミノ酸位置を有するもので、Minchiotti等(2008)Hum Mutat 29(8):1007−16、及びhttp://www.uniprot.org/uniprot/P02768から抜粋され、標準的な1文字アミノ酸コードを使用して説明される(例えば、D25Vは、配列番号1の位置1においてバリンへ変化されているアスパラギン酸を意味する)。

0041

表現型変化:判明している表現型変化の源(上記で言及の「多形」)に由来する表現型変化の「程度」を表すスコアであり;0=判明している表現型変化なし、1=熱安定性を減少することになる変化を除いたいずれかの変異に関して、配列番号1の残基と比べてこの位置において、表現型変化が存在することを説明するものであり、2=熱安定性の減少を生じるものとして説明される、配列番号1のこの位置における変異が存在することを示す。

0042

システインに対する保存された変異:(明細書中で説明される)図4から導かれるように、アミノ酸がシステインと比べてどれほどよく保存されているかを言及しているスコアであり、システインに対する変異を1〜5の範囲で示す。スコア1は、可能性のある最も保存的な変化(例えば、アラニンからシステイン)に割り当てられ、スコアは、システインと比べて最低の保存(例えば、ヒスチジンからシステインへ)に関するスコア5に及ぶ。

0043

選択判定基準を任意の所望の組合せで使用することができるが、選択判定基準の4つの好適なグループ(A, B, C, D)をほんの一例として、以下に説明する。これらの(A)及び(B)はまた、選択グループ1及び2と(それぞれ)呼ぶ:

0044

(A)特に好適な本発明の実施形態の第一態様は、チオアルブミンをデザイン及び/又は調製するための方法を供するものであり、当該方法は以下の段階を含んでなる:
少なくともアルブミン配列の1種のインスタンスを含んでなる三次元モデルを提供する段階(好適には三次元モデルはアルブミンのアミノ酸配列に関し、最も好適にはアルブミン配列のアミノ酸配列が供され、アミノ酸配列は、三次元モデルのC及び/又はN末端で分解されない1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10個のアミノ酸を含んでなり、好適にはアミノ酸配列が「全長」、すなわちアルブミンの成熟アミノ酸配列である);

0045

候補アミノ酸残基が、(モデル又はアミノ酸配列の)アルブミン配列のN若しくはC末端に関して1番目、2番目、3番目、4番目若しくは5番目の残基に相当する、又は(好適には三次元モデルに関して)以下の条件:二次構造内に存在しない;少なくとも90%の表面接触性(SASA)を有する;少なくともBファクタースコア60を有する;周知の哺乳類アルブミン(例えば、図2)と80%未満の相同性を有する;周知の哺乳類アルブミン(例えば、図2)と100%相同性を有する隣接残基を有しない;周知の表現型変化を有する多型がない;且つスコア5以上を有するシステインへの非保存的なアミノ酸変化がない;ことを満たす、アルブミン配列におけるアミノ酸残基を選択する段階、
選択残基のN側又はC側において、システインで1又は複数の選択アミノ酸残基を置換する段階、又はシステインを挿入する段階、
各変化がアミノ酸欠失、置換、延長、付加又は挿入である、1又は複数のさらなる変化を、アルブミン配列へ任意に加える段階;及び、
必要なアミノ酸配列を有するポリペプチドを任意に調製する段階。

0046

モデル1A06及び配列番号1に関して、選択判定基準(A)で同定された候補残基は、(溶媒接触性の降順で)L585、D1、A2、D562、A364、A504、E505、T79及びE86を含み、図5Aにも示す。

0047

(B)本発明の第一態様の他の好適な実施形態は、チオアルブミンをデザイン及び/又は調製するための方法を供し、当該方法は以下の段階を含んでなる:
アルブミン配列の少なくとも1種のインスタンスを含んでなる三次元モデル(好適には、三次元モデルは、アルブミンのアミノ酸配列に関し、最も好適にはアルブミン配列のアミノ酸配列もまた供され、アミノ酸配列は、三次元モデルのC及び/又はN末端で分解されない1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10個のアミノ酸を含んでよく、好適にはアミノ酸配列は「全長」、すなわち、アルブミンの成熟アミノ酸配列である)を供する段階;
(モデル又はアミノ酸配列の)アルブミン配列において候補アミノ酸残基を選択する段階であって、(好適には三次元モデルに関して)以下の条件:二次構造内に存在する;少なくとも90%の表面接触性を有する;少なくとも40のBファクタースコアを有する;周知の哺乳類アルブミン(例えば、図2)と80%未満の相同性を有する;周知の哺乳類アルブミン(例えば、図2)と100%相同性を有する隣接残基を有しない;周知の表現型変化を有する多型を有しない;及び5以上のスコアを有するシステインへの非保存アミノ酸変化を有しない;ことを満たす、段階、
選択残基のN側又はC側で、1又は複数の選択アミノ酸残基をシステインで置換する段階、又はシステインを挿入する段階、
各変化がアミノ酸欠失、置換、延長、付加又は挿入である、アルブミン配列への1又は複数のさらなる変化を任意に行う段階;並びに
必要なアミノ酸配列を有するポリペプチドを任意に調製する段階。

0048

モデル1A06及び配列番号1に関して、選択判定基準(B)で同定された候補残基は、(溶媒接触性の降順で)D129、D549、A581、D121、E82、S270、Q397及びA578を含み、図5Bにもまた示される。

0049

(C)本発明の第一態様の他の好適な実施形態は、チオアルブミンをデザイン及び/又は調製するための方法を供し、当該方法は以下の段階を含んでなる:少なくともアルブミン配列の1種のインスタンスを含んでなる三次元モデルを提供する段階(好適にはアルブミンのアミノ酸配列に関する三次元モデル、そして最も好適にはアルブミン配列のアミノ酸配列もまた供し、当該アミノ酸配列は三次元モデルのC及び/又はN末端で分解されない1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10個のアミノ酸を含んでなり、好適にはアミノ酸配列は、「全長」、すなわちアルブミンの成熟アミノ酸配列である);
(モデル又はアミノ酸配列の)アルブミン配列において候補アミノ酸残基を選択する段階であって、当該アミノ酸残基が、(好適には三次元モデルに関して)以下の条件:二次構造内に存在しない;少なくとも80%の表面接触性を有する;少なくとも50のBファクタースコアを有する;周知の哺乳類アルブミン(例えば、図2)と100%未満の相同性を有する;図3に並べられた様々なアルブミンと80%未満の相同性を有する;熱不安定性を生じる周知の多型がない;及び4以上のスコアを有する1又は複数のシステインへの非保存アミノ酸変化を有しない;ことを満たす、段階
選択残基のN側又はC側で、システインを有する選択アミノ酸残基を置換する段階又はシステインを挿入する段階;
各変化がアミノ酸欠失、置換、延長、付加又は挿入である1又は複数のさらなる変化をアルブミン配列に任意に行う段階;並びに、
必要なアミノ酸配列を有するポリペプチドを任意に調製する段階。

0050

モデル1A06及び配列番号1に関して、選択判定基準(C)で同定された候補残基を図5Cに示す。
(D)本発明の第一態様の他の好適な実施形態は、チオアルブミンをデザイン及び/又は調製するための方法を供するものであり、当該方法は、以下の段階を含んでなる:アルブミン配列の少なくとも1種のインスタンスを含んでなる三次元モデルを提供する段階(好適には、三次元モデルはアルブミンのアミノ酸配列に関し、最も好適にはアルブミン配列のアミノ酸配列もまた供し、アミノ酸配列が三次元モデルのC及び/又はN末端で分解されない1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10個のアミノ酸を含んでなる);
アルブミン配列で候補アミノ酸残基を選択する段階であって、アミノ酸残基が(好適には、三次元モデルに関して)以下の条件:二次構造内に存在する;少なくとも80%の表面接触性を有する;少なくとも30のBファクタースコアを有する;周知の哺乳類アルブミン(例えば、図2)に対して100%未満の相同性を有する;図3に並べられた様々なアルブミンに対して80%未満の相同性を有する;熱不安定性を生じることが周知の多型がない;且つ4以上のスコアを有するシステインへの非保存アミノ酸変化がない;ことを満たす、段階
選択残基のN側又はC側において、システインで1又は複数の選択アミノ酸残基を置換する段階、又はシステインを挿入する段階、
各変化がアミノ酸欠失、置換、延長、付加又は挿入である、1又は複数のさらなる変化を、アルブミン配列へ任意に行う段階;並びに、
必要なアミノ酸配列を有するポリペプチドを任意に調製する段階。

0051

モデル1A06及び配列番号1に関して、選択判定基準(D)で同定された候補残基を図5Dに示す。

0052

図5A、5B、5C及び5Dは図1から選択したものなので、列の見出しは同様である。

0053

候補残基は、アルブミン分子に存在するジスルフィド結合に関与する1又は複数のシステイン残基である(HSA、配列番号1の場合は、17個のジスルフィド結合が存在し、従って34個のシステインがジスルフィド結合に関与する)。ジスルフィド結合によって結合された2つのシステインを「カウンターパート」と呼ぶ。結合コンピテントシステインを生じるために、候補残基は削除し又はパートナーシステインにおいて遊離チオールを生じるために異なるアミノ酸、特にSer、Thr、Val又はAlaで置換してよい。ジスルフィド結合に関与する配列番号1の34個のシステイン残基は、C53、C62、C75、C91、C90、C101、C124、C169、C168、C177、C200、C246、C245、C253、C265、C279、C278、C289、C316、C361、C360、C369、C392、C438、C437、C448、C461、C477、C476、C487、C514、C559、C558及びC567である。本発明に関して、これらの34個の候補残基の一部は他のものより好適である。

0054

システイン残基は、PyMOLソフトウェア(Warren L. De- Lano 「The PyMOL Molecular Graphics System.」DeLano ScientificLLC, San Carlos, CA, USA. http://www.pymol.org)を使用して視覚的に点検し、ジスルフィド結合中のシステインは以下の3つのカテゴリーに分けた:
−カウンターパートシステインを結合部位である可能性の高い遊離チオールとしたまま、例えばセリンで置換することができるもの。これらは、C75、C91、C124、C168、C169、C316、C360、C361、C567、C558に相当する。
−カウンターパートを結合部位である可能性が中程度である遊離チオールとしたまま、セリンで置換することができるもの。これらは、C90、C101、C177、C265、C279、C278、C289、C369、C392、C438、C476、C487、C514、C559に相当する。
−カウンターパートを結合部位である可能性が低い遊離チオールとしたまま、セリンで置換することができるもの。これらは、C53、C62、C200、C246、C245、C253、C437、C448、C461、C477に相当する。

0055

判断は、表面接触性及び折り畳みポリペプチドに関連する潜在的な遊離チオールのC−アルファ−C−ベータ結合の配向性に基づく。この判断を使用して、HSAの各システイン残基に関して修飾スコアを抽出し、そして高、中、又は低とランク付けした。

0056

図6Aは、高い修飾スコアを有する全システイン残基の一覧(右側欄)を供し、この位置におけるシステイン残基の修飾が、結合部位としての使用に適当である可能性が高い遊離チオールを供しているカウンターパートシステインとなる可能性を示唆している。

0057

図6Bは、不対の(従って遊離チオールを供している)場合に、結合部位としての使用に適当である可能性の高いカウンターパートシステインの一覧を供する。
図6の列の表示は、以下に記載するもの及び、図1について説明されるものと同様である:
修飾スコア:明細書中で説明されるように、「高」、「中」又は「低」で定義される。
ジスルフィド情報:配列番号1におけるジスルフィド対合を要約する。
(多形)表現型変化:図1において列に表示された「多形」及び「表現型変化」を要約する。

0058

修飾のための好適なシステイン残基は、図6Aにおいて供される他の情報、例えば指定の二次構造、{(Clustal Wによって並べられた)哺乳類アルブミンの間で100%の}隣接保存残基を有しないシステイン残基、表現型変化を生じる周知の多型が存在しないことに基づいてさらに選択することができるかもしれない。

0059

あるいは、修飾のためのシステイン残基は、図6Aにおいて供されるそのカウンターパートシステイン残基の修飾によって生じる(遊離チオール基を含有する)システイン残基の環境を調べることによって選択することができ、特性は例えば高い%SASAなどが好適である(図6B, 5つ目の列)。

0060

明確にすると、配列番号1のヒト血清アルブミン以外のアルブミンに関する等価な残基が、変異に好適である。このような等価な残基は、配列番号1と同一の残基数を有しても有さなくてもよいが、例えば配列番号1並びに他のアルブミン、例えば図2及び/又は図3などに記載のものとの相同アライメントに関して、当業者によって明確に同定できる。例えば、図2において、横の「目盛」の160における位置の残基は等価であるが、異なる残基数を有し、時折、異なるアミノ酸、例えばヒトではL159、ヤギ断片ではW134、マカクではL151及びマウスではM159を有する。アライメント、例えば図2又は図3等に関して、等価な残基は配列番号1の候補アミノ酸の10、9、8、7、6、5、4、3、2又は1個のアミノ酸の範囲内であることが好ましい。当該アライメントの上部の「目盛」は、アミノ酸が配列番号1の候補アミノ酸の1〜10個のアミノ酸の範囲か否かを示す。

0061

グループ(A)の選択判定基準は、グループ(B)より好適であり、同様にグループ(B)はグループ(C)より好適であり、グループ(C)は同様にグループ(D)より好適である。

0062

当該方法は、ポリペプチドの受容体結合能力及び/又は結合コンピテンス(competence)を測定すること、並びに受容体結合能力及び/又は結合コンピテンスを有する又は有さないポリペプチドを任意に選択することをさらに含んでも含まなくてもよい。ポリペプチドを「調製すること」は、宿主細胞中でポリペプチドを発現すること及び/又はポリペプチドを宿主又は宿主細胞培地から精製することを含んでも含まなくてもよい。当該方法は、次の判定基準の1つ又は全てを満たす残基の選択を支持することを含んでよい:
−高い表面接触性を有する残基が、低い表面接触性を有するものより好適であること;
−他のアミノ酸からシステインへの保存的変異が非保存的変異より好適であること;
あるいは、又はさらに、本明細書を通じて詳述する通り選択判定基準は、本発明の第一態様の方法において、残基を選択するために使用しても使用しなくてもよい。

0063

本発明の第二態様は、本発明の第一態様に従ってデザイン及び/又は産生されたポリペプチド配列及び/又はポリペプチドを含んでなるチオアルブミンを供する。

0064

好適には、ポリペプチドは組換え型ポリペプチドである。好適にはポリペプチドは、単離及び/又は精製されたポリペプチドである。好適には、ポリペプチドは合成されたもの且つ/又は本来天然に生じないものである。具体的には、本発明は配列番号1の残基1〜585と少なくとも60%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド、又はこの断片若しくは融合物を供し、ここで:
(a)配列番号1の位置34と等価な位置に、結合コンピテントシステイン残基が存在し;且つ
(b)ポリペプチド中の他の箇所に、1個又は複数の、好適には2個以上の結合コンピテントシステイン残基が存在する。

0065

さらに、本発明は、配列番号1の残基1〜585と少なくとも60%同一であるアミノ酸配列、又はこの断片若しくは融合物を含んでなる結合コンピテントポリペプチドを供し、当該ポリペプチド中に:
(a)配列番号1の位置34と等価な位置に、結合コンピテントシステイン残基が存在せず;且つ、
(b)ポリペプチド中の他の箇所に、1又は複数の、好適には2個以上又は3個以上の結合コンピテントシステイン残基が存在する。

0066

ポリペプチドは、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19又は20個の結合コンピテントシステイン残基を含んでも含まなくてもよい。

0067

さらに詳細には、(周知のアルブミン配列、例えば配列番号1などに関して説明される)ポリペプチドは、1又は複数の以下のものを含んでも含まなくてもよい:
(a)配列番号1の残基L585、D1、A2、D562、A364、A504、E505、T79、E86、D129、D549、A581、D121、E82、S270、Q397及びA578のいずれかと等価な位置に相当する位置での、システインでないアミノ酸のシステインでの置換;
(b)配列番号1の残基L585、D1、A2、D562、A364、A504、E505、T79、E86、D129、D549、A581、D121、E82、S270、Q397及びA578のいずれかと等価な位置に相当する又は相当しないアミノ酸のN又はC側に隣接する位置でのシステインの挿入;
(c)C360、C316、C75、C168、C558、C361、C91、C124、C169及び/又はC567の欠失又は置換によって生じる又は生じない、C369、C361、C91、C177、C567、C316、C75、C169、C124及びC558のいずれかに相当する又は相当しない位置の、遊離チオール基を有するシステイン。
(d)アルブミン配列のN末端残基のN側及び/又はアルブミン配列のC末端残基のC側へのシステインの付加。

0068

(a)、(b)、(c)及び(d)の置換、欠失、付加又は挿入事象により、置換、挿入、欠失及び付加現象の前のポリペプチドに対して、最終的に、ポリペプチド配列の結合コンピテントシステイン残基の数が増加する。上記の(a)〜(d)内において、前記残基の全ての残基が好適である。しかしながら、各(a)、(b)、(c)及び(d)において、残基は優先度が低下していく順で収載される。

0069

チオアルブミンは、1又は複数の自然発生の遊離チオール基、例えばHSA中のシステイン34(配列番号1)などが、システインでないアミノ酸へ修飾されるポリペプチドを含んでも含まなくてもよい。例えば、システインは相対的に高い保存スコア(例えば、図4に従って計算されるような1, 2又は3)を有するアミノ酸、例えばアラニン又はセリンなどによって置換されても置換されなくてもよい。チオアルブミンは、1又は複数の自然に生じる遊離チオール基、例えばHSA(配列番号1)中のシステイン34などが存在するポリペプチドを含んでも含まなくてもよい。

0070

明細書中で詳述するように、本発明は、1又は複数の延長、付加、挿入、置換又は欠失によって、システイン残基を導入することによって達成される。

0071

付加は、延長及び/又は挿入によって行われてもよい。

0072

例えば、1又は複数の結合コンピテントシステインは、延長によって;例えば、単一システイン残基、あるいは1又は複数の結合コンピテントシステインを含む長いポリペプチドとして付加されても付加されなくてもよいさらなるシステイン残基を、分子のN末端又はC末端へ付加することによって、アルブミン中に生じても生じなくてもよい。システイン残基は、アルブミンのN又はC末端に直接隣接して付加してもよい。あるいは、アルブミン及びシステイン残基のN及び/又はC末端の間に位置する1又は複数の他のアミノ酸残基が存在してもよい。2個以上のシステイン残基を付加する場合には、付加されたシステインの一部又は全ては、1又は複数の他のアミノ酸、例えば1〜50個のアミノ酸、例えば1から、10、20、30又は40個のアミノ酸〜10から、20、30、40又は50個のアミノ酸によって互いに分離してもよい。好適なN末端延長は、成熟アルブミン(すなわち、そのリーダー配列から切断されたアルブミン)のN末端に直接隣接するCysの付加である。例えば、配列番号1を含んでなる又は配列番号1から成るアルブミンに関して、Cysは好適には、1番目のAsp(D1)に対して直接的にN末端となることである。このようなアルブミンは、「Cys−アルブミン」、例えば(HSAがヒト血清アルブミンである)「Cys−HSA」と呼ぶ。アルブミン、例えば配列番号1などの他の好適なN末端延長は、Cys−Ala−アルブミン、例えばCys−Ala−HSAなどを含む。好適なC末端延長は、アルブミン、例えば成熟アルブミンなどのC末端に直接隣接するCysの付加である。例えば、配列番号1を含んでなる又はからなるアルブミンに関して、Cysは好適には、最後のLeu(L585)残基に対して直接的なC末端である。このようなアルブミンは、「アルブミン−Cys」、例えば、HSA−Cysと呼ぶ。アルブミン、例えば配列番号1などの他の好適なC末端延長は、アルブミン−Ala−Cys、例えばHSA−Ala−Cysなどを含む。上述のように延長を供するのに適当なポリペプチドは、アルブミンのC又はN末端アミノ酸のC又はN側、例えば配列番号1中のL585のC側などへ付加又は挿入してよい。

0073

ポリペプチドは、結合パートナー、例えば生物活性化合物などが結合されるさらなるリンカーをさらに含んでも含まなくてもよい。例えばリンカーは、1級アミン、例えばリジンなどを含んでよい。

0074

1又は複数の結合コンピテントシステインは、挿入によって、例えばアルブミン配列からアミノ酸残基の除去なしに1又は複数の付加システインを添加することによって、あるいは1又は複数の隣接アミノ酸を少なくとも1つのシステインを含む多くの残基で置換することによって、アルブミン中に生成されてもされなくてもよく、従ってこれによりポリペプチドの全長が伸展する。例えば、システイン残基は、明細書中で同定されるアルブミン残基に直接隣接して導入されてよい。システイン残基は、単一システイン残基として又はポリペプチド内に導入されてよい。ポリペプチドは、2〜50個のアミノ酸長、好適には2、10、20、30又は40〜10、20、30、40又は50個のアミノ酸長でよい。

0075

あるいは、又は加えて、本発明は、アルブミンの1又は複数のジスルフィド結合中のシステイン残基の1つの異なるアミノ酸残基での置換を含み、これによりジスルフィド結合が切断され付加遊離チオール基から離れる。例えば、1又は複数のHSAの17個の自然発生のジスルフィド結合のシステインは、結合コンピテントシステインを供するために置換されてよい。このような置換は、ジスルフィド結合パートナーをもはや有しないために置換されていないシステインを生じ、従って遊離チオール基を供する。結合コンピテントシステインは、アルブミンの1又は複数の自然発生のジスルフィド結合、例えばアルブミン、例えばHSA(例えば、配列番号1)などの1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16又は17個の自然発生のジスルフィド結合から供されてよい。例えば、他のシステイン残基とジスルフィド結合を自然に形成する1個のシステイン残基は、相対的に保存されたアミノ酸残基、特にSer、Thr、Val又はAlaで置換されても置換されなくてもよい。配列番号1に関して、ジスルフィド結合に関与するシステイン残基は、C53、C62、C75、C91、C90、C101、C124、C169、C168、C177、C200、C246、C245、C253、C265、C279、C278、C289、C316、C361、C360、C369、C392、C438、C437、C448、C461、C477、C476、C487、C514、C559、C558及びC567である。修飾(すなわち、欠失又は置換)に好適なシステイン残基は、特にC360、C316、C75、C168、C558、C361、C91、C124、C169及び/又はC567に相当し、従って配列番号1の1又は複数のC369、C361、C91、C177、C567、C316、C75、C169、C124及びC558に結合コンピテントシステインを生じる。

0076

さらに、結合コンピテントシステインは、タンパク質構造におけるジスルフィド結合のシステインの1つの欠失によって、アルブミン中に生じても生じなくてもよく、これによりジスルフィド結合が切断されさらなる遊離チオール基が供される。

0077

あるいは、又は加えて、アルブミン分子に存在するがジスルフィド結合に関与しない1又は複数のシステイン残基(例えば、配列番号1の場合はCys34)は、削除されても削除されなくてもよい(すなわち、異なるアミノ酸での置換なしに)或いは異なるアミノ酸、特にSer、Thr、VaI又はAlaで置換されても置換されなくてもよい。

0078

2個以上の結合コンピテントシステイン残基を含んでなるポリペプチドに関して、ポリペプチドが折り畳まれる場合に、結合コンピテントシステイン残基は折り畳まれたタンパク質の表面上に相対的に均一に分布されても分布されなくてもよい。用語「折り畳み」は、天然の立体配置、例えば最も熱力学的に安定な折り畳み立体配置中に、ポリペプチド/タンパク質を折り畳むことを含む。相対的に均一な分布の利点は、2つ以上の結合部分の間に立体障害なく、2つ以上の部分のチオアルブミンへの結合ができることである。これは、チオアルブミンに結合される隣接部分(結合パートナー)間の、例えば立体障害などの問題に起因する潜在的な活性喪失を最小限にし、且つ任意に除去する利点を有する。このような部分、例えば生物活性分子は、相対的に大きくてよい。

0079

好適には2個以上の結合コンピテントシステインは、チオアルブミン分子の表面上に分布され、これらは可能な限り、例えば幾何的に可能な限り互いから離れるようスペースが置かれる。好適には、2個以上の結合コンピテントシステインの間の距離は、少なくとも10、20、30、40、50、60、70又は80オングストロームである。好適には、各結合コンピテントシステインは、分子において全ての他の結合コンピテントシステインから少なくとも10、20、30、40、50、60、70又は80オングストローム離れる。2つの結合コンピテントシステイン間の距離は、好適には、例えばアルブミンモデルで示されるように、折り畳みアルブミン分子の最長軸の長さの、少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、90又は95%、最も好適には100%の距離である。例えば、タンパク質構造1AO6で示されるように、配列番号1の最長軸は約85オングストロームである。従って、2個以上のシステイン残基は少なくとも65、70、75又は最も好適には80オングストローム離れていることが好ましい。最も好適には、各結合コンピテントシステイン残基は、折り畳みアルブミン分子の最長軸の少なくとも80、90又は95%、そして最も好適には100%の長さの距離である。

0080

好適には、結合コンピテントシステインの側鎖は、互いから離れる方向へ向けられ且つ/又はシステインに結合された部分がアルブミン構造の中心から離れる方向へ向けられるように方向付けられる。これは、結合部分及び/又はアルブミン部分自体の間の相互作用を防止する利点を供する。

0081

アミノ酸配列に関して、候補アミノ酸残基は、ソフトウェア、例えばPyMOL(Warren L. DeLano 「The PyMOL Molecular Graphics System」 DeLano ScientificLLC, San Carlos, CA, USA. http://www.pymol.org)などを使用して視覚的に点検されてよい。候補アミノ酸は、その基の他のメンバーへの近接性に基づいてカテゴリーに分けてよい。例えば、候補アミノ酸は、2、3、4、5、6、7、8、9又は10個のカテゴリーに分けてよい。候補アミノ酸の組合せが異なるカテゴリーから選択されることが好ましい。すなわち、チオアルブミンが各カテゴリー由来の1又は少数の変異を含むことが好ましい。

0082

配列番号1に関して、システイン変異の特に好適な組合せを特定するために、図5A及び5Bの候補残基を分析するためにPyMOLを使用した。このような組合せは、2個以上の結合コンピテントシステイン残基を有するチオアルブミンをデザインするために使用してよい。選択グループ1及び2は、明細書中で説明される選択方法図5A及び5B由来の選択判定基準(A)及び(B)に(それぞれ)相当する。選択グループ3は、図6Bで特定される残基に相当する。特に好適な残基は、列の見出しが図1と同様の図6A及び6Bに示されるものに加え、さらに明細書中で説明される「選択グループ」及び「近接グループ」である。

0083

列の見出しが図1及び図6で使用されたものと同様である図10に示されるものに加え、さらに以下の分析結果を示す:
近接グループ:HSA(特に、配列番号1)内の部位のサブセットを説明するための、明細書中で説明される近接グループの割り当て。

0084

例えば、(図5Aに収載される)選択グループ1で選択される候補アミノ酸残基はPyMOLソフトウェアを使用して視覚的に点検し、選択されたアミノ酸は、選択グループ1の他のメンバーへのこれらの近接性に基づいたカテゴリーに分けた。(図10「近接グループ」, 右側欄でA〜Eと表示された)5つのグループを生じ、4つは外観検査によって生じた。グループEは、N末端領域に存在することが周知である1AO6中の不可視のアミノ酸残基を含有する。加えて、cys34が近接グループA中に存在することが観察された。

0085

同様に、(図5Bに収載された)選択グループ2で選択されたアミノ酸残基は、PyMOLソフトウェアを使用して視覚的に点検され、選択されたアミノ酸は、選択グループ2の他のメンバーへのこれらの近接性に基づいたカテゴリー分けられた。(図10「近接グループ」, 右側欄で、F〜Jと表示された)5つのグループを生じた。
同様に、ジスルフィド結合の切断を生じている変異によって生じることができる、(図6Bに収載される)選択グループ3で選択される好適な自由システイン残基は、PyMOLソフトウェアを使用して視覚的に点検され、選択されたアミノ酸をそのグループの他のメンバーへのこれらの近接性に基づいたカテゴリーに分けた。(図10「近接グループ」, 右側欄で、K〜Nと表示された)4つのグループを生じた。選択グループ3の残基を言及する場合、前述の残基は生じる結合コンピテントシステイン(例えば、図6B)である。このような結合コンピテントシステインを生じるために、ジスルフィド結合にあるカウンターパートシステイン(例えば、図6A)は、例えば欠失又は置換によって除去すべきであることは明らかである。

0086

2個以上の変異の組合せが望まれる場合、(例えば、配列番号1に関して)異なる「近接」グループ内に存在するアミノ酸残基は、同一の近接グループ内に存在するものよりも好適である。配列番号1に関して、14個の近接グループ(すなわち、A〜N)が存在する。2個以上の結合コンピテントシステインを有するチオアルブミンに関して、14個のグループそれぞれから定義される結合コンピテントシステインが存在しない、又は1つ存在することが好ましい。つまり、このようなチオアルブミンが、同一グループに含まれる2個以上の結合コンピテントシステインを含まないことが好ましい。この判定基準を満たす多くの置換(permutation)が存在する。

0087

例えば、2つの遊離チオール基を含有するチオアルブミン変異体に関して、選択グループ1を生じた選択判定基準に基づく残基であって、一方の残基が近接グループCのA364と結合するために近接グループAから選択される、T79+A364の組合せは、近接グループAにどちらも存在するT79+E86よりも好適である。

0088

システイン34を含む組合せに関して、近接グループA、F又はKから残基を選択しないことが好ましい。つまり、1又は複数の近接グループB〜E、G〜J及びL〜Nから残基を選択することが好ましい。

0089

選択グループ1の中から選択される好適な変異の例には、以下のものが含まれてよい:−選択グループ1から選択される2個のアミノ酸残基に関して;近接グループA+C由来のアミノ酸残基、例えばT79+A364が好適であり、同様に、近接グループC+Eから選択されるアミノ酸残基、例えばA364+D1もまた好適である。さらに、近接グループD+Eに由来するアミノ酸残基、例えばL585+A2、又は+L585のC側+A2、或いはG+Iに由来するアミノ酸残基、例えばS270+A581が好適である。
−選択グループ1から選択される3個のアミノ酸残基に関して;近接グループA+C+Bに存在するアミノ酸残基は、例えばT79+A364+D562が好適である。同様に、近接グループB+C+E、例えばD562+A364+A2又はD562+A364+D1から選択されるアミノ酸残基もまた好適である。
−選択グループ1から選択される4個のアミノ酸残基に関して;近接グループA+C+B+Dに存在するアミノ酸残基、例えばT79+A364+D562+A504、或いはT79+D562+A364+L585が好適である。近接グループA+B+C+E、例えばC34+D562+A364+A2、T79+D562+A364+D1などから選択されるアミノ酸残基がさらに好適である。
−選択グループ1から選択される5個のアミノ酸残基に関して;近接グループA+C+B+D+Eに存在するアミノ酸残基、例えばT79+D562+A364+L585+D1などが好適である。同様に、E86+D562+A364+A504+A2もまた好適である。
−上述のアルブミン変異体は、配列番号1のCys34、又は他のアルブミン中の等価な位置に、システインをさらに含んでも含まなくてもよい。

0090

選択グループ2の中から選択される好適な変異の例には、以下を含んでよい:
−選択グループ2から選択される2個のアミノ酸残基に関して;近接グループG+Iに存在するアミノ酸残基、例えばS270+A581が好適である。あるいは、近接グループG+Hに存在するアミノ酸残基、例えばS270+D129が好適である。
−選択グループ2から選択される3個のアミノ酸残基に関して;近接グループG+I+Fに存在するアミノ酸残基、例えばS270+A581+E82が好適である。あるいは、近接グループG+I+Hに存在するアミノ酸残基、例えばS270+A581+D129が好適である。
−選択グループ2から選択される4個のアミノ酸残基に関して;近接グループG+I+F+Hに存在するアミノ酸残基、例えばS270+A581+E82+D129が好適である。
−選択グループ2から選択される5個のアミノ酸残基に関して;近接グループG+I+F+H+Jに存在するアミノ酸残基、例えばS270+A581+E82+D129+Q397が好適である。しかしながら、変異A578、A581と組合せたD549は好適でない。さらに、D549、A578、A581への変異、又は選択グループ1由来のL585の変異との組合せは好適でない。

0091

結合コンピテント遊離チオールのために、選択グループ3の中から選択された好適な部位の例には、以下の事項が含まれる:
−選択グループ3から選択される2個のアミノ酸残基に関して;近接グループM+Lに存在するアミノ酸残基、例えばC369+C177が好適である。同様に、C361+C124もまた好適である。
−ジスルフィド結合を切断する2個以上の変異は少ない方が好適である。
−上述のアルブミン変異体は、さらに配列番号1のCys34、又は他のアルブミン中の等価な位置にシステインを含んでも含まなくてもよい。

0092

選択グループ1、2及び3由来の部位の組合せはまた、選択グループ1由来の部位が選択グループ2由来の典型的に好ましい部位であり、選択グループ3から選択される典型的に好ましい部位であるものとすることができる。

0093

選択グループ1+2由来の部位の例には、近接グループC+I由来の残基、例えばA364+A581が含まれてよい。あるいは、近接グループA+G+I由来の残基、例えばC34+S270+A581、近接グループA+H+G+I由来の残基、例えばC34+D129+S270+A581、近接グループA+C+I由来の残基、例えばT79+A364+A581、又は近接グループC+I+H由来の残基、例えばA364+A581+D129もまた好適である。

0094

選択グループ1+3由来の部位の例には、近接グループA+L+M由来の残基、例えばC34+C169+C316、近接グループC+L由来の残基、例えばA364+C177を含むことが好適である。あるいは、近接グループB+M由来の残基、例えばD562+C369が好適である。

0095

選択グループ2+3由来の部位の例には、近接グループH+M由来の残基、例えばD129+C369を含むことが好適である。あるいは、近接グループI+M由来の残基、例えばA581+C369が好適である。

0096

選択グループ1+2+3由来の部位の例には、近接グループA+H+M+D由来の残基、例えばC34+D129+C360+L585、近接グループB+H+M由来の残基、例えばD562+D129+C369を含むことが好適である。

0097

上述の組合せは、近接グループの次のセット由来の残基の組合せより、一般的に好適である:(i)A、K及びF;(ii)B、D、I、J及びN;(iii)C及びM;(iv)H及びL。

0098

本発明の上述のアルブミン変異体は、配列番号1以外のアルブミンに基づく場合、配列番号1のCys34、又は等価な位置にシステインをさらに含んでも含まなくてもよい。1個以上の遊離チオール基(結合コンピテントシステイン)の導入のための部位は、選択グループ1、2及び3から選択されていることを、当業者であれば理解するであろう。しかしながら、このアプローチはまた配列番号1から選択される他の残基由来の1個以上の遊離チオール基の導入のための部位を選択するために使用されてよく、すなわち他の有効な選択グループを生じるために開示された方法を使用することができる。

0099

好適なチオアルブミンは、位置34の天然に生じるCysに加えて、位置2及び585にCysを有する配列番号1を含んでなる(配列番号78,コンストラクト「TA33」)。より好適なチオアルブミンは、位置34の天然に生じるCysに加えて、位置2、364、562、585にCysを有する配列番号1を含んでなる(配列番号82, コンストラクト「TA38」)。位置2、364、562及び585に3個又は4個のCysを含んでなるチオアルブミンもまた、好適である。

0100

ポリペプチドは、グリコシル化を減少する少なくとも1個の変異を含んでも含まなくてもよい。

0101

本発明の第三の態様は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを供する。ポリヌクレオチドは、発現され得る宿主に対してコドン最適化されてもされなくてもよい。配列番号2は、HSA(配列番号1)の通常のコード配列を供する。配列番号3は、出芽酵母からの発現のためにコドン最適化されたHSA(配列番号1)のコード配列を供する。本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを供するために、配列番号2又は3は変異されてよい。好適には、ポリヌクレオチドは合成且つ/又は組換え型である。好適には、ポリヌクレオチドは、単離されたポリヌクレオチドである。ポリヌクレオチドは、リーダー配列を有する又は有しないHSAをコードする。例えば、ポリヌクレオチドは、HSAの天然のリーダー配列を有するHSA(配列番号102のアミノ酸1〜24個)又は融合リーダー配列を有するHSA(配列番号49のアミノ酸1〜24個)をコードする。

0102

本発明の第4の態様は、本発明の第3の態様のポリヌクレオチドを含んでなるプラスミドを供する。プラスミドは、(参照により明細書中に全て組み込まれる)WO2005/061719、WO2005/061718及びWO2006/067511において説明されるような、2ミクロン単位のプラスミドである。プラスミドは、例えばシャペロン、特にPDIの発現を通じて、増強されたシャペロン活性を示してよい。

0103

本発明の第5の態様は、発現系、例えば本発明の第3の態様のポリヌクレオチド及び/又は本発明の第4の態様のプラスミドを含んでなる宿主細胞を供する。好適には、宿主細胞は、例えばヒト又はウシ細胞哺乳類細胞、或いは真菌細胞、例えば酵母細胞等である。あるいは、宿主細胞は、バクテリア細胞、例えばバシラス属(Bacillus)若しくは大腸菌(Escherichia coli)又はウイルス細胞、例えばバキュロウイルス(Baculovirus)、又は植物細胞、例えば米、例えばオリセティバ(Oryza sativa)であってよい。最も好適には、細胞は、例えばサッカロミセス属(Saccharomyces)(例えば、出芽酵母)、ピチア属(Pichia)又はアスペルギルス属(Aspergillus)の細胞等の酵母細胞である。

0104

本発明の第6の態様は、結合パートナー、例えば生物活性化合物、及び本発明のポリペプチドを含んでなる複合体であって、ここで結合パートナーがポリペプチドの結合コンピテントシステイン残基を介してポリペプチドに結合される複合体を供する。結合パートナーは、治療診断又は造影化合物、例えば明細書中で言及するものである。複合体は、それぞれ異なる且つ/又は同一化合物の複数のコピーである、2個以上、例えば2、3、4、5、6、7、8、9又は10個の結合パートナーを含んでよい。好適には、各結合パートナーは、ポリペプチドの結合コンピテントシステイン残基を介してポリペプチドに結合され、しかしながら結合パートナーは、他の手段、例えば遺伝子融合又はシステインでないアミノ酸、例えばリジン等への共有結合によって結合されてよい。

0105

本発明の第7の態様は、以下を含んでなる本発明のポリペプチドの製造方法を供する:(a)ポリペプチドの発現が可能な条件下で、本発明の宿主細胞を培養する段階;並びに、
(b)宿主細胞及び/又は宿主細胞成長培地由来のポリペプチドを回収する段階。

0106

従って、本発明はまた、以下:(a)上記で定義されるような選択のポリヌクレオチドコードタンパク質産生物を含んでなる本発明の宿主細胞を供する段階;及び(b)宿主細胞を成長させる段階(例えば、培養液で宿主細胞を培養する段階)、
を含んでなる本発明のポリペプチド(又はタンパク質)の製造のための方法を供し、これにより、1又は複数のヘルパータンパク質過剰発現を生じるように遺伝的に修飾されていない同一宿主細胞を、同一条件下で成長させる段階(例えば、培養する段階)によって達成される選択のタンパク質産生物の産生レベルと比べて、増加されたレベルの選択のタンパク質産生物を含んでなる細胞培養又は組換え型生物を生じる。
宿主細胞を成長させる段階は、多細胞生物由来の宿主細胞を再成長させて多細胞の組換え型生物(例えば植物又は動物など)にする段階、及び、任意に、これに由来する1又は複数の後代世代を生じる段階を含んでも含まなくてもよい。

0107

当該方法は、これにより発現された選択のタンパク質産生物を、培養された宿主細胞、組換え型生物又は培養液から精製する段階をさらに含んでも含まなくてもよい。
当該産生方法は、ポリペプチドの結合コンピテントシステイン残基を通して、結合パートナーを本発明のポリペプチドに結びつける段階を含んでよい。適切な結合方法及び結合パートナーは、明細書中で説明される。

0108

本発明の第8の態様は、本発明の複合体並びに少なくとも1つの医薬的に許容されるキャリア及び/又は希釈剤を含んでなる組成物を供する。

0109

本発明の第9の態様は、医薬成分及び/又は医薬産生物を製造するための方法を供し、本発明のチオアルブミンを製造する段階、任意にさらなる分子をチオアルブミンに結合する段階、得られる複合体を医薬的に許容される希釈剤及び/又はキャリアで任意に製剤する段階、並びに産生物を単位剤形で任意に調製する段階を含んでなる。

0110

本発明の第10の態様は、チオアルブミン複合体の産生のための本発明のポリペプチドの使用を供する。

0111

本発明の第11の態様は、本発明に記載の及び/又は本発明の方法によって生成される複合体の、疾病の治療、疾患の治療及び/又は診断のための使用を供する。

0112

本発明の第12の態様は、本発明の1又は複数のアルブミンを含んでなるゲルを供する。ゲルは、任意の適当な方法によって形成されてよい。例えば、ゲルは、適当な温度、例えば室温(15〜25℃, 例えば20℃)又は体温(36〜38℃, 好適には36.9℃)で、アルブミン溶液、又は懸濁液をインキュベートすることによって形成されてよい。ゲルは、医療機器、例えばステントコーティングするために使用してよい。ゲルは、創傷被覆中に又は上に使用してよい。アルブミンは、ゲル化する前に又はした後に、医療機器又は創傷被覆に適用されてよい。アルブミンは、実験施設内(ex situ)で又はインサイチュ(in situ)で(例えば、ヒト又は動物体上への適用又は中への挿入の前後、或いは挿入中に、医療機器又は被覆に)適用されてよい。

0113

本発明のポリペプチド及び/又は複合体は、例えば、血管新生の適用、抗血管新生の適用において使用してよいナノ粒子を調製するために、及び医療機器、例えばステントをコーティングするために使用してよい。ナノ粒子は、例えば非密着結合へのターゲティングに有効であり、従って腫瘍、例えば癌腫瘍のターゲティングに関して有用である。ナノ粒子は貪食細胞による貪食及び提示に特に感受性が高いので、免疫反応を誘発するために、ナノ粒子はまた抗原ターゲットにするのに有用であるとすることができる。本発明は、部分(結合パートナー)に結合されても結合されなくてもよい、本発明のチオアルブミンのみから成るナノ粒子を供する。本発明はまた、本発明のチオアルブミンを含んでなる、部分に結合されても結合されなくてもよいナノ粒子、並びにアルブミン関連であっても関連でなくてもよいナノ粒子の1又は複数の他の構成物を供する。好適な実施形態において、本発明のチオアルブミンは、ポリペプチドの表面上に位置する、少なくとも2つの結合コンピテントシステイン残基を含んでなる。このようなチオアルブミンは、1又は複数の結合コンピテントシステイン残基がナノ粒子の形成において使用され、1又は複数の結合コンピテント残基が、結合パートナー、例えば生物活性分子への結合のために使用されるナノ粒子の調製のために使用してよい。

0114

本発明は、あらゆるアルブミンに関する。好適な残基が配列番号1との関連で同定されている一方で、当業者であれば他のアルブミン、例えば図2及び3に開示されるアルブミンの配列中の等価な残基を特定し、そしてこのような等価な残基における(配列番号1以外の)アルブミンの変異は本発明の一部であることを理解することができるであろう。等価な残基は、例えば配列番号1と相同性アライメントで同定することができる。配列番号1以外のアルブミン中の残基は、配列番号1中のその等価な残基に同調する同一の残基を有しても有さなくてもよい。従って、本発明は、任意のアルブミン配列、例えばに表1に示される配列、さらに好適には、図2及び/又は3示される配列に基づいたチオアルブミンを供する。「に基づいた」は、1又は複数のさらなる遊離チオールを導入するためのアルブミン配列の修飾を含む。

0115

組換え型アルブミンは、高レベルの結合コンピテント遊離チオール基を有することによって、動物由来のアルブミンに比べて利点があり、病原性プリオン及びウイルスの混入の危険性なしに、製造することができる。チオアルブミン複合体の利点は、結合パートナーのために、チオアルブミン部分が別々に調製されることである。従って、チオアルブミンの1バッチは、多くの異なるチオアルブミン複合体を生成するために使用してよい。また、複合体の個々の構成成分は異なる方法によって製造することができ、従って1つの方法、例えば、宿主細胞、例えば酵母における異種タンパク質発現に限定されない。さらに、チオアルブミンは、複数の結合部位を含んでなり、従って単一のチオアルブミンは1タイプ以上の結合パートナー(例えば、治療剤診断剤ターゲティング剤造影剤)、及び/又は1又は複数のタイプの結合パートナーの複数のコピーに結合されてよい。異なるタイプの結合パートナーにチオアルブミンを結合する能力により、多機能性種を供することができる。チオアルブミンを結合パートナーの複数のコピーへ結合する能力により、分子濃度を増加することができ、これにより結合パートナーのたった1つのコピーを有する複合体と比較して、所定の目的に必要なチオアルブミン複合体の量、又は体積は増加する。アルブミン融合タンパク質を介した薬物送達の利点は、Osborn等(2002)、J Pharmacol Exp Ther 303(2):540〜8で考察される。本発明の結合を介した薬物送達は、同様の利点を有することが期待される。

0116

本発明に従って使用してもしなくてもよいさらに詳細な説明を以下にする:

0117

次元(3D)モデル
上記の開示は、配列番号1に関連する1A06として周知のアルブミンモデル(Protein Data Bank)に関してされている。図1は、1AO6に関するアミノ酸残基を示す。

0118

しかしながら、本発明はあらゆるアルブミン及びこれらの構造に関する。当業者であればアルブミンの構造を利用することができ、例えばヒトアルブミン三次構造に関する原子座標は、www.ncbi.nlm.nih.govのGenBankDNAデータベースで利用できる。

0119

構造は、適当なソフトウェア例えばRasM.1 Chime(Sayle, TIBS20, 374, 1995)を使用して見られる。利用できるアルブミン座標は以下を含む:
1AO6,1BM0(Sugio et al. (1999). Protein Enq 12(6): 439-46)であり、これはトップの17個の要求タンパク質中のものであった。
1UOR,He & Carter(1992).Nature 358(6383):209〜15。
1bj5及び1bke,Curry等(1998).Nat Struct Biol 5(9):827〜35。
1e7a,1e7b,1e7c,Bhattacharya等(2000).J Biol Chem 275(49):38731〜8。
1e7e,1e7f,1e7g,1e7h及び1e7i,Bhattacharya等(2000).J MoI Biol 303(5):721〜32。
1GNJ,Petitpas等(2001).J MoI Biol 314(5):955〜60。
1HA2及び1H9Z Petitpas等(2001).J Biol Chem 276(25):22804〜9。

0120

アルブミン
本発明で使用されるアルブミンは、自然発生のアルブミン、アルブミン関連タンパク質又はこれらの変異体、例えば天然又は組換え変異体である。変異体は、多型、断片、例えばドメイン及びサブドメイン、断片及び/又は融合タンパク質を含む。本発明のアルブミンは、任意の供給源から得られるアルブミンタンパク質の配列を含んでなる。典型的には、供給源は、哺乳類、例えばヒト又はウシである。好適な一実施形態では、血清アルブミンはヒト血清アルブミン(「HSA」)である。用語「ヒト血清アルブミン」は、ヒトで自然に生じているアミノ酸配列を有する血清アルブミン及びこの変異体を含む。好適には、アルブミンは、配列番号1のアミノ酸配列或いはこの変異体又は断片、好適にはこの機能変異体又は断片を有する。HSAコード配列は、ヒト遺伝子に相当するcDNAを単離するための周知の方法によって得られ、また、例えばEP0073646及びEP0286424に開示される。断片又は変異体は、機能的でも機能的でなくてもよい。例えば、断片又は変異体は、アルブミン受容体、例えばFcRnへ結合する能力を、(断片又は変異体が由来する)親アルブミンの受容体に結合する能力の少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、90又は100%まで保持する。相対的な結合能力は、当業者に周知の方法、例えば表面プラスモン共鳴試験によって測定される。

0121

アルブミンは、ヒトアルブミン又はヒトアルブミン類似体の自然に生じている多形変異体である。通常、ヒトアルブミンの変異体又は断片は、モル比で(mole for mole)、ヒトアルブミンのリガンド結合活性(例えば、FcRN結合)の少なくとも5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%(好適には、少なくとも80%, 90%, 95%, 100%, 105%又はそれ以上)、を有する。

0122

「アルブミン」は、ウシ血清アルブミンの配列を含んでなる。用語「ウシ血清アルブミン」は、ウシで自然に生じるアミノ酸配列を有する血清アルブミン、例えばスイスプロット受入番号P02769に由来するもの、及び明細書中で定義されるこの変異体を含む。用語「ウシ血清アルブミン」はまた、明細書中で定義される全長のウシ血清アルブミン又はこの変異体の断片を含む。

0123

多数のタンパク質は、アルブミンファミリー内に存在することが知られており;非排他的リストを以下の表1に示す。リストは、(他に指示しない限り)成熟タンパク質及びリーダー配列を含む配列の全長を示す。

0124

アルブミンは、イヌ(例えば、スイスプロット受入番号P49822-1を参照されたい)、ブタ(例えば、スイスプロット受入番号P08835-1を参照されたい)、ヤギ(例えば、製品番号A2514又はA4164としてSigmaから利用できる)、ネコ(例えば、スイスプロット受入番号P49064-1を参照されたい)、ニワトリ(例えば、スイスプロット受入番号P19121-1を参照されたい)、卵白アルブミン(例えば、トリ卵白アルブミンを参照されたい)(例えば、スイスプロット受入番号P01012-1を参照されたい)、シチメンチョウ卵白アルブミン(例えば、スイスプロット受入番号O73860-1を参照されたい)、ロバ(例えば、スイスプロット受入番号Q5XLE4-1を参照されたい)、モルモット(例えば、スイスプロット受入番号Q6WDN9-1を参照されたい)、ハムスター(DeMarco et al. (2007). International Journal for Parasitology 37(11): 1201-1208を参照されたい)、ウマ(例えば、スイスプロット受入番号P35747-1を参照されたい)、アカゲザル(例えば、スイスプロット受入番号Q28522-1を参照されたい)、マウス(例えば、スイスプロット受入番号P07724-1を参照されたい)、ハト(例えば、Khan et al, 2002, Int. J. Biol. Macromol., 30(3-4), 171-8で定義される)、ウサギ(例えば、スイスプロット受入番号P49065-1を参照されたい)、ラット(例えば、スイスプロット受入番号P02770-1を参照されたい)及びヒツジ(例えば、スイスプロット受入番号P14639-1を参照されたい)由来の1つの血清アルブミンに由来するアルブミンの配列を含んでなり、明細書中で規定するものとしてこれらの変異体及び断片を含む。

0125

アルブミンは、例えば血清アルブミン又は卵白アルブミン等のアルブミン、例えば以下の表1に示すものの配列を含んでなり、さらに明細書中で定義されるこの変異体及び断片を含む。

0126

0127

アルブミンの多くの自然に生じている変異形態は周知である。多くは、Peters,(1996, All About Albumin: Biochemistry, Genetics and Medical Applications, Academic Press, Inc., San Diego, California, p.170-181)において説明される。明細書中で定義する変異体は、これらの自然に生じている変異体、例えばMinchiotti等(2008)Hum Mutat 29(8):1007〜16.,及びhttp://www.uniprot.org/uniprot/P02768で説明されるものの1つであってよい。

0128

「変異体アルブミン」は、変化が、少なくとも1つの基本特性、例えば結合活性(ある種の且つ特異的な活性、例えばビリルビン又は脂肪酸、例えば長鎖脂肪酸、例えばオレイン酸(C18:1)、パルミチン酸(C16:0)、リノール酸(C18:2)、ステアリン酸(C18:0)、アラキドン酸(C20:4)及び/又はパルミトレイン酸(C16:1)への結合)、モル浸透圧濃度膠質浸透圧,コロイド浸透圧)、特定のpH領域(pH安定性)での性質(behaviour)等が顕著に変化していないアルブミンタンパク質を生じる場合には、1又は複数の位置においてアミノ酸挿入、欠失、又は置換が存在した、保存的又は非保存的なアルブミンタンパク質を意味する。ここで「顕著に」は、変異体の特性が、元のタンパク質、例えば変異体が由来するタンパク質からかなり明確に異なっていることである、と当業者であれば言及することを意味する。このような特性は、本発明におけるさらなる選択判定基準として使用してよい。

0129

典型的には、アルブミン変異体は、自然に生じているアルブミン、例えば配列番号1と、40%以上、通常少なくとも50%、より典型的には少なくとも60%、好適には少なくとも70%、さらに好適には少なくとも80%、さらに好適には少なくとも90%、さらに好適には少なくとも95%、最も好適には少なくとも98%以上の配列同一性を有する。2つのポリペプチド間のパーセント配列同一性は、適当なコンピュータープログラム、例えばUniversity of Wisconsin Genetic Computing GroupのGAPグログラムを使用して測定されてよく、配列が最適に並べられているポリペプチドに関するパーセント同一性が計算されると理解される。あるいはアライメントは、Clustal W program又はClustal V programを使用して実行され、これにより複数のアライメントの配列間の%相同性及び/又はペアワイズアライメントの配列間の%同一性を計算できる。使用されるパラメーターは、次の通りである:
FASTペアワイズアライメントパラメーター:K−tuple(word)size;1、ウィンドウサイズ;5、gap penalty;3、number of top diagonals;5。スコア化方法:Xパーセント。複数のアライメントパラメーター:gap open penalty;10、gap extension penalty;0.05。Scoring matrix:BLOSUM
Custal W:ペアワイズアライメントパラメーター:「Slow−Accurate」、Gap Penalty:10、Gap Length:0.1、Protein Weight Matrix:Gonnet 250、DNA Weight Matrix:IUB。複数のアライメントパラメーター:Gap penalty 10.00,gap length penalty 0.20, Delay Divergent Seqs(%)30,DNA transition weight 0.50,Protein weight matrix=Gonnet series,DNA weight matrix=IUB。
Clustal V:ペアワイズアライメントパラメーター:Ktuple:1,Gap Penalty:3, Window:5,Diaganols:5;複数のアライメントパラメーター:Gap penalty 10,gap length penalty10。

0130

保存的置換
明細書中で使用されるように、用語「保存的」アミノ酸置換は、同一のグループ内で行われ、典型的には実質的にタンパク質機能に影響しない置換を意味する。「保存的置換」は、目的の組合せ、例えばGIy、Ala;VaI、Ile、Leu;Asp、GIu;Asn、GIn;Ser、Thr;Lys、Arg;及びPhe、Tyrである。このような変異体は、当技術分野に周知の技術、例えば、明細書中で参照により組み込まれる、米国特許第4,302,386号(issued 24 November 1981 to Stevens)において開示される、部位特異的な変異原性によって作成されてよい。
一実施形態において、ベン図4は、保存的アミノ酸置換を測定するために使用してよく:図4を使用して、(0〜5に渡る)保存された変異のスコアが計算される。スコア0は、最も高い保存であり、システインに関しては、システイン残基の他のシステイン残基との置換のみに対して割り当てられる。任意の他のアミノ酸からシステインへの変化に関しては、スコアは1、2、3、4、5である。スコア1は、スコア2、3、4又は5より保存的な置換である。スコア5は、置換アミノ酸及びシステイン間の最も低い保存に割り当てられる。スコア0〜5は、システインから適切なアミノ酸に到達するのに交差される境界線(すなわち、線)の数として、図4から計算される。従って、システインに関するスコアは、境界線が交差しないので0である。同様に、3つの境界線が交差するので、アスパラギン酸(D)のスコアは3である。

0131

20個の異なるアミノ酸のための(図4に関する)保存された変異のスコアは、(当該アミノ酸に関して1文字コードを使用して)定義する:A=1、C=O、D=3、E=4、F=4、G=2、H=5、I=4、K=4、L=4、M=3、N=2、P=3、Q=3、R=5、S=1、T=1、V=3、W=3、Y=3。図1、5A、5B、5C及び5Dに関しては、列に表示される「システインに対する保存された変異」において、それぞれのアミノ酸残基に対するこれらのスコアが供される。保存的な変異のスコアを使用する場合、スコア3以下である残基、すなわちアスパラギン酸メチオニンプロリングルタミン、バリン、トリプトファンチロシングリシンアスパラギン、アラニン、セリン及びスレオニン等は、システインと共に比較的保存されるので好適である。より好適には、スコア2以下のアミノ酸、すなわち、グリシン、アスパラギン、アラニン、セリン、スレオニンである。最も好適には、スコア1のアミノ酸、すなわち、アラニン、セリン、スレオニンである。同様に、図4の保存された変異のスコアシステムを使用する場合、スコア4以上の残基、すなわち、グルタミン酸フェニルアラニンイソロイシン、リジン、ロイシン、ヒスチジン及びアルギニンは、あまり好適でない、又は全く好適でないかもしれない。

0132

あるいは、又は加えて、「保存的な」アミノ酸置換は、同一のグループ内、例えば塩基性アミノ酸(例えばアルギニン,リジン,ヒスチジン)、酸性アミノ酸(例えば、グルタミン酸及びアスパラギン酸)、極性アミノ酸(例えば、グルタミン及びアスパラギン)、疎水性アミノ酸(例えば、ロイシン,イソロイシン,バリン)、芳香族アミノ酸(例えば、フェニルアラニン,トリプトファン,チロシン)並びに分子量の小さいアミノ酸(例えば、グリシン,アラニン,セリン,スレオニン,メチオニン)のグループ内でなされる置換を意味する。

0133

例えば、配列番号1におけるアラニン−2の保存的置換は、グリシン又はセリンを含むことができる。非保存的置換は、あるグループ中のアミノ酸の、その他のグループのアミノ酸での置換を包含する。例えば、非保存的置換は、疎水性アミノ酸の極性アミノ酸での置換を含むことができる。

0134

断片
明細書中で使用される用語「断片」は、少なくとも1つの塩基性特性、例えば結合活性(ある種の且つ特異的な活性、例えばビリルビンへの結合)、モル浸透圧濃度(膠質浸透圧,コロイド浸透圧)、特定のpH領域(pH安定性)での性質が顕著に変化していない限り、全長アルブミン又はこの変異体の任意の断片を含む。ここで「顕著に」は、変異体の特性が、元のタンパク質由来のものから非常に明確に異なっている、と当業者であれば言及することを意味する。断片は、典型的には少なくとも50個のアミノ酸長である。断片は、少なくとも1つのアルブミンの完全なサブドメインを含んでなる。HSAのドメインは、組換え型タンパク質として発現されており(Dockal et a/., 1999, J. Biol. Chem., 274, 29303-29310)、ここでドメインIはアミノ酸1〜197から成っていると定義され、ドメインIIはアミノ酸189〜385から成っていると定義され、そしてドメインIIIはアミノ酸381〜585から成っていると定義されている。ドメインIとIIとの間、且つドメインIIとIIIとの間に存在する伸展αヘリックス構造(h10-h1)のために、ドメインの一部の重複が生じる(Peters, 1996, op. cit, 表2〜4)。HSAはまた、6個のサブドメイン(サブドメインIA, IB, IIA, IIB, IIIA 及びIIIB)を含んでなる。サブドメインIAは、アミノ酸6〜105を含んでなり、サブドメインIBはアミノ酸120〜177を含んでなり、サブドメインIIAはアミノ酸200〜291を含んでなり、サブドメインIIBはアミノ酸316〜369を含んでなり、サブドメインIIIAはアミノ酸392〜491を含んでなり、さらにサブドメインIIIBはアミノ酸512〜583を含んでなる。断片は、完全な又は部分的な1又は複数の上記で定義されるドメイン又はサブドメイン、或いはこれらのドメイン及び/又はサブドメインの任意の組合せを含んでよい。断片は、アルブミン又はアルブミンのドメインの少なくとも50、60、70、75、80、85、90、95、96、97、98又は99%を含んでなる又はから成ってよい。

0135

さらに、上記のいずれかを含んでなる単一若しくは複数の異種の融合物;又はアルブミンへの単一若しくは複数の異種の融合物、或いはこれらのいずれかの変異体又は断片を使用してよい。このような融合物は、WO 01/79271で例示されるようなアルブミンN末端融合物、アルブミンC末端融合物、並びにN末端及びC末端アルブミン共融合物を含む。

0136

相同性
図2及び3は、「P02768」として特定される、HSA(配列番号1)を有する様々なアルブミンファミリータンパク質のアライメントを示す。タンパク質配列は、アルブミンリーダー配列を含む。これらのアライメントは、上記で説明されるように選択されるHSA中のものに相当する保存領域及びアミノ酸残基を特定するために使用することができる。一方、配列又はどちらのアライメントもまた、相同性スコアをアルブミン配列中のアミノ酸残基に割り当てるために使用することができる。

0137

このような手順の一例は、Hein,JJ.(1990)の、Methodsin Enzymology、Vol.183:pp.626〜645中の「アライメント及び系統発生のための統一アプローチ」に基づき、Lasergene suiteの一部である、DNASTAR Inc.によって開発されたMegAlign program(version 8.0.2)である。Jotun Hein Method及び以下の設定、GAPPENALTY=11、複数のアライメントのためのGAPLENGTH PENALTY=3、且つペアワイズアライメントのためのKTUPLE=2、を使用して、一連のパーセンテージ同一性値を計算することができる。あるいは、Clustal W Method及び以下の設定、GAP PENALTY=10、複数のアライメントに関するGAP LENGTH 10及び、ペアワイズアライメントのためのKTUPLE=1、GAP PENALTY=3、WIND0W=5及びDIAGONAL=5を使用して、一連のパーセンテージ同一性値を計算することができる。あるいは、Clustal W Method及び次の設定、GAP PENALTY=10、GAP LENGTH PENALTY=0.2、DELAY DIVERGENCE=30、DNA transition=0.5、並びにProtein Weight matrixのためのGONNET SERIES及び複数のアライメントのためのDNA Weight matrixに関するIUB、並びにSlow accurate,GAP PENALTY=10、GAP LENGTH PENALTY=0.1を使用して、且つProtein Weight matrixに関してGONNET SERIES、並びにペアワイズアライメントのためのDNA Weight matrixに関してIUBを使用して、一連のパーセンテージ同一性値を計算することができる。あるいは、Clustal V Methodを(上記で)使用してよい。2つのアミノ酸配列のアライメントはまた、EMBOSSpackage(http://emboss.org)バージョン2.8.0.由来のNeedle programを使用して測定してよい。Needle programは、Needleman及びWunsch(1970)の「2個のタンパク質のアミノ酸配列中の類似性をサーチするために適用可能な一般的方法」J.MoI.Biol.48,443〜453において説明される包括的なアライメントアルゴリズムを実行する。使用される代替行列は、BLOSUM62であり、gap opening penaltyは10、そしてgap opening penaltyは0.5である。

0138

図2は、Clustal Wに基づいたMegAlign program(version 8.0.2)を使用して求められたHSA(アライメントでP02768と同定される、配列番号1)を含む16個の哺乳類アルブミンファミリータンパク質のアライメントを示す。タンパク質配列は、アルブミンリーダー配列を含む。各配列は、由来する動物及びデータベース受入番号で表示される。

0139

図3は、Clustal Vに基づいてMegAlign program(version 8.0.2)を使用して求められた、HSA(アライメントでP02768と同定される、配列番号1)を含む33個のアルブミンファミリー(哺乳類及び非哺乳類両方の)タンパク質のアライメントを示す。タンパク質配列は、アルブミンリーダー配列を含む。

0140

相同性は、図2及び/又は図3に関して測定してよい。所定のアミノ酸配列と配列番号1との同一性の程度は、2つの配列の短い方の長さによって分けられる、2つの配列のアライメント中の正確な対応の数として計算してよい。結果は、パーセント同一性で表現する。2つの配列が重複する同一の位置に同一のアミノ酸残基を有する場合に、正確な対応が生じる。配列の長さは、配列中のアミノ酸残基の数である。

0141

隣接残基の保存
さらに、HSAの個々のアミノ酸残基は、同位置における他のアルブミンファミリータンパク質のアミノ酸へのこれらの保存に従って、ランク付けすることができる。図1の列に表示される「アライン1」(Mamm. W (哺乳類, Clustal W))は、図2で示される哺乳類アルブミンのアライメントで計算されるように、配列番号1の各位置に関する相同性レベルを供する。相同性レベルスコアは、計算されてよい。明細書中で使用される、相同性レベルをスコア化するための1つの方法は、MegAlign program(version 8.0.2)によって供されるヒストグラムの長さを使用することによって(0〜100%の範囲で)計算され;最高=100%から、20%ずつ低下し、最低(0%)までの6つのレベルの相同性が測定され、図2においてバーの高さで示される。スコア100は、ヒト血清アルブミン由来の配列を他の哺乳類アルブミン配列と比較した場合に、最も高い保存を表し、且つその残基に修飾がないことを示し、一方スコア0は並べられた配列間の最も低い保存レベルを示す。

0142

同様に、(非哺乳類アルブミンを含む)様々なアルブミンがClustal Vを使用して並べられる場合には、HSA中の各アミノ酸残基に関する相同性レベルスコア(図1の列に表示される「アライン2」(Var. Sps. V(「様々な種(すなわち、哺乳類及び非哺乳類), Clustal V」))はMegalignによって供されるヒストグラムの長さを使用して計算される。異なるアルブミン配列及びアライメントアルゴリズム範囲が相同性レベルスコアを計算するために使用されると、当業者であれば理解できる。

0143

相同性スコア、例えば図2及び3のアライメントに関して、本発明の候補残基を特定するために説明されるものを使用する場合、好適な残基には、保存性が高くないもの(例えば、スコアが40未満、より好適には20未満、最も好適には0のもの)が含まれ、相同性レベルの高いもの(例えば、スコアが40以上、60以上、80以上、最も好適には100のもの)はあまり好適でない。

0144

HSA(配列番号1)中の各アミノ酸残基は、HSAが哺乳類アルブミンと並べられた場合、隣接残基が高保存(100%)されているかに従ってスコア化された(図1の、列に表示される「隣接100%(アライン1)」)。これは、アミノ酸が高保存ドメイン内に存在する場合、これはタンパク質の機能の構造に重要であり、従って切断は望ましくないからである。図1において、スコア0は、HSAが哺乳類アルブミンと並べられる場合に、残基が(図2のアライメントに関して)100%の相同性を有する任意の残基に隣接していないことを示し;スコア1は、HSAが哺乳類アルブミンと並べられる場合に、残基が100%相同性を有する1つの残基に隣接することを示し;スコア2は、HSAが哺乳類アルブミンと並べられる場合に、残基が100%の相同性を有する2つの残基に隣接することを示す。スコア0又は1を有する残基が好適である。スコア0を有する残基が最も好適である。

0145

例えば、スコア2を有するアミノ酸残基(例えば、バリン7(V7))は、代替アミノ酸への変異を受ける可能性が低い高相同性領域に生じる可能性があるので、これらのアミノ酸残基は好適には本発明の方法を使用して除外される。同様に、フェニルアラニン11(F11)は、保存残基の領域の、100%保存された1つの残基に隣接し、隣接する100%保存残基を有しない残基、例えばアラニン2(A2)、に隣接することはあまり好ましくない。

0146

本発明によれば、さらなる情報、例えば挿入、欠失又は置換のための好適な部位はまた、アライメント分析によって得られてよい。例えば、ネズミアルブミンは36個のシステイン残基を含み、(HSAへの相同性による)ジスルフィド結合に関与するシステインは全てシステイン34として存在するが、システイン残基は他の哺乳類アルブミン配列ではなく成熟ネズミタンパク質の579に存在し、他の哺乳類アルブミンとの相同性の欠如はこのアルブミンの構造及び/又は機能に特に重要でないことを示しているので、従ってチオアルブミン変異タンパク質579Cが好適である。さらに、様々な哺乳類アルブミンファミリー及びClustal Wのアライメントの使用(図2)は、他の哺乳類アルブミンと比べて、スナネズミアルブミンがアラニン−2(A2)とヒスチジン−3(H3)との間にさらなるアラニン残基を有することを示し、残基2(例えば、配列番号1のA2)の後及び残基3(例えば、配列番号1のH3)の前のシステイン残基の挿入が好適であることを示している。他の哺乳類アルブミンと比べて、モルモットアルブミンは、システイン34(C34)にセリン残基を有する。遊離チオール基のシステイン34における欠失が必要な実施例において、変異、例えばC34Sが好適である。

0147

(ヒト血清アルブミンを除いて)ほとんどの哺乳類アルブミン配列は、長さが584個未満又は同等のアミノ酸(リーダー配列を含む608個未満又は同等のアミノ酸)の配列を有する。図2におけるアライメントを使用して、ヒト血清アルブミン上に存在するさらなるアミノ酸残基は、他の哺乳類血清アルブミン配列中の任意の類似アライメントのアミノ酸残基なしにC末端に存在するように見える。従って、G584Cを含有し且つL585を欠失のチオアルブミン変異体が、好適である。多数のアルブミン配列(ウシ,ロバ,ヤギ,ウマ,ヒツジ,ブタ)は、長さ583個のアミノ酸(リーダー配列を含む607個のアミノ酸)である。図2中のアライメントを使用すると、これらの種のアルブミン配列はR117(リーダー配列を含むR141)に相当する残基を有しないので、V116C及びR117の欠失を含むチオアルブミン又はR117及びP118Cの欠失を含むチオアルブミンが好適であると見える。このようなチオアルブミンでは、アミノ酸配列の長さは配列番号1に比較して減少される。

0148

図2で使用されるアライメント及び導き出される結果は、特に哺乳類アルブミン及びClustal Wに関するものであり、当業者であれば、この教示はアルブミンファミリーの他のメンバー及び代替アライメントアルゴリズムに同様にあてはまると理解できる。

0149

アライメント及び同一性
アルブミン変異体は、配列番号1と少なくとも40%、特に少なくとも45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%の同一性を有する。

0150

同一性は、任意の方法、例えば明細書中で説明されるものを使用して計算されてよい。

0151

結合
チオアルブミンは、例えば遺伝又は化学融合を介して、1又は複数の結合パートナーに任意に融合されてよい。遺伝子融合を含んでなるチオアルブミンに関して、融合はN又はC末端に存在する、或いは挿入を含んでなる。

0152

アルブミンの遺伝子融合に関して、任意の他の遺伝子又は変異体、或いは部分又はいずれかの翻訳領域は、本発明と共に使用するための翻訳領域として利用されることができるということを当業者であればまた理解できる。例えば、翻訳領域は、任意の配列を含んでなるタンパク質をコードし、これは(酵素前駆体を含む)天然タンパク質、若しくは変異体、又は天然タンパク質の断片(例えば,ドメイン);或いは全体的な合成タンパク質;或いは異なるタンパク質(天然又は合成)の単一又は複数の融合物であってよい。このようなタンパク質は、WO01/79258、WO01/79271、WO01/79442、WO01/79443、WO01/79444及びWO01/79480で供されるリストに由来するもの、又はこれらの変異体若しくは断片とすることができるが、これに限定されない;なお、この開示は明細書中で参照により組み込まれる。これらの特許出願は、アルブミンのための融合パートナーとの関連でタンパク質のリストを示すが、本発明はこれらに限定されず、本発明の目的のために、これらの中に収載されたタンパク質のいずれかは単独で示される、或いはアルブミンのための融合パートナーとして、或いは上記のいずれかの任意の他のタンパク質若しくは断片又は変異体、所望のポリペプチドとして示されてよい。アルブミンの化学(又は結合として周知の)融合の例は、Leger等(2004)Bioorg Med Chem Lett 14(17):4395〜8;及びThibaudeau等(2005)Bioconjug Chem 16(4):1000〜8に示される。

0153

遺伝的又は化学的に融合されたアルブミンを使用する利点は、融合に寄与する分子のいずれか又は全ては非融合分子に対して改善された特性を有することである(Balan et al. (2006) Antivir Ther 11 (1): 35-45)。アルブミン及びアルブミン粒子はまた、薬物及びプロドラッグの作用部位への輸送及び投与のために重要である(Kratz, F. (2008) Journal of Controlled Release, 132 (3), p.171-183)。融合及び粒子技術は、改善された薬物動態特性、例えば半減期の延長のために改善された投与計画を供し、バイオアベイラビリティを改善し且つ融合された結合パートナー、例えば生物活性分子を不活化から保護する。

0154

ポリペプチドは、修飾(例えば、還元)グリコシル化、例えば、還元N結合グリコシル化又は還元O結合型グリコシル化を提示するがこれらに限定されない。アルブミン分子のN結合型グリコシル化のパターンは、任意の又は全てのN、X、又はS/T位置でアミノ酸グリコシル化コンセンサス配列、例えばN−X−S/Tを追加/除去することによって、修飾することができる。アルブミン多型はN結合型グリコシル化と共に存在する。アルブミン変異体は、リサイクル時間(recycling time)を有し、これにより生物活性キャリアとしての変異体の有効性が改善される。組換えで発現されたタンパク質は、宿主細胞を製造することによって望ましくない翻訳後の修飾に供することができる。例えば、配列番号1のアルブミンタンパク質配列は、N結合型グリコシル化に対する任意の部位を含まず、天然に、O結合型グリコシル化によって修飾されると報告されていない。しかしながら、多数の酵母種において生成された組換え型ヒトアルブミン(「rHA」)は、通常マンノースを含む、O結合型グリコシル化によって修飾することができることが分かっている。マンノシル化されたアルブミンは、レクチンコンカナバリンAに結合することができる。酵母によって生成されるマンノシル化されたアルブミンの量は、1又は複数のPMT遺伝子欠損酵母菌株(WO 94/04687)を使用することによって減少される。これを達成する最も便利な方法は、ゲノムに欠損を有する酵母を生み出すことであり、これによりPmtタンパク質の1つのレベルの減少が生じる。例えば、コード配列又は制御領域(又はPMT遺伝子において1つの発現を制御している他の遺伝子)において欠失、挿入又は転移があり、これによりPmtタンパク質がほとんど又は全く生成されない。あるいは、抗Pmt剤、例えば抗Pmt抗体を生成するために酵母を形質転換することができる。

0155

出芽酵母以外の酵母を使用する場合、出芽酵母のPMT遺伝子に等価な遺伝子の1又は複数の切断はまた、例えばピキアパストリス(Pichia pastoris)又はクルイベロミセスラクチス(Kluyveromyces lactis)において有益である。出芽酵母から単離されたPMT1(又は任意の他のPMT遺伝子)の配列は、他の真菌種において同様の酵素活性コード化している遺伝子の同定又は切断のために使用される。クルイベロミセス・ラクチスのPMT1相同体クローン化は、WO94/04687において説明される。

0156

「培養された宿主細胞又は培養液由来のこれによって発現された異種タンパク質を精製する」段階は、任意に細胞固定化細胞分離及び/又は細胞破砕を含んでなるが、常にこの段階又は細胞固定化、分離及び/又は破砕の段階と異なる少なくとも1つの他の精製段階を含んでなる。細胞固定化技術、例えばアルギン酸カルシウムビーズを使用して細胞を包むことは、当技術分野で周知である。同様に、細胞分離技術、例えば遠心分離濾過(例えば、直交流濾過,膨張層(expanded bed)クロマトグラフィ等)は、当技術分野で周知である。同様に、ビーズ粉砕、超音波処理酵素曝露等を含む細胞破砕方法は、当技術分野で周知である。

0157

少なくとも1つの他の精製段階は、当業者に周知のタンパク質精製に適当な任意の他の段階であってよい。例えば、組換え発現されたアルブミンの回収のための精製技術は次の:WO 92/04367の、マトリックス由来染料の除去;EP 464 590の、酵母由来着色料の除去;EP 319 067の、アルカリ沈殿及びその後のアルブミンの油相への適用;並びに完全な精製プロセスを説明するWO 96/37515、US 5 728 553及びWO 00/44772で開示されており;これらは全て明細書中で参照により組み込まれる。

0158

結合コンピテントアルブミン(「チオアルブミン」)の産生。
チオアルブミン又はチオアルブミンと他のタンパク質との融合は、当技術で周知の方法によって調製することができ(Sanker, (2004), Genetic Eng. News, 24, 22-28, Schmidt, (2004), Appl. Microbiol. Biotechnol., 65, 363-372)、これには、形質転換又は一過性発現による細胞株、例えばCHO(及びその変異体)、NSO、BHKHEK293、Vero又はPERC6細胞由来哺乳類細胞培養(Mason et al., (2004), Protein Expr. Purif., 36, 318-326; Mason et al., (2002), Biochemistry, 41 , 9448-9454);昆虫細胞培養(Lim et al., (2004) Biotechnol. Prog., 20, 1 192-1 197);アオウキクサ属又はイネような植物由来植物細胞培養トランスジェニック動物(Dyck et al., (2003) Trendsin Bio- technology, 21 , 394-399);トランスジェニック植物(Ma et al., (2003) Nature Reviews Genetics, 4, 794-805);グラム陽性及びグラム陰性バクテリア、例えば桿菌及び大腸菌(Steinlein, and Ikeda, (1993), Enzyme Microb. Technol., 15, 193-199);アスペルギルス属(Aspergillus)菌種(EP 238023, US 5,364,770, US 5,578,463, EP184438, EP284603, WO 2000/056900, WO9614413)、トリコデルマ属及びフザリウム属(Navalainen et al., (2005), Trends in Biotechnology, 23, 468-473)を含むがこれに限定されない糸状菌、における発現を含むがこれに限定されない。

0159

宿主細胞は、任意のタイプの細胞であってよい。宿主細胞は、動物(例えば、哺乳類,トリ,昆虫等)、植物(例えばイネ)、真菌又はバクテリア細胞であってもこれらでなくてもよい。バクテリア及び真菌、例えば酵母は、宿主細胞として好適であっても好適でなくてもよい。

0160

典型的な原核生物ベクタープラスミドは:Biorad Laboratories(Richmond, CA, USA)から利用できるpUC18、pUC19、pBR322、及びpBR329;Pharmacia(Piscataway, NJ, USA)から利用できるp7rc99A、pKK223−3、pKK233−3、pDR540及びpRIT5;Stratagene Cloning System(La JoIIa, CA 92037, USA)から利用できるpBSベクター、Phagescriptベクター、Bluescriptベクター、pNH8A、pNH16A、pNH18A、pNH46Aである。
典型的な哺乳類細胞ベクタープラスミドは、Pharmacia(Piscataway, NJ, USA)から利用できるpSVLである。このベクターは、SV40後期プロモーターをクローン化遺伝子の発現を誘導するために使用し、最も高い発現レベルはT抗原産生細胞、例えばCOS−1細胞で確認される。誘導性哺乳類発現ベクターの例としてはpMSGが挙げられ、Pharmacia(Piscataway, NJ, USA)からもまた利用できる。このベクターは、クローン化遺伝子の発現を誘導するために、ネズミ乳腺腫瘍ウイルス末端反復配列グルココルチコイド誘導性プロモーターを使用する。

0161

当業者に周知の方法は、コード配列を含む発現ベクター構築する、及び例えば適切な転写又は翻訳制御をするために使用することができる。このような方法の1つは、付着末端を介した核酸連結を含む。適合性付着末端は、適当な制限酵素の作用によってDNA断片及びベクター上に生じることができる。これらの末端は、相補的塩基対合を介して急速にアニールし、残存する切れ目DNAリガーゼの作用によって閉鎖することができる。

0162

さらなる方法は、合成二本鎖オリゴヌクレオチドリンカー及びアダプターを使用する。平滑末端を有するDNA断片は、突出3’末端を除去し陥凹3’末端を充填する、バクテリオファージT4DNAポリメラーゼ又は大腸菌DNAポリメラーゼIによって生じる。合成リンカー及び限定制限酵素のための認識配列を含む平滑末端二本鎖DNAの部分は、T4DNAリガーゼによって平滑末端DNA断片に結合されることができる。これらは、続いて付着末端を生じるために適切な制限酵素で消化され、適合性末端で発現ベクターに結合される。アダプターはまた、核酸連結のために使用される1つの平滑末端を含むが、予め形成された付着末端の1つもまた有する、化学的に合成されたDNA断片である。あるいは、DNA断片は、付着末端を任意に含有する1又は複数の合成二本鎖オリゴヌクレオチドの存在又は非存在下で、DNAリガーゼの作用によって一緒に結合することができる。

0163

様々な制限エンドヌクレアーゼ部位を含む合成リンカーは、Sigma−Genosys Ltd,London Road,Pampisford,Cambridge,United Kingdomを含む多数の供給元から市販されている。チオアルブミン、又はチオアルブミンと他のタンパク質との融合は、1又は複数のイントロンを含んでも含まなくてもよい、ヌクレオチド配列から発現されてよい。さらに、ヌクレオチド配列は、当技術分野で周知の方法によって、宿主に対してコドン最適化されてもされなくてもよい。

0164

チオアルブミン、又はチオアルブミンと他のタンパク質との融合は、還元N結合型グリコシル化で変異体として発現することができる。従って、ヒト血清アルブミン(HSA)の場合、例えば遺伝子コード配列の切断によって、タンパク質のO−グリコシル化に関与する1又は複数のタンパク質マンノシルトランスフェラーゼ欠損の酵母を使用することが特に有効である。組換え発現されたタンパク質は、宿主細胞を製造することによって、望ましくない翻訳後の修飾に供することができる。マンノシル化されたアルブミンは、レクチンコンカナバリンAに結合することができるであろう。酵母によって生成されるマンノシル化されたアルブミンの量は、1又は複数のPMT遺伝子欠損の酵母菌株を使用することによって減少することができる(WO 94/04687)。これを達成する最も簡便な方法は、ゲノムに欠損を有する酵母を作出することであり、これにより1つのPmtタンパク質の減少レベルが生じる。例えば、コード配列又は制御領域(或いは、他の遺伝子の1つのPMT遺伝子の発現制御)において欠失、挿入又は転移が存在しても存在しなくてもよく、これによりPmtタンパク質がほとんど又は全く生成されない。あるいは、酵母は、抗Pmt剤、例えば抗Pmt抗体を生成するために形質転換することができる。あるいは、酵母は、PMT遺伝子の1つの活性を抑制する化合物の存在下で培養することができる(Duffy et al, "Inhibition of protein mannosyltransferase 1 (PMT1) activity in the Pathogenic yeast Candida albicans", International Conference on Molecular Mechanisms of Fungal Cell Wall Biogenesis, 26-31 August 2001 , Monte Verita, Swit-zerland, Poster Abstract P38; 当該ポスター要旨はhttp://www.micro.biol.ethz.ch/cellwall/で見られる)。出芽酵母以外の酵母が使用される場合、出芽酵母のPMT遺伝子に相当する遺伝子の1又は複数の切断はまた、例えば、ピキア・パストリス又はクルイベロミセス・ラクチスにおいて有益である。出芽酵母から単離されたPMT1(又は任意の他のPMT遺伝子)の配列は、他の真菌種において同様の酵素活性をコード化する遺伝子の同定又は切断のために使用されてよい。クルイベロミセス・ラクチスのPMT1相同体のクローン化は、WO94/04687で説明される。

0165

酵母は、WO95/33833及びWO95/23857においてそれぞれ示されるように、HSP150及び/又はYAP3遺伝子の欠失を有しても有さなくてもよい。

0166

HSA変異体は、組換え型発現及び分泌によって生成されてよい。発現系(すなわち、宿主細胞)が酵母、例えば出芽酵母である場合、出芽酵母のための適当なプロモーは、PGK1遺伝子、GAL1又はGAL10遺伝子、TEF1、TEF2、PYK1、PMA1、CYC1、PH05、TRP1、ADH1、ADH2、グリセルアルデヒド−3−フォスフェートデヒドロゲナーゼヘキソキナーゼピルビン酸デカルボキシラーゼホスホフルクトキナーゼトリオースフォスフェートイソメラーゼホスホグルコースイソメラーゼグルコキナーゼ、α−接合因子フェロモン、a−接合因子フェロモン、PRB1プロモーター、PRA1プロモーター、GPD1プロモーター、及び他のプロモーターの5’制御領域の部分又は上流活性化部位との、5’制御領域の部分のハイブリッドを含むハイブリッドプロモーター(例えば、EP-A-258 067のプロモーター)に対する遺伝子、に関するものを含む。

0167

適当な転写終結シグナルは当技術分野で周知である。宿主細胞が真核生物由来の場合、転写終結シグナルは好適には、真核生物遺伝子の3’隣接配列に由来し、転写終結及びポリアデニル化に適切なシグナルを含む。適当な3’隣接配列は、例えば、使用される発現制御配列のために天然に結合された遺伝子の配列であり、すなわちプロモーターに対応する。あるいは、これらは異なってもよい。この場合、及び宿主が酵母、好適には出芽酵母の場合、出芽酵母ADH1、ADH2、CYC1又はPGK1遺伝子の終了シグナル遺伝子が好適である。

0168

任意の隣接遺伝子、例えば2μm遺伝子中への転写の読み過ごし又はその逆を防止する目的で、転写終結配列がプロモーター及び翻訳領域の上流下流いずれにも位置するように、プロモーター及びアルブミン変異体の配列を含んでなる組換え型タンパク質をコードする遺伝子の翻訳領域を、転写終結配列の近くに隣接させることが有益である。

0169

一実施形態において、酵母、例えば出芽酵母における好適な制御配列は:酵母プロモーター(例えば、EP 431 880に示される、出芽酵母PRB1プロモーター);及び転写ターミネーター、好適にはEP 60 057に示されるサッカロミセス属ADH1由来のターミネーターを含む。

0170

翻訳の読み過ごしを最小限化し、これにより伸長された非天然の融合タンパク質の産生を回避するために、翻訳終止コドン、例えばUAA、UAG又はUGAをコードする、1つ以上のDNA配列を組み込むことは、非コード領域に対して有益である。翻訳終止コドンはUAAが好適である。

0171

好適な一実施形態において、アルブミン変異体の配列を含んでなる組換え型タンパク質が分泌される。この場合、分泌リーダー配列をコードしている配列は、翻訳領域に含まれてよい。従って、本発明のポリヌクレオチドは、分泌リーダー配列をコードするポリヌクレオチド配列に操作可能に結合されたアルブミン変異体の配列を含んでなる組換え型タンパク質をコードする配列を含んでなる。リーダー配列は、必ずしも必要でないが、通常、ORFのの一次翻訳産生物のN末端に位置し、そして必ずしも必要でないが、通常、「成熟」タンパク質を得るために分泌プロセス中にタンパク質が切断される。従って、一実施形態において、リーダー配列との関連で用語「操作可能に結合された」は、アルブミン変異体の配列を含んでなる組換え型タンパク質をコードする配列が、5’末端且つインフレームで、分泌リーダー配列をコードするポリヌクレオチド配列の3’末端に結合されるという意味を含む。あるいは、分泌リーダー配列をコードするポリヌクレオチド配列は、アルブミン変異体の配列を含んでなる組換え型タンパク質のコード配列内のインフレームに、又はアルブミン変異体の配列を含んでなる組換え型タンパク質のコード配列の3’末端に位置してよい。

0172

(分泌プレ領域及びプレ/プロ領域とも呼ばれる)多数の天然又は人工のポリペプチドリーダー配列は、宿主細胞からタンパク質を分泌するために、使用又は開発されてきた。リーダー配列は、新生タンパク質を、細胞から周囲の媒体、又は場合によっては、細胞膜周辺腔中にタンパク質を排出する細胞機構へ向ける。

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