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図面 (17)

課題

本発明は、臨床現場等での簡易的な検査でも正確な結果を得ることができる高精度な一本鎖DNA調製方法の技術を提供することを目的とする。

解決手段

ライゲーション反応、好ましくはサイクリンクライゲーション反応で増幅させた一本鎖ヌクレオチド産物をPCRやLCR増幅することなく検出試料とすることで、より簡易的かつ迅速な遺伝子解析にも利用可能な高精度な一本鎖DNA産物を得る。

概要

背景

検体塩基配列解析して判定を行う遺伝子検査は、基礎研究医療食品等の分野で広く用いられている。より具体的には、突然変異の検出、遺伝子多型(ヒトや動物では、変化の頻度が1%以上のものを言う)の判定、病原菌の検出、遺伝子組換えの有無の検査等に用いられている。例えば、遺伝子多型判定は、薬の副作用や効果をあらかじめ予測できるとして、医療現場等で活用され始めている。

遺伝子検査は、典型的にはリアルタイムPCR機器を用いたTaqMan法やQP法、DNAマイクロアレイを用いた手法(DigiTag法等)等を使用して行われる。しかしながら、これらの方法はいずれも技術習得、高額な蛍光検出機器を必要とするため、受託解析は行われているものの、医療現場等では活用されにくいのが現状である。

また、オリゴヌクレオチドを固定した固相上で標的核酸を検出する方法が開示されている(特許文献1、特許文献2)。ここで言う「固相」とは、ニトロセルロース膜ナイロン膜等のオリゴヌクレオチドを固定可能な膜上にライン状またはスポット状にオリゴヌクレオチドを結合させたいわゆる「ストリップ」のことであり、具体例は、PAS(Printed Array Strip)と称されるものである。核酸クロマトグラフィー原理により、PCRにより調製したDNA産物をこのストリップ上に展開し、ハイブリダイゼーションにより検出が可能となる。この手法では、調製したDNA産物は二本鎖となっていて、そのDNA産物の一つの鎖の末端シングルタグをつけることを特徴としている。しかしながら、PCRにより標的の二本鎖DNA配列を増幅するため、感度反応性)は高いものの、プライマーダイマー等の非特異的な増幅産物が生じやすく精度(正確性)が低いことが問題としてあった。

医療現場等で簡易的に遺伝子解析を行うために、このような簡易的な方法でも検出が可能となる、高精度な核酸試料を提供する方法が必要とされている。

概要

本発明は、臨床現場等での簡易的な検査でも正確な結果を得ることができる高精度な一本鎖DNA調製方法の技術を提供することを目的とする。ライゲーション反応、好ましくはサイクリンクライゲーション反応で増幅させた一本鎖ヌクレオチド産物をPCRやLCR増幅することなく検出試料とすることで、より簡易的かつ迅速な遺伝子解析にも利用可能な高精度な一本鎖DNA産物を得る。

目的

医療現場等で簡易的に遺伝子解析を行うために、このような簡易的な方法でも検出が可能となる、高精度な核酸試料を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

この技術が所属する分野

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請求項1

遺伝子検査に用いる、一本鎖DNAを調製する方法であって、コモンオリゴクエリーオリゴを標的核酸上でハイブリダイゼーションし、ライゲーション反応を行う、一本鎖DNAの調製方法

請求項2

前記反応において、ハイブリダイゼーションおよびライゲーション工程サイクルを2回〜100回繰り返す、請求項1に記載の一本鎖DNAの調製方法。

請求項3

前記反応において、1サイクル中のハイブリダイゼーションが10秒間〜2分間程度、ライゲーションが10秒間〜2分間程度である、請求項2に記載の一本鎖DNAの調製方法。

請求項4

標的DNA領域PCR増幅した後に、PCR増幅された標的DNA産物上でハイブリダイゼーションし、ライゲーション反応を行う、請求項1〜3のいずれか1項に記載の一本鎖DNAの調製方法。

請求項5

前記クエリーオリゴが以下の(a)、(b)を有する、請求項1〜4のいずれか1項に記載の一本鎖DNAの調製方法:(a)前記標的核酸に相補的オリゴヌクレオチドからなる第一の一本鎖オリゴヌクレオチド、および(b)前記第一の一本鎖オリゴヌクレオチドの5'末端側にあるタグ配列または標識部分

請求項6

第一の一本鎖オリゴヌクレオチドの塩基数が10〜60塩基であることを特徴とする、請求項5に記載の一本鎖DNAの調製方法。

請求項7

前記コモンオリゴが以下の(a)、(b)を有する、請求項5または6に記載の一本鎖DNAの調製方法:(a)前記標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドからなる第二の一本鎖オリゴヌクレオチド、および(b)前記第二の一本鎖オリゴヌクレオチドの3'末端側にあるタグ配列または標識部分。

請求項8

前記コモンオリゴの5'末端がリン酸化されていることを特徴とする、請求項7に記載の一本鎖DNAの調製方法。

請求項9

第二の一本鎖オリゴヌクレオチドの塩基数が20〜70塩基であることを特徴とする、請求項7または8に記載の一本鎖DNAの調製方法。

請求項10

第一の一本鎖オリゴヌクレオチドと第二の一本鎖オリゴヌクレオチドがライゲーションした、一本鎖DNA産物の長さが、30〜150塩基であることを特徴とする、請求項7〜9のいずれか1項に記載の一本鎖DNAの調製方法。

請求項11

請求項1〜10のいずれか1項に記載の一本鎖DNAプローブを調製する方法で調製された一本鎖DNAをストリップに用いることを含む遺伝子検査法

請求項12

請求項1〜10のいずれか1項に記載の一本鎖DNAプローブを調製する方法で調製された一本鎖DNAをマイクロアレイに用いることを含む遺伝子検査法。

技術分野

0001

本発明は、遺伝子検査に用いる、一本鎖DNAライゲーション反応、特にサイクリングライゲーション反応(CLR)により増幅する技術に関する。

背景技術

0002

検体塩基配列解析して判定を行う遺伝子検査は、基礎研究医療食品等の分野で広く用いられている。より具体的には、突然変異の検出、遺伝子多型(ヒトや動物では、変化の頻度が1%以上のものを言う)の判定、病原菌の検出、遺伝子組換えの有無の検査等に用いられている。例えば、遺伝子多型判定は、薬の副作用や効果をあらかじめ予測できるとして、医療現場等で活用され始めている。

0003

遺伝子検査は、典型的にはリアルタイムPCR機器を用いたTaqMan法やQP法、DNAマイクロアレイを用いた手法(DigiTag法等)等を使用して行われる。しかしながら、これらの方法はいずれも技術習得、高額な蛍光検出機器を必要とするため、受託解析は行われているものの、医療現場等では活用されにくいのが現状である。

0004

また、オリゴヌクレオチドを固定した固相上で標的核酸を検出する方法が開示されている(特許文献1、特許文献2)。ここで言う「固相」とは、ニトロセルロース膜ナイロン膜等のオリゴヌクレオチドを固定可能な膜上にライン状またはスポット状にオリゴヌクレオチドを結合させたいわゆる「ストリップ」のことであり、具体例は、PAS(Printed Array Strip)と称されるものである。核酸クロマトグラフィー原理により、PCRにより調製したDNA産物をこのストリップ上に展開し、ハイブリダイゼーションにより検出が可能となる。この手法では、調製したDNA産物は二本鎖となっていて、そのDNA産物の一つの鎖の末端シングルタグをつけることを特徴としている。しかしながら、PCRにより標的の二本鎖DNA配列を増幅するため、感度反応性)は高いものの、プライマーダイマー等の非特異的な増幅産物が生じやすく精度(正確性)が低いことが問題としてあった。

0005

医療現場等で簡易的に遺伝子解析を行うために、このような簡易的な方法でも検出が可能となる、高精度な核酸試料を提供する方法が必要とされている。

先行技術

0006

特許5503021号
国際公開第2012/070618号
特許3103806号
特開2006−101844号
特公平6−36760号
特許3330599号

発明が解決しようとする課題

0007

本発明は、臨床現場等でも簡易的かつ正確に検査可能な遺伝子解析を可能とする、一本鎖DNA産物の調製方法の技術を提供することを目的とする。

0008

例えば、従来のストリップでの技術では、標的とするDNAを増幅させて、増幅したDNA産物をストリップ上で「展開」し、ストリップ上のオリゴヌクレオチドとDNA産物がハイブリダイゼーションを起こすことで判定を行うことが出来る。この技術では、標的とするDNAをPCRにより多量に増幅し、そのDNA産物をストリップ上で展開する。したがって、ストリップ上でDNA産物の検出を行うためにはPCRによる増幅が必須とされてきた。しかしながら、PCRにより増幅したDNA産物では、プライマーダイマー等の非特異的なDNA産物が発生することが多々あり、本来検出されないDNAがストリップ上で検出され、誤判定を生じるという問題点があった。

0009

また、ストリップでSNPを検出する場合、PCRに使用するプライマーの3’末端をSNPに対応する塩基に合わせることで、SNPに対応する二本鎖DNAを増幅させる手法が用いられている。しかしながら、SNPのPCRの増幅工程で、プライマーのハイブリダイゼーションが誤って起きることがあり、精度がさらに低くなる問題を生じた。

0010

さらに、ストリップを用いた検出において、一本鎖DNA配列を用いて検出する方法が考えられる。例えば、一本鎖DNAの一方の末端にシングルタグをつけ、もう一方の末端に標識物質をつけるものであり、PCRにより増幅した二本鎖DNA産物を熱変性により、一本鎖DNAに分離することで取得することが考えられる。しかしながら、この方法の場合、PCRにおいて、上記の問題点が発生し、精度が低くなることに加え、DNA産物を熱変性により分離するため、ストリップ上で展開させるときに、分離した一本鎖DNAが二本鎖DNAに一部戻るものがあり、感度がさらに低くなる問題を生じた。

0011

このため、臨床現場等で簡易的かつ高精度に検査可能なDNA検出技術の確立は重要課題の一つである。特に、大掛かりな装置等必要なく、臨床現場等で簡易的かつ高精度に検査可能なストリップを用いた遺伝子検査技術にも使用できる試料の調製が求められている。

0012

本発明者らは、上記課題を解決すべく、検査に用いる試料において二本鎖DNA産物を作製しないことで、プライマーダイマー等の非特異的二本鎖DNA産物を増幅させないことに着目した。そこで、ライゲーション増幅により、誤判定を起こすことの極めて少ない一本鎖DNA産物の調製方法の開発を検討した。

0013

一本鎖DNAを得る技術は従来より存在していた。有名な技術としては、Digitag法(特許文献3、特許文献4)やLCR(特許文献5、特許文献6)と言った技術があげられる。しかしながら、これらの技術では、反応に用いるオリゴヌクレオチドが非特異的に核酸試料に結合してしまい、ストリップ上で偽陽性として誤判定してしまうことがわかった。

0014

一本鎖DNAを得る技術である、Digitag法の工程を説明する。核酸試料の標的となる遺伝子配列をPCRにより増幅させる。熱変性を行い得られたPCR産物を分離させた後、クエリーオリゴコモンオリゴを用いて、ライゲーション反応を行い、一本鎖DNAのライゲーション産物を得る。得られた一本鎖DNAを鋳型として、再度PCRにより増幅させる。得られたPCR産物を熱変性により、一本鎖として、マイクロアレイ上に分注する。マイクロアレイ上のオリゴヌクレオチドプローブと一本鎖DNAがハイブリダイズし、ハイブリダイズした一本鎖DNAから発せられる蛍光を機器によって読み取り、検出を行う。このとき、得られる一本鎖DNAは、緑と赤の2種類蛍光標識のプライマーからなる。これらの蛍光により、緑と赤、そして緑と赤が混ざった黄色となる。このため、Digitag法では、単色の緑や赤の蛍光の検出においては、他方の蛍光標識のDNAがハイブリダイズしていても、微量であるため検出されない。そのため、わずかなダイマーが生成されていても問題とならない。

0015

しかしながら、上記のDigitag法で得られた一本鎖DNAをストリップ上で展開させると、わずかな遺伝子量であってもラインとして反応がでることになり、偽陽性として検出されることがある。そのため、一本鎖DNAを得る技術として優れてはいるが、精度の観点からはストリップで用いることができない。

0016

次に、一本鎖DNAを得る技術である、LCR反応の工程を説明する。核酸試料の標的となる遺伝子配列をPCRにより増幅させる。PCR後、クエリーオリゴとコモンオリゴ、および、クエリーオリゴとコモンオリゴに相補的なCクエリーオリゴとCコモンオリゴとリガーゼ等を混合する。得られたPCR産物を熱変性を行い分離させた後、クエリーオリゴとコモンオリゴを用いて、ライゲーション反応を行い、一本鎖DNAのライゲーション産物を得る。さらに、得られたライゲーション産物と相補的な、CクエリーオリゴとCコモンオリゴにより、相補的なライゲーション産物を得る。得られたライゲーション産物とFクエリーオリゴとFコモンオリゴを用いて、ライゲーション産物を得る。この工程を繰り返し行い、多量の一本鎖DNAを得ることができる。

0017

しかしながら、上記のLCRで得られた一本鎖DNAをストリップ上で展開させると、偽陽性として検出されることがある。これは、大量に一本鎖DNAを生成するために、プローブと鋳型との間でミスマッチハイブリダイゼーションが起こり、偽陽性となりうる意図しない一本鎖DNAとしてライゲーション産物が生成されるためである。また、プローブ同士がミスマッチハイブリダーゼーションしてしまうことでさらなる意図しない一本鎖DNAが生成されてしまう。そのため、一本鎖DNAを得る技術として優れてはいるが、精度の観点からはストリップで用いることができない。

0018

さらに、Digitag法のように、マルチプレックスPCRで増幅する遺伝子の種類が増えた場合は、反応のしやすい遺伝子が優先的に増幅され、反応しにくい遺伝子の増幅効率が悪くなることがあり、本来検出されるべき核酸試料が検出されず、偽陰性として誤判定することもありえる。

課題を解決するための手段

0019

本発明者らは、これらの問題点を解決するため、PCRやLCRと異なり、相補鎖DNAを用いない遺伝子増幅処理に着目し、一本鎖DNAをより簡易的に高精度に取得できる方法を見出し、本発明を完成させた。従来、一本鎖DNAを作製することは、DNAの増幅効率がPCRより悪く、感度が低いという問題点が指摘されていた。しかしながら、この指摘に反し、本技術では、簡易的な検査にも使用可能な一本鎖DNAを取得することを実現している。

0020

本発明はより具体的な態様において、ライゲーションの温度と反応時間、反応のサイクリングを制御することで所望の一本鎖DNAを得ることを可能とする。特に、ハイブリダイズとライゲーションの時間を従来よりも短くしてサイクル数を調整することにより所望の一本鎖DNA産物を高精度に得ることが可能となる。

0021

PCRやLCRのような従来の遺伝子増幅の処理では、所望のDNAと相補的なDNAを同時に調製して指数関数的に遺伝子を増幅させていたが、相補鎖DNAを調製しない一本鎖のライゲーション処理のみで、短時間の反応を繰り返すことで良好な結果が得られることは驚くべきことである。

0022

すなわち、本発明は、以下を提供するものである:
(1)遺伝子検査に用いる、一本鎖DNAを調製する方法であって、
コモンオリゴとクエリーオリゴを標的核酸上でハイブリダイゼーションし、ライゲーション反応を行う、一本鎖DNAの調製方法、
(2)前記反応において、ハイブリダイゼーションおよびライゲーションの工程サイクルを2回〜100回繰り返す、(1)に記載の一本鎖DNAの調製方法、
(3)前記反応において、1サイクル中のハイブリダイゼーションが10秒間〜2分間程度、ライゲーションが10秒間〜2分間程度である、(2)に記載の一本鎖DNAの調製方法、
(4)標的DNA領域をPCRで増幅した後に、PCR増幅された標的DNA産物上でハイブリダイゼーションし、ライゲーション反応を行う、(1)〜(3)のいずれかに記載の一本鎖DNAの調製方法、
(5)前記クエリーオリゴが以下の(a)、(b)を有する、(1)〜(4)のいずれかに記載の一本鎖DNAの調製方法:
(a)前記標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドからなる第一の一本鎖オリゴヌクレオチド、および
(b)前記第一の一本鎖オリゴヌクレオチドの5'末端側にあるタグ配列または標識部分
(6)第一の一本鎖オリゴヌクレオチドの塩基数が10〜60塩基であることを特徴とする、(5)に記載の一本鎖DNAの調製方法、
(7)前記コモンオリゴが以下の(a)、(b)を有する、(5)または(6)に記載の一本鎖DNAの調製方法:
(a)前記標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドからなる第二の一本鎖オリゴヌクレオチド、および
(b)前記第二の一本鎖オリゴヌクレオチドの3'末端側にあるタグ配列または標識部分、
(8)前記コモンオリゴの5'末端がリン酸化されていることを特徴とする、(7)に記載の一本鎖DNAの調製方法、
(9)第二の一本鎖オリゴヌクレオチドの塩基数が20〜70塩基であることを特徴とする、(7)または(8)に記載の一本鎖DNAの調製方法。
(10)第一の一本鎖オリゴヌクレオチドと第二の一本鎖オリゴヌクレオチドがライゲーションした、一本鎖DNA産物の長さが、30〜150塩基であることを特徴とする、(7)〜(9)のいずれかに記載の一本鎖DNAの調製方法。
(11)
(1)〜(10)のいずれかに記載の一本鎖DNAプローブを調製する方法で調製された一本鎖DNAをストリップに用いることを含む遺伝子検査法
(12)(1)〜(10)のいずれかに記載の一本鎖DNAプローブを調製する方法で調製された一本鎖DNAをマイクロアレイに用いることを含む遺伝子検査法。

発明の効果

0023

本発明により、簡易的な遺伝子解析にも使用できる一本鎖DNA産物を得ることが可能となる。

図面の簡単な説明

0024

通常のライゲーション反応およびサイクリングライゲーション反応の温度変化の具体例を示す図である。
本発明の試料の処理(サイクリングライゲーション反応)を示す図である。
ライゲーションチェインリアクション(LCR)の工程を示す図である。
実施例1の試料をPCRで増幅して得られた断片の確認結果を示す図である。
実施例1、4で用いたPASの模式図である。
実施例1の検出結果を示す図である。
実施例2の試料をPCRで増幅して得られた断片の確認結果を示す図である。
実施例2、3で用いたPASの模式図である。
実施例2の検出結果を示す図である。
実施例3の試料をPCRで増幅して得られた断片の確認結果を示す図である。
実施例3の検出結果を示す図である。
実施例4の検出結果を示す図である。
比較例1の試料をPCRで増幅して得られた断片の確認結果を示す図である。
比較例1の検出結果を示す図である。
比較例2の試料をPCRで増幅して得られた断片の確認結果を示す図である。
比較例2の検出結果を示す図である。

0025

本発明は、高精度な一本鎖DNAを取得する技術に関する。所望の一本鎖DNAの取得の確認は、核酸試料の目視による検出可能な状態での、複数の遺伝子多型の解析方法等によって行うことができる。より具体的には、固相担体に結合されたオリゴヌクレオチドプローブに、核酸試料を用いて調製された、タグ配列および標識部分を含む一本鎖DNAのライゲーション産物をハイブリダイズさせることによる標的核酸の検出を行うことによって確認できる。

0026

本発明の一本鎖DNAの調製方法は、あらゆる遺伝子の配列に対して用いることができる。例えば、細菌、ウイルス、植物、ヒトを含む動物、ヒト以外の動物の遺伝子に用いることができる。本発明の方法を応用することにより、例えば、変異、遺伝子多型、突然変異等の遺伝子変異の検出等を行うことができる。より具体的には、本発明の方法は、例えば、HPVデング熱インフルエンザウイルス等の検出および型判定、動植物の種の判定、遺伝子組換え作物の検出、ウイルス薬耐性株遺伝子、薬剤耐性菌遺伝子、一塩基多型(SNP)、マイクロサテライト置換欠損・挿入等の検出に利用可能である。

0027

(核酸試料)
本発明の一本鎖DNAの調製方法に用いられる核酸試料は、ヌクレオチド重合した分子であり、オリゴヌクレオチド、ポリペプチド等を含む。また、あらゆる種類の一本鎖または二本鎖のDNA等を含む。さらに、天然のヌクレオチドのみで形成されたもの、および非天然の塩基、ヌクレオチド、ヌクレオシドを一部に含むもの、あるいは合成核酸も含む。典型的には、核酸試料はDNAである。

0028

また、本発明の方法に用いられる核酸試料は、各種動植物由来の試料、例えば血液、尿、鼻汁唾液組織細胞、種子、植物組織、植物培養物等、および微生物由来の試料を用いて、当業者に周知の方法、例えば抽出等により得ることができる。得られた核酸は処理の前に精製してもよいし、しなくてもよい。また、人工的に合成して得ることもできる。好ましくは、核酸試料は、後述のライゲーション処理の前にPCRにより増幅される。この場合、PCRに用いられるプライマーは、対象となる試料に応じて、当業者が適宜選択、設計、調製できる。

0029

核酸試料の特定の部位をPCRにより増幅させることは、必ずしも必要な工程ではないが、後述のライゲーション処理において、より高い精度で増幅産物を得ることができる。

0030

PCRは、複数の遺伝子を同時に増幅させることができるマルチプレックスPCRが可能となる。増幅できる遺伝子数は2〜15である。好ましくは、3〜10であり、さらに好ましくは、4〜8である。遺伝子数が16を超えて、PCRを行うと、ダイマーが多く生成してしまい、精度が低くなり、現場等で簡易に使用できなくなる。

0031

PCRのTm値は、60〜80℃が好ましい。さらに好ましくは、65〜75℃である。比較的高温に設定することで、核酸試料とプライマーのアニーリングが特異的になり、マルチプレックスPCRのミスマッチが軽減される。

0032

(クエリーオリゴおよびコモンオリゴ)
本発明の一本鎖DNAの調製方法は、クエリーオリゴおよびコモンオリゴを調製することを含む。

0033

本明細書におけるクエリーオリゴとは、核酸試料に相補的な第一の一本鎖オリゴヌクレオチドおよび任意に検出プローブとハイブリダイズ可能なタグ配列、または任意に標識部分を含むものをいう。本発明において、クエリーオリゴはタグ配列または標識部分を含む。典型的には、第一の一本鎖オリゴヌクレオチドの5’末端側にタグ配列または標識部分が結合している。タグ配列と第一の一本鎖オリゴヌクレオチドとの間に、スペーサー配列が結合されていてもよいし、タグ配列と第一の一本鎖オリゴヌクレオチドがスペーサー配列なしに直接結合していてもよい。

0034

本明細書におけるコモンオリゴとは、核酸試料に相補的であって、第一の一本鎖オリゴヌクレオチドに隣接する第二の一本鎖オリゴヌクレオチド、および任意に標識部分、または任意に検出プローブとハイブリダイズ可能なタグ配列を含むものをいう。本発明の一実施形態において、コモンオリゴは標識部分またはタグ配列を含む。典型的には、第二の一本鎖オリゴヌクレオチドの3’末端側に標識部分またはタグ配列が結合している。また、第二の一本鎖オリゴヌクレオチドの5’末端に、リン酸を付加してもよいし、しなくてもよい。ただし、リン酸を付加しない場合は、後述のライゲーション反応前に5’末端へのリン酸付加を行う工程を入れることができる。

0035

本発明の好ましい実施形態において、クエリーオリゴがタグ配列を含み、コモンオリゴが標識部分を含む。また他の好ましい実施形態において、クエリーオリゴが標識部分を含み、コモンオリゴがタグ配列を含む。さらに他の好ましい実施形態において、クエリーオリゴがタグ配列を含み、コモンオリゴがタグ配列を含む 。

0036

標識部分は、検出プローブとハイブリダイズした一本鎖オリゴヌクレオチドを検出できるものであれば特に限定されない。例えば、フルオレセインテキサスレッドローダミンおよび緑色蛍光タンパク質などの蛍光物質ルミノールアクリジニウム誘導体などの発光物質;3H、125I、35S、14Cおよび32Pなどの放射性物質磁気ビーズなどの磁性物質ペルオキシダーゼアルカリフォスファターゼβ−グルクロニダーゼ、β−D−グルコシダーゼ、β−D−ガラクトシダーゼなどの酵素顔料および染料などの色素ビオチンアビジンおよびストレプトアビジンなどの親和性標識などが挙げられる。本発明の方法は目視による検査に使用できるものであり、蛍光物質、発光物質、色素などの標識部分を用いることが好ましい。また、標識部分をビオチンとし、着色したビーズ等を結合させたアビジンまたはストレプトアビジンを該ビオチンに結合させることで検出を行うことも好ましい。また、標識部分を抗体および/またはハプテンとし、そこに標識物質として蛍光、放射能磁性、酵素、燐光化学発光および着色からなる群から選択される1種または2種以上を結合させて検出を実現してもよい。ハプテンとは、単独で抗体と結合するが、それ自体は免疫応答を起こす能力のない物質をいい、例えば、ビオチン、ジゴキシゲニン、およびFITCなどが含まれる。

0037

第一の一本鎖オリゴヌクレオチド、第二の一本鎖オリゴヌクレオチドの長さは、対象となる試料に応じて当業者が適宜設定できる。例えば、第一の一本鎖オリゴヌクレオチドは10〜60塩基、第二の一本鎖オリゴヌクレオチドは20〜70塩基である。好ましくは、第一の一本鎖オリゴヌクレオチドは12〜40塩基、第二の一本鎖オリゴヌクレオチドは20〜50塩基である。

0038

本発明の方法を遺伝子変異の検出に用いる場合、変異部分がクエリーオリゴ、コモンオリゴのいずれに含まれていてもよい。好ましくは、変異部分はクエリーオリゴに含まれる。より好ましくは、変異部分はクエリーオリゴの3’末端に位置する。

0039

クエリーオリゴおよびコモンオリゴの好ましい濃度は、対象となる試料、検出の標的とする配列等に応じて当業者が適宜調整できる。好ましい濃度の例としては、終濃度でコモンオリゴが100nM〜5μM、クエリーオリゴが1μM〜10μM等である。

0040

(ライゲーション)
上記クエリーオリゴおよびコモンオリゴを、核酸試料を鋳型とするライゲーション反応に供することで所望の一本鎖DNA産物を得ることができる。本明細書にいうライゲーションとは、対応する核酸試料に結合したクエリーオリゴとコモンオリゴを連結する工程である。核酸試料に結合したクエリーオリゴとコモンオリゴは互いに隣接し合った状態になっているので、リガーゼ等を作用させてライゲーション反応を行うことにより、連結部を介してクエリーオリゴとコモンオリゴを連結させることができる。この際のライゲーション反応は複数の遺伝子を同時に増幅させることができるマルチプレックス反応が可能である。増幅できる遺伝子数は2〜15である。好ましくは、3〜10であり、さらに好ましくは、4〜8である。

0041

オリゴ同士の連結に使用し得る好適な試薬には、サーマスアクティカス(Thermus aquaticus)のTaqDNA Ligaseが含まれるが、これに限定されない。また、酵素的な手法に変えて、化学的な手法で両プローブ群を連結してもよい。

0042

より具体的には、図1右に示すように、核酸試料とクエリーオリゴ、コモンオリゴを結合させた後、90℃以上の高温(例えば90〜100℃)で数分間、次いで50℃程度の温度(例えば、40〜60℃)で数十分間反応させることでクエリーオリゴとコモンオリゴを連結させることで、一本鎖DNA産物を得ることができる。より具体的には、ライゲーション処理は、90℃以上の高温で数分間、次いで50℃程度の温度で10〜20分間、さらに90℃以上の高温で数分間置いた後、40℃程度に下げることで実施できる。さらに好ましくは後述のサイクリングライゲーション反応を行うことでより精度を高めることができる。

0043

(サイクリングライゲーション反応)
多量のライゲーション産物を得るためにLCRを用いると、上述の通り、検査精度の問題がある。そこで本発明者らはクエリーオリゴおよびコモンオリゴの相補鎖を加えることなく、90℃以上の熱処理と50℃程度のライゲーション反応を組合せることで、さらに高精度な一本鎖DNA産物を得ることを可能とした。この温度調整方法は、単純なライゲーション反応とは異なり、また、クエリーオリゴおよびコモンオリゴの相補鎖を入れないことからLCRとも異なった新しいライゲーション方法である。本発明者らは熱処理とライゲーション反応を組み合わせたこの温度調節方法をサイクリングライゲーション反応(CLR:Cycling Ligation Reaction)と命名した(図1左)。本明細書において、この反応を「サイクリングライゲーション反応」と称する。

0044

より具体的には、クエリーオリゴとコモンオリゴを核酸試料にハイブリダイズさせるライゲーションにおいて、ハイブリダイズとライゲーションの時間を10〜30秒程度の短時間に設定し、温度を比較的高い温度に設定する。その反応後、急速に高温にして、二本鎖となっていた核酸試料とDNA産物を乖離させ、再度温度を下げ、ライゲーションの反応を行う、といった工程を20回以上のサイクルで行う。この反応は、1.急激に温度を上げる、2.短時間で高温処理を行う、3.急激に温度を下げる、4.短時間でライゲーション反応を行う、これら4つの工程を短時間で繰返し行うことを特徴とする。このサイクリングライゲーション反応により、短時間で正確に標的とする一本鎖DNAだけを増幅させることができ、より高精度の一本鎖DNA産物を得ることができる。

0045

サイクリングライゲーション反応では、90℃以上の高温(例えば90〜100℃)と、50℃程度の温度(例えば、40〜60℃)を繰り返す(例えば、90℃15秒間および58℃30秒間を30サイクル)。好ましいサイクリングライゲーション反応のサイクル数は、例えば10回以上、20回以上、または30回以上である。サイクル数の下限、上限は特に限定されないが、下限は例えば2回以上、3回以上、4回以上、5回以上など、上限は例えば100回以下、90回以下、80回以下、70回以下、60回以下、50回以下、40回以下などが挙げられる。1サイクルの時間も特に限定されないが、下限は例えば10秒間以上、20秒間以上、30秒間以上など、上限は10分間以下、5分間以下、3分間以下、2分間以下、1分間以下などが挙げられる。ハイブリダイズとライゲーションの時間は同じであっても異なっていてもよく、調製する試料等に応じて適宜設定できる。各々の時間の上限、下限は特に限定されないが、下限は例えば10秒間以上、15秒間以上、30秒間以上、40秒間以上、50秒間以上などが挙げられ、上限は例えば5分間以下、3分間以下、2分間以下、1分間以下、50秒間以下、40秒間以下、30秒間以下などが挙げられる。

0046

従来のような、増幅した二本鎖DNAを検出に供する方法では、一本鎖のタグ配列と試料の間にスペーサー配列を使用する必要があるが、本発明の方法で得られる一本鎖DNA産物は、PCR増幅せずにハイブリダイゼーション処理に供することが可能であるため、スペーサー配列は必要なく、簡便かつ短時間の遺伝子解析を可能にする。

0047

ライゲーション処理を行うときに、核酸試料と同時に生成できるポジティブコントロールを用意することが好ましい。ポジティブコントロールとしては、G3PDH遺伝子等があげられる。検出をサンプルとポジティブコントロールの遺伝子産物で同時に行うことで、ライゲーション処理のミスか、該当のサンプルが含まれていないか判別できる。

0048

ライゲーション処理に用いられる限り、いかなるリガーゼを用いてもよい。好ましいリガーゼの例は、TaqDNAリガーゼである。

0049

検出用キット
本発明は他の態様において、本発明の一本鎖DNA産物の調製方法に用いることが可能なキットに関する。

0050

一の実施形態において本発明のキットは、検出プローブを備えた固相担体、検出プローブとハイブリダイズ可能なタグ配列および第一の一本鎖オリゴヌクレオチドを含むクエリーオリゴ、ならびに第二の一本鎖オリゴヌクレオチドおよび標識部分を含むコモンオリゴを含む。他の実施形態において、本発明のキットは、検出プローブを備えた固相担体、標識部分および第一の一本鎖オリゴヌクレオチドを含むクエリーオリゴ、ならびに第二の一本鎖オリゴヌクレオチドおよび検出プローブとハイブリダイズ可能なタグ配列を含むコモンオリゴを含む。さらに他の実施形態において、本発明のキットは、検出プローブを備えた固相担体、検出プローブとハイブリダイズ可能なタグ配列および第一の一本鎖オリゴヌクレオチドを含むクエリーオリゴ、ならびに第二の一本鎖オリゴヌクレオチドおよび標識プローブとハイブリダイズ可能なタグ配列を含むコモンオリゴを含む。好ましくは、本発明のキットは、さらにリガーゼを含む。

0051

また、本明細書にいう標識プローブとは、典型的に一本鎖DNA産物の両末端がタグ配列を有するときに、検出プローブとハイブリダイズしないタグ配列とハイブリダイズする、標識部分を有するオリゴヌクレオチドプローブのことである。

0052

以下、一本鎖DNA産物の態様は、コモンオリゴが標識部分を有するものとして、説明を行うが、例示の目的であり必ずしもこの態様に限定されるものではない。

0053

本発明のキットは、あらゆる遺伝子の配列の解析に用いることができる。例えば、細菌、ウイルス、植物、ヒトを含む動物、ヒト以外の動物の遺伝子解析に用いることができ、例えば、変異、遺伝子多型、突然変異等の遺伝子変異の検出等に用いることができる。より具体的には、例えば、HPV、デング熱、インフルエンザウイルス等の検出および型判定、動植物の種の判定、遺伝子組換え作物の検出、ハラール認証の検査、ウイルス薬剤耐性株遺伝子、薬剤耐性菌遺伝子、一塩基多型(SNP)、マイクロサテライト、置換・欠損・挿入等の検出に用いられる。例えば、本発明のキットは、遺伝子多型の検出や、ウシブタなどの食品偽装鑑定ウイルス感染簡易検査に用いられる。

0054

本願発明の方法で得られた一本鎖DNA産物の検出)
本発明の方法で得られた一本鎖DNA産物は、簡易的な遺伝子解析方法にも利用できる高精度なものである。このため、本発明の方法は、ストリップを用いるような簡易的な遺伝子解析方法のみならず、例えばマイクロアレイでの検出等を含む、遺伝子解析方法一般に応用できる。以下に、本発明の産物の確認、検出および利用の具体例を説明するが、本発明が必ずしもこれらに限定されるというものではない。

0055

例えば、本発明の方法で得られた一本鎖DNA産物は、検出プローブが固定された固相担体に供して検出することで確認できる。例えば、ストリップなどのクロマトグラフィー本体を用いる場合、一本鎖DNA産物を展開液に加え、必要に応じてバッファー、発色液等を加えて混合し、クロマトグラフィーによってハイブリダイゼーション反応を行う。本発明の方法で得られた一本鎖DNA産物は、遺伝子解析の結果が目視で検出可能な状態となるような簡易的な検査にも利用できる。

0056

ここでいう「目視で検出可能な状態」とは、目視で検出する態様を当然に含むが、実際に目視で検出を行うことを必要とするものではなく、例えばリーダー等の機械に読み取らせる態様も含む。また、追加の操作、例えば光の照射、を行うことで目視検査が可能となるような状態も含まれる。

0057

上述の固相担体は、典型的にはオリゴヌクレオチドプローブが固定されたものである。より具体的な例として、固相担体は膜上にオリゴヌクレオチドプローブを結合させたアレイである「DNAマイクロアレイ」や「ストリップ」である。例えば、固相担体は、異なる位置に複数のプローブが固定されたプローブ領域を有する。また、プローブ領域とは別の位置に、位置マーカー領域を有するものも挙げられる。本明細書において、固相担体に固定されたオリゴヌクレオチドプローブを、検出プローブとも称する。

0058

さらに具体的な固相担体の例は、展開溶媒を移動可能なクロマトグラフィー本体である。例えば、ガラスまたはプラスチック等の基板上に、シリカ膜物質等が塗布または接着等で固定されたものや、紙片ニトロセルロース等の膜物質を固定したもの等が挙げられる。このようなストリップの市販品の例は、PAS(TBA社製)である。

0059

本発明の方法は、様々な用途に用いられる。具体的な用途の例として、これらに限定されないが、医療現場における遺伝病遺伝子診断病原体の型の判別、税関における検疫食品工場食品販売店における食肉や植物の品種の検査、遺伝子組換え原料使用有無の判定等が挙げられる。以下に具体例を説明するが、本発明が必ずしもこれらに限定されるというものではない。

0060

例えば、ヒトの遺伝子検査について、ヒトの血液から遺伝子を抽出して本発明の方法を利用することで、容易に検査をすることができる。遺伝子としては、例えばシトクローム遺伝子があげられ、薬の代謝能力を知ることができる。例えば、体内ニコチンの代謝のしやすさ、イリノテカンタモキシフェンのような抗がん剤の副作用や薬の効果等を知ることができる。

0061

例えば、動物の遺伝子検査について、例えば各種動物のミトコンドリアの遺伝子に本発明の方法を用いることで、その種判別を行うことができる。そのため、動物が生きている状態で血液等を採血する必要は特に無く、食品用の食肉であっても遺伝子を取得することができる。他にも、加工品スープの原料等でも良い。動物としては、ウシやブタ、トリに限らず、ヒツジヤギ等であっても良い。

0062

また例えば、病原菌やウイルス等の検査について、例えば、感染者より直接採取した試料に本発明の方法を利用することで、容易に検査をすることができる。病原菌やウイルスに特に制限は無く、また、病原菌やウイルスの感染の有無だけではなく、型判別を行うこともできる。

0063

上記の検査は、特殊な装置を特に必要とすることはなく、卓上用の装置があれば可能となるものである。病院などの臨床現場での利用、食品工場での工程の検査、税関等での偽装食品混入の検査、動物の親子鑑定農作物の品種鑑定等、多くの場面でその利用が想定できる。

0064

以下に本発明を実施例を用いて詳細に説明するが、実施例は例示の目的であり、本願発明が必ずしも実施例に限定されるものではない。

0065

実施例1
本発明の一本鎖DNA産物の調製方法、およびその確認を次の手順で行った。以下、これらの順序に従って説明する。ライゲーション反応までの手順を図2に示す。
1.プライマーの調製
2.標的遺伝子の増幅
3.ライゲーション用プローブの調製
4.サイクリングライゲーション反応
5.クロマトグラフィー本体(PAS:Printed Array Strip)を用いた検出
また、ヒト由来ゲノムDNA(A、B、C、D、E、F、G)を実験供試した。

0066

1.プライマーの調製
ヒトゲノム中のCYP2D6遺伝子に特異的な以下の表1に示すプライマーC09、C10、C12、C14およびポジティブコントロールとしてG3PDH遺伝子に特異的なプライマーコントロール(ユーロフィンジェノミクス社製)を準備した。これらプライマーは通常のオリゴヌクレオチド合成方法に準じて合成され、100μMの濃度に調整された。C09プライマーはCYP2D6遺伝子の遺伝子多型であるrs1135840(GがCに変異)、C10プライマーは同遺伝子の遺伝子多型であるrs5030865(GがAに変異)、C12プライマーは同遺伝子の遺伝子多型であるrs16947(CがTに変異)、C14プライマーは同遺伝子多型であるrs1065852(CがTに変異)を含む遺伝子領域を増幅するように設計した。なお、図面ではrs1135840を4180G>C、rs5030865を1758G>A、rs16947を2850C>T、rs1065852を100C>Tと記載している。

0067

0068

2.標的遺伝子の増幅
2−1.反応液調製
標的遺伝子の増幅に使用したゲノムDNAはヒト由来のものを用いた。ゲノムDNAを表1のプライマーを用いて以下のように増幅した。なお、サンプル増幅用試薬として、KAPABIOSYSTEMS社のKAPA2GFAST Multiplexを使用した。サーマルサイクラーとして、eppendorf社のMastercycler(登録商標) gradientを使用した。表2に示す試薬を個々のサンプルごとに調製した。

0069

0070

2−2.PCR反応
調製したサンプル溶液PCRチューブに移し、サーマルサイクル反応(95℃で3分後、95℃で15秒、60℃で30秒、72℃で1分を30サイクル、その後72℃で5分、最後に4℃に下げる)を行った。そして、増幅したサンプルはAgilent Technologies社のバイオアナライザを用いて電気泳動し、目的とするサイズの増幅産物が得られたことを確認した。結果を図4に示す。

0071

3.ライゲーション用プローブの調製
3−1.ライゲーション用のプローブの調製
2.で得た増幅サンプルに結合させるライゲーション用プローブ(コモンオリゴはユーロフィンジェノミクス社製、クエリーオリゴはTBA社製)を準備した。プローブの塩基配列を表3に示す。ライゲーション用プローブは各遺伝子多型にコモンオリゴ1種類、クエリーオリゴ2種類を作成した。クエリーオリゴは遺伝子変異が生じていない野生型に結合するもの(WTと標記)と遺伝子変異が生じている変異型に結合するもの(MTと標記)からなる。コモンオリゴの5’末端にはリン酸基[P]が修飾されており、3’末端にはビオチン[Biotin]が標識されている。クエリーオリゴの5’末端にはクロマトグラフィー本体(PAS)に固定化されたオリゴDNAと相補的なタグ配列が付加されている(配列情報非開示)。また、クエリーオリゴとタグ配列の間にはSpacer C3が挿入されている。クロマトグラフィー本体に固定化されたオリゴDNAの位置は図5に記載した。なお、本実施例ではTBA社が販売するクロマトグラフィー本体のE12シリーズを使用した。

0072

0073

4.サイクリングライゲーション反応
4−1.反応液調製
ライゲーション反応における組成は表4のとおりとした。なお、ライゲーションを行うための酵素として、NEW ENGLAND BioLabs社のTaq DNA Ligaseを使用した。

0074

0075

4−2.ライゲーション反応
ライゲーション溶液をPCRチューブに移し、サーマルサイクラーにセットした。温度条件は、95℃で1分後、58℃で5分、その後、95℃で15秒、58℃で30秒を30サイクル、その後95℃で1分加熱し、37℃に温度を下げ反応を終了した。

0076

5.クロマトグラフィー本体を用いた検出
5−1.ハイブリダイゼーション反応
4.で得られた一本鎖DNAを用いての核酸クロマトグラフィーによるハイブリダイゼーション反応およびその検出を行った。

0077

5−2.反応液調製
ハイブリダイゼーション反応および検出は、展開液(TBA社製)、ラテックス液(TBA社製)、TEバッファーおよびライゲーション産物を混合して調製した反応液を用いて実施した。反応液の組成を表5に示す。

0078

0079

5−3.ハイブリダイゼーション工程
上記反応液各20μLを1.5mLチューブに加え、クロマトグラフィー本体の各下端部を差込んでクロマトグラフィーによるハイブリダイゼーション反応を行った。ハイブリダイゼーション反応は37℃で行った。反応液は約20分間ですべて吸い上がり、すべて吸いあがった段階でクロマトグラフィーによるハイブリダイゼーション反応を完了とした。反応終了後、クロマトグラフィー本体を風乾させ、目視による反応箇所の確認および画像を撮影した。

0080

5−4.検出工程
クロマトグラフィー本体の乾燥後の発色の有無を目視で確認した。図6に示すように、既知の遺伝子多型とクロマトグラフィー本体による遺伝子多型解析結果がすべて一致した。サイクリングライゲーション反応によりクロマトグラフィー本体上のラインがしっかりと目視できるようになった。これらのことから、本発明の方法が簡便な遺伝子多型の判定法に利用できることが示された。

0081

実施例2
本発明の方法が、ヒトの遺伝子の遺伝子多型だけでなく、動物種判定法にも利用できることを示すため、下記の手順で一本鎖DNA産物の調製および検出を行った。
1.プライマーの調製
2.標的遺伝子の増幅
3.ライゲーション用プローブの調製
4.サイクリングライゲーション反応
5.クロマトグラフィー本体(PAS:Printed Array Strip)を用いた検出
また、ヒト由来のゲノムDNA、ウシ由来のゲノムDNA、ブタ由来のゲノムDNA、ニワトリ由来のゲノムDNA、ウシとブタとニワトリ由来のDNAを1:1:1で混合したDNAを実験に供試した。

0082

1.プライマーの調製
ヒト、ウシ、ブタ、ニワトリのゲノム中のミトコンドリアDNAの中から、これら4種に共通のDNA配列を見つけ出し、表6に示すプライマー(ユーロフィンジェノミクス社製)を準備した。これらプライマーは通常のオリゴヌクレオチド合成方法に準じて合成され、100μMの濃度に調整された。

0083

0084

2.標的遺伝子の増幅
2−1.反応液調製
標的遺伝子の増幅に使用したゲノムDNAはヒト、ウシ、ブタ、ニワトリ由来のものを用いた。ゲノムDNAを表6のプライマーを用いて以下のように増幅した。なお、サンプル増幅用試薬として、KAPABIOSYSTEMS社のKAPA2GFAST Multiplexを使用した。サーマルサイクラーとして、eppendorf社のMastercycler(登録商標) gradientを使用した。表7に示す試薬を個々のサンプルごとに調製した。

0085

0086

2−2.PCR反応
調製したサンプル溶液をPCRチューブに移し、サーマルサイクル反応(95℃で3分後、95℃で15秒、57℃で30秒、72℃で1分を30サイクル、その後72℃で5分、最後に4℃に下げる)を行った。そして、増幅したサンプルはAgilent Technologies社のバイオアナライザを用いて電気泳動し、目的とするサイズの増幅産物が得られたことを確認した。結果を図7に示す。

0087

3.ライゲーション用プローブの調製
3−1.ライゲーション用のプローブの調製
2.で得た増幅サンプルに結合させるライゲーション用プローブ(コモンオリゴはユーロフィンジェノミクス社製、クエリーオリゴはTBA社製)を準備した。プローブの塩基配列を表8に示す。ライゲーション用プローブは各動物種にコモンオリゴ1種類、クエリーオリゴ1種類を作成した。また、ポジティブコントロール用として、ヒト、ウシ、ブタ、ニワトリに共通のコモンオリゴ、クエリーオリゴを作成した。コモンオリゴの5’末端にはリン酸基[P]が修飾されており、3’末端にはビオチン[Biotin]が標識されている。クエリーオリゴの5’末端にはクロマトグラフィー本体(PAS)に固定化されたオリゴDNAと相補的なタグ配列が付加されている(配列情報非開示)。また、本実施例ではクエリーオリゴとタグ配列の間にはSpacer C3は挿入されていない。クロマトグラフィー本体に固定化されたオリゴDNAの位置は図8に記載した。なお、本実施例ではTBA社が販売するクロマトグラフィー本体のF12シリーズを使用した。実施例1で使用したE12シリーズとは固定化されたオリゴDNAの位置が多少異なっている。

0088

0089

4.サイクリングライゲーション反応
4−1.反応液調製
ライゲーション反応における組成は表9のとおりとした。なお、ライゲーションを行うための酵素として、NEW ENGLAND BioLabs社のTaq DNA Ligaseを使用した。

0090

0091

4−2.ライゲーション反応
ライゲーション溶液をPCRチューブに移し、サーマルサイクラーにセットした。温度条件は、95℃で1分後、58℃で5分、その後、95℃で15秒、58℃で30秒を30サイクル、その後95℃で1分加熱し、37℃に温度を下げ反応を終了した。

0092

5.クロマトグラフィー本体を用いた検出
5−1.ハイブリダイゼーション反応
4.で得られた一本鎖DNAを用いての核酸クロマトグラフィーによるハイブリダイゼーション反応およびその検出を行った。

0093

5−2.反応液調製
ハイブリダイゼーション反応および検出は、展開液(TBA社製)、ラテックス液(TBA社製)、TEバッファーおよびライゲーション産物を混合して調製した反応液を使用して実施した。反応液の組成を表10に示す。

0094

0095

5−3.ハイブリダイゼーション工程
上記反応液各20μLを1.5mLチューブに加え、クロマトグラフィー本体の各下端部を差込んでクロマトグラフィーによるハイブリダイゼーション反応を行った。ハイブリダイゼーション反応は37℃で行った。反応液は約20分間ですべて吸い上がり、すべて吸いあがった段階でクロマトグラフィーによるハイブリダイゼーション反応を完了とした。反応終了後、クロマトグラフィー本体を風乾させ、目視による反応箇所の確認および画像を撮影した。

0096

5−4.検出工程
クロマトグラフィー本体の乾燥後の発色の有無を目視で確認した。図9に示すように、本手法によりクロマトグラフィー本体による各動物種判定が可能であった。このことから、本発明の方法が簡便な動物種判定にも利用できることが示された。

0097

実施例3
本発明の方法が、ヒトの遺伝子の遺伝子多型だけでなく、ウイルス等の型判定法にも利用できることを示すため、下記の手順で実験を行った。検出対象ヒトパピローマウイルスの16型および18型とした。
1.プライマーの調製
2.標的遺伝子の増幅
3.ライゲーション用プローブの調製
4.サイクリングライゲーション反応
5.クロマトグラフィー本体(PAS:Printed Array Strip)を用いた検出
また、実験材料として、HPV16の遺伝子断片およびHPV18の遺伝子断片を導入したプラスミド、および、HPV16に感染していることが既知の臨床検体1サンプルを用いた。

0098

1.プライマーの調製
表11に示すHPVの16型および18型に特異的なプライマーおよびポジティブコントロールとしてヒトのG3PDH遺伝子に特異的なプライマー(ユーロフィンジェノミクス社製)を準備した。これらプライマーは通常のオリゴヌクレオチド合成方法に準じて合成され、100μMの濃度に調整された。

0099

0100

2.標的遺伝子の増幅
2−1.反応液調製
標的遺伝子の増幅に使用したDNAはHPVの16型由来のDNA配列が含まれるプラスミドおよび18型由来のDNA配列が含まれるプラスミドを用いた。これらプラスミドには表11で示したHPV16およびHPV18のプライマー配列が含まれている。また、HPV型判定の性能を評価するために、HPV16の感染が既知のヒトゲノムDNAを実験に用いた。これらDNAを表11のプライマーを用いて以下のように増幅した。なお、サンプル増幅用試薬として、KAPABIOSYSTEMS社のKAPA2GFAST Multiplexを使用した。サーマルサイクラーとして、eppendorf社のMastercycler(登録商標) gradientを使用した。表12に示す試薬を個々のサンプルごとに調製した。

0101

0102

2−2.PCR反応
調製したサンプル溶液をPCRチューブに移し、サーマルサイクル反応(95℃で3分後、95℃で15秒、57℃で30秒、72℃で1分を30サイクル、その後72℃で5分、最後に4℃に下げる)を行った。そして、増幅したサンプルはAgilent Technologies社のバイオアナライザを用いて電気泳動し、目的とするサイズの増幅産物が得られたことを確認した。結果を図10に示す。

0103

3.ライゲーション用プローブの調製
3−1.ライゲーション用のプローブの調製
2.で得た増幅サンプルに結合させるライゲーション用プローブ(コモンオリゴはユーロフィンジェノミクス社製、クエリーオリゴはTBA社製)を準備した。プローブの塩基配列を表13に示す。ライゲーション用プローブはHPV16、HPV18およびポジティブコントロールのヒトG3PDH遺伝子にそれぞれコモンオリゴ1種類、クエリーオリゴ1種類を作成した。コモンオリゴの5’末端にはリン酸基[P]が修飾されており、3’末端にはビオチン[Biotin]が標識されている。クエリーオリゴの5’末端にはクロマトグラフィー本体(PAS)に固定化されたオリゴDNAと相補的なタグ配列が付加されている(配列情報非開示)。また、本実施例ではクエリーオリゴとタグ配列の間にはSpacer C3は挿入されていない。クロマトグラフィー本体に固定化されたオリゴDNAの位置は図8に記載した。なお、本実施例ではTBA社が販売するクロマトグラフィー本体のF12シリーズを使用した。実施例1で使用したE12シリーズとは固定化されたオリゴDNAの位置が多少異なっている。

0104

0105

4.サイクリングライゲーション反応
4−1.反応液調製
ライゲーション反応における組成は表14のとおりとした。なお、ライゲーションを行うための酵素として、NEW ENGLAND BioLabs社のTaq DNA Ligaseを使用した。

0106

0107

4−2.ライゲーション反応
ライゲーション溶液をPCRチューブに移し、サーマルサイクラーにセットした。温度条件は、95℃で1分後、58℃で5分、その後、95℃で15秒、58℃で30秒を30サイクル、その後95℃で1分加熱し、37℃に温度を下げ反応を終了した。

0108

5.クロマトグラフィー本体を用いた検出
5−1.ハイブリダイゼーション反応
4.で得られた一本鎖DNAを用いての核酸クロマトグラフィーによるハイブリダイゼーション反応およびその検出を行った。

0109

5−2.反応液調製
ハイブリダイゼーション反応および検出は、展開液(TBA社製)、ラテックス液(TBA社製)、TEバッファーおよびライゲーション産物を混合して調製した反応液を使用して実施した。反応液の組成を表15に示す。

0110

0111

5−3.ハイブリダイゼーション工程
上記反応液各20μLを1.5mLチューブに加え、クロマトグラフィー本体の各下端部を差込んでクロマトグラフィーによるハイブリダイゼーション反応を行った。ハイブリダイゼーション反応は37℃で行った。反応液は約20分間ですべて吸い上がり、すべて吸いあがった段階でクロマトグラフィーによるハイブリダイゼーション反応を完了とした。反応終了後、クロマトグラフィー本体を風乾させ、目視による反応箇所の確認および画像を撮影した。

0112

5−4.検出工程
クロマトグラフィー本体の乾燥後の発色の有無を目視で確認した。図11に示すように、本手法によりクロマトグラフィー本体によるHPVの16型、18型判定が可能であった。このことから、本手法が簡便なHPV型判定手法として有効であることを示した。

0113

実施例5
クエリータグスペーサーの有無が検査の結果に影響を与えるかを調べるため、次の手順で実験を行った。以下、これらの順序に従って説明する。
1.プライマーの調製
2.標的遺伝子の増幅
3.ライゲーション用プローブの調製(スペーサー無し)
4.サイクリングライゲーション反応
5.クロマトグラフィー本体(PAS:Printed Array Strip)用いた検出
また、ヒト由来のゲノムDNA 3サンプル(A12、B12、C12)を実験に供試した。

0114

1.プライマーの調製
ヒトゲノム中のCYP2D6遺伝子に特異的な以下の表16に示すプライマーC09、C10、C12、C14およびポジティブコントロールとしてG3PDH遺伝子に特異的なプライマーコントロール(ユーロフィンジェノミクス社製)を準備した。これらプライマーは通常のオリゴヌクレオチド合成方法に準じて合成され、100μMの濃度に調整された。C09プライマーはCYP2D6遺伝子の遺伝子多型であるrs1135840(GがCに変異)、C12プライマーは同遺伝子の遺伝子多型であるrs16947(CがTに変異)、C14プライマーは同遺伝子多型であるrs1065852(CがTに変異)を含む遺伝子領域を増幅するように設計した。なお、実施例の図ではrs1135840を4180G>C、rs16947を2850C>T、rs1065852を100C>Tと記載している。

0115

0116

2.標的遺伝子の増幅
2−1.反応液調製
標的遺伝子の増幅に使用したゲノムDNAはヒト由来のものを用いた。ゲノムDNAを表16のプライマーを用いて以下のように増幅した。なお、サンプル増幅用試薬として、KAPABIOSYSTEMS社のKAPA2GFAST Multiplexを使用した。サーマルサイクラーとして、eppendorf社のMastercycler(登録商標) gradientを使用した。表17に示す試薬を個々のサンプルごとに調製した。

0117

0118

2−2.PCR反応
調製したサンプル溶液をPCRチューブに移し、サーマルサイクル反応(95℃で3分後、95℃で15秒、60℃で30秒、72℃で1分を30サイクル、その後72℃で5分、最後に4℃に下げる)を行った。

0119

3.ライゲーション用プローブの調製
3−1.ライゲーション用のプローブの調製
2.で得た増幅サンプルに結合させるライゲーション用プローブ(コモンオリゴはユーロフィンジェノミクス社製、クエリーオリゴはTBA社製)を準備した。プローブの塩基配列を表18に示す。ライゲーション用プローブは各遺伝子多型にコモンオリゴ1種類、クエリーオリゴ2種類を作成した。クエリーオリゴは遺伝子変異が生じていない野生型に結合するもの(WTと標記)と遺伝子変異が生じている変異型に結合するもの(MTと標記)からなる。コモンオリゴの5’末端にはリン酸基[P]が修飾されており、3’末端にはビオチン[Biotin]が標識されている。クエリーオリゴの5’末端にはクロマトグラフィー本体(PAS)に固定化されたオリゴDNAと相補的なタグ配列が付加されている(配列情報非開示)。クエリーオリゴとタグ配列の間にはSpacer C3は挿入されていない。クロマトグラフィー本体に固定化されたオリゴDNAの位置は図5に記載した。なお、本実施例ではTBA社が販売するクロマトグラフィー本体のE12シリーズを使用した。

0120

0121

4.サイクリングライゲーション反応
4−1.反応液調製
ライゲーション反応における組成は表19のとおりとした。なお、ライゲーションを行うための酵素として、NEW ENGLAND BioLabs社のTaq DNA Ligaseを使用した。

0122

0123

4−2.ライゲーション反応
ライゲーション溶液をPCRチューブに移し、サーマルサイクラーにセットした。温度条件は、95℃で1分後、58℃で5分、その後、95℃で15秒、58℃で30秒を30サイクル、その後95℃で1分加熱し、37℃に温度を下げ反応を終了した。

0124

5.クロマトグラフィー本体を用いた検出
5−1.ハイブリダイゼーション反応
4.で得られた一本鎖DNAを用いての核酸クロマトグラフィーによるハイブリダイゼーション反応およびその検出を行った。

0125

5−2.反応液調製
ハイブリダイゼーション反応および検出は、展開液(TBA社製)、ラテックス液(TBA社製)、TEバッファーおよびライゲーション産物を混合して調製した反応液を使用して実施した。反応液の組成を表20に示す。

0126

0127

5−3.ハイブリダイゼーション工程
上記反応液各20μLを1.5mLチューブに加え、クロマトグラフィー本体の各下端部を差込んでクロマトグラフィーによるハイブリダイゼーション反応を行った。ハイブリダイゼーション反応は37℃で行った。反応液は約20分間ですべて吸い上がり、すべて吸いあがった段階でクロマトグラフィーによるハイブリダイゼーション反応を完了とした。反応終了後、クロマトグラフィー本体を風乾させ、目視による反応箇所の確認および画像を撮影した。

0128

5−4.検出工程
クロマトグラフィー本体の乾燥後の発色の有無を目視で確認した。図12に示すように、既知の遺伝子多型とクロマトグラフィー本体による遺伝子多型解析結果がすべて一致し、かつ、Spacer C3がある場合と無い場合の結果も一致した。このことから、本発明の方法を利用すると、スペーサー配列を用いることなく、解析に供するサンプルを調製できることが示された。

0129

比較例1
従来法のDigiTag法による標的遺伝子変異の検出に沿って試料の調製を次の手順で行った。以下、これらの順序に従って説明する。
1.プライマーの調製1
2.標的遺伝子の増幅
3.ライゲーション用プローブの調製
4.ライゲーション反応
5.プライマーの調製2
6.ライゲーション反応産物を鋳型としたPCR増幅
7.クロマトグラフィー本体(PAS:Printed Array Strip)を用いた検出
また、ヒト由来のゲノムDNA 3サンプル(G05、B06、D06)を実験に供試した。

0130

1.プライマーの調製1
1−1.プライマーの調製
ヒトゲノム中のCYP2D6遺伝子に特異的な以下の表21に示すプライマーC14(ユーロフィンジェノミクス社製)を準備した。これらプライマーは通常のオリゴヌクレオチド合成方法に準じて合成され、100μMの濃度に調整された。C14プライマーはCYP2D6遺伝子の遺伝子多型であるrs1065852(CがTに変異)を含む遺伝子領域を増幅するように設計した。

0131

0132

2.標的遺伝子の増幅
2−1.反応液調製
標的遺伝子の増幅に使用したゲノムDNAはヒト由来のものを用いた。ゲノムDNAを表21のプライマーを用いて以下のように増幅した。なお、サンプル増幅用試薬として、QIAGEN社のMultiplexPCRKitを使用した。サーマルサイクラーとして、eppendorf社のMastercycler(登録商標) gradientを使用した。表22に示す試薬を個々のサンプルごとに調製した。

0133

0134

2−2.PCR反応
調製したサンプル溶液をPCRチューブに移し、サーマルサイクル反応(95℃で15分後、95℃で30秒、68℃で2分を40サイクル、その後4℃に下げる)を行った。そして、増幅したサンプルはAgilent Technologies社のバイオアナライザを用いて電気泳動し、目的とするサイズの増幅産物が得られたことを確認した。結果を図13に示す。

0135

3.ライゲーション用プローブの調製
3−1.ライゲーション用のプローブの調製
2.で得た増幅サンプルに結合させるライゲーション用プローブ(ユーロフィンジェノミクス社製)を準備した。プローブの塩基配列を表23に示す。ライゲーション用プローブは各遺伝子多型にコモンオリゴ1種類、クエリーオリゴ2種類を作成した。クエリーオリゴは遺伝子変異が生じていない野生型に結合するもの(WTと標記)と遺伝子変異が生じている変異型に結合するもの(MTと標記)からなる。コモンオリゴの3’末端およびクエリーオリゴの5’末端には次のPCR増幅用のタグ配列が付与されている(太字下線で示す)。

0136

0137

3−2.コモンオリゴの5’末端のリン酸化
ライゲーション反応を行うために、コモンオリゴの5’末端にリン酸基を付加した。リン酸基を付加する試薬として、東洋紡社のT4 Polynucleotide Kinaseを使用した。

0138

3−3.反応液調製
表24に示す試薬を調製した。

0139

0140

3−4.反応条件
コモンオリゴ溶液をPCRチューブに移し、サーマルサイクラーにセットした。温度条件は、37℃で30分後、95℃で3分、その後4℃に下げ、反応を終了した。

0141

3−5.反応液調製
リン酸基付加反応を行ったコモンオリゴ溶液全量(20μL)にクエリーオリゴ20μL(各100nM)を混合した。

0142

4.ライゲーション反応
4−1.反応液調製
ライゲーション反応における組成は表25のとおりとした。なお、ライゲーションを行うための酵素として、NEW ENGLAND BioLabs社のTaq DNA Ligaseを使用した。

0143

0144

4−2.ライゲーション反応
ライゲーション溶液をPCRチューブに移し、サーマルサイクラーにセットした。温度条件は、95℃で5分後、58℃で15分、95℃で2分、その後37℃に下げ、反応を終了した。

0145

5.プライマーの調製2
5−1.プライマーの調製
コモンオリゴのタグ配列を認識するオリゴDNA(TBA社製)とクエリーオリゴのタグ配列を認識するオリゴDNA(ユーロフィンジェノミクス社製)を準備した。これらプライマーは通常のオリゴヌクレオチド合成方法に準じて合成され、100μMの濃度に調整された。プライマーの塩基配列を表26に示す。プライマーはコモンオリゴのタグ配列を認識するものを1種類、クエリーオリゴのタグ配列を認識するものを2種類作成した。クエリーオリゴのタグ配列を認識するプライマーは遺伝子変異が生じていない野生型に結合するもの(WTと標記)と遺伝子変異が生じている変異型に結合するもの(MTと標記)からなる。コモンオリゴのタグ配列を認識するプライマーの3’末端にはビオチンが標識されており、クエリーオリゴのタグ配列を認識するプライマーの5’末端にはクロマトグラフィー本体(PAS)に固定化されたオリゴDNAと相補的なタグ配列が付加されている(配列情報非開示)。また、クエリーオリゴとタグ配列の間にはSpacer C3が挿入されている。Spacer C3はPCRの伸長阻害するホスホロアミダイトであり、PCRを行った際、Spacer C3の5’側は一本鎖状態が保たれる。

0146

0147

6.ライゲーション反応産物を鋳型としたPCR増幅
6−1.反応液調製
4.のライゲーション反応で得られた産物を表26のプライマーを用いて以下のように増幅した。なお、サンプル増幅用試薬として、東洋紡社のKOD−Plus−Neoを使用した。サーマルサイクラーとして、eppendorf社のMastercycler(登録商標) gradientを使用した。表27に示す試薬を個々のサンプルごとに調製した。

0148

0149

6−2.PCR反応
調製したサンプル溶液をPCRチューブに移し、サーマルサイクル反応(94℃で2分後、98℃で10秒、60℃で30秒、68℃で15秒を40サイクル、その後4℃に下げる)を行った。

0150

7.クロマトグラフィー本体を用いた検出
7−1.ハイブリダイゼーション反応
6.で得られた二本鎖のDNAを用いての核酸クロマトグラフィーによるハイブリダイゼーション反応およびその検出を行った。

0151

7−2.反応液調製
ハイブリダイゼーション反応および検出は、展開液(TBA社製)、ラテックス液(TBA社製)、ホルムアミドを30%含有するTEバッファーおよびライゲーション産物を混合して調製した反応液を使用して実施した。反応液の組成を表28に示す。

0152

0153

7−3.ハイブリダイゼーション工程
上記反応液各50μLを1.5mLチューブに加え、クロマトグラフィー本体の各下端部を差込んでクロマトグラフィーによるハイブリダイゼーション反応を行った。反応液は約20分間ですべて吸い上がり、すべて吸いあがった段階でクロマトグラフィーによるハイブリダイゼーション反応を完了とした。反応終了後、クロマトグラフィー本体を風乾させ、目視による反応箇所の確認および画像を撮影した。

0154

7−4.検出工程
クロマトグラフィー本体の乾燥後の発色の有無を目視で確認した。結果を図14に示す。図14に示すように、既知の遺伝子多型とクロマトグラフィー本体を用いた遺伝子多型判定結果は一致しなかった。サンプルG05は100C>Tの遺伝子型がC/Cであるが、結果はC/Tとなっており、また、D06は遺伝子型がT/Tにもかかわらず、判定結果はC/Tとなった。また、ネガティブコントロールである水をテンプレートとした場合でも、Cの部分に青いラインが出ており、従来法であるDigiTag法で調製した一本鎖DNA産物は、簡易な遺伝子多型判定に利用することが困難であると考えられた。

0155

比較例2
従来法のLCR法による標的遺伝子変異の検出に沿って試料の調製を次の手順で行った。以下、これらの順序に従って説明する。LCRの手順を図3に示す。
1.プライマーの調製
2.標的遺伝子の増幅
3.ライゲーション用プローブの調製
4.LCR
5.クロマトグラフィー本体(PAS:Printed Array Strip)を用いた検出
また、ヒト由来のゲノムDNA(A、B、C)を実験に供試した。

0156

1.プライマーの調製
ヒトゲノム中のCYP2D6遺伝子に特異的な以下の表29に示すプライマーC12、C14(ユーロフィンジェノミクス社製)を準備した。これらプライマーは通常のオリゴヌクレオチド合成方法に準じて合成され、100μMの濃度に調整された。C12プライマーは同遺伝子の遺伝子多型であるrs16947(CがTに変異)、C14プライマーは同遺伝子多型であるrs1065852(CがTに変異)を含む遺伝子領域を増幅するように設計した。なお、図面ではrs16947を2850C>T、rs1065852を100C>Tと記載している。

0157

0158

2.標的遺伝子の増幅
2−1.反応液調製
標的遺伝子の増幅に使用したゲノムDNAはヒト由来のものを用いた。ゲノムDNAを表29のプライマーを用いて以下のように増幅した。なお、サンプル増幅用試薬として、KAPABIOSYSTEMS社のKAPA2GFAST Multiplexを使用した。サーマルサイクラーとして、eppendorf社のMastercycler(登録商標) gradientを使用した。以下に示す試薬を個々のサンプルごとに調製した。反応液の組成を表30に示す。

0159

0160

2−2.PCR反応
調製したサンプル溶液をPCRチューブに移し、サーマルサイクル反応(95℃で3分後、95℃で15秒、60℃で30秒、72℃で1分を30サイクル、その後72℃で5分、最後に4℃に下げる)を行った。そして、増幅したサンプルはAgilent Technologies社のバイオアナライザを用いて電気泳動し、目的とするサイズの増幅産物が得られたことを確認した。結果を図15に示す。

0161

3.ライゲーション用プローブの調製
3−1.ライゲーション用のプローブの調製
2.で得た増幅サンプルに結合させるライゲーション用プローブ(コモンオリゴはユーロフィンジェノミクス社製、クエリーオリゴはTBA社製)およびライゲーション用プローブに相補的なLCR用プローブを準備した。プローブの塩基配列を表31に示す。ライゲーション用プローブは各遺伝子多型にコモンオリゴ1種類、クエリーオリゴ2種類を作成した。クエリーオリゴは遺伝子変異が生じていない野生型に結合するもの(WTと標記)と遺伝子変異が生じている変異型に結合するもの(MTと標記)からなる。コモンオリゴの5’末端にはリン酸基[P]が修飾されており、3’末端にはビオチン[Biotin]が標識されている。クエリーオリゴの5’末端にはクロマトグラフィー本体(PAS)に固定化されたオリゴDNAと相補的なタグ配列が付加されている(配列情報非開示)。また、クエリーオリゴとタグ配列の間にはSpacer C3が挿入されている。

0162

さらに、LCRを行うためのコモンオリゴに相補的なコモンオリゴComp2種類とクエリーオリゴに相補的なクエリーオリゴComp1種類を各遺伝子多型に作成した。コモンオリゴCompは遺伝子変異が生じていない野生型に結合したクエリーオリゴ(WTと標記)とコモンオリゴからなる一本鎖DNAに結合するもの(Com-Comp−WTと標記)、および遺伝子変異が生じている変異型に結合したクエリーオリゴ(MTと標記)とコモンオリゴからなる一本鎖DNAに結合するもの(Com−MTと標記)からなる。また、クエリーオリゴCompの5’末端にはリン酸基が修飾されている。クロマトグラフィー本体はE12シリーズを使用した。

0163

0164

4.LCR
4−1.反応液調製
ライゲーション反応における組成は表32のとおりとした。なお、ライゲーションを行うための酵素として、NEW ENGLAND BioLabs社のTaq DNA Ligaseを使用した。

0165

0166

4−2.ライゲーション反応
ライゲーション溶液をPCRチューブに移し、サーマルサイクラーにセットした。温度条件は、95℃で1分後、58℃で5分、その後、95℃で15秒、58℃で30秒を30サイクル、その後95℃で1分加熱し、37℃に温度を下げ反応を終了した。

0167

5.クロマトグラフィー本体を用いた検出
5−1.ハイブリダイゼーション反応
4.で得られた一本鎖DNAを用いての核酸クロマトグラフィーによるハイブリダイゼーション反応およびその検出を行った。

0168

5−2.反応液調製
ハイブリダイゼーション反応および検出は、展開液(TBA社製)、ラテックス液(TBA社製)、TEバッファーおよびライゲーション産物を混合して調製した反応液を用いて実施した。反応液の組成を表33に示す。

0169

0170

5−3.ハイブリダイゼーション工程
上記反応液各20μLを1.5mLチューブに加え、クロマトグラフィー本体の各下端部を差込んでクロマトグラフィーによるハイブリダイゼーション反応を行った。ハイブリダイゼーション反応は37℃で行った。反応液は約20分間ですべて吸い上がり、すべて吸いあがった段階でクロマトグラフィーによるハイブリダイゼーション反応を完了とした。反応終了後、クロマトグラフィー本体を風乾させ、目視による反応箇所の確認および画像を撮影した。

0171

5−4.検出工程
クロマトグラフィー本体の乾燥後の発色の有無を目視で確認した。図16に示すように、既知の遺伝子多型とクロマトグラフィー本体を用いた遺伝子多型判定結果は一致しなかった。また、ネガティブコントロールである水をテンプレートとした場合でも、全ての場所にラインが出てしまった。LCRで使用したプローブ同士が非特異的に結合してしまった結果、偽陽性が現れたと考えられる。これらのことから、LCR法で調製した一本鎖DNA産物は、簡易な遺伝子多型判定に利用することは困難であると考えられた。

0172

本発明の方法によって得られた一本鎖DNAを用いた判定においては、正確な判定ができた結果となった。しかしながら、従来技術である、Digitag法やLCRによって得られた一本鎖DNAでは、誤判定の結果となった。

実施例

0173

これらの結果より、一本鎖DNAの取得において、他のミスマッチが起こることが無く、正確に一本鎖DNAを得ることができ、また簡便で迅速に反応を行うことができるため、臨床現場等においても用いることができ、有用である結果となった。

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