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図面 (2)

課題

新たなディフェンシン等の抗菌性ペプチド分泌誘導剤を提供することを課題とする。

解決手段

発芽玄米及び/又は玄米由来ステロール配糖体を有効成分とするα−ディフェンシン等の抗菌性ペプチドの分泌誘導剤

概要

背景

細菌感染症真菌感染症人類寿命を左右する大きな疾患であり、抗生物質合成抗菌剤など種々の薬剤が開発されてきた。しかし抗生物質や抗菌剤は常に抵抗性微生物出現する。ひとたびこのような抗生物質耐性菌が出現すると、従来の抗菌剤では治療の手段がなく、耐性菌に対する対策は新たな抗菌剤を開発するしかなかった。
近年高齢者の間で、免疫の低下に伴う常在菌による感染症が問題となっている。常在菌は所謂多剤耐性株が多く、いったん老人介護施設などで多剤耐性菌の感染患者が発生すると効果的な治療手段がなく、施設内で多数の患者が連鎖的に発生し、状況によっては施設の閉鎖や患者の隔離などが必要になってくる。このため、多剤耐性菌に対する対策は大きな社会問題となっている。
このため、インターフェロン類やインターロイキン類の分泌誘導する多糖糖タンパク質などを投与して生体免疫システムを増強する治療や予防方法が提案されているが、あまり効果はあがっていない。
ところで動物、植物、昆虫酵母乳酸菌などのさまざまな生物には、外界からの病原微生物侵入に対して自己防御するための自己生体防御機構が本来備っている。このような外来からの進入を防御するために、アミノ酸が10数個〜50数個程度からなる抗菌ペプチドを生物自らが産生していることが明らかになっている。これらの抗菌ペプチドは、細菌、真菌などに対してはば広い範囲の抗菌スペクトルを有しているとともに、生物自らが産生していることから生体に対しては副作用阻害作用も有していない。

このような抗菌ペプチドのうち、ヒト由来の抗菌ペプチドとしては、例えば、ディフェンシンファミリー(α−ディフェンシン、β−ディフェンシン等)、カセリシジンLL-37)、ダームシジン(dermcidin)、LEAP-1(ヘプシジン)、LEAP-2などが知られている。また、ウシ好中球から単離された、トリプトファンリッチな13アミノ酸からなる広域スペクトル抗菌活性を示す抗菌ペプチドであるインドリシジン類似体の合成カチオン性抗菌ペプチドオミガナン(Ominagan pentahydrochloride) が、カテーテル局所感染予防薬として開発されている(例えば、非特許文献1参照)。さらに、乳酸菌が産生する抗菌ペプチドであるナイシンが、食品添加物としてすでに使用されている。

この抗菌ペプチドを人為的に人に発現増強または分泌促進することができれば多剤耐性菌などの感染により一層大きな効果が期待できる。このような技術として、例えば、有機酸をヒトβ−ディフェンシンの分泌促進剤の有効成分として使用する技術(特許文献1)、酵母由来多糖類含有組成物によってディフェンシン遺伝子発現誘導する技術(特許文献2)、酵母由来の不溶性画分によってディフェンシン遺伝子を発現誘導する技術(特許文献3)、酵母由来のマンナン含有成分を用いて抗菌ペプチドを発現誘導する技術(特許文献4)、イソロイシンロイシンまたはバリンから選ばれた分岐鎖必須アミノ酸の有効成分による抗菌ペプチドの発現誘導に関する技術(特許文献5)、ヨーグルト甘酒抽出物焼酎もろみ糠味噌濃縮物などの有効成分を使用した抗菌ペプチドの発現誘導技術(特許文献6)などが提案されている。
現在も日常で簡便に使用できる抗菌ペプチドの誘導剤の探索が行われている。

概要

新たなディフェンシン等の抗菌性ペプチドの分泌誘導剤を提供することを課題とする。発芽玄米及び/又は玄米由来ステロール配糖体を有効成分とするα−ディフェンシン等の抗菌性ペプチドの分泌誘導剤

目的

本発明は、ヒトに備わっている自己生体防御機構を発揮する抗菌性ペプチドの一種であるα−ディフェンシン等の抗菌性ペプチドの誘導剤を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

請求項2

請求項1に記載された抗菌性ペプチドの誘導剤を含有する飲食品(発芽玄米及び玄米を除く)。

請求項3

請求項1に記載された抗菌性ペプチドの誘導剤を含有するペットフード(発芽玄米及び玄米を除く)。

技術分野

0001

本発明は、抗菌性ペプチド分泌誘導剤に関する。

背景技術

0002

細菌感染症真菌感染症人類寿命を左右する大きな疾患であり、抗生物質合成抗菌剤など種々の薬剤が開発されてきた。しかし抗生物質や抗菌剤は常に抵抗性微生物出現する。ひとたびこのような抗生物質耐性菌が出現すると、従来の抗菌剤では治療の手段がなく、耐性菌に対する対策は新たな抗菌剤を開発するしかなかった。
近年高齢者の間で、免疫の低下に伴う常在菌による感染症が問題となっている。常在菌は所謂多剤耐性株が多く、いったん老人介護施設などで多剤耐性菌の感染患者が発生すると効果的な治療手段がなく、施設内で多数の患者が連鎖的に発生し、状況によっては施設の閉鎖や患者の隔離などが必要になってくる。このため、多剤耐性菌に対する対策は大きな社会問題となっている。
このため、インターフェロン類やインターロイキン類の分泌を誘導する多糖糖タンパク質などを投与して生体免疫システムを増強する治療や予防方法が提案されているが、あまり効果はあがっていない。
ところで動物、植物、昆虫酵母乳酸菌などのさまざまな生物には、外界からの病原微生物侵入に対して自己防御するための自己生体防御機構が本来備っている。このような外来からの進入を防御するために、アミノ酸が10数個〜50数個程度からなる抗菌ペプチドを生物自らが産生していることが明らかになっている。これらの抗菌ペプチドは、細菌、真菌などに対してはば広い範囲の抗菌スペクトルを有しているとともに、生物自らが産生していることから生体に対しては副作用阻害作用も有していない。

0003

このような抗菌ペプチドのうち、ヒト由来の抗菌ペプチドとしては、例えば、ディフェンシンファミリー(α−ディフェンシン、β−ディフェンシン等)、カセリシジンLL-37)、ダームシジン(dermcidin)、LEAP-1(ヘプシジン)、LEAP-2などが知られている。また、ウシ好中球から単離された、トリプトファンリッチな13アミノ酸からなる広域スペクトル抗菌活性を示す抗菌ペプチドであるインドリシジン類似体の合成カチオン性抗菌ペプチドオミガナン(Ominagan pentahydrochloride) が、カテーテル局所感染予防薬として開発されている(例えば、非特許文献1参照)。さらに、乳酸菌が産生する抗菌ペプチドであるナイシンが、食品添加物としてすでに使用されている。

0004

この抗菌ペプチドを人為的に人に発現増強または分泌促進することができれば多剤耐性菌などの感染により一層大きな効果が期待できる。このような技術として、例えば、有機酸をヒトβ−ディフェンシンの分泌促進剤の有効成分として使用する技術(特許文献1)、酵母由来多糖類含有組成物によってディフェンシン遺伝子発現誘導する技術(特許文献2)、酵母由来の不溶性画分によってディフェンシン遺伝子を発現誘導する技術(特許文献3)、酵母由来のマンナン含有成分を用いて抗菌ペプチドを発現誘導する技術(特許文献4)、イソロイシンロイシンまたはバリンから選ばれた分岐鎖必須アミノ酸の有効成分による抗菌ペプチドの発現誘導に関する技術(特許文献5)、ヨーグルト甘酒抽出物焼酎もろみ糠味噌濃縮物などの有効成分を使用した抗菌ペプチドの発現誘導技術(特許文献6)などが提案されている。
現在も日常で簡便に使用できる抗菌ペプチドの誘導剤の探索が行われている。

0005

国際公開第2005/027893号
特開2003−197号公報
特開2003−262号公報
特開2006−241023号公報
特開2003−95938号公報
特開2005−270117号公報

先行技術

0006

Selsted, et al.; J.Biol.Chem.267:4292,1992

発明が解決しようとする課題

0007

本発明は、ヒトに備わっている自己生体防御機構を発揮する抗菌性ペプチドの一種であるα−ディフェンシン等の抗菌性ペプチドの誘導剤を提供することを課題とする。

課題を解決するための手段

0008

すなわち、本発明の主な構成は、次のとおりである。
(1)発芽玄米及び/又は玄米由来ステロール配糖体を有効成分とする抗菌性ペプチドの誘導剤。
(2)(1)に記載された抗菌性ペプチドの誘導剤を含有する飲食品(発芽玄米及び玄米を除く)。
(3)(1)に記載された抗菌性ペプチドの誘導剤を含有するペットフード(発芽玄米及び玄米を除く)。

発明の効果

0009

この発明に係る抗菌ペプチドの発現誘導剤または分泌促進剤は、経口投与によって腸管内に抗菌ペプチドの発現を誘導または分泌を促進できることから、医薬、飲食品、ペット用飼料として使用できるという効果がある。

図面の簡単な説明

0010

本発明による抗菌性ペプチドの分泌促進効果を示すグラフ

0011

本発明に使用する発芽玄米及び/又は玄米から抽出されたステロール配糖体画分(以下「ASG」と称する場合がある)は、発芽玄米及び/又は玄米から得た糠をヘキサン中性脂質を除去し、得られた残渣をさらに有機溶媒にて抽出した脂質画分に含まれ、高速液体クロマトグラフィーHPLC)で分離・濃縮することが出来る。
本発明は、この発芽玄米及び/又は玄米由来のステロール配糖体を有効成分とするα−ディフェンシン誘導剤である。摂取方法は、経口、注射により行うことができ、医薬、飲食品、食品添加剤ペット用の医薬剤、ペット用飼料の添加剤として活用することができる。通常食用にしている発芽玄米及び/又は玄米由来の成分であるので、安全性が高い。ASGは、発芽玄米及び/又は玄米の糠成分から極微量抽出される成分であるので、ASGを医薬、あるいは飲食品、ペット用医薬や飼料に応用する場合は、抽出されたASGそのものを使用する。発芽玄米及び/又は玄米そのものあるいは発芽玄米及び/又は玄米の粉末などASGを抽出する前の状態で使用することは発明の対象外である。

0012

本発明は、α−ディフェンシン等の抗菌性ペプチドの誘導剤、食品添加物、食品およびペットフード、動物用医薬として利用することができる。剤型は、公知の方法により助剤とともに任意の形態に製剤化して、経口摂取(投与)することができる。カプセル剤又は錠剤顆粒剤細粒剤散剤、液状として摂取(投与)できる。
摂取(投与)量は、摂取(投与)方法と、対象者年齢病状一般状態等によって変化し得るが、成人では体重1kg当たり通常、1日当たり有効成分として0.1〜600mgが適当である。

0013

本発明のα−ディフェンシン等抗菌性ペプチドの誘導剤は、一般食品や健康食品に配合することができ、また、食品添加物の成分とすることもできる。配合する食品は特に限定されず、例えば食パン菓子パンパイデニッシュドーナツ、ケーキ等のベーカリー食品、うどん、そば、中華麺焼きそばパスタ等の麺類天ぷらコロッケ等のフライ類カレーシチュードレッシング等のソース類、ふりかけ類、かまぼこ等の練り製品ジュース等の飲料、スナック菓子米菓、飴、ガム等の菓子類を挙げることができる。
ペットには、ハムスターリス等の哺乳類の飼料として適している。本発明のペットフードの形態は特に限定されるものではなく、例えばドライタイプウェットタイプセミモイストタイプビスケットタイプ、ソーセージタイプジャーキータイプ、粉末、顆粒カプセルなどが挙げられる。

0014

<発芽玄米及び又は玄米由来のステロール配糖体>
1.糠成分を採取する発芽玄米は、公知の方法により調製することができる。本出願人は、発芽玄米について多数の提案をしており、例えば、特許第3423927号公報、特許第3611804号公報、特許第3738025号公報等に開示された発芽玄米の製法によって得ることができる。
発芽玄米及び/又は玄米を5〜15%程度搗精して糠成分を採取する。この糠成分を最初に、ヘキサンにて脱脂する。この脱脂工程は、一般の糠を脱脂して米糠油を採取する方法と同様である。本発明では、この脱脂糠原料として、さらに、有機溶媒を用いてステロール配糖体画分を抽出する。

0015

2.本願発明で使用するASGは、以下の化学式で特定されるステロール配糖体である。

0016

(i)一般式(1)中のXは以下の群から選択され、かつ、Yは5α-cholest-8(14)-en3β-olであるパルミチン酸(16:0)、ステアリン酸(18:0)、2-ヒドロキシ-オクタデカン酸(18:0 (2h))、オレイン酸(18:1)、リノール酸(18:2)、又は、リグノセリン酸(24:0)
(ii) 一般式(1)中のXは2-ヒドロキシ-オクタデカン酸(18:0 (2h))であり、かつ、Yは以下の群から選択されるCampesterol、Stigmasterol、5α-cholest-8(14)-en-3β-ol、又は、β-Sitosterol

0017

以下に実施例、試験例を示し、本発明をさらに説明する。
<ASGの調製例>
発芽玄米糠をヘキサンで脂質成分中の中性脂質を除去後、それぞれの残渣につき、ヘキサン、クロロホルム及びメタノールを用いてASGの粗抽出液を調製した。このASG粗抽出液からクロロホルム:メタノール(2:1)混合液で抽出し、シリカゲル担体カラムクロマト
グラフィーによって、ASGの調製を行った。
試験に用いたASGの抽出は発芽玄米約2,000kgを搗精して得られた糠200kg(搗精度10%)を用いて行った。
米糠(500g)が浸る量のヘキサンを加え十分に撹拌した後ガーゼでろ過を行い、脱脂糠を得た。その後、ヘキサンを揮発させた脱脂糠を1.5kgに対してクロロホルム:メタノール2:1を(3L)加えて総脂質画分を抽出し、抽出液エバポレーター乾固させ乾固物を得た。

0018

乾固物は300mlのクロロホルム:ヘキサン=1:1に溶解し、クロロホルムで膨潤させた直径10cm×長さ100cm(メルク社製シリカゲル60を80cm充填)のカラムに全溶解液アプライした。溶液がイアトロビーズに全てしみ込んだ後、クロロホルム:ヘキサン=1:1(7,840ml)、クロロホルム(20,160ml)、クロロホルム:メタノール=9:1(10,080ml)の順でそれぞれを通液した。クロロホルム:メタノール=9:1の通液により分離した暗緑色の溶液だけを全て採取した。
採取した暗緑色の溶液はエバポレーターで乾固させ試験に供した。表1に各ポイントでの収量を示す。

0019

0020

<ASG分析
抽出したASGの分析は以下の条件で行った。この分析の結果、最終乾固物には、ASGが72.6%含まれていることが判明した。
分析条件
検出器:CoronaTMCADTM ChargedAerosol Detector
カラム:LiChrospher Si 60(5μm,125×4mm i.d.,Merck)
カラム温度:40度
流速:1mL/min.
注入量 :10μL
サンプ溶媒:クロロホルム:メタノール(2:1,vol/vol)
検量線濃度 :10,20,40,60及び80μg/mL
移動相グラジェント条件(表2参照)

0021

0022

<ディフェンシン誘導試験
I.材料及び方法
特開2011−78318号公報に開示されているマウス小腸陰窩を用いたパネト細胞からのα−ディフェンシン分泌アッセイ系を用いてASGがパネト細胞から抗菌性ペプチドであるα−ディフェンシンの分泌誘導効果を抗菌活性を指標にして確認した。
1.小腸陰窩材料採取
ICRマウス(日本チャールズリバー社)から、従来法に従ってクリプト(小腸陰窩)を含む小腸の組織を採取し、1mLのPBS(−)に懸濁して、クリプトを含む懸濁液を調製した{Ayabe Tら、Nature Immunol.第1巻、第113-118頁、2000年}。この懸濁液に含まれるクリプト数を血球計算盤(Burker−Turk;サンリード硝子社)を用いて数えたところ、5〜8×104個であった。また、位相差顕微鏡オリンパス社)を用いて弱拡大視野で観察して、この懸濁液に含まれる組織のうちクリプトが占める割合を求めたところ、その割合は70%以上であった。
2. パネト細胞分泌反応およびex vivo殺菌アッセイ:
回収した小腸陰窩と上記のASG含有組成物をex vivo共培養して粗分泌物を回収した。ASG(以下グラフ中ではPSGと標記している)の濃度は生理食塩水を用いて1:10,000、1:1,000または1:100希釈とした。同時に小腸陰窩のASG非曝露のPBS対照上清も回収した。30%酢酸中でペプチドを抽出、透析に引き続いて真空凍結乾燥した。回収した分泌物および非曝露対照上清抽出物を1μLが小腸陰窩100個由来となるように純水に溶かした。
次に、分泌物のSalmonella Typhimurium phoP-に対する殺菌活性解析した。
パネト細胞分泌物および非曝露対照上清、抽出物を1×106colony-forming units (CFU) のS. Typhimurium phoP-と37℃で60分反応させた後、TSAプレート上で一晩培養した。生存CFUをカウントし、殺菌率図1に示した。

0023

II.結果
ASGのパネト細胞からのα−ディフェンシン等の抗菌性ペプチド分泌誘導による S. Typhimurium phoP-に対するex vivoでの殺菌活性を解析した。ASGをマウス小腸陰窩に反応濃度および小腸陰窩数を変えて検討したところ、図1に示すように、ASG(1:10,000 〜1:100)に暴露した小腸陰窩50個由来の分泌物はコントロールと比較して99%以上の有意な殺菌率を認めた。また、この殺菌活性はASGの濃度に依存していた。小腸陰窩 100個由来の分泌物はASG(1:100)でさらに強力な殺菌活性を示した。
小腸陰窩200個および500個由来の分泌物では検討したすべてのASG濃度で細菌数が100分の1以下となった。
以上の結果より、ASGはマウス小腸パネト細胞からのα−ディフェンシン等抗菌性ペプチドによるex vivo殺菌活性放出を誘導することが明らかになった。また、その殺菌活性はASG濃度依存性であることが確認できた。

0024

以下に本発明のASGを用いた処方例を示す。
処方例1
[カプセル剤]
組成
ASG………………100mg
ミツロウ………………10mg
ぶどう種子オイル…110mg
上記成分を混合し、ゼラチンおよびグリセリンを混合したカプセル基剤中に充填し、軟カプセルを得た。

0025

処方例2
[錠剤]
組成
ASG乾固物……………150mg
セルロース…………………80mg
デンプン……………………20mg
ショ糖脂肪酸エステル………2mg
上記成分を混合、打錠し、錠剤を得た。

実施例

0026

処方例3
[飲料]
組 成 (配合;質量%)
果糖ブト糖液糖 5.00
クエン酸10.4
L−アスコルビン酸0.20
香料0.02
色素0.10
ASG乾固物 1.00
水 82.28

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